JPS6181775A - 酵素の製造方法 - Google Patents
酵素の製造方法Info
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- JPS6181775A JPS6181775A JP18129584A JP18129584A JPS6181775A JP S6181775 A JPS6181775 A JP S6181775A JP 18129584 A JP18129584 A JP 18129584A JP 18129584 A JP18129584 A JP 18129584A JP S6181775 A JPS6181775 A JP S6181775A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、微生物の培養方法に関し、更に詳細には、グ
リシンおよび／またはマンガン化合物を培地に加えて微
生物を培養し、微生物が生産する生理活性物質の生産量
を増加させ、特に、該生理活性物質の菌体外への排出（
分泌）を促進する方法に関する。
リシンおよび／またはマンガン化合物を培地に加えて微
生物を培養し、微生物が生産する生理活性物質の生産量
を増加させ、特に、該生理活性物質の菌体外への排出（
分泌）を促進する方法に関する。
一般に、細菌や酵母等の微生物を培養して、酵素等の高
分子生理活性物質を製造する方法は周知である。このよ
うな高分子生理活性物質は、微生物の菌体内で生産され
、通常は、菌体外に排出（分泌）されることなく、はと
んど菌体内に蓄積される。このため高分子生理活性物質
を取り出すためには、集菌した菌体を超音波処理等によ
り破砕し、遠心分離等により目的物を分離、精製する必
要がある。このような機械的破砕操作は、時間や労力の
損失となるばかりでなく、生産物を変質させるおそれも
あり、好ましくない。
分子生理活性物質を製造する方法は周知である。このよ
うな高分子生理活性物質は、微生物の菌体内で生産され
、通常は、菌体外に排出（分泌）されることなく、はと
んど菌体内に蓄積される。このため高分子生理活性物質
を取り出すためには、集菌した菌体を超音波処理等によ
り破砕し、遠心分離等により目的物を分離、精製する必
要がある。このような機械的破砕操作は、時間や労力の
損失となるばかりでなく、生産物を変質させるおそれも
あり、好ましくない。
ところで菌体内に生産物が一定量蓄積されると、その生
産は当然停止する。しかし、これが菌体内に蓄積される
ことなく、菌体外に排出（分泌）されれば、その生産は
継続して行われるはずである。
産は当然停止する。しかし、これが菌体内に蓄積される
ことなく、菌体外に排出（分泌）されれば、その生産は
継続して行われるはずである。
このため、菌体内で生産された生産物を菌体外に排出（
分泌）させ、菌体内生産を継続させ、菌体外に著量の生
産物を蓄積させようとする試みがなされている。たとえ
ば、掲載らは、ベニシリナーゼ、キシラナーゼ等の高分
子物質の菌体外生産に関与する遺伝情を長を担うバチル
ス属微生物の染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
を含有する前記高分子物質の菌体外生産能を有するエシ
ェリヒア属の微生物をＮａ塩又はに塩含有培地で培養し
て、前記高分子物質を菌体外に分泌させることに成功し
ている（特願昭Ｓ８〜３８０８７号及び同５８−２３２
５０７号明細書参照）。
分泌）させ、菌体内生産を継続させ、菌体外に著量の生
産物を蓄積させようとする試みがなされている。たとえ
ば、掲載らは、ベニシリナーゼ、キシラナーゼ等の高分
子物質の菌体外生産に関与する遺伝情を長を担うバチル
ス属微生物の染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
を含有する前記高分子物質の菌体外生産能を有するエシ
ェリヒア属の微生物をＮａ塩又はに塩含有培地で培養し
て、前記高分子物質を菌体外に分泌させることに成功し
ている（特願昭Ｓ８〜３８０８７号及び同５８−２３２
５０７号明細書参照）。
本発明の目的は、微生物が生産する有用な生理活性物質
の生産量を増大させる方法を提供することである。さら
に本発明の目的は、微生物の菌体内で生産される有用な
生理活性物質を、菌体外に排出（分泌）させ、それによ
って培地中に著量の生産物を蓄積させる方法を提供する
ことである。
の生産量を増大させる方法を提供することである。さら
に本発明の目的は、微生物の菌体内で生産される有用な
生理活性物質を、菌体外に排出（分泌）させ、それによ
って培地中に著量の生産物を蓄積させる方法を提供する
ことである。
本発明の目的は、グリシンおよびマンガン化合物から成
る群から選ばれる少なくとも１種の化合物を培地に加え
て微生物を培養することにより達成される。
る群から選ばれる少なくとも１種の化合物を培地に加え
て微生物を培養することにより達成される。
