JPH0242994A - β−ヒドロキシアミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
活性を有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物、なかでもセリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片とべりターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
有する該属微生物の菌体もしくはその処理物を利用し、
酵素反応によってグリシンとアルデヒドより対応するβ
ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関するものである
。したがって、本発明はバイオインダストリーの産業分
野に関し、とくに化粧品、医薬品、飼Ｕ添加物、医薬中
間体として有用なセリン、スレオニン、フェニルセリン
などのβ−ヒドロキシアミノ酸の製造分野に関する。

従来の技術 セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｅ、、Ｃ
，２，１，２，１，＞　（以下Ｓ　ＨＭ　Ｔと略す）は
、代謝上重要な酵素であり微生物、動物、植物などに広
く存在する。この酵素は、グリシンとアルデヒドからβ
−ヒドロキシアミノ酸への合成反応を触媒する〔アドバ
ンス・イン・エンザイモロジイ（八ｄｖａｎｓ　　ｉｎ
　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　　５３．　８３−１１
２（１９８２）］　　。

この酵酵素芯を用いたβ−ヒドロキシアミノ酸の製造法
に関しては、エシェリヒア属、サルモネラ属、タレブシ
エラ属に属する微生物の該酵素活性を利用した方法が知
られている（特開昭５９−１０９１８７、特開昭６ｌ−
９２９４）。また、コリネバクテリウム属およびプレビ
バクテリウｌ−属に属する微生物の菌体またはその処理
物を用いたグリシンとアルデヒドからのβ−ヒドロキシ
アミノ酸の製造法としては、ａｋ　、’ｉＴｉ’Ｒ１生
物のスレオニンアルドラーセ活性を利用した方法が知ら
れている（特公昭５４−１２５５４）。

発明が解決しようとする課題 化粧品成分、医薬品、医薬原料などとして有用なセリン
、スレオニン、アロスレオニン、β−フェニルセリンな
どのβ−ヒドロキシアミノ酸は近年ますまず需要が増大
しつつあり、その製造法の改良は常に望まれている。

課題を解決するだめの手段 本発明者らは、効率よくβ−ヒドロキシアミノ酸を製造
する方法を開発するために研究を行った。

その結果、コリネバクゾリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物に、微生物由来のＳＨＭＴの合成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
との組換え体ＤＮＡを保有させて該酵素活性を増大させ
た微生物の菌体もしくはその処理物の存在下にグリシン
とアルデヒドとを反応させれば、効率よくβ−ヒドロキ
シアミノ酸が生成することを見出し本発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、ＳＨＭＴ活性を有する１ｆｉ生物の菌体
またはその処理物の存在下、グリシンとアルデヒドとを
反応さけて反応液中にβ−ヒドロキシアミノ酸を生成さ
せ、反応液から生成したβ−ヒドロキシアミノ酸を採取
することを特徴とするβ−ヒドロキシアミノ酸の製造法
を提供する。

本発明に用いられる微生物としては、コリネバクデリウ
ｌ−属またはブレビバクテリウム１匡に属し、ＳＨＭＴ
活性を有する微生物であればいずれも用いることができ
る。

また、ＳＨＭＴの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物に保有させることによって、ＳＨＭＴ活性を増大さけ
た微生物をｉ）ることができ、この微生物を用いること
によりさらに効率よくβ−ヒドロキシアミノ酸を製造す
ることができる。

Ｓ　［−（Ｍ　Ｔの合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、Ｓｌ（Ｍ
Ｔ活性を有する微生物の染色体ＤＮＡをＤＮＡ断片の供
給源とし、コリネバクテリウム匡またはブレビバクテリ
ウム属菌種中で自律複製できるベクターを用いて、該Ｄ
ＮＡ断片を該ベクターに組み込むことによって得ること
ができる。

ＳＨＭＴの合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の供
給源となる微生物としては、ＳＨＭＴ活性を有する微生
物ならばいかなる微生物でも使用できる。具体的に好適
な例としては、コリ不バクテリウノ・・グルタミクム、
エシェリヒア・コリなどがあげられる。

該遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込むためのベクターと
しては、コリネバクテリウ１１属またはブレビバクテリ
ウム属菌種中で自律？ｌＩ製できるものであれば特に限
定されないが、例えばｐｃＧｌ（特開昭５７−１３４５
００）、ｐｃｃ２　（特開昭５８−３５１９７＞、ｐＣ
Ｇ４．ｐｃＧｌｌ　　（いずれも特開昭５７−１８３７
９９）、ｐＣＥ５４、ｐｃＢｌｏｌ（いずれも特開昭５
８１０５９９９）　、ｐ　ＣＥ　５１、ｐＣＥ５２、ｐ
ｃＥｓ３〔いずれもモレキュラー・アンド・ジェネラル
・ジエネティクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、
　１９６　．１７５（１９８４）］　、およびそれらか
ら誘導されたプラスミドを使用することができる。

ＳＨＭＴをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、常法〔メソッヅ・イン
・エンザイモロジイ　（！Ａｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）、　６Ｂ　（１９７９）　〕により種
々の組換え体混成物と共に生成させることができる。こ
の混成物を用いて、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物を形質転換し、このうち
ＳＨＭＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミド
を保有する形質転換株を選択し、その株よりプラスミド
を単離することにより、ＳＨＭＴをコードする遺伝子を
含む組換え体プラスミドを取？１′Ｆすることができる
。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物の形質転換法としては、プロトプラストを
用いる方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５
７−１８６４８９）により実施することができる。Ｓｌ
−ＩＭＴをコードする遺伝子を含む組換え体プラスミド
を保有する形質転換株の選択法としては、該遺伝子の欠
失した変異株を宿主として形質転換を行い欠損形質が相
補された形質転換株を選択する方法、ＳＨＭＴのアミノ
酸配列に対応する塩基配列を有する合成りＮＡ断片また
はすでにクローン化されているＳ　）（Ｍ　Ｔ遺伝子の
断片とハイブリダイズする性質を指標にして選択する方
法などがあげられる。

コリネバクテリウム属またはプレビバクテリウｌ−属菌
種の宿主・ベクター系を用いる代わりに、たとえば大腸
菌などの他の菌種の宿主・ベクター系を用いても、上記
と同様の方法により目的の組換え体プラスミドを取得す
ることができる。

このようにして取得したＳＨＭＴの合成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドを保有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物の培養は、通常用いられる合成または天
然培地を用いて行うことができる。培地の炭素源として
は、グルコース、クリセロール、フラクトース、シュー
クロース、マルトース、マンノース、１ｌ１５）、７Ａ
粉粉氷水解物、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアルコ
ル、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有
機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水
素、アルコール類なども用いｉ′）る。

窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモ−’−
ウＬ　、硫ａアンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類
あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン
、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチ
ーブ・リカー、カゼイン加水分解物、フィツシュミール
あるいはその消化物、脱脂穴豆粕あるいはその消化物、
輔加水分解物などの窒素含有有機物など種々の物が使用
可能である。無機物としては、リン酸第−水素カリウム
、リン酸第二水累カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化す）　ＩＪウド、
硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが
使用できる。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐ　ｔ（は中性付近に維持することが
望ましい。培養期間は通常１〜５日間である。

このようにして得られた培養物、あるいはｊΔ養物から
遠心分離などにより採取された生菌体、その乾煙菌体、
もくしは生菌体を磨砕、自己消化、音波処理などを行う
ことにより得られる菌体処理物またはこれらの菌体の抽
出物より得られる酵素含有物または菌体もしくは酵素含
有物を固定化した菌体処理物をＳＨＭＴの酵素源として
用いることができる。グリシンとアルデヒドとを反応さ
せてβ−ヒドロキシアミノ酸を生成させる反応は、一般
に微生物の菌体またはその処理物とグリシンおよびアル
デヒドを含有する液とを混合することにより行われる。

本発明に使用できるアルデヒドとしては、ホルムアルデ
ヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒドなどがあげ
られる。反応液中のアルデヒドの濃度は、０．１〜１０
０　ｍＭの範囲であるが、通常２０ｍＭ以下の濃度で使
用することが望ましい。

