JPH0751070A - ニトリラーゼ活性を有するポリペプチド - Google Patents
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドInfo
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- JPH0751070A JPH0751070A JP5197461A JP19746193A JPH0751070A JP H0751070 A JPH0751070 A JP H0751070A JP 5197461 A JP5197461 A JP 5197461A JP 19746193 A JP19746193 A JP 19746193A JP H0751070 A JPH0751070 A JP H0751070A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は新規ニトリラーゼポリペプチドの提
供を目的とする。 【構成】 本発明は、ニトリラーゼ活性を有する新規ポ
リペプチド及びそれを製造するための遺伝子的手段、即
ち、 −ニトリラーゼ活性を有し、従ってニトリル類をカルボ
ン酸類に加水分解することのできるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列、 −遺伝子コードの同義性に由来するこの配列の類似体、 −これらの配列のいづれか又はそのフラグメントとハイ
ブリダイズし、且つ、ニトリラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、並びに −それらの獲得を可能とする発現カセット及び微生物、
に関する。
供を目的とする。 【構成】 本発明は、ニトリラーゼ活性を有する新規ポ
リペプチド及びそれを製造するための遺伝子的手段、即
ち、 −ニトリラーゼ活性を有し、従ってニトリル類をカルボ
ン酸類に加水分解することのできるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列、 −遺伝子コードの同義性に由来するこの配列の類似体、 −これらの配列のいづれか又はそのフラグメントとハイ
ブリダイズし、且つ、ニトリラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、並びに −それらの獲得を可能とする発現カセット及び微生物、
に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はニトリラーゼ活性を有す
る新規ポリペプチド、それらを製造するための遺伝子操
作手段、一般にはＤＮＡカセット、その組換ＤＮＡ配列
を有する発現カセット、及び前記ＤＮＡ配列を含む組換
微生物（宿主微生物）に関する。
る新規ポリペプチド、それらを製造するための遺伝子操
作手段、一般にはＤＮＡカセット、その組換ＤＮＡ配列
を有する発現カセット、及び前記ＤＮＡ配列を含む組換
微生物（宿主微生物）に関する。
【０００２】本発明は更に、本発明にかかわるポリペプ
チド又は本発明にかかわるＤＮＡ配列を含む宿主微生物
によりニトリル類をカルボン酸類に変換せしめる酵素的
方法に関する。本発明の方法のある特定の用途は、本発
明にかかわるポリペプチド又は宿主微生物の補助を伴う
アジポニトリルの加水分解によるアジピン酸アンモニウ
ム又はアンモニウム−５−シアノバレレート（５−シア
ノ吉草酸アンモニウム）の酵素的合成である。
チド又は本発明にかかわるＤＮＡ配列を含む宿主微生物
によりニトリル類をカルボン酸類に変換せしめる酵素的
方法に関する。本発明の方法のある特定の用途は、本発
明にかかわるポリペプチド又は宿主微生物の補助を伴う
アジポニトリルの加水分解によるアジピン酸アンモニウ
ム又はアンモニウム−５−シアノバレレート（５−シア
ノ吉草酸アンモニウム）の酵素的合成である。
【０００３】アジピン酸アンモニウムは極めて有用な生
成物であることが知られており、なぜならこれはアジピ
ン酸、即ちそれ自体がナイロン６，６の製造のために広
く利用されている生成物へと変換されうるからである。
成物であることが知られており、なぜならこれはアジピ
ン酸、即ちそれ自体がナイロン６，６の製造のために広
く利用されている生成物へと変換されうるからである。
【０００４】ジニトリル類の酵素的加水分解は数多くの
著者によって述べられている。しかしながら、これらの
ジニトリル類が有機酸へと加水分解される経路はあまり
言及されていない。理論的な加水分解系は以下の通りで
ある：
著者によって述べられている。しかしながら、これらの
ジニトリル類が有機酸へと加水分解される経路はあまり
言及されていない。理論的な加水分解系は以下の通りで
ある：
【化１】
【０００５】ＮＨ＝ニトリルヒドラターゼ Ｎｉ＝ニトリラーゼ Ａ＝アミダーゼ Ｒ＝（ＣＨ2 ）ｎ：ｎはアジポニトリルの場合は４の整
数に相当する。
数に相当する。
【０００６】実際、一定の経路が好ましいとされ、そし
て一定の生成物が生成されない又はそうでなければ加水
分解されないことがよく観察される。
て一定の生成物が生成されない又はそうでなければ加水
分解されないことがよく観察される。
【０００７】この加水分解を可能とする酵素活性の存在
が実証されてきた微生物の中で特に挙げられうるのは、
フサリウム（Fusarium) 属に属する株（これはスクシノ
ニトリル及びアジポニトリルを分解するが、その反応生
成物は示されていない）〔GoldlustらのBiotechnol.and
Appl.Biochem.,1989,11,581〕；シュードモナス属に属
する株（これはアジポニトリルを分解する）〔Yanaseら
のAgric.Biol.Chem.,1982,46,2925 〕；並びにロドコッ
カス属に属する株、特にアジポニトリルをアジピン酸に
加水分解させるロドカッコス ロドクラス (Rhodococc
us rhodochrous)ＮＣＩＢ １１ ２１６〔 Bengis-Ga
rberら、Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,32,II 〕及
び更にはそのニトリラーゼがアジポニトリル及びグルタ
ロニトリルを加水分解するロドコッカス ロドクラスＫ
２２〔Yamadaら、J.Bacteriol.,1990,172 (a),4807-481
5 〕であるが、しかしながら芳香性ニトリル類の加水分
解に比べて低い活性率が伴う。
が実証されてきた微生物の中で特に挙げられうるのは、
フサリウム（Fusarium) 属に属する株（これはスクシノ
ニトリル及びアジポニトリルを分解するが、その反応生
成物は示されていない）〔GoldlustらのBiotechnol.and
Appl.Biochem.,1989,11,581〕；シュードモナス属に属
する株（これはアジポニトリルを分解する）〔Yanaseら
のAgric.Biol.Chem.,1982,46,2925 〕；並びにロドコッ
カス属に属する株、特にアジポニトリルをアジピン酸に
加水分解させるロドカッコス ロドクラス (Rhodococc
us rhodochrous)ＮＣＩＢ １１ ２１６〔 Bengis-Ga
rberら、Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,32,II 〕及
び更にはそのニトリラーゼがアジポニトリル及びグルタ
ロニトリルを加水分解するロドコッカス ロドクラスＫ
２２〔Yamadaら、J.Bacteriol.,1990,172 (a),4807-481
5 〕であるが、しかしながら芳香性ニトリル類の加水分
解に比べて低い活性率が伴う。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、ジニトリル類
の酵素的加水分解はやや複雑であることが認められう
る。どのケースにおいても第１のＣＮ基はこの酵素によ
って加水分解されるが、いくつかのケースにおいては第
２の基は加水分解されないか、又はそうでなければ他の
ケースにおいては非常に遅い速度で加水分解される。
の酵素的加水分解はやや複雑であることが認められう
る。どのケースにおいても第１のＣＮ基はこの酵素によ
って加水分解されるが、いくつかのケースにおいては第
２の基は加水分解されないか、又はそうでなければ他の
ケースにおいては非常に遅い速度で加水分解される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ニトリル類をカルボン酸
類に、より詳しくはジニトリル類を全体的に、且つ、迅
速にカルボン酸類又はニカルボン酸類に加水分解するこ
とが、適切に選ばれた酵素をそのまま、又は好ましくは
それを作る組換微生物の形態においてのいづれかで用い
て可能であることがこの度発見された。
類に、より詳しくはジニトリル類を全体的に、且つ、迅
速にカルボン酸類又はニカルボン酸類に加水分解するこ
とが、適切に選ばれた酵素をそのまま、又は好ましくは
それを作る組換微生物の形態においてのいづれかで用い
て可能であることがこの度発見された。
【００１０】本発明は従ってコマモナス テストステロ
ニ (Comamonas testosteroni) の株より単離されたニ
トリラーゼ活性を有する新規のポリペプチドに関する。
より正確には、これらのポリペプチドは天然又は組換微
生物の培養物からの抽出及び精製により調製され、その
精製は、細胞培養物から酵素抽出物を調製し、この抽出
物を硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いでクロマトグラ
フィー及びゲル濾過を包括する種々の工程によりそれを
精製することより構成される一連の工程により行われ
る。当業者によく知られている技術を採用するこれらの
工程は下記の実施例に詳しく述べられている。
ニ (Comamonas testosteroni) の株より単離されたニ
トリラーゼ活性を有する新規のポリペプチドに関する。
より正確には、これらのポリペプチドは天然又は組換微
生物の培養物からの抽出及び精製により調製され、その
精製は、細胞培養物から酵素抽出物を調製し、この抽出
物を硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いでクロマトグラ
フィー及びゲル濾過を包括する種々の工程によりそれを
精製することより構成される一連の工程により行われ
る。当業者によく知られている技術を採用するこれらの
工程は下記の実施例に詳しく述べられている。
【００１１】本明細書において、「ニトリラーゼ活性」
はニトリルのカルボン酸アンモニウムへの直接変換能力
を意味し、関連のアミドはこの酵素にとっての基質では
ない。
はニトリルのカルボン酸アンモニウムへの直接変換能力
を意味し、関連のアミドはこの酵素にとっての基質では
ない。
【００１２】本発明は更にニトリラーゼ活性を有するポ
リペプチドについてコードするＤＮＡ配列（配列番号３
及び４）に関する。本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列は、 −図４と５（並びに配列番号３及び５）に示すような、
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列、 −遺伝子コードの同義性に由来するこの配列の類似体、 −又はそうでなければこれらの配列のうちのいづれか
と、もしくはそれらのフラグメントとハイブリダイズ
し、且つ、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列、より選ばれうる。
リペプチドについてコードするＤＮＡ配列（配列番号３
及び４）に関する。本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列は、 −図４と５（並びに配列番号３及び５）に示すような、
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列、 −遺伝子コードの同義性に由来するこの配列の類似体、 −又はそうでなければこれらの配列のうちのいづれか
と、もしくはそれらのフラグメントとハイブリダイズ
し、且つ、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列、より選ばれうる。
【００１３】かかるＤＮＡ配列は、精製したポリペプチ
ドより製造したヌクレオチドプローブの補助を伴って、
所望のポリペプチドについてコードするゲノムＤＮＡフ
ラグメントをクローンすることにより獲得できる。
ドより製造したヌクレオチドプローブの補助を伴って、
所望のポリペプチドについてコードするゲノムＤＮＡフ
ラグメントをクローンすることにより獲得できる。
【００１４】本発明は更に上記で定義した組換ＤＮＡ配
列を、その発現を確実にするシグナルと共に有する発現
カセットに関する。これらの発現カセットは宿主のゲノ
ムの中に組込まれるか、又は発現ベクター、例えば選別
手段を含むプラスミド上に位置しているかのいづれかで
よい。
列を、その発現を確実にするシグナルと共に有する発現
カセットに関する。これらの発現カセットは宿主のゲノ
ムの中に組込まれるか、又は発現ベクター、例えば選別
手段を含むプラスミド上に位置しているかのいづれかで
よい。
【００１５】特に、これらの発現カセットは、リボソー
ム結合部位及びプロモーター配列を含む転写及び翻訳開
始領域を含む。これらの領域は該ポリペプチドを当然に
生産する微生物と同類又は異種であってよい。
ム結合部位及びプロモーター配列を含む転写及び翻訳開
始領域を含む。これらの領域は該ポリペプチドを当然に
生産する微生物と同類又は異種であってよい。
【００１６】これらの領域の選択は利用した宿主に特に
依存する。特に、この宿主微生物が原核細胞のとき、異
種プロモーターは強力な細菌性プロモーター、例えば
Ｅ．コリのトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒ
ｐ、Ｅ．コリのラクトースオペロンプロモーターＰｌａ
ｃ、ファージラムダ右側プロモーターＰR 、ファージラ
ムダ左側プロモーターＰL 、シュードモナス及びコマモ
ナスの強力プロモーター並びにコリネバクテリアの強力
プロモーターより選ばれうる。
依存する。特に、この宿主微生物が原核細胞のとき、異
種プロモーターは強力な細菌性プロモーター、例えば
Ｅ．コリのトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒ
ｐ、Ｅ．コリのラクトースオペロンプロモーターＰｌａ
ｃ、ファージラムダ右側プロモーターＰR 、ファージラ
ムダ左側プロモーターＰL 、シュードモナス及びコマモ
ナスの強力プロモーター並びにコリネバクテリアの強力
プロモーターより選ばれうる。
【００１７】より詳しくは、ファージラムダ右側プロモ
ーターの場合、熱感受性型ＰR ＣＩｔｓが好ましいこと
がある。真核微生物、例えば酵母の場合、このプロモー
ターは解糖系酵母遺伝子、例えばホスホグリセラーゼキ
ナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ラクターゼ（ＬＡＣ
４）及びエノラーゼ（ＥＮＯ）に由来しうる。
ーターの場合、熱感受性型ＰR ＣＩｔｓが好ましいこと
がある。真核微生物、例えば酵母の場合、このプロモー
ターは解糖系酵母遺伝子、例えばホスホグリセラーゼキ
ナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ラクターゼ（ＬＡＣ
４）及びエノラーゼ（ＥＮＯ）に由来しうる。
【００１８】リボソーム結合部位を考慮する限り、ラム
ダＣII遺伝子に由来するもの、同様にコマモナスもしく
はシュードモナスの同類遺伝子に由来するもの又はコリ
ネバクテリアの遺伝子に由来するものが、その宿主微生
物が真核系であるときに優先的に使用される。
ダＣII遺伝子に由来するもの、同様にコマモナスもしく
はシュードモナスの同類遺伝子に由来するもの又はコリ
ネバクテリアの遺伝子に由来するものが、その宿主微生
物が真核系であるときに優先的に使用される。
【００１９】注目の宿主の翻訳及び機能性転写の終結を
可能とする領域はコード配列の３′末端に位置すること
ができる。この発現カセットは組換宿主の選別を可能と
する１又は複数のマーカーも含んで成る。好ましいマー
カーは優性マーカー、即ち、抗生物質、例えばアンピシ
リンもしくはストレプトマイシン又はその他の毒性生成
物に対する耐性を授けるものである。
可能とする領域はコード配列の３′末端に位置すること
ができる。この発現カセットは組換宿主の選別を可能と
する１又は複数のマーカーも含んで成る。好ましいマー
カーは優性マーカー、即ち、抗生物質、例えばアンピシ
リンもしくはストレプトマイシン又はその他の毒性生成
物に対する耐性を授けるものである。
【００２０】腸内細菌、例えばＥ．コリ、コマモナスも
しくはシュードモナス属に属する細菌、及びコリネバク
テリウム、ブレビバクテリウムもしくはロドコッカス属
に属するコリネバクテリアが、使用される宿主微生物の
中で特に挙げられる。
しくはシュードモナス属に属する細菌、及びコリネバク
テリウム、ブレビバクテリウムもしくはロドコッカス属
に属するコリネバクテリアが、使用される宿主微生物の
中で特に挙げられる。
【００２１】本発明は更に、本発明にかかわる組換ＤＮ
Ａ配列、例えば選別手段を含むプラスミドを含む微生物
に関する。
Ａ配列、例えば選別手段を含むプラスミドを含む微生物
に関する。
【００２２】プラスミド構造上に前記ＤＮＡ配列を含む
組換微生物はコレクション ナショナル デ カルチャ
ーズ デ マイクロ−オルガニズムス（Collection Nat
ionale de Cultures de Micro-organismes:C.N.C.M.)
