CH666695A5

CH666695A5 - Procede enzymatique de preparation de l-amino acides contenant du soufre.

Info

Publication number: CH666695A5
Application number: CH1632/86A
Authority: CH
Inventors: Masao Shimada; Takeshi Nakamura; Kenichi Ishiwata; Nobuyoshi Makiguchi; Masami Uemura
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-22
Publication date: 1988-08-15
Also published as: JPH0527389B2; IT1190275B; FR2580667A1; GB2174390A; KR890004021B1; IT8647912A0; KR860008273A; DE3613388C2; GB8609015D0; JPS61242589A; GB2174390B; NL8600984A; FR2580667B1; AU5634886A; AU562772B2; CA1299127C; DE3613388A1

Description

DESCRIPTION

La présente invention concerne un procédé de préparation de L-cystéine et/ou de L-cystine par réaction d'une L-alanine substituée en position ß avec un sulfure métallique, un hydrosulfure métallique, un polysulfure métallique, le sulfure d'ammonium, l'hydrosulfure d'ammonium ou un polysulfure d'ammonium, en présence de tryptophane synthase.

La L-cystéine et la L-cystine sont largement utilisées en cosmétique, dans l'industrie alimentaire, en tant qu'additif alimentaire, et pour d'autres applications ainsi que pour des applications médicales, par exemple en tant qu'ingrédient de liquide pour transfusions.

On connaît jusqu'à présent différents procédés de préparation de L-cystéine et de L-cystine. A titre d'exemple caractéristique de tels procédés connus, on peut citer les suivants: (1) extraction à partir de matières naturelles, telles que les cheveux et les poils, (2) synthèses chimiques comme décrit, par exemple, dans la demande de brevet japonais publiée N° SHO 57-200356, (3) synthèse enzymatique à partir d'acide DL-2-aminothiazoline-4-carboxylique, comme décrit dans le brevet japonais publié N° SHO 54-2272, et (4) réaction d'une alanine substituée en ß avec un sulfure ou un hydrosulfure métallique, en présence de cystéine désulfhydrase, comme décrit dans le brevet japonais publié N° SHO 57-21311. Toutefois, de tels procédés ne présentent pas nécessairement les avantages requis pour une mise en œuvre industrielle.

Compte tenu de l'état de la technique susmentionné, la présente invention résulte d'études entreprises en vue du développement d'un procédé nouveau de préparation de L-cystéine et/ou de L-cystine, d'un faible prix de revient, et de la découverte.du fait que l'on peut produire de la L-cystéine et/ou de la L-cystine par réaction d'une L-alanine substituée en ß avec un sulfure métallique, un hydrosulfure métallique, un polysulfure métallique, le sulfure d'ammonium, l'hydrosulfure d'ammonium ou un polysulfure d'ammonium, en présence de tryptophane synthase. En conséquence, le procédé selon l'invention présente les caractéristiques spécifiées dans la revendication 1.

Comme on le sait, la tryptophane synthase est largement répandue dans les micro-organismes, les plantes supérieures et d'autres sources de cette substance. A ce sujet, on peut se référer, par exemple, à l'article publié dans «Bacteriological Reviews», vol. 39, N° 2, pages 87-120 (1975).

Pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, on utilisera habituellement de la tryptophane synthase produite à partir de micro-organismes, mais cela ne constitue pas la seule source d'enzyme utilisable. A titre d'exemple de souches de micro-organisme producteur de tryptophane synthase, on peut, par exemple, citer les suivantes: Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coli MT-

10242 (FERM BP-20), Neurospora crassa ATCC-14692 et Saccharo-myces cerevisiae ATCC-26787.

Des méthodes d'extraction de tryptophane synthase à partir de cultures cellulaires sont connues et décrites, par exemple, dans «Journal of Biological Chemistry», vol. 249, N° 24, pages 7756-7763 (1974) pour E. coli', idem, vol. 250, N° 8, pages 2941-2946 (1975) pour Neurospora crassa; et «European Journal of Biochemistry», vol. 102, pages 159-165 (1979) pour Saccharomyces cerevisiae, respectivement.

La tryptophane synthase utilisable pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention n'est pas nécessairement une enzyme extraite et purifiée. Comme source d'enzyme, pour la mise en œuvre du procédé selon la présente invention, on peut utiliser, par exemple, des cultures de micro-organismes producteurs de tryptophane synthase, des cellules vivantes recueillies à partir de cultures par centri-fugation ou méthode du même genre, des produits de dessiccation provenant de telles cellules et des débris de cellules obtenus par broyage, traitement des cellules aux ultrasons ou d'autres manières appropriées, ou par autolyse de celles-ci. On peut également utiliser des extraits provenant de telles cellules et des enzymes brutes obtenues à partir de ces extraits. En outre, on peut naturellement utiliser des cellules ou enzymes immobilisés.

