FR2557590A1 - Procede pour eviter la degradation de l'activite d'une enzyme par un substrat en phase aqueuse - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONERNE UN PROCEDE DESTINE A EVITER QUE L'ACTIVITE D'UNE ENZYME SOIT DEGRADEE PAR UN SUBSTRAT DANS UNE REACTION ENZYMATIQUE EN PHASE AQUEUSE. CE PROCEDE CONSISTE A ASSURER LA PRESENCE D'UN SOLVANT ORGANIQUE NON MISCIBLE A L'EAU MAIS MISCIBLE AU SUBSTRAT DANS LE MELANGE REACTIONNEL DE MANIERE A REDUIRE LA CONCENTRATION DU SUBSTRAT DANS LA PHASE AQUEUSE A UNE VALEUR INFERIEURE A LA CONCENTRATION A LAQUELLE L'ACTIVITE DE L'ENZYME EST SENSIBLEMENT INHIBEE.

Description

La présente invention concerne un perfectionnement à une réaction enzymatique en phase aqueuse. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour empêcher l'activité d'une enzyme d'être dégradée par un substrat dans une réaction utilisant l'enzyme, dans lequel, par l'addition d'un solvant organique miscible au substrat mais non miscible à l'eau au système réactionnel, la réaction s'effectue tout en maintenant la concentration du substrat dans la phase aqueuse au-dessous de la concentration à laquelle l'activité de l'enzyme est inhibée (appelée concentration inhibitrice).

Dans une réaction utilisant une enzyme, l'eau est le meilleur milieu réactionnel pour l'enzyme, et par conséquent, une telle réaction est généralement conduite en phase aqueuse. Cependant, certains substrats sont peu solubles dans l'eau. Dans le cas de l'utilisation d'un tel substrat, on doit prendre diverses précautions afin de fixer la quantité de substrat nécessaire à la réaction dans une phase aqueuse contenant une enzyme (qu'on désigne parfois par liquide contenant une enzyme) et pour que la réaction s'effectue régulièrement. Par exemple, on sait conduire la réaction en utilisant un solvant organique.Le brevet Japonais NO 34153/1972 décrit que le toluène, le butanol, l'éthanol ou l'acétone est utilisé comme agent favori.sant la réaction dans un procédé de production de L-tryptophane à partir d'indole et de sérine en utilisant une bactérie du genre
Aerobacterium. Le brevet britannique GB-13134 décrit que dans l'oxydation du décane, on utilise un substrat insoluble dans liteau, en présence d'une enzyme oxydant le décane et du diméthylformamide miscible à l'eau et au substrat.

Dans ces procédés, les solvants organiques sont utilisés pour favoriser la dissolution des substrats dans le liquide contenant l'enzyme et pour favoriser les réactions.

Dans les réactions utilisant des enzymes, l'effet de la concentration d'un substrat sur l'enzyme doit être pris en considération. Si, dans une réaction enzymatique, la concentration d'un substrat dans la phase réactionnelle est élevée, l'activité de l'enzyme peut s'en trouver fortement diminuée en retardant la réaction.On sait par exemple que dans la production de tryptophane en présence d'une enzyme en utilisant l'acide anthranilique comme précurseur, la concentration d'acide anthranilique dans la phase aqueuse affecte la dégradation de l'activité de l'enzyme utilisée dans la réaction (brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 4 363 875) ; dans la production de L-DOPA à partir de
L-sérine et de pyrocatéchine en utilisant Erwinia herbicola, la présence de pyrocatéchine comme seul substrat à une forte concentration dans la phase aqueuse réduit l'activité de l'enzyme (Agric. Biol. Chem., Volume 37, 493-499 , 725735, 1973) , et dans la production de tryptophane à partir d'indole et de sérine, l'indole comme seul substrat réduit l'activité de la tryptophane-synthétase (U.Behrendt, The
First European Congress on Biotechnology, 2/186-2/189, 1978).

En conséquence, si dans une réaction utilisant une enzyme, un substrat est susceptible de réduire l'activité de l'enzyme, la réaction doit être conduite tout en maintenant la concentration du substrat dans le liquide contenant l'enzyme au-dessous de la concentration à laquelle l'activité de l'enzyme est dégradée (concentration inhibitrice) afin de faciliter la réaction même lorsque le substrat esten- tièrement soluble dans le liquide contenant l'enzyme. Afin d'industrialiser des réactions de ce type, on doit mettre au point un analyseur continu destiné à déterminer en continu la concentration de substrat pendant la réaction afin de maintenir la concentration du substrat dans le liquide contenant l'enzyme au-dessous de la concentration inhibitrice.En outre, pour introduire le substrat en continu, un système d'introduction de matière relié directement à l'analyseur en continu est nécessaire. Ainsi, l'appareil et la mise en oeuvre de la réaction deviennent inévitablement complexes. Si dans des réactions de ce type, on utilise un fort excès d'une enzyme et que la vitesse de consommation du substrat dans la réaction est plus rapide que la vitesse de mélange du substrat avec l'eau, la réaction peut naturellement s'effectuer à une concentration de substrat sensiblement inférieure à la concentration inhibitrice. Cependant, étant donné que la quantité d'enzyme utilisée dans la réaction est très importante en pratique, ce processus ne présente pas d'intérêt du point de vue industriel.

Le tryptophane obtenu à partir d'indole par une réaction enzymatique ou une réaction de fermentation doit avantageusement être exempt de l'indole n'ayant pas réagi lorsqu'on l'utilise dans des médicaments ou des additifs alimentaires, car l'indole n'ayant pas réagi dégage une odeur inhérente désagréable.

Jusqu'à présent, la distillation à la vapeur d'eau était connue comme procédé pour éliminer l'indole n'ayant pas réagi de la solution réactionnelle dans la production de L-tryptophane à partir d'indole par une réaction enzymatique (brevet japonais NO 800/1982). Mais du fait que la pression de vapeur de l'indole est inférieure à celle de l'eau, il faut une grande quantité de vapeur d'eau pour éliminer l'indole par distillation. Ceci augmente les frais d'énergie, et un tel procédé n'est pas industriellement réalisable. Il est devenu ainsi fortement souhaitable de résoudre ce problème.

La présente invention se propose de fournir un procédé perfectionné pour empêcher l'activité d'une enzyme d'être dégradée par un substrat dans une réaction enzymatique.

