JPH0158957B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物を用いてα−アセトアミド桂皮
酸からＬ−フエニルアラニンを製造する方法に関
する。 Ｌ−フエニルアラニンは必須アミノ酸の一つで
あり、栄養上あるいは医薬上重要な物質である。 本発明者らは先に、アクロモバクター属、アエ
ロバクター属、シユードモナス属、アグロバクテ
リウム属、フラボバクテリウム属、アルスロバク
ター属、コリネバクテリウム属又はミクロコツカ
ス属に属するある種の微生物がα−アセトアミド
桂皮酸からＬ−フエニルアラニンを生成せしめる
能力を有していることを見い出し、これにより新
たなＬ−フエニルアラニンの製造法を開発した
（特開昭57−99198）。 本発明者らは、α−アセトアミド桂皮酸からＬ
−フエニルアラニンを生成せしめる能力を有する
微生物について、更に検索を進めた結果、自然界
より分離したバチルス属又はアルカリゲネス属に
属する微生物が前記能力を有していることを見い
出し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明はバチルス属又はアルカリゲネス
属に属し、α−アセトアミド桂皮酸からＬ−フエ
ニルアラニンを生成せしめる能力を有する微生物
の培養液、該培養液から得た菌体又は該菌体の処
理物をα−アセトアミド桂皮酸又はその塩に作用
させ、生成したＬ−フエニルアラニンを採取する
ことを特徴とするＬ−フエニルアラニンの製造法
である。 本発明において使用する微生物は、バチルス属
又はアルカリゲネス属に属し、α−アセトアミド
桂皮酸からＬ−フエニルアラニンを生成せしめる
能力を有するものであればいずれでもよい。かか
る微生物の例としては、バチルス・スフエリカス
Ｎ−７株（微工研菌寄第6746号）及びアルカリゲ
ネス・フエカリスＳ−７株（微工研菌寄第6745
号）等が好適に挙げられる。 上記の２菌株はα−アセトアミド桂皮酸を添加
した最小培地において、α−アセトアミド桂皮酸
を単一炭素源として生育し得る微生物の中から新
たに分離された新菌株であり、その菌学的性質は
以下の通りである。 Ｎ−７株 (a) 形態 細胞の形：桿菌 細胞の大きさ：0.5〜0.7×1.0〜2.5μｍ 細胞の多形性の有無：無、運動性：有 鞭毛の着生状態：周鞭毛 胞子の有無：有、 胞子の形：球形〜わずかに卵形 胞子の大きさ：0.6〜0.8μｍ 胞子の形成部位：末端付近 胞子のうの形：ふくらんでいる グラム染色性：グラム陽性 抗酸性：非抗酸性 (b) 生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 生育状態：適度、形状：円形、周囲は不規
則、表面はしわ状、偏平〜わずかに隆起、色
状：肌色、不透明 (2) 肉汁寒天斜面培養 生育状態：適度、形状：糸状、表面はしわ
状、色状：肌色、鈍光 (3) 肉汁液体培養 混濁しない、わずかに沈殿、表面に皮膜を
形成する (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンを液化しない、穿刺口周辺にのみ
生育 (5) リトマス・ミルク アルカリ性、固化しない (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：認められない (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：無 (6) 硫化水素の生成：無 (7) デンプンの加水分解：無 (8) クエン酸の利用 Koser培地：陽性 Christensen培地：陽性 (9) 無機窒素源の利用： 硝酸塩又はアンモニウム塩を単一窒素源と
して用いる (10) 色素の生成：無 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲： PH５〜９（最適PH７付近） 10℃で生育できる（最適温度25〜30℃）。
37℃で生育できない (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト 糖の分解は弱いながら酸化的 (17) 糖類から酸及びガス生成の有無