On peut utiliser tout milieu synthétique ou naturel pour la culture de cellules productrices de tryptophane synthase, à condition qu'ils contiennent une source de carbone, une source d'azote, des minéraux et, éventuellement, une petite quantité d'agents nutritifs secondaires. Il peut parfois être utile d'ajouter de petites quantités de tryptophane ou d'indole au milieu de culture. Egalement, on peut parfois augmenter la quantité de tryptophane synthase produite grâce à des adjonctions de petites quantités d'acide indole-acrylique au milieu de culture.

On effectue la culture de manière aérobie, en secouant la culture ou en la soumettant à une agitation par aération. De préférence, la température de culture est dans le domaine de 20 à 40° C, habituellement de 25 à 37° C. Le pH du milieu de culture est de 5 à 8.

Comme on le sait, la tryptophane synthase est une enzyme multi-fonctionnelle, c'est-à-dire que l'enzyme catalyse non seulement la synthèse de L-tryptophane à partir d'acide indole-3-glycérophospho-rique et de L-sérine, mais également de nombreuses autres réactions, comme décrit, par exemple, dans «Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology», vol. 49, pages 127-185 (1979).

Toutefois, la présente invention résulte de la découverte du fait que la réaction selon l'invention peut être catalysée par la tryptophane synthase.

Parmi les L-alanines substituées en ß, qui constituent l'un des substrats de la réaction, on peut utiliser par exemple: des L-alanines ß-halogénées, telles que la ß-chloro-L-alanine et la ß-bromo-L-alanine; des O-alkyl-L-sérines, telles que la O-méthyl-L-sérine et la O-éthyl-L-sérine; des S-alkyl-L-cystéines, telles que la S-méthyl-L-cystéine et la S-éthyl-L-cystéine; la O-acétyl-L-sérine; la O-benzyl-L-sérine; la S-benzyl-L-cystéine; le O-sulfate de L-sérine; la L-sérine etc.

Comme exemple de sulfure, hydrosulfure ou polysulfure, qui constituent l'autre substrat que l'on peut utiliser pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, on peut mentionner les composés suivants: sulfures métalliques tels que sulfure de sodium, sulfure de potassium et sulfure de lithium; hydrosulfures métalliques tels que hydrosulfure de sodium, hydrosulfure de potassium et hydrosulfure de lithium; polysulfures métalliques tels que polysulfures de sodium et polysulfures de potassium; sulfure d'ammonium; hydrosulfure d'ammonium; polysulfures d'ammonium, etc.

Conformément à l'invention, on fait habituellement réagir la L-alanine substituée en ß et le sulfure, hydrosulfure ou polysulfure dans un milieu aqueux, à un pH de 6 à 10, en présence de tryptophane synthase. On choisit la température de réaction dans la gamme de 20 à 60° C. La durée de réaction est généralement comprise entre 1 et 100 heures, pour chaque lot soumis à la réaction,

bien qu'elle puisse varier, selon le titre de l'enzyme, les concentra5

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tions des substrats utilisés et les autres paramètres. On peut effectuer la réaction en milieu stationnaire ou sous faible agitation.

Il n'y a pas de limite particulière aux concentrations des substrats, L-alanine substituée en ß et sulfure, hydrosulfure ou polysulfure, mais celles-ci sont habituellement dans la gamme de 0,1 à 30% en poids environ. On peut ajouter la totalité des substrats en une seule fois, au début de la réaction ou, en variante, on peut les ajouter par fractions au fur et à mesure de l'avancement de la réaction. Avantageusement, le sulfure, hydrosulfure ou polysulfure est présent dans le milieu réactionnel en quantité équimolaire ou en excès par rapport à la L-alanine substituée en ß. Il est avantageux d'ajouter une petite quantité d'un coenzyme, le pyridoxal phosphate, en plus des substrats.

