JPS6258710B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物を用いてアセトアミド桂皮酸か
らＬ―フエニルアラニンを製造する方法に関す
る。 Ｌ―フエニルアラニンは必須アミノ酸の１つで
あり、栄養上あるいは医薬上重要な物質である。
従来、微生物を用いるＬ―フエニルアラニンの製
法としては、桂皮酸を基質とするものが多く例え
ば桂皮酸を添加した培地に、アスパルターゼ活性
の強い細菌を培養して培地中にＬ―フエニルアラ
ニンを生成蓄積せしめる方法（特公昭40−15955
号）、あるいはスポロボロマイセス属に属する微
生物又はその処理物を桂皮酸に作用せしめる方法
（特開昭53−96388号）などが知られている。しか
しながら基質である桂皮酸は安価なものとは伝い
難く、そのため、上業的にはなお改善の余地があ
つた。 しかるに本発明者らは工業上、より有利なＬ―
フエニルアラニンの製造法について種々研究を重
ねた結果、全く意外にも微出物にα―アミノ酸の
合成中間体として容易かつ安価に製造されるアセ
トアミド桂皮酸をＬ―フエニルアラニンに転換せ
しめる能力のあることを見出し本発明を完成する
に至つた。 かかる知見に基づく本発明はアセトアミド桂皮
酸からＬ―フエニルアラニンを生成せしめる能力
を有する微生物の培養液、該培養液から採取した
菌体または該菌体の処理物をアセトアミド桂皮酸
に作用せしめ、生成したフエニルアラニンを採取
することを特徴とするＬ―フエニルアラニンの製
造法でありこの本発明方法を式で示せば下記の通
りである。 このようなアセトアミド桂皮酸からＬ―フエニ
ルアラニンへの転換反応は従来全く知られていな
い新規反応である。 本発明において使用する微生物は、アエロバク
ター属、シユードモナス属、アグロバクテリウム
属、フラボバクテリウム属、アルスロバクター
属、コリネバクテリウム属又はミクロコツカス属
に属し、アセトアミド桂皮酸からＬ―フエニルア
ラニンを生成せしめる能力を有するものがあげら
れる。具体的には例えば、アエロバクター・アエ
ロゲネス（Aerobacter aerogenes）125（微工研
菌寄第5756号）、シユードモナス・フルオレツセ
ンス（pseudomonas fluorescens）IF03081，ア
グロバクテリウム・クメフアシエンス
（Agrobacterium cumefaciens）22（微工研菌寄
第5754号）、フラボバクテリウム・フラベツセン
ス（Flavobacterium flavescens）236（微工研菌
寄第5753号）、フラボバクテリウム・ルテツセレ
ス（Flavobacterium Iutescens）IAM1667、ア
ルスロバクター・パラフイネウス（Arthrobacter
paraffineus）ATCC15591、コリネバクテリウ
ム・ハイドロカルボクラスタス
（Corynebacterium hydrocarboclastus）
ATCC15592、ミクロコツカス・デライトリフイ
カンス（Micrococcus deraitrificans）359（微工
研菌寄第5755号）等があげられる。これらの微生
物がアセトアミド桂皮酸をＬ―フエニルアラニン
に転換せしめ得ることは現在まで全く知られてい
ない。 上記微生物を培養するための培地としては、炭
素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む
通常の栄養培地が使用できる。炭素源としては例
えばグルコース、シユークロース、フラクトー
ス、マンノース、マニトール、キシロース、ガラ
クトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリ
ン等の糖若しくは糖アルコール、酢酸、クエン
酸、乳酸、フマール酸、マレイン酸等の有機酸、
メタノール、エタノール、プロパノール等のアル
コール類又は炭化水素等が使用できる。窒素源と
しては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アン
モニウム等の無機酸アンモニウム塩、酢酸アンモ
ニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモ
ニウム塩又は尿素、アンモニア水、アンモニアガ
ス等を使用することができる。有機栄養源として
は、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ
ーンステイープリカー、蛋白質加水分解物、アミ
ノ酸等が使用できる。又無機塩類としては例えば
硫酸第１鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、
リン酸第１鉄、リン酸１カリウム、リン酸２ナト
リウム、塩化ナトリウム等が使用できる。培養は
常法により実施すればよく、例えば培地のPHを５
〜10に調整し、菌株を接種した後、温度10〜60℃
で好気的に培養する。尚、培養にあたつて培地中
にアセトアミド桂皮酸を少量添加しておくことに
より得られる培養物または菌体のアセトアミド桂
皮酸からのＬ―フエニルアラニン生成能を高める
ことができ好ましい。この場合アセトアミド桂皮
酸の添加量は使用する微生物により多少相違する
が、通常0.01％以上、とりわけ0.1〜0.5％が好ま
しい。さらにこの添加したアセトアミド桂皮酸は
上記培養において唯一の炭素源、窒素源として用
いることもできる。 この様にして微生物を培養した後、得られる培
養液、該培養液から採取した菌体または該菌体の
処理物（例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕
物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌
体抽出物）をアセトアミド桂皮酸に作用させるこ
とによりＬ―フエニルアラニンを生成させること
ができる。基質であるアセトアミド桂皮酸はアン
モニウム塩の形で用いるのが好ましく、又遊離酸
もしくはアンモニウム塩以外の塩の形で用いる場
合は例えば塩化アンモニウム、略酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機酸アンモニウム、
又は酢酸アンモニウム、シユウ酸アンモニウム、
酒石酸アンモニウム等の有機酸アンモニウムを共
存させることにより好ましい結果を得ることがで
きる。 該反応において基質であるアセトアミド桂皮酸
の使用量は特に制限されないが通常0.1〜10％を
用いるのが好ましい。 反応は培養後の菌体を含む培養液中にアセトア
ミド桂皮酸を加えて実施してもよく、また培養液
から遠心分離、ろ過等により採取した菌体または
該菌体処理物をアセトアミド桂皮酸含有水性溶媒
中に加えて反応せしめてもよい。さらにこれらの
バツチ法の他、例えば微生物菌体をカラギーナン
ゲル法又はポリアクリルアミド法により固定化し
た固定化微生物をカラムに充填したのち基質含有
溶液を流下させる連続法により実施することをで
きる。アセトアミド桂皮酸のフエニルアラニンへ
の転換反応は上記いずれの場合にも水性媒質中10
〜60℃とりわけ30℃、PH５〜10とりわけ７〜８程
度で実施するのが好ましい。 尚、本発明において生菌体を用いてアセトアミ
ド桂皮酸のＬ―フエニルアラニンへの転換反応を
実施するにあたつては反応時間の短縮、或いはＬ
―フエニルアラニンの蓄積量の増加をはかるため
例えば界面活性剤又はＬ―アスパラギン酸、Ｌ―
アラニン等のＬ―アミノ酸を添加して当該反応を
実施することもでき、この様な場合には界面活性
剤は反応液に対し概ね0.0001〜0.01％Ｌ―アミノ
酸は概ね基質であるアセトアミド桂皮酸と当モル
量添加して実施するのが適当である。 かくして反応液中に生成蓄積したＬ―フエニル
アラニンの分離精製は、通常のイオン交換樹脂法
やその他の公知方法を組み合せて容易に行なうこ
とができる。 以下、実施例を挙げて本発明方法を具体的に説
明する。尚、実施例中Ｌ―フエニルアラニンの確
認及び定量は、ペーパークロマトグラフイーによ
るニンヒドリン発色位置、アミノ酸オートアナラ
イザー及びペーパークロマトグラムのニンヒドリ
ン発色スポツト抽出液の比色定量により行なつ
た。 実施例 １ グルコース0.5％、ポリペプトン１％、肉エキ
ス１％、酵母エキス、1.25％、塩化ナトリウム
0.5％及びアセトアミド桂皮酸0.2％を含有する培
地をPH7.0に調整し、これを500ml肩付振とうフラ
スコに100ml宛分注し、120℃で10分間蒸気滅菌し
た。 これに下記第１表に示す微生物を接種し30℃で
24時間培養した。この培養液より菌体を遠心分離
により集菌し、生理食塩水に懸濁液さらに遠心分
離により集菌した。該菌体を各々PH7.5に調整し
た基質溶液（アセトアミド桂皮酸ナトリウム塩、
濃度１％）100mlに加え、30℃で１日反応させ
た。結果を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 下記第２表に示す微生物を用い実施例１におい
てアセトアミド桂皮酸ナトリウム塩にかえてアセ
トアミド桂皮酸アンモニウム塩を用いる他は実施
例１と同様に行なつた。結果を第２表に示す。

