JPS59109187A - Ｌ−セリンの酵素的合成方法 - Google Patents
Ｌ−セリンの酵素的合成方法Info
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- JPS59109187A JPS59109187A JP58214222A JP21422283A JPS59109187A JP S59109187 A JPS59109187 A JP S59109187A JP 58214222 A JP58214222 A JP 58214222A JP 21422283 A JP21422283 A JP 21422283A JP S59109187 A JPS59109187 A JP S59109187A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアミノ酸であるし一セリンの合成方法に関する
。アミノ酸し−セリンは過食および栄養配合物中に用い
られる貴重力市販製品の一種であり、またこれは成る種
の合成法における中間体または出発原料としても利用さ
れるものである。従つて、■７−セリンに関する需要が
あり、そのため、これを生成するために各種の方法が開
発されて来た。数多くのこれらの方法のうちには醗酵に
よるＬ−セリンの製造も包含されている。たとえば、森
永Ｙ、他による［Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
ｊ ４５ （６）１４１９〜２４ （１９８１年）、森
永Ｙ、他による［Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
。Ｊ ４５（６）１４２５〜１４３０（１９８１年）参
照。また、米国特許第３，６１６，２２４号（特許権者
：シイオ他）（１９７１年）には、醗酵によるセリンを
含む各種アミノ酸の生成方法が開示されており、これは
成る種のバクテリアの菌株を同化炭素源としてメタノー
ルを含有する培地上で培養するものである。更にまた、
米国特許第３，９４３，０３８号（特許権者：森永他）
を参照されたい。これには、酸素、水素および二酸化炭
素の存在下で水性培地において各種バクテリアの特定菌
株を培養することによるセリンおよびその他のアミノ酸
の製造方法が開示されている。
。アミノ酸し−セリンは過食および栄養配合物中に用い
られる貴重力市販製品の一種であり、またこれは成る種
の合成法における中間体または出発原料としても利用さ
れるものである。従つて、■７−セリンに関する需要が
あり、そのため、これを生成するために各種の方法が開
発されて来た。数多くのこれらの方法のうちには醗酵に
よるＬ−セリンの製造も包含されている。たとえば、森
永Ｙ、他による［Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
ｊ ４５ （６）１４１９〜２４ （１９８１年）、森
永Ｙ、他による［Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
。Ｊ ４５（６）１４２５〜１４３０（１９８１年）参
照。また、米国特許第３，６１６，２２４号（特許権者
：シイオ他）（１９７１年）には、醗酵によるセリンを
含む各種アミノ酸の生成方法が開示されており、これは
成る種のバクテリアの菌株を同化炭素源としてメタノー
ルを含有する培地上で培養するものである。更にまた、
米国特許第３，９４３，０３８号（特許権者：森永他）
を参照されたい。これには、酸素、水素および二酸化炭
素の存在下で水性培地において各種バクテリアの特定菌
株を培養することによるセリンおよびその他のアミノ酸
の製造方法が開示されている。
先行技術によって教示される醗酵法の共通の欠点は液体
培地中で生成され、かつ回収されるＬ −セリンの濃度
が比較的長い醗酵後でも比較的低いことである。
培地中で生成され、かつ回収されるＬ −セリンの濃度
が比較的長い醗酵後でも比較的低いことである。
セリンはまた、化学的合成法によっても生産することが
できる。たとえば、カネド編集［アミノ酸の合成的製造
および利用（５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄｓ ）Ｊホールステッド、プレス、ブックス
（１９７４年）参照。これらの化学的方法はしばしばＤ
−およびＬ−光学的異性体から成るラセミ混合物として
、あるいは好ましくない方のＤ−異性体としてセリンを
生成する。ＤＬ−混合物は、Ｄ−セリン異化バクテリア
、セリンラセマーゼを用いる方法、またはＬ −アミノ
酸アシル酵素、セリン誘導体の分別結晶により、あるい
は類似の方法によって分鯖しなければならず、その結果
製品にコストを付加することに彦る。
できる。たとえば、カネド編集［アミノ酸の合成的製造
および利用（５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄｓ ）Ｊホールステッド、プレス、ブックス
（１９７４年）参照。これらの化学的方法はしばしばＤ
−およびＬ−光学的異性体から成るラセミ混合物として
、あるいは好ましくない方のＤ−異性体としてセリンを
生成する。ＤＬ−混合物は、Ｄ−セリン異化バクテリア
、セリンラセマーゼを用いる方法、またはＬ −アミノ
酸アシル酵素、セリン誘導体の分別結晶により、あるい
は類似の方法によって分鯖しなければならず、その結果
製品にコストを付加することに彦る。
Ｌ−セリンはグリシンから生成されることが知られてい
る。グリシンからのＬ−セリンの生物学的生成は数種類
の微生物により達成されて来た。
る。グリシンからのＬ−セリンの生物学的生成は数種類
の微生物により達成されて来た。
たとえば、日中Ｙ、他による「Ｊ、 Ｆｅｒｍｅｎｔ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、 ｊ ５９ ： ４４７ （１９８１
年）参照。
年）参照。
醗酵法によった場合、この方法についての欠点はＬ−セ
リンの収率が余り高くないことである。従って）Ｌ−セ
リンを高収率で合成する方法の必要性が存在する。そこ
で本発明の目的けＬ−セリンの合成法を開発することに
あり、該方法によれば有効に回収することができる溶液
中でセリンは高濃度で生産される。
リンの収率が余り高くないことである。従って）Ｌ−セ
リンを高収率で合成する方法の必要性が存在する。そこ
で本発明の目的けＬ−セリンの合成法を開発することに
あり、該方法によれば有効に回収することができる溶液
中でセリンは高濃度で生産される。
更に本発明の目的はＬ−セリンを生成する酵素的手段を