Lorsqu'on utilise, comme source d'enzyme, des cellules ou un milieu de culture d'un micro-organisme capables de produire la tryptophane synthase, on peut augmenter le rendement par adjonction, au milieu réactionnel, d'au moins un composé choisi parmi les alcools, les esters, les cétones et les agents tensioactifs. Comme alcool, on peut utiliser, par exemple, l'éthanol, le 1-propanol, le 2-propanol, le 1-butanol, le 2-butanol, l'alcool isobutylique, l'alcool tertiobutylique, le 1-pentanol, le 1-octanol, etc. Comme ester, on peut utiliser, par exemple, le formiate d'éthyle, le formiate de propyle, le formiate de butyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de propyle, l'acétate de butyle, l'acétate d'isobutyle, etc. Comme cétone, on peut utiliser, par exemple, l'acétone, la méthyléthylcé-tone, la méthylisobutylcétone, etc. Comme agent tensioactif, on peut utiliser par exemple des agents tensioactifs anioniques, tels que le dodécylsulfate de sodium et le déoxycholate de sodium, des agents tensioactifs non ioniques, tels que les éthers éthylphényliques et d'autres agents tensioactifs. La quantité de ces composés ajoutés au milieu réactionnel est habituellement dans la gamme de 0,01 à 5%, en poids, bien qu'elle puisse varier selon le type de composé ou la souche utilisée.

Lorsque l'on effectue la réaction de cette manière, le milieu réactionnel contient généralement un mélange de L-cystéine et L-cystine, en raison du fait que la L-cystéine produite est facilement oxydée et transformée en L-cystine. La quantité de L-eystine augmente progressivement au fur et à mesure de l'avancement de la réaction. Toutefois, on peut faire varier le rapport de la concentration en L-cystéine par rapport à celle de L-cystine en agissant sur les paramètres réactionnels.

On peut effectuer la séparation de la L-cystéine ou de la L-cystine du milieu réactionnel de toute manière connue appropriée. Par exemple, on peut isoler facilement la L-cystine, qui est difficilement soluble dans l'eau, en aérant le milieu réactionnel, de manière à oxyder une proportion importante de L-cystéine en L-cystine, après la fin de la réaction. On peut obtenir la L-cystéine en soumettant la L-cystine ainsi obtenue à une réduction par voie électrolytique.

On a effectué la détermination quantitative des teneurs en L-cystéine et L-cystine par Chromatographie en phase liquide. En outre, la Chromatographie en phase liquide, effectuée en utilisant une colonne pour la séparation des isomères optiques, a montré que la cystéine et la cystine produites avaient toutes deux la configuration L.

On va maintenant donner des exemples de mise en œuvre du procédé selon l'invention.

Exemple 1 :

On a inoculé de 1'Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20)

dans un milieu liquide renfermant 1 % d'extrait de viande, 0,5% de peptone, 0,1% d'extrait de levure et 0,2% de KH2P04, de pH 7,0, et on l'a cultivé pendant 20 heures, sous agitation, à 30° C. Après la culture, on a isolé les cellules par centrifugation et purifié l'enzyme selon la méthode de O. Adachi et al., décrite dans «The Journal of Biological Chemistry», vol. 249, N° 24, pages 7756-7763 (1974). On a utilisé dans la réaction suivante l'enzyme tryptophane synthase ainsi obtenue qui avait une activité spécifique (titre) de 9,2 unités par mg. L'activité de l'enzyme a été déterminée par la méthode de

C. Yanofsky et al., décrite dans «Methods in Enzymology», vol. 15, pages 801-807 (1962). Une unité est représentée par la quantité d'enzymes produisant 1 |imol/min de tryptophane à partir de L-sérine et d'indole, à 37° C, et à pH 7,8.

On a ajouté 0,5 mg de tryptophane synthase à 10 ml d'un milieu réactionnel, de pH 8,5, contenant 50 mM de L-sérine, 100 mM d'un sulfure, hydrosulfure ou polysulfure, comme indiqué au tableau 1, et 0,1 mM de pyridoxal phosphate et l'on a agité doucement à 35° C, pendant 10 heures. Les concentrations de L-cystéine et de L-cystine produites ainsi que les rendements en quantité totale de ces composés, par rapport à la L-sérine, sont indiqués au tableau 1.

Tableau 1

Nature des sulfures, etc.

L-cystéine (mM)

L-cystine (mM)

Rendement (moles %)

Sulfure de sodium

18

6,5

62

Hydrosulfure de sodium

16

5

52

Sulfure de potassium

11

3,5

36

Sulfure d'ammonium

8

1,5

22

Hydrosulfure d'ammonium

6

2

20

Trisulfure d'ammonium

6

1,5

18

Disulfure de sodium

11

3

34

Exemple 2;

On procède à la culture de Neurospora crassa ATCC-14692,

selon la méthode de W.H. Matchett et al., décrite dans «The Journal of Biological Chemistry», vol. 250, N° 8, pages 2941-2946 (1975) et on purifie l'enzyme. L'enzyme tryptophane synthase ainsi obtenue avait une activité spécifique de 1,3 unité par mg.

