JPH0724587B2 - 酵素を利用した反応方法 - Google Patents
酵素を利用した反応方法Info
- Publication number
- JPH0724587B2 JPH0724587B2 JP57117825A JP11782582A JPH0724587B2 JP H0724587 B2 JPH0724587 B2 JP H0724587B2 JP 57117825 A JP57117825 A JP 57117825A JP 11782582 A JP11782582 A JP 11782582A JP H0724587 B2 JPH0724587 B2 JP H0724587B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- substrate
- enzyme
- concentration
- indole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は水相および有機溶媒相の２相系で実施する酵素
を利用した反応方法に関するものである。
を利用した反応方法に関するものである。
より詳しくは、基質が酵素の活性を劣化させる反応方法
において、該基質と混和し得るが水と混和しない有機溶
媒の存在下、水相中の該基質濃度を酵素の活性を劣化さ
せない濃度以下、いわゆる阻害濃度以下に保ちながら反
応を実施する方法に関するものである。
において、該基質と混和し得るが水と混和しない有機溶
媒の存在下、水相中の該基質濃度を酵素の活性を劣化さ
せない濃度以下、いわゆる阻害濃度以下に保ちながら反
応を実施する方法に関するものである。
酵素を利用する反応方法では酵素にとつて水が最良の反
応媒体であり、通常、反応は水媒体中で実施されてい
る。しかしながら、基質によつては水に対する溶解性が
低いものがあり、必ずしも最良の媒体とはならない。こ
のような基質では酵素を含有する水媒体中（以下、酵素
含有液と言う）での反応に必要な量の基質を確保し、反
応を円滑に進めるためにいくつかの方法がとられてい
る。例えば、有機溶媒、すなわち水および基質と混和す
る溶媒、または水と混和しないが基質と混和する有機溶
媒を用い反応を実施する例も知られている。即ち、特公
昭47−34153号公報では、インドールおよびセリンをア
クロバクテリウム属細菌を利用してＬ−トリプトフアン
を製造する方法において、反応促進剤としてトルエン、
ブタノール、アルコール、アセトンが用いられること、
また、特開昭47−43287号公報では水に溶解しない基質
であるデカンをデカン酸化酵素の存在下で酸化する際、
水および基質と混和するジメチルホルムアミドを用いる
こと、さらに特公昭56−45593号公報では、基質が酵素
含有液にほとんど不溶である酵素反応において、水と混
和しないが基質とは混和し得る有機溶媒の存在下に反応
を実施する方法を開示している。
応媒体であり、通常、反応は水媒体中で実施されてい
る。しかしながら、基質によつては水に対する溶解性が
低いものがあり、必ずしも最良の媒体とはならない。こ
のような基質では酵素を含有する水媒体中（以下、酵素
含有液と言う）での反応に必要な量の基質を確保し、反
応を円滑に進めるためにいくつかの方法がとられてい
る。例えば、有機溶媒、すなわち水および基質と混和す
る溶媒、または水と混和しないが基質と混和する有機溶
媒を用い反応を実施する例も知られている。即ち、特公
昭47−34153号公報では、インドールおよびセリンをア
クロバクテリウム属細菌を利用してＬ−トリプトフアン
を製造する方法において、反応促進剤としてトルエン、
ブタノール、アルコール、アセトンが用いられること、
また、特開昭47−43287号公報では水に溶解しない基質
であるデカンをデカン酸化酵素の存在下で酸化する際、
水および基質と混和するジメチルホルムアミドを用いる
こと、さらに特公昭56−45593号公報では、基質が酵素
含有液にほとんど不溶である酵素反応において、水と混
和しないが基質とは混和し得る有機溶媒の存在下に反応
を実施する方法を開示している。
これらの方法において、有機溶媒は基質を酵素含有液に
可溶化することをたすけ、反応促進剤として使用されて
いる。特に、後者の方法における有機溶媒の役割りは、
基質を貯蔵する機能、反応生成物を抽出する機能と共に
最も主要な機能として、この方法が水にほとんど溶けな
い基質の酵素反応を対象とするものであるため、基質を
有機溶媒に可溶化し、水相系へ円滑に溶解させ実質上水
中の基質濃度を飽和状態とする機能である。
可溶化することをたすけ、反応促進剤として使用されて
いる。特に、後者の方法における有機溶媒の役割りは、
基質を貯蔵する機能、反応生成物を抽出する機能と共に
最も主要な機能として、この方法が水にほとんど溶けな
い基質の酵素反応を対象とするものであるため、基質を
有機溶媒に可溶化し、水相系へ円滑に溶解させ実質上水
中の基質濃度を飽和状態とする機能である。
すなわち、この方法は前期機能により反応を促進するも
ので、水に殆んど溶けない基質の酵素反応を実施するに
は優れた方法と言える。
ので、水に殆んど溶けない基質の酵素反応を実施するに
は優れた方法と言える。
しかしながら、酵素を利用する反応方法では、基質濃度
が酵素に与える影響も考慮する必要がある。
が酵素に与える影響も考慮する必要がある。
すなわち、酵素を利用する反応においては、基質の濃度
が反応を進行させる酵素の活性を著しく低下させるもの
もある。例えば、アンスラニル酸を前駆体とし、酵素の
存在下トリプトフアンを製造する場合、水相中のアンス
ラニル酸の濃度が反応に用いる酵素の活性劣化に影響を
及ぼすこと（特開昭57−5694）、またＬ−セリンとピロ
カテコールよりエルビニア・ヘルビコラを酵素としてＬ
−DOPAを製造する際、その基質であるピロカテコールが
水溶媒中高濃度に存在すると酵素活性を劣化すること
（Agric.Biol.Clem,37巻、493−499;725〜735,1973）、
さらにインドールとセリンよりトリプトフアンを製造す
るさい、その基質であるインドールが合成酵素であるト
リプトフアン・シンセターゼの活性を劣化させること等
が知られている（U.Behrendt,The First European Cong