(Institut Pasteur,25rue duDocteur Roux,Paris) にn
o. Ｉ−１２４２で１９９２年７月２１日に寄託してあ
る。この微生物はプラスミドｐＸＬ２１４８を含むＥ．
コリＴＧ１株である。この微生物は参照番号Ｇ４２０７
により本出願人により区別もされている。
組換微生物はコレクション ナショナル デ カルチャ
ーズ デ マイクロ−オルガニズムス（Collection Nat
ionale de Cultures de Micro-organismes:C.N.C.M.)
(Institut Pasteur,25rue duDocteur Roux,Paris) にn
o. Ｉ−１２４２で１９９２年７月２１日に寄託してあ
る。この微生物はプラスミドｐＸＬ２１４８を含むＥ．
コリＴＧ１株である。この微生物は参照番号Ｇ４２０７
により本出願人により区別もされている。
【００２３】本発明は更にニトリル類をカルボン酸塩類
に変換せしめることの可能な微生物、そしてより詳しく
は式ＮＣ−Ｒ−ＣＮの脂肪式ニトリル類（ここでＲは１
〜１０個の炭素原子を有する線状又は枝分れしたアルキ
レン基である）をカルボン酸塩類に変換せしめることの
可能な微生物に関連する。
に変換せしめることの可能な微生物、そしてより詳しく
は式ＮＣ−Ｒ−ＣＮの脂肪式ニトリル類（ここでＲは１
〜１０個の炭素原子を有する線状又は枝分れしたアルキ
レン基である）をカルボン酸塩類に変換せしめることの
可能な微生物に関連する。
【００２４】本発明にかかわる微生物によるその合成の
際にその一次及び二次構造が獲得される他に、問題のポ
リペプチドは最適ニトリラーゼ活性を保有するためにそ
の三次及び四次構造において安定化されることが重要で
ある。
際にその一次及び二次構造が獲得される他に、問題のポ
リペプチドは最適ニトリラーゼ活性を保有するためにそ
の三次及び四次構造において安定化されることが重要で
ある。
【００２５】本出願人は上記の安定化を促すための手段
を発見した功績を得た。
を発見した功績を得た。
【００２６】従って、本発明にかかわる任意の微生物
は： −この微生物が合成するポリペプチド、特に本明細書に
おいて言及しているニトリラーゼの折りたたみを補助す
るための少なくとも１種のタンパク質因子、 −及び／又はかかる因子をコードする遺伝子、を含み、
この因子は問題の微生物の基底レベルに相当する量より
も多量で存在している。
は： −この微生物が合成するポリペプチド、特に本明細書に
おいて言及しているニトリラーゼの折りたたみを補助す
るための少なくとも１種のタンパク質因子、 −及び／又はかかる因子をコードする遺伝子、を含み、
この因子は問題の微生物の基底レベルに相当する量より
も多量で存在している。
【００２７】本発明の用語において、基底レベルとは問
題対応の野生型微生物により達成されうる最大レベルを
意味すると理解される。
題対応の野生型微生物により達成されうる最大レベルを
意味すると理解される。
【００２８】好都合には、この因子はＥ．コリのＧｒｏ
Ｅシャペロン又は真核もしくは原核起源のその類似体で
ある。
Ｅシャペロン又は真核もしくは原核起源のその類似体で
ある。
【００２９】Ｅ．コリのＧｒｏＥシャペロンは通常野生
型株に存在している。
型株に存在している。
【００３０】この因子をコードする遺伝子は染色体又は
体外染色体要素（プラスミド、ファージ）によって保有
される。これらは好ましくは微生物におけるこの因子の
合成を促すため、任意の既知で適切な手段によって増幅
される。
体外染色体要素（プラスミド、ファージ）によって保有
される。これらは好ましくは微生物におけるこの因子の
合成を促すため、任意の既知で適切な手段によって増幅
される。
【００３１】この因子をコードする遺伝子はその宿主微
生物と同類又は異種の発現系の支配下にある。
生物と同類又は異種の発現系の支配下にある。
【００３２】本発明は更に本発明にかかわるポリペプチ
ド又はそれを生産する組換微生物の補助を伴ってニトリ
ル類をカルボン酸類に変換せしめる方法に関連する。こ
の方法は、変換すべきニトリルを前記で定義したポリペ
プチド又は組換微生物と接触させることより成る。この
方法は一般に室温で行われる。本発明の一つの特定の態
様において、このポリペプチド又は組換微生物を固相支
持体の上に又は中に固定化する。
ド又はそれを生産する組換微生物の補助を伴ってニトリ
ル類をカルボン酸類に変換せしめる方法に関連する。こ
の方法は、変換すべきニトリルを前記で定義したポリペ
プチド又は組換微生物と接触させることより成る。この
方法は一般に室温で行われる。本発明の一つの特定の態
様において、このポリペプチド又は組換微生物を固相支
持体の上に又は中に固定化する。
【００３３】本発明の方法はニトリル類のカルボン酸類
への変換、そしてより詳しくは式ＮＣ−Ｒ−ＣＮのジニ
トリル類（ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する線
状又は枝分れしたアルキレン基である）のカルボン酸類
への変換に適する。
への変換、そしてより詳しくは式ＮＣ−Ｒ−ＣＮのジニ
トリル類（ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有する線
状又は枝分れしたアルキレン基である）のカルボン酸類
への変換に適する。
【００３４】本発明の方法はアジポニトリルからアジピ
ン酸アンモニウムの酵素的合成に特に適する。
ン酸アンモニウムの酵素的合成に特に適する。
【００３５】下記の実施例は本発明の特徴及び利点を例
証し、本発明の範囲を限定することを意図していない。
証し、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００３６】本明細書で利用している略語は下記の意味
を有している： ＳＳＣ：ハイブリダイゼーションのため一般に利用され
る、クエン酸ナトリウムとＮａＣｌを含む緩衝液（２０
×ＳＳＣ＝３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリ
ウム、pH７） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム ＦＰＬＣ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアク
リルアミドゲル電気泳動 ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド
を有している： ＳＳＣ：ハイブリダイゼーションのため一般に利用され
る、クエン酸ナトリウムとＮａＣｌを含む緩衝液（２０
×ＳＳＣ＝３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリ
ウム、pH７） ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム ＦＰＬＣ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアク
リルアミドゲル電気泳動 ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド
【００３７】
実施例１：コマモナス テストステロニ種のニトリラー
ゼの精製 １−細胞の調製：コマモナス テストステロニ種の株を
振盪フラスコの中で２８℃で１５時間３０分、以下の組
成を有する培地Ａにおいて培養した。
ゼの精製 １−細胞の調製：コマモナス テストステロニ種の株を
振盪フラスコの中で２８℃で１５時間３０分、以下の組
成を有する培地Ａにおいて培養した。
【００３８】グルコース ５ｇ／ｌ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ／ｌ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５．２４ｇ／ｌ ＫＨＰＯ4 ２．７７ｇ／ｌ 酵母抽出物 ５ｇ／ｌ カスアミノ酸 １ｇ／ｌ
【００３９】この予備培養物を、１５ｌの培地Ａを含む
２０ｌの発酵槽に接種するために用いた。pH、温度、空
気の風速及び振盪速度はそれぞれ６．６、２８℃、３０
０ｌ／ｈ及び３５０rpm に設定した。２４時間後、８４
ｇの湿潤細胞を回収した。これは０．９ｇ／ｌの乾燥重
量の細胞含有量及び６６０nm（ＯＤ660nm ) にてこの吸
光度に相当する。
２０ｌの発酵槽に接種するために用いた。pH、温度、空
気の風速及び振盪速度はそれぞれ６．６、２８℃、３０
０ｌ／ｈ及び３５０rpm に設定した。２４時間後、８４
ｇの湿潤細胞を回収した。これは０．９ｇ／ｌの乾燥重
量の細胞含有量及び６６０nm（ＯＤ660nm ) にてこの吸
光度に相当する。
【００４０】２−アジポニトリルに対する酵素活性の決
定 乾燥重量１３．１mgの細胞を含む細胞残渣を、５０mMの
リン酸カリウム緩衝液、pH７中の５２．３mMのアジポニ
トリルの溶液２mlの中に懸濁した。反応を２５℃で、振
盪しながら実施し、そしてその反応速度をサンプリング
によって追尾した。高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により各サンプルについて５−シアノバレラミ
ド、アジパミド、５−シアノバレレート、アジパメート
及びアジペートを測定した。その結果を図１に示し、こ
れはシアノバレレート（曲線ａ）及びアジピン酸アンモ
ニウム（曲線ｂ）の収率（縦座標）の曲線を示してい
る。シアノバレレート及びアジペートのそれぞれの生成
速度は０．４５以上及び０．１５Ｕ／細胞の乾燥重量mg
（１Ｕは１分間当りに１μmol の生成物が生成される値
に相当する）であった。
定 乾燥重量１３．１mgの細胞を含む細胞残渣を、５０mMの
リン酸カリウム緩衝液、pH７中の５２．３mMのアジポニ
トリルの溶液２mlの中に懸濁した。反応を２５℃で、振
盪しながら実施し、そしてその反応速度をサンプリング
によって追尾した。高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により各サンプルについて５−シアノバレラミ
ド、アジパミド、５−シアノバレレート、アジパメート
及びアジペートを測定した。その結果を図１に示し、こ
れはシアノバレレート（曲線ａ）及びアジピン酸アンモ
ニウム（曲線ｂ）の収率（縦座標）の曲線を示してい
る。シアノバレレート及びアジペートのそれぞれの生成
速度は０．４５以上及び０．１５Ｕ／細胞の乾燥重量mg
（１Ｕは１分間当りに１μmol の生成物が生成される値
に相当する）であった。
【００４１】３−精製 全ての精製工程は何らかの記載がない限り、５０mMのト
リス／ＨＣｌ緩衝液、pH７．５、１mMのジチオエリトリ
トール（ＤＴＥ）において実施した。各工程において、
画分のニトリラーゼ活性は１０mMのアジポニトリルの存
在下において１０mMのリン酸緩衝液の中でpH７及び２５
℃にて決定した。プールのタンパク質濃度はクマジーブ
ルー法（ＰＩＥＲＣＥタンパク質アッセイキット）によ
り決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Phastsys
tem,PHARMACIA)により分析した。
リス／ＨＣｌ緩衝液、pH７．５、１mMのジチオエリトリ
トール（ＤＴＥ）において実施した。各工程において、
画分のニトリラーゼ活性は１０mMのアジポニトリルの存
在下において１０mMのリン酸緩衝液の中でpH７及び２５
℃にて決定した。プールのタンパク質濃度はクマジーブ
ルー法（ＰＩＥＲＣＥタンパク質アッセイキット）によ
り決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Phastsys
tem,PHARMACIA)により分析した。
【００４２】各工程の手順を以下に記載する。
【００４３】工程１：粗抽出 ５７ｇの湿潤細胞を８５mlの緩衝液の中に含ませ、そし
て超音波で３０分処理した（Bioblockに由来するＶＩＢ
ＲＡ−ＣＥＬＬソニケーター：プローブ１３mm；出力
７；４０％の周期作動）。ＯＤ660nm は９７から６０に
落ちた。最大４８，０００ｇで６０分間の遠心後、その
上清液を回収した。
て超音波で３０分処理した（Bioblockに由来するＶＩＢ
ＲＡ−ＣＥＬＬソニケーター：プローブ１３mm；出力
７；４０％の周期作動）。ＯＤ660nm は９７から６０に
落ちた。最大４８，０００ｇで６０分間の遠心後、その
上清液を回収した。
【００４４】この上清液を硫酸アンモニウムの徐々なる
添加によって１５％飽和にした。１時間後、この懸濁物
を最大３０，０００ｇで３０分間遠心した。この上清液
を５０％飽和にした。１時間後、この懸濁物を同様の条
件で遠心し、そしてその沈殿物を回収し、その後緩衝液
に対して２日間透析した。
添加によって１５％飽和にした。１時間後、この懸濁物
を最大３０，０００ｇで３０分間遠心した。この上清液
を５０％飽和にした。１時間後、この懸濁物を同様の条
件で遠心し、そしてその沈殿物を回収し、その後緩衝液
に対して２日間透析した。
【００４５】工程２：イオン交換カラム（Ｑセファロー
スファストフロー） 透析した画分を２５０ml／ｈの速度において緩衝液によ
り平衡にした「Ｑセファロース ファスト フロー」の
カラム（２６×３８０mm）に１２５ml／ｈの速度で添加
した。このカラムに、以下の溶液を順に２５０ml／ｈの
速度で浸透させた： −緩衝液１６６ml、 −緩衝液中の０〜０．２ＭのＫＣｌの勾配１８０ml −０．２ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１８０ml −緩衝液中の０．２〜０．４ＭのＫＣｌの勾配２７０ml −０．４ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１８０ml −１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液２００ml。
