DE3347617A1

DE3347617A1 - Verfahren zur verhinderung der verminderung der aktivitaet eines enzyms

Info

Publication number: DE3347617A1
Application number: DE19833347617
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Sagamihara Kanagawa Kawashima; Nobuyuki Kamakura Kanagawa Kawashima; Syosuke Yokohama Kanagawa Nagai; Masaharu Mobara Chiba Ohoka; Takao Fujisawa Kanagawa Takano; Yukihiro Zushi Kanagawa Yoshikawa
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1982-07-08
Filing date: 1983-12-30
Publication date: 1985-07-11
Also published as: CH659824A5; DE3347617C2; AU2280183A; GB8333899D0; GB2151634A; NL8304495A; FR2557590A1; JPS5911187A; GB2151634B; CA1207689A; FR2557590B1; AU564178B2; JPH0724587B2

Description

G 21 28-K 71

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Verbesserung einer Enzymreaktion in wässriger Phase. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat bei einer Reaktion unter Verwendung des Enzyms, bei dem ein organisches Lösungsmittel, das mit dem Substrat mischbar, jedoch mit Wasser nicht mischbar ist, zu dem Reaktionssystem gefügt wird, und die Reaktion durchgeführt wird, während die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase unter der Konzentration gehalten wird, bei der die Aktivität des Enzyms inhibiert wird (sogenannte inhibitorische Konzentration) . '

Bei einer Reaktion unter Verwendung eines Enzyms ist Wasser das beste Reaktionsmedium für das Enzym, und daher wird eine derartige Reaktion gewöhnlich in einer wässrigen Phase durchgeführt. Einige Substrate weisen jedoch eine geringe Löslichkeit in Wasser auf. Im Falle der Verwendung eines derartigen Substrats werden verschiedene Maßnahmen getroffen, um eine Substratmenge sicherzustellen, die für die Reaktion in einer wässrigen Phase, die das Enzym enthält, erforderlich ist (manchmal als Enzym enthaltende Flüssigkeit bezeichnet), und die Reaktion wird glatt

go durchgeführt. Beispielsweise ist es bekannt, die Reaktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels durchzuführen. Die JP-Patentveröffentlichung 34153/1972 beschreibt, daß Toluol, Butanol, Ethanol oder Aceton als Reaktionspromotor bei einem Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und Serin unter Anwendung eines Bakteriums voin Genus Aerobacterium verwendet wird. Die GB-Patentveröffentlichung 13134 beschreibt, daß bei der Oxidation von Decan ein wasserunlösliches Substrat

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in Anwesenheit eines Decan-oxidierenden Enzyms, mit Wasser mischbarem Dimethylformamid und dem Substrat verwendet wird.

Bei diesen Verfahren werden die organischen Lösungsmittel verwendet, um die Auflösung der Substrate in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit zu unterstützen und die Reaktionen zu fördern.

Bei Reaktionen unter Verwendung von Enzymen sollte die Wirkung der Konzentration eines Substrats auf ein Enzym in Betracht gezogen werden. Wenn bei einer Enzymreaktion die Konzentration eines Substrats in der Reaktionsphase groß ist/ so kann die Aktivität des Enzyms beträchtlich unter Verzögerung der Reaktion verringert werden. Es ist beispielsweise bekannt, daß bei der Erzeugung von Tryptophan in Anwesenheit eines Enzyms,- unter Verwendung von Anthranilsäure als Vorläufer die Konzentra-

tion der Anthranilsäure in der wässrigen Phase die Verminderung der Aktivität des bei der Reaktion verwendeten Enzyms beeinflußt (US-PS 4 363 875) ; daß bei der Produktion von L-DOPA aus L-Serin und Brenzkatechin unter Verwendung von Erwinia herbicola die Anwesenheit von Brenzkatechin .als ein Substrat in hoher Konzentration in der wässrigen Phase die Enzymaktivität verringert (Agric. Biol, Chem., Band 37, 493-499; 725-735, 1973); und daß bei der Erzeugung von Tryptophan aus Indol und Serin, Indol als eines der Substrate,die Aktivität der Tryptophansythetase verringert (U. Behrendt, The First European Congress on Biotechnology, 2/186-2/189, 1978).

Dementsprechend sollte, falls in einer Reaktion unter Verwendung eines Enzyms ein Substrat die Aktivität des Enzyms verringern kann, die Reaktion unter Halten der Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter der Konzentration durchgeführt werden, bei der die Aktivität des Enzyms vermindert wird (die inhibitorische Konzentration), um die Reaktion glatt verlaufen zu lassen,

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selbst wenn das Substrat in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit vollständig löslich ist. Um Reaktionen dieses Typs industriell durchführen zu können, muß ein kontinuierlicher Analysator zur kontinuierlichen Analyse der Substratkonzentration während der Reaktion entwickelt werden, um die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter der inhibitorischen Konzentration zu halten. Darüber hinaus ist zur Beschickung des Substrats in kontinuierlicher Weise ein Materialbeschickungssystem erforderlich, das direkt mit dem kontinuierlichen Analysator verbunden ist. Auf diese Weise werden die Vorrichtung und der Reaktionsbetrieb unvermeidlich kompliziert. Wenn bei Reaktionen dieser Art ein großer Enzymüberschuß verwendet wird und die Geschwindigkeit des Substratverbrauchs der Reaktion größer ist als die Mischgeschwindigkeit des Substrats mit Wasser, so kann die Reaktion selbstverständlich bei einer wesentlich geringeren Substratkonzentration als die inhibitorische Konzentration durchgeführt werden. Da jedoch die Menge des bei der Reaktion verwendeten Enzyms in der Praxis sehr groß ist, weist eine derartige Verfahrensweise keine industrielle Bedeutung auf.

Aus Indol durch eine Enzymreaktion oder Fermentationsreaktion erhaltenes Tryptophan sollte günstig frei von dem nicht-umgesetzten Indol sein, wenn es in Arzneimitteln oder Nahrungsmxttelzusätzen verwendet wird, da das nicht-umgesetzte Indol einen ihm zu eigenen unangenehmen Geruch abgibt.

Bisher war die Dampfdestillation als Methode zur Entfernung des nicht-umgesetzten Indols aus der Reaktionslösung bei der Herstellung von L-Tryptophan aus Indol durch Enzymreaktion bekannt (JP-Patentveröffentlichung 800/1982).

Q5 Da jedoch der Dampfdruck von Indol geringer als der von Wasser ist, ist eine große Dampfeenge zur Entfernung von Indol durch Destillation erforderlich. Dies trägt zu den Energiekosten bei, und eine derartige Verfahrensweise ist

gewerblich nicht durchführbar. Es besteht daher ein starkes Bedürfnis zur Lösung diese Problems.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion.

Erfindungsgemäß wird dieses Ziel durch ein Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion in wässriger Phase erreicht, bei dem ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, jedoch mit dem Substrat mischbar ist, in dem Reaktionssystem anwesend ist, wodurch die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase unter die Konzentration verringert wird, bei der die Aktivität des Enzyms wesentlich inhibiert wird.

