JPH0767387B2

JPH0767387B2 - β‐ラクタム化合物の製造を目的とする遺伝子および遺伝子産物

Info

Publication number: JPH0767387B2
Application number: JP1503743A
Authority: JP
Inventors: クナウセデル、フランツ; ライトネル、エルンスト; パルマ、ノルベルト; ヴェベル、ゲルハルト
Original assignee: ビオヘミー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1988-04-08
Filing date: 1989-04-07
Publication date: 1995-07-26
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: FI895846A0; WO1989009821A1; HK99996A; FI103053B1; EP0336446B1; JPH02503750A; AU3362689A; DK622189D0; FI103053B; HU892092D0; HU208845B; DE58907667D1; DK175769B1; KR900700610A; HUT52156A; EP0336446A1; ATE105860T1; AU637317B2; DK622189A; ES2054916T3

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、構造および多価機能性の点で新規であり、
ペニシリンＧおよびペニシリンＶの生合成の最終段階を
触媒する、精製された単離形態の鍵酵素の遺伝子および
遺伝子産物に関するものである。

既に1953年に、加藤（「ジャーナル・オブ・アンティバ
イオティックス・シリーズ」、東京６、130−136頁、19
53年）により、前駆物質を欠くペニシリン発酵物におい
てペニシリン核の蓄積が観察されている。後にこのβ−
ラクタムは、バチェラー等（「ネイチャー」、183、257
−258頁、1959年）により単離され、６−アミノペニシ
ラン酸（６−APA）として同定された。６−APAは、特に
前駆体を欠くペニシリン発酵物において蓄積される。エ
リクソンおよびベネット（「アプライド・マイクロバイ
オロジー」、13、738−742頁、1965年）は、６−APA
を、前駆物質としてのフェニル−またはフェノキシ酢酸
の非存在下におけるイソペニシリンＮの酵素的７−脱ア
シル化により得られるか、または天然疎水性ペニシリン
類の酵素的開裂により形成される第二中間大謝物とみな
した。後にペニシリン生合成の最終段階は、フェニル−
またはフェノキシ酢酸をイソペニシリンＮのＬ−α−ア
ミノアジピン酸側鎖と交換することによって、側鎖酸が
アシル−補酵素Ａ−化合物として反応を開始することに
より構成されることが発見された。このアシル基転移を
触媒する酵素は、ローダー（Postepy Hig.Med.Dosw.、2
6、493−500頁、1972年）によりペニシリウム・クリソ
ゲヌムの粗抽出物において同定され、ペニシリン・アシ
ルトランスフェラーゼ（PAT）と命名された。この酵素
は全てのペニシリン形成菌において見出され、細胞内で
局在している。フォーセット等の研究（「バイオケミカ
ル・ジャーナル）」、151、741−746頁、1975年）は、
フェニルアセチル−補酵素Ａの存在下でのペニシリウム
・クリソゲヌムの酵素粗抽出部によるイソペニシリンＮ
からペニシリンＧへのアシル基転移を確認している。

ペニシリンＧまたはＶの生合成におけるPATの重要性
は、ブルナー等（「ホッペ−ザイラーズ・ツァイチュリ
フト・フュール・フィジオロギシェ・ヘミー」349、95
−103頁、1968年）、スペンサー（「バイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョンズ」31、170−175頁、1968年）、ガーテンバックお
よびブランズバーグ（「アクタ・ケミカ・スカンディナ
ビカ」22、1059−1061頁、1968年）、スペンサーおよび
マウング（「バイオケミカル・ジャーナル」118、29−3
0頁、1970年）、メーシェルト等（「ジャーナル・オブ
・アンティバイオテックス」33、722−730頁、1980
年）、コゲカー等（「インディアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス」
20、208−212頁、1983年）、フレデリクゼン等（「バイ
オテクニカル・レターズ」６、549−545頁、1984年）、
アブラハム（「レギュレーション・オブ・セカンダリー
・メタボライト・フォーメーション」中、クラインカウ
フ等編、プロシーディングス・オブ・ザ・シックスティ
ーンズ・ワークショップ・コンファレンシーズ・ヘキス
ト、グラハト・カストレ、12.−16.5.85、第16巻、バイ
ンハイム、115−132頁、1986年）、ルエンゴ等（「ジャ
ーナル・オブ・アンティバイオティックス」39、1565−
1573頁および1754−1759頁、1986年）並びにアルバレス
等（「アンティマイクロバイアル・エージェンツ・アン
ド・ケモセラピー」31、1675−1682頁、1987年）により
為された観察により確認されている。またチオール依存
性酵素は、様々なペニシリン内でのアシル基交換を触媒
し得、高い合成能を有するペニシリン下部における場合
の方が低生産株における場合より見出される度合が大き
い（プルースおよびジョンソン、「ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー」94、1502−1508頁、1967年）。

この発明は、この重要な生合成酵素の遺伝子配列および
遺伝子産物の単離、特性検定および説明に関するもので
あり、力価の増加およびハイブリッドまたは突然変異合
成の両方に関する遺伝子工学技術の必須先行条件または
新規なβ−ラクタム形質転換方法の開示を提供する。

蛋白質配列決定は、ローゼン、「メソッズ・エンザイモ
ロジー」25、344−359頁（1972年）により知られてい
る。同様に、当技術分野の現段階では、蛋白質をコード
する遺伝子の位置決め（ロズスタイン等、コールド・ス
プリング・ハーバー・シンポジア・オン・クォンティテ
イティブ・バイオロジー、XLV巻、99−105頁、1981年）
およびそれらの配列決定（マクサムおよびギルバート、
「メソッズ・エンザイモロジー」65、499−560頁、1980
年）が知られている。強力で所望により誘導性であり得
るプロモーターへの遺伝子のカップリング達成は、プリ
ブノー、「バイオロジカル・レギュレーション・アンド
・デベロップメント」、第１巻、231−277頁、プレナム
・プレス・ナンバー４（ゴールドバーガー等、1979年）
により知られている。

β−ラクタム生合成の幾つかの酵素は、既に純粋形態で
単離され、構造に従い特性検定されている。同様に、こ
れらの酵素の幾つかの暗号化遺伝子領域は、その間に単
離され、配列決定され、形質転換に適した対応する発現
ベクターに組み込まれ、クローン化されている（例、セ
ファロスポリウム・アクレモニウムからイソペニシリン
Ｎシンテターゼ：サムソン等、「ネイチャー」318、191
−194頁、1985年、ボールドウィン等、「ジャーナル・
オブ・アンディバイオティックス」40（５）、652−659
頁、1987年、EP200425、イーライ・リリー、1985年、ペ
ニシリウム・クリソゲヌムからイソペニシリンＮシンテ
ターゼ：カー等「ジーン」48、257−266頁、1986年、EP
225128、イーライ・リリー、185年、セファロスポリウ
ム・アクレモニウムからエクスパンダーゼ：サムソン
等、「バイオテクノロジー」５、1207−1214頁、1987
年、並びにβ−ラクタム生合成を触媒するストレプトマ
イセス・クラブリゲルスから幾つかの酵素:EP233715、
ビーチャム、1986年）。同様に、それらの発現ベクター
により行なわれたβ−ラクタム生産性微生物の最初の形
質転換については、既に記載されている（スカトルド
等、「カレント・ジェネティクス」12（５）、337−348
頁、1987年）。

第９図に示されている反応式に従い、ペニシリン生合成
の最終段階、すなわちイソペニシリンＮのアシル決転移
または６−APAへのその開裂およびペニシリンへのその
アシル化を触媒するPATは、既に以前に（上記参照）ペ
ニシリン生産菌株において同定されており、その多価触
媒的機能性も記載されているが、それは非常に不安定で
あるため、現時点ではまだ、注目に値するほど純粋には
単離され得ず、構造による特性検定も不可能である。非
常に不安定で微酸性であり、40〜100時間の発酵中にペ
ニシリウム・クリソゲヌムのペニシリン形成株において
多量に形成されるチオール依存性PATは、一方では補酵
素Ａ活性化発酵性側鎖（例、疎水性前駆物質フェノキシ
酢酸、フェニル酢酸、ヘキサン酸、オクタン酸などのア
シル−補酵素Ａ−化合物）の天然ペニシリン類（例、イ
ソペニシリンＮ、ペニシリルＶ、ペニシリンＧ、６−AP
A等）へのアシル基転移を触媒し、他方では天然ペニシ
リンどうしのアシル基転移を触媒する、すなわちアシル
基転移の間、アシル酵素複合体によって、アシル供与体
およびアシル受容体としての両方の天然ペニシリン機能
を発揮するが、補酵素Ａ活性化疎水性前駆化合物の方は
ただアシル供与体として酵素反応に入り得る。アシル転
移は水性媒質中で行なわれるため、求核剤としての水は
またアシル酵素複合体と競合し、それによりエネルギー
に富むアシル供与体は単に加水分解的に開裂され得る。
すなわち、６−APA、天然ペニシリンのβ−ラクタム核
は、常にペニシリン発酵物の培養ブロスにおいて見出さ
れる。