スファストフロー） 透析した画分を２５０ml／ｈの速度において緩衝液によ
り平衡にした「Ｑセファロース ファスト フロー」の
カラム（２６×３８０mm）に１２５ml／ｈの速度で添加
した。このカラムに、以下の溶液を順に２５０ml／ｈの
速度で浸透させた： −緩衝液１６６ml、 −緩衝液中の０〜０．２ＭのＫＣｌの勾配１８０ml −０．２ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１８０ml −緩衝液中の０．２〜０．４ＭのＫＣｌの勾配２７０ml −０．４ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１８０ml −１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液２００ml。
【００４６】ニトリラーゼ活性を有する画分は０．２Ｍ
のＫＣｌ段階の際に容量１２９mlにおいて溶離した。
のＫＣｌ段階の際に容量１２９mlにおいて溶離した。
【００４７】ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
で以下の工程を実施した。
で以下の工程を実施した。
【００４８】工程３：ゲル濾過（ＦＰＬＣスーパデック
ス２００） ニトリラーゼ活性を有する以上のようにして獲得した画
分（１２９ml）を、８０％飽和での硫酸アンモニウムに
よるタンパク質沈殿、それに続く緩衝液に対する透析に
より１２mlにまで濃縮した。このようにして濃縮した画
分（１２ml）を、０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液
で平衡にしたゲルのカラム（１６×６００mm）上に０．
８ml／min の速度で、２バッチに分けて添加した。ニト
リラーゼ活性を有する画分は１ml／min の速度で全容量
３６mlにおいて上記の緩衝液により溶離した。これらの
画分は２８０kDa の分子量に相当した。
ス２００） ニトリラーゼ活性を有する以上のようにして獲得した画
分（１２９ml）を、８０％飽和での硫酸アンモニウムに
よるタンパク質沈殿、それに続く緩衝液に対する透析に
より１２mlにまで濃縮した。このようにして濃縮した画
分（１２ml）を、０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液
で平衡にしたゲルのカラム（１６×６００mm）上に０．
８ml／min の速度で、２バッチに分けて添加した。ニト
リラーゼ活性を有する画分は１ml／min の速度で全容量
３６mlにおいて上記の緩衝液により溶離した。これらの
画分は２８０kDa の分子量に相当した。
【００４９】工程４：ヒドロキシアパタイトのカラム
（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＨＰＨＴ；７．８×１００mm） 以上のようにして獲得した画分を限界濾過（ＤＩＡＦＬ
Ｏ ＰＭ３９膜、ＡＭＩＣＯＮ）により８mlに濃縮し
た。この濃縮した溶液を、１０μＭのＣａＣｌ2の加え
られた緩衝液で平衡にした。このカラムに以下の溶液を
順に０．５ml／min.の速度で浸透させた： −平衡用緩衝液５ml −平衡用緩衝液中の０〜３５０mMのリン酸カリウムの勾
配１５ml −３５０mMのリン酸カリウムの加えられた平衡用緩衝液
１０ml。
（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＨＰＨＴ；７．８×１００mm） 以上のようにして獲得した画分を限界濾過（ＤＩＡＦＬ
Ｏ ＰＭ３９膜、ＡＭＩＣＯＮ）により８mlに濃縮し
た。この濃縮した溶液を、１０μＭのＣａＣｌ2の加え
られた緩衝液で平衡にした。このカラムに以下の溶液を
順に０．５ml／min.の速度で浸透させた： −平衡用緩衝液５ml −平衡用緩衝液中の０〜３５０mMのリン酸カリウムの勾
配１５ml −３５０mMのリン酸カリウムの加えられた平衡用緩衝液
１０ml。
【００５０】ニトリラーゼ活性を有する画分は３mlの容
量において、６２と１３５mMのリン酸カリウムとの間で
溶離した。
量において、６２と１３５mMのリン酸カリウムとの間で
溶離した。
【００５１】工程５：疎水性相互作用カラム（ＦＰＬＣ
−フェニルセファロースＨＲ ５／５） 上記のようにして獲得した活性画分を硫酸アンモニウム
で１５％飽和にし、１５％飽和にて硫酸アンモニウムを
含む緩衝液で平衡にしたカラム上に０．５ml／min.の速
度で添加した。
−フェニルセファロースＨＲ ５／５） 上記のようにして獲得した活性画分を硫酸アンモニウム
で１５％飽和にし、１５％飽和にて硫酸アンモニウムを
含む緩衝液で平衡にしたカラム上に０．５ml／min.の速
度で添加した。
【００５２】このカラムに以下の溶液を浸透させた： −平衡用緩衝液６ml −緩衝液中の１５％〜０％に低下する硫酸アンモニウム
勾配１２ml −２３mlの緩衝液。
勾配１２ml −２３mlの緩衝液。
【００５３】ニトリラーゼ活性を有するいくつかの画分
は平衡用緩衝液でカラムを洗っている最中に溶離したも
のである。これらの活性画分は同じ条件のもとで再度注
入した。この操作を２回繰り返した。勾配をかけた後に
溶離した活性画分をプールした（容量５１ml）。
は平衡用緩衝液でカラムを洗っている最中に溶離したも
のである。これらの活性画分は同じ条件のもとで再度注
入した。この操作を２回繰り返した。勾配をかけた後に
溶離した活性画分をプールした（容量５１ml）。
【００５４】工程６：ゲル濾過（ＦＰＬＣ−スーパーデ
ックス２００） この５１mlを膜上での限外濾過（ＤＩＡＦＬＯ ＰＭ３
０、ＡＭＩＣＯＮ）により３mlに濃縮した。この３ml
を、０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液で平衡にした
カラム（１６×６００mm）に添加した。活性を含む９ml
が２８０kDa に相当する分子量の箇所で溶離した。この
溶液をグリセロールで３６％にし、その後１５日間凍結
保存した。
ックス２００） この５１mlを膜上での限外濾過（ＤＩＡＦＬＯ ＰＭ３
０、ＡＭＩＣＯＮ）により３mlに濃縮した。この３ml
を、０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液で平衡にした
カラム（１６×６００mm）に添加した。活性を含む９ml
が２８０kDa に相当する分子量の箇所で溶離した。この
溶液をグリセロールで３６％にし、その後１５日間凍結
保存した。
【００５５】工程７：イオン交換カラム（ＦＰＬＣモノ
Ｑ ＨＲ ５／５） このタンパク質溶液を融解し、そして０．１ＭのＫＣｌ
を含む緩衝液で平衡にしたカラムに０．５ml／min.の速
度で添加した。このカラムに以下の溶液を順に浸透させ
た： −０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１５ml（０．５
ml／min.にて) −０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液４．５ml（１ml
／min.にて) −緩衝液中での０．１〜０．４ＭのＫＣｌの勾配１５ml
（１ml／min.にて） −０．４ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１０ml。
Ｑ ＨＲ ５／５） このタンパク質溶液を融解し、そして０．１ＭのＫＣｌ
を含む緩衝液で平衡にしたカラムに０．５ml／min.の速
度で添加した。このカラムに以下の溶液を順に浸透させ
た： −０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１５ml（０．５
ml／min.にて) −０．１ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液４．５ml（１ml
／min.にて) −緩衝液中での０．１〜０．４ＭのＫＣｌの勾配１５ml
（１ml／min.にて） −０．４ＭのＫＣｌの加えられた緩衝液１０ml。
【００５６】活性画分は０．１５と０．３ＭのＫＣｌと
の間で溶離した。これらの画分は均質であった。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥは３８及び３９kDa に非常に近い２本のバン
ドを示した。これにより得られた画分を以降「精製ニト
リラーゼ」と呼ぶ。
の間で溶離した。これらの画分は均質であった。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥは３８及び３９kDa に非常に近い２本のバン
ドを示した。これにより得られた画分を以降「精製ニト
リラーゼ」と呼ぶ。
【００５７】上記の精製工程それぞれに由来するデータ
を下記の第１表にまとめる。
を下記の第１表にまとめる。
【００５８】
【表１】
【００５９】略語：ＰＦ＝精製計数； Ｕ＝１μmol ／ｈ
【００６０】４−ニトリラーゼのＮ−末端配列の決定 精製タンパク質を獲得して、「アプライド バイオシス
テム モデル４７０Ａ」装置を利用してエドマン自動配
列分解によってその２７個のアミノ酸のＮ末端配列を決
定した。その配列を配列番号１に示す。
テム モデル４７０Ａ」装置を利用してエドマン自動配
列分解によってその２７個のアミノ酸のＮ末端配列を決
定した。その配列を配列番号１に示す。
【００６１】配列ライブラリーの探索は、ヨーロッパ特
許出願第３７３，１７３号の対象物をなす、ブロモキシ
ニルに対して活性なクレブシエラ ニューモニア（Kleb
siella pneumonia) のニトリラーゼとの５３％の相同性
の発見を可能にした。
許出願第３７３，１７３号の対象物をなす、ブロモキシ
ニルに対して活性なクレブシエラ ニューモニア（Kleb
siella pneumonia) のニトリラーゼとの５３％の相同性
の発見を可能にした。
【００６２】５−精製ニトリラーゼの活性： ａ）−ニトリラーゼ活性に対するpHの影響：精製ニトリ
ラーゼを、下記の第２表に示す条件のもとで２種類の基
質、アジポニトリル及び５−シアノバレレートについて
種々のpH値で試験した。
ラーゼを、下記の第２表に示す条件のもとで２種類の基
質、アジポニトリル及び５−シアノバレレートについて
種々のpH値で試験した。
【００６３】
【表２】
【００６４】共通条件：〔基質〕＝１０mM；緩衝液＝１
０mM；Ｔ＝２５℃； 〔ニトリラーゼ〕＝シアノバレレートについては１２μ
ｇ／ml アジポニトリルについては３μｇ／ml（画分、工程
６）； Ｕ（アジポニトリル）＝生成シアノバレレートのμmol
／ｈ Ｕ（シアノバレレート）＝生成アジペートのμmol ／ｈ
０mM；Ｔ＝２５℃； 〔ニトリラーゼ〕＝シアノバレレートについては１２μ
ｇ／ml アジポニトリルについては３μｇ／ml（画分、工程
６）； Ｕ（アジポニトリル）＝生成シアノバレレートのμmol
／ｈ Ｕ（シアノバレレート）＝生成アジペートのμmol ／ｈ
【００６５】ｂ）−精製ニトリラーゼの活性範囲：精製
ニトリラーゼの活性をアジポニトリル、５−シアノバレ
ラミド、５−シアノバレリン酸、ベンゾニトリル、プロ
ピオニトリル及びアクリロニトリルについて測定した。
その結果を第３表に示す。
ニトリラーゼの活性をアジポニトリル、５−シアノバレ
ラミド、５−シアノバレリン酸、ベンゾニトリル、プロ
ピオニトリル及びアクリロニトリルについて測定した。
その結果を第３表に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】共通条件：酢酸緩衝液１０mM、pH４；基質
１０mM；容量＝３ml；Ｔ＝２５℃；反応時間１又は３
ｈ；タンパク質：５〜３０μｇ／ml
１０mM；容量＝３ml；Ｔ＝２５℃；反応時間１又は３
ｈ；タンパク質：５〜３０μｇ／ml
【００６８】実施例２：コマモナス テストステロニ種
のニトリラーゼのクローニング 配列番号１において示すＮＨ2 末端配列よりヌクレオチ
ドプローブを合成した；文献に記載のコマモナスの株に
おける高い比率のＧＣ(Tamaokaら、Int.J.Syst.Bacteri
ol.,1987, 37,52-59) はリジンの場合及びバリンの場合
におけるコドンの第３位置についての選択を指示する。
このプローブは１２８の同義性の２６量体であり、配列
番号２にそれを示している。
のニトリラーゼのクローニング 配列番号１において示すＮＨ2 末端配列よりヌクレオチ
ドプローブを合成した；文献に記載のコマモナスの株に
おける高い比率のＧＣ(Tamaokaら、Int.J.Syst.Bacteri
ol.,1987, 37,52-59) はリジンの場合及びバリンの場合
におけるコドンの第３位置についての選択を指示する。
このプローブは１２８の同義性の２６量体であり、配列
番号２にそれを示している。
【００６９】以下の手法は、まずこのヌクレオチドプロ
ーブの特異性を評価し、次いでクローンすべきゲノムＤ
ＮＡフラグメントの種類を決定することより成る。簡潔
すると、コマモナス テストステロニ種のゲノムＤＮＡ
を、クローニングのために有用な部位に対応するいくつ
かの制限酵素（ＳｓｔＩ，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩ，Ｐｓ
ｔＩ他）により消化した。
ーブの特異性を評価し、次いでクローンすべきゲノムＤ
