LU85096A1 - Synthese enzymatique de l-serine - Google Patents

Description

r 1 • Synthèse enzymatique de L-sérine,

La présente invention concerne un procédé en vue d'effectuer la synthèse de lucide aminé L-sérine. L'acide aminé L-sérine est un produit com-5 mercial intéressant qui est utilisé dans des composi tions d'hyperalimentation et des compositions nutri- * tives et que l'on emploie également comme produit intermédiaire ou matière de départ dans certains procédés de synthèse. Dès lors, il existe une demande 10 pour la L-sérine et différents procédés ont été élaborés pour sa préparation. Un certain nombre de ces procédés consistent à produire la L—sérine par fermentation (voir, par exemple, Morinagà, Y. et al., Agric. Biol. Chem. 45(6)1419-24 (198I) \ Morinaga, Y et al., 15 Agric. Biol. Chem. 45(6) 1425-1430 (198I)). De même, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3.616.224 accordé aux noms de Shiio et al., (1971)3 on décrit un procédé pour la production de différents acides aminés, y compris la sérine, par fermentation, procédé 20 au cours duquel on cultive des souches de certaines bactéries sur des milieux contenant du méthanol comme source de carbone assimilable. On se référera également au brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3*943.038 accordé aux noms de Morinaga et al. (1976) dans lequel 25 on décrit un procédé de préparation de sérine et , d'autres acides aminés en cultivant des souches spé cifiques de différentes bactéries dans un milieu de * culture aqueux en présence d'oxygène, d'hydrogène et d'anhydride carbonique.

30 Un inconvénient commun des procédés de fer mentation décrits dans la technique antérieure réside dans le fait que la concentration de L-sérine produite dans le bouillon et récupérée est relativement faible, même après des fermentations relativement longues.

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On peut également préparer la sérine par des procédés chimiques de synthèse (voir, par exemple, Kanedo (éd.), ^Synthetic Production and Utili-zation of Amino Acids11 ,Halsted Press Books (1974))· 5 Très souvent, ces procédés chimiques produisent la

sérine sous forme d’un mélange racémique des isomè-; res optiques D et L ou sous forme de l’isomère D

moins préféré. Des mélanges d’isomères DL doivent être dédoublés par des procédés dans lesquels on 10 utilise une bactérie catabolisant la D-sérine, à savoir la racémase de sérine, par acylase d’acides L-aminés, par cristallisation fractionnée de dérivés de sérine ou par des procédés analogues, ce qui augmente le prix de revient du produit.

15 On sait que la L—sérine peut être produite à partir de la glycine. La production biologique de la L-sérine à partir de la glycine a été effectuée avec différents micro-organismes (voir, par exemple, Tanaka, Y. et al., 11 J. Ferment. Technol.11 59:447 20 (198I)). Tout comme pour les procédés de fermentation, un inconvénient de ce procédé réside dans le fait que le rendement de L—sérine n’est pas spécifiquement très élevé.

Dès lors, il est nécessaire de trouver un 25 procédé en vue d’effectuer la synthèse de la L—sérine v avec de hauts rendements. En conséquence, un objet de la présente invention est d’élaborer un procédé ' de synthèse de la L—sérine, procédé dans lequel la sérine est produite en hautes concentrations dans 30 une solution de laquelle elle peut être efficacement récupérée.

De même, un objet de l’invention est de fournir un moyen enzymatique en vue de produire la L-sérine, la réaction pouvant être effectuée dans un système.discontinu ou immobilisé.

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, 3

On a découvert que la L—sérine pouvait être synthétisée efficacement à partir de glycine et de formaldéhyde en présence de quantités bioca— talytiques de l’enzyme hydroxyméthyltransférase de 5 sérine et du co-facteur tétrahydrofolate dans des conditions donnant lieu à la production de sérine.

* L’enzyme peut être présente en cellules entières, sous forme d’un extrait brut ou sous forme d’une ' enzyme purifiée et elle peut être sous forme immo- 10 bilisée ou non.