Selon la présente invention, ce but peut être atteint par un procédé destiné à empêcher l'activité d'une enzyme d'être dégradée par un substrat dans une réaction enzymatique en phase aqueuse, ce procédé impliquant la pré sence dans le système réactionnel d'un solvant organique non miscible à l'eau mais miscible au substrat, afin de réduire la concentration du substrat dans la phase aqueuse à une valeur inférieure à la concentration à laquelle l'activité de l'enzyme est sensiblement inhibée.

Des formes de mise en oeuvre du procédé ci-dessus selon la présente invention comprennent
(A) un procédé qui consiste à effectuer une réaction enzymatique en-utilisant l'indole comme seul substrat en phase aqueuse en présence d'un solvant organique non miscible à l'eau mais miscible à l'indole, à récupérer le solvant organique du mélange réactionnel et à enlever l'enzyme, à extraire l'indole n'ayant pas réagi de la solution aqueuse résultante de L-tryptophane avec le solvant organique récu péré, et à réutiliser l'extrait dans la réaction ; et
(B) un procédé qui consiste à effectuer une réaction enzymatique en utilisant l'indole comme seul substrat dans une solution aqueuse-en présence d'un solvant organique non miscible à l'eau mais miscible à l'indole, et à séparer l'indole n'ayant pas réagi comme phase de solvant organique, du mélange réactionnel.

Le principe de base de la présente invention est que la concentration d'un substrat dans une phase aqueuse est maintenue au-dessous d'une certaine concentration fixée selon le rapport de répartition du substrat entre une phase de solvant organique dans laquelle le substrat est dissous et la phase aqueuse.

En général, dans une réaction dans laquelle l'activité d'une enzyme est réduite par un substrat, la concentration du substrat dans une phase aqueuse doit toujours être maintenue basse, et dans ce but, on utilise un procédé dans lequel le substrat est ajouté petit à petit, soit en continu, soit par intermittence, au système réactionnel contenant l'enzyme. Ce procédé, cependant, nécessite un fonctionnement et un appareillage complexes pour maîtriser la réaction de telle sorte que lorsque le substrat est ajouté au système réactionnel, sa concentration dans le liquide contenant l'enzyme soit maintenue à une faible valeur.

Au contraire, selon le procédé de la présente invention, un solvant organique miscible au substrat mais non miscible à l'eau est ajouté à un liquide contenant une enzyme pour dissoudre le substrat presque complètement dans la phase de solvant organique. Par suite, la concentration du substrat dans la phase aqueuse peut être maintenue sen siblement inférieure à la concentration inhibitrice selon le rapport de répartition du substrat entre la phase de solvant organique et la phase aqueuse. Là, il importe peu que le produit réactionnel soit dissous ou précipité dans la phase de solvant organique ou dans la phase contenant 1 'enzyme.

Selon le procédé de la présente invention, le substrat contenu dans la phase liquide contenant l'enzyme est fourni en continu par la phase de solvant organique selon le rapport de répartition du substrat entre les deux phases à mesure que la réaction progresse et consomme le substrat. Le solvant organique destiné à dissoudre le substrat peut être ajouté en une seule fois, par intermittence, ou en continu pourvu que la concentration du substrat dans la phase aqueuse puisse être maintenue à une valeur inférieure à la concentration inhibitrice. Au besoin, la vitesse du mouvement du substrat peut être modifiée en faisant varier la surface de contact entre la phase organique et la phase aqueuse, par une opération telle qu'une agitation.

Dans le procédé de la présente invention, les enzymes peuvent être utilisées seules ou sous forme d'un mélange de deux ou davantage. Mais on doit utiliser au moins une enzyme d'un type dont l'activité est réduite par un substrat lorsqu'il est utilisé dans une réaction enzymatique effectuée selon un procédé classique.

Les enzymes utilisées dans la présente invention n'ont pas toujours besoin d'être pures et il peut s'agir d'enzymes brutes. Par exemple, les enzymes peuvent être des cellules vivantes recueillies à partir d'un bouillon de culture d'un microorganisme producteur d'enzyme par centrifugation, etc, des cellules obtenues par congélation ou séchage des cellules vivantes, des produits traités de ces cellules obtenus par des traitements tels qu'un broyage, une autodigestion et un traitement aux ultrasons, des extraits de ces cellules, et des enzymes obtenues à partir des extraits.

Le solvant organique utilisé dans le procédé de la présente invention est miscible aux substrats mais non miscible à l'eau. En pratique, il est nécessaire de choisir, selon l'enzyme utilisée, les solvants organiques qui ne réduisent pas l'activité des enzymes dans les conditions de réaction.

On choisit un solvant organique convenant à un substrat et une enzyme donnés, et sa quantité est déterminée comme indiqué ci-après. En particulier, on utilise une enzyme et un substrat devant réagir et la concentration inhibitrice du substrat dans un liquide contenant une enzyme dans les conditions de réaction est déterminée.Ensuite, le rapport de répartition du substrat entre le liquide contenant une enzyme et le solvant organique est déterminé et la concentration du substrat dans le solvant organique qui est inférieure à la concentration inhibitrice mesurée ci-dessus est indiquée. - Dès que la concentration du substrat dans le solvant organique à utiliser dans la réaction est déterminée comme ci-dessus, la quantité du liquide contenant une enzyme et la quantité de solvant organique utilisé peuvent etre déterminés à partir de la quantité du substrat utilisé selon la concentration du produit réactionnel désiré accumulé dans le mélange réactionnel.

Par suite, tant que la concentration du substrat dans le liquide contenant l'enzyme peut être maintenue audes sous de la concentration inhibitrice, on peut choisir librement le solvant organique, et sa quantité peut être déterminée librement.

Le procédé de la présente invention est décrit ci-après en ce qui concerne la production de L-tryptophane en utilisant l'indole et la L- ou DL-sérine comme substrats.

Etant donné que dans la production de L-tryptophane à partir d'indole et de L-sérine en utilisant la tryptophane-synthétase, l'indole réduit l'activité de la tryptophane-synthétase, la réaction doit être effectuée en maintenant la concentration d'indole dans l'eau à une faible valeur. Dans ce but, on a utilisé des agents tensio-actifs non ioniques ou des résines adsorbantes (Behrendt, The First European Congress in Biotechnology, 2/186-189, 1978). Cependant, la réaction en présence d'un surfactif non ionique diffère, de par son mécanisme, de la réaction selon le procédé de la présente invention qui est effectuée pratiquement entre deux phases, car l'indole est sous la forme de micelle dans la phase aqueuse sous l'effet du surfactif. De plus, ce procédé n'est pas industrialisable, car il est difficile de séparer le surfactif du produit réactionnel après la réaction.Le procédé impliquant l'utilisation de résines adsorbantes est inintéressant du point de vue industriel car, avec certaines résines adsorbantes, l'indole adsorbé ainsi ne se sépare pas complètement, ou bien le produit réactionnel risque d'être adsorbé sur ces résines.