ＮＡフラグメントの種類を決定することより成る。簡潔
すると、コマモナス テストステロニ種のゲノムＤＮＡ
を、クローニングのために有用な部位に対応するいくつ
かの制限酵素（ＳｓｔＩ，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨＩ，Ｐｓ
ｔＩ他）により消化した。
【００７０】アガロースゲルでの電気泳動及びナイロン
膜への転写後、種々の消化物をこのプローブとハイブリ
ダイズさせた。このプローブは利用したハイブリダイゼ
ーション条件のもとで十分なる特異性を有していた（ハ
イブリダイゼーション緩衝液＝５×ＳＳＣ、５×デンハ
ーツ、０．１％のＳＤＳ、５０mMのＮａ3 ＰＯ4 、pH
６．５、２５０μｇ／mlのｓｓＤＮＡ；ハイブリダイゼ
ーション温度５０℃；洗浄条件：１ｈで６×ＳＳＣ、室
温、及び５分間で、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５
０℃）。
膜への転写後、種々の消化物をこのプローブとハイブリ
ダイズさせた。このプローブは利用したハイブリダイゼ
ーション条件のもとで十分なる特異性を有していた（ハ
イブリダイゼーション緩衝液＝５×ＳＳＣ、５×デンハ
ーツ、０．１％のＳＤＳ、５０mMのＮａ3 ＰＯ4 、pH
６．５、２５０μｇ／mlのｓｓＤＮＡ；ハイブリダイゼ
ーション温度５０℃；洗浄条件：１ｈで６×ＳＳＣ、室
温、及び５分間で、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、５
０℃）。
【００７１】これらの条件のもとで、これらのプローブ
は特にＳｓｔＩ，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨ及びＰｓｔＩによ
る消化の場合において、あいまいさを伴うことなく重要
なシグナルを獲得することを可能にした。このハイブリ
ダイゼーションブロットは特に約４kbの単一のＳｓｔＩ
−ＳｓｔＩフラグメントの存在を示した。このフラグメ
ントをクローンするため、ゲノムＤＮＡのＳｓｔＩ消化
物に由来する３．５〜４．５kbのフラグメントをアガロ
ース上での調製用電気泳動及び電気溶離により精製し、
次いでそれ自体がＳｓｔＩによって消化されたプラスミ
ドｐＵＣ１９(YANISCHら、Gene, 33(1985)103)にリゲー
トした。株ＤＨ５α（Clontech Loboratory,Palo Alto,
California) の中への形質転換後、ＬＢａｍｐＸ−ｇａ
ｌ（SAMBROOKら、Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual 第２版、Cold Spring HarborPress,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,N.Y.,1989) 上の６００の白色クロー
ンをそれぞれ継代培養し、ナイロン膜に転写し、次いで
同じ緊張条件のもとでサザンブロットをハイブリダイズ
させるために用いたプローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより分析した。約４．１kbの同一のフラグメントが
両方向において挿入された２つのクローン（ｐＸＬ２０
７５〔図２の（ａ）〕及びｐＸＬ２０７６〔図２の
（ｂ）〕をより詳しく分析した（制限地図化、プライマ
ーとしてこのプローブを用いる部分シーケンシング及び
サザンブロット）。これによりこのプローブとハイブリ
ダイズする遺伝子の５′部分が、ＸｈｏＩからＸｂａＩ
に至る方向に向いて、約１５０bpのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ
フラグメントの上にあることを示すことができた。図２
の（ａ）及び（ｂ）はこれらのプラスミドの制限地図を
示す。
は特にＳｓｔＩ，ＳｐｈＩ，ＢａｍＨ及びＰｓｔＩによ
る消化の場合において、あいまいさを伴うことなく重要
なシグナルを獲得することを可能にした。このハイブリ
ダイゼーションブロットは特に約４kbの単一のＳｓｔＩ
−ＳｓｔＩフラグメントの存在を示した。このフラグメ
ントをクローンするため、ゲノムＤＮＡのＳｓｔＩ消化
物に由来する３．５〜４．５kbのフラグメントをアガロ
ース上での調製用電気泳動及び電気溶離により精製し、
次いでそれ自体がＳｓｔＩによって消化されたプラスミ
ドｐＵＣ１９(YANISCHら、Gene, 33(1985)103)にリゲー
トした。株ＤＨ５α（Clontech Loboratory,Palo Alto,
California) の中への形質転換後、ＬＢａｍｐＸ−ｇａ
ｌ（SAMBROOKら、Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual 第２版、Cold Spring HarborPress,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,N.Y.,1989) 上の６００の白色クロー
ンをそれぞれ継代培養し、ナイロン膜に転写し、次いで
同じ緊張条件のもとでサザンブロットをハイブリダイズ
させるために用いたプローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより分析した。約４．１kbの同一のフラグメントが
両方向において挿入された２つのクローン（ｐＸＬ２０
７５〔図２の（ａ）〕及びｐＸＬ２０７６〔図２の
（ｂ）〕をより詳しく分析した（制限地図化、プライマ
ーとしてこのプローブを用いる部分シーケンシング及び
サザンブロット）。これによりこのプローブとハイブリ
ダイズする遺伝子の５′部分が、ＸｈｏＩからＸｂａＩ
に至る方向に向いて、約１５０bpのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ
フラグメントの上にあることを示すことができた。図２
の（ａ）及び（ｂ）はこれらのプラスミドの制限地図を
示す。
【００７２】実施例３：ニトリラーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含む１１９４bpのフラグ
メントの配列 シーケンス化したニトリラーゼ遺伝子を含む１１９４bp
のフラグメントのクローンしたインサートの位置を図３
に示している。当業者に知られている常法によるこのフ
ラグメントのシーケンシングの手法も図３に示してい
る。種々の配列は全て連鎖停止法により獲得した（７−
デアザ−ｄＧＴＰに存在下におけるシーケナーゼキッ
ト；（35Ｓ）ｄＡＴＰはサブフラグメントを有する組換
Ｍ１３の一本鎖マトリックス（ｍｐ１８又は１９； YAN
ISCHら、前掲を参照のこと) 上に、又は直接プラスミド
ｐＸＬ２０７５上にある）。いくつかの特異的プライマ
ーもこの目的のために合成した。
ペプチドをコードするＤＮＡを含む１１９４bpのフラグ
メントの配列 シーケンス化したニトリラーゼ遺伝子を含む１１９４bp
のフラグメントのクローンしたインサートの位置を図３
に示している。当業者に知られている常法によるこのフ
ラグメントのシーケンシングの手法も図３に示してい
る。種々の配列は全て連鎖停止法により獲得した（７−
デアザ−ｄＧＴＰに存在下におけるシーケナーゼキッ
ト；（35Ｓ）ｄＡＴＰはサブフラグメントを有する組換
Ｍ１３の一本鎖マトリックス（ｍｐ１８又は１９； YAN
ISCHら、前掲を参照のこと) 上に、又は直接プラスミド
ｐＸＬ２０７５上にある）。いくつかの特異的プライマ
ーもこの目的のために合成した。
【００７３】本発明にかかわるＤＮＡ配列を図４と５に
示す。獲得した配列の平均Ｇ＋Ｃ含量は４５．７％であ
り、これはコマモナスのその他の株について述べられて
いる６１．５％のＧ＋Ｃ含量よりも低かった(Tamaoka
ら、前掲) 。獲得した配列の分析は３８，７２５Ｄａの
分子量に相当する３５４残基数のポリペプチドをコード
する１０６４bpの解放解読枠（以降ｎｉｔ遺伝子と呼
ぶ）の特性化を可能にした。このポリペプチドのアミノ
酸配列を図４と５に示している。このポリペプチドはプ
ローブを合成するために用いたＮＨ2 末端配列、同様に
精製ニトリラーゼのトリプシンフラグメント上に決定さ
れた３つの内在配列（図４と５においてこれらの内在配
列に下線を付した）を含んで成る。
示す。獲得した配列の平均Ｇ＋Ｃ含量は４５．７％であ
り、これはコマモナスのその他の株について述べられて
いる６１．５％のＧ＋Ｃ含量よりも低かった(Tamaoka
ら、前掲) 。獲得した配列の分析は３８，７２５Ｄａの
分子量に相当する３５４残基数のポリペプチドをコード
する１０６４bpの解放解読枠（以降ｎｉｔ遺伝子と呼
ぶ）の特性化を可能にした。このポリペプチドのアミノ
酸配列を図４と５に示している。このポリペプチドはプ
ローブを合成するために用いたＮＨ2 末端配列、同様に
精製ニトリラーゼのトリプシンフラグメント上に決定さ
れた３つの内在配列（図４と５においてこれらの内在配
列に下線を付した）を含んで成る。
【００７４】従ってこの解放解読枠が本発明にかかわる
ＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。
ＤＮＡ配列を示す（配列番号３）。
【００７５】実施例４：他のタンパク質との相同性、相
同配列の同定 本発明にかかわるＤＮＡ配列をＮＢＲＦタンパク質ライ
ブラリーにおける全ての配列と比較した；除草剤ブロモ
キシニルに特異的なクレブシエラ オガエナのニトリア
ーゼ(Stalkerら、J.Biol.Chem.,1988,263 ,6310-6314)
とのみ有意な相同性が見い出された。これら２つのニト
リラーゼは３２０個のアミノ酸にわたって３４．９％の
完全相同性を示した。更にこのタンパク質はインドール
−３−アセトニトリルに特異的なアラビドプシス（Arab
idopsis)のニトリラーゼ〔Bartlingら、Eur.J.Bioche
m.,205,417-424,1992 〕と３１２個のアミノ酸にわたっ
て３４．４％の完全相同性を示した。
同配列の同定 本発明にかかわるＤＮＡ配列をＮＢＲＦタンパク質ライ
ブラリーにおける全ての配列と比較した；除草剤ブロモ
キシニルに特異的なクレブシエラ オガエナのニトリア
ーゼ(Stalkerら、J.Biol.Chem.,1988,263 ,6310-6314)
とのみ有意な相同性が見い出された。これら２つのニト
リラーゼは３２０個のアミノ酸にわたって３４．９％の
完全相同性を示した。更にこのタンパク質はインドール
−３−アセトニトリルに特異的なアラビドプシス（Arab
idopsis)のニトリラーゼ〔Bartlingら、Eur.J.Bioche
m.,205,417-424,1992 〕と３１２個のアミノ酸にわたっ
て３４．４％の完全相同性を示した。
【００７６】実施例５：Ｅ．コリにおけるニトリラーゼ
の発現 精製ニトリラーゼについてのコード枠の同定を確認する
ため、ｎｉｔ遺伝子を、下記の手順に従い、それ自体の
リボソーム結合部位を先行させて、Ｅ．コリのラクトー
スオペロンプロモーターのコントロール下に置いた：図
６に示すプラスミドｐＸＬ２０８７は、プラスミドｐＸ
Ｌ２０７５に由来するＸｈｏＩ−ＮｃｏＩフラグメント
を、ベクターｐＭＴＬ２５（Chambersら、Gene,1988,6
8,139-149) の対応の部位の間に挿入することによって
獲得した。従ってこのプラスミドはラクトースオペロン
プロモーターＰｌａｃ、それに続くリボソーム結合部位
及び構造ニトリラーゼ遺伝子、並びにアンピシリン耐性
を授ける遺伝子を含む。
の発現 精製ニトリラーゼについてのコード枠の同定を確認する
ため、ｎｉｔ遺伝子を、下記の手順に従い、それ自体の
リボソーム結合部位を先行させて、Ｅ．コリのラクトー
スオペロンプロモーターのコントロール下に置いた：図
６に示すプラスミドｐＸＬ２０８７は、プラスミドｐＸ
Ｌ２０７５に由来するＸｈｏＩ−ＮｃｏＩフラグメント
を、ベクターｐＭＴＬ２５（Chambersら、Gene,1988,6
8,139-149) の対応の部位の間に挿入することによって
獲得した。従ってこのプラスミドはラクトースオペロン
プロモーターＰｌａｃ、それに続くリボソーム結合部位
及び構造ニトリラーゼ遺伝子、並びにアンピシリン耐性
を授ける遺伝子を含む。
【００７７】ニトリラーゼの発現はプラスミドｐＸＬ２
０８７を含むＥ．コリＴＧ１株において識別化された。
この目的のため、株ＴＧ１／ｐＸＬ２０８７及びコント
ロールの株ＴＧ１／ｐＵＣ１９を、１００μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢ培地（Miller,J.H.,1972,Experim
ents in Molecular Genetics-Cold Spring Harbor Labo
ratory,Cold Spring Harbor,N.Y.) 中で３７℃で１６時
間培養し、次いで同じ培地の中で１００倍希釈して同じ
温度で培養した。この培養物が０．５〜１のＯＤ610 に
達したら、ＩＰＴＧを１mMの最終濃度となるように加え
た。２時間の培養後、その細菌を集めた。
０８７を含むＥ．コリＴＧ１株において識別化された。
この目的のため、株ＴＧ１／ｐＸＬ２０８７及びコント
ロールの株ＴＧ１／ｐＵＣ１９を、１００μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢ培地（Miller,J.H.,1972,Experim
ents in Molecular Genetics-Cold Spring Harbor Labo
ratory,Cold Spring Harbor,N.Y.) 中で３７℃で１６時