Im folgenden sind Beispiele für Ausführungsformen der vorstehenden Verfahrensweise gemäß der Erfindung aufgeführt:

A) Ein Verfahren, das darin besteht, eine Enzymreaktion durchzuführen, unter Verwendung von Indol als ein Substrat in einer wässrigen Phase, in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels, das mit Wasser nicht mischbar, jedoch mit Indol mischbar ist, Gewinnen des organischen Lösungsmittels aus dem Reaktionsgemisch und Entfernen des Enzyms, Extrahieren des nicht-umgesetzten Indols aus der resultierenden wässrigen L-Tryptophanlösung, wobei das organische Lösungsmittel wiedergewonnen wird und erneute Verwendung des Extrakts in der Reaktion; und

B) eine Methode, die darin besteht, eine Enzynreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat in einer wässrigen Lösung in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels durchzuführen, das mit Wasser nicht-

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mischbar, jedoch mit Indol mischbar ist und das nicht-umgesetzte Indol als eine organische Lösungsmittelschicht aus dem Reaktionsgemisch abzutrennen.

Das Grundprinzip der Erfindung liegt darin, daß die Konzentration eines Substrats in einer wässrigen Phase unter einer bestimmten festgesetzten Konzentration entsprechend dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen einer organischen Lösungsmittelphase,in der das Substrat gelöst ist, und der wässrigen Phase, gehalten wird.

Im allgemeinen muß bei einer Reaktion, bei der die Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat verringert wird, die Konzentration des Substrats in einer wässrigen Phase

l§ immer niedriggehalten werden, und für diesen Zweck wird eine Methode angewendet, bei der bis zu einem gewissen Ausmaß das Substrat nach und nach entweder kontinuierlich oder intermittierend zu dem das Enzym enthaltenden Reaktionssystem gefügt wird. Diese Methode erfordert jedoch eine komplizierte Verfahrensweise und Vorrichtung zur Steuerung der Reaktion derart, daß, wenn das Substrat zu dem Reaktionsmedium gefügt wird, dessen Konzentration in dar Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedriggehalten wird.

Im Gegensatz hierzu wird gemäß der erfindungsgemäßen Verfahrensweise ein mit einem Substrat mischbares, jedoch mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel zu der Enzym enthaltenden Flüssigkeit zur fast vollständigen

eg Auflösung des Substrats in der organischen Lösungsmittelphase gefügt. Als Ergebnis kann die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase im wesentlichen unter der inhibitorischen Konzentration entsprechend dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen der organischen

gg Lösungsmittelphase und der wässrigen Phase gehalten werden. Hierbei ist es unbeachtlich, ob das Reaktionsprodukt in der organischen Lösungsmittelphase oder der Enzym enthaltenden Phase aufgelöst oder ausgefällt ist.

EAD ORIGINAL

Nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wird das Substrat in der Enzym enthaltenden flüssigen Phase kontinuierlich aus der organischen Lösungsmittelphase je nach dem Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen den beiden Phasen im Verlauf der Reaktion und mit dem Verbrauch des Substrats zugeführt. Das organische Lösungsmittel zur Auflösung des Substrats kann auf einmal oder intermittierend oder kontinuierlich zugesetzt werden, solange die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase niedrige.rgehalten werden kann als die inhibitor!sehe Konzentration. Falls erforderlich, kann die Geschwindigkeit der Bewegung des Substrats durch Verändern der Kontaktfläche zwischen der organischen Phase und der wässrigen Phase durch einen Arbeitsgang, wie Rühren, verändert werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können Enzyme allein oder als ein Gemisch von zwei oder mehreren verwendet werden. Aber es sollte mindestens ein Enzym von einem Typ sein, dessen Aktivität durch ein Substrat verringert wird, wenn es bei einer Enzymreaktion verwendet wird, die nach einer üblichen Verfahrensweise durchgeführt wird.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme müssen nicht immer rein sein, sondern es können auch rohe sein. Beispielsweise können die Enzyme lebende Zellen sein, die aus einer Kulturbrühe eines Enzym erzeugenden Mikroorganismus durch Zentrifugieren usw. gesammelt wurden, Zellen, die durch Frieren oder Trocknen der lebenden Zellen erhalten wurden; behandelte Produkte dieser Zellen, erhalten durch Behandlungen, wie Vermählen, Selbst-Digestion und Ultraschallbehandlung, Extrakte dieser Zellen und aus den Extrakten erhaltene Enzyme.

Das bei der erfindungsgemäßen Verfahrensweise verwendete organische Lösungsmittel ist mit den Substraten nischbar, jedoch mit Wasser nicht mischbar. In der Praxis ist es notwendig, je nach den verwendeten Enzymen, solche orga-

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nische Lösungsmittel auszuwählen, die die Aktivitäten der Enzyme unter den Reaktionsbedingungen nicht verringern.

Ein organisches Lösungsmittel, das für ein bestimmtes Substrat und ein Enzym anpaßbar ist, wird ausgewählt, und seine Menge wird wie nachstehend gezeigt bestimmt. Speziell werden ein Enzym und ein umzusetzendes Substrat verwendet, und die inhibitorische Konzentration des Substrats in einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter den Reaktionsbedingungen wird gemessen. Anschließend wird das Verteilungsverhältnis des Substrats zwischen der Enzym enthaltenden Flüssigkeit und dem organischen Lösungsmittel bestimmt und die Konzentration des Substrats in dem organischen Lösungsmittel, die niedriger als die vorstehend gemessene inhibitorische Konzentration, wird vorgeschrieben. Wenn die Konzentration des Substrats in dem bei der Reaktion zu verwendenden organischen' Lösungsmittel wie vorstehend bestimmt ist, kann die Menge der Enzym enthaltenden Flüssigkeit und die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels aus der verwendeten Substratmenge je nach der Konzentration des gewünschten, in dem Reaktionsgemisch akkumulierten Reaktionsprodukts bestimmt werden.

Daher kann, solange die Konzentration des Substrats in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedriger gehalten werden kann, als die inhibierende Konzentration, das organische Lösungsmittel frei gewählt werden, und seine Menge kann frei bestimmt werden.

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise wird nachstehend im Hinblick auf die Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Indol und L- oder DL-Serin als Substrate beschrieben. Da bei der Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin unter Verwendung von Tryptophansynthetase Indol die Aktivität von Tryptophansynthetase verringert, muß die Reaktion durchgeführt werden, unter

BAD ORIGJNAk

Niedrighalten der Indolkonzentration in Wasser. Aus diesem Zwecke wurden nichtionische oberflächenaktive Mittel oder Adsorbensharze verwendet (Behrendt, The First European Congrass in Biotechnology, 2/186-189, 1978). Die Reaktion in Anwesenheit eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels unterscheidet sich jedoch im Mechanismus von der Reaktion entsprechend der erfindungsgemäßen Verfahrensweise, die im wesentlichen zwischen zwei Phasen durchgeführt wird, da Indol in der Form einer Micelle in der wässrigen Phase durch den Einfluß des oberflächenaktiven Mittels vorliegt. Darüber hinaus ist diese Verfahrensweise gewerblich nicht durchführbar, da es schwierig ist, das oberflächenaktive Mittel von dem Reaktionsprodukt nach der Reaktion abzutrennen. Die Verfahrens- weise unter Einbeziehung der Anwendung eines Adsorbensharzes ist industriell nachteilhaft, da bei einigen Adsorbensharzen daran adsorbiertes Indol nicht vollständig abzutrennen ist oder das Reaktionsprodukt an diesen Harzen adsorbiert werden kann.