PATの検出は、慣用的分析方法、例えば放射能、微生物
またはクロマトグラフィーによる試験方法を用いて行な
われ得る。例えば酵素反応６−APA＋フェノキシアセチル−補酵素Ａ→ペニシリン
Ｖ＋補酵素A: を触媒する、PAPの６−APA−フェノキシアセチル補酵素
Ａ−アシル・トランスフェラーゼ活性を測定するため
に、次の３種の異なる試験方法を準備した。

ａ）特異的生成物−感受性試験株を用いた微生物寒天拡
散試験によるペニシリンＶの検出。例えば、マイクロコ
ッカス・ルテウスATCC9341は、６−APAに対する場合よ
りも小数点以下３位より大きい倍率でのペニシリンに対
する抗菌感受性を有する。

ｂ）S35−標識６−APAを用いる場合、β−カウンターに
おいて抽出可能なS35−ペニシリンＶの検出（S35−ペニ
シリンＧから酵素的）。

ｃ）抽出されたペニシリンＶのHPLCによる検出。

酵素的アシル基転移反応は、下記混合物を用いてマイク
ロタイター・プレートで行なわれる。

６−APA（反応緩衝液中2.5mg/ml） 20μ PaCoA（再蒸留水中約15−20mg/ml） 30μ 酵素または反応緩衝液（0.1モル燐酸緩衝液pH7.8、１ミ
リモルDTT含有） 150μ 直後に、または１時間の一定したインキュベーション期
間内の様々な時点で、20μのアリコートを各々採取
し、次に同じマイクロタイマー・プレート中で50％水性
エタノール（＝酵素反応の停止）により1:5または5U/ml
のペニシリナーゼ（＝β−ラクタム対照）により1:5に
希釈し、マイクロコッカス・ルテウスATCC9341またはラ
クタム−超感受性株シドモナス・エルギノサBC248を播
種（播種率0.5％、ディフコの抗生物質培地１、１ウェ
ル当たり50μ、37℃でインキュベーション15時間）し
た試験プレートにおける寒天拡散試験でペニシリンＶに
ついて試験した。

様々な時点で、アリコートを酵素的アシル基転移調製物
（総体積2mlを有する上記と同じ混合物）から採取し、
次に、pH2（HCl）でジイソプロピルエーテルにより抽出
し（1:1）、窒素により有機相を濃縮し、残留物を同体
積の反応緩衝液に再懸濁し、HPLCによりペニシリンＶに
ついて試験した（PaCoA有量測定に関する条件、ただし
溶離剤として0.025モル燐酸緩衝液pH7.0中40％メタノー
ルおよび60％0.01モルTBASを使用）。

保持時間（分）フェノキシ酢酸 1.10 ペニシロン酸Ｇ 1.62 ペニシロン酸Ｖ 1.92 ペニシリンＧ 3.00 ペニシリンＶ 4.92 ３−デスアセトキシセファロスポリンＶ 2.46 セファロスポリンＶ 3.24 同様の方法で、多特異性PAT酵素の他の活性はHPLCによ
り測定され得る。この場合、極性基質または生成物の溶
離剤として、0.025モル燐酸緩衝液pH7.0中0.001モルTBA
Sを単独使用する。

保持時間（分）イソペニシリンＮ 1.67 ６−APA 4.00 DTT（還元） 2.41 DTT（酸化） 4.60 イソペニシリンＮは、吸着樹脂（DIAION HP20）および
逆相クロマトグラフィー（ヌクレオシルC18、10μｍ）
を用いることにより、前駆体を欠くペニシリン発酵物か
ら回収され得る。

酵素調製物によっては、多特異性生合成酵素の実際の活
性が検出される指示反応の選択に特に注意を払わなけれ
ばならない。例えば、粗酵素調製物に存在する妨害活性
は、急速にフェノキシアセチル−補酵素Ａ（＝PaCoA）
およびペニシリンＶを加水分解し、またエネルギーに富
む側鎖誘導体PaCo_-を有する６−APAをペニシリンＶにア
シル化する（これは、例えば既知蛋白質分解酵素、例え
ばキモトリプシンが触媒する）ため、この粗抽出物にお
けるPATの指示反応として６−APA−フェノキシアセチル
−補酵素Ａアシルトランスフェラーゼ活性を用いること
はあまり有益ではない。しかしながら、これらの干渉活
性は、実際のチオール依存性PATとは明確に区別され
る。それらは、例えば異なるクロマトグラフィー溶離作
用、安定性プロフィールおよび阻害パターンを有する。
これらの干渉妨害活性は、一方では粗調製物で先に見出
された非常に低い特異的PAT活性（約１−10μU/mg蛋白
質）、並びにまた、酵素希釈率が増加すると、粗抽出物
における６−APA−PaCoA−アシルトランスフェラーゼ活
性も最大活性まで大きく増加するという、逆説と思われ
る発見を説明する。PAT検出における本質的因子は、高
酸化感受性SH−酵素を活性化または安定化させる還元性
化合物、例えばジチオトレイトールまたはβ−メルカプ
トエタノールの存在である。

また、PATは温度に対する不安定性が高いため、酵素精
製はかなり困難である。例えば、新たに製造した酵素調
製物でも、様々な安定剤（例、５ミリモルのジチオトレ
イトール＋５％ソルビトール＋0.1ミリモルのフェニル
メタンスルホニルフルオリド）の存在にも拘わらず、37
℃での１時間の一定したインキュベーション後には全チ
オール依存性６−APA−PaCoAアシルトランスフェラーゼ
活性を失う。従って、酸化を防ぎながら４℃の冷却実験
室で全精製作業を行うのが適切である。粗製の精製前酵
素溶液は、あまり活性を失わずに安定剤の存在下で数週
間冷凍され得る（−196℃、−20℃）。しかしながら、
その場合、幾つかの冷凍交換段階により、すぐにPAT活
性は不活性される。また、硫酸アンモニウム沈澱物は、
前記安定剤混合物の存在下では４℃で数日または数週間
多かれ少なかれ安定している。

若いペニシリン陽性ペニシリン菌糸体からは、この発明
で使用されるPATの精製方法により、菌糸体の分解、核
酸沈澱、蛋白質沈澱、疎水性相互作用およびアフィニテ
ィー・クロマトグラフィー後に、酵素反応速度または蛋
白質化学特性検定に必要とされる、比較的安定した少な
くとも50％活性の酵素調製物が得られる。比較的貯蔵可
能な蛋白質沈澱に対する後処理は、慣用的精製方法、例
えば高圧ホモジナイザーもしくはガラス製ボール−ミル
による細胞分解またはセチルトリメチルアンモニウムブ
ロミド、ストレプトマイシン・スルフェートもしくはプ
ロタミン・スルフェートによる核酸沈澱により行なわれ
得る。蛋白質沈澱の場合、中でも硫酸アンモニウムが適
しており、検出可能なPAT活性を全て沈澱させるには50
％飽和度で充分である。硫酸アンモニウム沈澱から出発
すると、チオール依存性PATは、疎水性相互作用により
フェニルセファロースCI4Bに結合する。90％を越えるバ
ラスト蛋白質の除去後、生成物を、低イオン強度の安定
剤水溶液で溶離し、10kDカット・オフ限外ろ過膜により
濃縮し、さらに好ましくはアフィニティー・クロマトグ
ラフィーまたは別法としてアニオン交換クロマトグラフ
ィー（DEAE−セファロースFF）によるゲルろ過工程（ウ
ルトロゲル・アカ54）または吸着クロマトグラフィー
（ヒドロキシルアパタイト）により精製すると、少なく
とも50％の活性酵素調製物が形成される。これは、硫酸
アンモニウム沈澱に基づくと約10000濃度係数に相当す
る。

常用のマクロ多孔性担体材料、例えばセファロース、セ
ルロース、ポリマー性材料、安定化シリカゲル、酸化ア
ルミニウム等は、親和性マトリックスとして使用され得
る。C₂〜C₁₀スペイサーにより担体に結合、またはスペ
イサーの非存在下で担体と共有結合、または疎水性もし
くはイオノゲン相互作用により担体に結合する適当な親
和性リガンドは、好ましくはアシルまたはアミノ−β−
ラクタム化合物である。これらのリガンドのスペイサー
またはマトリックスへ結合は、リガンドの結合部位が精
製すべき酵素に接近し得る状態のままであるように行な
われなければならない。この発明によると、特に強い精
製効果は、特に、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキ
シ−1,2−ジヒドロキノリン（EEDQ）により結合する、
末端アミノスペイサーを有する親和性マトリックス、例
えばAH−セルロース4BまたはHMD−ウルトロゲル・アカ3
4、リガンド、例えば天然ペニシリン類、好ましくは６
−APA、ペニシリンＶもしくはペニシリンＧまたは類似
した安定性３−デスアセトキシセファロスポリン化合
物、例えば７−アミノ−３−デスアセトキシセファロス
ポラン酸（７−ADCA）または７−フェノキシアセトアミ
ド−もしくは７−フェニルアセトアミド−３−デスアセ
トキシセファロスイポラン酸（３−デスアセトキシセフ
ァロスポリンＶおよびＧ）により示される。すなわち、
アミノ−β−ラクタム親和性マトリックスは、エシェリ
ヒア・コリの可溶性ペニシリンＧ−アシラーゼによる高
価な保護基工業技術を用いなくても対応するフェニルア
セトアミド−β−ラクタムマトリックスから生成され得
る。