【表】

【表】 (d) その他の性質 (1) ジヒドロキシアセトン：生成しない (2) 分離源：土壤 Ｓ−７株 (a) 形態 細胞の形：桿菌 細胞の大きさ：0.5〜0.7×1.0〜2.5μｍ 細胞の多形性の有無：無 運動性の有無：有 鞭毛の着生状態：周鞭毛 胞子の有無：無 グラム染色性：陰性 抗酸性：非抗酸性 (b) 生育状態 (1) 肉汁寒天板培養 生育状態：適度、形状：円形、全縁、隆
起、表面は滑らか、色状：肌色、光沢あり、
不透明 (2) 肉汁寒天斜面培養 生育：適度、形状：糸状、色状：肌色、光
沢あり (3) 肉汁液体培養 混濁しない、沈殿は生成しないかごくわず
かに生成する、表面に皮膜を形成する (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンを液化しない、穿刺口周辺にのみ
生育 (5) リトマス・ミルク アルカリ性、固化しない (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：認められない (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：無 (6) 硫化水素の生成：無 (7) デンプンの加水分解：無 (8) クエン酸の利用 Koser培地：陽性 Christensen培地：陽性 (9) 無機窒素源の利用： アンモニウム塩又は硝酸塩を単一窒素源と
して利用 (10) 色素の生成：無 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲： PH５〜９（最適PH７付近） 10℃で生育できる（最適温度25〜30℃） 37℃で生育できない (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) OFテスト：糖の分解は弱いながら酸化
的 (17) 糖から酸及びガス生成の有無

【表】

【表】 (d) その他の性質 (1) 酢酸、プロピオン酸又は酪酸を唯一の炭素
源、エネルギー源として生育する。 (2) 分離源は土壤 以上述べた菌学的諸性質をバージエイのマニユ
アル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第８版に基づき検索した結果、
Ｎ−７株はグラム陽性、好気性で胞子を形成する
桿菌であることより、バチルス属に含まれる細菌
であると考えられる。そこでバチルス属に含まれ
る種について検索を行つた結果、バチルス・スフ
エリカスについての記載事項と生理学的性質にお
いてＤ−マンニツトからの酸生成及び硝酸塩の還
元テストの２点において少し異なるが、本菌株を
バチルス・スフエリカスの一菌株と見なすのが最
も妥当であると結論し、本菌をバチルス・スフエ
リカス（Bacillus Sphaericus）と同定した。一
方、Ｓ−７株についても同様に検索した結果、グ
ラム陰性、好気性及び周鞭毛を有する桿菌である
こと、更にその生理学的性質からオキシダーゼ活
性は非常に弱いが、アルカリゲネス属に含まれる
細菌であると考えられる。そこでアルカリゲネス
属に含まれる種について検索を行い、本菌をアル
カリゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）
と同定した。 バチルス・スフエリカスＮ−７株及びアルカリ
ゲネス・フエカリスＳ−７株は上記の如く、いず
れもα−アセトアミド桂皮酸を単一炭素源として
含有する培地に生育しうる微生物の中から分離さ
れたものであるが、これら例示菌株以外にも広く
自然界の微生物から本発明に使用しうる菌株を分
離することができる。例えば、リン酸−カリウム
0.1％、硫酸マグネシウム0.05％を含有する基本
培地に唯一の炭素源としてα−アセトアミド桂皮
酸を0.5〜５％程度添加して作成した培地（PH
7.0）に適当量の自然界微生物試料を添加し、30
℃で７〜10日間振とう培養を行い、生育して来た
微生物を分離することによつて行われる。 本発明に係る微生物を培養する培地としては、
炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含