間培養し、次いで同じ培地の中で１００倍希釈して同じ
温度で培養した。この培養物が０．５〜１のＯＤ610 に
達したら、ＩＰＴＧを１mMの最終濃度となるように加え
た。２時間の培養後、その細菌を集めた。
【００７８】これらの細胞を超音波処理した後、粗画分
中の、又は遠心後の残渣及び上清液中のニトリラーゼの
発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。その結果を図８
に示し、ＩＰＴＧの存在下において培養した細胞抽出物
において高レベルのニトリラーゼの発現が示された；し
かしながら、このタンパク質は本質的に不溶性状であっ
た。
中の、又は遠心後の残渣及び上清液中のニトリラーゼの
発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。その結果を図８
に示し、ＩＰＴＧの存在下において培養した細胞抽出物
において高レベルのニトリラーゼの発現が示された；し
かしながら、このタンパク質は本質的に不溶性状であっ
た。
【００７９】図８において、Ｍは分子量マーカーを示
し、その分子量はkDa で示している。更にそのレーンは
以下の意味を有している。
し、その分子量はkDa で示している。更にそのレーンは
以下の意味を有している。
【００８０】
【表４】
【００８１】プラスミドｐＸＬ２０８７から出発して、
ニトリラーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドｐ
ＸＬ２０８７のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐ
ＢＲ３２２のＳａｌＩとＥｃｏＲＩ部位〔SUTCLIFFE,Nu
cleic Acid Res.,5(1978)2721-2730〕との間に挿入する
ことによってプラスミドｐＸＬ２１４８を作った。
ニトリラーゼをコードする遺伝子を有するプラスミドｐ
ＸＬ２０８７のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐ
ＢＲ３２２のＳａｌＩとＥｃｏＲＩ部位〔SUTCLIFFE,Nu
cleic Acid Res.,5(1978)2721-2730〕との間に挿入する
ことによってプラスミドｐＸＬ２１４８を作った。
【００８２】このプラスミドｐＸＬ２１４８（その制限
地図を図７に示す）を更に塩化カルシウム法によりＥ．
コリＴＧ１株を形質転換せしめるために用いた。このよ
うにして形質転換せしめたＥ．コリＴＧ１株（ｐＸＬ２
０４８）（Ｇ４２０７）はパリ（Institut Pasteur,25r
ue du Docteur Roux) のコレクション ナショナルデ
カルチャーズ デ マイクロオルガニズムスにno. Ｉ−
１２４２で１９９２年７月２１日に寄託してある。組換
微生物の中でニトリラーゼを製造するためにその他の発
現系を利用した。
地図を図７に示す）を更に塩化カルシウム法によりＥ．
コリＴＧ１株を形質転換せしめるために用いた。このよ
うにして形質転換せしめたＥ．コリＴＧ１株（ｐＸＬ２
０４８）（Ｇ４２０７）はパリ（Institut Pasteur,25r
ue du Docteur Roux) のコレクション ナショナルデ
カルチャーズ デ マイクロオルガニズムスにno. Ｉ−
１２４２で１９９２年７月２１日に寄託してある。組換
微生物の中でニトリラーゼを製造するためにその他の発
現系を利用した。
【００８３】まず最初に、ファージλＣII遺伝子のＲＢ
Ｓの支配下で、Ｅ．コリのトリプトファンオペロンプロ
モーターの後方のｎｉｔ遺伝子をＥ．コリにおいて発現
させる。これを行うため、ｎｉｔの開始コドン上にＮｄ
ｅＩ制限部位を作りあげ、そしてｎｉｔ遺伝子の５′部
分を含む１１７bpのＮｄｅＩ／ＡｈａIIフラグメントを
ｐＸＬ２０８７から出発してＰＣＲ技術により増幅させ
た。第１フラグメントの消化後に獲得した６１bpのＮｄ
ｅＩ／ＸｂａＩフラグメントを、Ｅ．コリのトリプトフ
ァンオペロンプロモーター及びバクテリオファージλＣ
II遺伝子のリボソーム結合部位を含むＥｃｏＲＩ／Ｎｄ
ｅＩフラグメント（Ｐｔｒｐ−ＲＢＳＣII）に、ｐＵＣ
１９のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ部位(Yanischら、Gene, 3
3,(1985)103) との間でリゲートし、プラスミドｐＸＬ
２１４９を得た。Ｐｔｒｐ−ＲＢＳＣIIの後方のｎｉｔ
の５′部分を含むｐＸＬ２１４９のＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ
Ｉフラグメントを、ｎｉｔ遺伝子の３′部分を含むｐＸ
Ｌ２０８７のＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントに、ｐＸ
Ｌ６４２（Mayaux、結果未公開) のＥｃｏＲＩとＳａｌ
Ｉ部位との間でリゲートした。ｐＸＬ６４２はｐＸＬ５
３４(Lattaら、1990,DNA Cell Biol.,9,129)の誘導体で
あり、その過剰発現遺伝子は金属プロテアーゼの組織イ
ンヒビターをコードし、そして過剰発現遺伝子より下流
のＨｉｎｄIII部位はＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄIII 多重部位に置き代っている。
Ｓの支配下で、Ｅ．コリのトリプトファンオペロンプロ
モーターの後方のｎｉｔ遺伝子をＥ．コリにおいて発現
させる。これを行うため、ｎｉｔの開始コドン上にＮｄ
ｅＩ制限部位を作りあげ、そしてｎｉｔ遺伝子の５′部
分を含む１１７bpのＮｄｅＩ／ＡｈａIIフラグメントを
ｐＸＬ２０８７から出発してＰＣＲ技術により増幅させ
た。第１フラグメントの消化後に獲得した６１bpのＮｄ
ｅＩ／ＸｂａＩフラグメントを、Ｅ．コリのトリプトフ
ァンオペロンプロモーター及びバクテリオファージλＣ
II遺伝子のリボソーム結合部位を含むＥｃｏＲＩ／Ｎｄ
ｅＩフラグメント（Ｐｔｒｐ−ＲＢＳＣII）に、ｐＵＣ
１９のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ部位(Yanischら、Gene, 3
3,(1985)103) との間でリゲートし、プラスミドｐＸＬ
２１４９を得た。Ｐｔｒｐ−ＲＢＳＣIIの後方のｎｉｔ
の５′部分を含むｐＸＬ２１４９のＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ
Ｉフラグメントを、ｎｉｔ遺伝子の３′部分を含むｐＸ
Ｌ２０８７のＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントに、ｐＸ
Ｌ６４２（Mayaux、結果未公開) のＥｃｏＲＩとＳａｌ
Ｉ部位との間でリゲートした。ｐＸＬ６４２はｐＸＬ５
３４(Lattaら、1990,DNA Cell Biol.,9,129)の誘導体で
あり、その過剰発現遺伝子は金属プロテアーゼの組織イ
ンヒビターをコードし、そして過剰発現遺伝子より下流
のＨｉｎｄIII部位はＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄIII 多重部位に置き代っている。
【００８４】従って最終プラスミドｐＸＬ２１５８は、
アンピシリン耐性を授ける遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳ
ＣIIのコントロール下にあるｎｉｔ遺伝子を含むｐＢＲ
３２２（Sutcliffe,Nucleic Acid Res.,5(1978)2721)の
誘導体である。このプラスミドｐＸＬ２１５８の制限地
図を図９に示す。
アンピシリン耐性を授ける遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳ
ＣIIのコントロール下にあるｎｉｔ遺伝子を含むｐＢＲ
３２２（Sutcliffe,Nucleic Acid Res.,5(1978)2721)の
誘導体である。このプラスミドｐＸＬ２１５８の制限地
図を図９に示す。
【００８５】Ｅ．コリＴＧ１株を形質転換させるために
プラスミドｐＸＬ２１５８を利用した。この株ＴＧ１／
ｐＸＬ２１５８及びベクターｐＭＴＬ２２を含むコント
ロールのＴＧ１株を、１００μｇ／mlのアンピシリン及
び１００μｇ／mlのトリプトファンを含むＭ９グルコー
ス培地（Miller,J.H.,1972,Experiments in Molecular
Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,N.Y.) の中で３０℃で１６時間培養した。これ
らの培養物をトリプトファンを含まない培地で１００倍
に希釈し、そして同じ温度で６時間培養した。
プラスミドｐＸＬ２１５８を利用した。この株ＴＧ１／
ｐＸＬ２１５８及びベクターｐＭＴＬ２２を含むコント
ロールのＴＧ１株を、１００μｇ／mlのアンピシリン及
び１００μｇ／mlのトリプトファンを含むＭ９グルコー
ス培地（Miller,J.H.,1972,Experiments in Molecular
Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,N.Y.) の中で３０℃で１６時間培養した。これ
らの培養物をトリプトファンを含まない培地で１００倍
に希釈し、そして同じ温度で６時間培養した。
【００８６】細胞の超音波処理の後、コマモナス テス
トステロニＮＴ１のニトリラーゼの発現を粗抽出物にお
いて、又は遠心後の残渣及び上清液において１２．５％
のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで調べた。その結果
を図１０に示す。
トステロニＮＴ１のニトリラーゼの発現を粗抽出物にお
いて、又は遠心後の残渣及び上清液において１２．５％
のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで調べた。その結果
を図１０に示す。
【００８７】
【表５】
【００８８】このゲルが示すには、ｐＸＬ２１５８は、
優先的に可溶性状のニトリラーゼの発現を強く誘発す
る。
優先的に可溶性状のニトリラーゼの発現を強く誘発す
る。
【００８９】次にニトリラーゼの適切な折りたたみを補
助するＧｒｏＥシャペロン効果を試験した (Hemmingsen
ら、1988,Nature,333,330)。この目的のため、プラスミ
ドｐＸＬ２０３５を下記の手法で作製した：ＧｒｏＥの
２つのサブユニットをコードするｇｒｏＥＳ及びｇｒｏ
ＥＬ遺伝子を含む２．２kbのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII
フラグメントをプラスミドｐＯＦ３９(Fayetら、1986,M
ol.Gen.Genet.,202,435)より抽出し、次いでベクターｐ
ＤＳＫ５１９（Keenら、1988,Gene,70,191) のＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄIII 部位との間に導入した。
助するＧｒｏＥシャペロン効果を試験した (Hemmingsen
ら、1988,Nature,333,330)。この目的のため、プラスミ
ドｐＸＬ２０３５を下記の手法で作製した：ＧｒｏＥの
２つのサブユニットをコードするｇｒｏＥＳ及びｇｒｏ
ＥＬ遺伝子を含む２．２kbのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII
フラグメントをプラスミドｐＯＦ３９(Fayetら、1986,M
ol.Gen.Genet.,202,435)より抽出し、次いでベクターｐ
ＤＳＫ５１９（Keenら、1988,Gene,70,191) のＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄIII 部位との間に導入した。
【００９０】プラスミドｐＸＬ２０３５をｐＸＬ２１５
８を含むＴＧ１株の中に導入した。得られる株を５０mg
／ｌのカナマイシンの存在下において先と同じ条件のも
とで培養した。この発現結果を図１０に示している。Ｇ
ｒｏＥの過剰発現（ＧｒｏＥＬサブユニットのみがゲル
上で識別された）はｐＸＬ２１５８より発現したニトリ
ラーゼのバルクを可溶化することが見い出された。
８を含むＴＧ１株の中に導入した。得られる株を５０mg
／ｌのカナマイシンの存在下において先と同じ条件のも
とで培養した。この発現結果を図１０に示している。Ｇ
ｒｏＥの過剰発現（ＧｒｏＥＬサブユニットのみがゲル
上で識別された）はｐＸＬ２１５８より発現したニトリ
ラーゼのバルクを可溶化することが見い出された。
【００９１】シュードモナス ブチダにおいてニトリラ
ーゼを製造するために同じ発現系を用いた。従って、ｐ
ＸＬ２１５８より出発して、１２５６bpのＮｄｅＩ／Ｎ
ｃｏＩフラグメント及び５３５bpのＮｃｏＩ／ＢａｍＩ
フラグメントをｐＸＬ１８４１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ
部位との間に導入した。ｐＸＬ１８４１(Blancheら、19
91,J.Bacteriol.,173,4637) はＰｔｒｐ−ＲＢＳＣIIの
後方のメタノバクテリウム イバノビイ（Methanobacte
rium ivanovii) を発現するｐＫＴ２３０(Bagdasarian
ら、1981,Gene,15,237) の誘導体である。
ーゼを製造するために同じ発現系を用いた。従って、ｐ
ＸＬ２１５８より出発して、１２５６bpのＮｄｅＩ／Ｎ
ｃｏＩフラグメント及び５３５bpのＮｃｏＩ／ＢａｍＩ