本発明に使用される微生物として特に好ましいものは細
菌および酵母である。
菌および酵母である。
細菌としては、たとえば、グラム陽性好アルカリ性細菌
であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） Ｎｏ、 Ａ −
５９（ＡＴＣＣ２１５９１） （アルカリアミラーゼ
生産菌として分離された。Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ。
であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） Ｎｏ、 Ａ −
５９（ＡＴＣＣ２１５９１） （アルカリアミラーゼ
生産菌として分離された。Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 Ｖｏｌ、 ３６．１８１９頁、１９７２
年）、グラム陽性好アルカリ性細菌であるバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ） Ｎｏ、Ｃ−１２５（Ｆ ＥＲＭ
Ｂ Ｐ −４６９）（β−ガラクトシダーゼ生産菌、八
Ｈｒｉｃ。
年）、グラム陽性好アルカリ性細菌であるバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ） Ｎｏ、Ｃ−１２５（Ｆ ＥＲＭ
Ｂ Ｐ −４６９）（β−ガラクトシダーゼ生産菌、八
Ｈｒｉｃ。
旧ｏｆ、 （：ｈｅｍ、 Ｖｏｌ、 ４３．８５真お
よび１３５９頁、１９７９年）、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ １
０ １ （ＭｏＩｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ １
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ＣＳ ＨＬａｂ
。
よび１３５９頁、１９７９年）、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ １
０ １ （ＭｏＩｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ａ １
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ＣＳ ＨＬａｂ
。
１９８２．５０４頁、Ｌｅｕ 、 Ｐｒｏ 、 ’ｒｈ
ｉａｍｉｎｅ 要求性）、酵母としては、パン酵母（
オリンタル酵母（株）製）などが挙げられる。
ｉａｍｉｎｅ 要求性）、酵母としては、パン酵母（
オリンタル酵母（株）製）などが挙げられる。
本発明に使用することができる微生物は、上記具体例に
限定されるものではなく、グリシンおよび／またはマン
ガン化合物を加えた培地中で培養することにより、菌体
生産物の総生産量を増加し、菌体生産物を菌体外に排出
し、著量に蓄積するものであれば、既存の培養菌株、自
然界から新たに分離された菌株、あるいはこれらの菌株
の変異株、さらに、遺伝子組換や細胞融合によって新た
に酵素等の有用生理活性物質生産能力を獲得するに至っ
た微生物など、いずれも使用することができる。
限定されるものではなく、グリシンおよび／またはマン
ガン化合物を加えた培地中で培養することにより、菌体
生産物の総生産量を増加し、菌体生産物を菌体外に排出
し、著量に蓄積するものであれば、既存の培養菌株、自
然界から新たに分離された菌株、あるいはこれらの菌株
の変異株、さらに、遺伝子組換や細胞融合によって新た
に酵素等の有用生理活性物質生産能力を獲得するに至っ
た微生物など、いずれも使用することができる。
本発明に使用されるマンガン化合物としては、たとえば
、硫酸マンガン、１９≦化マンガン、硝酸マンガン、炭
酸マンガン、ケイ酸マンガン、ピロリン酸マンガン、リ
ン酸水素マンガン等の無機酸塩、酢酸マンガン、酒石酸
マンガン、シュウ酸マンガン、クエン酸マンガン等の有
機酸塩などが挙げられる。。
、硫酸マンガン、１９≦化マンガン、硝酸マンガン、炭
酸マンガン、ケイ酸マンガン、ピロリン酸マンガン、リ
ン酸水素マンガン等の無機酸塩、酢酸マンガン、酒石酸
マンガン、シュウ酸マンガン、クエン酸マンガン等の有
機酸塩などが挙げられる。。
本発明において、グリシンの添加量は、培地に対して０
．１−１０重量％、好ましくは０．２〜３．０重量％が
適当である。これより少ないと目的とする効果の発現が
不十分であり、またこれより多いと逆に微生物の生育阻
害が顕著になり、好ましくない。
．１−１０重量％、好ましくは０．２〜３．０重量％が
適当である。これより少ないと目的とする効果の発現が
不十分であり、またこれより多いと逆に微生物の生育阻
害が顕著になり、好ましくない。
一方、マンガン化合物の添加量は、培地に対して０．５
μＭ以上であればよい。これより少ないと目的とする効
果の発現が不十分である。なおマンガン化合物の毒性は