ress on Biotechnology,2/186〜2/189,1978）。
が反応を進行させる酵素の活性を著しく低下させるもの
もある。例えば、アンスラニル酸を前駆体とし、酵素の
存在下トリプトフアンを製造する場合、水相中のアンス
ラニル酸の濃度が反応に用いる酵素の活性劣化に影響を
及ぼすこと（特開昭57−5694）、またＬ−セリンとピロ
カテコールよりエルビニア・ヘルビコラを酵素としてＬ
−DOPAを製造する際、その基質であるピロカテコールが
水溶媒中高濃度に存在すると酵素活性を劣化すること
（Agric.Biol.Clem,37巻、493−499;725〜735,1973）、
さらにインドールとセリンよりトリプトフアンを製造す
るさい、その基質であるインドールが合成酵素であるト
リプトフアン・シンセターゼの活性を劣化させること等
が知られている（U.Behrendt,The First European Cong
ress on Biotechnology,2/186〜2/189,1978）。
したがつて、酵素を利用する反応において、基質が酵素
の活性を劣化させるような場合は、前記のような基質を
水に可溶化しようとする試みに対し、反応を円滑させる
ためには基質が酵素含有液に十分に溶解する場合であつ
ても、水中での基質濃度を活性の劣化が生じる濃度（以
下、阻害濃度と言う）範囲以外に低く抑えて反応を実施
する必要がある。このため、この種の反応の工業化にあ
たつては、水中での基質濃度を阻害濃度以下に保つよ
う、反応中基質濃度を連続的に分析する必要があるの
で、連続分析計の開発が必要となり、また基質を連続的
に装入するため、連続分析計と直結した原料装入装置が
必要となるなど、装置ならびに反応操作が煩雑になるこ
とが避けられなかつた。勿論、この種の反応では反応に
使用する酵素の使用量を大過剰にし、基質が水に混和す
る速度より反応で消費される速度の方を大きくすれば実
質上は基質の阻害濃度以下で反応できることは言うまで
もないが、実際的にこの様な反応方法は反応に使用する
酵素の使用量が極めて大量となり工業的には意味がな
い。
の活性を劣化させるような場合は、前記のような基質を
水に可溶化しようとする試みに対し、反応を円滑させる
ためには基質が酵素含有液に十分に溶解する場合であつ
ても、水中での基質濃度を活性の劣化が生じる濃度（以
下、阻害濃度と言う）範囲以外に低く抑えて反応を実施
する必要がある。このため、この種の反応の工業化にあ
たつては、水中での基質濃度を阻害濃度以下に保つよ
う、反応中基質濃度を連続的に分析する必要があるの
で、連続分析計の開発が必要となり、また基質を連続的
に装入するため、連続分析計と直結した原料装入装置が
必要となるなど、装置ならびに反応操作が煩雑になるこ
とが避けられなかつた。勿論、この種の反応では反応に
使用する酵素の使用量を大過剰にし、基質が水に混和す
る速度より反応で消費される速度の方を大きくすれば実
質上は基質の阻害濃度以下で反応できることは言うまで
もないが、実際的にこの様な反応方法は反応に使用する
酵素の使用量が極めて大量となり工業的には意味がな
い。
本発明者らは基質が酵素の活性を劣化させる、酵素を利
用する反応において、上記の問題点を解消するような反
応方法について鋭意検討した。その結果基質と混和する
水と混和しない有機溶媒を用い水溶液との２相系とし、
酵素含有溶液での基質濃度を実質的に阻害濃度以下に低
く抑えながら基質の酵素的転化を高収率で実施する本発
明の方法を見出した。
用する反応において、上記の問題点を解消するような反
応方法について鋭意検討した。その結果基質と混和する
水と混和しない有機溶媒を用い水溶液との２相系とし、
酵素含有溶液での基質濃度を実質的に阻害濃度以下に低
く抑えながら基質の酵素的転化を高収率で実施する本発
明の方法を見出した。
すなわち、本発明は、少なくとも１種の基質が酵素の活
性を劣化させる反応方法において、水と混和しないが基
質と混和しうる有機溶媒を、水相中の基質濃度が実質的
に酵素の活性阻害濃度以下になるように添加して反応す
ることを特徴とする酵素を利用した反応方法である。
性を劣化させる反応方法において、水と混和しないが基
質と混和しうる有機溶媒を、水相中の基質濃度が実質的
に酵素の活性阻害濃度以下になるように添加して反応す
ることを特徴とする酵素を利用した反応方法である。
本発明の方法によれば、基質を溶解した有機溶媒相と水
相との２相間における基質の分配比から水相系での基質
の濃度を所望の一定濃度以下に抑えることができる。
相との２相間における基質の分配比から水相系での基質
の濃度を所望の一定濃度以下に抑えることができる。
すなわち、基質による酵素活性の低下が認められる反応
では、水相系での基質濃度を常に低くおさえる必要があ
り、そのため酵素を含有する反応系に基質を継続的にま
たは断続的に何らかの方法で少量づつ添加する方法がと
られる。このような方法では基質を反応系へ添加する場
合、酵素含有液中の基質濃度を低く保つように行なう煩
雑な操作と装置が必要とされ問題である。
では、水相系での基質濃度を常に低くおさえる必要があ
り、そのため酵素を含有する反応系に基質を継続的にま
たは断続的に何らかの方法で少量づつ添加する方法がと
られる。このような方法では基質を反応系へ添加する場
合、酵素含有液中の基質濃度を低く保つように行なう煩
雑な操作と装置が必要とされ問題である。
しかし、本発明の方法では、基質と混和し水と混和しな
い有機溶媒を酵素含有液に添加することにより、酵素の
活性を低下させる基質を有機溶媒相にほとんど溶解さ
せ、有機溶媒相と水相間の基質の分配比より水相中の基
質濃度を実質的に阻害濃度以下に抑える。この際、反応
生成物が有機溶媒相、あるいは酵素含有相のいづれの相
に溶解または析出しても問題ない。
い有機溶媒を酵素含有液に添加することにより、酵素の
活性を低下させる基質を有機溶媒相にほとんど溶解さ
せ、有機溶媒相と水相間の基質の分配比より水相中の基
質濃度を実質的に阻害濃度以下に抑える。この際、反応
生成物が有機溶媒相、あるいは酵素含有相のいづれの相
に溶解または析出しても問題ない。
また、本発明の方法によれば、反応の進行と共に消費さ