提供することにあり、該方法によれば反応はバッチまた
は固定方式において行うことができる。
提供することにあり、該方法によれば反応はバッチまた
は固定方式において行うことができる。
セリン生成条件下で５年体触媒量の酵素、セリンヒドロ
キシメチルトランスフェラーゼおよび助因子、テトラヒ
ドロフオレートの存在にのいて、Ｌ−セリンがグリシン
およびホルムアルデヒドから有効に合成できることが見
出された。この酵素は粗抽出物として完全な細胞で、あ
るいは精製した酵素として存在することが可能であり、
まだ固定もしくは非固定形態であってよい。
キシメチルトランスフェラーゼおよび助因子、テトラヒ
ドロフオレートの存在にのいて、Ｌ−セリンがグリシン
およびホルムアルデヒドから有効に合成できることが見
出された。この酵素は粗抽出物として完全な細胞で、あ
るいは精製した酵素として存在することが可能であり、
まだ固定もしくは非固定形態であってよい。
酵素、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（以
下、 ［ｓＨＭＴｊと称する）は助因子、ピリドキサ
ール−５７−ホスフェートおよびテトラヒドロフオレー
トに左右される反応においてグリシンに対するセリンの
開裂を触媒することが知られている。この反応によって
グリシンおよびメチレンテトラヒドロフオレートが得ら
れる。シルツクＬ、による［酵素学における進歩（Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） Ｊ ５
３ ： ８３ （１９８２年）参照。
下、 ［ｓＨＭＴｊと称する）は助因子、ピリドキサ
ール−５７−ホスフェートおよびテトラヒドロフオレー
トに左右される反応においてグリシンに対するセリンの
開裂を触媒することが知られている。この反応によって
グリシンおよびメチレンテトラヒドロフオレートが得ら
れる。シルツクＬ、による［酵素学における進歩（Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） Ｊ ５
３ ： ８３ （１９８２年）参照。
今や、ＳＨＭＴ酵素がグリシンおよびホルムアルデヒド
からＬ−セリンを生成するための生体触媒として有効に
使用し得ることが見出された。この反応は助因子テトラ
ヒドロフオレー１− （ＴＨＦ ）の存在下で起こる。
からＬ−セリンを生成するための生体触媒として有効に
使用し得ることが見出された。この反応は助因子テトラ
ヒドロフオレー１− （ＴＨＦ ）の存在下で起こる。
ＴＨＦの供給源は８ＨＭＴの供給源とも成り得るもので
あり、ＴＨＦについて、これはＳＨＭＴを含有する微生
物細胞中に見出されるものであり、あるいはＴＨＰは外
部供給源から添加してもよい。この方法の一つの利点は
Ｌ−セリン光学的異性体のみが生成されることである。
あり、ＴＨＦについて、これはＳＨＭＴを含有する微生
物細胞中に見出されるものであり、あるいはＴＨＰは外
部供給源から添加してもよい。この方法の一つの利点は
Ｌ−セリン光学的異性体のみが生成されることである。
もう一つの利点は、反応が行われた後の反応器からの生
成物は、醗酵用液体培地中に見出され、あるいは化学合
成の結果期待された複合混合物というよりはむしろグリ
シンおよびＬ−セリンのみを含有していることである。
成物は、醗酵用液体培地中に見出され、あるいは化学合
成の結果期待された複合混合物というよりはむしろグリ
シンおよびＬ−セリンのみを含有していることである。
Ｌ−セリンがグリシンおよびホルムアルデヒドから合成
できることは驚くべきことである。ホルムアルデヒドは
タン白質と化学的に反応し、そして酵素の不活性化を生
ずるものとして知られている。フレンチＤ、他による［
タン白質化学における進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） Ｊ２ ：
２７７−３３５ （１９４５年）参照。事実、８ＨＭＴ
はホルムアルデヒドにより急速に不活性化される。しか
し、反応混合物に過剰のテトラヒドロフオレートを添加
することにより酵素を保護し得ることが判明しでいる。
できることは驚くべきことである。ホルムアルデヒドは
タン白質と化学的に反応し、そして酵素の不活性化を生
ずるものとして知られている。フレンチＤ、他による［
タン白質化学における進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ） Ｊ２ ：
２７７−３３５ （１９４５年）参照。事実、８ＨＭＴ
はホルムアルデヒドにより急速に不活性化される。しか
し、反応混合物に過剰のテトラヒドロフオレートを添加
することにより酵素を保護し得ることが判明しでいる。
このＴ ＨＦがホルムアルデヒドと反応し、その結果酵
素を保護する。
素を保護する。
８ＨＭＴの化学的変性もまた安定性およびホルムアルデ
ヒドによる不活性化からの保護をもたらす。
ヒドによる不活性化からの保護をもたらす。
たとえば、酵素面上のイミドエステルとアミン基の反応
（ミーンズＧ、他による［タン白質の化学（１１） 豹変性（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）ｊホールデンーデイ、イ
ンコーホレーテッド、 １９７１年参照）は、未変性酵
素の場合よりも高いホルムアルデヒド濃度の存在におい
て酵素を作用させ得ることが見出された。
（ミーンズＧ、他による［タン白質の化学（１１） 豹変性（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ）ｊホールデンーデイ、イ
ンコーホレーテッド、 １９７１年参照）は、未変性酵
素の場合よりも高いホルムアルデヒド濃度の存在におい
て酵素を作用させ得ることが見出された。
グリシンからのＬ−セリンの合成を説明するも □の
と考えられる酵素的経路は以下に示される通りである。
と考えられる酵素的経路は以下に示される通りである。
ホルムアルデヒド＋Ｔｌ−ＩＦ 、： ）ｆＶン−
ＴＨＦ反応は、Ｔ１１１；’の酸化を阻止するだめに嫌
気性条件下、たとえば窒素雰囲気において行うのが好ま
しい。
ＴＨＦ反応は、Ｔ１１１；’の酸化を阻止するだめに嫌
気性条件下、たとえば窒素雰囲気において行うのが好ま
しい。
基質Ｓ ＨＭ Ｔおよび助因子’ｌｒ”ＨＦは共に各種
の方法で反応させることができる。反応体と触媒を導入
する順序は臨界的ではないが、ＴＨＦの存在下でＳ Ｈ
Ｍ Ｔにグリシンとホルムアルデヒドをゆっくりと添加
するのが好ましい。反応はＬ−セリン生成条件下で行わ