低いため、かなりの濃度（例えば１００１１／ｒ）に増
加させても生育阻害は認められない。
μＭ以上であればよい。これより少ないと目的とする効
果の発現が不十分である。なおマンガン化合物の毒性は
低いため、かなりの濃度（例えば１００１１／ｒ）に増
加させても生育阻害は認められない。
本発明に使用する微生物の培養培地としては、通常、微
生物の培養に使用される培地に、グリシンおよび／また
はマンガン化合物をｌイＳ加したものが使用される。す
なわち、炭素源、窒素源、無機物、その他栄養物を程良
く含有する培地であれば、合成培地、天然培地のいずれ
もが使用できる。炭素源、窒素源は、使用菌が利用可能
なものであればいずれの種類を用いてもよい。無機塩、
ビタミン類等についても、微生物の培地に通常使用され
るものを使用することができる。
生物の培養に使用される培地に、グリシンおよび／また
はマンガン化合物をｌイＳ加したものが使用される。す
なわち、炭素源、窒素源、無機物、その他栄養物を程良
く含有する培地であれば、合成培地、天然培地のいずれ
もが使用できる。炭素源、窒素源は、使用菌が利用可能
なものであればいずれの種類を用いてもよい。無機塩、
ビタミン類等についても、微生物の培地に通常使用され
るものを使用することができる。
以下、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例の記載に限定されるものでは
ない。
、本発明はこれらの実施例の記載に限定されるものでは
ない。
実施例１
好アルカリ性バチルスに５９ （ＡＴＣＣ２１５９１
）を使用し、α−グルコシダーゼ活性について２周べた
。
）を使用し、α−グルコシダーゼ活性について２周べた
。
９００ｍｌの井戸水に、可溶性でんぷん１５ｇ１ポリペ
プトン５ｇ、イーストエキス（ディフコ社製）５ｇ、リ
ン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．
２ｇおよび所定量のグリシンおよび／またはマンガン化
合物を加えた培地、および炭酸ナトリウム水溶液（１０
０ｇ／ｌを別別に調製し、殺菌した。ｈ（ｉ、菌時１／
１０量の炭酸ナトリウム溶液を前記培地に無菌的に加え
て、種培地および本培地とする。
プトン５ｇ、イーストエキス（ディフコ社製）５ｇ、リ
ン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．
２ｇおよび所定量のグリシンおよび／またはマンガン化
合物を加えた培地、および炭酸ナトリウム水溶液（１０
０ｇ／ｌを別別に調製し、殺菌した。ｈ（ｉ、菌時１／
１０量の炭酸ナトリウム溶液を前記培地に無菌的に加え
て、種培地および本培地とする。
３００ ｍ （ｌの４個ひだ付三角フラスコに培地５０
ｍ ｌを入れ、これに、あらかじめ１晩培養したちの
０．２ｍＪを植菌して、３７℃で所定時間、振とう培養
（ロータリーシェーカー、２０ＯＲＰＭ）Ｌ、２ｍｌず
つ無菌的にサンプリングする。
ｍ ｌを入れ、これに、あらかじめ１晩培養したちの
０．２ｍＪを植菌して、３７℃で所定時間、振とう培養
（ロータリーシェーカー、２０ＯＲＰＭ）Ｌ、２ｍｌず
つ無菌的にサンプリングする。
サンプルの一部をそのまま１０〜３０倍に希釈して全酵
素活性を測定する。サンプルの残部は遠心分離し、上澄
液を５〜３０倍して、培地中に排出（分泌）された酵素
の活性を測定する。
素活性を測定する。サンプルの残部は遠心分離し、上澄
液を５〜３０倍して、培地中に排出（分泌）された酵素
の活性を測定する。
酵素活性は、次のように測定する。まず、ｐ−ニトロフ
ェニルα−Ｄ−グルコシド２ｍＭ、ｐＨ７，５のリン酸
緩衝液４０ｍＭ、酵素液０．０３〜０．１ｍβを含む総
量０．５ｍＪの液に、基質を加えて反応を開始し、恒温
槽中、４０℃、１０分間往復振とう後、１Ｍ炭酸ナトリ
ウム０．１ｍ ｌを加えて反応を停止する。これに蒸留
水３ｍｌを加えて希釈攪拌し、４２０ ｎｍの吸収を測
定し、あらかじめ作成しておいた標準曲線から、酵素活
性を求める。１分間に１マイクロモルのｐ−二トロフェ
ノールを生産する酵素量を１単位とする。
ェニルα−Ｄ−グルコシド２ｍＭ、ｐＨ７，５のリン酸
緩衝液４０ｍＭ、酵素液０．０３〜０．１ｍβを含む総
量０．５ｍＪの液に、基質を加えて反応を開始し、恒温
槽中、４０℃、１０分間往復振とう後、１Ｍ炭酸ナトリ
ウム０．１ｍ ｌを加えて反応を停止する。これに蒸留
水３ｍｌを加えて希釈攪拌し、４２０ ｎｍの吸収を測
定し、あらかじめ作成しておいた標準曲線から、酵素活
性を求める。１分間に１マイクロモルのｐ−二トロフェ
ノールを生産する酵素量を１単位とする。
全酵素活性すなわち、培地中の酵素と菌体中の酵素の全
活性は、培養液全体を希釈し、細胞膜を透過性にするた
めトルエン１滴を加えて、５分後から、酵素反応を開始
し、反応停止後、遠心分離（３０００ＲＰＭ、５分間）
によって菌体を除去し、上澄液について酵素活性を測定
することにより求める。培地中の酵素活性を全酵素活性