れていく酵素含有液相中の基質は２相間の分配比にした
がい連続的にかつ所望のある一定濃度以下で供給され
る。なお、基質を溶解した有機溶媒は、水相中の基質濃
度が阻号濃度以下に抑えることができれば、一括して添
加しても、間欠的に添加しても、また連続的に添加して
もよい。撹拌等の操作により有機相と水相との接触面積
を変化させて、基質の移動速度を変化させることができ
る。
れていく酵素含有液相中の基質は２相間の分配比にした
がい連続的にかつ所望のある一定濃度以下で供給され
る。なお、基質を溶解した有機溶媒は、水相中の基質濃
度が阻号濃度以下に抑えることができれば、一括して添
加しても、間欠的に添加しても、また連続的に添加して
もよい。撹拌等の操作により有機相と水相との接触面積
を変化させて、基質の移動速度を変化させることができ
る。
本発明の方法に適用される酵素は一種または二種以上併
用していても良い。これらの酵素は少くとも一種が基質
により活性の劣化を示すものである。
用していても良い。これらの酵素は少くとも一種が基質
により活性の劣化を示すものである。
また、本発明に用いられる酵素類は、必ずしも純粋であ
る必要はなく、通常、それぞれの酵素の生産菌の培養液
から遠心分離などの方法により採取した生菌体、その凍
結菌体、または乾燥菌体でもよく、これらの菌体を磨
砕、自己消化、超音波処理などの処理により得られた菌
体処理物、さらにはこれらの菌体からの抽出物ならびに
該抽出物より得られる酵素等の粗製物が用いられる。
る必要はなく、通常、それぞれの酵素の生産菌の培養液
から遠心分離などの方法により採取した生菌体、その凍
結菌体、または乾燥菌体でもよく、これらの菌体を磨
砕、自己消化、超音波処理などの処理により得られた菌
体処理物、さらにはこれらの菌体からの抽出物ならびに
該抽出物より得られる酵素等の粗製物が用いられる。
本発明の方法は反応系に反応媒体、基質、酵素及びその
他必要な物の混合して反応を実施し、酵素の活性を低く
させることなく、より好ましい工業的な反応装置と反応
操作より良好な成績で目的物を取得することができる。
他必要な物の混合して反応を実施し、酵素の活性を低く
させることなく、より好ましい工業的な反応装置と反応
操作より良好な成績で目的物を取得することができる。
本発明の方法に使用される有機溶媒は基質と混和し、水
と混和しないものであれば良いが、実際上は反応に使用
する酵素に応じ、反応条件下で、溶媒自身が酵素の活性
劣化を起さないものを選ぶ必要がある。
と混和しないものであれば良いが、実際上は反応に使用
する酵素に応じ、反応条件下で、溶媒自身が酵素の活性
劣化を起さないものを選ぶ必要がある。
さらに有機溶媒は基質および酵素に適合したものを選択
し、その使用量を決定する。すなわち、反応に使用され
る酵素および該酵素の活性を劣化させる基質から反応条
件下における酵素含有液中の基質の阻害濃度を測定す
る。
し、その使用量を決定する。すなわち、反応に使用され
る酵素および該酵素の活性を劣化させる基質から反応条
件下における酵素含有液中の基質の阻害濃度を測定す
る。
次に酵素含有液と有機溶媒との２相間における基質の分
配比を求め、先きに測定した酵素含有液中での基質によ
る阻害濃度以下になるような有機溶媒中の基質濃度を設
定する。
配比を求め、先きに測定した酵素含有液中での基質によ
る阻害濃度以下になるような有機溶媒中の基質濃度を設
定する。
このようにして反応に供する有機溶媒中の基質濃度が決
まれば、反応液中の目標反応生成物蓄積濃度に応じたそ
れぞれの基質使用量から酵素含有液の使用量および有機
溶媒使用量を決めることができる。
まれば、反応液中の目標反応生成物蓄積濃度に応じたそ
れぞれの基質使用量から酵素含有液の使用量および有機
溶媒使用量を決めることができる。
したがつて、酵素含有液中での基質濃度を阻害濃度以下
に抑えることのできるものであれば、有機溶媒の選択、
およびその使用量の決定は自由に行なうことができる。
に抑えることのできるものであれば、有機溶媒の選択、
およびその使用量の決定は自由に行なうことができる。
次に本発明の方法をインドールとＬまたはDL−セリンを
基質とするＬ−トリプトフアンの製造により説明する。
基質とするＬ−トリプトフアンの製造により説明する。
従来、インドールとＬ−セリンよりトリプトフアン・シ
ンセターゼを用いるＬ−トリプトフアンの製造法では、
インドールがトリプトフアン・シンセターゼの活性を劣
化させる基質であるため、水中のインドール濃度を低く
抑えて反応を実施せねばならない。そのため、非イオン
性界面活性剤を用いるか、あるいは吸着樹脂を用いる方
法もある（Behrendt,The First European Congress on
Biotechnology,2/186〜2/189,1978）。
ンセターゼを用いるＬ−トリプトフアンの製造法では、
インドールがトリプトフアン・シンセターゼの活性を劣
化させる基質であるため、水中のインドール濃度を低く
抑えて反応を実施せねばならない。そのため、非イオン
性界面活性剤を用いるか、あるいは吸着樹脂を用いる方
法もある（Behrendt,The First European Congress on
Biotechnology,2/186〜2/189,1978）。
この方法ではインドールが界面活性剤により水相中でミ
セル状態となつており、本発明の方法である実質的に２
相間で実施される反応とは異つている。しかも反応に非
イオン性界面活性剤を用いているので、反応終了後反応
生成物との分離が困難で工業的な製造法とは言い難い。
セル状態となつており、本発明の方法である実質的に２
相間で実施される反応とは異つている。しかも反応に非
イオン性界面活性剤を用いているので、反応終了後反応
生成物との分離が困難で工業的な製造法とは言い難い。
また、吸着樹脂を用いる方法では樹脂によつては吸着さ
れたインドールが完全に溶離してこなかかつたり、ある
いは反応生成物が吸着される恐れがあり工業的に問題が
ある。
れたインドールが完全に溶離してこなかかつたり、ある
いは反応生成物が吸着される恐れがあり工業的に問題が
ある。
しかしながら、本発明の方法によりインドールを有機溶
媒に溶解しておき、セリンおよび酵素を含んだ水溶液に
加え２相の状態で反応を実施すれば、水相に溶解するイ