れる。エシェリヒアコリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）（１２） Ｓ ）］ Ｍ Ｔ遺伝子（ｇｌｙＡ ）をＳ Ｉ（Ｍ
Ｔの供給源として用いる場合には、これらの条件は通常
、反応温度約４乃至約６０°ＣおよびｐＨ約４乃至約１
１の範囲を伴うものである。好せしい反応条件は温度約
２０乃至４５°ＣおよびｐＨ約６乃至８．５における反
応の実施を伴うものである。もし、温度が約４゜Ｃ未満
であると、反応時間は可成り緩慢となり、他方温度が約
６０°Ｃを超えると酵素が変性される可能性がある。同
様に、ｐ）］が約４未満あるいは約１１よりも高くなる
と、酵素は不活性となる可能性がある。ＳＩ（ＭＴは微
生物および高等生物の代謝の中心を占める酵素なので、
この酵素については数多くの潜在的供給源があるｊｌ
Ｌ−セリンを生成するために行われる反応条件の範囲は
用いられる酵素の供給源に関連している。たとえば、耐
熱性微生物から得た酵素は、酵素源がエシェリヒアコリ
である場合よりも高温で用いることが可能であった。
の方法で反応させることができる。反応体と触媒を導入
する順序は臨界的ではないが、ＴＨＦの存在下でＳ Ｈ
Ｍ Ｔにグリシンとホルムアルデヒドをゆっくりと添加
するのが好ましい。反応はＬ−セリン生成条件下で行わ
れる。エシェリヒアコリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）（１２） Ｓ ）］ Ｍ Ｔ遺伝子（ｇｌｙＡ ）をＳ Ｉ（Ｍ
Ｔの供給源として用いる場合には、これらの条件は通常
、反応温度約４乃至約６０°ＣおよびｐＨ約４乃至約１
１の範囲を伴うものである。好せしい反応条件は温度約
２０乃至４５°ＣおよびｐＨ約６乃至８．５における反
応の実施を伴うものである。もし、温度が約４゜Ｃ未満
であると、反応時間は可成り緩慢となり、他方温度が約
６０°Ｃを超えると酵素が変性される可能性がある。同
様に、ｐ）］が約４未満あるいは約１１よりも高くなる
と、酵素は不活性となる可能性がある。ＳＩ（ＭＴは微
生物および高等生物の代謝の中心を占める酵素なので、
この酵素については数多くの潜在的供給源があるｊｌ
Ｌ−セリンを生成するために行われる反応条件の範囲は
用いられる酵素の供給源に関連している。たとえば、耐
熱性微生物から得た酵素は、酵素源がエシェリヒアコリ
である場合よりも高温で用いることが可能であった。
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは完全な細
胞の形態でも、粗抽出物の形態でも、あるいは精製した
酵素であってもよい。この酵素は固定または非固定状で
用いることができる。まだ、酵素は反応を触媒するのに
足る量をもって使用される。酵素は、それを高収率で生
成するだめの慣用の遺伝子工学的技法を用いて変性した
微生物から得られる。スタウファＧ、他による［遺伝子
（Ｇｅｎｅ）ｊ １５：６３〜７２（１９８１年）参照
。
胞の形態でも、粗抽出物の形態でも、あるいは精製した
酵素であってもよい。この酵素は固定または非固定状で
用いることができる。まだ、酵素は反応を触媒するのに
足る量をもって使用される。酵素は、それを高収率で生
成するだめの慣用の遺伝子工学的技法を用いて変性した
微生物から得られる。スタウファＧ、他による［遺伝子
（Ｇｅｎｅ）ｊ １５：６３〜７２（１９８１年）参照
。
ＳＨＭＴ遺伝子（ｇｌｙＡ、 ）は単離され、そしてプ
ラスミドにクローンさせることができ、次いでこれは高
レベルのＳＨＭＴ遺伝子タン白質合成をもたらす適切な
宿主細胞に形質転換させるために用いることができる。
ラスミドにクローンさせることができ、次いでこれは高
レベルのＳＨＭＴ遺伝子タン白質合成をもたらす適切な
宿主細胞に形質転換させるために用いることができる。
メチコニン代謝に際して変性されてしまっているミュー
タント微生物もまた。８ＨＭＴを大量に生産する。スタ
ツファＧ、Ｖ、およびプレンキレイＪ、 Ｅ。による「
遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）Ｊ−影」−１２２１（１
９７８年）ならびにスタツファＧ、Ｖ、およびプレンキ
レイＪ、Ｅ、による［Ｊ。
タント微生物もまた。８ＨＭＴを大量に生産する。スタ
ツファＧ、Ｖ、およびプレンキレイＪ、 Ｅ。による「
遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）Ｊ−影」−１２２１（１
９７８年）ならびにスタツファＧ、Ｖ、およびプレンキ
レイＪ、Ｅ、による［Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 Ｊ １２９．７４０ （１９７
７年）参照。遺伝子クローニング技法を用いて、酵素活
性は２０倍に高められ、そしてこれは細胞の可溶性タン
白質の１０％を超えるものである。プラスミド、具体的
にはｇｌｙＡ遺伝子がクローンされているＩ？ＢＲ，３
２２の誘導体によって形質転換されたＥ、Ｃｏ１１菌株
（Ｇｘ１７０３）、すなわちｐＧｘ】２２がイリノイ州
、ペオリアのザ、ノーザン、レジオナル、リサーチ、ラ
ボラトリ−にＮＲＲＬＡＢ−１５２１５として寄託され
た。同様であるが、高コピ一番号を生じる変質を伴うよ
り小さいプラスミドによって形質転換されたクレブゾエ
ラエーロジエンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ ）菌株（Ｇｘ １７０４ ）、すなわちｐＧ
Ｘｌ ３９がメリーランド州、ロックビルのジ、アメリ
カン、タイプ、カルチャー、コレクションＡＴＣＣ屋３
９２１５として、またｐ Ｇ ｘで形質転換されたサル
モネラチヒムリウム菌株（Ｇｘ １６８２ ） がＡＴ
ＣＣＡ３９２１．５とし−７１−Ｗ託された。
７年）参照。遺伝子クローニング技法を用いて、酵素活
性は２０倍に高められ、そしてこれは細胞の可溶性タン
白質の１０％を超えるものである。プラスミド、具体的
にはｇｌｙＡ遺伝子がクローンされているＩ？ＢＲ，３
２２の誘導体によって形質転換されたＥ、Ｃｏ１１菌株
（Ｇｘ１７０３）、すなわちｐＧｘ】２２がイリノイ州
、ペオリアのザ、ノーザン、レジオナル、リサーチ、ラ
ボラトリ−にＮＲＲＬＡＢ−１５２１５として寄託され
た。同様であるが、高コピ一番号を生じる変質を伴うよ
り小さいプラスミドによって形質転換されたクレブゾエ
ラエーロジエンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇ
ｅｎｅｓ ）菌株（Ｇｘ １７０４ ）、すなわちｐＧ
Ｘｌ ３９がメリーランド州、ロックビルのジ、アメリ
カン、タイプ、カルチャー、コレクションＡＴＣＣ屋３