On sait que l'enzyme hydroxyméthyltrans— férase de sérine catalyse le clivage de la sérine en glycine dans une réaction dépendant des co-facteurs pyridoxal-5’-phosphate et tétrahydrofolate. La réac-15 tion donne de la glycine et du tétrahydrofolate de méthylène. (Voir Schirck L., Advances in Enzymology 53.:83 (1982)), A présent, on a découvert que l’enzyme hydroxyméthyltransférase de sérine pouvait être utilisée efficacement comme biocatalyseur pour pro-20 duire de la L-sérine à partir de glycine et de formaldéhyde. La réaction a lieu en présence du cofacteur tétrahydrofolate. La source du tétrahydrofolate peut être la source de 1'hydroxyméthyltransférase de sérine, car le tétrahydrofolate se trouve 25 dans des cellules de micro-organismes contenant de 1’hydroxyméthyltransférase de sérine ou le tétrahydrofolate peut être ajouté à partir d'une source ^ exogène. Un avantage de ce procédé réside dans le fait qu’il produit uniquement l’isomère optique 30 L-sérine. Un autre avantage réside dans le fait qu'après avoir effectué la réaction, le produit sortant du réacteur contient uniquement de la glycine et de la L—sérine plutôt qu’un mélange complexe que l'on escompterait trouver dans un bouillon de fermen-35 tation ou à la suite d’une synthèse chimique.

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Il est surprenant de constater que la L— sérine puisse être synthétisée à partir de glycine et de formaldéhyde, car on sait que le formaldéhyde réagit chimiquement avec des protéines et provoque 5 l’inactivation des enzymes (French, D. et al., “Advances in Protein Chemistry” 2:277-335 (1945))· " En fait, l'hydroxyméthyltransférase de sérine est inactivée rapidement par le formaldéhyde. Toutefois, on a découvert que l’on pouvait protéger l'enzyme 10 en ajoutant un excès de tétrahydrofolate au mélange réactionnel. Le tétrahydrofolate réagit avec le formaldéhyde, protégeant ainsi l'enzyme.

Une modification chimique de l’hydroxyméthyltransférase de sérine assure également une 15 stabilité et une protection contre l'inactivation par le formaldéhyde. Par exemple, on a trouvé que la réaction d’imido-esters avec des groupes amino (voir Means, G., et al,, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc., 1971) sur la surface de 20 l'enzyme permettait,à l'enzyme, de fonctionner en présence de formaldéhyde en .concentrations plus élevées que dans le cas de l'enzyme non modifiée.

On donnera ci-après la voie enzymatique que l'on pense être responsable de la synthèse de la 25 L-sérine à partir de glycine : formaldéhyde + tétrahydrofolate tétrahydro- <5— folate de méthylène tétrahydrofolate de méthylène + 30 glycine ‘^ZJIZZZZZZZZ-ZZZZZZZZJIJIZ___I_I___ L- sérine + tétrahydrofolate.

Il est préférable d'effectuer la réaction dans des conditions anaérobies, par exemple, sous une atmosphère d'azote, afin d'empêcher l'oxydation 35 du tétrahydrofolate.