ンドールを低い濃度に保つことができ、しかも反応の進
行と共に消費されたインドールは有機溶媒相から自動的
に補給され反応は円滑に進行する。
媒に溶解しておき、セリンおよび酵素を含んだ水溶液に
加え２相の状態で反応を実施すれば、水相に溶解するイ
ンドールを低い濃度に保つことができ、しかも反応の進
行と共に消費されたインドールは有機溶媒相から自動的
に補給され反応は円滑に進行する。
この方法において、エシエリヒア・コリ変異株を含有す
る液において、インドールの阻害濃度はおよそ800ppmで
ある。
る液において、インドールの阻害濃度はおよそ800ppmで
ある。
従つて、インドールを水相中、この濃度以下に分配する
有機溶媒、例えば、トルエン、クロルベンゼン、クエン
酸エチル、メチルイソブチルケトン、アニソールなどを
選択して使用することができる。
有機溶媒、例えば、トルエン、クロルベンゼン、クエン
酸エチル、メチルイソブチルケトン、アニソールなどを
選択して使用することができる。
例えば、トルエンを選択した場合、20wt％濃度のインド
ール溶液を使用すれば、インドールはエシエリヒア・コ
リ変異株を含有する液中に720ppm以下で溶解し、前記の
阻害濃度以下で反応を実施することができる。
ール溶液を使用すれば、インドールはエシエリヒア・コ
リ変異株を含有する液中に720ppm以下で溶解し、前記の
阻害濃度以下で反応を実施することができる。
同様に、他の溶媒では、つぎのようなインドール濃度に
すれば反応条件下酵素含有液中のインドール濃度を800p
pm以下にすることができる。すなわち、クエン酸エチル
では40wt％、メチルイソブチルケトンでは50wt％、アニ
ソールでは30wt％およびモノクロベンゼンでは20wt％で
ある。
すれば反応条件下酵素含有液中のインドール濃度を800p
pm以下にすることができる。すなわち、クエン酸エチル
では40wt％、メチルイソブチルケトンでは50wt％、アニ
ソールでは30wt％およびモノクロベンゼンでは20wt％で
ある。
本発明の方法でＬ−トリプトフアン要求性エシエリヒア
・コリのトリプトフアナーゼ欠損変異株を用い炭素およ
び窒素源ならびに無機塩を含有する培地を用いてＬ−ト
リプトフアンの酵素的な製造を実施するには、まず好気
性の条件下28〜40℃、pH6〜８の条件でエシエリヒア・
コリ変異株を培養し、菌体をその培養液のまままたは培
地から分離してピリドキザールリン酸塩およびＬ−セリ
ン、無機物を溶解した溶液に懸濁させる。pH7.5〜9.5好
ましくはpH8〜９の条件下水と混和しないがインドール
と混和する有機溶媒に溶解したインドール溶液を一括、
あるいは連続的に加え20〜40℃の範囲で反応を行いＬ−
トリプトフアンを生成せしめる。
・コリのトリプトフアナーゼ欠損変異株を用い炭素およ
び窒素源ならびに無機塩を含有する培地を用いてＬ−ト
リプトフアンの酵素的な製造を実施するには、まず好気
性の条件下28〜40℃、pH6〜８の条件でエシエリヒア・
コリ変異株を培養し、菌体をその培養液のまままたは培
地から分離してピリドキザールリン酸塩およびＬ−セリ
ン、無機物を溶解した溶液に懸濁させる。pH7.5〜9.5好
ましくはpH8〜９の条件下水と混和しないがインドール
と混和する有機溶媒に溶解したインドール溶液を一括、
あるいは連続的に加え20〜40℃の範囲で反応を行いＬ−
トリプトフアンを生成せしめる。
この際用いられる有機溶媒としては、ベンゼン、トルエ
ン、クロルベンゼン、ニトロベンゼン、アセトフエノン
等の芳香族炭化水素およびその誘導体、炭素数６以上の
脂肪族エステル類、例えばｎ−ブチルアセテート、イソ
アミルアセテート、エチルブチレート、イソブチルアセ
テート等、炭素数６以上の脂肪族ケトン類、例えばメチ
ルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、ジイソプロ
ピルケトン、メチル−ｎ−アミルケトン、ジ−ｎ−プロ
ピルケトン等、クエン酸エステル類、例えばアセチルト
リエチルシトレート、アセチルトリブチルシトレート、
トリエチルシトレート、トリブチルシトレート等そのほ
か酒石酒エステル類、リンゴ酸エステル類が使用され
る。エーテル類としてアニソール等も使用される。
ン、クロルベンゼン、ニトロベンゼン、アセトフエノン
等の芳香族炭化水素およびその誘導体、炭素数６以上の
脂肪族エステル類、例えばｎ−ブチルアセテート、イソ
アミルアセテート、エチルブチレート、イソブチルアセ
テート等、炭素数６以上の脂肪族ケトン類、例えばメチ
ルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、ジイソプロ
ピルケトン、メチル−ｎ−アミルケトン、ジ−ｎ−プロ
ピルケトン等、クエン酸エステル類、例えばアセチルト
リエチルシトレート、アセチルトリブチルシトレート、
トリエチルシトレート、トリブチルシトレート等そのほ
か酒石酒エステル類、リンゴ酸エステル類が使用され
る。エーテル類としてアニソール等も使用される。
この際、有機溶媒の使用量は反応条件下での酵素含有液
相と有機溶媒相との間のインドール分配比と、インドー
ル使用量により決まるため、各種有機溶媒によりその使
用量は異なるが、通常は酵素含有液相中のインドール濃
度が800ppm以下、工業的に好ましくは750ppm以下になる
ように決めれば良い。
相と有機溶媒相との間のインドール分配比と、インドー
ル使用量により決まるため、各種有機溶媒によりその使
用量は異なるが、通常は酵素含有液相中のインドール濃
度が800ppm以下、工業的に好ましくは750ppm以下になる
ように決めれば良い。
この際、反応生成物であるＬ−トリプトフアンは酵素含
有液中に結晶として析出してくるが、この反応条件下で
は、反応の進行に何ら影響を与えない。
有液中に結晶として析出してくるが、この反応条件下で
は、反応の進行に何ら影響を与えない。
この製造法において、基質にDL−セリンを用いても何ら
差しつかえない。すなわち、この際はセリンラセマーゼ
としてシユードモナス・プテイーダ（MT−10182）の培
養菌体、またはシユードモナス・プンクタータ（MT−10
243）の培養菌体を用いることにより有機溶媒による活