Wenn im Gegensatz dazu eine Lösung von Indol in einem organischen Lösungsmittel zu einer wässrigen Lösung gefügt wird, die Serin und das Enzym enthält, und die Reaktion in zwei Phasen durchgeführt wird, so kann die Konzentration des in der wässrigen Phase gelösten Indols niedriggehalten werden und Indol wird automatisch aus der organischen Lösungsmittelphase im Verlauf des Verbrauchs während der Reaktion zugeführt. Daher verläuft die Reaktion glatt.

In einer Flüssigkeit, die einen Mutantenstamm von Escherichia coli enthält, ist die inhibitorisehe Konzentration des Indols etwas 800 ppm. Beispiele für organische Lösungsmittel, die Indol in niedrigerer Konzentration als die inhibitorische Konzentration in die wässrige Phase freisetzen, sind Toluol, Chlorbenzol, Ethylcitrat, Methylisobuty!keton und Anisol. Wird beispielsweise eine 20 Gew.-% Toluollösung von Indol verwendet,

so löst sich Indol in einer Konzentration von weniger als 720 ppm in einer einen Mutantenstamm von Escherichia coli enthaltenden Flüssigkeit, und die Reaktion kann durchgeführt werden, während die Konzentration an Indol niedrigergehalten wird als die vorstehende inhibitorische Konzentration. Die Konzentration an Indol in einer Enzym enthaltenden Flüssigkeit unter den Reaktionsbedingungen kann niedriger als 800 ppm gehalten werden, wenn die Konzentration von Indol in anderen Lösungsmitteln 40 Gew.-% für Ethylcitrat, 50 Gew.-% für Methylisobutylketon, 30 Gew.-% für Anisol und 20 Gew.-% für Monochlorbenzol,

ist.

Gemäß einer typischen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrensweise kann L-Tryptophan hergestellt werden durch Kultur eines Mutantenstammes von Escherichia coli durch Unterwerfen eines Kulturmediums, das einen Tryptophanase-Mangel-Mutantenstamm von L-Tryptophan erforderndem Escherichia coli, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, anaeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 28 bis 40 C und einem pH Wert von 6 bis 8, Suspendieren der Mikrobenzellen entweder wie in der Kulturbrühe oder nach dem Abtrennen aus dem Kulturmedium, in einer Pyridoxalphosphat, L-Serin und anorganisches Material enthaltenden Lösung, anschließenden Zusatz einer Lösung von Indol in einem mit Indol mischbaren, jedoch mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels auf einmal oder kontinuierlich, bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5, vor-

zugsweise 8 bis 9, und Durchführen der Reaktion bei einer Temperatur von 20 bis 40°C.

Beispiele für das organische Lösungsmittel, das zu diesem Zeitpunkt verwendet werden kann, umfassen aromatische Kohlenwasserstoffe und ihre Derivate, wie Benzol, Toluol, Chlcrbenzol, Nitrobenzol und Acetophenon; aliphatische Ester mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, wie n-Butylacetat, Isoamylacetat, Ethylbutyrat und Isobutylacetat; aliphati-

BAD

sehe Ketone mit mindestens 6 Kohlenstoffatomen, wie Methylisobutylketon, Diisobutylketon, Diisopropylketon, Methyln-amylketon und Di-n-propylketon; Zitronensäureester, wie Acetyltriethyleitrat, Acetyltributyleitrat, Triethylcitrat und Tributylcitrat; Weinsäureester; Apfelsäureester; und Ether, wie Anisol.

Die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittel variiert je nach seiner Art, da sie bestimmt wird durch das Verteilungsverhältnxs von Indol zwischen einer Enzym enthaltenden flüssigen Phase und einer organischen Phase unter den Reaktionsbedingungen und der verwendeten Indolmenge. Gewöhnlich wird sie derart bestimmt, daß die Indolkonzentration in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit niedriger als 800 ppm, industriell bevorzugt niedriger als 750 ppm, beträgt.

L-Tryptophan, bei dem es sich um das Reaktionsprodukt handelt, fällt in Form von Kristallen in der Enzym enthaltenden Flüssigkeit aus. Unter den angewendeten Reaktionsbedingungen beeinflussen diese Kristalle überhaupt nicht das Fortschreiten der Reaktion.

Bei dem vorstehenden Verfahren kann DL-Serin als Substrat verwendet werden. In diesem Falle kann durch Verwendung kultivierter Zellen von Pseudomonas putida (MT-10182) oder Pseudomonas punctata (MT-10243) als Serinracemase, L-Tryptophan in hohen Ausbeuten erhalten werden, ohne die Aktivität des Enzyms durch das organische Lösungsmittel zu vermindern.

Es ist von großer gewerblicher Bedeutung, daß L-Tryptophan ohne jegliches Problem aus chemisch hergestellten DL-Serin und Indol in Anwesenheit von zwei Enzymtypen hergestellt werden kann, unter Verwendung von leicht verfügbaren organischen Lösungsmitteln.

Das durch die vorstehende Verfahrensweise erhaltene

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Reaktionsgemisch enthält das resultierende L-Tryptophan, das nicht umgesetzte Ausgangsmaterial, das organische Lösungsmittel, das Enzym, usw. Vorzugsweise wird dieses Reaktionsgemisch mittels der Methode entsprechend den nachstehend beschriebenen Ausführungsformen A) oder B) behandelt.

Gemäß der Ausführungsform A) wird folgendes Gewinnungsverfahren durchgeführt. Zuerst wird das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch gewonnen und das Enzym wird entfernt. Wenn das Reaktionsgemisch kräftig gerührt wird, während das Enzym und das organische Lösungsmittel miteinander darin vorhanden sind, so wird die Grenzfläche zwischen der wässrigen-Phase und der organischen Lösungsmittelphase undeutlich,und es wird manchmal schwierig, das organische Lösungsmittel abzutrennen, in dem das extrahierte nicht umgesetzte Indol gelöst ist. Um dieses Phänomen zu vermeiden, ist es üblich, das organische Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch an erster Stelle zu gewinnen. Dies kann beispielsweise durch übliches Destillieren erzielt werden. Anschließend wird das in dem Reaktionsgemisch,aus dem das organische Lösungsmittel gewonnen wurde, enthaltene Enzym entfernt.

Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Verfahrensweise zur Entfernung des bei der Reaktion verwendeten Enzyms aus dem Reaktionsgemisch. Eine industriell wirksame Verfahrensweise besteht darin, eine Mineralsäure zu dem Reaktionsgemisch zu fügen, aus dem das organische Lösungsmittel entfernt wurde, dadurch den pH-Wert des Reaktionsgemxschs auf 2 bis 5 einzustellen, es je nach Erfordernis zur Förderung der Ausflockung des Enzyms zu erhitzen und das ausgeflockte. Enzym durch Maßnahmen, wie Filtrieren, zu entfernen. Wenn erforderlich, kann das Reakticnsgemisch, aus dem das Enzym entfernt wurde, konzentriert werden, um das nicht-umgesetzte Indol v/irksam aus dem Reaktionsgemisch zu extrahieren und abzu-

trennen, ist es bevorzugt, L-Tryptophan im gelösten Zustand ohne seine Ausfällung als Kristalle zu halten. Wenn L-Tryptophan aus wässriger Lösung kristallisiert Wird, so bezieht es nicht-umgesetztes Indol ein, das eine ähnliche Molekülstruktur aufweist, und bewirkt seine gleichzeitige Kristallisation. Aus diesem Grunde sollte je nach der Behandlungstemperatur die Konzentration des durch das organische Lösungsmittel zu extrahierenden Reaktionsgemischs derart eingestellt werden, daß sich L-Tryptophan im gelösten Zustand befindet.