酵素製造に必要とされる微生物は、常用のペニシリン形
成用栄養培地において培養される。栄養培地の適当な成
分は、真菌培養に一般に使用されている全ての基質であ
る。これらの栄養素に加えて、微生物の成長を促進し、
PAT活性を高める添加剤を適当に組み合わせて使用する
ことができる。添加剤は、例えば硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸塩および同様の無
機塩類並びに成長促進物質、ビタミン類および微量元素
である。様々な誘導物質、好ましくはフェノキシ−もし
くはフェニル酢酸およびそれらの誘導体もしくは類縁体
を加えることにより、達成される酵素力価はかなり増強
され得る。

培養は、主として好気性条件下15〜35℃の温度範囲およ
び４ないし８のpH値で行なわれる。培養ブロスが最大酵
素活性に到達するのに要する時間は、使用される微生物
のタイプにより異なるため、最適培養時間は好ましくは
個々の株ごとに別々に評価する。一般に、培養の持続時
間は、好ましくは２〜５日の範囲である。アシル基転移
の場合、培養ブロスまたはそこから製造される活性二次
調製物が使用され得る。それらの活性二次調製物の例と
しては、培養ブロスから回収および洗浄された非修飾ま
たは透過化細胞、菌糸体の物理的、化学的および酵素的
処理により得られる細胞不含有抽出物（例えば、菌糸体
の分解または超音波処理により得られる細胞ホモジネー
ト、および表面活性物質または酵素による処理により形
成される細胞リゼイト）、慣用の酵素精製方法、例えば
塩析、分別沈澱、透析、ゲルろ過、イオン交換−、吸着
−およびアフィニティー−クロマトグラフィーを要いて
細胞不含有抽出物を精製することにより得られる所望の
酵素の部分または全体精製調製物、酵素または非修飾ま
たは透過化細胞を、吸着、共有結合形成、架橋、収納ま
たは封入手段により水不溶性高分子量担体物質を用いて
物理的または化学的に固定させる方法で得られる安定化
PAT調製物がある。

生成した上記酵素濃縮物の酵素的または物理化学的特性
検定は、古典的方法、例えばクロマトグラフィー、電気
泳動、基質特異性に関する研究、Ｎ−末端配列決定、活
性および安定性に関するpHおよび温度プロフィール、活
性化、阻害および安定化の試験等を用いて行なわれ得
る。

多くの遺伝子単離方法が存在する。一般的概説は、ワト
ソン等（レコンビニエルテDNA−アイン・アインフュー
ルング、ハイデルベルグ、1983年）およびウィナッカー
（ゲーネ・ウント・クローン−アイン・アインフュール
ング、ゲンテクノロジー中、バインハイム、1984年）の
著書に記載されている。pat−遺伝子（酵素PATの遺伝
子）の場合、必要なアミノ酸配列が存在するため、合成
DNA−プローブの使用が最も有意義であると思われる。
遺伝子コードに基づくDNA配列は、PATのポリペプチド１
のアミノ酸配列から誘導され得、対応するオリゴヌクレ
オチドは、化学的に合成され得る。第５図は、PATのポ
リペプチド１のアミノ酸基２〜22の配列を示す。２、
３、４または６個のコドンが数個のアミノ酸に割り当て
られるため、結果的にアミノ酸配列下に与えられたヌク
レオチド配列が形成される。この場合16のみの相異なる
遺伝子配列が可能であるため、例えばアミノ酸残基16〜
21に対する部分が特に適している。RNAに相補適である
これらの16オリゴヌクレオチドは、各々４個のオリゴヌ
クレオチドを有する４種の混合物（第５図におけるオリ
ゴヌクレオチド混合物１、２、３および４）として合成
され得る。これらのDNA配列と非常に類似したさらに別
のDNA配列が、ペニシリウム・クリソゲヌムのゲノムに
形成されているため、遺伝子のさらに確かな同定は、恐
らくこれらのオリゴヌクレオチドによっても為され得な
いと思われる。これらの様々なDNA配列間の区別は非常
に複雑であり得る。従って、トレーサー配列として利用
可能なさらに別のオリゴヌクレオチドが要望されてい
る。

DNAプローブを用いた遺伝子単離戦略は、レイズ（「ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」183、
１−12、1985年）により検討されている。例えば、ある
種のコドンまたはある種のジヌクレオチド系列の頻度に
関する情報が知られている場合、さらに長いDNA配列が
合成され得る。ペニシリウム・クリソゲヌムの場合、そ
のような情報は利用できない。これにも拘わらず、プロ
ーブとしてさらに長いオリゴヌクレオチドを得るため
に、利用可能なオリゴヌスレオチドが配列決定プライマ
ーとして使用され得る。酵素「逆転写酵素」は、所定の
RNAに相補適なDNA鎖を合成して得るが、ただし適当なス
ターター分子（＝プライマー）が存在する場合のみであ
る。上記の場合、オリゴヌクレオチド混合物１〜４はプ
ライマーとして使用され得る。すなわち、調製物には多
くの他のmRNAが存在するが、pat−mRNAのみの配列決定
が可能である。配列決定反応は、塩基−特異性鎖−破壊
試験（ジデオキシヌクレオチド・トリホスフェート）の
存在下で行なわれる。すなわち、多くの延長されたオリ
ゴヌクレオチドが製造され、そのゲル電気泳動分析によ
り、pat−mRNAに相補的なDNAの塩基系列の測定が行なわ
れる。この方法の利点は、得られた配列情報により新し
いオリゴヌクレオチドが直接合成され得ることである。
さらに、非常に重要なのは、この配列が、アミノ酸配列
から誘導される配列と同じでなければならないことであ
り、確実にpat−特異的配列が実際に存在することであ
る。

次に、遺伝子の現実の単離は、遺伝子バンクから行なわ
れ得る。遺伝子バンクは、各々ペニシリウム・クリソゲ
ヌムのDNAの小部分を含む組換えDNAベクターのコレクシ
ョンである（λ−EMBL3遺伝子バンクの場合、これは、
１組換え分子につき約0.05％である）。プラーク・ハイ
ブリダイゼーションにより、λ−クローンは単離され
得、これらは放射能標識DNAプローブとハイブリダイゼ
ーションする。物理的地図は、これらのクローンのDNA
から製造され得る。その制限地図は、配向決定の補助と
して機能し得る制限エンドヌクレアーゼ交差部位の配置
を示す。DNAハイブリダイゼーション技術に用いると、D
NAプローブがハイブリダイゼーションするDNAの部分領
域を測定することができる。対応する部分フラグメント
は、プラスミド−またはバクテリオファージ−ベクター
分子に組み込まれ、さらに分子遺伝子方法により特性検
定される。次に、DNA断片をベクターM13mp19ヘクローン
化することにより、DNA配列の決定が可能となり、それ
によってat−特異的DNAプローブがプライマーとして使
用され得る。さらにDNAの配列決定により、遺伝子の暗
号化部分およびそこから誘導されたPATのアミノ酸配列
を確認することができる。既に決定されたアミノ酸部分
配列は、必要な情報を提供し得る。

DNA配列情報に基づき、ペニシリウム・クリソゲヌムのp
at−遺伝子は発現ベクターに組み込まれ得、よく知られ
た発現生物体へのPATの良好な発現が可能となる（レツ
ニコフおよびゴールド、「マクシマイジング・ジーン・
エクスプレッション」、ボストン、1986年）。ATGが正
確にエシェリヒア・コリ出発コドンの位置に来る形であ
る正確な構築を可能にするため、Ncol交差部位を部位突
然変異により導入することができる。しかしながら、こ
の前に、完全なcDNAクローンが対応する遺伝しバンクか
ら単離されなければならない。実施例19（第７図も参
照）は、プラスミドpBC2001の構築の詳細を記載してい
る。これを実施するため、まず第一にpat−cDNA−クロ
ーンからのDNAフラグメントをM13mp19にクローン化す
る。すなわち、部位突然変異においてNcol交差部位、さ
らにクローニングに必要なHind III交差部位の導入に使
用される一本鎖DNAが利用可能である。Ncol−Hind−III
−フラグメントがベクターpKK233−２に組み込まれた場
合、プラスミドpBC2001が製造される。それは、エシェ
リヒア・コリ選択指標として、エシェリヒア・コリにお
ける発現に有効なシグナル（ptcr、rrnBT1T2）およびア
ンピシリン耐性遺伝子（bla）を含む。

pat−遺伝子のDNAは、ペニシリウム・クリソゲヌムまた
は他のβ−ラクタム生産微生物の形質転換を可能にする
ベクターに組み込まれ得る。形質転換体は導入されたDN
Aの幾つかのコピーを含むことが多いため（例、コラー
等）、遺伝子のさらに強力な発現が可能であり、ペニシ
リン形成が増強され得る。実施例20は、プラスミドpBC2
002の構築を記載しており、それはペニシリウム・クリ
ソゲヌムの形質転換に使用され得る。pBC2002（第８図
も参照）は、修飾ベクターpHS103に組み込まれた、4.8k
bのSal1制限フラグメント上に完全なペニシリウム・ク
リソゲヌムpat−遺伝子を含む。フレオマイシン耐性遺
伝子（ble）は、ペニシリウム・クリソゲヌムにおける
選択を可能にする。アソピリシン耐性遺伝子（bla）
は、エシェリヒア・コリにおける選択を可能にする。