む通常の栄養培地が使用できる。炭素源としては
該微生物の利用可能なものであればいずれも使用
することができ、例えばグルコース、フラクトー
ス、マンノース、シヨ糖、マンニツト、ソルビト
ール、グリセリン等の糖もしくは糖アルコール、
酢酸、クエン酸、フマール酸等の有機酸が使用で
きる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム等の無機酸アンモニウ
ム塩、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム
等の有機酸アンモニウム塩等を使用することがで
きる。有機栄養源としては、例えば酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、
タンパク質加水分解物、アミノ酸等が使用でき
る。又、無機塩類としては、例えば硫酸第一鉄、
硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸−カリ
ウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム等が
使用できる。培養は常法により実施すればよく、
例えば培地のPHを５〜９好ましくはPH６〜８に調
整し、菌株を接種した後10〜35℃、好ましくは25
〜30℃で好気的に培養する。尚、培養にあたつて
培地中にα−アセトアミド桂皮酸を少量添加して
おくことにより、得られる培養物又は菌体のα−
アセトアミド桂皮酸からのＬ−フエニルアラニン
生成能を高めることができる。この場合、α−ア
セトアミド桂皮酸の添加量は通常0.01％以上、と
りわけ0.1〜１％が好ましい。尚、この添加した
α−アセトアミド桂皮酸は上記培養において唯一
の炭素源、窒素源として用いることができる。 この様にして微生物を培養した後、得られる培
養液、該培養液から採取した菌体又は該菌体の処
理物（例えば、洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕
物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌
体抽出物、ポリアクリルアミドゲル又はカラギー
ナンゲル等で固定化した菌体等）をα−アセトア
ミド桂皮酸又はその塩に作用させることによりＬ
−フエニルアラニンを生成させることができる。 該反応は培養後の菌体を含む培養液にα−アセ
トアミド桂皮酸又はその塩を加えて実施してもよ
く、又培養液から遠心分離、ろ過等により採取し
た菌体又は該菌体処理物をα−アセトアミド桂皮
酸含有水性溶媒中に加えて反応せしめてもよい。
更に、これらの他、例えば菌体をカラギ−ナンゲ
ル法又はポリアクリルアミド法等により固定化し
て調製した固定化菌体をカラムに充填した後、基
質含有溶液を流下させる連続法により実施するこ
ともできる。α−アセトアミド桂皮酸のＬ−フエ
ニルアラニンへの転換反応は上記いずれの場合に
も水性媒質中10〜60℃、とりわけ30℃付近、PH５
〜10とりわけPH７〜８程度で実施するのが好まし
い。又、基質であるα−アセトアミド桂皮酸又は
その塩の添加濃度はバツチ式か連続式かによつて
も異なるが、バツチの場合一般に水性媒質中0.5
〜20％、とりわけ３〜10％程度が好ましく、連続
式の場合はこれよりやや低い濃度であるのが好ま
しい。 尚、本発明方法においてα−アセトアミド桂皮
酸のＬ−フエニルアラニンへの転換反応を実施す
るに当つては、反応系にＬ−アミノ酸又はＬ−ア
ミノ酸とＬ−フエニルアラニン・トランスアミナ
ーゼとを添加しておけば反応時間の短縮或いはＬ
−フエニルアラニンの蓄積量の増加をはかること
ができるので好ましい。添加するＬ−アミノ酸と
しては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｌ−アラニンなどが好適に挙げられ、これら
は単独で又は組合せて用いてもよい。又、これら
Ｌ−アミノ酸の添加量は基質であるα−アセトア
ミド桂皮酸と概ね当モル量程度が好ましい。又、
Ｌ−フエニルアラニン・トランスアミナーゼは必
ずしも精製されたものでなくてもよく、Ｌ−フエ