Das nicht-umgesetzte Indol wird durch ein organisches Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch extrahiert, aus dem das Enzym entfernt wurde. Das organische Lösungsmittel kann in geeigneter Weise aus solchen gewählt werden, die in der Reaktion verwendet werden. Gewöhnlich wird das gleiche organische Lösungsmittel verwendet, das bei der Reaktion eingesetzt wird. Daher kann das wiedergewonnene organische Lösungsmittel für diesen Zweck verwendet werden. Jedoch muß das Lösungsmittel nicht das gleiche sein, wie das bei der Reaktion verwendete, und Lösungsmittel, die für die Tryptophan erzeugende Reaktion und für die Extraktion des nicht-umgesetzten Indols geeignet sind, können gewählt werden.

Die vorstehende Wiedergewinnungsverfahrensweise ist besonders geeignet bei der Herstellung von L-Tryptophan durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat, da das wiedergewonnene Indol erneut verwendet werden kann. Im allgemeinen wird bei der Herstellung von L-Tryptophan durch eine Enzymreaktion das Enzym usw., das bei der Reaktion verwendet wird, aus dem Reaktionsgemisch durch eine allgemeine Verfahrensweise entfernt, und anschließend wird L-Tryptophan isoliert. Die Verwendung der wiedergewonnenen Lösung, die das nicht-urngesetzte Material als solches enthält, inhibiert häufig die Aktivität des Enzyms,und dies führt bei der industriellen Praxis zu einem ernstlichen Problem.

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Wird jedoch das nicht-umgesetzte Indol aus dem Reaktionsgemisch mit dem organischen Lösungsmittel entsprechend der vorstehenden Wiedergewinnungsmethode extrahiert, so kann der Gehalt an Indol in L-Tryptophankristallen verringert werden, und das Indol, das mit dem organischen Lösungsmittel in Form der Lösungsmitteiläsung extrahiert wird, kann erneut bei der nächsten Reaktion verwendet werden, ohne das extrahierte Indol aus der Lösung zu isolieren (wenn es verwendet wird, erfolgt die Reaktion ohne Inhibieren des Enzymaktivität).

Die Menge des bei der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols verwendeten organischen Lösungsmittels variiert in Abhängigkeit von dem Verteilungsverhältnis von Indol zwischen der organischen Lösungsmittelphase und der wässrigen Phase, sowie auch von der Reaktionsumwandlung des Indols. Da jedoch Enzyme mit feststehenden spezifischen Aktivitäten handelsüblich sind und die Reaktionsumwandlung konstant ist, kann die Menge des bei der Extraktion verwendeten organischen Lösungsmittels leicht bestimmt werden.

Es besteht keine spezielle Einschränkung bei der Durchführung der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols und

sie kann nach üblicher Verfahrensweise durchgeführt wer-25

den. Im allgemeinen wird eine geeignete Menge eines

organischen Lösungsmittels zu dem Reaktionsgemisch, aus dem das Enzym entfernt wurde, gefügt, und das Gemisch wird gerührt, um die wässrige Phase voll mit der organischen Phase in Kontakt zu bringen. Wie vorstehend erwähnt, 30

ist es bevorzugt, das Reaktionsgemisch in einem derartigen Zustand zu halten, daß keine L-Tryptophankristalle ausgefällt werden. Industriell ist es v/irksam, die Extraktion unter Erwärmungsbedingungen durchzuführen, um

die Löslichkeit des L-Tryptoohans in Wasser zu vergrö-35

ßern. Nach einem gleichmäßigen Kontakt der beiden Phasen, wie vorstehend beschrieben, wird das Gemisch stehengelassen, um es in eine wässrige Phase und eine organische Lösungsmittelphase zu trennen. Der Extraktionsvorgang

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kann ansatzweise durchgeführt werden, jedoch wird er industriell kontinuierlich nach einer Gegenstrom-Extraktionsmethode durchgeführt.

Das das extrahierte nicht-umgesetzte Indol enthaltende organische Lösungsmittel wird in der nächsten Reaktion wiederverwendet, nachdem erforderlichenfalls frisches Lösungsmittel zugesetzt wurde oder mit einem anderen Lösungsmittel vermischt wurde oder frisches Indol zugesetzt wurde.

Diese Verfahrensweise ist von großer industrieller Bedeutung, da das nichtumgesetzte Indol wirksam wiedergewonnen werden kann, selbst wenn die Umwandlung von Indol durch Schwankungen der spezifischen Aktivität des Enzyms die häufig bei Enzymreaktionen auftreten, variiert wird. Selbst wenn darüber hinaus das Indol extrahiert wird und als solches wiedergewonnen wird, kann die Reaktion ohne Inhibierung der Enzymaktivität durchgeführt werden.

Wenn die vorstehende Wiedergewinnungsmethode angewendet wird, kann das nicht-umgesetzte Indol wirksam extrahiert und auch aus einer L-Tryptophan enthaltenden Reaktionsmischung, die nach üblicher Verfahrensweise erhalten wurde,, wiedergewonnen werden.

Nach der Ausführungsform B) wird das Reaktionsgemisch, das das resultierende L-Tryptophan, das nicht-umgesetzte Material, das organische Lösungsmittel und das Enzym enthält, in eine organische Lösungsmittelphase und eine wässrige Phase getrennt. Die organische Lösungsmittelphase, die das nicht-umgesetzte Material enthält, wird gewonnen. Anschließend wird das Enzym aus der wässrigen Phase entfernt, d. h. dem Reaktionsgemisch, das das L-Tryptophan enthält, um das L-Tryptophan zu gewinnen.

Wann das Enzym und das organische Lösungsmittel zusammen in dem Reaktionsgemisch enthalten sind, so wird die Grenzfläche zwischen der wässrigen Phase und der organi-

sehen Lösungsmittelphase manchmal undeutlich und ihre Trennung kann schwierig werden. In einem derartigen Falle kann die Trennung nach einer üblichen Verfahrensweise durchgeführt werden, beispielsweise durch Behandeln des Reaktionsgemischs in einem Zentrifugenabscheider. Falls die Extraktion und das Abtrennen unter Verwendung des verwendeten organischen Lösungsmittels wiederholt werden, wird die Wirkung der Entfernung des Indols verstärkt.

Bei dem Trennvorgang kann L-Tryptophan in der wässrigen Lösung in Form von Kristallen ausfallen, jedoch ist die Wirkung der Extraktion des nicht-umgesetzten Indols besser, wenn es in dem gelösten Zustand vorhanden ist.

Es ist günstig, wenn die Temperatur zum Trennungszeitpunkt unter dem Siedepunkt des organischen Lösungsmittels liegt und wenn Wasser und organisches Lösungsmittel ein Azeotrop unter seinem Siedepunkt bilden. Die abgetrennte und wiedergewonnene Indollösung kann direkt bei der nächsten Reaktion ohne Probleme verwendet werden.