グリシンの基質濃度にはとくに制限はないが、般にはＯ
，１〜３０重量％の範囲で使用する。さらに、反応に際
しては、基質の他に補酵素であるピリドキサールリン酸
を微量添加することが望ましい。またアルデヒドとして
ホルムアルデヒドを用いる場合は、補酵素としてテトラ
ヒドロ葉酸を反応系に添加することにより反応が高めら
れる。反応液中に加える３１１ＭＴ１７）量は、前記し
たような酵素の処理方法によって異なるがとくに制限は
なく、基質の濃度、酵素の活性、その他の条件によって
適宜変更し得る。菌体を酵素源として用いる場合、界面
活性剤または有機溶剤の添加により、より良好な収量が
得られる。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン　（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製
）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどのカ
チオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸な
どのγニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビ
タン・モノステアレート　（例えばノニオン５Ｔ２２１
、日本油脂社製）などの非イツン性界面活性剤など、グ
リシン止アルデヒドからβ−ヒドロキシアミノ酸を生成
する反応を促進するものであればいずれでも使用でき、
これらは通常１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくはＩ〜２０
ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

有機溶剤としてはトルエン、キシレン、アセトン、脂肪
族アルコール、ベンセン、酢酸エチルなどを用いること
ができ、０．１〜５０μＱ／ｍｌ、好ましくは１〜２０
μＱ／ｍｌの濃度で用いる。

この反応における反応温度は通常２０〜６０℃の範囲で
ある。反応のｐ　Ｉ（は通常６〜１０の範囲で、反応時
間は通常５〜７０時１？ｆｌ程度である。

反応液中に生成したβ−ヒドロキシアミノ酸の分離・精
製は、イオン交換樹脂、活性炭などによる吸着、脱着処
理などの公知の方法により行うことができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ （＋）　　大［開閉（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）由来のＳ　ＨＭ　Ｔ逍伝子を含むＤＮＡ断片とコリ
ネバクテリウム・グルタミクムの染色体ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーション コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体ＤＮＡ中に
大腸菌の３８ＭＴｉ１１伝子と相同性を示す特異的な配
列が存在するか否かを、大腸菌のＳＨＴＭＪ伝子を含む
ＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーション試
験により検討した。

特開昭５８−１２６７８９に示した方法に従い、コリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の染色
体Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。

大腸菌のＳＨＭＴ遺伝子を含むプラスミドｐｃｓ２７は
、それを保有する大腸菌に１２株亜株　Ｇ５２４５／ｐ
Ｇｓ２７　Ｃジーン（Ｇｅｎｅ）。

１４．６３（１９８４）］からアンらの方法〔ジャーナ
ル・ツブ・バタテリオロジイ（Ｊ、口ａｃｔｅｒｉｏｌ
、　）。

１４０　　、４００（１９７９）］に従い単離した。

コリネバクテリウム・グルタミクム八ＴＣＣ３１８３３
の染色体ＤＮＡ２μｇを含むｍ！Ｉ　ｆｌＮ酵素Ｂａｒ
ｎＪｆｌ用反応緩衝液［１０ｍＭ　　）リス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（以下トリスと略す）、７ｍ〜
ｌＭｇＣｌ２．１００ｍＭ　　ＮａＣ１、ρ１１７．５
：１２Ｏｕ＆に５単位のＢａｍ１ｌｌ（宝酒造社製、５
単位／μＱ）を添加し、３７℃で２時間消化反応させた
。該消化物をアガロースゲル電見泳動にかけた後、サザ
ンの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ、　！Ｊｏ１．Ｂｉｏｌ、）。