ニルアラニン・トランスアミナーゼ活性の強い微
生物、例えばアクロモバクター属〔アクロモバク
ター・アクアチリス（Achromobactor
aquatilis）OUT8003、アクロモバクター・リク
イダム（Achromobactor liquidum）
OUT8012〕、アルカリゲネス属〔アルカリゲネ
ス・フエカリス（Alcaligenes facalis）
OUT8025〕、アルスロバクター属〔アルスロバク
ター・グロビホルミス（Arthrobactor
globiformis）IFO12956〕、バチルス属〔バチル
ス・セレウス（Bacillus cereus）IFO3001〕、コ
リネバクテリウム属〔コリネバクテリウム・ハイ
ドロカルボクラスタス（Corynebacterium
hydrocarboclastus）ATCC15592〕、アシネトバ
クター属〔アシネトバクター・カルコアセチクス
（Acinetobactor calcoaceticus）IFO12552〕、パ
ラコツカス属〔パラコツカス・デニトリフイカン
ス（Paracoccus denitrificans）IFO12442〕、プ
ロテウス属〔プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）OUT8102〕、シユードモナス属〔シユ
ードモナス・オーレオフアシエンス
（Pseudomonus aureofaciens）IAM1001、シユ
ードモナス・ルベツセンス（Pseudomonas
rubescens）IAM1510、シユードモナス・スクイ
ルキリエンシス（Pseudomonas
schuylkilliensis）IAM1092〕等の微生物を常法
に従つて培養し、得られた培養液、該培養液から
採取した菌体又は該菌体の処理物をそのまま該Ｌ
−フエニルアラニン・トランスアミナーゼとして
用いることができる。 又、本発明方法において生菌体を用いる場合、
反応液中に界面活性剤（例えば、臭化セチルトリ
メチルアンモニウム、トリトンＸ−100等）を添
加しておけば反応時間の短縮あるいはＬ−フエニ
ルアラニンの蓄積量の増加をはかることができ
る。界面活性剤の添加量は反応液に対して概ね
0.0001〜0.1％程度が好ましい。 かくして反応液中に生成蓄積したＬ−フエニル
アラニンの分離精製は、通常のイオン交換樹脂法
やその他の公知方法を組合わせて容易に行うこと
ができる。 以下、実施例をあげて本発明方法を具体的に説
明する。尚、実施例中のＬ−フエニルアラニンの
確認及び定量はペーパークロマトグラフイーによ
るニンヒドリン発色位置、アミノ酸オートアナラ
イザー及びロイコノストツク・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）Ｐ−60を用いた
バイオアツセイ法により行つた。 実施例 １ グルコース0.5％、ポリペプトン１％、肉エキ
ス１％、酵母エキス1.25％、塩化ナトリウム0.5
％及びα−アセトアミド桂皮酸0.2％を含有する
培地をPH7.0に調整し、これを500ml容肩付振とう
フラスコに100ml宛分注し、120℃で10分間蒸気滅
菌した。これに予め寒天斜面培地に30℃で24時間
生育させた下記第１表に示す微生物を一白金耳接
種し、30℃で24時間培養した。各微生物の培養液
100mlから遠心分離にて菌体を集め、生理食塩水
100mlにけん濁し、洗浄した。洗浄し、遠心分離
にて菌体を集め、この菌体を３％α−アセトアミ
ド桂皮酸水溶液（アンモニア水でPH7.5に調整）
100mlにけん濁し、30℃で18時間反応させた。反
応液中に生成したＬ−フエニルアラニンの量は下
記第１表の通りである。

【表】 実施例 ２ 下記第２表に示す微生物を実施例１と同一組成
の培地100mlに同一条件で培養し、集菌した。こ
の菌体を各々２％のＬ−アスパラギン酸及び0.01
％の臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む３
％α−アセトアミド桂皮酸水溶液（アンモニア水
でPH7.5に調整）100mlにけん濁し、30℃で18時間
反応させた。反応液中に生成したＬ−フエニルア
