JPH0446116B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌ−フエニルアラニンの製造法に関
し、更に詳しくは微生物を用いて桂皮酸メチルエ
ステルとアンモニアもしくはアンモニア供与体か
らＬ−フエニルアラニンを製造する方法に関す
る。

Ｌ−フエニルアラニンは必須アミノ酸の一つで
あり、栄養上あるいは医薬上重要な物質であるば
かりでなく、甘味物質の前駆体として産業上重要
な物質である。Ｌ−フエニルアラニンの製造法と
しては、Ｌ−フエニルアラニンアンモニア・リア
ーゼの存在下に、桂皮酸とアンモニウムイオンと
を反応させる方法が英国特許第1489468号、特開
昭56−26197号、特開昭53−96388号、特開昭59−
14796号などに開示されている。しかしこのＬ−
フエニルアラニンアンモニア・リアーゼを用いる
方法はＬ−フエニルアラニンの工業生産に適した
方法ではあるが、反応にかかわるＬ−フエニルア
ラニンアンモニア・リアーゼが基質である桂皮酸
により阻害を受け、その酵素活性がたちまち著し
く低下するので、反応液中の桂皮酸の濃度を極力
抑える必要がある。したがつて生成するＬ−フエ
ニルアラニンの濃度も低いものでしかない。

本発明者らは、Ｌ−フエニルアラニンの製造法
に関して鋭意研究を重ねた結果、水性媒質中有機
溶媒の存在下桂皮酸メチルエステルとアンモニア
もしくはアンモニア供与体にＬ−フエニルアラニ
ンアンモニア・リアーゼを生産する能力を有する
微生物を作用させることにより、Ｌ−フエニルア
ラニンが好都合に生産されることを見い出し、本
発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明のＬ−フエニルアラニンの製
造法はＬ−フエニルアラニンアンモニア・リアー
ゼを生産する能力を有する微生物の培養液、該培
養液から採取した菌体、もしくは該菌体の処理物
を桂皮酸メチルエステルとアンモニア、もしくは
アンモニア供与体に水及び水と二相を形成する有
機溶媒の存在下で作用させ、Ｌ−フエニルアラニ
ンを製造することを特徴とする。

本発明では反応の基質として、従来の桂皮酸そ
のものに代えてそのメチルエステルを用いるか
ら、酵素阻害が起り難く、従つて反応に際し基質
を高い濃度で仕込んで作業を進めることができ
る。

この場合、桂皮酸メチルエステルは、有機溶媒
の側に高濃度に分配が起り、水層での消費に伴つ
て漸時有機溶媒側から反応に供給されるようであ
る。

なお、エステルでない桂皮酸自体を反応基質と
し低アンモニア濃度で反応を行うに際し有機溶媒
を存在させることは特開昭59−14796号公報に記
載されているが、この場合未反応の桂皮酸の大部
分は有機溶媒相に存在するとしている。しかし、
高アンモニア濃度での反応の場合には本発明者ら
の試験によれば桂皮酸は殆ど水相に分配されてお
り、このため桂皮酸による阻害が発生し、本発明
と同じ様には反応が進行しなかつた。

さらにメチルエステルに代えてエチルエステル
を用いて同様に反応を試みたが何故かこの場合も
殆んど反応が進行しなかつた。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明に用いる微生物はＬ−フエニルアラニン
アンモニア・リアーゼ生産能を有する微生物であ
れば、いずれの微生物をも使用されるが、より具
体的に例示すれば、ロドトルラ・グルチニス
（Rho−dotorula glutinis）ATCC 10788があげ
られる。上記の微生物の培養液、該培養液から遠
心分離等により採取した菌体、または該菌体の処
理物（例えば、アセトン乾燥処理、洗浄処理、凍
結乾燥処理、菌体の酵素処理、超音波処理、菌体
自体をアルギン酸法、もしくはポリアクリルアミ
ド法により固定化したもの）を酵素源として使用
する。

本発明の方法の好ましい態様は上記の酵素源と
アンモニア、もしくはアンモニア供与体を１モル
濃度以上含有するPH８〜11、好ましくはPH９〜10
程度の水溶液と桂皮酸メチルエステルが0.05モル
濃度以上で行われ、水と二相を形成する有機溶媒
の添加量は水性媒質中0.7〜50％、好ましくは0.7
〜20％程度の範囲が良い。水と二相を形成する有
機溶媒としては、トルエン、ベンゼン、酢酸エチ
ルまたはヘキサンが挙げられる。反応温度は20〜
45℃、好ましくは35〜40℃で行なうのが好まし
い。反応時間は撹拌、流下等の方法、あるいは酵
素源の形態により異なるので一様ではないが、通
常10〜72時間程度で十分である。なお、界面活性
剤を添加することにより反応時間を短縮できる場
合がある。