【表】 実施例 ３ 下記第３表に示す微生物を用い、実施例１にお
いてアセトアミド桂皮酸ナトリウム塩に代えてア
セトアミド桂皮酸アンモニウム塩とＬ―アラニン
を用いる他は、実施例１と同様にして行なつた。
結果を第３表に示す。

【表】 実施例 ４ 下記第４表に示す微生物を用い、実施例１にお
いてアセトアミド桂皮酸ナトリウム塩に代えてア
セトアミド桂皮酸アンモニウム塩とＬ―アスパラ
ギン酸アンモニウム塩を用いる他は実施例１と同
様にして行なつた。結果は第４表に示す。

【表】 実施例 ５ アセトアミド桂皮酸３％、酵母エキス0.1％、
リン酸１カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.05
％を含有した培地をPH7.0に調整し、これを500ml
肩付振とうフラスコ100mlあて分注し、120℃で10
分間蒸気滅菌した。これにコリネバクテリウム・
ハイドロカルボクラスタスATCC15592を１白金
耳接種し、30℃で24時間培養した。この培養液か
ら菌体を実施例１と同様にして集菌した。この菌
体に、基質として１％のアセトアミド桂皮酸アン
モニウム塩とＬ―アラニンとを含む溶液（PH7.5
に調整）100mlを加え30℃で１日振とう培養して
反応させたところ反応液中には150mgのＬ―フエ
ニルアラニンが生成した。 実施例 ６ アルスロバクター・パラフイネウス
ATCC15591を用い、実施例２と同様に行なつた
ところ反応液100ml当り150mgのＬ―フエニルアラ
ニンが生成した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アエロバクター属、シユードモナス属、アグ
   ロバクテリウム属、フラボバクテリウム属、アル
   スロバクター属、コリネバクテリウム属あるいは
   ミクロコツカス属に属し、アセトアミド桂皮酸か
   らＬ―フエニルアラニンを生成せしめる能力を有
   する微生物の培養液、該培養液から採取した菌体
   または該菌体の処理物をアセトアミド桂皮酸もし
   くはその塩に作用せしめ、生成したＬ―フエニル
   アラニンを採取することを特徴とするＬ―フエニ
   ルアラニンの製造法。