ラニンの量は下記第２表の通りである。

【表】 実施例 ３ 下記第３表に示す微生物をグルコース５％、酵
母エキス0.5％、リン酸一カリウム0.1％、硫酸マ
グネシウム0.05％及びα−アセトアミド桂皮酸
0.5％を含有する培地（PH7.0）100mlを用いて実
施例１と同一条件で培養し、集菌した。この菌体
をそれぞれパラコツカス・デニトリフイカンス
IFO12442の凍結乾燥菌体0.3％、Ｌ−アスパラギ
ン酸２％及び臭化セチルトリメチルアンモニウム
0.05％を含有する３％α−アセトアミド桂皮酸水
溶液（アンモニア水でPH7.5に調整）100mlにけん
濁し、30℃で18時間反応させた。反応液中に生成
したＬ−フエニルアラニン量は下記第３表の通り
である。 尚、パラコツカス・デニトリフイカンス
IFO12442の凍結乾燥菌体は、グルコース１％、
リン酸二アンモニウム0.2％、酵母エキス１％、
コーンステイープリカー0.5％、リン酸一カリウ
ム0.1％、硫酸マグネシウム0.05％、硫酸マンガ
ン0.001％、硫酸第一鉄0.005％、塩化カルシウム
0.1％及びカラリン0.003％を含有する培地（PH
7.0）を用いて、30℃で24時間培養し、純水で洗
浄後、常法により調製した。

【表】 実施例 ４ バチルス・スフエリカスＮ−７株（微工研菌寄
第6746号）を実施例３と同一培地100mlを用い、
同一条件で培養し、集菌した。この菌体を、Ｌ−
アスパラギン酸２％、臭化セチルトリメチルアン
モニウム0.05％及び実施例３と同様に調製したパ
ラコツカス・デニトリフイカンスIFO12442の凍
結乾燥菌体0.3％を含む３％α−アセトアミド桂
皮酸水溶液（アンモニア水でPH7.5に調整）100ml
にけん濁し、30℃で反応させた。反応開始48時間
後、反応液中にはＬ−フエニルアラニン2.5ｇが
生成、蓄積した。この反応液を遠心分離して菌体
を除去し、上澄液を活性炭処理した後、濃縮し、
少量のメタノールを添加して粗結晶2.6ｇを得た。
この粗結晶を加熱しながら少量の水に溶解し、PH
5.5に調整後、メタノールを加え、析出晶ろ取す
ることによりＬ−フエニルアラニンの結晶2.0ｇ
を得た。 M.P.259℃ 〔α〕²⁰ _D＝−34.3゜（Ｃ＝１、水）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス属又はアルカリゲネス属に属し、α
   −アセトアミド桂皮酸からＬ−フエニルアラニン
   を生成せしめる能力を有する微生物の培養液、該
   培養液から得た菌体又は該菌体の処理物をα−ア
   セトアミド桂皮酸又はその塩に作用させ、生成し
   たＬ−フエニルアラニンを採取することを特徴と
   するＬ−フエニルアラニンの製造法。 ２ Ｌ−アミノ酸の存在下に微生物の培養液、該
   培養液から採取した菌体又は該菌体の処理物をα
   −アセトアミド桂皮酸又はその塩に作用させる特
   許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アス
   パラギン酸又はＬ−アラニンである特許請求の範
   囲第２項記載の製造法。 ４ Ｌ−アミノ酸及びＬ−フエニルアラニン・ト
   ランスアミナーゼの存在下に微生物の培養液、該
   培養液から得た菌体又は該菌体の処理物をα−ア
   セトアミド桂皮酸又はその塩に作用させる特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。 ５ Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アス
   パラギン酸又はＬ−アラニンである特許請求の範
   囲第４項記載の製造法。 ６ 微生物がα−アセトアミド桂皮酸からＬ−フ
   エニルアラニンを生成せしめる能力を有するバチ
   ルス・スフエリカスである特許請求の範囲第１
   項、第２項、第３項、第４項又は第５項記載の製
   造法。 ７ 微生物がα−アセトアミド桂皮酸からＬ−フ
   エニルアラニンを生成せしめる能力を有するアル
   カリゲネス・フエカリスである特許請求の範囲第
   １項、第２項、第３項、第４項又は第５項記載の
   製造法。