さらに、DNAの操作は可能である。同様に、プロモータ
ー・セグメントを交換すると、ペニシリウム・クリソゲ
ヌムにおける転写が改善され得る。ATGの部位突然変異
は、ペニシリウム・クリソゲヌムにおける翻訳を増加さ
せ得る。部位指向的またはフラグメント特異的−非指向
的であるが遺伝子特異的−突然変異により特定のアミノ
酸基を交換すると、酵素の安定性またはその活性もしく
は特異性を変化させる特定の突然変異体を単離すること
ができる。

無作為または作為的に選択された微生物のスクリーニン
グ（放射性pat−DNAとの特異的ハイブリダイゼーション
についてそれらの微生物のDNAを調べる）はまた、単離
されたDNAセグメントの明らかな用途である。そのスク
リーニングの結果は、以前に未知のβ−ラクタムを生産
した株、またはPAT類似酵素を含むが他の特性を有する
株であり得る。

この発明のDNAは、ペニシリウム・クリソゲヌムから単
離された。その方法は実施例10〜13に記載されており、
第４、５および６図に示されている。PATのポリペプチ
ド１のアミノ酸配列から出発して（第５図）、４つのオ
リゴヌクレオチドを合成し（第５図：オリゴヌクレオチ
ド混合物１〜４、第6C図）、これらを配列決定プライマ
ーとして使用する（実施例11）。こうして決定された配
列の最初の29塩基（第6D図）は、過程されたpat−mRNA
配列と同じである（第6B図）。この形質転換の結果とし
て、30量体が合成され（第6E図）、これをペニシリウム
・クリソゲヌム遺伝子バンクからのλクローン単離にお
ける放射性プローブとして使用した（実施例12および1
3）。M13ベクターへのサブクローニング後、DNAの配列
決定を行った（第6F図）。この配列の最初の77塩基は、
mRNAに相補的な配列の塩基35〜111と同じである（第6D
図）。これらの個々の配列間の関係は、pat−遺伝子が
実際に単離されたことを立証している。

PATは約38000ダルトンの分離量を有する。110ダルトン
の平均アミノ酸分子量からは、遺伝子の暗号化部分につ
いて1100bpのサイズが予測され得る。フィラメント状菌
の遺伝子は普通数個のみ、次いで小さなイントロンを含
むため（バランセ、「イースト」２、229、1986年）、
完全な遺伝子は記載されたDNA分子上に存在すること、
および同様に制御領域が完全形態で存在することが推測
され得る。

以下、実施例によりこの発明の説明を行うが、限定的な
ものではない。実施例において、省略形ml、、mg、
ｇ、rpm、DS、WV％およびＵは、ミリリットル、リット
ル、ミリグラム、グラム、１分当たりの回転数、乾燥物
質、重量／体積パーセントおよび国際酵素単位（１国際
酵素単位＝１マイクロモル基質／分）を表す。重量部は
mlに対するｇとして体積部に関するものであり、温度は
摂氏で与えられている。生成物の特定検定は、次の技
術、すなわち高性能薄層クロマトグラフィー（HPTL
C）、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、紫外線分
光測光法（UV）、赤外線分光測定法（IR）および核磁気
共鳴（NMR）を用いて実施された。実施例において列挙
された株名称に付け加えられた番号は、株自体が寄託さ
れているそれらの培養コレクション、例えばATCC（アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション・ロックビ
ル、メリーランド、アメリカ合衆国）の登録された株記
号に対応する。

フェノキシアセチル−相酵素Ａ（PaCoA）の製造および
分析：原理：補酵素Ａ＋フェノキシ酢酸塩化物→PaCoA 氷で冷やしながら、901mgのCoAを15mlの再蒸留水に溶か
し、水酸化ナトリウム（2.56mlの1N−NaOHおよび1.60ml
の0.5N−NaOH）によりpH7.0にセットする。続いて、合
計235mgのフェノキシ酢酸塩化物を激しく攪はんしなが
ら分けて加え、pH値を7.0に保つ（1.8mlの1N−NaOH）。
氷で冷やしながら１時間攪はん後、溶液を３回抽出し
（毎回40mlのジエチルエーテルにより、pH2.0（６また
は1N−HCl）で）、次いで水相をNaOHにより中和し、残
留エーテルを回転蒸発器において室温で除去し、混合物
を短時間窒素によりガス処理し、次いで再蒸留水により
1:50に希釈し、500μの分量でアンプルに詰め、液体
窒素中で冷凍する。HPLCを用いて分析を行い、フェニル
アセチル−補酵素Ａ（PeCoA）を標準として使用する。

HPLCシステム:HP1090液体クロマトグラム（ヒューレッ
ト・パッカード）カラム：ハイパージルODS5μｍ、C18、150×200mm 積分器：モデル3392（ヒューレット・パッカード）/ATT
3 流速:0.5ml/分検出:230nm 溶離剤:35％メタノール 65％0.01モルの硫酸テトラブチルアンモニウム（TBA
S）、0.025モル燐酸緩衝液pH7.0中評価：実施例１酵素活性バイオマスの製造。

ペニシリウム・クリソゲヌムP2/ATCC48271の凍結乾燥胞
子を含むアンプルの内容物を、8mlの媒質Ａ（１リット
ル当たりの組成：ラクトース15g、コーンスティープ・
リカー（とうもろこしの浸漬液）からの窒素0.11g、5g
のビッテ・ペプトン、4gのNaCl、0.5gのMaSO₄・7H₂O、
0.6gのKH₂PO₄、5mgのFeCl₃・6H₂O、2mgのCuSO₄・5H₂O、
蒸留H₂Oを適量加えて全部で1000ml、pH4.85、殺菌:120
゜で20分間）に懸濁する。225mlの大麦を含む２のエ
ルレンマイヤー・フラスコに、この胞子懸濁液2mlを播
種する。満たす前に、透明になるまで大麦を水で洗浄
し、20〜30分間媒質Ａ中で膨張させ、ふるいによりろ過
し、約１時間ろ紙上で乾燥し、続いて２のエルレンマ
イヤー・フラスコ中225mlに満たし、次いで１日間隔で
約１時間100゜で３回滅菌し、播種前に40〜45゜で２日
間で乾燥する。胞子を播種後、エルレンマイヤー・フラ
スコを短時間振り混ぜ、次に約８日間24±１゜および相
対湿度60±10％でインキュベーションする。

この一定したインキュベーション期間後、菌胞子を、垂
直アジテーターにおいて３〜５分間140rpmで250mlの0.9
％NaCl＋0.1％トウィーン80に再懸濁する。さらに250ml
の0.9％NaCl溶液（トウィーンは含まず）を加えた後、
胞子懸濁後を１の播種キャニスターに無菌状態で静か
に注ぐ。各々200mlの媒質Ｂ（１リットル当たりの組成:
9gのフェノキシ酢酸カリウム、150gのラクトース水和
物、医薬媒質としての窒素2.25g、10.5gの（NH₄）₂S
O₄、4gのNaSO₄、0.5gのKH₂PO₄、10mlの動物油（ラード
油）、25gのCaCO₃、蒸留H₂Oを適量加えて全部で1000m
l、pH6.5、殺菌:120゜で20分間）を含む50本の２エル
レンマイヤー・フラスコに、４゜で約１箇月間貯蔵され
得るこの播種材料8mlを各々播種し、次いで25±１゜で
３日間260rpmで震とうする。この震とうインキュベーシ
ョン後、1820gの酵素活性バイオマスが採取される。ペ
ニシリン力価は、パルプ（軟塊）１リットル当たりペニ
シリンV1.9gである。