性劣化を受けることなくＬ−トリプトフアンを高収率で
得ることができる。この化学的に合成されたDL−セリン
とインドールを２種の酵素の存在下、さらに工業的に生
産されている有機溶媒との２相系で何ら問題もなくＬ−
トリプトフアンを製造しうることは工業的に極めて重要
なことである。
差しつかえない。すなわち、この際はセリンラセマーゼ
としてシユードモナス・プテイーダ（MT−10182）の培
養菌体、またはシユードモナス・プンクタータ（MT−10
243）の培養菌体を用いることにより有機溶媒による活
性劣化を受けることなくＬ−トリプトフアンを高収率で
得ることができる。この化学的に合成されたDL−セリン
とインドールを２種の酵素の存在下、さらに工業的に生
産されている有機溶媒との２相系で何ら問題もなくＬ−
トリプトフアンを製造しうることは工業的に極めて重要
なことである。
以下、本発明の方法を実施例により更に詳しく説明す
る。
る。
実施例１ 撹拌機を備えた300mlフラスコにＬ−セリン9.27g、硫酸
アンモニウム3g、ピリドキザールリン酸10mg、水82.5g
を加え良くかきまぜる。濃アンモニア水でpH8.5に調整
し、35℃に昇温したのち、トリプトフアンシンセターゼ
を含有するエシエリヒア・コリ（MT−10242）培養菌体
の湿潤塊3gを加え、続いてインドール6.89gを溶解し
たアセチルトリブチルシトレート溶液68.9gを加える。4
8時間反応させたのち、反応液を５％苛性ソーダ水溶液
で全容が300mlになるように加え生成したＬ−トリプト
フアンを完全に溶解する。分液漏斗で水相と有機相とを
分液し水相の一部を遠心分離機にて遠心分離し、菌体を
沈降させる。上澄の清澄液を採取し、液体クロマトグラ
フイーによりＬ−トリプトフアンの濃度を分析し、生成
量を求めた。反応収率は96.5mol％対インドールであつ
た。
アンモニウム3g、ピリドキザールリン酸10mg、水82.5g
を加え良くかきまぜる。濃アンモニア水でpH8.5に調整
し、35℃に昇温したのち、トリプトフアンシンセターゼ
を含有するエシエリヒア・コリ（MT−10242）培養菌体
の湿潤塊3gを加え、続いてインドール6.89gを溶解し
たアセチルトリブチルシトレート溶液68.9gを加える。4
8時間反応させたのち、反応液を５％苛性ソーダ水溶液
で全容が300mlになるように加え生成したＬ−トリプト
フアンを完全に溶解する。分液漏斗で水相と有機相とを
分液し水相の一部を遠心分離機にて遠心分離し、菌体を
沈降させる。上澄の清澄液を採取し、液体クロマトグラ
フイーによりＬ−トリプトフアンの濃度を分析し、生成
量を求めた。反応収率は96.5mol％対インドールであつ
た。
また、有機溶媒の使用量を変え、水相中のインドール分
配比を変えて、その時のＬ−トリプトフアンの生成収率
を求めた。結果を表−１に示す。
配比を変えて、その時のＬ−トリプトフアンの生成収率
を求めた。結果を表−１に示す。
なお、有機溶媒を添加することなく、反応を実施したと
ころ、微生物含有液相中のインドール濃度は3000ppm
で、この時のＬ−トリプトフアン収率は47mol％であつ
た。この実験事実からも水と混和しない有機溶媒を添加
し、微生物含有液相中のインドール濃度を低くおさえる
効果がＬ−トリプトフアンの製造にとり極めて重要な事
であるかがわかる。すなわち、水溶媒のみで反応させる
と、この反応条件下での水相中のインドール濃度が3000
ppmであり、その時のＬ−トリプトフアンの収率が47mol
％対インドールであるにもかかわらず、有機溶媒とし
て、クエン酸ブチルを加え水相中のインドール濃度を79
0ppmにおさえることにより、Ｌ−トリプトフアンの収率
は95mol％対インドールと著しく向上している。なお、
水相中のインドール濃度を1070ppmと、800ppm以上にし
たところ、Ｌ−トリプトフアンの収率は、800ppm以下に
くらべ約10％も低下していることがわかる。
ころ、微生物含有液相中のインドール濃度は3000ppm
で、この時のＬ−トリプトフアン収率は47mol％であつ
た。この実験事実からも水と混和しない有機溶媒を添加
し、微生物含有液相中のインドール濃度を低くおさえる
効果がＬ−トリプトフアンの製造にとり極めて重要な事
であるかがわかる。すなわち、水溶媒のみで反応させる
と、この反応条件下での水相中のインドール濃度が3000
ppmであり、その時のＬ−トリプトフアンの収率が47mol
％対インドールであるにもかかわらず、有機溶媒とし
て、クエン酸ブチルを加え水相中のインドール濃度を79
0ppmにおさえることにより、Ｌ−トリプトフアンの収率
は95mol％対インドールと著しく向上している。なお、
水相中のインドール濃度を1070ppmと、800ppm以上にし
たところ、Ｌ−トリプトフアンの収率は、800ppm以下に
くらべ約10％も低下していることがわかる。
実施例２ トリプトフアン・シンセターゼを含有するエシエリヒヤ
・コリ（MT−10242）湿潤塊6.8g（固形分1.7g）およ
びセリンラセマーゼを含有するシユードモナス・プチー
ダ（MT−10182）湿潤塊3.4g（固形分0.85g）を水に懸
濁させ全体の体積を20mlとする。
・コリ（MT−10242）湿潤塊6.8g（固形分1.7g）およ
びセリンラセマーゼを含有するシユードモナス・プチー
ダ（MT−10182）湿潤塊3.4g（固形分0.85g）を水に懸
濁させ全体の体積を20mlとする。
次ぎにDL−セリン11.3g、硫酸アンモニウム6.0g、ピリ
ドキザールリン酸10mgおよび水66gを入れた300mlフラス
コを濃アンモニア水でpH8.5に調整し、先きに調整した
菌体懸濁液を入れる。
ドキザールリン酸10mgおよび水66gを入れた300mlフラス
コを濃アンモニア水でpH8.5に調整し、先きに調整した
菌体懸濁液を入れる。
35゜に保温したのち、インドール11.5gを溶解したトル
エン溶液57.2gを加え35℃、48時間反応させた。この反
応開始時の水相中のインドール濃度は720ppmであつた。
エン溶液57.2gを加え35℃、48時間反応させた。この反
応開始時の水相中のインドール濃度は720ppmであつた。
実施例１と同様な操作で反応生成物を分析したところ、