で除したものを排出度とする。結果を第１表に示す。
活性は、培養液全体を希釈し、細胞膜を透過性にするた
めトルエン１滴を加えて、５分後から、酵素反応を開始
し、反応停止後、遠心分離（３０００ＲＰＭ、５分間）
によって菌体を除去し、上澄液について酵素活性を測定
することにより求める。培地中の酵素活性を全酵素活性
で除したものを排出度とする。結果を第１表に示す。
２リ 慴グリシンとマン
ガン化合物を併用することにより全酵素活性が大きくな
り、グリシンを添加することにより培地中の酵素活性す
なわち排出度が大きくなることがわかる。
ガン化合物を併用することにより全酵素活性が大きくな
り、グリシンを添加することにより培地中の酵素活性す
なわち排出度が大きくなることがわかる。
実施例２
好アルカリ性バチルスｌｌ＆ＡＣ−１２５（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−４６９）を使用し、β−ガラクトシダーゼ活性につ
いて調べた。
Ｐ−４６９）を使用し、β−ガラクトシダーゼ活性につ
いて調べた。
培地は、実施例１の培地において、可溶性でんぷんの代
りに、乳糖１５ ｇを加えたものを使用した。実施例１
と同様に種培養を行い、本培養は、２１の２個ひだ付三
角フラスコに培地４００ｍｌを入れ、これに、ｌ ｍ
ｌの種培養液を加えて、実施例１と同様に行った。３ｍ
ｌずつサンプリングした。
りに、乳糖１５ ｇを加えたものを使用した。実施例１
と同様に種培養を行い、本培養は、２１の２個ひだ付三
角フラスコに培地４００ｍｌを入れ、これに、ｌ ｍ
ｌの種培養液を加えて、実施例１と同様に行った。３ｍ
ｌずつサンプリングした。
酵素活性は、実施例１においてｐ−ニトロフェニルα−
Ｄ−グルコシドの代りに、０−ニトロフェニルβ−Ｄ−
ガラクトシドを使用するほかは、同様に行う。１分間に
１マイクロモルのＯ−ニトロフソールを生産する酵素量
を１単位とする。
Ｄ−グルコシドの代りに、０−ニトロフェニルβ−Ｄ−
ガラクトシドを使用するほかは、同様に行う。１分間に
１マイクロモルのＯ−ニトロフソールを生産する酵素量
を１単位とする。
結果を第２表に示す。本菌株においては、マンガン化合
物は酵素の総括性を増加させ、かつ排出を促進するので
、マンガン化合物のみの添加でもある程度の良好な結果
が得られる。しかしグリシン０．５％を同時添加する事
により菌体外に排出される酵素の収率は改善されるため
、共に用いる事が望ましい。
物は酵素の総括性を増加させ、かつ排出を促進するので
、マンガン化合物のみの添加でもある程度の良好な結果
が得られる。しかしグリシン０．５％を同時添加する事
により菌体外に排出される酵素の収率は改善されるため
、共に用いる事が望ましい。
ソリ ャ
実施例３
エシェリヒア・コリを使用し、β−ガラクトシダーゼ活
性を測定した。培地は実施例２で使用した培地より炭酸
ナトリウムを除いたものを使用し、本培養は５０ｍ２の
培地で、３００ｍｌの４個ひだ付三角フラスコを使用し
た。活性測定法は実施例２と同しである。
性を測定した。培地は実施例２で使用した培地より炭酸
ナトリウムを除いたものを使用し、本培養は５０ｍ２の
培地で、３００ｍｌの４個ひだ付三角フラスコを使用し
た。活性測定法は実施例２と同しである。
結果を第３表に示す。グリシンは排出に対する効果のみ
でなく、全酵素活性を３〜７倍に上昇させる。
でなく、全酵素活性を３〜７倍に上昇させる。
叩ヤｌ 守
実施例４
パン酵母を使用し、β−フラクトシダーゼ活性を測定し
た。培地は、実施例１の培地から炭酸ナトリウムを除い
たものを使用した。この培地１００ｍｆｆを、３００ｍ
ｇの三角フラスコに入れ、植菌し、３０〜３２℃で４８
時間、種培養する０種培養液を滅菌水に懸濁し、６００
ｎｍの吸収が【００付近となるようにｊｌｉｌ整し、そ
の１ｍｆｆ１を本培養培地に植菌し、本培養を実施例１
と同様に行った。
た。培地は、実施例１の培地から炭酸ナトリウムを除い
たものを使用した。この培地１００ｍｆｆを、３００ｍ
ｇの三角フラスコに入れ、植菌し、３０〜３２℃で４８
時間、種培養する０種培養液を滅菌水に懸濁し、６００
ｎｍの吸収が【００付近となるようにｊｌｉｌ整し、そ
の１ｍｆｆ１を本培養培地に植菌し、本培養を実施例１
と同様に行った。
酵素活性の測定は次のように行った。５％サッカロース
０．’１ｒｎｌ、０．２ＭリンｆＩＩｌｌ街液（ｐＨ７
，５）０．１ｍｉ！、酵素液０．０２〜Ｑ、１ｍｌを含
む、聡ｆｉｔ０．４ｍｌの試料液を、恒／！ｌ槽中、４
０℃、３０分間振とうしながら反応させる０次にＤＮＳ
試薬（福井作藏著「還元υどの定量法Ｊ１９頁、１９６
９年）１．０ｍｌを加えて反応を停止し、混合して１０
０°Ｃ１５分間加熱後、水冷し、藤留水４ｍｆを加え、
５００ｎｍの吸収を測定する。対照として、蒸留水３．
４ｍｆにＤＮＳ試薬１．０ｍ＋＋を加え、同様に処理し
たものを使用する。１分間に還元糖をグルコースとして
１マイクロモル生成する酵素量を＋ｉ位とする。