実施例２酵素活性粗酵素調製物の製造。

実施例１で得られた1786gの湿った菌糸体（＝220gDS）
を、５ミリモルのジチオトレイトール（DTT）、0.1％ト
リトンX100および0.1ミリモルのフェニルメタンスルホ
ニルフルオリド（PMSF）を含む3.5の0.1モル燐酸緩衝
液（pH7.5）に再懸濁し、ガラス製ボール・ミル中（510
mlの500−750μｍガラス粒（パール）を有する600mlの
鋼製粉砕容器、回転速度2000rpm、摩擦ギャップの幅0.1
mm、流速30／時、前進移動２〜３゜、回帰移動５゜、
前進移動−20/8゜および回帰移動−5/−１゜で食塩水冷
却）2/3゜に冷却しながら連続的にホモジネートする。
続いて、このホモジネートを15000rpmおよび４゜で30分
間遠心分離し、上清を０゜で0.5WV％のセチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド（CTAB）と混合し、30分間攪は
んする。沈澱した核酸を遠心分離（10分間、15000rpm、
４゜）により分離し、固体硫酸アンモニウムを加えるこ
とにより上清を50WV％の飽和度にし、４゜で一夜保つこ
とにより、蛋白質沈澱を完了させる。次いで、沈澱を遠
心分離し、冷飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、5WV
％のソルビトール、５ミリモルのDTT、２ミリモルのEDT
Aおよび0.1ミリモルのPMSFを加えた後、次のクロマトグ
ラフィー工程まで４゜で貯蔵する。蛋白質測定（ブラッ
ドフォード）または活性測定（ランダム−超感受性株シ
ュードモナス・エルギノサBC248による６−APA−PaCoA
−アシルトランスフェラーゼ活性の微生物学的検出）を
用いて、分解または２つの沈澱工程が行なわれる。実測
値を第１表に列挙する。

実施例３阻害剤の追加を伴う場合または伴わない場合における酵
素調製物AS−沈澱でのアシル基転移活性またはペニシリ
ンＶ開裂活性の微生物学的検出。

阻害剤を追加する場合または追加しない場合における、
PaCoAによる６−APAまたはイソペニシリンＮのアシル基
転移およびカリウム・ペニシリンＶの開裂に関する微生
物学的寒天拡散試験において次の要領により、実施例２
の記載に従い製造された粗酵素調製物を試験する。

試験生物体：マイクロコッカス・ルテウスATCC/BC85、
0.5％播種試験培値：抗生物質培値１（ディフコ）、110ml 試験プレート：ヌンク243×243×18mm 試料:1ウェル当たり50μ（直径6mm）インキュベーション:37゜、15時間酵素:AS−沈澱（実施例２の記載に従い製造された）:1m
lを遠心分離（20000rpm/10分）、上清を廃棄、沈澱物を
20mlのRP＋Ｚに再懸濁。

RP＋Z:0.1モル燐酸緩衝液pH7.5＋１ミリモルDTT＋10ミ
リモルMgCl₂。

A.アシル基転移／アシル化マイクロタイマー・プレートにおける製造：基質６−APAまたはイソペニシリンＮ（2.5mg/ml） 10μ
PaCoA（約15mg/ml） 15μ 阻害剤の使用下または不使用下での酵素またはRP＋Ｚ75
μ 阻害剤:a）阻害剤不使用（＝対照）ｂ）２ミリモルのヨードアセトアミドｃ）２ミリモルのPMSF インキュベーション時間の直後および／または７、30お
よび60分後、20μアリコートを沈澱物から採取し、50
％エタノールにより1:5に希釈し（酵素反応停止）、寒
天拡散試験においてペニシリン含有量について試験す
る。

PaCoA（HHφmm）によるイソペニシリンＮ（＃28および3
6）のアシル基転移酵素希釈率により異なるPaCoAによる６−APAのアシル化 B.ペニシリンＶ開裂マイクロタイマー・プレートにおける製造：カリウム・ペニシリンＶ 100μg/ml 10μ 0.1モル燐酸緩衝液pH7.5 15μ 酵素またはRP＋Ｚ（＋阻害剤） 75μ ａ）阻害剤不使用（＝対照）ｂ）＋２ミリモルのヨードアセトアミドｃ）＋２ミリモルエチルマレインイミドｄ）＋２ミリモルのPMSF ｅ）RP＋Ｚ様々な阻害剤の存在下におけるカリウム・ペニシリンＶ
（HHφmm）の開裂。

比較としてのアシル基転移実施例４ PATの活性化、阻害、安定化およびpHプロフィール。

実施例２の記載に従い製造されたPAT−硫酸アンモニウ
ム沈澱を、様々な活性剤または阻害剤または安定剤の存
在下、0.1モル反応緩衝液により1:10に希釈し、微生物
学試験モデルにおいて直後または４゜または−20゜で１
日インキュベーション後に、６−APA−PaCoAアシルトラ
ンスフェラーゼ活性について試験する。結果を第２表に
要約する。

実施例５ PATの温度安定性。

実施例２の記載に従い製造されたPAT−硫酸アンモニウ
ム沈澱を、１または10ミリモルのDTTを含む0.1モル燐酸
緩衝液pH7.5により1:20に希釈し、次に厳密に遠心分離
し、上清を、−196゜、−20゜、＋４゜、＋20゜および
＋37゜での一定したインキュベーションに付し、微生物
学試験モデルにおいて直後または１、４、26および120
時間後に６−APA−PaCoAアシルトランスフェラーゼ活性
について試験する。結果を第７表に列挙する。

実施例６フェニルセファロースC1−4Bにおける疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー（HICフロー）および６−APA−AH−セ
ファロース4Bにおけるアフィニティー・クロマトグラフ
ィー（アフィニティー・フロー）によるPATの精製。

実施例２の記載に従い製造されたPAT−硫酸アンモニウ
ム沈澱240gを、１モル（NH₄）₂SO₄および１ミリモルDTT
を含む50ミリモル燐酸緩衝液（pH7.5）2000mlに溶か
し、＋４゜での実験用冷却チャンバ中、200mlの平衡状
態のフェニルセファロースC1−4Bを仕込んだBP113−カ
ラムに加える。続いて、カラムを、流速50ml/分で１モ
ル（NH₄）₂SO₄および１ミリモルDTTを含む３基礎容量の
50ミリモル燐酸緩衝液pH7.5により洗浄し、次いで、１
ミリモルのDTTを含むさらに２基礎容量の50ミリモル燐
酸緩衝液pH7.5によりバラスト蛋白質を除去し、次い
で、１ミリモルDTT含む３基礎容量の脱イオン水（Ｅ−H
₂O）によりPAT−酵素を溶離し、活性フラクションを、1
0kDのカット−オフを有するポリスルホン限外ろ過膜を
用いてペリコン・カセット・システム中で10分の１の容
量に濃縮し、1WV％ソルビトール、５ミリモルのDTT、２
ミリモルのEDTAおよび0.1ミリモルのPMSFにより安定化
させ、次のクロマトグラフィー工程まで−20゜で冷凍す
る。微生物学的に確立された６−APA−PaCoA−アシルト
ランスフェラーゼ活性および１基礎容量を含む個々のフ
ラクションの総蛋白質含有量を下表に要約する。

翌日、注意深い条件下でHICフラクションの活性保持物
質（retentate）を解凍し、50mlのアフィニティー・マ
トリックス６−APA−AH−セファロース4Bを含むK26/40
ファーマシア・カラムに加える。これは、LKB−記録
「プラクティカル・ガイド・フォー・ユース・イン・ア
フィニティー・クロマトグラフィー・アンド・リレイテ
ッド・テクニカス」、ルアクタフ・IBF−ソシエテ・キ
ミク・ポワンツ−ジラール、フランス1933、133頁に従
い、EEDQによりペニシリンＧをAH−セファロース4B（フ
ァーマシア）にカップリングし、続いてエシェリヒア・
コリの可溶性ペニシリンＧ−アミダーゼによりフェニル
酢酸を開裂することにより製造されたものであった。次
いで、カラムを、下記媒質により４゜および流速3ml/分
で溶離する。

AL278/1:12基礎容量の50ミリモル燐酸緩衝液pH7.5＋１
ミリモルDTT＋0.1モルNaCl AL278/2:3基礎容量の同緩衝液＋１ミリモルDTT＋0.1モ
ルNaCl＋１ミリモル６−APA AL278/3:6基礎容量の同緩衝液＋１ミリモルDTT＋１モル
NaCl＋１ミリモル６−APA 特異的溶離剤６−APAによりフラクション278/2において
溶離されたPAT活性を、10kDのカット・オフを有するポ
リスルホン−UF−膜を用いてミニタン・カセット・シス
テム中で10分の１の容量に濃縮し、再び安定性混合物1W
V％ソルビトール、５ミリモルDTT、２ミリモルEDTAおよ
び0.1ミリモルPMSFと混合し、分割して急速冷凍する。H
PLC測定により少なくとも50％純度であるこの酵素調製
物の基質特異性を、第４表に記録する。

実施例７モノP/ファーマシアにおけるアフィニティー・クロマト
グラフィーにより製造されたPAT酵素調製物のクロマト
フォーカシング（クロマトフォーカシングAL310）。

アフィニティー・クロマトグラフィーにより実施例６の
記載に従い精製され、濃縮されたPAT酵素調製物の1ml分
量を、注意深く解答し、次いで平衡状態のPD10セファデ
ックスG25充填カラムにおいて25ミリモルのビストリス/
HCl緩衝液（pH6.3）と緩衝液交換を行い、次いで同緩衝
液により平衡状態にされた4mlFPLCモノＰ充填カラムに
加え、すぐ後に流速60ml/時で1:10希釈ポリバファー74
（pH4.0に設定）100mmにより溶解し、次いでピークごと
に分画化する。これらのフラクションについては、最初
の形態またはセントリコン10により10倍濃縮して、PR
C、SDS−勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動、インモ
ビリンに基づく等電点電気泳動およびゲルろ過により分
析を行う。