Par contre, lorsqu'une solution d'indole dans un solvant organique est ajoutée à une solution aqueuse contenant de la sérine et l'enzyme et que la réaction est conduite en deux phases, la concentration d'indole dissous dans la phase aqueuse peut être maintenue à une faible valeur, et l'indole est automatiquement fourni par la phase de solvant organique à mesure qu'il est consommé par la réaction. Par suite, la réaction s'effectue aisément.

Dans un liquide contenant une souche mutante de
Escherichia coli, la concentration inhibitrice d'indole est d'environ 800 ppm. Des exemples de solvants organiques qui font passer l'indole, à une concentration inférieure à la concentration inhibitrice, dans la phase aqueuse sont le toluène, le chlorobenzène, le citrate d'éthyle, la méthylisobutyl-cétone et l'anisole. Par exemple, si l'on utilise une solution toluénique à 20 X en poids d'indole, l'indole se dissout à une concentration inférieure à 720 ppm dans un liquide contenant une souche mutanté de Escherichia coli, et la réaction peut être effectuée tout en maintenant la concentration d'indole inférieure à la concentration inhibitrice précitée.La concentration d'indole dans un liquide contenant une enzyme dans les conditions de réaction peut être maintenue à une valuer inférieure à 800 ppm si la concentration d'indole dans d'autres solvants est de 40 X en poids pour le citrate d'éthyle, 50 X en poids pour la méthyl-isobutyl-cétone, 30 X en poids pour l'anisole et 20 X en poids pour le monochlorobenzène.

Selon une forme de mise en oeuvre typique du procédé delta présente invention, le L-tryptophane peut être produit par culture d'une souche mutante de Escherichia coli en soumettant un milieu de culture contenant une souche mutante pauvre en tryptophanase de Escherichia coli nécessitant du L-tryptophane, une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux dans des conditions aérobies à une température de 28 à 400C et un pH de 6 à 8, en mettant en suspension les cellules microbiennes soit dans le bouillon de culture soit après séparation du milieu de culture dans une solution contenant du phosphate de pyridoxal, de la L-sérine et des matières minérales, puis en ajoutant une solution d'indole dans un solvant organique miscible à l'indole mais non miscible à l'eau en une fois ou en continu à un pH de 7,5 à 9,5, de préférence de 8 à 9, et en conduisant la réaction à une température de 20 à 400C.

Des exemples de solvant organique pouvant être utilisé comprennent des hydrocarbures aromatiques et leurs dérivés tels que benzène, toluène, chlorobenzène, nitrobenzène et acétophénone ; des esters aliphatiques ayant au moins 6 atomes de carbone tels que l'acétate de n-butyle, l'acétate d'isoamyle, le butyrate d'éthyle et l'acétate d'isobutyle ; des cétones aliphatiques ayant au moins 6 atomes de carbone telles que la méthyl-isobutyl-cétone, la diisobutyl-cétone, la diisopropyl-cétone, la méthyl-namyl-cétone et la di-n-propyl-cétone ; des esters de l'acide citrique tels que le citrate d'acétyltriéthyle, le citrate d'acétyltributyle, le citrate de triéthyle et le citrate de tributyle ; des esters de l'acide tartrique ; des esters de l'acide malique , et des éthers tels que l'anisole.

La quantité de solvant organique utilisé varie selon le type de solvant car elle est déterminée par le rapport de répartition de l'indole entre une phase liquide contenant une enzyme et une phase organique dans les conditions de réaction et la quantité d'indole utilisée. En général, elle est déterminée de telle sorte que la concentration d'indole dans le liquide contenant l'enzyme soit inférieure a 800 ppm, du point de vue industriel de préférence inférieure à 750 ppm.

Le L-tryptophane qui est le produit réactionnel précipite sous forme de cristaux dans le liquide contenant l'enzyme. Dans les conditions de réaction utilisées, ces cristaux n'affectent en aucune manière l'évolution de la réaction.

Dansle procédé ci-dessus, la DL-sérine peut être utilisée comme substrat. Dans ce cas, en utilisant des cellules cultivées de Pseudomonas putida (MT-lOl82) ou de
Pseudomonas punctata (MT-10243) comme sérine-racémase, le
L-tryptophane peut être obtenu en des rendements élevés sans dégradation de l'activité de l'enzyme par le solvant organique.

il est d'une grande importance commerciale que le
L-tryptophane puisse être produit sans difficulté à partir de DL-sérine provenant de synthèse chimique et d'indole en présence de deux types d'enzymes en utilisant des solvants organiques facilement disponibles.

Le mélange réactionnel obtenu par le procédé cidessus contient le L-tryptophane résultant, la matière brute n'ayant pas réagi, le solvant organique, l'enzyme, etc. De préférence, ce mélange réactionnel est traité par le procédé conforme au mode de mise en oeuvre (A) ou (B) décrit ci-dessus.

Selon le mode de mise en oeuvre (A), on utilise le procédé de récupération suivant. Tout d'abord, le solvant organique est récupéré du mélange réactionnel et l'en- zyme est enlevée. Si le mélange réactionnel est agité énergiquement pendant que l'enzyme et le solvant organique y sont présents ensemble, l'interface entre la phase aqueuse et la phase de solvant organique devient peu visible et il est parfois difficile de séparer le solvant organique contenant l'indole n'ayant pas réagi, extrait et dissous dans celui-ci. Pour éviter ce phénomène, il est de pratique c9urante de récupérer le solvant organique du mélange réactionnel en premier lieu. Ceci peut etre réalisé par une distillation courante, par exemple. Ensuite, l'enzyme contenue dans le mélange réactionnel duquel le solvant organique a été récupéré est enlevée.

I) n'y a pas de limitation particulière quant au procédé séparation de l'enzyme utilisée dans la réaction du mélange réactionnel. Un procédé efficace du point de vue industriel consiste à ajouter un acide minéral au mélange réactionnel duquel le solvant organique a été éliminé, de manière à ajuster le pH du mélange réactionnel à 2-5, à le chauffer selon les besoins pour favoriser une floculation de l'enzyme et à retirer l'enzyme floculée, par exemple par filtration.

Au besoin, le mélange réactionnel duquel l'enzyme a été retirée peut être concentré. Pour extraire et séparer efficacement l'indole n'ayant pas réagi du mélange réactionnel, il est préférable de maintenir le L-tryptophane à l'état dissous sans qu'il précipite sous forme de cristaux.