反応液中に生成蓄積したＬ−フエニルアラニン
の精製は通常のイオン交換樹脂法や、その他の公
知の方法を組み合わせることにより、容易に行な
うことができる。

本発明方法によれば反応終了後の未反応の桂皮
酸メチルエステルは水には溶解し難く、容易に目
的とするＬ−フエニルアラニンと分離できる。

以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明
するが、該実施例中Ｌ−フエニルアラニンの定量
は液体クロマトによるアミノ酸分析法により行な
つた。

以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明
する。

実施例 １ 下記組成からなる培地Ａ（PH6.0）90mlを500ml
フラスコに入れ、オートクレーブにより120℃、
15分殺菌後、これに除菌フイルターを通して無菌
化した培地B10mlを加えた後、ロドトルラ・グル
チニスATCC 10788を接種して、30℃で48時間培
養を行なつた。培養終了後、培養液500mlを遠心
分離し、ロドトルラ・グルチニスの菌体を得た。

培地Ａ組成 ポリペプトン 10ｇ／ 酵母エキス ３ 〃 マルツエキス ３ 〃 KH₂PO₄ ３ 〃 （NH₄）₂SO₄ ３ 〃 Ｌ−フエニルアラニン 0.1 〃 （PH6.0） 培地Ｂ組成 ビオチン 200μｇ パントテン酸カルシウム 20mg 葉 酸 20μｇ イノシトール 100mg ニコチン酸 ４mg ｐ−アミノ安息香酸 ２mg ピリドキシン塩酸塩 ４mg リボフラビン ２mg チアミン塩酸塩 ４mg H₂O １ かくして得られた菌体を桂皮酸メチルエステル
0.5ｇ（３ミリモル）トルエン1.0ｇを含む８モル
濃度の塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（PH
9.52）10mlに入れ、更に水を加えて全量で20mlと
し、ゆるやかな撹拌を行ないながら30℃にて24時
間反応させた。その結果、反応液中にはＬ−フエ
ニルアラニンが0.18ｇ生成蓄積した。

比較例 １ 培地Ａ（PH6.0）100mlを500mlフラスコに入れ、
オートクレーブ殺菌処理後、前記実施例で用いた
菌を−白金耳接種して、30℃で40時間培養を行な
つた。培養終了後、培養液500mlを遠心分離にか
け、菌体を得た。実施例１のようにはトルエンを
加えることなく、この集菌菌体と桂皮酸メチルエ
ステル0.25ｇ（1.54ミリモル）とを、反応液中の
アンモニア濃度が４モル濃度になるように調整し
た塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（PH9.7）
10mlに加え、30℃にて40時間撹拌しながら反応を
行なつた。反応終了後、反応液中にはＬ−フエニ
ルアラニンが0.015ｇ生成した。

比較例 ２ 実施例１と同様にして得られたロドトルラ・グ
ルチニスの菌体を桂皮酸0.44ｇ（３ミリモル）を
含む４モル濃度の塩化アンモニウム−アンモニア
緩衝液（PH9.52）10mlに入れ、更に水を加えて全
量で20mlとし、緩やかな撹拌を行いながら30℃に
て24時間反応させた。その結果、反応液中にはＬ
−フエニルアラニンが0.05ｇ生成蓄積した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｌ−フエニルアラニンアンモニア・リアーゼ
   を生産する能力を有する微生物の培養液、該培養
   液から採取した菌体、もしくは該菌体の処理物
   を、水及び水と二相を形成する有機溶媒の存在下
   で桂皮酸メチルエステルとアンモニア、もしくは
   アンモニア供与体に作用させることを特徴とする
   Ｌ−フエニルアラニンの製造法。 ２ Ｌ−フエニルアラニンアンモニア・リアーゼ
   を生産する能力を有する微生物がロドトルラ・グ
   ルチニス（Rhodotorula glutinis，）ATCC
   10788である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ アンモニア供与体が塩化アンモニウム、硫酸
   アンモニウムまたは酢酸アンモニウムである特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ４ 水と二相を形成する有機溶媒がトルエン、ベ
   ンゼン、酢酸エチルまたはヘキサンである特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。