０．’１ｒｎｌ、０．２ＭリンｆＩＩｌｌ街液（ｐＨ７
，５）０．１ｍｉ！、酵素液０．０２〜Ｑ、１ｍｌを含
む、聡ｆｉｔ０．４ｍｌの試料液を、恒／！ｌ槽中、４
０℃、３０分間振とうしながら反応させる０次にＤＮＳ
試薬（福井作藏著「還元υどの定量法Ｊ１９頁、１９６
９年）１．０ｍｌを加えて反応を停止し、混合して１０
０°Ｃ１５分間加熱後、水冷し、藤留水４ｍｆを加え、
５００ｎｍの吸収を測定する。対照として、蒸留水３．
４ｍｆにＤＮＳ試薬１．０ｍ＋＋を加え、同様に処理し
たものを使用する。１分間に還元糖をグルコースとして
１マイクロモル生成する酵素量を＋ｉ位とする。
結果を第４表に示す。
シ リ
実施例５
実施例２において、硫酸マンガンの代りに種々のマンガ
ン化合物を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を調べた
。培養は、３００ ｍ ｌの三角フラスコにて、５３
ｍ １の培地を用いて行い、４８時間後に酵素活性を測
定した。結果を第５表に示す。
ン化合物を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を調べた
。培養は、３００ ｍ ｌの三角フラスコにて、５３
ｍ １の培地を用いて行い、４８時間後に酵素活性を測
定した。結果を第５表に示す。
本発明にしたがい、グリシンおよび／またはマンガン化
合物を培地に添加して微生物を培養することにより、微
生物が生産する酵素などの有用な生理活性物質の全生産
量（菌体内と菌体外の総和）を大巾に増大させ、しかも
、菌体外に排出される生産物質の比率を著しく向上する
ことができる。
合物を培地に添加して微生物を培養することにより、微
生物が生産する酵素などの有用な生理活性物質の全生産
量（菌体内と菌体外の総和）を大巾に増大させ、しかも
、菌体外に排出される生産物質の比率を著しく向上する
ことができる。
手 続 補 正 書（方式）６０．２．こ８昭和 年
月 日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１８１２９
５号２、発明の名称 微生物の培養方法３、補正
をする者 事件との関１系 出 願 人 名称（６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５゜ ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄
７゜ １、 明細書第４頁第１４行および第１８行の’ Ａｇ
ｒｉｃ、 ”の前に［アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー：」を加入する。
月 日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１８１２９
５号２、発明の名称 微生物の培養方法３、補正
をする者 事件との関１系 出 願 人 名称（６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５゜ ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄
７゜ １、 明細書第４頁第１４行および第１８行の’ Ａｇ
ｒｉｃ、 ”の前に［アグリカルチュラル・バイオロジ
カル・ケミストリー：」を加入する。
２、同第５頁第１行の″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ”の前に
「モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・マ
ニュアル・シー・ニス・エイチ・ラボ、１９８２．５０
４頁、ロイシン、プロリン、チアミン要求性：」を加入
する。
「モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・マ
ニュアル・シー・ニス・エイチ・ラボ、１９８２．５０
４頁、ロイシン、プロリン、チアミン要求性：」を加入
する。
昭和 年 月 日
１、事件の表示 昭和５９年特許願第１８１２９５
号２、発明の名称 微生物の培養方法３、補正を
する者 事件との関係 出願人 名称 （６７９）理化学研究所 ４、代理人 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の
欄明細書第２０頁末行に下記の文章を加入する。
号２、発明の名称 微生物の培養方法３、補正を
する者 事件との関係 出願人 名称 （６７９）理化学研究所 ４、代理人 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の
欄明細書第２０頁末行に下記の文章を加入する。
「実施例６
遺伝子組換えによりセルラーゼ生産能を獲得した大腸菌
によるセルラーゼの菌体外生産大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ、