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Le substrat, à savoir 11hydroxyméthyl-transférase de sérine, de même que le co-facteur, à savoir le tétrahydrofolate, peuvent réagir ensemble de diverses manières. Bien que 1*ordre dans 5 lequel les réactifs et les catalyseurs sont introduits, ne soit pas critique, il est préférable d'ajouter lentement la glycine et le formaldéhyde ! à 1’hydroxyméthyltransférase de sérine en présence !" de tétrahydrofolate. La réaction est effectuée dans 10 des conditions donnant lieu à la production de L- sérine. Lorsque le gène d·hydroxyméthyltransférase de sérine (glyA) d’E. coli est utilisé comme source d1hydroxyméthyltransférase de sérine, ces conditions englobent généralement une température réactionnelle 15 d’environ 4 à environ 60°C et un pH se situant dans l’intervalle allant d’environ 4 à environ 11. Les conditions réactionnelles préférées consistent à effectuer la réaction à une température d’environ 20 à environ 45°C et à un pH d’environ 6 à 8,5. Si la tem-20 pérature est inférieure à environ 4°C, le temps de ; réaction est considérablement ralenti et, si la tem pérature s’élève au-delà d’environ 60°C, l’enzyme peut être dénaturée. De la même manière, à un pH inférieur à environ 4 ou supérieur à environ 11, 25 l’enzyme peut être inactivée. L’hydroxyméthyltransférase de sérine est une enzyme centrale dans le métabolisme des micro-organismes et des organismes supé-- rieurs ; dès lors, il existe de nombreuses sources virtuelles de cette enzyme. Les intervalles des con-30 ditions dans lesquelles la réaction de production de L-sérine est effectuée, sont en relation avec la source de l’enzyme utilisée. Par exemple, des enzymes obtenues à partir des micro—organismes thermophiles pour— I raient être utilisées à une température supérieure à |i 35 celle pouvant être envisagée lorsque la source de

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6 1*enzyme est E. coli.

L1 hydroxyméthyltransférase de sérine peut être sous forme de cellules entières, d’un extrait brut ou d’une enzyme purifiée· L’enzyme peut être 5 utilisée sous forme immobilisée ou non· L’enzyme est utilisée en quantités suffisantes pour catalyser la réaction.

L’enzyme peut être obtenue à partir de micro-organismes qui ont été modifiés en adoptant 10 des techniques génétiques classiques pour la produire avec de hauts rendements (voir Stauffer, G· et al.,

Gene 15:63-72 (1981)). Le gèn e d ’ hydr oxyméthylt rans-férase de sérine (glyA) peut être isolé et cloné en un plasmide qui peut alors être utilisé pour trans— 15 former des cellules hôtes appropriées donnant lieu à l’expression de 1 ’ hydr oxyméthylt r ans feras e de sérine à un haut niveau· Des micro-organismes mutants qui ont été modifiés dans leur métabolisme de méthionine donnent également lieu à une surproduction d'hydroxy-20 méthyltransférase de sérine, (Voir Stauffer, G.V., et Brenchley, J.E., Genetics.88a 221 (1978) et Stauffer, G.V· et Brenchley, J.E., J. Bacteriol. 129, 740 (1977))· En adoptant des techniques de clonage de gènes, l’activité enzymatique a été accrue jusqu’à 20 fois 25 et elle peut représenter plus de 10$ de la protéine . soluble de la cellule. Une souche E, coli (Gxl703) transformée avec un tel plasmide, spécifiquement un J - dérivé de pBR322 dans lequel le gène glyA a été cloné, pGxl22, a été déposée au ‘'Northern Regional Research 30 Laboratory", Peoria, Illinois, E.U.A. sous le numéro NRRL B-15215· Une souche Klebsiella aerogenes (Gxl704) transformée avec un plasmide semblable, mais plus petit avec une altération provoquant un nombre élevé de copies, pGxl39 a été déposée à l"1 American 35 Type Culture Collection", Rockville, Maryland, E.U.A·, /

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* , 7 sous le numéro ATCC 39214* tandis qu’une souche Salmonella typhimurium (Gxl682) transformée avec pGxl39 a été déposée sous le numéro ATCC 39215· 1 De plus, lorsque le gène est retiré d’une 5 source telle que E. coli« il peut être modifié par mutagénèse au hasard ou par mutagénèse dirigée sur un siège pour produire une enzyme ayant une meilleure stabilité. En variante, le gène peut être complètement synthétisé chimiquement avec des chan-10 gements multiples afin d’améliorer la stabilité de l’enzyme au cours du procédé décrit.