Es besteht keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Verfahrensweise zur Entfernung des Enzyms aus dem Reaktionsgemisch nach dem Abtrennen der das nicht-umgesetzte Indol enthaltenden organischen Lösungsmittelphase. ■ Eine industriell wirksame Entfernungsverfahrensweise besteht im Zusatz einer Mineralsäure bzw. anorganischen Säure zu dem Reaktionsgemisch, das nach der Entfernung der organischen Lösungsmittelphase verbleibt, um den pH-Wert des Gemischs auf 2 bis 5 einzustellen. Erwärmen je nach Erfordernis, um das Enzym auszuflocken, und Entfernen der ausgeflockten Masse durch Maßnahmen, wie Filtrieren. L-Tryptophan kann durch Konzentrieren des Reaktionsgemischs, aus dem das Enzym so entfernt wurde, erhalten werden.

Nach der vorstehenden Verfahrensweise bewegt sich das nicht-umgesetzte Indol in dem Reaktionsgemisch wirksam zu dem organischen Lösungsmittel. Das organische Lösungsmittel, das das nicht-umgesetzte Indol enthält, kann in der nächsten Reaktionsstufe verwendet werden, nachdem, je nach Erfordernis, frisches Lösungsmittel zugeführt oder frisches Indol zugesetzt wurde.

Diese Wiedergewinnungsverfahrensweise ist auch besonders brauchbar bei der Herstellung von L-Tryptophan durch eine Enzymreaktion unter Verwendung von Indol als ein Substrat, aus dem gleichen Grunde wie bei der Ausführungsform A).

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist von großer industrieller Bedeutung, da L-Tryptophan mit hoher Reinheit, das frei von Indol ist, erhalten werden kann, und das Ausgangsindol wiedergewonnen und erneut verwendet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein 300-ml-Kolben, ausgerüstet mit einem Rührer, wurde mit 9,27 g L-Serin, 3 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 82,5 g Wasser beschickt, und es wurde gut gerührt. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit konzentriertem wässrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt, und die Temperatur wurde auf 35°C angehoben. 3 g eines naßen cremigen Kuchens kultivierter Zellen von Escherichia coli (MT-10242) mit einem Gehalt an Tryptophansynthetase wurden zugesetzt. Anschließend wurden 68,9 g einer Acetyltributylcitratlösung vor. 6,89 g Indol zugefügt. Die Reaktion wurde 48 h durchgeführt, und das Reaktionsgemisch wurde auf einem Gesamtvolumen von 300 ml mit 5 %

wässriger Natriuinhydroxidlösung verdünnt, um das resultierende L-Tryptophan vollständig aufzulösen. Die Lösung wurde durch einen Scheidetrichter in eine wässrige Phase und eine Lösungsmittelphase getrennt. Ein Teil der wässrigen Phase wurde mittels eines Zentrifugenabscheiders zur Sedimentation der Mikrobenzellen zentrifugiert. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt/ und die Konzentration des L-Tryptophans wurde durch Flüssigkeitschromatographie analysiert, und seine Ausbeutemenge wurde bestimmt. Die Ausbeute des Produkts, basierend auf Indol, betrug 96,5 Mo1-%.

Die vorstehende Verfahrensweise wurde wiederholt, wobei jedoch die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels geändert wurde, und das Verteilungsverhältnis in der wässrigen Phase verändert wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt.

Wurde die vorstehende Reaktion ohne Zusatz des organischen Lösungsmittels durchgeführt, so betrug die Konzentration des Indols in der den Mikroorganismus enthaltenden Flüssigkeit 3000 ppm, und die Ausbeute an L-Tryptophan betrug 47 Mol—%. Aus diesem Versuchstatsachen ist ersichtlich, daß es für die Herstellung von L-Tryptophan wichtig ist, ein mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungsmittel zuzusetzen und die Konzentration an Indol in der den Mikroorganismus enthaltenden Flüssigkeit niedrigzuhalten. Speziell wenn die Reaktion in Wasser ohne Zusatz eines organisches Lösungsmittels durchgeführt wurde, so wurde die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase zu 3000 ppm, und die Ausbeute an L-Tryptophan betrug, basierend auf Indol, 47 Mol-%. Wurde im Gegensatz Butyleitrat als organisches Lösungsmittel zugesetzt, und die Konzentration an Indol bei 790 ppm in der wässrigen Phase ge~ halten, so stieg die Ausbeute an L-Tryptophan beträchtlich auf 95 Mol-%,. basierend auf Indol, an. T'Jenn dia Konzentration an Indol in der wässrigen Phase bei 1070 ppra (höher als 800 ppm) gehalten wurde, so sank die Ausbeute

-19-

an L-Tryptophan um etwa 10 %, bezogen auf die ab, die erhalten wurde, wenn die Indolkonzentration 800 ppm betrug.

Tabelle

Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels +) 1

(g)

Konzentration an Indol in der Lösung des organischen Lösungsmittels +)1 (Gew.-%)

Konzentration
an Indol in
der Enzym enthaltenden
Flüssigkeit
(ppm) +)2

Ausbeute an L-Tryptophan (Mol-% basierend auf Indol)

68,9

34,45

27,56

22,97

19,69

15,31

10 20 25 30

35 45

160

400

520

660

790

1070

96,5 96,3 95,8 96,2 95,0 86,3 47

+)1: Acetyltributylcitrat

+)2: In einem frühen Stadium der Reaktion +)3: Es wurde kein organisches Lösungsmittel zugesetzt

Beispiel 2

30 6/8 g (Feststoffgehalt 1,7'g) eines nassen cremigen Kuchens von Escherichia coli (MT-10242), enthaltend Tryptophansynthetase und 3,4 g (Feststoffgehalt 0,85 g) Pseudomonas putida (MT-10182), enthaltend Serinracemase, wurden in Wasser suspendiert, und das Gesamtvolumen der

35 Suspension wurde auf 20 ml eingestellt.

BAD ORIGINAL

Eine wässrige Lösung, die aus 11,3 g DL-Serin, 6,0 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 66 g Wasser bestand, wurde in einen 300-ml-Kolben beschickt, und der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mit konzentriertem wässrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt, und die vorstehend hergestellt Mikrobenzellsuspension wurde in den Kolben beschickt.

Das Innere des Kolbens wurde bei 35 C gehalten und 57,2 g einer Toluollösung von 11,5 g Indol wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde bei dieser Temperatur 48 h durchgeführt. Zu Beginn der Reaktion betrug die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase 720 ppm.

Das Reaktionsprodukt wurde nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 1 analysiert. Es zeigte sich, daß das L-Tryptophan in einer Ausbeute von 89,3 Mol-%, basierend auf Indol, erhalten wurde.

Um die Wirkung der Konzentration des Indols in der wässrigenPhase zu bestimmen, wurde die vorstehende Verfahrensweise wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Menge des verwendeten Toluols variiert wurde. Die Ausbeuten an L-Tryptophan in diesen Ansätzen sind in der Tabelle II gezeigt.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die inhibitorische Konzentration von Indol in der wässrigen Phase etwa 800 ppm beträgt. Wie gezeigt, war, wenn die Reaktion bei einer Indolkonzentration von nicht mehr als 720 ppm gestartet wurde, die Ausbeute an L-Tryptophan etwa 90 Mol-%, sie verringerte sich jedoch auf 82 Mol-%, wenn die Reaktion bei einer Indolkonzentration von 920 ppm durchgeführt wurde.