ＨＢＩＯＩ）に好アルカリ性バチルスＮｏ、Ｎ−４の
ＤＮＡを組みこみ、セルラーゼを生産するようになった
大腸菌についてグリシン無添加時とグリシン１．０％添
加の場合の菌体外セルラーゼ活性を測定した。使用した
好アルカリ性バチルスＮｏ、 Ｎ −４のセルラーゼ生
産については掲載ら（カナディアン・ジャーナル・オブ
畳マイクロバイオロジイ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ Ｍｉ’ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ３ Ｑ巻
ｐ７７４〜７７９．１９８４年）が記述し、大腸菌への
セルラーゼ遺伝子の組換え実験と得られたｐＮＫ〜１
、ｐＮ、に−２株のアルカリセルラーゼ生産については
指原らの報告（ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
１５８巻ｐ５０３〜５０６．１９８４年）に記載され
ている。
によるセルラーゼの菌体外生産大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ、
ＨＢＩＯＩ）に好アルカリ性バチルスＮｏ、Ｎ−４の
ＤＮＡを組みこみ、セルラーゼを生産するようになった
大腸菌についてグリシン無添加時とグリシン１．０％添
加の場合の菌体外セルラーゼ活性を測定した。使用した
好アルカリ性バチルスＮｏ、 Ｎ −４のセルラーゼ生
産については掲載ら（カナディアン・ジャーナル・オブ
畳マイクロバイオロジイ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆ Ｍｉ’ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ３ Ｑ巻
ｐ７７４〜７７９．１９８４年）が記述し、大腸菌への
セルラーゼ遺伝子の組換え実験と得られたｐＮＫ〜１
、ｐＮ、に−２株のアルカリセルラーゼ生産については
指原らの報告（ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
１５８巻ｐ５０３〜５０６．１９８４年）に記載され
ている。
培地はプレイン・ハート・インフュージョン（Ｄｒａｉ
ｎ ｆｌｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地（ディフコ
（Ｄｉｆｃｏ）社製）に３０μｇ／ｍｉ！のアンピシリ
ンを加えたものを使用した。培地は３００−の２個ひだ
付三角フラスコに５０ｍ１！の培地を入れ一晩前培養し
た培養液Ｌ Ｏｍｌ！を加えて３７℃２４時間培養後、
遠心上澄液の活性を比較した。活性はカルボキシメチル
セルロースナトリウム塩０．５％水溶液０．２５ｍ１！
、Ｍ−炭酸ナトリウム ０．０５ｍ１および培養の遠心
上澄液０．２ｍｆ！を４０℃３０分反応後、ＤＮＳ試薬
（“還元糖の定量法”、福井作蔵編、東京大学出版会発
行１９６９年、１９頁）１．Ｏｎｕ！を加え、１００℃
５分煮沸後、水冷し、３．Ｑｍｉ！の蒸留水を加えて混
合し、５００ｎｍの吸収を測定し、グルコース量に換算
した。この条件で１分間に１μｍｏｆｒｅ のグルコー
スを生産するような酵素量を１単位とした。
ｎ ｆｌｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地（ディフコ
（Ｄｉｆｃｏ）社製）に３０μｇ／ｍｉ！のアンピシリ
ンを加えたものを使用した。培地は３００−の２個ひだ
付三角フラスコに５０ｍ１！の培地を入れ一晩前培養し
た培養液Ｌ Ｏｍｌ！を加えて３７℃２４時間培養後、
遠心上澄液の活性を比較した。活性はカルボキシメチル
セルロースナトリウム塩０．５％水溶液０．２５ｍ１！
、Ｍ−炭酸ナトリウム ０．０５ｍ１および培養の遠心
上澄液０．２ｍｆ！を４０℃３０分反応後、ＤＮＳ試薬
（“還元糖の定量法”、福井作蔵編、東京大学出版会発
行１９６９年、１９頁）１．Ｏｎｕ！を加え、１００℃
５分煮沸後、水冷し、３．Ｑｍｉ！の蒸留水を加えて混
合し、５００ｎｍの吸収を測定し、グルコース量に換算
した。この条件で１分間に１μｍｏｆｒｅ のグルコー
スを生産するような酵素量を１単位とした。
指原らの報告によればｐＮＫ−１では全活性の９５．６
％、ＰＮＫ−２では８６．１％が、菌体内に存在する。
％、ＰＮＫ−２では８６．１％が、菌体内に存在する。
これらの菌体の活性がグリシン添加培養により培養液中
に排出（分泌）された−め、本実施例での菌体外活性が
高くなるものと考えられる。結果を第６表に示す。
に排出（分泌）された−め、本実施例での菌体外活性が
高くなるものと考えられる。結果を第６表に示す。
第 ６ 表
ｐＮＫ ｌ 無添加 １１．４〃
１％ ９６３９ ｐＮＫ ２ 無添加 １９．０活性は
培養液１リツトル中に排出された酵素単位。
１％ ９６３９ ｐＮＫ ２ 無添加 １９．０活性は
培養液１リツトル中に排出された酵素単位。