９２１５として、またｐ Ｇ ｘで形質転換されたサル
モネラチヒムリウム菌株（Ｇｘ １６８２ ） がＡＴ
ＣＣＡ３９２１．５とし−７１−Ｗ託された。
更に遺伝子をＥ、ｃｏｌｉのような供給源から取出す際
、ランダム変徨生成または変種生成を指向する部位によ
り変異させて、改良した安定性を有する酵素る生成する
ことができる。あるいは遺伝子を（１５） 複合変化により完全に化学的に合成して、開示された工
程の間中、酵素の安定性を改良することができる。
、ランダム変徨生成または変種生成を指向する部位によ
り変異させて、改良した安定性を有する酵素る生成する
ことができる。あるいは遺伝子を（１５） 複合変化により完全に化学的に合成して、開示された工
程の間中、酵素の安定性を改良することができる。
完全な細胞を用いて、Ｔ Ｉ（Ｆの供給源を提供するこ
ともできる。所望により、付加的なＴ ＨＦも飽和レベ
ルに達するまで添加することができるが、このレベルは
ｐＨおよび温度に左右されるものである。たとえば、水
溶液中、ｐＨ約７．５および反応温度約３７°Ｃにおい
て、ＴＨＦは濃度が５０ｍＭを超えるまで添加すること
ができる。’Ｉ’ ＨＦ が溶解する間、 ｐＨは
調節せねばならない。もし８ＨＭＴが粗抽出物まだは精
製酵素のいずれがとして添加されれば、ＴＨＦの独自の
供給源が必要とされる。
ともできる。所望により、付加的なＴ ＨＦも飽和レベ
ルに達するまで添加することができるが、このレベルは
ｐＨおよび温度に左右されるものである。たとえば、水
溶液中、ｐＨ約７．５および反応温度約３７°Ｃにおい
て、ＴＨＦは濃度が５０ｍＭを超えるまで添加すること
ができる。’Ｉ’ ＨＦ が溶解する間、 ｐＨは
調節せねばならない。もし８ＨＭＴが粗抽出物まだは精
製酵素のいずれがとして添加されれば、ＴＨＦの独自の
供給源が必要とされる。
添加し得るＴＨＦの量は温度、溶媒条件および反応が行
われるｐＨに従って変動する１、 固定に際してＴＨＥ’はＳＨＭＴを得るためにその活性
を保持することが見出されている。反応を遂行するため
に用いられるバイオリアクターの内部に保持し得る基質
に結合させることによってＴ）ＩＦ’を固定することは
、Ｌ−セリンの合成が完了した（１６） 後、助因子の反覆使用を高めるために有利である。
われるｐＨに従って変動する１、 固定に際してＴＨＥ’はＳＨＭＴを得るためにその活性
を保持することが見出されている。反応を遂行するため
に用いられるバイオリアクターの内部に保持し得る基質
に結合させることによってＴ）ＩＦ’を固定することは
、Ｌ−セリンの合成が完了した（１６） 後、助因子の反覆使用を高めるために有利である。
たとえば、’Ｉ’ＨＦは可溶性ポリマー、たとえばデキ
ストラン、ポリエチレングリコール、またはポリエチレ
ンイミンで固定することができる。固定は初めの２つの
場合には共有結合によって、また第３番目の場合にはイ
オンの相互作用によって起る。
ストラン、ポリエチレングリコール、またはポリエチレ
ンイミンで固定することができる。固定は初めの２つの
場合には共有結合によって、また第３番目の場合にはイ
オンの相互作用によって起る。
一般に共有結合は基質のアミン基と共にＴＨＦ のカル
ボキシ基によって生ずる。あるいは同様の結合方法を用
いて、ＴＨＦもまた、不溶性基質に結合させることがで
きる。
ボキシ基によって生ずる。あるいは同様の結合方法を用
いて、ＴＨＦもまた、不溶性基質に結合させることがで
きる。
また、もしセリンがバッチ法で合成されれば、ＴＨＦ
をリサイクルさせることができる。たとえば、Ｌ−セ
リンが合成された後、反応溶液は活性炭またはイオン変
換基を通過させることができ、これらはＬ−セリン生成
物溶液から’ｌ’ ＨＦを分離し、そして保持するもの
である。次いでＴＨＦを開放し、そして中和することが
できる。更にＴＨＦは小さい分子、たとえばグルコサミ
ンに共有結合させることにより変性して、助因子の回収
を容易にしてもよい。Ｌ−セリンが合成された後、反応
溶液をホウ酸塩基に移行させる。ホウ酸塩は’ＩＩＩＦ
−グルコサミンとのみ結合して、変性されたＴＩＩＦは
開放され、そしてリサイクルすることができる。
をリサイクルさせることができる。たとえば、Ｌ−セ
リンが合成された後、反応溶液は活性炭またはイオン変
換基を通過させることができ、これらはＬ−セリン生成
物溶液から’ｌ’ ＨＦを分離し、そして保持するもの
である。次いでＴＨＦを開放し、そして中和することが
できる。更にＴＨＦは小さい分子、たとえばグルコサミ
ンに共有結合させることにより変性して、助因子の回収
を容易にしてもよい。Ｌ−セリンが合成された後、反応
溶液をホウ酸塩基に移行させる。ホウ酸塩は’ＩＩＩＦ
−グルコサミンとのみ結合して、変性されたＴＩＩＦは
開放され、そしてリサイクルすることができる。
グリシンおよびホルムアルデヒドをテトラヒドロフオレ
ート−ＳＨＭＴ混合物に添加するのが好ましい。添加し
得るグリシンの量は反応のｐＨ，７１Ｍ度および溶媒条
件によって変動するが、これは通常飽和レベルに達する
まで添加することが可能である。
ート−ＳＨＭＴ混合物に添加するのが好ましい。添加し
得るグリシンの量は反応のｐＨ，７１Ｍ度および溶媒条
件によって変動するが、これは通常飽和レベルに達する
まで添加することが可能である。
先に述べたように、ホルムアルデヒドはＳＨＭＴに対し
て非常に有毒である可能性がある。従って、ホルムアル
デヒドは一般に、池の成分に対し、ゆっくりと添加され
、そしてその添加は調整される。
て非常に有毒である可能性がある。従って、ホルムアル
デヒドは一般に、池の成分に対し、ゆっくりと添加され
、そしてその添加は調整される。
ホルムアルデヒドは酵素活性を保持するのに足りる量を
もって添加されて、通常用いられるＴ ＨＦ濃度より高
い約１０ｍＭ未満の濃度を維持する。
もって添加されて、通常用いられるＴ ＨＦ濃度より高
い約１０ｍＭ未満の濃度を維持する。
もつとも、ホルムアルデヒドを添加して用いられるＴ
ＨＦ濃度よりも高い約５０ｍＭ程度の高濃度を維持して
もよい。系中のＴＨＦの濃度が犬になればなる程、ＴＨ
Ｆがホルムアルデヒドと良好に反応することについて、
ホルムアルデヒドの濃度を高く維持することが可能とな
り、その結果酵素を保護することになる。Ｔ Ｉ（Ｆと
ホルムアルデヒドとの反応のメカニズムは力どン、Ｒ，
，Ｇ。他による［Ｊ。
ＨＦ濃度よりも高い約５０ｍＭ程度の高濃度を維持して
もよい。系中のＴＨＦの濃度が犬になればなる程、ＴＨ
Ｆがホルムアルデヒドと良好に反応することについて、
ホルムアルデヒドの濃度を高く維持することが可能とな
り、その結果酵素を保護することになる。Ｔ Ｉ（Ｆと