フラグメントをｐＸＬ１８４１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ
部位との間に導入した。ｐＸＬ１８４１(Blancheら、19
91,J.Bacteriol.,173,4637) はＰｔｒｐ−ＲＢＳＣIIの
後方のメタノバクテリウム イバノビイ（Methanobacte
rium ivanovii) を発現するｐＫＴ２３０(Bagdasarian
ら、1981,Gene,15,237) の誘導体である。
【００９２】従って、最終プラスミドｐＸＬ２１６９は
カナマイシン耐性を授ける遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳ
ＣIIのコントロール下にあるｎｉｔ遺伝子を含むｐＫＴ
２３０の誘導体である（図１１を参照のこと）。このプ
ラスミドをシュードモナスプチダＧ２０８１の株に導入
した。Ｇ２０８１は、ナリジキシン酸及びリファピシン
に対して耐性にされたシュードモナス プチダＫＴ２４
４０（BagdasarianとTimmis,1981,HofschneidとGoebel,
Topics in Microbiology and Immunolgy,47,Springer V
erlag,Berlin)の誘導体である。コントロールのプラス
ミドとしてベクターｐＤＳＫ５１９（Keenら、1988,Gen
e,70,191) を用いた。Ｇ２０８１（ｐＸＬ２１６９）及
び株Ｇ２０８１（ｐＤＳＫ５１９）を２０mg／ｌのカナ
マイシンを含むＬＢ培地の中で３０℃で一夜培養した。
これらの予備培養物を同じ培地の中で１００倍希釈し
た。培養を次に同じ温度で７時間３０分続行した。これ
らの細胞の超音波処理後、粗画分、又は遠心後の残渣及
び上清液中のコマモナステストステロニＮＩ１のニトリ
ラーゼの発現を１０％のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ルで調べた。その結果を図１２に示す。株Ｇ２０８１
（ｐＤＳＫ５１９）の粗抽出物のみを載せ（ウェル
Ｄ）；株Ｇ２０８１（ｐＸＬ２１６９）については、全
抽出物、超音波処理残渣及び超音波処理上清液をそれぞ
れウェルＣ，Ｂ及びＡに載せた。この実験は、シュード
モナス プチダが可溶性状の大量のニトリラーゼを発現
することを示している。
カナマイシン耐性を授ける遺伝子及びＰｔｒｐ−ＲＢＳ
ＣIIのコントロール下にあるｎｉｔ遺伝子を含むｐＫＴ
２３０の誘導体である（図１１を参照のこと）。このプ
ラスミドをシュードモナスプチダＧ２０８１の株に導入
した。Ｇ２０８１は、ナリジキシン酸及びリファピシン
に対して耐性にされたシュードモナス プチダＫＴ２４
４０（BagdasarianとTimmis,1981,HofschneidとGoebel,
Topics in Microbiology and Immunolgy,47,Springer V
erlag,Berlin)の誘導体である。コントロールのプラス
ミドとしてベクターｐＤＳＫ５１９（Keenら、1988,Gen
e,70,191) を用いた。Ｇ２０８１（ｐＸＬ２１６９）及
び株Ｇ２０８１（ｐＤＳＫ５１９）を２０mg／ｌのカナ
マイシンを含むＬＢ培地の中で３０℃で一夜培養した。
これらの予備培養物を同じ培地の中で１００倍希釈し
た。培養を次に同じ温度で７時間３０分続行した。これ
らの細胞の超音波処理後、粗画分、又は遠心後の残渣及
び上清液中のコマモナステストステロニＮＩ１のニトリ
ラーゼの発現を１０％のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ルで調べた。その結果を図１２に示す。株Ｇ２０８１
（ｐＤＳＫ５１９）の粗抽出物のみを載せ（ウェル
Ｄ）；株Ｇ２０８１（ｐＸＬ２１６９）については、全
抽出物、超音波処理残渣及び超音波処理上清液をそれぞ
れウェルＣ，Ｂ及びＡに載せた。この実験は、シュード
モナス プチダが可溶性状の大量のニトリラーゼを発現
することを示している。
【００９３】実施例６：組換株のニトリラーゼ活性のア
ッセイ 下記の実施例はＥ．コリＴＧ１及びシュードモナス プ
チダＧ２０８１の組換株のニトリラーゼ活性を例証す
る。
ッセイ 下記の実施例はＥ．コリＴＧ１及びシュードモナス プ
チダＧ２０８１の組換株のニトリラーゼ活性を例証す
る。
【００９４】これらの株の中に組込んだ種々のプラスミ
ドは下記の通りである； プラスミド 特 徴 ｐＸＬ２０８７ プロモーターＰｌａｃのコントロール下にあるコマモナスＮＩ １ニトリラーゼ遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２１５８ トリプトファンプロモーターのコントロール下にあるコマモナ スＮＩ１ニトリラーゼ遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２０３５ ＧｒｏＥ及びＳをコードする遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２１６９ Ｐｔｒｐのコントロール下にあるコマモナスＮＩ１ニトリラー ゼ遺伝子を有する、挿入を有する広域宿主プラスミド。 ｐＤＳＫ５１９ コントロールプラスミド（前掲）
ドは下記の通りである； プラスミド 特 徴 ｐＸＬ２０８７ プロモーターＰｌａｃのコントロール下にあるコマモナスＮＩ １ニトリラーゼ遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２１５８ トリプトファンプロモーターのコントロール下にあるコマモナ スＮＩ１ニトリラーゼ遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２０３５ ＧｒｏＥ及びＳをコードする遺伝子を有する組換プラスミド。 ｐＸＬ２１６９ Ｐｔｒｐのコントロール下にあるコマモナスＮＩ１ニトリラー ゼ遺伝子を有する、挿入を有する広域宿主プラスミド。 ｐＤＳＫ５１９ コントロールプラスミド（前掲）
【００９５】誘発せしめた、又は誘発せしめていないこ
れらの株の活性を、種々のpH値にてアジポニトリル及び
５−シアノバレレートについて測定し、そして陰性コン
トロール株、即ち、Ｅ．コリＴＧ１、Ｅ．コリＴＧ１
（ｐＸＬ２０３５）及びシュードモナス プチダＧ２０
８１と比較した。
れらの株の活性を、種々のpH値にてアジポニトリル及び
５−シアノバレレートについて測定し、そして陰性コン
トロール株、即ち、Ｅ．コリＴＧ１、Ｅ．コリＴＧ１
（ｐＸＬ２０３５）及びシュードモナス プチダＧ２０
８１と比較した。
【００９６】１−細胞の調製：培養は第４表に記載の条
件下で行った。対数増殖期の間、２つの組換株の培養物
の一方を１mMのＩＰＴＧで誘発せしめた；３７℃で２時
間後、この培養物を処理した。
件下で行った。対数増殖期の間、２つの組換株の培養物
の一方を１mMのＩＰＴＧで誘発せしめた；３７℃で２時
間後、この培養物を処理した。
【００９７】
【表６】
【００９８】略語： ａ：ＬＢ培地；ｂ：ＬＢ培地＋
１００μｇのＡｍｐ；ｃ：培地ｂ＋ＯＤ660nm ＝１に至
るまでの１mMのＩＰＴＧの添加；ｄ：ＬＢ培地＋５０mg
／ｌのカナマイシン；ｅ：Ｍ９培地＋１００mg／ｌのア
ンピシリン＋５０mg／ｌのカナマイシン；ＤＷ：乾燥重
量 共通条件：１〜３：１６時間目の予備培養物による１／
１００の比での接種；培養時間５．７５ｈ；Ｔ＝３７℃ ４〜８：３７℃にてトリプトファンの添加を伴う１７時
間目の予備培養物による１／１００の比での接種；１５
ｌの発酵槽の中での培養時間：Ｅ．コリについては２３
ｈ、そしてＰ．プチダについては７．５ｈ；Ｔ＝３０℃
１００μｇのＡｍｐ；ｃ：培地ｂ＋ＯＤ660nm ＝１に至
るまでの１mMのＩＰＴＧの添加；ｄ：ＬＢ培地＋５０mg
／ｌのカナマイシン；ｅ：Ｍ９培地＋１００mg／ｌのア
ンピシリン＋５０mg／ｌのカナマイシン；ＤＷ：乾燥重
量 共通条件：１〜３：１６時間目の予備培養物による１／
１００の比での接種；培養時間５．７５ｈ；Ｔ＝３７℃ ４〜８：３７℃にてトリプトファンの添加を伴う１７時
間目の予備培養物による１／１００の比での接種；１５
ｌの発酵槽の中での培養時間：Ｅ．コリについては２３
ｈ、そしてＰ．プチダについては７．５ｈ；Ｔ＝３０℃
【００９９】２−比活性の測定 比活性の測定の条件及び結果を第５表にまとめた。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
【表８】
【０１０２】共通条件：〔基質〕＝５０mM；Ｔ＝２５
℃；緩衝液５０mM；反応は１〜３については９０min 、
そして４〜８については１２０分 略語： Ｗ：全細胞；Ｓ：超音波処理細胞；Ｕ：生成
した１μmol アジペート／ｈ、ただし（ａ）生成した１
μmol の５−シアノバレレート／ｈ；Ｕａ＝生成したシ
アノバレレートのμmol ／ｈ／ＤＷ細胞のmg；Ｕｂ＝生
成したアジペートのμmol ／ｈ／乾燥細胞のmg；Ａｄ
Ｎ：アジポニトリル；ＣＶＡ＝５−シアノバレレート；
ＤＷ：乾燥重量
℃；緩衝液５０mM；反応は１〜３については９０min 、
そして４〜８については１２０分 略語： Ｗ：全細胞；Ｓ：超音波処理細胞；Ｕ：生成
した１μmol アジペート／ｈ、ただし（ａ）生成した１
μmol の５−シアノバレレート／ｈ；Ｕａ＝生成したシ
アノバレレートのμmol ／ｈ／ＤＷ細胞のmg；Ｕｂ＝生
成したアジペートのμmol ／ｈ／乾燥細胞のmg；Ａｄ
Ｎ：アジポニトリル；ＣＶＡ＝５−シアノバレレート；
ＤＷ：乾燥重量
【０１０３】実施例７：懸濁物におけるＥ．コリ（ｐＸ
Ｌ２０８７）によるアジポニトリルのバッチ式加水分解
によるアジピン酸アンモニウムの合成 ２１ｇ／ｌの初期濃度のＥ．コリ株（ｐＸＬ２０８７）
を含む５０mMのリン酸緩衝液、pH７、初期容量５mlに、
０，１，２，３，５，６及び７ｈの反応時間目にて、１
２０μｌ又は１０６８μｌのアジポニトリルを２５℃で
磁気撹拌しながら加えた。この反応を、毎時１００μｌ
の反応容量のサンプルをとることにより分析的にモニタ
ーした。加水分解は反応速度の有意な損失を伴うことな
く進行することが見い出せた。
Ｌ２０８７）によるアジポニトリルのバッチ式加水分解
によるアジピン酸アンモニウムの合成 ２１ｇ／ｌの初期濃度のＥ．コリ株（ｐＸＬ２０８７）
を含む５０mMのリン酸緩衝液、pH７、初期容量５mlに、
０，１，２，３，５，６及び７ｈの反応時間目にて、１
２０μｌ又は１０６８μｌのアジポニトリルを２５℃で
磁気撹拌しながら加えた。この反応を、毎時１００μｌ
の反応容量のサンプルをとることにより分析的にモニタ
ーした。加水分解は反応速度の有意な損失を伴うことな
く進行することが見い出せた。
【０１０４】アジポニトリルの添加後３０分からの平均
活性値を下記の第６表にまとめる。
活性値を下記の第６表にまとめる。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】実施例８：樹脂上に固定化したＥ．コリ
（ｐＸＬ２０８７）による固定層反応系におけるアジポ
ニトリルの加水分解によるアジピン酸ナトリウムの合成 Ｅ．コリ（ｐＸＬ２０８７）細胞をまず米国特許第４，
７３２，８５１号に記述の技術により固定化した。
（ｐＸＬ２０８７）による固定層反応系におけるアジポ
ニトリルの加水分解によるアジピン酸ナトリウムの合成 Ｅ．コリ（ｐＸＬ２０８７）細胞をまず米国特許第４，
７３２，８５１号に記述の技術により固定化した。
【０１０７】得られる生物触媒を次にアジポニトリルの
アジピン酸ナトリウムへの加水分解のために固定層カラ
ムにおいて用いた。
アジピン酸ナトリウムへの加水分解のために固定層カラ
ムにおいて用いた。
【０１０８】１−樹脂へのＥ．コリ（ｐＸＬ２０８７）
の固定 細胞を以下のプロトコールに従って固定した： −２２％の固形含有量を有する１ｇ（湿潤重量）のＥ．
コリ（ｐＸＬ２０８７） −１ｇのＰＯＬＹＣＵＰポリアゼチジン −１ｇのＤＵＯＬＩＴＥ Ａ １７１樹脂 １ｇの細胞をポリアゼチジン溶液の中に懸濁した。均質
にした後、樹脂をこの細胞懸濁物の中に注ぎ入れた。全
体をスパチュウでかき混ぜ、次いでフッドの中で１８ｈ
大気に解放して乾かした。次に４ml又は１．３ｇの生物
触媒を集めた。
の固定 細胞を以下のプロトコールに従って固定した： −２２％の固形含有量を有する１ｇ（湿潤重量）のＥ．
コリ（ｐＸＬ２０８７） −１ｇのＰＯＬＹＣＵＰポリアゼチジン −１ｇのＤＵＯＬＩＴＥ Ａ １７１樹脂 １ｇの細胞をポリアゼチジン溶液の中に懸濁した。均質
にした後、樹脂をこの細胞懸濁物の中に注ぎ入れた。全
体をスパチュウでかき混ぜ、次いでフッドの中で１８ｈ
大気に解放して乾かした。次に４ml又は１．３ｇの生物
触媒を集めた。
【０１０９】固定化及び遊離細胞の活性を５０mMのアジ
ポニトリルについて２５℃及びpH７で決定した。これら
はそれぞれ３０及び１１０μmol の２−シアノバレレー
ト／ｈ／細胞mg（ＤＷ）であり、固定化収率は２６％と
推測された。
ポニトリルについて２５℃及びpH７で決定した。これら
はそれぞれ３０及び１１０μmol の２−シアノバレレー
ト／ｈ／細胞mg（ＤＷ）であり、固定化収率は２６％と
推測された。
【０１１０】２−固定層反応系におけるアジポニトリル
の加水分解 以下に示す条件のもとで連続供給式固定層反応系におけ
る半減期を決定した： Ｔ：２８℃；触媒；０．５ｇ又は２ml又は８５mgの細胞
（乾燥重量）；〔アジポニトリル〕：５０mM；リン酸緩
衝液：５０mM、pH７；流速３．７±０．１ml／ｈ；カラ
ム：径１cm、高さ３cm。
の加水分解 以下に示す条件のもとで連続供給式固定層反応系におけ
る半減期を決定した： Ｔ：２８℃；触媒；０．５ｇ又は２ml又は８５mgの細胞