On a utilisé l'enzyme liquide dans la réaction suivante. On a soumis à une agitation modérée, à 35° C, pendant 10 heures, un milieu réactionnel (pH 8,5,10 ml) contenant 50 mM de L-sérine, 100 mM d'hydrosulfure de sodium, 0,1 mM de pyridoxal phosphate et 1,3 unité de tryptophane synthase. On a obtenu ainsi la production de 12 mM de L-cystéine et 4 mM de L-cystine dans le milieu réactionnel.

Exemple 3:

On a inoculé du Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787 dans un milieu liquide renfermant 1% de peptone, 0,5% d'extrait de levure, 2% de glucose et 0,01% d'acide indole-acrylique, ce milieu ayant un pH de 6,0, et on a procédé à la culture, sous agitation, à 30° C, pendant 20 heures. Après culture, on a recueilli les cellules par centrifugation. On a purifié l'enzyme selon la méthode de M. Dettwiler et al., décrite dans «European Journal of Biochemistry», vol. 102, pages 159-165 (1979). On a ainsi obtenu de la tryptophane synthase ayant une activité spécifique de 1,2 unité par mg.

On a utilisé l'enzyme liquide pour effectuer la réaction suivante. On a agité doucement, à 35° C, pendant 10 heures, un milieu de réaction liquide (10 ml) contenant 50 mM de L-sérine, 100 mM d'hydrosulfure de sodium, 0,1 mM de pyridoxal phosphate et 1,2 unité de tryptophane synthase. Le milieu de réaction liquide résultant contenait 11 mM de L-cystéine et 3 mM de L-cystine produits par la réaction.

Exemple 4:

On a inoculé Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) dans un milieu de réaction liquide à pH 7,0, contenant 1 % d'extrait de viande, 0,5% de peptone, 0,1% d'extrait de levure et 0,2% de KH2P04, puis maintenu sous agitation à 30° C, pendant 20 heures. Après culture, on a recueilli les cellules par centrifugation et on les a utilisées en tant que source d'enzyme tryptophane synthase. Les cellules humides avaient une activité spécifique de 120 unités par g.

On a maintenu sous agitation, à 35° C, pendant 24 heures, un milieu réactionnel (100 ml) contenant 200 mM de L-sérine, 300 mM

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de sulfure de sodium, 0,1 mM de pyridoxal phosphate et 5 g des cellules humides, ce milieu ayant été ajusté à un pH de 8,5, au moyen de HCl. Après la fin de la réaction, on a réduit la L-cystine présente dans le milieu réactionnel en L-cystéine au moyen de dithiothréitol. La quantité de L-cystéine produite était de 98 mM.

fie empie 1:

On a utilisé la tryptophane synthase obtenue selon l'exemple 1 dans la réaction suivante.

On a ajouté la tryptophane synthase (500 unités) à 100 ml d'un milieu réactionnel liquide contenant 300 mM d'une L-alanine substituée en ß, indiquée au tableau 2, 600 mM d'hydrosulfure de sodium, 1 mM de pyridoxal phosphate et 480 mM de tampon tris-aminomé-thane-HCl, pH 8,5, puis maintenu sous agitation modérée à 35° C, pendant 1 heure. Après la fin de la réaction, on a réduit la L-cystéine présente dans le milieu réactionnel liquide en L-cystéine au moyen de dithiothréitol, puis mesuré la quantité de L-cystéine. Les résultats sont indiqués au tableau 2.

Tableau 2

L-alanine substituée en

L-cystéine (mM)

ß-chloro-L-alanine

82

O-méthyl-L-sérine

116

O-acétyl-L-sérine

95

O-benzyl-L-sérine

24

S-méthyl-L-cystéine

27

S-éthyl-L-cystéine

18

S-benzyl-L-cystéine

5

O-sulfate de L-sérine

37

L-sérine

123

Exemple 6:

On a inoculé Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19) dans un milieu liquide de pH 7,0, contenant 1% d'extrait de viande, 0,5% de peptone, 0,1 % d'extrait de levure et 0,2% de KH2P04 puis maintenu le milieu de culture sous agitation, à 30° C, pendant 20 heures. Après culture, on a recueilli les cellules par centrifugation puis congelé à — 20° C pour les conserver en tant que source d'enzyme tryptophane synthase. Les cellules humides avaient une activité de tryptophane synthase de 89 unités par g. On a utilisé les cellules ainsi conservées pour effectuer la réaction suivante.