ホルムアルデヒドとの反応のメカニズムは力どン、Ｒ，
，Ｇ。他による［Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｊ２４１ （２４）５８５１〜５
８６３（１９６６年）中に説明されている。反応装置内
の酵素活性が犬になればなる程、所望の濃度を維持する
ために添加されるホルムアルデヒドは早くなる。
８６３（１９６６年）中に説明されている。反応装置内
の酵素活性が犬になればなる程、所望の濃度を維持する
ために添加されるホルムアルデヒドは早くなる。
更に反応体に対し、第２のＳ Ｉ−］’ Ｍ Ｔ動因子
、ピリドキサール５′−ホスフェートを添加するのが有
利であることも見出されている。ピリドキサール５′−
ホスフエートも酵素に緊密に結合される。もし、■・−
セリンが反応装置中で長い時間にわたり合成されると、
ピリドキサールホスフェートは喪失し、もしくは不活性
となるが、この場合には付加的なピリドキサールホスフ
ェートを添加すればよい。
、ピリドキサール５′−ホスフェートを添加するのが有
利であることも見出されている。ピリドキサール５′−
ホスフエートも酵素に緊密に結合される。もし、■・−
セリンが反応装置中で長い時間にわたり合成されると、
ピリドキサールホスフェートは喪失し、もしくは不活性
となるが、この場合には付加的なピリドキサールホスフ
ェートを添加すればよい。
合成中の動因子の損失は反応溶液の黄色の喪失およびセ
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによる活性の
喪失によって示される。反応に添加されるピリドキサー
ルホスフェートの濃度は必要に応じ Ｏ乃至約２０ ｍ
Ｍの範囲で変化することが可能であシ、そして好ましく
は約０１１ｍＭ乃至約１ｍＦｖｉの範囲でおる。
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによる活性の
喪失によって示される。反応に添加されるピリドキサー
ルホスフェートの濃度は必要に応じ Ｏ乃至約２０ ｍ
Ｍの範囲で変化することが可能であシ、そして好ましく
は約０１１ｍＭ乃至約１ｍＦｖｉの範囲でおる。
過剰のピリドキサールホスフェートの添加は付加的な機
能を果たすことができる。ｇｌｙＡ遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換された成る種の微生物であって
、高レベルのＳ ＨＭ、 Ｔを合成するものにおいては
、ピリドキサール５′−ホスフェートの添加が存在する
ＳＨＭＴを飽和し、また観察される酵素活性を高めるた
めに必要である。この種の微生物の一塊が、上に固定し
たプラスミドｐＧｘ １３９を含有するＫｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓである。合成反応は何らか
の無害溶媒の存在下で行うことができる。これら溶媒の
具体例には、エタノール、メタノール、インプロパツー
ルおよびジオキサンがある。
能を果たすことができる。ｇｌｙＡ遺伝子を含有するプ
ラスミドにより形質転換された成る種の微生物であって
、高レベルのＳ ＨＭ、 Ｔを合成するものにおいては
、ピリドキサール５′−ホスフェートの添加が存在する
ＳＨＭＴを飽和し、また観察される酵素活性を高めるた
めに必要である。この種の微生物の一塊が、上に固定し
たプラスミドｐＧｘ １３９を含有するＫｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓである。合成反応は何らか
の無害溶媒の存在下で行うことができる。これら溶媒の
具体例には、エタノール、メタノール、インプロパツー
ルおよびジオキサンがある。
以下の実施例は本発明を更に例示しようとするものであ
る。
る。
〔実施例１〕
（１９ノ
プラスミドｐＧｘ１３９を含む、および含まないバクテ
リア菌株を、０４％グルコースまたはラクトースを補給
したＬＢ培地（バクトドリプトーン１０２／リツトル、
酵母菌抽出物５２／リツトル、Ｎａｃｌ ５ ！ｉ’
／リットル）または微細培地（Ｋ、１（ＰＯ４１０、ｆ
ｌ’／リットル、ＫＨ２Ｐ０，４．５り／リットル、（
ＮＨ４）２ｓｏ、１．Ｏり／リットルおよびクエン酸ナ
トリウム・２Ｈ２００，５Ｆ／リツトル）中で成長させ
た。指示された場合には、アミノ酸を２０μｙ／ｍｌま
で、そしてビタミンを１μｙ／ｍｌとなるまで添加した
。セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの比活性
は細胞の超音波処理後の抽出可能なタン白質の分／巧当
シのベンズアルデヒドおよびグリシンに転換されたＬ−
フェニルセリンのモル数によって表示される。
リア菌株を、０４％グルコースまたはラクトースを補給
したＬＢ培地（バクトドリプトーン１０２／リツトル、
酵母菌抽出物５２／リツトル、Ｎａｃｌ ５ ！ｉ’
／リットル）または微細培地（Ｋ、１（ＰＯ４１０、ｆ
ｌ’／リットル、ＫＨ２Ｐ０，４．５り／リットル、（
ＮＨ４）２ｓｏ、１．Ｏり／リットルおよびクエン酸ナ
トリウム・２Ｈ２００，５Ｆ／リツトル）中で成長させ
た。指示された場合には、アミノ酸を２０μｙ／ｍｌま
で、そしてビタミンを１μｙ／ｍｌとなるまで添加した
。セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの比活性
は細胞の超音波処理後の抽出可能なタン白質の分／巧当
シのベンズアルデヒドおよびグリシンに転換されたＬ−
フェニルセリンのモル数によって表示される。
効力検定は０．１ｍＭのピリドキサールホスフェートと
共にｐＨ７，，３において５０ｍＭホスフェート緩衝液
中で、また２０°Ｃで３５ ｍＭの１・−フェニルセリ
ンにおいて行われた。ベンズアルデヒドの外観は記録分
光光度計により２７９ ｎＭで監視（２０） した。
共にｐＨ７，，３において５０ｍＭホスフェート緩衝液
中で、また２０°Ｃで３５ ｍＭの１・−フェニルセリ
ンにおいて行われた。ベンズアルデヒドの外観は記録分
光光度計により２７９ ｎＭで監視（２０） した。
ＳＨＭＴ
比活性（ｎモル／分／〃り）
Ｅ、ｃｏｌｉ
ＧＸ］、６９８ − ３９ Ｎ、Ｄ、＊Ｇ
Ｘ１７（１４，−３６Ｎ、Ｄ。
Ｘ１７（１４，−３６Ｎ、Ｄ。
ＧＸ１７０４ ｐＧｘ１３９ ５９０ １１４
グルコース２２３’ １０４ ラクト
ース菌株 遺伝子型 Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ１６９８ ｔｒｐＥＡ、 ｔｎａ２．５ｅｒＢ、
］ａｃＩｑｔｓ４０２ＧＸ１６７１ ｔｈｉ 、 ａ