（乾燥重量）；〔アジポニトリル〕：５０mM；リン酸緩
衝液：５０mM、pH７；流速３．７±０．１ml／ｈ；カラ
ム：径１cm、高さ３cm。
【０１１１】細胞の初期活性は１．５μmol のアジペー
ト／ｈ／mgの細胞（乾燥重量）であった。３２日間又は
７７０ｈ後に６６％の初期活性が保持された。
ト／ｈ／mgの細胞（乾燥重量）であった。３２日間又は
７７０ｈ後に６６％の初期活性が保持された。
【０１１２】
配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起 源 生物名：コマモナス テストステロニ Met Lys Asn Tyr Pro Thr Val Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Ala Val 5 10 15 Phe Met Asn Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Thr 20 25
【０１１３】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列の種類：合成ＤＮＡ 他の情報：Ｎは、Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴ
【０１１４】配列番号：３ 配列の長さ：１１９４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ctcgagacaaaattgggacagtcgccccctatctgcaaaatggaacctcctttgcacatctataaa 66 attttttgaggaagacagca ATG AAA AAT TAT CCT ACA GTC AAG GTA GCA GCA 119 Met Lys Asn Tyr Pro Thr Val Lys Val Ala Ala 11 GTG CAA GCT GCT CCT GTA TTT ATG AAT CTA GAG GCA ACA GTA GAT AAA 167 Val Gln Ala Ala Pro Val Phe Met Asn Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys 27 ACT TGT AAG TTA ATA GCA GAA GCA GCA TCT ATG GGC GCC AAG GTT ATC 215 Thr Cys Lys Leu Ile Ala Glu Ala Ala Ser Met Gly Ala Lys Val Ile 43 GGC TTC CCA GAA GCA TTT ATT CCC GGC TAT CCA TAT TGG ATT TGG ACA 263 Gly Phe Pro Glu Ala Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ile Trp Thr 59 TCA AAT ATG GAC TTC ACT GGA ATG ATG TGG GCC GTC CTT TTC AAG AAT 311 Ser Asn Met Asp Phe Thr Gly Met Met Trp Ala Val Leu Phe Lys Asn 75 GCG ATT GAA ATC CCA AGC AAA GAA GTT CAA CAA ATT AGT GAT GCT GCA 359 Ala Ile Glu Ile Pro Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile Ser Asp Ala Ala 91 AAA AAG AAT GGA GTT TAC GTT TGC GTT TCT GTA TCA GAG AAA GAT AAT 407 Lys Lys Asn Gly Val Tyr Val Cys Val Ser Val Ser Glu Lys Asp Asn 107 GCC TCG CTA TAT TTG ACG CAA TTG TGG TTT GAC CCG AAT GGT AAT TTG 455 Ala Ser Leu Tyr Leu Thr Gln Leu Trp Phe Asp Pro Asn Gly Asn Leu 123 ATT GGC AAG CAC AGG AAA TTC AAG CCC ACT AGT AGT GAA AGA GCT GTA 503 Ile Gly Lys His Arg Lys Phe Lys Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ala Val 139 TGG GGA GAT GGG GAT GGA AGC ATG GCT CCC GTA TTT AAA ACA GAG TAT 551 Trp Gly Asp Gly Asp Gly Ser Met Ala Pro Val Phe Lys Thr Glu Tyr 155 GGG AAT CTT GGG GGA CTC CAG TGC TGG GAA CAT GCT CTC CCA TTA AAC 599 Gly Asn Leu Gly Gly Leu Gln Cys Trp Glu His Ala Leu Pro Leu Asn 171 ATT GCG GCG ATG GGC TCA TTG AAC GAA CAG GTA CAT GTT GCT TCC TGG 647 Ile Ala Ala Met Gly Ser Leu Asn Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp 187 CCA GCC TTC GTC CCT AAA GGC GCA GTA TCA TCC AGA GTA TCA TCC AGC 695 Pro Ala Phe Val Pro Lys Gly Ala Val Ser Ser Arg Val Ser Ser Ser 203 GTC TGT GCG TCT ACT AAT GCG ATG CAT CAG ATC ATT AGT CAG TTT TAC 743 Val Cys Ala Ser Thr Asn Ala Met His Gln Ile Ile Ser Gln Phe Tyr 219 GCG ATC AGC AAT CAG GTA TAT GTA ATT ATG TCA ACC AAT CTC GTT GGC 791 Ala Ile Ser Asn Gln Val Tyr Val Ile Met Ser Thr Asn Leu Val Gly 235 CAA GAC ATG ATT GAC ATG ATT GGG AAA GAT GAA TTT TCC AAA AAC TTT 839 Gln Asp Met Ile Asp Met Ile Gly Lys Asp Glu Phe Ser Lys Asn Phe 251 CTA CCG CTT GGT TCT GGA AAC ACA GCG ATT ATT TCT AAC ACC GGT GAG 887 Leu Pro Leu Gly Ser Gly Asn Thr Ala Ile Ile Ser Asn Thr Gly Glu 267 ATT TTG GCA TCA ATT CCA CAA GAC GCG GAG GGA ATT GCT GTT GCA GAG 935 Ile Leu Ala Ser Ile Pro Gln Asp Ala Glu Gly Ile Ala Val Ala Glu 283 ATT GAC CTT AAC CAA ATA ATT TAT GGA AAG TGG TTA CTG GAT CCC GCC 983 Ile Asp Leu Asn Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Trp Leu Leu Asp Pro Ala 299 GGT CAT TAC TCT ACT CCC GGC TTC TTA AGT TTG ACA TTT GAT CAG TCT 1031 Gly His Tyr Ser Thr Pro Gly Phe Leu Ser Leu Thr Phe Asp Gln Ser 315 GAA CAT GTA CCC GTA AAA AAA ATA GGT GAG CAG ACA AAC CAT TTC ATC 1079 Glu His Val Pro Val Lys Lys Ile Gly Glu Gln Thr Asn His Phe Ile 331 TCT TAT GAA GAC TTA CAT GAA GAT AAA ATG GAT ATG CTA ACG ATT CCG 1127 Ser Tyr Glu Asp Leu His Glu Asp Lys Met Asp Met Leu Thr Ile Pro 347 CCG AGG CGC GTA GCC ACA GCG TGA tcgccgcctctcggggcgttcggttgctgata 1183 Pro Arg Arg Val Ala Thr Ala 354 gccatcgcctt 1194
【０１１５】配列番号：４ 配列の長さ：１１９４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ CTCGAGACAA AATTGGGACA GTCGCCCCCT ATCTGCAAAA TGGAACCTCC TTTGCACATC 60 TATAAAATTT TTTGAGGAAG ACAGCAATGA AAAATTATCC TACAGTCAAG GTAGCAGCAG 120 TGCAAGCTGC TCCTGTATTT ATGAATCTAG AGGCAACAGT AGATAAAACT TGTAAGTTAA 180 TAGCAGAAGC AGCATCTATG GGCGCCAAGG TTATCGGCTT CCCAGAAGCA TTTATTCCCG 240 GCTATCCATA TTGGATTTGG ACATCAAATA TGGACTTCAC TGGAATGATG TGGGCCGTCC 300 TTTTCAAGAA TGCGATTGAA ATCCCAAGCA AAGAAGTTCA ACAAATTAGT GATGCTGCAA 360 AAAAGAATGG AGTTTACGTT TGCGTTTCTG TATCAGAGAA AGATAATGCC TCGCTATATT 420 TGACGCAATT GTGGTTTGAC CCGAATGGTA ATTTGATTGG CAAGCACAGG AAATTCAAGC 480 CCACTAGTAG TGAAAGAGCT GTATGGGGAG ATGGGGATGG AAGCATGGCT CCCGTATTTA 540 AAACAGAGTA TGGGAATCTT GGGGGACTCC AGTGCTGGGA ACATGCTCTC CCATTAAACA 600 TTGCGGCGAT GGGCTCATTG AACGAACAGG TACATGTTGC TTCCTGGCCA GCCTTCGTCC 660 CTAAAGGCGC AGTATCATCC AGAGTATCAT CCAGCGTCTG TGCGTCTACT AATGCGATGC 720 ATCAGATCAT TAGTCAGTTT TACGCGATCA GCAATCAGGT ATATGTAATT ATGTCAACCA 780 ATCTCGTTGG CCAAGACATG ATTGACATGA TTGGGAAAGA TGAATTTTCC AAAAACTTTC 840 TACCGCTTGG TTCTGGAAAC ACAGCGATTA TTTCTAACAC CGGTGAGATT TTGGCATCAA 900 TTCCACAAGA CGCGGAGGGA ATTGCTGTTG CAGAGATTGA CCTTAACCAA ATAATTTATG 960 GAAAGTGGTT ACTGGATCCC GCCGGTCATT ACTCTACTCC CGGCTTCTTA AGTTTGACAT 1020 TTGATCAGTC TGAACATGTA CCCGTAAAAA AAATAGGTGA GCAGACAAAC CATTTCATCT 1080 CTTATGAAGA CTTACATGAA GATAAAATGG ATATGCTAAC GATTCCGCCG AGGCGCGTAG 1140 CCACAGCGTG ATCGCCGCCT CTCGGGGCGT TCGGTTGCTG ATAGCCATCG CCTT 1194