９８　、５０３（１９７５）’］に従ってニトロセルロ
ース・フィルターにＤＮＡを吸着させた。

プローブＤＮＡとしてはｐＧｓ２７より得られる１、２
キロベース（Ｋｂ）の５ｊｕｌＰｖｕＩＩ断片を用いた
。制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動による
解析によって得られたこの断片の制限酵素地図と、既に
明らかなっている大腸菌のＳＨＭＴのＤＮＡ塩基配列〔
ヌクレイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ八
ｃｉｄｓ　へｅｓ、）、　　ＩＩ　、２０６５（１９８
３）　］との比較により、Ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片は１２５
１ｂｐの大腸菌由来のＳＨＭＴ構造遺伝子のうち３′側
約１１００ｂρと３′側周辺配列約１００ｂｐから構成
されていることが示された。該ＤＮＡ断片は、ｐ　Ｇ　
Ｓ　２７ブラスミドＤＮＡ１Ｏ■を含む５ｔｕｌおよび
Ｐｖｕ［Ｉ用反応緩衝液（ＢａｍＨＩ用反応緩衝液と同
じ）５０μＱに、２０単位の５ｔｕＩ　　（宝酒造社製
、１２単位／μＱ）および２Ｃ１位のＰｖｕ［Ｉ（宝酒
造社製、ｌＯ単位／μρ）を添加し、３７℃で２時間消
化反応させた反応物からマニアナイスらにより記述され
た方法〔モレキュラー・クローニング（コールドスプリ
ングハーバ−研究所編集）　、１６４〜１６９（１９８
２）　］に従って回収した後、ニックトランスレーショ
ンキット　（宝酒造社製）を用いて、〔α−３２Ｐ〕デ
オキシシトシン−３−リン酸によるニックトランスレー
ションヲ行った。

３２ｐでラベルされた該ＤＮＡ断片をプローブとして、
フィルターに吸着されたコリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションを、マニアナイスらにより記述された方法
〔モレキュラー・クローニング（コールドスプリングハ
ーバ−研究所編集）　、３８７−３８９（１９ｇ２）　
’］に従って行った。

ただしハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄に
は、０．１　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ−０，５％ＳＤＳ溶液［：
１５ｍＭ　　ＮａＣｊ！、１．５ｍＭクエン酸、５ｍｇ
／＋ｎｌドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐ　Ｈ７
，０：］ではなく０．８ＸＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液
Ｃｌ２０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、１２ｍＭクエン酸、１ｍ
ｇ／ｍ１ｓＤｓ、ｐＨ７，０］を用い、６５℃で４０分
間加温した。その結果、約４Ｋｂの位置にただ１つ、プ
ローブとハイブリダイズするバンドが見出され、コリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の染色
体ＤＮＡ上に大腸菌のＳＨＭＴ遺伝子のＤＮＡ配列と高
い相同性を有するＤＮＡ配列が存在することが示された
。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３１８３３のシーンバンクの作成 コリネバクテリウム、属およびブレビバクテリウム属の
ベクタープラスミドで、カナフィシン、テトラサイタリ
ン、アンピシリンおよびクロラムフェニコールの耐性遺
伝子を有するｐＣＥ５３〔モレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジエネティクス（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｊ、　）、　１９６　　、１７５（１９８４）　〕よ
、それを保有するコリネバクテリウム・グルタミクムの
培養菌体から特開昭５７−Ｄ４５００に示した方法によ
り濃縮単離した。またコリネバクゾリウム・グルタミク
ム八ＴＣＣ３１８３３の染色体Ｄ　Ｎ　Ａは（１）に示
した方法と同様にして調製した。

これらを材料にしてコリネバクテリウム・グルタミクム
＾ＴＣＣ３１８３３のシーンバンクを以下のようにして
作成した。

コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３１８３３
の染色体ＤＮＡ２０μｇを含む制限酵素ＢａｍＨＩ用反
応緩衝液２００μｆｆに、５０単位のＢａｍＨｒを添加
し、３７℃で２時間反応させた。該消化物をアガロース
ゲル電気泳動にかけた後、約４Ｋｂに相当する部分のゲ
ルを切りだし、マニアナイスらにより記述された方法〔
モレキュラー・クローニング（コールトスプリンク／’
ｖ　−ｔ＜　一研究Ｔｆ編集）　、１６４−１６９（１
９Ｂ２）　〕に従ってＤＮＡを回収した。一方、ｐＣＥ
５３プラスミドＤＮＡ２犀を含む制限酵素ＢａｍＨｊ用
反応緩衝液５０ｔｄｔに５１１℃位のＢａｍＨＩを添加
し、３７℃で２時間反応させた後、０．５単位の大腸菌
アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製、０．５］単位
／頭）を添加し、６５℃で１時間反応させた。