ｒａ 、 ５ｔｒＲ、ｇｌｙＡ、 ［５ｅｒＢｔｒｐＲ
：］、ＩａｃＩｑｌ、ＩａｃＺ ： ： ｔｎ５ＧＸ１
７０３ ｇｌｙＡ、 ｐｈｅＡ、 を旧、Ｉａｃ 、
ａｒａ 、 ５ｔｒＲサルモネラ チヒムリウム ＬＴ
２ ＧＸ１６８２ ｔｒｐＢＥＤＣ４３Ｆ’１ａｃＩｑｔ
ｓ４２０ｐｒ。
グルコース２２３’ １０４ ラクト
ース菌株 遺伝子型 Ｅ、ｃｏｌｉ ＧＸ１６９８ ｔｒｐＥＡ、 ｔｎａ２．５ｅｒＢ、
］ａｃＩｑｔｓ４０２ＧＸ１６７１ ｔｈｉ 、 ａ
ｒａ 、 ５ｔｒＲ、ｇｌｙＡ、 ［５ｅｒＢｔｒｐＲ
：］、ＩａｃＩｑｌ、ＩａｃＺ ： ： ｔｎ５ＧＸ１
７０３ ｇｌｙＡ、 ｐｈｅＡ、 を旧、Ｉａｃ 、
ａｒａ 、 ５ｔｒＲサルモネラ チヒムリウム ＬＴ
２ ＧＸ１６８２ ｔｒｐＢＥＤＣ４３Ｆ’１ａｃＩｑｔ
ｓ４２０ｐｒ。
ＧＸ１７０４ １ｓｄ（Ｌ−セリンデアミナーゼミュー
タント）＊未測定 プラスミドｐＧｘ１３９を含有するＥ、 ｃｏｌｉ菌種
ＧＸ］６７１は本発明方法におけるＳＨＭＴの供給源と
して用いられている代表的な付加的菌種である。
タント）＊未測定 プラスミドｐＧｘ１３９を含有するＥ、 ｃｏｌｉ菌種
ＧＸ］６７１は本発明方法におけるＳＨＭＴの供給源と
して用いられている代表的な付加的菌種である。
〔実施例２〕
ＮＲＲ，ＬＡＢ−１５２１５として寄託された（ｐＧｘ
１２２を含有する）エシェリヒアコリ菌種ＧＸ−１７０
３のコロニーの一つを以下に述べる培養基■の１００ｍ
１（２３） 中に接種し、そして３７°Ｃで一晩中振とうした。
１２２を含有する）エシェリヒアコリ菌種ＧＸ−１７０
３のコロニーの一つを以下に述べる培養基■の１００ｍ
１（２３） 中に接種し、そして３７°Ｃで一晩中振とうした。
培養基■：
に、、 ＨＰＯ４１０，５１ｆ／１
Ｋ）ｌ、 ＰＯ４４，５ｙ／１
（ＮＨ４）、８０４１ ？／ｌ
くえん酸ナトリウム−２Ｈ，ＯＯ，５？／ ｔフェニル
アラニン ２０μｙ／ｍｌビタミンＢ、１Ａ
ｔ、／ｍｔ アンピシリン １００μｙ／ｍ１Ｍｇ５Ｏ
，２ｍＭ Ｆ ｅ Ｓ ０４５ｍｒ／ｍｔ 細胞培養基を遠心分離することによって細胞を収集し、
そして酵素供給源として用いた。窒素ブランケット下で
グリシン（最終濃度１１ｍＭ）をテトラヒドロフオレー
ト（最終濃度５ｍＭ）、ピリドキサール−ホスフェ−）
（１ｍＭ ）およびホルムアルデヒド（最終濃度１０
ｍＭ）と混合した。
アラニン ２０μｙ／ｍｌビタミンＢ、１Ａ
ｔ、／ｍｔ アンピシリン １００μｙ／ｍ１Ｍｇ５Ｏ
，２ｍＭ Ｆ ｅ Ｓ ０４５ｍｒ／ｍｔ 細胞培養基を遠心分離することによって細胞を収集し、
そして酵素供給源として用いた。窒素ブランケット下で
グリシン（最終濃度１１ｍＭ）をテトラヒドロフオレー
ト（最終濃度５ｍＭ）、ピリドキサール−ホスフェ−）
（１ｍＭ ）およびホルムアルデヒド（最終濃度１０
ｍＭ）と混合した。
ｐＨは０．１ Ｍリン酸カリウムによって７．６に維持
し、そしてこの反応混合物の最終容量を１００ｍｌとｌ
−だ。反応は上述の反応溶液を細胞と３７°Ｃで（２４
） 振とうによって混合することによシ開始された。
し、そしてこの反応混合物の最終容量を１００ｍｌとｌ
−だ。反応は上述の反応溶液を細胞と３７°Ｃで（２４
） 振とうによって混合することによシ開始された。
８時間後、セリフ５ｍＭが生成された（収率はグリシン
基準で４５％であった）。全ての酵素活性は保持された
。グリシンとセリンの濃度は高性能液体クロマトグラフ
ィーを用いて測定された。
基準で４５％であった）。全ての酵素活性は保持された
。グリシンとセリンの濃度は高性能液体クロマトグラフ
ィーを用いて測定された。
〔実施例３〕
ＡＴＣＣＡ３９２１４として寄託された（ｐＧｘ１３９
を含有する）クレブシェラエーロジェンズ菌種ＧＸ １
７０４のコロニーの一つを以下に述べる培養基■の１０
０ｍｔ中に接種し、そして３０°Ｃで一晩中振とうした
。
を含有する）クレブシェラエーロジェンズ菌種ＧＸ １
７０４のコロニーの一つを以下に述べる培養基■の１０
０ｍｔ中に接種し、そして３０°Ｃで一晩中振とうした
。
培養基■ニ
ド リ プ ト − ン
１０ｙ／１ＮａｃＬ
１０１／１酵母抽出物
ＦＭ／ノ。
１０ｙ／１ＮａｃＬ
１０１／１酵母抽出物
ＦＭ／ノ。
グルコース １０ｔ／を細胞培養基を
遠心分離することによって細胞を収集し、そして酵素供
給源として用いた。
遠心分離することによって細胞を収集し、そして酵素供
給源として用いた。
Ｅ、 ｃｏｌｉの代りにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒ
ｏｇｅｎｅｓを用いた他はセリン生成のための実施例１
の手順に従った３、８時間後、セリン７ ｍＭが生成さ
れた（収率はグリシン基準で６４％であった）。全ての
酵素活性は保持された。
ｏｇｅｎｅｓを用いた他はセリン生成のための実施例１
の手順に従った３、８時間後、セリン７ ｍＭが生成さ
れた（収率はグリシン基準で６４％であった）。全ての
酵素活性は保持された。
〔実施例４〕
Ｅ、ｃｏｌｉ（菌種ＧＸＩ ７０３ ）からの部分的に
精製したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを
用いた他は実施例１０手順に従った。細胞は超音波処理
により４°Ｃで破壊した。遠心分離後収集した上澄みを
４°ＣおよびｐＨ７，５において硫酸アンモニウム（５
０％飽和）と混合した。遠心分離により固形分を除、去
した後、硫酸アンモニウム含有量を１００％飽和に増加
することによって酵素は溶液を追い出された。この酵素
は遠心分離と透析により収集された。反応の４時間後に
セリン１０ｍＭが生成された。収率はグリシン基準で９
０％であった１、全ての酵素活性は保持された。
精製したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを
用いた他は実施例１０手順に従った。細胞は超音波処理
により４°Ｃで破壊した。遠心分離後収集した上澄みを
４°ＣおよびｐＨ７，５において硫酸アンモニウム（５
０％飽和）と混合した。遠心分離により固形分を除、去
した後、硫酸アンモニウム含有量を１００％飽和に増加
することによって酵素は溶液を追い出された。この酵素
は遠心分離と透析により収集された。反応の４時間後に
セリン１０ｍＭが生成された。収率はグリシン基準で９
０％であった１、全ての酵素活性は保持された。
〔実施例５〕
最初のグリシン濃度が３４０ｍＭであり、またホルムア
ルデヒド（当初濃度２ Ｍ ）が１ｍｔ／時間の割合で
導入された他は実施例３の手順に従った。１２時間後、
セリフ１．１９ ｍＭが生成された。