L’utilisation de cellules entières peut fournir une source de tétrahydrofolate. On peut éventuellement ajouter une quantité supplémentaire 15 de tétrahydrofolate pour atteindre des niveaux de saturation qui dépendent du pH et de la température. Par exemple, à tin pH d’environ 7*5 et à une température réactionnelle d’environ 37°C, dans une solution aqueuse, on peut ajouter du tétrahydrofolate 20 pour atteindre une concentration nettement supérieure à 50 mM. Le pH doit être réglé tandis que le tétrahydrofolate se dissout. Si l’on ajoute l’hydroxy— méthyltransférase de sérine sous forme d’un extrait brut ou d’une enzyme purifiée, une source indépendants te de tétrahydrofolate est nécessaire. La quantité ‘ , de tétrahydrofolate que l’on peut ajouter, varie avec j les conditions relatives à la température et au sol— j - vant, ainsi qu’avec le pH auquel est effectuée la j réaction.

j 30 On a découvert que le tétrahydrofolate j conservait son activité vis-à-vis de 1’hydroxyméthyl- transférase de sérine lors de l’immobilisation.

Il est avantageux d’immobiliser le tétrahydrofolate en le fixant sur un support qui peut être retenu à 35 l’intérieur d’un bioréacteur .utilisé pour effectuer •f / 8 » la réaction, car ainsi on favorise l’utilisation répétée du co-facteur au terme de la synthèse de la L-sérine. Par exemple, le tétrahydrofolate peut " être immobilisé avec des polymères solubles tels que 5 le dextrane, le polyéthylène-glycol ou la polyéthy- lène-imine. L’immobilisation a lieu moyennant une fixation covalente dans les deux premiers cas et par interaction ionique dans le troisième cas. La fixation covalente a généralement lieu à l’intervention 10 des groupes carboxy du tétrahydrofolate avec un groupe amino du support. En variante, en adoptant des procédés de fixation analogues, on peut également fixer le tétrahydrofolate sur un support' insoluble.

En variante, si la sérine est synthétisée 15 dans un procédé discontinu, on peut recycler le tétrahydrofolate. Par exemple, après avoir effectué la synthèse de la L-sérine, on peut faire passer la solution réactionnelle à travers du charbon activé ou à travers une colonne échangeuse d’ions qui retien-20 dra et séparera le tétrahydrofolate de la solution de L-sérine obtenue. Le tétrahydrofolate peut alors être libéré et neutralisé. En variante, le tétrahydrofolate peut être modifié par fixation covalente sur une petite molécule telle qu’une glucosamine, 25 afin de faciliter la récupération du co-facteur.

, Après avoir effectué la synthèse de la L-sérine, on fait passer la solution du réacteur dans une colonne • de borate. Le borate se fixe uniquement sur le tétrahydrofolate/glucosamine et le tétrahydro-30 folate modifié peut être libéré et recyclé.

De préférence, on ajoute la glycine et le formaldéhyde au mélange de tétrahydrofolate et d’hy-droxyméthyltransférase de sérine. La quantité de glycine que l’on peut ajouter, varie avec les condi— 35 tions réactionnelles relatives au pH, à la tempéra- L· ' 9 ture et au solvant, mais on peut généralement l’ajouter jusqu’à ce que le niveau de saturation soit atteint.

- Comme on l’a indiqué précédemment, le for- 5 maldéhyde peut être hautement toxique vis-à-vis de l’hydroxyméthyltransférase de sérine. En conséquence, . le formaldéhyde est généralement ajouté lentement aux autres composants et son addition est réglée. Le ' formaldéhyde est ajouté en une quantité suffisante 10 pour maintenir l’activité enzymatique, généralement pour maintenir une concentration supérieure de moins d’environ 10 mM à la concentration utilisée en tétra— hydrofolate, encore que le formaldéhyde puisse être ajouté pour maintenir une concentration aussi élevée 15 qu’une concentration supérieure d’environ 50 mM à la concentration utilisée en tétrahydrofolate. Plus la concentration en tétrahydrofolate dans le système est importante, plus la concentration de formaldéhyde peut être maintenue élevée, car le tétrahydro-20 folate réagit favorablement avec le formaldéhyde, protégeant ainsi l’enzyme, le mécanisme de la réaction du tétrahydrofolate et du formaldéhyde est décrit par Kallen, R.G. et al., J. Biol. Chem. 241(24) 585I-5863 (1966). Plus l’activité de l’enzyme dans le réacteur 25 est forte, plus le formaldéhyde est ajouté rapidement pour maintenir la concentration désirée.