該反応物に５０頭のフェノールを加えよく攪拌した後、
水層部分を採取した。この操作をさらに２回繰り返した
後、エタノール１００−を加え、−８０℃で２０分間放
置し、遠心分離して（）られる沈殿分画を回収した。

以上のようにして回収したコリネバクテリウム・グルタ
ミクム＾ＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡの約４Ｋｂの
ＢａｍＨｆ切断断片の両分、およびｐＣＥ５３のＢａｍ
Ｈ［切断断片のアルカリフォスファターセ処理物を含む
Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液＜６６ｍＭ）リス、６．６ｍＭ　
　Ｍｇｃｌｚ、１０ｍ１ｖｌジチオスレイトール、ｐ　
Ｈ７，６）１００μ＆に１００ｍＭ　　ＡＴＰ２μ９Ｓ
Ｔ４リガーセ（宝酒造社製、３５０単位／μ＆）３５０
単位を加え、１６℃で２４時間反応させた。得られたり
ガーゼ反応混合物をコリネバクテリウド・グルタミクム
＾ＴＣＣ３１８３３の形質転換に供した。

形質転換はプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−
１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９）により
実施した。形質転換株の選択は、カナマイシン４００μ
ｇ／ｍｌを含むＲＣＧ　Ｐ寒天培地〔グルコース５ｇ、
カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ、　　　Ｋ　　ト１２ＰＯ４１，
５ｇ。

ＭｇＣｊ’ａ・６Ｈ２００，４１ｇ５ＦｅＳＯ４・７　
Ｈ２Ｏ１０ｍｇ％Ｍｎ　５０４・４〜６Ｈ２０２ｍｇ１
Ｚｎ　ＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，９０１ｇ、　（ＮＨ４）
ｓＭｏｔ○オ・４　Ｆ（ｚＯ０，０４ｍｇ、ビオチン３
０■、サイアミン塩酸塩２ｍｇ５コハク酸二ナトリウム
１３５ｇ１ポリビニルピロリドン（分子ｆｆｉ　１０．
０００）３０ｇ、および寒天１　ｆｉ　ｇを純水１βに
含み、ｐＨ７，４に調整した培地〕を用いた。

出現したカナマイシン耐性形質転換株のうち、テトラサ
イタリンに対する耐性を獲得していない株を選択した。

以上のようにして、コリネバクテリウド・グルタミクｌ
、　ＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡの約４ＫｂのＢ
ａｍＨ１切断断片がｐＣＥ５３のＢａｍＨ１切断部位に
挿入された組換え体プラスミドを保有する株を９４０株
取得した。

（３）　コリネバクテリウム・グルタミク１１八ＴＣＣ
３１８３３のシーンバンクより大腸菌のＳＩＩＭＴ遺伝
子とハイブリダイズするプラスミドの選択 （２）で取得したバーンバンク９４０株から、特開昭５
７−１３４５００に示された方法によりプラスミドを単
離した。これらのプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切
断後、（１）と同様の方法により大腸菌のＳＨＭＴ遺伝
子を含む１．２　Ｋ　ｂのＳ　ｔ　１１１−ＰｖｕＩＩ
断片をプローブとするノ１イブリダイゼーションを行っ
た。その結果、プローブとハイブリダイズする約４Ｋｂ
のＢａｍＨ［切断断片を含む組換え体プラスミドがシー
ンバンク中に存在することが明らかになった。このうち
の１つをｐｃｇ　ｌ　ｙ八−１と命名した。