Lorsque le L-tryptophane est cristallisé dans la solution aqueuse, il implique l'indole n'ayant pas réagi ayant une structure moléculaire analogue et provoque sa cristallisation simultanée. Pour cette raison, selon la température de traitement, la concentration du mélange réactionnel devant être extrait par le solvant organique doit etre ajustée à une valeur à laquelle le L-tryptophane se trouve à l'état dissous.

L'indole n'ayant pas réagi est extrait par un solvant organique du mélange réactionnel duquel l'enzyme a été retirée. Le solvant organique peut etre convenablement choisi parmi ceux qui sont utilisés dans la réaction. En général, on utilise le même solvant organique que celui utilisé dans la réaction. Par suite, le solvant organique récupéré peut être utilisé dans ce but. Cependant, le solvant n'est pas nécessairement le même que celui utilisé dans la réaction, et on peut choisir des solvants qui sont efficaces pour la réaction de production de tryptophane et l'extraction de l'indole n'ayant pas réagi, respectivement.

Le procédé de récupération ci-dessus est particulièrement utile dans la production de L-tryptophane par une réaction enzymatique utilisant l'indole comme seul substrat car l'indole récupéré peut être réutilisé. Généralement, dans la production de L-tryptophane par une réaction enzymatique, l'enzyme utilisée dans la réaction est retirée du mélange réactionnel par un procédé classique, puis le L-tryptophane est isolé. L'utilisation de la solution récupérée contenant la matière inchangée telle quelle inhibe souvent l'activité de l'enzyme et ceci -pose un grave problème en pratique industrielle.Cependant, lorsque l'indole n'ayant pas réagi est extrait du mélange réactionnel avec le solvant organique selon le procédé de récupération pré cité, la teneur en indole des cristaux de L-tryptophane peut être réduite, et l'indole tel qu'extrait avec le solvant organique sous la forme de la solution dans le solvant peut être réutilisé dans la réaction suivante sans isolement de l'indole extrait de la solution (lorsqu'il est réutilisé, la réaction s'effectue sans inhiber l'activité de l'enzyme).

La quantité de solvant organique utilisé dans l'extraction de l'indole n'ayant pas réagi varie selon le rapport de répartition de l'indole entre la phase de solvant organique et la phase aqueuse et également le degré de réaction de l'indole. Cependant, étant donné que les enzymes présentant des activités spécifiques déterminées sont disponibles dans le commerce et que le degré de réaction est constant, la quantité de solvant organique utilisé pour l'extraction peut être facilement déterminée.

Il n'y a pas de limitations particulières quant au mode d'extraction de l'indole n'ayant pas réagi, et l'on peut faire appel à tout procédé classique pour cette extraction. En général, une quantité appropriée de solvant organique est ajoutée au mélange réactionnel duquel l'enzyme a été retirée, et le mélange est agité pour établir un contact total entre la phase aqueuse et la phase organique.

Comme indiqué ci-dessus, il est préférable de maintenir le mélange réactionnel de telle sorte que les cristaux de Ltryptophane ne précipitent pas. Du point de vue industriel, il est efficace de conduire l'extraction à chaud afin d'augmenter la solubilité du L-tryptophane dans l'eau. Après une mise en contact uniforme des deux phases comrre ci-dessus, le mélange est laissé au repos pour qu'il se sépare en une phase aqueuse et une phase de solvant organique. L'opération d'extraction peut être exécutée en discontinu, mais du point de vue industriel, elle est conduite en continu par un procédé d'extraction à contrecourant.

Le solvant organique contenant l'indole extrait n'ayant pas réagi est réutilisé dans la réaction suivante après, si nécessaire, l'addition d'une nouvelle charge de solvant, ou son mélange avec un autre solvant, ou introduction d'indole frais.

Ce procédé est d'une grande importance du point de vue industrie car l'indole n'ayant pas réagi peut être efficacement récupéré même lorsque la conversion d'indole varie sous l'effet des fluctuations de l'activité spécifique de l'enzyme qui se produisent souvent dans des réactions enzymatiques. En outre, même si l'indole, tel qu'extrait et récupéré, est réutilisé tel quel, la réaction peut être conduite sans inhiber l'activité de l'enzyme.

Si l'on fait appel au procédé de récupération précité, l'indole n'ayant pas réagi peut être efficacement extrait et récupéré également à partir d'un mélange réactionnel contenant du L-tryptophane obtenu par un procédé classique.

Selon le mode opératoire (B), le mélange réactionnel contenant le L-tryptophane résultant, la matière n'ayant pas réagi, le solvant organique et l'enzyme est tout d'abord séparé en une phase de solvant organique et une phase aqueuse. La phase de solvant organique contenant la matière n' ayant pas réagi est récupérée. Ensuite, l'enzyme est retirée de la phase aqueuse, c'est-à-dire le mélange réactionnel contenant le L-tryptophane pour obtenir le L-tryptophane. Lorsque l'enzyme et le solvant organique sont présents ensemble dans le mélange réactionnel, l'interface entre la phase aqueuse et la phase de solvant organique devient parfois peu visible et leur séparation peut devenir difficile. Dans ce cas, la séparation peut être effectuée par un procédé connu, par exemple en soumettant le mélange réactionnel - un séparateur centrifuge.Si l'ex-traction et la séparation sont répétées en utilisant le solvant organique usagé, l'effet d'élimination de l'indole augmente.

Dans le processus de séparation, le L-tryptophane de la solution aqueuse peut précipiter sous forme de cristaux, mais l'effet de l'extraction de l'indole n'ayant pas réagi est meilleur s'il se trouve à l'état dissous.

Avantageusement, la température au moment de la séparation est inférieure au point d'ébul]ition du solvant organique, et si l'eau et le solvant organique forment un azéotrope, inférieure à son point d'ébullitiont La solution d'indole séparée et récupérée peut être utilisée directement dans la réaction suivante sans aucune difficulté.

I1 n'y a pas de limitation particulière concernant le procédé de séparation de l'enzyme du mélange réactionnel après la séparation de la phase de solvant organique contenant l'indole n'ayant pas réagi. Un procédé d'élimination efficace du point de vue industriel consiste à ajouter un acide minéral au mélange réactionnel restant après l'élimination de la phase de solvant organique pour ajuster le pH du mélange à 2-5, à le chauffer si nécessaire pour favoriser la floculation de l'enzyme, et à éliminer la masse floculée par des moyens tels qu'une filtration. Le L-tryptophane peut être obtenu par concentration du mélange réactionnel duquel l'enzyme a ainsi été séparée.