Ｌ−トリプトフアンが対インドール89.3mol％で得られ
ていた。
Ｌ−トリプトフアンが対インドール89.3mol％で得られ
ていた。
なお、水相中のインドール濃度の影響をみるため、トル
エン使用量を変えてその時のＬ−トリプトフアン収率を
しらべた。反応条件は前述と同じ条件で実施した。結果
を表２に示す。
エン使用量を変えてその時のＬ−トリプトフアン収率を
しらべた。反応条件は前述と同じ条件で実施した。結果
を表２に示す。
この結果からも水相中でのインドールによる阻害濃度が
800ppm付近にあることがわかる。すなわち、720ppm以下
のインドール濃度で反応を開始すればＬ−トリプトフア
ンの収率は約90mol％で得られるが、920ppmでは82mol％
と低下していることがわかる。
800ppm付近にあることがわかる。すなわち、720ppm以下
のインドール濃度で反応を開始すればＬ−トリプトフア
ンの収率は約90mol％で得られるが、920ppmでは82mol％
と低下していることがわかる。
実施例３ 実施例２と同様な操作でDL−セリンと、インドールをエ
シエリヒヤ・コリ（MT−10232）培養菌体およびシユー
ドモナス・プンクタータ（MT−10243）培養菌体の存在
下反応させた。
シエリヒヤ・コリ（MT−10232）培養菌体およびシユー
ドモナス・プンクタータ（MT−10243）培養菌体の存在
下反応させた。
このさい、有機溶媒として、メチルイソブチルケトンを
用い、反応開始時の水相中のインドール濃度が760ppmに
なる様にして反応を実施した。
用い、反応開始時の水相中のインドール濃度が760ppmに
なる様にして反応を実施した。
35℃、48時間後のＬ−トリプトフアンの反応収率は98.6
mol％対インドールであつた。
mol％対インドールであつた。
なお、水相中のインドール濃度の影響をみるため、メチ
ルイソブチルケトンの使用量を変え、その時のＬ−トリ
プトフアンの収率をしらべた。結果を表−３に示す。
ルイソブチルケトンの使用量を変え、その時のＬ−トリ
プトフアンの収率をしらべた。結果を表−３に示す。
このように、水相中のインドール濃度をメチルイソブチ
ルケトンを用いることにより800ppm以下におさえればＬ
−トリプトフアンが99mol％以上の収率で得られる。
ルケトンを用いることにより800ppm以下におさえればＬ
−トリプトフアンが99mol％以上の収率で得られる。
実施例４ 実施例２と同様にしてDL−セリンとインドールをエツシ
エルヒヤ・コリ（MT−10242）およびシユードモナス・
プテイーダ（MT−10182）の存在下反応させた。インド
ール溶媒として、アニソールを用い水相中のインドール
濃度が300ppm以下で反応した。
エルヒヤ・コリ（MT−10242）およびシユードモナス・
プテイーダ（MT−10182）の存在下反応させた。インド
ール溶媒として、アニソールを用い水相中のインドール
濃度が300ppm以下で反応した。
35℃、48時間後のＬ−トリプトフアンの収率は対インド
ール95mol％であつた。
ール95mol％であつた。
実施例５ 200ml反応槽に、DL−セリン20g、酢酸アンモン1.0g亜硫
酸ナトリウム0.2g、DETA0.1gおよびErwinia herbi cola
（ATCC 21434）培養液を加える。
酸ナトリウム0.2g、DETA0.1gおよびErwinia herbi cola
（ATCC 21434）培養液を加える。
培養液はErwinia herbicola菌株をＬ−チロシン 0.2
％、K2HPO4 0.2％、MgSO4 7H2O 0.1％、FeSO4 7H2O
2ppm、ピリドキシンHCl0.01％、グリセリン0.6％、コハ
ク酸0.5％、DL−メチオニン 0.1％、DL−アラニン 0.
2％、グリシン0.05％、Ｌ−フエニルアラニン 0.1％、
大豆蛋白加水分解物12ml中28℃で28時間通気培養したも
のを用いた。
％、K2HPO4 0.2％、MgSO4 7H2O 0.1％、FeSO4 7H2O
2ppm、ピリドキシンHCl0.01％、グリセリン0.6％、コハ
ク酸0.5％、DL−メチオニン 0.1％、DL−アラニン 0.
2％、グリシン0.05％、Ｌ−フエニルアラニン 0.1％、
大豆蛋白加水分解物12ml中28℃で28時間通気培養したも
のを用いた。
次ぎにピロカテコール0.7gを含むトルエン溶液を加え水
中でのピロカテコール濃度が3000ppm以下になる様にコ
ントロールし、37℃でpH8で48時間反応を行つた。Ｌ−D
OPAの蓄積量は、30g/であつた。
中でのピロカテコール濃度が3000ppm以下になる様にコ
ントロールし、37℃でpH8で48時間反応を行つた。Ｌ−D
OPAの蓄積量は、30g/であつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） 審判の合議体 審判長 鐘尾 宏紀 審判官 広田 雅紀 審判官 大高 とし子 (56)参考文献 特開 昭49−108286（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】少なくとも１種の基質が酵素の活性を劣化
させる反応方法において、水と混和しないが基質と混和
しうる有機溶媒を、水相中の基質濃度が実質的に酵素の
活性阻害濃度以下になるように添加して反応することを
特徴とする酵素を利用した反応方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57117825A JPH0724587B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 酵素を利用した反応方法 |
| GB08333899A GB2151634B (en) | 1982-07-08 | 1983-12-20 | Enzyme reaction method for producing l-tryptophan |
| CA000443995A CA1207689A (en) | 1982-07-08 | 1983-12-22 | Enzyme reaction |