（４）　ｐＣｇ　ｌ　ｙΔ−１保存菌体のＳ　ＨＭ　′
Ｆ活性の測定 （３）で取得したｐｃｇｌｙＡ−１が、ＳＨＭＴの合成
に関与する遺伝子を含むプラスミドであることを確かめ
るために、ｐｃｇｌｙＡ−１保存菌体のＳ　ＨＭ　′Ｆ
活性を測定した。

ＳＨＭＴ活性の測定は、基質としてβ−７エニルセリン
を用いるウレビンチの方法〔バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　　１６　　、５３４２（１
９７７）　］に従って行った。ただし酵素源としては粗
抽出液ではなく、菌体を用いた。またその際基質などの
透過性を向上させるため、界面活性剤としてセチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）を１ｍｇ／
ｍ１ｍ加した。その結果第１表に示されるように、ｐｃ
ｇ　ｌ　ｙΔ−１を保有させることにより得られた形質
転換株のＳ　ＨＭ　Ｔ活性が約１４倍に増加しているこ
とが明らかとなり、該プラスミドがＳＨＭＴの合成に関
与する】伝子を含むものであることが確かめられた。

なおｐＣｇ　ｌ　ｙΔ−１を（呆イ１′１−るコリネ）
１クテリウム・グルタミクム八ＴＣ［：　３１８３３は
、コリネバクテリウム・グルタミクムＫ　７５　　（Ｆ
ＥＲＭ　ＵＰｌ　８７　ｌＩ　）として昭和６３年５月
１１日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）
に寄託されている。

第　　　１　　　表 八ＴＣＣ３１８３３ （５）　　ｐｃｇｌｙＡ−１保存菌株を用いたβ−ヒド
ロキシアミノ酸の生産 ２００ｍ１の３５Ｍ培地〔グルコース１０ｇ。

ＮＨ＋Ｃｆ　　４ｇ１尿素２ｇ、酵母エキスＩｇ、Ｋ２
ＨＰＯ４ＩｇＳ　Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、ＭｇＣβ２・６ｔ
［−００，４ｇ％　Ｆ　ｅｓｏ、・　７ｌ−１ａＯ１０
ｍｇ５Ｍｎ５○＋・４〜６Ｉ−Ｔ２Ｏ０，２ｍｇ、Ｚｎ
ＳＯ４・　７Ｈ２００，９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏｎ・　５Ｈｚ
００．４ｍｇ、Ｎａ２Ｂ＋Ｏｔ’　１０Ｈ２００，０９
ｍｇ。

（Ｎ）１４）６ＭＯ７０２４・４８２０　０．０４＋ｎ
ｇ１ビオチン３０μｇ１サイアミン塩酸塩１ｍｇを純水
１１に含みｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕を１β容振盪
フラスコに分注し、滅菌後、予め種培地〔ブイヨン２０
ｇ、酵母エキス５ｇ１グルコース５ｇを純水１！に含み
ｐ　Ｈ７，２に調整した培地３５ｍｌ中で３０℃、２４
時間生育させたコリネバクテリウム・グルタミクム＾Ｔ
ＣＣ３１８３３およびコリネバクテリウム・グルタミク
ム＾ＴＣＣ３１８３３／ｐｃｇｌｙＡ−１（Ｋ２Ｓ）を
各２ｍｌ接種し、３０℃で１５時間振盪培養した。Ｋ２
Ｓの培養においては、培地にカナマイシンを２０μｇ／
ｍｌ添加した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を集め、生理食塩水で洗浄後、再度遠心分離して湿菌体
を？１′Ｆだ。

以上のようにして調製した菌体を酵素源とし、グリシン
とアルデヒドを基質として用いて、βヒドロキシアミノ
酸の生成反応を行った。

ａ、グリシン５００μｍｏｌｅ、ホルムアルデヒド２０
　μｍｏｌｅ、ピリドキサールリン酸１　μｍｏｌｅ。

テトラヒドロキシ葉酸１ｍｇ％　β−メルカプトエタノ
ール１００μｍｏ　ｌ　ｅ、キシレン１０ｍｇを含む１
００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）１ｍｌず
つに、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１
ｇ３３／ρｃｇ＋ｙ＾−１（Ｋ２Ｓ）の菌体およびコリ
ネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３１８３３の［
４体をそれぞれ湿菌体にして０．１　ｇずつ加え、３７
℃で２０分間反応させた。反応液中に生成したセリンの
定量は高速液体クロマトグラフィーで行った。生成した
セリン債を第２表に示す。