Gracie au procédé ci-dessus, l'indole n'ayant pas réagi présent dans le mélange réactionnel se déplace vers le solvant organique. Le solvant organique contenant l'indole n'ayant pas réagi peut être utilisé dans la réaction suivante après, si nécessaire, l'addition d'une nouvelle charge de solvant ou une nouvelle charge d'indole.

Ce procédé de récupération est également particulièrement utile dans la production de L-tryotophane par une réaction enzymatique en utilisant l'indole comme seul substrat pour la même raison que dans le mode opératoire (A).

Le procédé de la présente invention est d'une grande importance du point de vue industriel car du L-tryptophane de grande pureté exempt d'indole peut etre obtenu et l'indole de départ peut etre récupéré et réutilisé.

Les exemples suivants illustrent le procédé de la présente invention d'une façon plus détaillée.

Exemple 1.

On introduit dans un ballon de 300 ml, équipé d'un agitateur, 9,27 a de L-sérine, 3 g de sulfate d'ammonium, 10 g de phosphate de pyridoxal et 82,5 g d'eau, et on agite bien le tout. On ajuste le pH du mélange à 8,5 avec une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque et on porte la température à 350C. On ajoute 3 g d'un gateau crème humide de cellules cultivées de Escherichia coli (MT-1O242) contenant de la tryptophane-synthétase. On ajoute ensuite 68,9 o d'une solution dans le citrate d'acétyltributyle de 6,89 o d'indole.On conduit a réaction pendant 48 heures et on dilue le mélange réactionnel jusqu'à un volume total de 300 ml avec une solution aqueuse à 5 X d'hydroxyde de so- dium pour dissoudre complètement le L-tryptophane résultant.

On sépare la solution à l'aide d'une ampoule à décanter en une phase aqueuse et une phase de solvant organique. On centrifuge une partie de la phase aqueuse à l'aide d'un séparateur centrifuge pour que les cellules microbiennes se déposent par sédimentation. On recueille le liquide transparent surnageant et on détermine la concentration de L-tryptophane par chromatographie en phase liquide et on en détermine la quantité obtenue. Le rendement en produit sur la base de l'indole est de 96,5 moles S.

On répète le mode opératoire ci-dessus à la différence près qu'on fait varier la quantité de solvant organique utilisé et le rapport de répartition dans la phase aqueuse. Les résultats sont indiqués sur le tableau 1.

Lorsqu'on conduit la réaction ci-dessus sans ajouter de solvant organique, la concentration d'indole dans le liquide contenant le microorganisme est de 3000 ppm, et le rendement en L-tryptophane est de 47 moles %. On voit d'après cela que, pour la production de L-tryptophane, il importe d'ajouter un solvant organique non miscible à l'eau et de maintenir la concentration d'indole dans le liquide contenant le microorganisme à une faible valeur. En particulier, lorsque la réaction est conduite dans l'eau sans addition de solvant organique, la concentration d'indole dans la phase aqueuse est de 3000 ppm, et le rendement en
L-tryptophane est de 47 moles X sur la base de l'indole.

Par contre, lorsqu'on ajoute du citrate de butyle comme solvant organique et qu'on maintient la concentration d'indole dans la phase aqueuse à -790 ppm, le rendement en Ltryptophane augmente nettement jusqu'à 95 moles X sur la base de l'indole. Lorsque la concentration d'indole dans la phase aqueuse est maintenue à 1070 ppm (supérieure à 800 ppm), le rendement en L-tryptophane diminue d'environ 10 X par rapport à celui obtenu lorsque la concentration d'indole est de 800 ppm.

TABLEAU 1
Quantité de Concentration Concentration Rendement en solvant orga- d'indole dans d'indole dans L-tryptophane nique (01) la solution de le liquide (moles X sur utilisé (g) solvant organi- contenant la base de
que (01)(X en l'enzyme (ppm) l'indole)
poids) (02)
68,9 10 160 96,5
34,45 20 400 96,3
27,56 25 520 95,8
22,97 30 660 96,2
19,69 35 790 95,0
15,31 45 1070 86,3
(o3) ~ 3000 47 (01) : citrate d'acétyltributyle (02) : au début de la réaction (03) : sans addition de solvant organique
Exemple 2.

On-met en suspension dans l'eau 6,8 g (teneur en matières solides 1,7 g) d'un gâteau crème humide de Escherichia coli (MT-10242) contenant de la tryptophane-synthétase et 3,4 g (teneur en matières solides 0,85 g) de Pseudomonas putida (MT-10182) contenant de la sérine-racémase et on ajuste à 20 ml le volume total de la suspension.

On introduit une solution aqueuse consistant en 11,3 g de DL-sérine1 6,0 g de sulfate d'ammonium, 10 mg de phosphate de pyridoxal et 66 g d'eau dans un ballon de 300 ml, et on ajuste le pH de la solution aqueuse à 8,5 avec une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque et on introduit dans le ballon la suspension de cellules microbiennes préparée précédemment.

L'intérieur du ballon est maintenu à 35QC et on ajoute 57,2 g d'une solution dans le toluène de 11,5 g d'indole, puis on conduit la réaction à cette température pendant 48 heures. Au début de la réaction, la concentration en indole dans la phase aqueuse est de 720 ppm.

On analyse le produit réactionnel par le même mode opératoire que dans l'exemple 1. On constate ou'on obtient le L-tryptophane en un rendement de 89,3 moles X sur la base de l'indole.

Afin de déterminer l'effet de la concentration d'indole dans la phase aqueuse, on répète le mode opératoire ci-dessus à la différence près qu'on fait varier la quantité de toluène. Les rendements en L-tryptophane dans ces essais sont indiqués sur le tableau 2.

On voit d'après les résultats que la concentration inhibitrice d'indole dans la phase aqueuse est d'environ 800 ppm. Comme indiqué, lorsque la réaction débute à une concentration d'indole ne dépassant pas 720 ppm, le rendement en tryptcphane est d'environ 90 moles X, mais il diminue à 82 moles X lorsque la réaction débute à une concentration d'indole de 920 ppm.

TABLEAU 2
Quantité de Concentration Concentration Rendement en solution d'indole dans d'indole dans L-tryptophane toluénique la solution la phase aqueuse (moles X sur
(g) toluénique au début de la la base de ~~~~~~~~~~ en Doids) réaction (ppm) l'indole)
115 10 450 91,2
57,5 20 720 89,3
38,3 30 920 82,4
Exemple 3.