【０１１６】配列番号：５ 配列の長さ：３５４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ポリペプチド Met Lys Asn Tyr Pro Thr Val Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Phe Met Asn Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Thr Cys Lys Leu Ile 20 25 30 Ala Glu Ala Ala Ser Met Gly Ala Lys Val Ile Gly Phe Pro Glu Ala 35 40 45 Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ile Trp Thr Ser Asn Met Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Met Met Trp Ala Val Leu Phe Lys Asn Ala Ile Glu Ile Pro 65 70 75 80 Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile Ser Asp Ala Ala Lys Lys Asn Gly Val 85 90 95 Tyr Val Cys Val Ser Val Ser Glu Lys Asp Asn Ala Ser Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr Gln Leu Trp Phe Asp Pro Asn Gly Asn Leu Ile Gly Lys His Arg 115 120 125 Lys Phe Lys Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ala Val Trp Gly Asp Gly Asp 130 135 140 Gly Ser Met Ala Pro Val Phe Lys Thr Glu Tyr Gly Asn Leu Gly Gly 145 150 155 160 Leu Gln Cys Trp Glu His Ala Leu Pro Leu Asn Ile Ala Ala Met Gly 165 170 175 Ser Leu Asn Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Phe Val Pro 180 185 190 Lys Gly Ala Val Ser Ser Arg Val Ser Ser Ser Val Cys Ala Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Met His Gln Ile Ile Ser Gln Phe Tyr Ala Ile Ser Asn Gln 210 215 220 Val Tyr Val Ile Met Ser Thr Asn Leu Val Gly Gln Asp Met Ile Asp 225 230 235 240 Met Ile Gly Lys Asp Glu Phe Ser Lys Asn Phe Leu Pro Leu Gly Ser 245 250 255 Gly Asn Thr Ala Ile Ile Ser Asn Thr Gly Glu Ile Leu Ala Ser Ile 260 265 270 Pro Gln Asp Ala Glu Gly Ile Ala Val Ala Glu Ile Asp Leu Asn Gln 275 280 285 Ile Ile Tyr Gly Lys Trp Leu Leu Asp Pro Ala Gly His Tyr Ser Thr 290 295 300 Pro Gly Phe Leu Ser Leu Thr Phe Asp Gln Ser Glu His Val Pro Val 305 310 315 320 Lys Lys Ile Gly Glu Gln Thr Asn His Phe Ile Ser Tyr Glu Asp Leu 325 330 335 His Glu Asp Lys Met Asp Met Leu Thr Ile Pro Pro Arg Arg Val Ala 340 345 350 Thr Ala
【図面の簡単な説明】
【図１】コマモナス テストステロニ種の株について
の、時間における反応時間の関数としての、アジポニト
リルからシアノバレレート（曲線ａ）及びアジピン酸ア
ンモニウム（曲線ｂ）への加水分解の収率（％）を示
す。
の、時間における反応時間の関数としての、アジポニト
リルからシアノバレレート（曲線ａ）及びアジピン酸ア
ンモニウム（曲線ｂ）への加水分解の収率（％）を示
す。
【図２】（ａ）はプラスミドｐＸＬ２０７５そして
（ｂ）はｐＸＬ２０７６の制限地図を示す。
（ｂ）はｐＸＬ２０７６の制限地図を示す。
【図３】本発明にかかわるニトリラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列（図面の中では「ニ
トリラーゼ遺伝子」と称している）を含む４．１kbのＳ
ｓｔＩ−ＳｓｔＩフラグメントの制限地図を示す。この
図面の中には、本発明にかかわるＤＮＡ配列を含むＸｂ
ａＩ−ＳｓｔＩフラグメントを製造する手法も示してい
る。
リペプチドをコードするＤＮＡ配列（図面の中では「ニ
トリラーゼ遺伝子」と称している）を含む４．１kbのＳ
ｓｔＩ−ＳｓｔＩフラグメントの制限地図を示す。この
図面の中には、本発明にかかわるＤＮＡ配列を含むＸｂ
ａＩ−ＳｓｔＩフラグメントを製造する手法も示してい
る。
【図４】本発明にかかわるＤＮＡ配列及びその推定アミ
ノ酸配列を示す。
ノ酸配列を示す。
【図５】本発明にかかわるＤＮＡ配列及びその推定アミ
ノ酸配列の図４の続きを示す。
ノ酸配列の図４の続きを示す。
【図６】プラスミドｐＸＬ２０８７の制限地図を示す。
【図７】プラスミドｐＸＬ２１４８の制限地図を示す。
【図８】Ｅ．コリＴＧ１／ｐＸＬ２０２７の株における
本発明にかかわるＤＮＡ配列の発現を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（１０％のＳＤＳ）を示す。各レーンは６１０nmで
３の吸光度の培養物６０μｌに相当するタンパク質量に
対応する。
本発明にかかわるＤＮＡ配列の発現を示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（１０％のＳＤＳ）を示す。各レーンは６１０nmで
３の吸光度の培養物６０μｌに相当するタンパク質量に
対応する。
【図９】プラスミドｐＸＬ２１５８の制限地図を示す。
【図１０】ＴＧ１／ｐＸＬ２１５８及びＴＧ１／ｐＸＬ
２１５８＋ｐＸＬ２０３５（ＧｒｏＥ）の株における本
発明にかかわるＤＮＡ配列の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（１２．５％のＳＤＳ）を示す。
２１５８＋ｐＸＬ２０３５（ＧｒｏＥ）の株における本
発明にかかわるＤＮＡ配列の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（１２．５％のＳＤＳ）を示す。
【図１１】プラスミドｐＸＬ２１６９の制限地図を示
す。
す。
【図１２】シュードモナス プチダＧ２０８１−ｐＸＬ
２１６９の株における本発明にかかわるＤＮＡ配列の発
現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％のＳＤＳ）を示す。
２１６９の株における本発明にかかわるＤＮＡ配列の発
現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％のＳＤＳ）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/00 2121−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:40） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ソフィー レビイ−シル フランス国，75007 パリ，リュ ドゥ モンテスイ，２ (72)発明者 ジョエル クルゼット フランス国，75012 パリ，リュ デ ム ニエール 48−52
Claims (21)
- 【請求項１】 ニトリラーゼ活性を有し、従ってニトリ
ル類をカルボン酸類に加水分解せしめることのできるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、 −配列番号３に記載のニトリラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、 −遺伝子コードの同義性に由来するこの配列の類似体、
及び −これらの配列のいづれか又はそのフラグメントとハイ
ブリダイズし、且つ、ニトリラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、 より選ばれるＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 配列番号４に記載のヌクレオチド配列を
含む請求項１に記載の組換ＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 請求項１又は２のいづれか１項に記載の
ＤＮＡ配列の発現に由来し、且つ、ニトリラーゼ活性を
有するポリペプチド。 - 【請求項４】 配列番号５に記載の配列を含んで成る請
求項３に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載のＤＮＡ配列を含
む微生物。 - 【請求項６】 選別手段を含むプラスミド上に請求項１
又は２に記載のＤＮＡ配列を含む、微生物。 - 【請求項７】 プラスミドｐＸＬ２１４８を含むＥ．コ
リ（E.coli) ＴＧ１の株より成り、この株が参照番号Ｇ
４２０７を有し、そして番号Ｉ−１２４２のもとでコレ
クション ナショナル デ カルチャーズ デ マイク
ロ−オルガニズムス（国際微生物保存機関）に寄託され
ている微生物。 - 【請求項８】 宿主微生物における請求項１又は２に記
載のＤＮＡ配列の発現を確実にするシグナルの支配下に
ある前記配列より成る発現カセットを含む微生物。 - 【請求項９】 前記ＤＮＡ配列の上流に、生産されるポ
リペプチドと同類又は異種のリボソーム結合部位及びプ
ロモーター配列を含んで成る、請求項８に記載の微生
物。 - 【請求項１０】 前記プロモーターがＥ．コリのラクト
ーヌオベロンプロモーターＰｌａｃ、ファージラムダ右
側オペロンプロモーターＰR 、ファージラムダ左側オペ
ロンプロモーターＰL 、又はコリネバクテリウム（Cory
nebacterium)、コマモナス (Comamonas)もしくはシュー
ドモナス (Pseudomonas)の強力プロモーターでありう
る、請求項９に記載の微生物。 - 【請求項１１】 前記リボソーム結合部位がファージラ
ムダＣII遺伝子に由来するもの、又はＥ．コリ、コマモ
ナス、シュードモナスもしくはコリネバクテリウムの遺
伝子に由来するものでありうる、請求項９に記載の微生
物。 - 【請求項１２】 前記発現カセットが選別手段を含むプ
ラスミドにより保有されている、請求項８〜１１のいづ
れか１項に記載の微生物。 - 【請求項１３】 前記選別手段が抗生物質耐性を授ける
マーカーである、請求項１２に記載の微生物。 - 【請求項１４】 Ｅ．コリ、コマモナス、コリネバクテ
リウム、ブレビバクテリウム（Brevibacterium) 、ロド
コッカス (Rhodococcus)及びシュードモナスの株より選
ばれる請求項５〜１３のいづれか１項に記載の微生物。 - 【請求項１５】 微生物であって、 −この微生物が合成する請求項３又は４に記載のポリペ
プチドの折りたたみを補助するための少なくとも１種の
タンパク質因子及び／又はかかる因子をコードする遺伝
子を含み、 −そして前記因子が問題の微生物の基底レベルに相当す
る量よりも多量に存在している、 請求項５〜１４のいづれか１項に記載の微生物。 - 【請求項１６】 前記因子がＥ．コリのＧｒｏＥシャペ
ロン又は真核もしくは原核起源のその類似体である請求
項１５に記載の微生物。 - 【請求項１７】 前記因子をコードする遺伝子が染色体
又は体外染色体要素（プラスミド、ファージ）により保
有され、従って前記遺伝子が増幅される、請求項１５又
は１６に記載の微生物。 - 【請求項１８】 前記因子をコードする遺伝子が前記微
生物と同類又は異種である発現系の支配下にある、請求
項１７に記載の微生物。 - 【請求項１９】 ニトリル類を変換せしめる酵素的方法
であって、このニトリル類を請求項３もしくは４のいづ
れかに記載のニトリル活性を有するポリペプチド又は請
求項５〜１９のいづれか１項に記載の宿主微生物と接触
せしめることより成る方法。 - 【請求項２０】 前記ニトリルが式ＮＣ−Ｒ−ＣＮのジ
ニトリル（式中、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有するア
ルキレン基である）である、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記ニトリルがアジポニトリルであ
る、請求項１９又は２０に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9209882A FR2694571B1 (fr) | 1992-08-10 | 1992-08-10 | Polypeptides possédant une activité nitrilase, séquence d'ADN codant pour lesdits polypeptides, cassettes d'expression et micro-organismes hôtes permettant leur obtention. |
| FR9209882 | 1992-08-10 |
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|---|---|
| JPH0751070A true JPH0751070A (ja) | 1995-02-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5197461A Withdrawn JPH0751070A (ja) | 1992-08-10 | 1993-08-09 | ニトリラーゼ活性を有するポリペプチド |
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|---|---|
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