Original

Tabelle

I I

Menge der	Konzentration	Konzentration	Ausbeute an
Toluollösung	an Indol in	an Indol in	L-Tryptophan
(g)	der Toluol	der wässrigen	(Mol-%, basierend
	lösung	Phase in einer	auf Indol)
	(Gew.-%)	frühen Stufe der
		Reaktion (ppm)
115	10	450	91,2
57,5	20	720	89,3
38,3	30	920	82,4

Beispiel 3

Nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 2 wurden DL-Serin und Indol in Anwesenheit von Kulturzellen von Escherichia coli (MT-10232) und kultivierten Zellen von Pseudomonas punctata (MT-10243) umgesetzt.

Hier wurde Methylisobutylketon als organisches Lösungsmittel verwendet, und die Reaktion wurde so durchgeführt, daß die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase zu Beginn der Reaktion auf 760 ppm eingestellt wurde.

Nach Durchführen der Reaktion bei 35 C während 48 h betrug die Ausbeute an L-Tryptophan 98,6 Mol-%, basierend auf Indol.

Zur Bestimmung der Wirkung der Indo!konzentration in der wässrigen Phase wurde die Menge an Methylisobutylketon variiert, und die Änderungen der Ausbeute an L-Tryptophan wurden bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III aufgeführt.

Es ist ersichtlich, daß durch Halten der Konzentration in der wässrigen Phase unter 800 ppm unter Verwendung

BAD ORIGINAL

von Methylisobutylketon L-Tryptophan in einer Ausbeute von mehr als 99 Mol-% erhalten werden kann.

Tabelle III

Menge der Konzentration Konzentration an Ausbeute an

Ketonlösung an Indol in Indol in der L-Tryptophan

(g) der Ketonlösung wässrigen Phase (Mol-%, basie-

(Gew.-%) in einer frühen rend auf Indol) Stufe der Reaktion

' (ppm)

80 99,8

190 99,9

340 99,8

28,75 40 510 99,6

720 98,6

115	10
57,5	20
38,3	30
28,75	40
23,0	50

Beispiel

Nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 2 wurden DL-Serin und Indol in der'Anwesenheit von Escherichia coli (MT-10242) und Pseudomonas putida (MT-10182) umgesetzt. Durch Verwenden von Anisol als Lösungsmittel wurde die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase unter 300 ppm gehalten.

Nach 48stündiger Reaktion bei 35°C betrug die Ausbeute an L-Tryptophan, basierend auf Indol, 95 Mol-%.

Beispiel 5

20 g DL-Serin, 1,0 g Ammoniuntacetat (Ar^oniak-Acetat) , 0,2 g Natriumbisulfat, 0,1 g DETA und eine Kulturbrühe von Erwinia herbicola (ATCC 21434) wurden in ein 200 ml-

BAD. ORIGINAL

-23-Reaktionsgefäß eingespeist.

Die Kulturbrühe wurde erhalten durch Kultur von Erwinia herbicola unter Belüften bei 28°C während 28 h in einem Kulturmedium, das aus 0,2 % L-Tyrosin, 0,2 % K₂HPO₄, 0,1 % MgSO₄.7H₂O, 2 ppm FeSO₄^H₃O, 0,01 % Pyridoxinhydrochlorid, 0,6 % Glycerin, 0,5 % Bernsteinsäure, 0,1 % DL-Methionin, 0,2 % DL-alanin (DL-alanikne), 0,05 % Glycin, 0,1 % L-Phenylalanin und 12 ml Sojabohnenprotein-hydrolysat bestand.

Eine Toluollösung, die 0,7 g Brenzkatechin enthielt, wurde zugesetzt, und die Konzentration des Brenzkatechins in Wasser wurde auf unter 3000 ppm eingestellt. Unter diesen Bedingungen wurde die Reaktion bei einer Temperatur von 37°C und bei einem pH-Wert von 8 während 48 h durchgeführt. Die Menge an akkumuliertem L-DOPA betrug 30 g pro Liter.

Beispiel 6

Escherichia coli enthaltende Mikrobenzellen wurden bei einer Temperatur von 30°C und einem pH-Wert von 7 in Anwesenheit von Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat, Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, Eisensulfat, Hefeextrakt und Polypepton unter Einblasen von Luft in das Kulturmedium und Zusatz von Glucose und Indol kultiviert. Außer dem wurden Mikrobenzellen, die Pseudomonas putida enthielten, in einem gleichen Kulturmedium bei einer Temperatur von 30°C und einem pH-Wert von 7 kultiviert, wobei Luft eingeblasen und Glucose zugesetzt wurde. In 40 h waren diese Mikrobenzellen in einer Konzentration von 30 bis 35 g/l ausgebildet. Durch Super-Hochgeschwindigkeitszcntrifugenabscheidunci erhielt nan £3ie als cremige Kuchen mit einem Wassergehalt von 85 bis 85 %.

BAn

77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser wurden in einen Kolben eingesetzt, und der pH-Wert des Gemische wurde mit 29 % wässrigem Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Außerdem wurden 51,2 g des cremigen Kuchens von Escherichia coli und 23,2 g des cremigen Kuchens von Pseudomonas putida zugesetzt, und das gesamte Gemisch wurde gut gerührt. Darüber hinaus qurden 392 g einer Toluollösung von 78,4 g Indol zugesetzt, und die Reaktion wurde 40 h bei 35°C durchgeführt. Der Gehalt an L-Tryptophan in der Reaktionsmasse erwies sich als 129,8 g durch Flüssigkeitschromatographie. Die Ausbeute betrug 95,0 %, basierend auf Indol.

Toluol wurde durch Destillation entfernt, und das Reak.-tionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt, um die Konzentration von L-Tryptophan auf 4,2 Gew.-% einzustellen. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit 98 % Schwefelsäure auf 4,0 eingestellt, und wurden "27 g Aktivkohle zugesetzt. Die Temperatur wurde auf 95°C angehoben, und das Gemisch wurde 1 h bei 95 bis 98°C gehalten und heiß bei dieser Temperatur filtriert, um die Zellen zusammen mit der Aktivkohle zu entfernen. Bei 80°C wurde das wiedergewonnene Toluol zu dem Filtrat gefügt, und es wurde gut gerührt. Anschließend wurde das Rühren beendet, und das Gemisch wurde stehengelassen. Es trennte sich zu einer oberen Toluolschicht und einer unteren wässrigen Schicht. Die Toluolschicht wurde entfernt, und die gleiche Toluolmenge, wie vorstehend, wurde zu der wässrigen Schicht gefügt, und es wurde erneut extrahiert.

Die Konzentration an Indol in der wässrigen Schicht betrug 55 ppm nach der ersten Extraktion und 4 ppm nach der zweiten Extraktion.