第１図は、モノＰにおけるPAT−酵素の溶離プロフィー
ルを示す。多機能酵素は、少なくとも３種の等電形態
（PAT310/3、PAT310/4およびPAT310/5）に分解される。
異なる電荷を有するこれらの酵素変異型は、真のアイソ
ザイムまたは同じ酵素の異なる酸化還元形態を表し得
る。

第２図から明らかな通り、ペニシリウム・クリソゲヌム
のチオール依存性PATは、RPCの変性条件下で（カラム＝
バイオラド・ハイ・ポアRP304、250×4.6mm、PHLC−パ
ラメーター:0.5ml/分、45バール、280nm、40゜、25μ
注射容量、溶離剤A:0.01％トリフルオロ酢酸を含む35％
水性アセトニトリルおよび溶離剤B:0.01％トリフルオロ
酢酸を含む80％水性アセトニトリル間での一次勾配、30
分）、１つのポリペプチド１、並びにイソ−または酸化
還元−変異型によって、１種または２種の可変性疎水性
ポリペプチド変異型2aおよび2bに分解される。

SDS−勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第3a図参
照、レムリ、「ネイチャー」227、680−685頁、1970年
による条件、ただし、８−20％Ｔによる勾配ゲル）で
は、PAT−酵素は、約30および8kDの分子量を有する、様
々なサイズの２種のオリペプチドに分解される。RPCお
よび後続のSDS−勾配−PAGEを溶いると、RPCにおいて最
初に溶離されるポリペプチド１は、約30kD成分と同一で
あり、２種のさらに強力な保持された疎水性ポリペプチ
ド2aおよび2bは、8kDと同一であることが立証され得
る。さらに、その多次元分析により、SDS−勾配−PAGE
における小ポリペプチド2aおよび2bは同じ移動性を有
し、塩基性イソ−または酸化還元−変異型の大きい方の
約30kDポリエプチド１は、酸性の強い形態の対応するポ
リペプチド１よりも迅速に移動することが示され得る。

アンホリンに基づく等電点電気泳動（IEF）の間（第3b
図参照、LKBアプリケーション・ノート1804による方法
論的手法）、活性親和性プールは、5.1に等電点を有す
る互いに近接した３つの帯を示す。

インモビリンに基づく高度溶媒IEFの狭いpH範囲におい
ては（第3c図参照、LKBアプリケーション・ノート1819
による方法論的手法）、クロマトフォーカシングにより
分離されるPAT−変異型は5.15、5.06および5.32のpi−
値を有する。

ファーマシアのスーパロース12におけるゲルろ過により
分子量を測定すると（溶離剤:1ミリモルDTTを含む0.1モ
ル燐酸緩衝液pH7.5、0.4ml/分）、36.5kDの分子量が測
定され、またLKBのTKS−G2000SWでは（同じ溶離剤、0.5
ml/分）、38kDの分子量が測定される。これは２種の変
性ポリペプチド１および２の合計と但しく相関してい
る。

実施例８ポリペプチド１並びに2aおよび2bのＮ−末端配列決定。

実施例６の記載に従いアフィニティー・クロマトグラフ
ィーにより精製されたPAT酵素調製物の別の分量（2mg蛋
白質）を、注意深く解凍後（実施例７の場合と同じカラ
ムおよび条件、ただし、フラッター増加勾配：分／％、
Ｂ＝0/0、8/0、20/12、25/12、30/100、33/100、36/0、
40/0）、RPCにより２回分離し、ポリペプチド１並びに2
aおよび2bを含むフラクションを凍結乾燥し、蛋白質シ
ーケンサーにおいてＮ−末端配列決定を行う。

Ｎ−末端アミノ酸配列： 30kD単位／ポリペプチド1:部分配列１ 8kD単位I/ポリペプチド2a:部分配列６ 8kD単位II/ポリペプチド2b:部分配列６ SDS−勾配−PAGEの場合と同様、RPCにおいて異なる保持
性を有する小ポリペプチド2aおよび2bは、配列決定され
た分子部分において区別されない。

実施例９ポリペプチド１および２の蛋白質分解性ペプチド・フラ
グメントの配列決定。

実施例８の記載に従い製造されるポリペプチド１または
２の凍結乾燥フラクションを、J.M.ウィルキンソン
（「プラクティカル・プロテイン・ケミストリー−ア・
ハンドブック」、A.ダーブル編、1986年）に従いトリプ
シンまたはリシ−エンドペプチダーゼにより酵素的に開
裂し、個々のペプチド・フラグメントをRPCにより単離
し、蛋白質シーケンサーにおいて配列決定する。中でも
下記のアミノ酸部分配列が得られる。

AS−部分配列２（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列３（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列４（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列５（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列７（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列８（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列９（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列10（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列11（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列12（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列13（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列14（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列15（リシル−エンドペプチダーゼによるポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列16（リシル−エンドペプチダーゼによるポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列17（リシル−エンドペプチダーゼによるポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列18（リシル−エンドペプチダーゼによるポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列19（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列20（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列21（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列22（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列23（リシル−エンドペプチダーゼによるポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列24（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）：実施例10 ペニシリウム・クリソゲヌムの菌糸体からのポリ（Ａ）
⁺RNAの単離。

ペニシリウム・クリソゲヌムP2/ATCC48271の胞子懸濁液
を、250rpmでのアジテーターにおいて、約70時間25゜で
各々100mlのCDS−培地（１のCDS−培地の場合、オー
トクレーブ処理により、900mlの溶液A:3gのNaNO₃、0.5g
のMgSO₄・7H₂O、0.5gのkcl、0.1gのFeSO₄・2H₂O、5gの
酵母抽出物、10gのカゼイン・ペプトン、20gのサッカロ
ース、pH5.8および100mlの溶液B:250ミリモルのK₂HPO₄/
KH₂PO₄、pH5.8を混合する）を含む５本のエルレンマイ
ヤー・フラスコ（各々1000ml）中でインキュベーション
する。各々300mlのCDLP−培地（CDS−培地と同じ組成、
ただし、20gのサッカロースの代わりに、150gのラクト
ース／および50mlの10％フェノキシ酢酸「水に溶解、
KOHによりpH7.5に設定］）を含む12本のエルレンマイヤ
ー・フラスコ（各々1000ml）に、各々30mlの前培養物を
播種し、250rpmのアジテーター中25゜で40時間インキュ
ベーションする。ビュフナー漏斗を用いて菌糸体をろ過
し、TE（10ミリモルのトリス/HCl、pH8.1、１ミリモルE
DTA）により簡単に洗浄し、液体窒素中で微細粉末に粉
砕する。この粉砕を溶解緩衝液（５モルのグアニジ・モ
ノチオシアナート、10ミリモルEDTA、50ミリモリのトリ
ス/HCl、pH7.5、８％β−エルカプトエタノール）（湿
った菌糸体の塊1g当たり3ml溶解緩衝液）に懸濁し、室
温で１時間攪はんする。全RNAの単離は、記載された方
法（カサラ等、DNA2、329−335頁、1983年）に従い行な
われる。60gの湿った菌糸体の塊からは、約18gの粗RNA
が単離され得る。これをエタノールにより沈澱させ、−
70゜で貯蔵する。ポリ（Ａ）⁺RNAの濃縮は、マニアチス
等の記載（「モノキュラー・クローニング」、コールド
・スプリング・ハーバー、1982年）に従い、オリゴ（d
T）セルロース−アフィニティー・クロマトグラフィー
により行なわれる。この目的の場合、粗RNAを遠心分離
し、乾燥し、水に溶かす。クロマトグラフィー後、ポリ
（Ａ）⁺RNAを含むフラクションを再びエタノールにより
沈澱させ、−70゜で貯蔵する。ポリ（Ａ）⁺RNAの正常性
をグリオキサルの存在下でゲル電気泳動により試験し
（マニアチス等）、UV−吸収により濃度を試験する。