| AU22801/83A AU564178B2 (en) | 1982-07-08 | 1983-12-22 | Improvement in enzyme reactions to prevent enzyme activity being degraded |
| CH696983A CH659824A5 (de) | 1982-07-08 | 1983-12-29 | Verfahren zur verhinderung der herabsetzung der aktivitaet eines enzyms in einer enzymreaktion in waessriger phase. |
| DE19833347617 DE3347617C2 (de) | 1982-07-08 | 1983-12-30 | Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms |
| NL8304495A NL8304495A (nl) | 1982-07-08 | 1983-12-30 | Werkwijze voor het verbeteren van een enzymreactie. |
| FR8321118A FR2557590B1 (fr) | 1982-07-08 | 1983-12-30 | Procede pour eviter la degradation de l'activite d'une enzyme par un substrat en phase aqueuse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57117825A JPH0724587B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 酵素を利用した反応方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5911187A JPS5911187A (ja) | 1984-01-20 |
| JPH0724587B2 true JPH0724587B2 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=14721171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57117825A Expired - Lifetime JPH0724587B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 酵素を利用した反応方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0724587B2 (ja) |
| AU (1) | AU564178B2 (ja) |
| CA (1) | CA1207689A (ja) |
| CH (1) | CH659824A5 (ja) |
| DE (1) | DE3347617C2 (ja) |
| FR (1) | FR2557590B1 (ja) |
| GB (1) | GB2151634B (ja) |
| NL (1) | NL8304495A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5085991A (en) * | 1987-09-25 | 1992-02-04 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Process of preparing purified aqueous indole solution |
| JPH1142097A (ja) * | 1997-01-09 | 1999-02-16 | Daicel Chem Ind Ltd | Ｄ−トリプトファンの製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT978495B (it) * | 1973-01-26 | 1974-09-20 | Antonimi E | Procedimento per condurre reazio ni enzimatiche mediante l uso di sistemi bifasici acquoso organici |
| US4102744A (en) * | 1976-12-20 | 1978-07-25 | Exxon Research & Engineering Co. | Two phase fermentation |
| JPS55135595A (en) * | 1979-04-03 | 1980-10-22 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Preparation of dipeptide |
| NL8103168A (nl) * | 1981-07-01 | 1983-02-01 | Tno | Werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatische reaktie. |
-
1982
- 1982-07-08 JP JP57117825A patent/JPH0724587B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-12-20 GB GB08333899A patent/GB2151634B/en not_active Expired
- 1983-12-22 CA CA000443995A patent/CA1207689A/en not_active Expired
- 1983-12-22 AU AU22801/83A patent/AU564178B2/en not_active Expired
- 1983-12-29 CH CH696983A patent/CH659824A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-30 NL NL8304495A patent/NL8304495A/nl not_active Application Discontinuation