Die wässrige Schicht, wurde auf L-Tryptophankonzentration von 10 Gew.-% konzentriert und auf 20°C gekühlt. Die ausgefällten L-Tryptophankristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die

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isolierte L-Tryptophanmenge betrug 100 g. Die Reinheit betrug 99,5 % bei einem Indolgehalt von 0 ppm. Wenn die wiedergewonnene Toluollösung des Indols in der nächsten Reaktion nach Zufuhr von zusätzlichem Toluol verwendet wurde, so ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute von L-Tryptophan, und die Reaktion verlief in gutem Zustand.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle

IV

Anzahl der Recyclisate der extrahierten Toluolschicht

0 1 2 3

4 5

Ausbeute an L-Tryptophan (Mol-%, basierend auf Indol)

95,0 98,3 98,6 97,0 95,4 98,7

316 g jedes der Reaktionsgemische, die 500 ppm und 2000 ppm nicht-umgesetztes Indol enthielten, wurden mit 27,6 g Toluol bei 80⁰C extrahiert, und die Beziehung zwischen der Anzahl der Extraktionen undder Konzentration des in der wässrigen Phase verbleibenden Indols wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Konzentration an Anzahl der Konzentration an

Indol in der Extraktionen Indol im Wasser

wässrigen Phase nach der Extraktion

in einer frühen (ppm.) Stufe der Reaktion

(ppm)

2000 1 299

299 2 54

54 3 9,8

500 1 45

45 2 18

18 3 3

Beispiel

• L-Tryptophan wurde hergestellt durch Reaktion von L-Serin und Indol in Wasser und Diisobutylketon bei einer Temperatur von 35 C und bei einem pH-Wert von 8,5 in Anwesenheit von Escherichia coli-Zellen, die.nach der gleichen Verfahrensweise wie im Beispiel 6 kultiviert wurden. Die

__ Ausbeute an L-Tryptophan betrug 98,3 %, basierend auf 25

Indol.

Das Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung von Diisobutylketon destilliert, und anschließend auf einem Zentrifugen-

abscheider behandelt, unter Erzielung eines weißen cremi-30

gen Kuchens, der L-Tryptophan und die Mikrobenzellen enthielt.

Der cremige Kuchen wurde in Wasser gefügt und mit Wasser

auf eine L-Tryptophankonzentration von 0,8 Gew.-% ver-35

dünnt. Die L-Tryptophankristalle wurden in Wasser gelöst und die Lösung wurde durch eine Ultrafiltrationsniembran bei Raumtemperatur zur Entfernung der Mikrobenzellen ge-

BAD ORIGINAL

leitet. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase 90 ppm. Diisobutylketon in einer Menge von einem Fünftel der Menge der wässrigen Phase wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde gerührt. Das Gemisch wurde stehengelassen, um es in zwei Schichten zu trennen. Die Diisobutylketonschicht wurde entfernt. Anschließend wurde der gleiche Extraktionsvorgang wiederholt, unter Verwendung der gleichen Menge an Diisobutylketon wie bei dem vorhergehenden Arbeitsgang. 10

Die Konzentration an Indol in der wässrigen Schicht betrug 32 ppm nach der ersten Extraktion und 2 ppm nach der zweiten Extraktion.

Die Indol enthaltende Diisobutylketonschicht wurde in der nächsten Reaktion wiederverwendet nach Zufuhr einer erforderlichen Indolmenge. Bei der nächsten Reaktion traten keine Probleme auf.

Beispiel 8

L-Tryptophan wurde hergestellt durch Reaktion von DL-Serin und Indol bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 35°C während 48 h in Wasser und Benzol in Anwesenheit von Escherichia coli und Pseudomonas punctata, die kultiviert und gesammelt wurden nach der Verfahrensweise des Beispiels 6. Die Ausbeute an L-Tryptophan betrug, basierend auf Indol 93,7 %. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung von Benzol destilliert und dann mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von 4,2 Gew.-% verdünnt. Das verdünnte Gemisch wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt, und es wurden 15 Gew.-% Aktivkohle, basierend auf dem resultierender. Tryptophan., zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 95 bis 98 C 1 h erwärmt. Es wurde unter Druck bei dar gleichen Temperatur während 1 h filtriert. Zu dem Filtrat

RAH ORIGINAL

wurde Benzol bei 80°C gefügt. Das Gemisch wurde gut gerührt und dann zur Trennung in Schichten stehengelassen. Das verwendete Benzol war das bei der vorstehenden Destillation gewonnene. Die gleiche Extraktion wurde dreimal unter Verwendung der gleichen Menge an frischem Benzol wiederholt. Die Konzentration an Indol in der wässrigen Phase betrug vor der Extraktion 1850 ppm, 265 ppm nach der ersten Extraktion, 43 ppm nach der zweiten Extraktion und 4,6 ppm nach der dritten Extraktion. Wenn das Reaktionsgemisch konzentriert und kristallisiert wurde, erhielt man L-Tryptophan mit einer Reinheit von 99,7 % und in einer Ausbeute von 69,8 %, basierend auf Indol. Sein Indolgehalt betrug 2,1 ppm.

Die gewonnene benzolische Indollösung wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen Menge an frischem Indol verwendet. In der nächsten Reaktion trat kein Problem auf.

Beispiel 9

Eine wässrige Lösung aus 11,3 g DL-Serin, 6,0 g Ammoniumsulfat, 10 mg Pyridoxalphosphat und 66 g destilliertem Wasser wurde gut bei 35°C in einem 300 ml-Kolben gerührt, und 29 % wässriges Ammoniak wurde zur Einstellung des pH-Werts der Lösung auf 8,5 zugesetzt.

Anschließend wurden 4,0 g eines Zellcremekuchens, der Escherichia coli,kultiviert nach der Arbeitsweise des Beispiels 6, und 2,5 g eines Zellcremekuchens, enthaltend Pseudomonas putida, kultiviert nach der Arbeitsweise des Beispiels 6, zugesetzt, und es wurde bei 35°C gut gerührt, um zu dispergieren.

Außerdem wurde eine Lösung von 11,5 g Indol in 26,8 g Diisobuty!keton zugesetzt, und das Gemisch wurde 40 h

-29-bei 35°C und 90 UpM gerührt.

Nach der Reaktion wurde mit dem Rühren aufgehört. Das Reaktionsgemisch wurde stehengelassen, um es in zwei Schichten zu trennen. Die obere Diisobutylketonschicht wurde entfernt. Diisobuty!keton wurde in der gleichen Menge wie vorstehend zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min bei 90 UpM gerührt. Das Gemisch wurde anschließend stehengelassen, und die Diisobutylketonschicht wurde in gleicher Weise wie vorstehend gewonnen.

Es zeigte sich, daß das nicht-umgesetzte Indol, das in dem Reaktionsgemisch am Ende der Reaktion verblieb, bis zu einem Ausmaß von 85 % durch die erste Extraktion mit Diisobutylketon gewonnen wurde und bis zu einem Ausmaß von 99 % durch die zweite Extraktion. Die Indo!menge wurde gaschromatographisch analysiert.

Wenn das wiedergewonnene Diisobutylketon in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der gewünschten Indolmenge verwendet wurde, ergaben sich keine Probleme.

Beispiel 10

Es wurde die gleiche Reaktion wie im Beispiel 9 bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 640 UpM durchgeführt, unter Verwendung von 45,7 g Toluol. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch im Zentrifugenabscheider behandelt, um die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten auszuprägen, da es sich um eine gleichmäßige Emulsion handelte.

Die obere Toluolschicht wurde entfernt. Anschließend wurde Toluol in der gleichen Menge zugesetzt, und die Extraktion des nicht-ungesetzten Indols v/urde wiederholt.

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Es zeigte sich, daß das nicht-umgesetzte Indol·, das am Ende der Reaktion in dem Reaktionsgemisch enthalten war, bis zu einem Ausmaß von 87 % durch die erste Extraktion und bis zu einem Ausmaß von 99,9 % durch die zweite Extraktion wiedergewonnen wurde.