実施例７ トランスアミナーゼの排出（分泌）標準培
地として１１中に次の成分を含むものを使用した。グル
コース又は可溶性でんぷん又は乳糖１５ｇ、ポリペプト
ン５ｇ１イーストエキス５ｇ、リン酸二カリウム１．０
ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ ｇ、硫酸マンガ
ン（４又は５）水和物０．０２ｇ、生育に必要な場合は
肉エキス３．０ ｇ 、好アルカリ性細菌の場合は炭酸
ナトリウムｌ （Ｉｇを別途殺菌して加えた。細菌株は
３ＱＱｍｉ！のエルレンマイヤーフラスコ又は２個ひだ
付三角フラスコ又は４個ひだ付三角フラスコに５０ｍ１
！の培地を入れ、前培養液０．５ ｍｌを植菌し、好ア
ルカリ性細菌およびバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）は３７℃その他は３０〜３２
℃で回転振とう機（２００回転／分）で培養した。アセ
トバクター・バスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）およびグルコノバクタ−
・ロゼウス（Ｇｌｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ
） は初発ｐＨ５，７、好アルカリ性細菌は初発ｐＨ
１０，３、その他はｐＨ７，１とした。グルタミン酸−
オキザｎ ｉ’ｉ’＋酸トランスフェラーゼ（°ｆミノ
基転移酵素、以下ＧＯＴ） 、グルタミン酸−ピルピン
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）は和光純薬工業製の測
定試薬を使用した。
地として１１中に次の成分を含むものを使用した。グル
コース又は可溶性でんぷん又は乳糖１５ｇ、ポリペプト
ン５ｇ１イーストエキス５ｇ、リン酸二カリウム１．０
ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２ ｇ、硫酸マンガ
ン（４又は５）水和物０．０２ｇ、生育に必要な場合は
肉エキス３．０ ｇ 、好アルカリ性細菌の場合は炭酸
ナトリウムｌ （Ｉｇを別途殺菌して加えた。細菌株は
３ＱＱｍｉ！のエルレンマイヤーフラスコ又は２個ひだ
付三角フラスコ又は４個ひだ付三角フラスコに５０ｍ１
！の培地を入れ、前培養液０．５ ｍｌを植菌し、好ア
ルカリ性細菌およびバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）は３７℃その他は３０〜３２
℃で回転振とう機（２００回転／分）で培養した。アセ
トバクター・バスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）およびグルコノバクタ−
・ロゼウス（Ｇｌｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ
） は初発ｐＨ５，７、好アルカリ性細菌は初発ｐＨ
１０，３、その他はｐＨ７，１とした。グルタミン酸−
オキザｎ ｉ’ｉ’＋酸トランスフェラーゼ（°ｆミノ
基転移酵素、以下ＧＯＴ） 、グルタミン酸−ピルピン
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）は和光純薬工業製の測
定試薬を使用した。
すなわちＧＯＴ測定は０．２ｍｊ！の基質液（４ｍＭα
−ケトゲルタール酸、２００ｍＭのし一アスパラギン酸
、０．ＩＭのリン酸緩衝液を含む）と０．０５ｍの酵素
液（培養後の遠心上澄液）を４０℃１５分又は３０分反
応させ、０．１ｍｊ！の発色液（３ｍＭの２．４ジニト
ロフエニルヒドラジン、５％酢酸、９５％のジメチルホ
ルムアミドから成る）を加えて４０℃１０分発色させ、
０．４−の０．５Ｎ−水酸化ナトリウムを加え、４０℃
１０分後５２０１ｍの吸収を測定した。
−ケトゲルタール酸、２００ｍＭのし一アスパラギン酸
、０．ＩＭのリン酸緩衝液を含む）と０．０５ｍの酵素
液（培養後の遠心上澄液）を４０℃１５分又は３０分反
応させ、０．１ｍｊ！の発色液（３ｍＭの２．４ジニト
ロフエニルヒドラジン、５％酢酸、９５％のジメチルホ
ルムアミドから成る）を加えて４０℃１０分発色させ、
０．４−の０．５Ｎ−水酸化ナトリウムを加え、４０℃
１０分後５２０１ｍの吸収を測定した。
ＧＰＴの場合基質液は２ｍＭのα−ケトゲルタール酸、
２０ＱｍＭのＤＬ−アラニン、０．１Ｍのリン酸２７
ｆｌｉ液を含むものを使用し、ＧＯＴ。
２０ＱｍＭのＤＬ−アラニン、０．１Ｍのリン酸２７
ｆｌｉ液を含むものを使用し、ＧＯＴ。
ＧＰＴ共ｐｌ＋７．／Ｉである。この条件で１分間に１
ｇモルのピルビン酸を生じる酵フ：１１を１屯位とした
。結果を第７表に示す。
ｇモルのピルビン酸を生じる酵フ：１１を１屯位とした
。結果を第７表に示す。
Claims (2)
- （１）グリシンおよびマンガン化合物から成る群から選
ばれる少なくとも１種の化合物を培地に加えて微生物を