On a également découvert qu’il pouvait être - avantageux d’ajouter, aux réactifs, un deuxième co facteur d’hydroxyméthyltransférase de sérine, à savoir 30 le pyridoxal-5*-phosphate. Le pyridoxal-5’-phosphate est fermement lié à l’enzyme. Si la L-sérine est synthétisée dans un réacteur au cours d’une période prolongée, le pyridoxal-phosphate peut être perdu ou inactivé, auquel cas on peut ajouter une quantité 35 supplémentaire de pyridoxal-phosphate. La perte du f,

H

* 10 co-facteur au cours de la synthèse est indiquée par la perte de couleur jaune de la solution réactionnelle et la perte d*activité, par 1*hydroxyméthyltrans-férase de sérine. La concentration de pyridoxal-5 phosphate ajouté à la réaction peut varier de 0 à environ 20 iriM (selon les nécessités) et elle se situe, de préférence, entre environ 0,1 iriM et environ 1 iriM.

L1addition d’un excès de pyridoxal-phosphate peut exercer une fonction supplémentaire. On a trouvé 10 que, dans certains micro-organismes qui ont été transformés par des plasmides contenant le gène glyA et qui expriment de hautes teneurs en hydroxyméthyltransfé-rase de sérine, l’addition de pyridoxal-5’-phosphate était nécessaire pour saturer 11hydroxyméthyltrans— 15 férase de sérine présente et améliorer l’activité enzymatique observée. Un micro—organisme de ce type est Klebsiella aerogenes contenant le plasmide pGxl39 identifié ci-dessus.

La réaction de synthèse peut être effectuée 20 en présence de n’importe quel solvant non néfaste.

Parmi ces solvants, il y a, par exemple, l’éthanol, le inéthanol, l’isopropanol et le dioxanne.

Les exemples ci-après sont donnés afin d’illustrer l’invention de manière plus détaillée.

25 Exemple 1 . On a cultivé des souches bactériennes avec et sans le plasmide pGxl39 dans un milieu LB (10 g/l • de tryptone Bacto, 5 g/l d’extrait de levure, 5 g/l de NaCl) ou un milieu minimum (10,5 g/l de K^HPO^, 30 4,5 g/l de KH2P04, 1 g/l de (NH4)2S04 et 0,5 g/l de citrate de sodium,21^0) complété avec 0,4$ de glucose ou de lactose. Lorsque cela était indiqué, on a ajouté des acides aminés à raison de 20 jig/ml. et des vitamines à raison de 1 ^ig/ml. L’activité spécifique de 35 1’hydroxyméthyltransférase de sérine est exprimée en

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11 nmoles de β-phényl-sérine transformée en benzaldéhyde et en glycine par minute et par mg de protéine extractible après traitement des cellules aux ultra-- sons· 5 Les titrages ont été effectués dans un tam pon de phosphate 50mM à un pH de 7j3 avec du pyri-doxal-phosphate 0,1 mM et de la β-phényl-sérine 35 mM à 20°C. L’apparition du benzaldéhyde a été contrôlée à 279 nM dans un spectrophotomètre d’enregistrement.

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Activité spécifique d*hydroxyméthyltransférase de sérine (nmoles/min/mg)

Souche Plasmide Milieu LB Milieu Supplément - minimum 5 Eb coli GX1698 - 39 N.D.* GX1671 pGxl39 221 N.D.

GX1703 pGxl39 141 533 Glucose, ’ phénylala- 10 nine, thia- mine GX1703 pGxl22 218 682 glucose, ' phénylala- nine, thia- 15 mine

Salmonella typhimurium LT2 GX1682 - 28 10 glucose, tryptophane 17 lactose, 20 tryptophane GX1682 pGxl39 152 . 133 glucose, tryptophane 306 lactose, tryptophane 25 Klebsiella aerogenes GX1704 - 36 N.D.