ＡＴＣＣ３１８３３ 第２表 ラム上のニンヒドリン発色スポットを切り取り、そのス
ポット抽出液を発色定量することにより行った。生成し
たアロスレオニン量を第３表に示す。

第　　　３　　　表 す、グリシン５００μｍｏｌｅ、アセトアルデヒド２０
μｍｏｌｅ、ピリドキサールリンＭｌ□□。１ｅ、β−
メルカプトエタノール１００μｍｏ　ｌ　ｅ、キシレン
１［１ｍｇを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８，０ｌ１ｍｌずつに、コリネバクテリウム・グル９
　ミクムＡＴＣＣ３１８３３／ｐｃｇｌｙＡ−１（Ｋ２
Ｓ）の菌体およびコリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ３１８３３の菌体をそれぞれ湿菌体にして０、１
　ｇ　ｆツ加、ｔ、３７℃で１６時間反応させた。

反応液中に生成したアロスレオニンの定量は、山田らの
方法〔ジャーナル・オブ・ファーメンティジョン・テク
ノロジー（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　
）。

す、　５０７　（１９８５）　）に従い、ペーパークロ
マドグ＾ＴＣＣ３１８３３ に７５ ５．２ Ｃ，アセトアルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを用
いた以外は、ｂと同じ条件で反応を行った。反応液中に
生成したβ−フェニルセリンの定量は高速液体クロマト
グラフィーにて行った。生成したβ−フェニルセリン量
を第４表に示す。

第 表 ＡＴＣＣ３１８３３ に７５ ３．８ 以上のように、ｐｃｇｌｙＡ−１を保有させた形質転換
株を用いることにより、β−ヒドロキシアミノ酸の生産
性が著しく向上することが示された。

実施例２ 実施例１（５）と同様の方法で調製したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムに７５の湿菌体５ｇを、グリシン１
５　ｍｍｏｌｅ　、ピリドキサールリン酸５０　ｍｍｏ
ｌｅ　、テトラヒドロ葉酸１００ｍｇ、βメルカプトエ
タノール５＋ｎｍｏｌｅ、ノニオン１Ｓ２１２　２５０
ｍｇ、ナイミーンＳ−２１５５０ｍｇを含む５０ｍＭリ
ン酸カリウ１．緩衝液（ｐＨ８，０）５０ｍｌにｕＱし
、ホルｌ、アルデヒドをフィードしながら５０℃で反応
させた。ホルムアルデヒドのフィード速度は反応Ｏ〜４
時間目までは毎時１．５　ｍｍｏｌｅ　、　４〜７時間
目までは毎時り、　Ｏｍｍｏｌｅ　、　７〜１０時間口
までは毎時０．７５ｍｍｏｌｅ　、それ以降は毎時０．
５　ｍｍｏｌｅに設定した。

また反応中のｐＨはＫ］（にて８．０に、酸化還元電位
はβ−メルカプトエタノールにて一３５０ｍＶ以下にな
るようコントロールした。その結果、反応１０時間後に
ｌ　Ｑｍｍｏｌｅ　、２４時間後に１１．８　ｍｍｏｌ
ｅのセリンが生成した。同様の実験をコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の湿菌体を用いて
行ったところ、生成したセリンは２４時間後でｌ、　Ｑ
　ｍｍｏｌｅであった。