ルデヒド（当初濃度２ Ｍ ）が１ｍｔ／時間の割合で
導入された他は実施例３の手順に従った。１２時間後、
セリフ１．１９ ｍＭが生成された。
〔実施例６〕
グリ７ン（当初濃度２Ｍ）およびホルムアルデヒド（当
初濃度２ Ｍ ）を１ｍｔ／時間の同一速度で導入した
。５時間後、セリン５７ｍＭが生成された。
初濃度２ Ｍ ）を１ｍｔ／時間の同一速度で導入した
。５時間後、セリン５７ｍＭが生成された。
〔実施例７〕
ＴＨＦ が変性された以外は実施例３０手順に従った。
デキストラン（「ファーマシアＴ ４０ Ｊ（商標）５
２）を水中に溶解して、最終濃度５％とした。デキスト
ラン溶液は０．１ Ｍ Ｎａ ＩＯ，によって１時間室
温で酸化した。酸化したデキストランはエタノールを６
０％（Ｖ／Ｖ）になるまで添加することにより析出した
。この工程を２回反復した。酸化したデキストランをｐ
Ｈ９，０において、０．２Ｍ１．６−ヘキサンジアミン
（ＨＭ Ｄ ） １００ｍＡ中に溶解した。３０分およ
び６０分後に夫々ホウ水素化ナトリウム（０，２ｆ）を
添加した。
２）を水中に溶解して、最終濃度５％とした。デキスト
ラン溶液は０．１ Ｍ Ｎａ ＩＯ，によって１時間室
温で酸化した。酸化したデキストランはエタノールを６
０％（Ｖ／Ｖ）になるまで添加することにより析出した
。この工程を２回反復した。酸化したデキストランをｐ
Ｈ９，０において、０．２Ｍ１．６−ヘキサンジアミン
（ＨＭ Ｄ ） １００ｍＡ中に溶解した。３０分およ
び６０分後に夫々ホウ水素化ナトリウム（０，２ｆ）を
添加した。
ＨＭ Ｄ−デキストランを水に抗して一晩中透析し、か
つ凍結乾燥した。窒素雰囲気下、ｐ Ｈ７，０におイテ
Ｔ）ＩＦ （５ｍＭ ）をｌ、−ｘｆルー ３− （３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１０ｍＭお
よび０．５９（、Ｔ−ＩＭＤ−テキストランと混合した
。生成した析出物は遠心分離により収集し、そして０、
５ Ｍ Ｎａｃｌ溶液で２回洗浄した。固形Ｔ Ｉ−Ｉ
Ｉｉ” は実施例３において説明したように反応混合
物と混合した。反応の３時間後、セリ７７ ｍＭが生成
された。
つ凍結乾燥した。窒素雰囲気下、ｐ Ｈ７，０におイテ
Ｔ）ＩＦ （５ｍＭ ）をｌ、−ｘｆルー ３− （３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１０ｍＭお
よび０．５９（、Ｔ−ＩＭＤ−テキストランと混合した
。生成した析出物は遠心分離により収集し、そして０、
５ Ｍ Ｎａｃｌ溶液で２回洗浄した。固形Ｔ Ｉ−Ｉ
Ｉｉ” は実施例３において説明したように反応混合
物と混合した。反応の３時間後、セリ７７ ｍＭが生成
された。
特 許 出 願 人 ジエネツクス・コーポレイション
マン アメリカ合衆国４７９０６インデイ アナ州ウエスト・ラフアイエラ チ・ブロツフ・ハロー４０ （２’８） 手続補正書（自発） 昭和５９年１月１２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭５８−２１４２２２号２、
発明の名称 Ｌ−セリンの酵素的合成方法 ３、補正をする者 名称 ジエネツクス コーポレイション５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 別紙のとおり ６、 補正の内容 （１）明細書第２１頁第１４行に［Ｌ−フェニルセリ−
Ｉとあるのを「β−フェニルセリ」と補正する。
マン アメリカ合衆国４７９０６インデイ アナ州ウエスト・ラフアイエラ チ・ブロツフ・ハロー４０ （２’８） 手続補正書（自発） 昭和５９年１月１２日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭５８−２１４２２２号２、
発明の名称 Ｌ−セリンの酵素的合成方法 ３、補正をする者 名称 ジエネツクス コーポレイション５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 別紙のとおり ６、 補正の内容 （１）明細書第２１頁第１４行に［Ｌ−フェニルセリ−
Ｉとあるのを「β−フェニルセリ」と補正する。
（２）同第２１［１第１８行に「Ｌ−フエ」とあるのを
「β−フエ」と補正する。
「β−フエ」と補正する。
（３）同第２４頁第１４行に「（最終濃度１１ｍＭ
’）」とあるのを［（最終濃度１．２ｍＭ）Ｊと補正す
る。
’）」とあるのを［（最終濃度１．２ｍＭ）Ｊと補正す
る。
（４）同第２６頁第１行に「実施例１」とあるのを「実
施例２」と補正する。
施例２」と補正する。
手続補正書（自発）
昭和５９年１ 月１３日
特許庁長官殿
１、事件の表示 特願昭５８−２１４２２２号２、
発明の名称 Ｌ−セリンの酵素的合成方法 ３、補正をする者 名 称 ジェネックス コーボレイション５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄
発明の名称 Ｌ−セリンの酵素的合成方法 ３、補正をする者 名 称 ジェネックス コーボレイション５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄
Claims (33)
- （１）Ｌ−セリンの生成条件下で、生体触媒量のセリン
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびテトラヒド
ロフオレートの存在においてグリシンとホルムアルデヒ
ドとを反応させることを特徴とするＬ−セリンの合成方
法。 - （２）温度が約４°乃至約６０°、そしてｐＨが約４乃
至約１１の範囲内に維持される特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - （３）温度が約２０°乃至約４５°Ｃ１そしてｐＨが約
６乃至約８．５の範囲内にある特許請求の範囲第２項記
載の方法。 - （４） セリンヒドロキシメチルトランスフニーｙ−
ゼが完全な細胞中に含まれている特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （５） セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
が粗抽出物の形態である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - （６） セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
が精製酵素の形態である特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - （７）セリ／ヒドロキシメチルトランスフェラーゼが固