GX1704 pGxl39 590 114 glucose 223 108 lactose «P w

Souche Génotype 30 E» coli GXI698 trpEA, tna2, serB, laclq ts 402 GX1671 thi, ara j strR, glyA, fserB trpR] , laclql, lacZt:tn5

GX1703 glyA, pheA, thi, lac, ara, strR

L· 13

Salmonella typhimurium LT2 * GX1682 trpBEDC43 F* laclq ts420 pro

Klebsiella aerogenes ? GX1704 lsd (mutant de déaminase de L-sérine).

5 * Non déterminé.

La souche E, coli GXI67I, qui contient le , plasmide pGxl39, est une souche supplémentaire re présentative qui a été utilisée comme source d'hydro-’ xyméthyltransferase de sérine dans le procédé de la 10 présente invention.

Exemple 2

On a inoculé une colonie de la souche Escherichia coli GX 1703 (contenant pGxl22) qui a été déposée sous le numéro NRRL B-15215, dans 100 ml 15 du milieu de culture I décrit ci-dessous et on a agité à 37°C pendant une nuit.

Milieu de culture I : k2hpo4 10,5 g/1 KH2P04 4,5 g/1 20 (NH4)2S04 1 g/1 j Citrate de sodium . 2H20 „ 0,5 g/l

Phénylalanine 20 ^ig/ml

Vitamine B^ 1 ^ig/ml

Ampicilline 100 ^ig/ml

25 - MgS04 2 mM

' FeSO. 5 mg/ml

On a recueilli des cellules par centrifugation du milieu de culture de cellules et on les a utilisées comme source d’enzyme. Sous une couverture 30 d'azote, on a mélangé de la glycine (concentration finale : 12 mM) avec du tétrahydrofolate (concentration finale ï 5 mM), du pyridoxal-phosphate (l mM) et du formaldéhyde (concentration finale : 10 mM)· On a maintenu le pH à 7,6 avec un tampon de phosphate 35 de potassium 0,1M et le volume final de ce mélange /

/U

14 réactionnel était de 100 ml. On a fait démarrer la réaction en mélangeant les cellules et la solution réactionnelle ci-dessus à 37°C avec agitation. Après 8 heures, on a obtenu une concentration de 5 mM de 5 sérine (le rendement était de 45%j calculé sur la glycine). Toute l'activité enzymatique a été retenue.

» On a déterminé les concentrations en glycine et en sérine par chromatographie liquide à haut rendement.

Exemple 3 10 On a inoculé une colonie de la souche

Klebsiella aerogenes GX1704 (contenant pGxl39) qui a été déposée sous le numéro ATCC 39214j dans 100 ml du milieu de culture XX décrit ci—dessous et on a agité à 30°C pendant une nuit.

15 Milieu de culture II

Trypton e 10 g/1

NaCl 10 g/1

Extrait de levure 5 g/l

Glucose 10 g/l 20 On a recueilli les cellules par centrifuga tion du milieu de culture de^cellules et on les a utilisées comme source d'enzyme.

On a suivi le procédé de l'exemple 1 pour la production de sérine, avec cette exception qu'au 25 lieu de E. coli, on a utilisé Klebsiella aerogenes.'

Après 8 heures, on a obtenu une concentration de 7 niM de sérine (le rendement était de 64^5 calculé sur la • glycine). Toute l'activité enzymatique a été retenue.