実施例３ コリ不バタテリウム属またはブレビバクテリウム属のベ
クタープラスミドｐｃＧ１１（特開昭５７−１８３７９
９）　ｔ、それを保有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの培養菌体から特開昭５７１３４５００に示した
方法により濃縮単離した。このようにして調製したｐｃ
ＧＩｆ　　２μｇを含む制限酵素ＢｇｆＩＩ用反応緩衝
液（ＢａｍＨＩ用緩衝液と同じ）２０ρに制限酵素Ｂｇ
ｆＩＩ（宝酒造社製、ＩＯ単位／ρ）５単位を添加し、
３７℃で２時間消化反応させた後、６５℃で“１時間加
温した。一方、大腸菌のＳＨＭＴ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＧ５２７　２μｇを含む制限酵素ＢａｍＨ１用反応
緩衝液２０ｕＱに５単位のＢａｍＨｌを添加し、：３７
℃で２時間消化反応させた後、６５℃で１時間加温した
。両反応液を混合し、純水５０頭、１０倍濃度の７４’
Ｊガーゼ緩衝液１０ｄ、１００ｍＭ　　ＡＴＰ２ｍおよ
びＴ４１Ｊガーゼ３５０単位を加え、１６℃で２４時間
反応させた。得られたりガーゼ反応物をコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴｌ’Ｃ３１８３３の形質転換に
供した。形質転換株の選択にはスベクチノマイシン４０
０　ｇ／ｍＩを含むＲＣＧＰ寒天培地を用いた。出現し
たスペクチノマイシン耐性形質転換株のうちの１株につ
いて、特開昭５７−１３４５００に示された方法により
プラスミドを単離した。このプラスミドの構造を、各種
制限酵素による切断とアガロースゲル電気泳動により調
べたところ、ｐＣＧ　ｌ　ｌのＢｇｊ！ＩＩ切断箇所に
ｐｃｓ　２７由来の４．９　Ｋ　ｂのＢａｍＨＩ切断断
片が挿入された構造を育していることが判明した。この
プラスミドをｐＧＡ２と命名した。

ｐＧΔ２を保有するコリネバクテリウド・グルタミクム
＾ＴＣ［：３１８３３　（八ＴＣＣ３１８３３／ρＧ八
２）を実施例１の（５）と同様の方法で培養し、実施例
１の（５）ａと同様の操作により反応を行ったところ、
反応液中には３．０μｍｏｌｅのセリンが生成した。一
方、コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３１８
３３の菌体を用いた場合のセリン生成量は１．２μｍｏ
ｌｅであった。

発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物、なかでも微生物のセリン
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼの合成に関与する
遺伝情報を担うＤＮ、へ断片とベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡを保有する咳属微生物の菌体またはその処理
物を利用することにより、効率良くグリンンと各種アル
デヒドより対応するβ−ヒドロキシアミノ酸を製造する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃｇｌｙＡ−１のＢａｍＨＩによる制限酵素
切断地図と作成工程を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で表示されて
いる。ｐｃｇ　ｌ　ｙＡ−１の黒い実線部分は、コリネ
バクテリウド・グルタミクム＾ＴＣＣ３１８３３の染色
体ＤＮＡ山来で、大腸菌５ＩＩＩＪＴ遺伝子と高い相同
性を示す配列を有するＤＮＡ断片を示す。 特許出願人　（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 手続補正書（自発） 昭和６３年ｌ／月２２日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属し、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
   活性を有する微生物の菌体またはその処理物の存在下、
   グリシンとアルデヒドとを反応させて反応液中にβ−ヒ
   ドロキシアミノ酸を生成させ、該反応液から生成したβ
   −ヒドロキシアミノ酸を採取することを特徴とするβ−
   ヒドロキシアミノ酸の製造法。
2. （２）該微生物が、セリンヒドロキシメチルトランスフ
   ェラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片と
   ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有する微生物で
   ある請求項１記載の方法。
3. （３）該ＤＮＡ断片が、エシェリヒア属、コリネバクテ
   リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物由
   来のＤＮＡ断片である請求項２記載の方法。
4. （４）エシェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブ
   レビバクテリウム属に属する微生物のセリンヒドロキシ
   メチルトランスフェラーゼの合成に関与する遺伝情報を
   担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとが結合した組換え体
   ＤＮＡ。
5. （５）エシェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブ
   レビバクテリウム属に属する微生物のセリンヒドロキシ
   メチルトランスフェラーゼの合成に関与する遺伝情報を
   担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
   保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物。