実施例11 酵素PATをコードするRNAの部分配列決定。

遺伝子コードを基礎として、DNA配列は、PATのポリペプ
チド１のアミノ酸配列から誘導される（実施例８）（第
５図）。最少数の異なる配列を可能にする17bpの範囲
を、オリゴヌクレオチド混合物の合成用に選択する。目
的とする鎖、すなわちまたRNAに相補的である４種の異
なるオリゴヌクレオチドの４種の混合物を合成する（第
５図にけるオリゴヌクレオチド混合物１、２、３および
４）。これらのオリゴヌクレオチドを酵素的に燐酸化
し、すなわち放射性標識する（マニアチス等）。15ngの
オリゴヌクレオチドを、30分間37゜で250μCiのATPを含
む12μの反応調製物（50ミリモルのトリス/HCl、pH9.
5、10ミリモルMgCl₂、５ミリモルDTE、５％グリセリ
ン）中、16単位のポリヌクレオチドキナーゼとインキュ
ベーションする（アマーシャムPB10218）。250ミリモル
のKCl、10ミリモルのトリス/HCl、pH8.3中10μｇのポリ
（Ａ）⁺RNA（実施例10）を、0.5mlの反応容器中で２μ
の32−Ｐ−標識オリゴヌクレオチド混合物と混合す
る。混合物を２分間75゜に加熱し、次いで45分間50゜で
温める。４つのエッペンドルフ容器の各々に、3.3μ
の反応緩衝液（24ミリモルのトリス/HCl、pH8.3、16ミ
リモルMgCl₂）、８ミリモルDTE、0.4ミリモルdATP、0.8
ミリモルdGTP、0.4ミリモルdCTP、0.4ミリモルdTTP、６
単位の逆転写酵素を加える。さらに各々は、１μの１
ミリモルdATPまたは１μの１ミリモルdGTPまたは１μ
の１ミリモルdCTPまたは１μの１ミリモルdTTPを有
する。２μのポリ（Ａ）⁺RNA−オリゴヌクレオチド混
合物を加えた後、エッペンドルフ容器の内容物を短時間
遠心分離にかけ、50゜で45分間加熱する。２μの停止
緩衝液（99％ホルムアミド、0.3％ブロモフェノール・
ブルー、0.3％キシレン−シアノール）を加え、３分間
沸騰させることにより、反応を終結させる。４μの各
試料を、８％ポリアクリルアミド／尿素ゲルに適用し、
40W（セキ・ゲン、バイオラド）で2.5時間暴露する。そ
の後、ゲルを20分間５％メタノール、５％酢酸中に置
き、80゜で１時間乾燥する。冷却したゲルを家庭用ホイ
ルに包む。Ｘ線フィルム（コダックXOマットAR）を20時
間適用する。このＸ線フィルムから読取られる配列を再
生する。

１〜29位は、PATのポリペプチド１のアミノ酸配列（第
５、6D図）から誘導されるDNA配列に相補的である。こ
の配列の最初の30ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチ
ドを合成する。

実施例12 ペニシリウム・クリソゲヌムのゲノム遺伝子バンクの構
築。

CDS−培地で洗浄したペニシリウム・クリソゲヌム培養
の菌糸体（実施例10）からDNAを単離する。菌糸体を液
体窒素中で粉砕し、次いで１％サルコシル、0.1モルEDT
A、pH8、100μｇプロテイナーゼK/ml（1g菌糸体/25ml）
に加え、37゜で48時間攪はんする。混合物をエタノール
で３回抽出し、0.1体積部の３モル酢酸ナトリウム（pH
5.2）を加えた後、エタノールにより沈澱させる。続い
て、CsCl−EtBr遠心分離を行い（マニアチス等）、イソ
アミルアルコールにより抽出し、TEで透析した後、UV吸
収により濃度を測定する。さらに、アガロース−ゲル電
気泳動によりDNAを試験する。300μｇのペニシリウム・
クリソゲヌムDNAを、U Sau3A（BRL）において37゜で60
分間10ミリモルのトリス/HCl、pH7.5、10ミリモルMgC
l₂、１ミリモルDTE、50ミリモルNaCl中で開裂する。開
裂の程度をアガロース−ゲルで試験する。DNAの大部分
は10ないし20kb間のサイズを有するのが望ましい。次い
で、DNAを２つのNaCl勾配（TE［10ミリモルのトリス/HC
l、pH8.0、１ミリモルEDTA］中20％6NaClを含む２本の
ベックマン−SW28.1超遠心分離管を冷凍、次いで解答す
ることにより製造）に適用し、ローターSW28.1中に置い
た超遠心機において14000rpmで16時間遠心分離を行う。
管の内容物を分画する。10kbよりも大きいDNAを含むフ
ラクションを合わせ、TEで透析する。DNAを濃縮（500μ
g/ml）後、それを、BmH1およびEcoR Iにより開裂してお
いたλ−EMBL3−DNA（フリシャウフ等、「ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー」170、827−832
頁、1983年）により精製する。0.5UのT4−DNA−リガー
ゼを加えた後、それを、30ミリモルのトリス/HCl、pH7.
5、10ミリモルMgCl₂、10ミリモルDTE、2.5ミリモルATP
中16゜で一夜ライゲーションする（DTE濃度200μg/ml、
ベクター対ペニシリウム・クリソゲヌムDNAのモル引1:
1）。このライゲーション混合物を、蛋白質抽出物
（「パッケージング・ミクシーズ」、マニアチス等）で
補助しながらインビトロ包装する。生成したλ−リゼイ
トを指示株NM539（フリシャウフ等）で適用する。10⁶pf
uが得られる。

実施例13 PAT−特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシ
ョンするλ−クローンの単離。

株NM538（フリシャウフ等）による、λ−EMBL3における
ペニシリウム・クリソゲヌム遺伝子バンク（実施例12）
の40000の組換えファージを、0.7％アガロース中90mmの
TB−プレート（TB培地は、１リットル当たり10gのバク
ト−トリプトンおよび5gのNaClを含み、NaOHによりpHを
7.5に設定する）に放す。これらのプレートの２つの型
（印象）をナイロン・フィルター（アマーシャム・ハイ
ボンドＮ−フィルター）上で作成する。DNAをUV固定し
た後、これらのフィルターをハイブリダイゼーションに
用いる。PATのポリペプチド１のアミノ酸配列から誘導
されるDNA配列に相補的な配列を有する、実施例11に記
載された30量体に、放射性標識を行う（実施例11記載の
T4−ポリヌクレオチド−キナーゼ反応）。６×SSPE（１
×SSPEは、0.15モルNaCl、10ミリモルNaH₂PO₄、１ミリ
モルでDETA、pH7.4である）、30％ホルムアミド、５×
デハード、0.1％SDS、100μg/mlニシン精子DNA、0.1ミ
リモルATP、3ng/ml32−Ｐ−標識オリゴヌクレオチド中3
7゜で約20時間ハイブリダイゼーションを行う。次い
で、フィルターを、２×SCC（１×SCCは、0.3モルNaC
l、0.03モルくえん酸ナトリウム、pH7.0である）、0.1
％SDSにより室温て10分間３回洗浄し、次に１×SCC、0.
1％SDSにより56゜で20分間３回洗浄し、乾燥後、オート
ラジオグラフィーを行う。Ｘ線フィルムにおける陽性ハ
イブリダイゼーション・シグナルに対応する、オリジナ
ル・プレートのアガロース層における領域を、滅菌した
パスツール・ピペットにより採取し、SM−緩衝液（5.8g
のNaCl、2gのMgSO₄・7H₂Oおよび50mlの1Mトリス/HCl、p
H7.5）に再懸濁する。また、指示株としてNM538による
適当な希釈物をTB−プレートに放す。これらのプレート
上のファージをナイロン・フィルターに移し、上記と同
様にハイブリダイゼーションする。対応する組換えλ−
ファージを、２番目に陽性シグナルを与えるプラークか
ら単離する。これらのファージの精製DNAは、制限分析
およびサザーン・ハイブリダイゼーションに使用され
る。さらに、プラスミド（pUC12、メッシング、「メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー」101、20、1983年）お
よびM13−ベクター（M13mp18、M13mp19、ノランダー
等、「ジーン」26、101、1983年）においてサブクロー
ニングを行う。オリゴヌクレオチドを有するM13mp19−
サブクローンの配列決定により、下記配列が与えられ
る。

RNAを用いて確かめられた（実施例11）DNA配列のヌクレ
オチド35〜111は、このDNA配列のヌクレオチド１〜77と
適合する（第6F図）。

実施例14 PAT遺伝子のDNA配列。

第４図において、このDNA配列の位置を２本の水平線に
より表す。１は最初にヌクレオチドに対応し、1972は最
後のヌクレオチドに対応する。

実施例15 PAT遺伝子のDNA配列。

このDNA配列では、このDNA配列の暗号化能力を有する実
験的に決定されたアミノ酸部分配列との比較により暗号
化領域を確立した。すなわち、この遺伝子には３つのイ
ントロンの存在することが示されている。さらに、それ
らは、イントロン−エクスロン一致配列（ランボセック
およびリーチ、「クリティカル・レビューズ・イン・バ
イオテクノロジー」６、357−393頁、1987年）により同
定された。

実施例16 DNAから誘導された、PATのアミノ酸配列。

このポリペプチドは、40000Dの分子量を有する。それが
アミノ酸基102および103間で開裂された場合、２種のポ
リペプチドが得られる。すなわち１つは、分子量11500D
でポリペプチド２のＮ−末端アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドである。ポリペプチド・フラグメントは全て再
びこのアミノ酸配列に見出され得る（AS部分配列９〜2
4）。すなわち、これは「PATの8kD合成」である。もう
１つは、分子量28500Dでポリペプチド１のＮ−末端アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドである。ペプチド・フラ
グメントは全て再びこのアミノ酸配列に見出され得る
（AS部分配列２、３、４、５、７、８）。すなわち、こ
れは「PATの30kD成分」である。