Exemple 4 30 On a suivi le procédé de l'exemple 1, avec cette exception que l'on a utilisé 1'hydroxyméthyl-transférase de sérine partiellement purifiée provenant de E. coli (souche GX1703)· On a brisé les cellules par traitement aux ultrasons à 4°C. On a mélan— 35 gé le produit surnageant recueilli après centrifuga— il / -\ 15 tion avec du sulfate d'ammonium (saturation ï 50$) à 4°C et à un pH de 7*5· Après élimination du solide par centrifugation, on a chassé l'enzyme hors de - la solution en portant la teneur en sulfate d'ammo- 5 nium à une saturation de 100/&. On a recueilli l'enzyme par centrifugation et on l'a soumise à une dialyse, . Après réaction pendant 4 heures, on a obtenu une con centration de 10 iriM de sérine. Le rendement était de 90$, Galculé sur la glycine. Toute l'activité enzy— 10 matique a été retenue.

Exemple 5

On a suivi le procédé de l'exemple 3j avec cette exception que la concentration initiale en glycine était de 340 mM et que l'on a introduit le for- % 15 maldéhyde (concentration initiale : 2m) à raison de 1 ml/heure. Après 12 heures, on a obtenu une concentration de 119 mM de sérine.

Exemple 6

On a suivi le procédé de l'exemple 3, avec 20 cette exception que l'on a introduit la glycine (concentration initiale î 2M) et le formaldéhyde (concentration initiale î 2M) à la même vitesse de 1 ml/ heure. Après 5 heures, on a obtenu une concentration de 57 mM de sérine.

25 ' Exemple 7

On a suivi le procédé de l'exemple 3j avec cette exception que l'on a modifié le tétrahydrofolate. On a dissous 5 g de dextrane ("Pharmacia T40") dans l'eau à une concentration finale de 5%· On a oxydé 30 · la solution de dextrane au moyen de NalO^ 0,1M pendant une heure à la température ambiante. On a précipité le dextrane oxydé par addition d'éthanol jusqu'à 60$ (volume/volume) . On a répété deux fois cette étape.

On a dissous le dextrane oxydé dans 100 ml de 1,6-35 hexane-diamine 0,2M à un pH de 9· On a ajouté 0,2 g

L

« 16 de borohydrure de sodium après 30 et 60 minutes respectivement. On a dialysé le 1,6— hexane-diamine/dextrane vis-à-vis de 11 eau pendant * une nuit et on l’a lyophilisé. On a mélange du 5 tétrahydrofolate (5 mM) avec 10 iriM de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide et 0,5$ de . 1,6-hexane-diamine/dextrane à un pH de 7 sous une atmosphère d’azote. On a recueilli le précipité formé par centrifugation et on l’a lavé deux fois 10 avec une solution de NaCl 0,5M. On a mélangé le tétrahydrofolate solide avec le mélange réactionnel comme décrit à l’exemple 3· Après réaction pendant 3 heures, on a obtenu une concentration de 7 “M de sérine.

A

(A

Claims (25)