Par le même mode opératoire que dans l'exemple 2, on fait réagir de la DL-sérine et de l'indole en présence de cellules cultivées de Escherichia coli (MT-l0232) et de cellules cultivées de Pseudomonas punctata (MT-10243).

Cette fois, on utilise la méthyl-isobutyl-cétone comme solvant organique et on conduit la réaction de telle sorte que la concentration d'indole dans la phase aqueuse au début de la réaction soit ajustée à 760 ppm.

Après avoir conduit la réaction à 350C pendant 48 heures, le rendement en L-tryptophane est de 98,6 moles
X sur la base de l'indole.

Pour déterminer l'effet de la concentration de l'indole dans la phase aqueuse, on fait varier la quantité de méthyl-isobutyl-cétone et on examine les variations du rendement en L-tryptophane. Les résultats sont indiqués sur le Tableau 3.

On voit qu'en maintenant la concentration d'indole dans la phase aqueuse au-dessous de 800 ppm en utilisant la méthyl-isobutyl-cétone, le L-tryptophane peut être obtenu en un rendement supérieur à 99 moles X.

TABLEAU 3
Quantité de Concentration Concentration Rendement en solution d'indole dans d'indole dans L-tryptophane cétonique la solution la phase aqueuse (moles % sur
(g) cétonique au début de la la base de
(% en poids) réaction (ppm) l'indole)
115 10 80 99,8
57,5 20 190 99,9
38,3 30 340 99,8
28,75 40 510 99,6
23,0 50 720 98,6
Exemple 4.

Par le même mode opératoire que dans l'exemple 2, on fait réagir la DL-sérine et l'indole en présence de
Escherichia coli (MT-10242) et de Pseudomonas putida (MT10182). En utilisant l'anisole comme solvant, on maintient la concentration d'indole dans la phase aqueuse au-dessous de 300 ppm.

Après avoir conduit la réaction à 350C pendant 48 heures, le rendement en L-tryptophane sur la base de l'indole est de 95 moles X.

Exemple 5.

On introduit dans un réacteur de 200 ml, 20 g de
DL-sérine, 1,0 g d'acétate d'ammonium1 0,2 g de bisulfate de sodium, 0,1 g de DETA et un bouillon de culture de
Erwinia herbicola (ATCC 21434).

On a préparé le bouillon de culture en cultivant
Erwinia herbicola sous aération à 280C pendant 28 heures dans un milieu de culture consistant en 0,2 % de L-tyrosine, 0,2 X de K2HP04, 0,1 % de MgS04.7H20, 2 ppm de FeS04.7H20, 0,01 X de chlorhydrate de pyridoxine, 0,6 % de glycérol, 0,5 X d'acide succinique, 0,1 X de DL-méthionine, 0,2 % de
DL-alanine, 0,05 X de glycine, 0,1 % de L-phénylalanine et 12 iril d'un hydrolysat de protéines de soja.

On ajoute une solution dans le toluène contenant 0,7 g de pyrocatéchine, et on ajuste la concentration de pyrocatéchine dans.l'eau à une valeur inférieure à 3000 ppm.

Dans ces conditions, on conduit la réaction à une température de 370C et à pH 8 pendant 48 heures. La quantité de
L-DOPA accumulée est de 30 g/litre.

Exemple 6.

On cultive des cellules microbiennes contenant
Escherichia coli à une température de 300C et à pH 7 en présence de phcsphate monopotassique, de phosphate dipotassique, de sulfate d'amnlonium, de chlorure de calcium, de sulfate de fer, d'extrait de levure et de polypeptone tout -en insufflant de l'air dans le milieu de culture et en ajoutant du glucose et de l'indole. En outre, on cultive des cellules microbiennes contenant Pseudomonas nutida dans un milieu de culture analogue à une température de 3o0C et 9 pH 7 tout en insufflant de l'air et en ajoutant du glucose.

En 40 heures, ces cellules microbiennes sont formées en une concentration de 30 à 35 g/litre. A l'aide d'un séparateur centrifuge à très grande vitesse, on les obtient sous forme de gâteaux crème ayant une teneur en eau de 85 à 85 %.

On place dans un ballon de la DL-sérine (77,3 g), 10,5 g de sulfate d'ammonium et 486 g d'eau, et on ajuste le pH du mélange à 8,5 à l'aide d'une solution aqueuse à 29 X d'ammoniaque. De plus, on ajoute 51,2 g du gâteau crème de Escherichia coli et 23,2 g du gâteau crème de Pseudomonas putida et cn agite bien tout le mélange. En outre, on ajoute 392 g d'une solution dans le toluène de 78,4 g d'indole et on conduit la réaction à 350C pendant 40 heures. On constate que la teneur en L-tryptophane dans la masse réactionnelle est de 129,8 g par chromatographie en phase liquide. Son rendement est de 95,0 X sur la base de l'indole.

On chasse le toluène par distillation et on dilue le mélange réactionnel à l'eau pour ajuster la concentration de L-tryptophane à 4,2 % en poids. On ajuste le pH du mélange à 4,0 avec de l'acide sulfurique à 98 X et on ajoute 27 g de carbone activé. On élève la température à 950C et on maintient le mélange à 95-980C pendant 1 heure et le filtre à chaud à cette température pour enlever les cellules ainsi que le carbone activé. A 800C, le toluène récupéré est ajouté au filtrat, et on agite bien le tout. On arrête l'agitation, et on laisse reposer le mélange. Il se sépare en une phase toluénique supérieure et une phase aqueuse inférieure. On élimine la phase toluénique et on ajoute de nouveau la même quantité de toluène que ci-dessus à la phase aqueuse et on répète l'extraction.

La concentration d'indole dans la phase aqueuse est de 55 ppm après la première extraction et de 4 ppm après la deuxième extraction.

On concentre la phase aqueuse. jusqu'à une concentration de L-tryptophane de 10 x en poids, et on refroidit à 200C. On recueille par filtration les cristaux de L-tryptophane précipités, on les lave à l'eau et les sèche. La quantité de L-tryptophane isolé est de 100 g. I1 présente une pureté de 99.5 % et une teneur en indole de 0 ppm.

Lorsqu'on utilise la solution toluénique récupérée d'indole dans la réaction suivante après introduction de toluène supplémentaire, le rendement en L-tryptophane n'est pas modifié et la réaction s'effectue dans de bonnes conditions.

Les résultats sont indiqués sur le tableau 4.