- 1983-12-30 FR FR8321118A patent/FR2557590B1/fr not_active Expired
- 1983-12-30 DE DE19833347617 patent/DE3347617C2/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2151634B (en) | 1988-06-15 |
| CH659824A5 (de) | 1987-02-27 |
| GB2151634A (en) | 1985-07-24 |
| FR2557590A1 (fr) | 1985-07-05 |
| DE3347617A1 (de) | 1985-07-11 |
| DE3347617C2 (de) | 1986-08-28 |
| FR2557590B1 (fr) | 1988-03-04 |
| NL8304495A (nl) | 1985-07-16 |
| GB8333899D0 (en) | 1984-02-01 |
| JPS5911187A (ja) | 1984-01-20 |
| AU564178B2 (en) | 1987-08-06 |
| AU2280183A (en) | 1985-06-27 |
| CA1207689A (en) | 1986-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4080259A (en) | Process of preparing L and D α-amino acids by enzyme treatment of DL-α-amino acid amide | |
| Ståhl et al. | The synthesis of a D-amino acid ester in an organic media with α-chymotrypsin modified by a bio-imprinting procedure | |
| JP2003528572A (ja) | アスパルテートでの酵素トランスアミノ化によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法 | |
| EP0527553A1 (en) | Process for producing r(-)-mandelic acid and derivative thereof | |
| US5591613A (en) | Method for the preparation of D-arginine and L-ornithine | |
| Gibson et al. | The partial purification and properties of indole-3-glycerol phosphate synthetase from Escherichia coli | |
| EP0120208B1 (de) | Mikrobiologisch hergestellte L-Phenylalanin-Dehydrogenase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung | |
| JPH0724587B2 (ja) | 酵素を利用した反応方法 | |
| Halpin et al. | Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies of mandelate metabolism in whole bacterial cells and in isolated, in vivo cross-linked enzyme complexes | |
| GB2152503A (en) | Process for producing L-phenylalanine | |
| Presecan et al. | Preparation of 15N-labeled l-alanine by immobilized l-alanine dehydrogenase: Differential incorporation of 15N in bacterial proteins | |
| Shiio et al. | Altered prephenate dehydratase in phenylalanine-excreting mutants of Brevibacterium flavum | |
| JPH01320991A (ja) | Ｄ−ホモフエニルアラニン類の製造方法 | |
| JPS6224076B2 (ja) | ||
| KR870001150B1 (ko) | 효소 반응의 개량방법 | |
| US5085991A (en) | Process of preparing purified aqueous indole solution | |
| GB1577087A (en) | Enzyme preparation having l-amino acyl amidase activity | |
| JPH0471906B2 (ja) | ||
| JPH0751075B2 (ja) | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 | |
| JPH0446116B2 (ja) | ||
| EP1311700B1 (en) | Production process of l-phenylalanine derivatives by microorganisms | |
| JPS6296095A (ja) | 酵素によるアセトアミド桂皮酸のｌ−フエニルアラニンへの転化方法 | |
| JP2674076B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造方法 | |
| JPS5914796A (ja) | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 | |
| CA1335970C (en) | Process for preparing purified aqueous indole solution |