1. 4 17
2. 1. Procédé de synthèse de la L-sérine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir de la glycine et du formaldéhyde en présence de quan- 5 tités biocatalytiques d'hydroxyméthyltransférase de sérine et de tétrahydrofolate dans des conditions de - production de L-sérine.
3. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la température est maintenue entre 1Ό environ 4 eh environ 60°C, tandis que le pH se situe dans l'intervalle allant d'environ 4 à environ 11.
4. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la température' se situe dans l'intervalle allant d'environ 20 à environ 45°C, tandis v 15 que le pH se situe dans l'intervalle allant d'environ 6 à environ 8,5. 4» Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est contenue dans des cellules entières. 20 5· Procédé suivant la revendication 1, ca ractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est sous forme d'un extrait brut.
5. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de 25 sérine est sous forme“ d'une enzyme purifiée.
6. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est immobilisée.
7. 8. Procédé suivant la revendication 1, ca- 30 ractérisé en ce qu'on effectue la réaction sous forme d'un système discontinu.
8. 9. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction sous forme d'un système continu. L~ 9 18
9. 10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la source de tétrahydrofolate est constituée de cellules microbiennes entières - contenant l,hydroxyméthyltransférase de sérine.
10. 11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'on ajoute une quantité supplé-- mentaire de tétrahydrofolate au système réactionnel afin de porter la concentration du tétrahydrofolate ( * à un maximum du degré de saturation.
11. 12. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du tétrahydrofolate se situe dans l'intervalle allant d'environ 0,15 à environ 50 mM.
12. 13· Procédé suivant la revendication 1, % 15 caractérisé en ce que le tétrahydrofolate est immobilisé.
13. 14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le tétrahydrofolate est immobilisé avec un polymère soluble,
14. 15. Procédé suivant la revendication 133 caractérisé en ce que le tétrahydrofolate est immobilisé par fixation sur un support solide.
15. 16. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le tétrahydrofolate est modifié 25 de telle sorte qu'il puisse être recyclé.
16. 17· Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la glycine peut être ajoutée : - jusqu'à ce que la solution réactionnelle en soit saturée. ; , 30 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute le formaldéhyde jusqu'à une concentration maximum supérieure d'environ 30 mM à environ 50 mM à la concentration du tétrahydrofolate. L 19
17. 19· Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que la concentration de formaldéhyde est portée à un état constant d’une concentra— « tion supérieure d'environ 10 mM à la concentration 5 de tétrahydrofolate,
18. 20. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu’on ajoute du pyridoxal-phosphate aux réactifs à une concentration de 0 à environ 20 mM.
19. 21. Procédé suivant la revendication 20, 10 caractérisé en ce que la concentration du pyridoxal- phosphate se situe dans l'intervalle allant d'environ 0,1 à 1,0 mM.
20. 22. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'hydroxyméthyltrans- 15 férase de sérine est la souche Escherichia coli GX1703 contenant le plasmide pGxl22 et déposée au "Northern Regional Research Laboratory" sous le numéro NRRL B-15215.
21. 23. Procédé suivant la revendication 1, 20 caractérisé en ce que la source d'hydroxyméthyltrans-férase de sérine est la soucjhe Salmonella thyphimurium Gxl682, contenant le plasmide pGxl39 et déposée à 1'"American Type Culture Collection" sous le numéro ATCC 39215.
22. 24. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la source d'hydroxyméthyltrans— férase de sérine est la souche Klebsiella aerogenes GX1704j contenant le plasmide pGxl39 et déposée à 1'"American Type Culture Collection" sous le numéro 30 ATCC 39214.
23. 25. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité d'hydroxyméthyl-transférase de sérine en cellules a été amplifiée par manipulation génétique. h ‘ i 20
24. 26, Procédé suivant la revendication 1, ! caractérisé en ce que l’activité d’hydroxyméthyl- transférase de sérine en cellules a été amplifiée par clonage du gène d’hydroxyméthyltransférase de | 5 sérine en un plasmide et par transformation d’une cellule hôte avec ce plasmide pour donner lieu à ;j - une surproduction d’hydroxyméthyltransférase de ;i serine. k ; 27· Procédé suivant la revendication 1, i 10 caractérisé en ce que 1’hydroxyméthyltransferase de i sérine est obtenue à partir de n’importe quelle 'i source biologique. i 28, Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le gène d’hydroxyméthyltrans-15 férase de sérine a été modifié par mutagénèse au hasard ou par mutagénèse dirigée sur siège pour ac-’ croître la stabilité de l’enzyme,
25. 29. Procédé suivant la revendication 1, ri |j caractérisé en ce que l’enzyme hydroxyméthyltrans- 20 férase de sérine est modifiée chimiquement pour ac-1! croître sa stabilité. '1 30. Procédé suivant la revendication 29, lj caractérisé en ce que l’enzyme est modifiée par réac- tion avec des imido-esters, Ί 25 31· Culture pratiquement biologiquement pure de la souche Escherichia coli GX1703 contenant 1 le plasmide pGxl22, îj :j ~ 32. Culture pratiquement biologiquement r> i: pure de la souche Salmonella typhimurium GX1682 con- jj 30 tenant le plasmide pGxl39· ,| 33· Culture pratiquement biologiquement ï pure de la souche Klebsiella aerogenes^ GX1704 conte- H =! λ nant le plasmxde pGxl39· i