TABLEAU 4
Nombre de recyclages de la Rendement en l,-tryptophane phase toluénique extraite (moles S sur la base de l'indole)
0 95,0
1 98,3
2 98,6
3 97,0
4 95,4
5 98,7
On extrait 316 g de chacun des mélanges réac tionnels contenant 500 ppm et 2000 ppm d'indole n'ayant pas réagi avec 27,6 g de toluène à 800C et on examine la relation existant entre le nombre d'extractions et la concentration d'indole restant dans la phase aqueuse. Les résultats sont indiqués sur le tableau 5.

TABLEAU 5
Concentration d' indole Nombre Concentration d'indans la phase aqueuse d'extractions dole dans l'eau au début de la réac- après extraction tjon (dam) ~~~~~~~~~~~~~ (ppm)
2000 1 299
299 2 54
54 3 9,8
500 1 45
45 2 18
18 3 3
Exemple 7.

On produit du L-tryptophane en faisant réagir la
L-sérine et l'indole dans l'eau et la diisobutyl-cétone à une température de 350C et à un pH de 8,5 en présence de cellules de Escherichia coli cultivées par le même mode opératoire que dans l'exemple 6. Le rendement en L-tryptophane est de 98,3 X sur la base de l'indole.

On distille le mélange réactionnel pour séparer la diisobutyl-cétone, et on le traite à l'aide d'un séparateur centrifuge pour obtenir un gâteau crème humide contenant le L-tryptophane et les cellules microbiennes.

On verse le gâteau crème dans l'eau et le dilue à l'eau jusqu'à une concentration de L-tryptophane de 0,8 X en poids. On dissout les cristaux de L-tryptophane dans l'eau et on fait passer la solution à travers une membrane d'ultrafiltratjon à la température ambiante pour éliminer les cellules microbiennes. Cette fois, la concentration d'indole dans la phase aqueuse est de 90 ppm. On ajoute de la diisobutyl-cétone en une quantité égale au cinquième de la quantité de phase aqueuse et on agite le mélange. On laisse reposer le mélange pour qu'il se sépare en deux phases. On élimine la phase de diisobutyl-cétone. Ensuite, on répète la même opération d'extraction en utilisant la même quantité de diisobutyl-cétone que dans l'opération précédente.

La concentration d'indole dans la phase aqueuse est de 32 ppm après la première extraction et de 2 ppm après la deuxième extraction.

On utilise la phase de diisobutyl-cétone contenant l'indole dans la réaction suivante après avoir ajouté la quantité nécessaire d'indole. La réaction suivante n'offre aucune difficulté.

Exemple 8.

On produit du L-tryptophane en faisant réagir de la DL-sérine et de l'indole à pH 8,5 et à une température de 350C pendant 48 heures dans l'eau et du benzène en présence de Escherichia coli et Pseudomonas punctata cultivés et recueillis par le même mode opératoire que dans l'exemple 6. Le rendement en L-tryptophane est de 93,7 X sur la base de l'indole.

On distille enduite le mélange réactionnel pour chasser le benzène, puis on le dilue à l'eau jusqu'à une concentration en L-tryptophane de 4,2 X en poids. On ajuste le pH du mélange dilué à 3,5 avec de l'acide chlorhydrique, et on ajoute 15 X en poids, sur la base du tryptophane résultant, de carbone activé. On chauffe le mélange à 95-980C pendant 1 heure. On le filtre à la presse à la même température pendant 1 heure. On ajoute au filtrat du benzène à 800C. On agite bien le mélange puis on le laisse reposer pour qu'il se sépare en deux phases. Le benzène utilisé est celui récupéré par distillation comme ci-dessus. On répète la même opération d'extraction trois fois en utilisant la même quotité de benzène frais.La concentration d'indole dans la phase aqueuse est de 1850 ppm avant l'ex traction, de 265 ppm après la première extraction, de 43 ppm après la deuxième extraction, et de 4,6 ppm après la troisième extraction. Lorsque le mélange réactionnel est concentré et cristallisé on obtient du L-tryptophane ayant une pureté de 99,7 X en un rendement de 69,8 t sur la base de l'indole. Sa teneur en indole est de 2,1 ppm.

On utilise la solution benzénique récupérée d'indole dans la réaction suivante après avoir introduit la quantité nécessaire d'indole frais. a réaction suivante n'offre pas de difficulté.

Exemple 9.

On agite bien à 350C dans un ballon de 300 ml une solution aqueuse constituée de 11,3 g de DL-sérine, 6,0 g de sulfate d'ammonium, 10 mg de phosphate de pyridoxal et 66 g d'eau distillée, et on ajoute une solution aqueuse d'ammoniaque à 29 X pour ajuster le pH de la solution à 8,5.

Ensuite, on ajoute 4,0 g d'un gâteau crème de cellules contenant Escherichia coli cultivé par le même mode opératoire que dans l'exemole 6 et 2,5 g d'un gâteau crème de cellules contenant Pseudomonas putida cultivé par le même mode opératoire que dans l'exemple 6, et on agite bien à 350C pour les disperser.

En outre, on ajoute une solution de 11,5 g d'indole dans 26,8 g de diisobutyl-cétone, et on agite le mélange à 350C et à 90 tours/minute pendant 40 heures.

A la finde la réaction, on interrompt l'agitation.

On laisse le mélange réactionnel reposer pour qu'il se sépare en deux phases. On enlève la phase supérieure de diisobutyl-cétone. On ajoute de la diisobutyl-cétone en la même quantité que ci-dessus et on agite le mélange à 90 tours/ minute pendant 30 minutes. On laisse ensuite reposer le mélange, et on récupère la phase de diisobutyl-cétone de la même manière que ci-dessus.

On constc.tp que l'indole n'ayant pas réagi restant dans le mélange réactionnel à la fin de la réaction est récupéré en une proportion de 85 S par la première extraction avec la diisobutyl-cétone, et en une proportion de 99 % par la deuxième extraction. La quantité d'indole est déterminée par chromatographie en phase gazeuse.

Lorsqu'on utilise la diisobtyl-cétone récupérée dans la réaction suivante après avoir introduit une quantité requise d'indole, on ne rencontre pas de difficulté.

Exemple JO.

On conduit la meme réaction que dans l'exemple 9 à une vitesse de rotation de 640 tours/minute en utilisant 45,7 g de toluène. A la fin de la réaction, on soumet le mélange réactionnel à une séparation par centrifugation pour rendre distincte l'interface entre les deux phases! car il forme une émulsion uniforme.