Das wiedergewonnene Toluol, das Indol enthielt, wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen Indolmenge wiederverwendet. Es ergaben sich keine Probleme bei der nächsten Reaktion.

Beispiel 11

Die gleiche Reaktion wie im Beispiel 9 wurde unter Verwendung von 14,3 g Ethyleitrat durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in der Form einer gleichmäßigen Emulsion im kontinuierlichen Zentrifugenabscheider behandelt, um es in eine wässrige Schicht und eine Ethylcitratschicht zu trennen. Zu der wässrigen Schicht wurde die gleiche Menge an Ethyleitrat, wie sie in der Reaktion verwendet wurde, gefügt, und das Gemisch wurde erneut in eine wässrige Schicht und eine organische Schicht durch kontinuierliche Zentrifugenabscheidung getrennt. Aus einem Teil der wässrigen Schicht wurden Proben entnommen, und das resultierende Tryptophan wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert. Seine Ausbeute ergab sich als 99,7 % basierend auf Indol.

Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von 4,2 Gew.-% verdünnt und mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Pulverisierte Aktivkohle wurde in einem Anteil von 15 Gew.-%, basierend auf L-Tryptophan, zugesetzt/ und das Gemisch -.-/urde 1 h bei 90°C erwärmt. Nach dem vollständigen Auflösen der L-Tryptophankristalle wurde die Lösung durch Absaugen

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bei der gleichen Temperatur filtriert, um Mikrobenzellen zusammen mit Aktivkohle zu entfernen.

Das heiße Filtrat wurde auf eine L-Tryptophankonzentration von 10 Gew.-% konzentriert und auf 1O°C gekühlt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf 5,9 eingestellt, und die ausgefällten ablagerungsartigen Kristalle wurden durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Die Ausbeute an isolierten L-Tryptophan betrug 74,5 Mol-%, basierend auf Indol. Es wies eine Reinheit von 99,4 % und einen Indolgehalt von 1,2 ppm auf.

Das wiedergewonnene Ethylcitrat, das Indol enthielt, wurde in der nächsten Reaktion nach Zufuhr der erforderlichen Indolmenge verwendet. In der nächsten Reaktion ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute an L-Tryptophan, und die Reaktion verlief in gutem Zustand.

Beispiel 12

Escherichia coli enthaltende Zellen und Pseudomonas putida enthaltende Zellen wurden jeweils in gleicher Weise wie in Beispiel 9 kultivert und in einem Superzentrifugenabscheider behandelt, unter Bildung von Zellcremekuchen der beiden Mikroorganismen, jeweils mit einem Wassergehalt von 75 %.

Eine wässrige Lösung aus 77,3 g DL-Serin, 10,5 g Ammoniumsulfat und 486 g Wasser wurde mit 29 % wässrigem Ammoniak auf den pH-Wert 8,5 eingestellt,und 51,2 g des Zellcremekuchens von Escherichia coli und 23,2 g des Zellcremekuchens von Pseudomonas putida, die v?ie vorstehend erbalten wurden, wurden zugesetzt. Es wurde durch sorgfältige Rühren dispergiert und 392 g Toluollösung von 78,4 g Indol

wurden zugesetzt- Die Reaktion wurde 48 h bei 35 C durchgeführt.

Nach der Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemische genommen und in eine Toluolschicht und eine wässrige Schicht durch einen Zentrifugenabscheider getrennt. L-Tryptophan wurde gelöst durch Zusatz eines Alkali zu der wässrigen Schicht, in der Kristalle von L-Tryptophan ausgefällt wurden. Anschließend wurde die wässrige Schicht durch ein Membranfilter geleitet, um die Mikrobenzellen zu entfernen. Das Filtrat wurde einer Hochleistungsfähigkeits-Flüssigkeitschromatographie unterzogen, um das L-Tryptophan zu analysieren. Die Ausbeute an L-Tryptophan in dem Reaktionsgemisch erwies sich als 99,3 Mol-%, basierend auf Indol.

Ein weitererTeil des Reaktionsgemischs wurde entnommen und in eine wässrige Schicht und eine Toluolschicht durch einen Zentrifugenabscheider getrennt. Die Konzentration des nicht-umgesetzten Indols, das in dem Toluol enthalten war, wurde gaschromatographisch als 2,3 ppm gemessen.

Wenn die Toluollösung, die Indol enthielt, in der nächsten Reaktion nach dem Zusatz der erforderlichen Menge an frischem Indol verwendet wurde, so ergab sich keine Auswirkung auf die Ausbeute von L-Tryptophan, und die Reaktion verlief gut.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle VI aufgeführt.

BAD ORIGINAL

Tabelle

V I

Anzahl der Recyclisate der wiedergewonnenen Toluolschicht

0 1 2 3 4 5

Ausbeute an L-Tryptophan (Mol-%, basierend auf Indol)

99,3 98,5 98,9 99,2 98,2 99,4

Die wässrige Schicht, die durch Zentrifugenabtrennung gewonnen wurde, wurde mit Wasser auf eine L-Tryptophankonzentration von 4,2 Gew.-% verdünnt und mit 98 % Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0 eingestellt. 27,0 g pulverisierte Aktivkohle wurden zugesetzt, und die Temperatur des Gemischs wurde auf 98°C angehoben. Anschließend wurde das Gemisch 1 h bei 98 bis 100°C zur Auflösung der ausgefällten L-Tryptophankristalle gehalten.

Die Mikrobenzellen wurden zusammen mit der Aktivkohle durch Heißfiltration entfernt. Das Filtrat wurde auf eine L-Tryptophankonzentration von 15 Gew.-% zur Ausfällung von ablagerungsartigen Kristallen von L-Tryptophan konzentriert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren bei 10 C abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet unter Bildung von blaßgelben ablagerungsartigen Kristallen von L-Tryptophan mit einer Reinheit von 99,2 % in einer Ausbeute von 81,3 Mol-%, basierend auf Indol. Die resultierenden L-Tryptophankristalle wiesen eine spezifische Drehung von -31,8°, einen Schwermetallgehalt von weniger als 20 pm und einen Verbrennungsrückstand von 0,02 Gew.-% sowie einen Amnioniakgehalt von 0,01 Gew.-% auf. Die in der vorstehenden Beschreibung mit der Bezeichnung "MT" gekennzeichneten Mikroorganismenstänvme (wie z.B.

BAD ORIGINAL

1 Pseudomonas putida MT-10182, Pseudomonas punctata MT-10243 Escherichia coli MT-10242, Escherichia coli MT-10232) wurden hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministery

5 of Int. Trade and Industry, Japan.

Claims

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann ^

Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Or. F. Zumstein jun. 3 3 4 7 O

PATENTANWÄLTE

ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE

10 G 2128-K 71

Mitsui Toatsu Chemicals INC., ToTcyo/Japan

15 -

Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms

PatentansOruch

25 Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Aktivität eines Enzyms durch ein Substrat in einer Enzymreaktion in wässriger Phase, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reaktionssystem ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar, jedoch mit dem Substrat mischbar

30 ist, zusetzt, um die Konzentration des Substrats in der wässrigen Phase unter die Konzentration zu verringern, bei der die Aktivität des Enzyms wesentlich inhibiert wird.