定される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （８）反応がバッチシステムで行われる特許請求の範囲
編１項記載の方法。 - （９）反応が連続システムで行われる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （１０）テトラヒドロフオレートの供給源が、セリンヒ
ドロキシメチルトランスフェラーゼ−に含有ｆる完全な
微生物細胞である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１１）反応系に追加のテトラヒドロフオレートを添加
してテトラヒドロフオレート濃度を飽和レベルの最大限
に増加させる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 - （１２）テトラヒドロフオレートの濃度が約０１５乃至
約５０ｍＭである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１３）テトラヒドロフオレー１・が固定される特許請
求の範囲第１項記載の方法。 - （１４）テトラヒドロフオレートが可溶性ポリマーで固
定される特許請求の範囲第１３項記載の方法。 - （１５）テトラヒドロフオレートが固体基質に結合させ
ることにより固定される特許請求の範囲第１３項記載の
方法。 - （１６）テトラヒドロフオレートがリサイクルできるよ
うに変性される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１７）反応溶液がグリシンで飽和されるまでグリシン
を添加できる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１８）ホルムアルデヒドがＴ）（Ｆ濃度より犬である
最大濃度約３０ｍＭ乃至約５０ｍＭまで添加される特許
請求の範囲第１環記載の方法。 - （１９）ホルムアルデヒドの濃度がＴＨＦより犬である
約１０ｍＭの定常状態とされる特許請求の範囲第１８項
記載の方法。 - （２０）ピリドキサールホスフェ−１・が反応体に対し
濃度０乃至約２０ｍＭで添加される特許請求の範囲第１
項記載の方法。 - （２１）ビリドキザールホスフエート濃度が約０１乃至
１．０ｍ？ｖｌの範囲に及んでいる特許請求の範囲第２
０項記載の方法。 - （２２） ＳＩＩＭＴの供給源が、ＮＲＩもＬ７１１Ｂ
−１５２１５としてザ、ノーザン、レジオナル、リザー
チ、ラボラトリ−に寄託されたプラスミドｐＧｘ１２２
を含有するエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ）菌株ＧＸ１７０３である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （２３） ８ＢＩＭＴの供給源が、Ａ、 Ｔ ＣＣ扁３
９２］５としてジ、アメリカン、タイプ、カルチャー、
コレクション に寄託されたプラスミドｐＧｘ１３９を
含有するサルモネラチヒムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）菌株Ｇｘ１６８２である
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （２４）ＳＨＭＴの供給源が、ＡＴＣＣ５３９２１４と
してジ、アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクショ
ンに寄託されたシラスミドｐＧｘ１３９を含有するクレ
ブシエラエーロジエンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａａｅｒ
ｏｇｅｎｅｓ ）菌株ＧＸ１７０４である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （２５）細胞中のセリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼ活性が遺伝的操作により増強される特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （２６）細胞中のセリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼ活性が、セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子をプラスミド中にクローニングし、そして該
プラスミドによって宿主細胞を形質転換してセリンヒド
ロキシメチルトランスフェラーゼを大量生産することに
より増強される特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （２７）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが
何らかの生物供給源から得られる特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （２８）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺
伝子がランタ゛ム変種生成または変種生成を指向する部
位によって変質されて酵素安定性を増す特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （２９）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ酵
素が化学的に変性されて酵素安定性を増す特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （３０）酵素がイミドエステルとの反応により変性され
る特許請求の範囲第２９項記載の方法。 - （３１）プラスミドｐＧｘ １２２を含有するエシェリ
ヒアコリ菌株ＧＸ １７０３から成る略生物学的に純粋
な培養物。 - （３２）プラスミドｐＧｘ１３９を含有するザルモネラ
チヒムリウム菌種ＧＸ１６８２から成る略生物学的に純
粋々培養物。 - （３３） ｐＧｘｌ ３９を含有するクレブシエラエー
ロジエンズから成る略生物学的に純粋な培養物。
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|---|---|---|---|
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