On a soumis à agitation modérée, à 35° C, pendant 10 heures, un milieu réactionnel (100 ml) contenant 200 mM de L-sérine, 300 mM de sulfure de sodium, 0,1 mM de pyridoxal phosphate, 100 mM de tampon tris-aminométhane-HCl (pH 8,5) et 5 g de cellules humides. Après la fin de la réaction, on a réduit la L-cystine présente dans le milieu réactionnel en L-cystéine, par le dithiothréitol, et l'on a mesuré la quantité de L-cystéine produite. La quantité ainsi déterminée était de 114 mM.

Exemple 7:

On a utilisé les cellules humides obtenues selon l'exemple 6 dans la réaction suivante.

On a soumis à agitation modérée, à 35° C, pendant 10 heures, un milieu réactionnel liquide (100 ml) à pH 8,0, contenant 200 mM (2,1 g) de L-sérine, 1000 mM d'hydrosulfure de sodium, 0,1 mM de pyridoxal phosphate et 5 g de cellules humides. On a ensuite ajouté de la L-sérine au bout de 2 heures et 5 heures après le début de la réaction, chaque fois en quantité de 2,1 g. Au cours de la réaction, on a maintenu à 8,0 le pH du milieu réactionnel liquide par adjonction d'acide phosphorique 6N. Après la fin de la réaction, on a constaté que 4,3 g de L-cystéine et 1,1 g de L-cystine étaient accumulés dans le milieu réactionnel liquide.

Exemple 8:

On a directement utilisé les cellules humides obtenues dans l'exemple 4 en tant que source d'enzyme tryptophane synthase dans la réaction suivante.

On a soumis à une agitation modérée, à 35° C, pendant 5 heures, un milieu réactionnel (100 ml, pH 8,5) contenant 200 mM de L-sérine, 300 mM de sulfure de sodium, 1 mM de pyridoxal phophate, 5 g de cellules humides et le composé indiqué au tableau 3. On a maintenu le pH du milieu réactionnel à 8,5+0,3 pendant la réaction. Après la fin de la réaction, on a réduit la L-cystine présente dans le milieu réactionnel en L-cystéine, au moyen de dithiothréitol, et on a mesuré ensuite la quantité de L-cystéine produite. Les résultats de ces mesures sont indiqués au tableau 3.

Tableau 3

Composé ajouté (concentration g/1)

Quantité de L-cystéine (mM)

Témoin

(0)

67,2

Ethanol

(10)

99,6

1-Propanol

(10)

119,4

2-Propanol

(10)

105,6

1-Butanol

(10)

140,0

2-Butanol

(10)

128,7

Alcool isobutylique

(5)

114,8

Alcool tert.-butylique

(5)

107,2

1-Pentanol

(5)

106,5

1-Octanol

(10)

128,7

Formiate d'éthyle

(5)

96,7

Formiate de propyle

(5)

99,8

Formiate de butyle

(5)

104,3

Acétate de méthyle

(5)

98,4

Acétate d'éthyle

(5)

108,9

Acétate de butyle

(5)

162,5

Acétate d'isobutyle

(5)

129,1

Acétone

(5)

96,5

Méthyléthylcétone

(5)

111,8

Méthylisobutylcétone

(5)

167,0

Déoxycholate de sodium

(1)

139,4

Dodécylsulfate de sodium

(1)

160,9

Triton X-100

(1)

160,7

4

s

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R

Claims

666 695 2 REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de L-cystéine et/ou L-cystine, caractérisé en ce qu'on fait réagir une L-alanine substituée en ß, représentée par la formule générale (I):

X-CH2-CHCOOH (I)

I

nh2

dans laquelle X représente un atome d'halogène ou un groupe —OR ou —SR dans lequel R est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, acétyle ou benzyle ou un groupe acide sulfonique, avec un sulfure métallique, un hydrosulfure métallique, un polysulfure métallique, le sulfure d'ammonium, l'hydrosulfure d'ammonium ou un polysulfure d'ammonium, en présence de tryptophane synthase.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la réaction en présence de 0,01 à 5% en poids d'au moins un composé choisi parmi les alcools, les esters, les cétones et les agents tensioactifs.