On enlève la phase supérieure toluénique. Ensuite, on ajoute du toluène en la même quantité, et on répète lex- traction de l'indole n'ayant pas réagi.

On constate que l'indole n'ayant pas réagi présent dans le mélange réactionnel à la fin de la réaction est récupéré en une proportion de 87 % par la première extraction, et de 99,9 % par la deuxième extraction
Le toluène récupéré contenant l'indole est utilisé dans la réaction suivante après introduction de la quantité requise d'indole. Il ne se présente aucune difficulté dans la réaction suivante.

Exemple 11.

On conduit la même réaction que dans l'exemple 9 en utilisant 14,3 g de citrate d'éthyle. A la fin de la réaction, on soumet le mélange réactionnel sous la forme d'une émulsion uniforme à une séparation continue par centrifugation pour le séparer en une phase aqueuse et une phase de citrate d'éthyle. On ajoute à la phase aqueuse la même quantité de citrate d'éthyle que celle utilisée dans la réaction et on sépare encore le mélange en une phase aqueuse et une phase organique au moyen d'un séparateur centrifuge travaillant en continu.

On prélève une partie de la phase aqueuse comme échantillon et on analyse le tryptcphane résultant par chromatographie en phase liquide à haute performance. On constate que son rendement est de 99,7 X sur la base de l'indole.

On dilue le mélange réactionnel à l'eau jusqu'à une concentration en L-tryptophane de 4,2 X en poids et on ajuste le pH à 3,5 avec de l'acide sulfurique. On ajoute du carbone activé en poudre en une proportion de 15 X en poids sur la base du L-tryptophane, et on chauffe le mélange à 900C pendant 1 heure. Après dissolution totale des cristaux de L-tryptophane, on filtre la solution à la trompe à la même température pour enlever les cellules microbiennes ainsi que le carbone activé.

On concentre le filtrat chaud jusqu'à une concentration en L-tryptophane de 10 X en poids et on le refroidit jusqu'à 100C. On ajuste ensuite le pH de la solution à 5,9 et on sépare par filtration les cristaux précipités en forme d'écailles, on les lave à l'eau et on les sèche.

Le rendement en L-tryptophane isolé est de 74,5 moles X sur la base de l'indole. Sa pureté est de 99,4 X et sa teneur en indole est de 1,2 ppm.

Le citrate d'éthyle récupéré contenant l'indole est utilisé dans la réaction suivante après introduction d'une quantité requise d'indole. Aucun effet n'est exercé sur le rendemen; en L-tryptophane dans la réaction suivante et la réaction évolue dans des conditions satisfaisantes.

Exemple 12.

Des cellules contenant Escherichia coli et des cellules contenez. Pseudomonas nutida sont cultivées chacune de la 1lême manière que dans l'exemple 9 et soumises à une séparation par centrifugation pour former des gâteaux crème de cellules des deux microorganismes ayant chacun une teneur en eau de 75 X.

Une solution aqueuse constituée de 77,3 g de DLsérine, 10,5 g de sulfate d'ammonium et 486 g d'eau est ajustée à pH 8,5 avec une solution aqueuse à 2 X d'ammoniaque, et on ajoute 51,2 g du gâteau crème de cellules de
Escherichia coli et 23,2 g du gâteau crème de cellules de
Pseudomonas tutida obtenus comme ci-dessus. On les disperse par agitation poussée et on ajoute 392 g d'une solution toluénique de 78,4 g d'indole. On conduit la réaction à 350C pendant 48 heures.

A la fin de la réaction, on prend une partie du mélange réactionnel et on le sépare en une phase toluénique et une phase aqueuse par centrifugation. On dissout le Ltryptophane par addition d'une substance alcaline à la phase aqueuse dans laquelle les cristaux de 1.-tryptophane précipitent. Ensuite, on fait passer la phase aqueuse à travers un filtre à membrane pour séparer les cellules microbiennes. On soumet le filtrat à une chromatographie en phase liquide à haute performance pour déterminer la teneur en L-tryptophane.

On constate que le rendement en L-tryptophane du mélange réactionnel est de 99,3 moles X sur la base de l'indole.

On prend une autre portion du mélange réactionnel et la sépare en une phase aqueuse et une phase toluénique à l'aide d'un séparateur centrifuge. La concentration de l'indole n'ayant pas réagi présent dans le toluène, telle que mesurée par chromatographie en phase liquide, est de 2,3 ppm.

Lorsque la solution toluénique contenant l'indole est utilisée dans la réaction suivante après addition d'une quantité requise d'indole frais, aucun effet n'est exercé sur le rendement en L-tryptophane, et la réaction évolue dans de bonnes conditions.

Les résultats sont indiqués sur le tableeu 6.

TABLEAU 6
Nombre de recyclages de la Rendement en L-tryptophane phase toluénique récupérée (moles X sur la base de
I'indole)
0 99,3
1 98,5
2 98,9
3 99,2
4 98,2
5 99,4
La phase aqueuse récupérée par séparation centrifuge est diluée à l'eau jusqu'à une concentration en Ltryptophane de 4,2 X en poids et ajustée à pH 4,0 avec de l'acide sulfurique à 98 X. On ajoute du carbone activé en poudre (27 g) et on porte la température du mélange à 980C.

On maintient ensuite le mélange à 98-1000C pendant 1 heure pour dissoudre les cristaux précipités de L-tryptophane.

On sépare les cellules microbiennes ainsi que le carbone activé par filtration à chaud. On concentre le filtrat jusqu'à une concentration en L-tryptophane de 15 S en poids pour précipiter des cristaux de L-tryptophane analogues à des écailles. On sépare les cristaux par filtration à 100C, on les lave à l'eau et les sèche pour obtenir des cristaux jaune pâie, analogues à des écailles, de L-tryptophane ayant une pureté de 99,2 X en un rendement de 81,3 moles X sur la base de indole. Les cristaux de L-tryptophane résultant ont un pouvoir rotatoire spécifique de.

-31,80, une teneur en métaux lourds inférieure à 20 ppm, un résidu de combustion de 0,02 X en poids et.une teneur en ammonium de 0,01 X en poids.

Claims (1)

1. REVENDICATION

   Procédé pour éviter que l'activité d'une enzyme soit dégradée par un substrat dans une réaction enzymatique en phase aqueuse, caractérisé en ce qu'on assure la présence d'un solvant organique non miscible-à l'eau mais miscible au substrat dans le système réactionnel, de manière à réduire la concentration du substrat dans la phase aqueuse à une valeur inférieure à la concentration à laquelle l'activité de l'enzyme est sensiblement inhibée.