培養することを特徴とする微生物の培養方法。 - （２）微生物が、細菌または酵母である特許請求の範囲
第１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18129584A JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18129584A JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6181775A true JPS6181775A (ja) | 1986-04-25 |
| JPH0452114B2 JPH0452114B2 (ja) | 1992-08-20 |
Family
ID=16098179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18129584A Granted JPS6181775A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | 酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6181775A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04360680A (ja) * | 1991-06-05 | 1992-12-14 | M D Res Kk | 培地、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4892579A (ja) * | 1972-03-16 | 1973-11-30 | ||
| JPS5443595A (en) * | 1977-09-12 | 1979-04-06 | Showa Electric Wire & Cable Co | Method of forming bridged polyethylene cable connector |
| JPS5612111A (en) * | 1979-07-10 | 1981-02-06 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Electric power supply unit of electric power amplifier |
| JPS5675094A (en) * | 1979-11-27 | 1981-06-20 | Kitasato Inst:The | Medium for preparing antibiotic |
| JPS59109187A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-06-23 | ジェネックス・コーポレイション | Ｌ−セリンの酵素的合成方法 |
-
1984
- 1984-08-30 JP JP18129584A patent/JPS6181775A/ja active Granted
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4892579A (ja) * | 1972-03-16 | 1973-11-30 | ||
| JPS5443595A (en) * | 1977-09-12 | 1979-04-06 | Showa Electric Wire & Cable Co | Method of forming bridged polyethylene cable connector |
| JPS5612111A (en) * | 1979-07-10 | 1981-02-06 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Electric power supply unit of electric power amplifier |
| JPS5675094A (en) * | 1979-11-27 | 1981-06-20 | Kitasato Inst:The | Medium for preparing antibiotic |
| JPS59109187A (ja) * | 1982-11-19 | 1984-06-23 | ジェネックス・コーポレイション | Ｌ−セリンの酵素的合成方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04360680A (ja) * | 1991-06-05 | 1992-12-14 | M D Res Kk | 培地、およびペプチド又は蛋白質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0452114B2 (ja) | 1992-08-20 |
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