実施例17 実験的に決定されたアミノ酸配列とDNAから誘導されたP
ATのアミノ酸配列との比較。

30kD/ポリペプチド１（Ｎ−末端アミノ酸配列） AS部分配列２（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 GlyAlaThrLeuPheAsnIleIleTyrAspHisAlaArg 13 311 GlyAlaThrLeuPheAsnIleIleTyrAspHisAlaArg 323 AS部分配列３（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 11 333 ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 343 AS部分配列４（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 GluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnArg 11 258 GluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnArg 268 AS部分配列５（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 MetGluPheLeu_AspGlyPheAspGlyThrLys 12 272 MetGluPheLeuLeuAspGlyPheAspGlyThrLys 283 AS部分配列７（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 IleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 14 187 IleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArg 200 AS部分配列８（ポリペプチド１のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 8kD単位I/ポリペプチド2a 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGlu
HisGly 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGlu
HisGly SerAlaAlaLysAlaValIleAlaArgSerIleAspPheAlaValAsp 3
4 SerAlaAlaLysAlaValIleAlaArgSerIleAspPheAlaValAsp 3
4 8kD単位II/ポリペプチド2b 1 MetLeuHisIleLeyCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGlu
HisGly 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGlu
HisGly SerAlaAlaLysAlaValIleAlaArgSerIleAspPheAlaValAspLe
uIle SerAlal_laLysValIleAlaArg_IleAspPheAlaValAspLeu_ ArgGlyLysThr 40 _Gly_Thr 40 AS部分配列９（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 8 90 ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97 AS部分配列10（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 ThrTyrAnyGluIleArg 6 65 ThrTyrGluG1uIleArg 70 AS部分配列11（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 TrpProLys 3 62 TrpProLys 64 AS部分配列12（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 SerIleAspPheAlaValAspLeuIleArg 10 28 SerIleAspPheAlaValAspLeuIleArg 37 AS部分配列13（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 AspvalSerGluIleValMetLueAsnThrArg 11 79 AspvalSerGluIleValMetLueAsnThrArg 89 AS部分配列14（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 1 GlnValLeuSerGlnLeuGlyArg 8 49 GlnValLeuSerGlnLeuGnyArg 56 AS部分配列15（シリル−エンドペプチダーゼを含むポリ
ペプチド２のペプチド・フラグメント）： 6 CysGlnGlyThrProPheGlu 12 1 CysGlnGlyThrProPheGlu 7 AS部分配列16（シリル−エンドペプチダーゼを含むポリ
ペプチド２のペプチド・フラグメント）： 65 TyrTyrGluGluIleArgGlyIleAlaLys 74 1 TyrTyrGluGluIleArgGlyIleAlaLys 10 AS部分配列17（シリル−エンドペプチダーゼを含むポリ
ペプチド２のペプチド・フラグメント）： 49 GlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGluArgTrpProLy
s 64 1 GlnValLeuSerGlnLeuGlyArgValIleGluGlUArg_ProLys 1
6 AS部分配列18（シリル−エンドペプチダーゼを含むポリ
ペプチド２のペプチド・フラグメント）： 75 GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg 8
9 1 GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThrArg 15 AS部分配列19（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 23 AlaValIleAlaArg 27 1 AlaValIleAlaArg 5 AS部分配列20（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 42 LysThrAspGluGluLeuLys 48 1 Lys_AspGluGluLeuLys 7 AS部分配列21（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 71 GlyIleAlaLys 74 1 GlyIleAlaLys 4 AS部分配列22（ポリペプチド２のトリプチック・ペプチ
ド・フラグメント）： 57 ValIleGluGluArg 61 1 ValIleGluGluArg 5 AS部分配列23（シリル−エンドペプチダーゼを含むポリ
ペプチド２のペプチド・フラグメント）： 87 AsnThrArgThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97 1 AsnThr_ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 11 要約：実施例18 イソペニシリンＮシンテターゼ（ips）の遺伝子およびP
ATの遺伝子間に存在するDNAフラグメントの部分配列。

この配列は、ips遺伝子に存在する「GGATCC」、すなわ
ち制限遺伝子BamH1の認識配列から始まる。この遺伝子
の最後の34（Ｃ−末端）コドンを示す。それらは、公開
されたDNA配列との比較により同定された（カー等、
「ジーン」48、257−266頁、1986年）。中間領域の後
に、pat−DNA配列の１位が1442から続く。このDNA部分
配列を第４図において示す（Ｂ）。

ips−およびpat−遺伝子間の狭いカップリングを証明
し、またpat−遺伝子の転写および翻訳に不可欠な制御
要素全てがこのフラグメントに存在するため、このDNA
部分配列は重要である。

実施例19 プラスミドpBC2001の構築およびエシェリヒア・コリに
おけるpat−遺伝子の発現。

ａ）ペニシリウム・クリソゲヌムのcDNA遺伝子バンクの
構築。

５μｇのポリ（Ａ）^＋−RNA（これの単離および精製に
ついては実施例10に記載されている）を、４種のデオキ
シヌクレオシド・トリホスフェートの存在下で逆転写酵
素を用いてオリゴdT−プライマーと反応させることによ
り、相補的１本鎖DNAを形成させる。そこから酵素リボ
ヌクレアーゼＨおよびDNAポリメラーゼにより２本鎖分
子形成させる（グプラーおよびホフマン、「ジーン」2
5、263、1983年）。適当なEcoR Iアダプターを加えた後
（このために酵素ポリヌクロキシドキナーゼおよびT54
−DNAリガーゼが用いられる）、線状２本鎖cDNAが得ら
れ、これはクローニング・ベクター中に組み込まれ得
る。これらの反応の場合、市販されているcDNA合成キッ
ト（ファーマシア社製）を使用するのが好ましい。それ
は最も重要な酵素およびアダプター・オリゴヌクレオチ
ドを含む。この反応は、製造会社の使用説明書に従い行
なわれる。こうして合成された、EcoR I末端を有する２
鎖DNAを、ベクターgt10にクローン化する（ユイン等、
「DNAクローニング」、グローバー、D.M.編、オクスフ
ォード、１、49、1985年）。80μのcDNA超生物を、予
めEcoR Iにより開裂し、ホスファターゼにより処理して
おいた（マニアチス等）16μのgt10−DNA（８μｇ）
と混合する。２μの３モル酢酸ナトリウム（pH5.2）
および250μのエタノールを加えた後、混合物を−20
゜で20時間沈澱させ、続いて60μの10ミリモル・トリ
ス−HCl（pH7.5）、１ミリモルEDTAに溶かす。66ミリモ
ルのトリス−HCl（pH7.5）、１ミリモルのスペルミジ
ン、10ミリモルMgCl₂、15ミリモルのジチオトレイトー
ル、0.2mg/mlBSA、0.5ミリモルATP中6UのT4−DNAリガー
ルを加えることにより12゜で20時間ライゲーションを行
う。ライゲーション混合物を蛋白質抽出物（「パッケー
ジング・ミックス」）によりインビトロ包装し、エシェ
リヒア・コリ株C600hflと培養する（ユイン等）。必要
な方法は記載されている（マニアチス等）。その試験で
は、5.10⁵を越えるプラークを得ることができる。

ｂ）pat−特異液cDNAクローンの単離およびM13mp19にお
けるサブクローニング。

実施例13の記載に従い、ペニシリウム・クリソゲヌcDNA
遺伝子バンクの約40000のプラークを用いてプラーク・
ハイブリダイゼーションを行う。エシェリヒア・コリ株
C6000hfl（ユイン等）を指示株として使用する。EcoR I
により部分開裂後、組換えgt10−ファージのDNAを、Eco
R I−開裂M13mp19−RF−DNAとライゲーションし、トラ
ンスフィクションする。組換えM13mp19−RF−DNAの個々
のクローンを同定し、制限地図法により確認する。

ｃ）Ncol交差部位を挿入するための組換えM13mp19クロ
ーンのDNAの部位突然変異。

下記配列を有する41単量体オリゴヌクレオチドが合成さ
れる。

５′−TCCGACCCGCAGCAGCCATGGTTCACATCCTCTGTCAAGGC−
３′ pat−cDNAのDNA配列と比べると、このDNA配列は、Ｎ−
末端メチオニン基に対応するATGを囲むNcol交差部位が
得られる点が変わっている。右方へ20、左方へ15のヌク
レオチドは、pat−cDNA配列と同一である。５ピコモル
の燐酸化オリゴヌクレオチドおよび0.5ピコモルの１本
鎖M13mp19−DNAを混合し、10μの20ミリモルのトリス
−HCl（pH7.5）、10ミリモルMgCl₂、50ミリモルNaCl
中、５分間65゜および20分間42゜で加熱する。エフテダ
ルザーおよびヘニコフに従い（「ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ」14、5115、1986年）、クレノウ・ポリメ
ラーゼ、T4−DNAリガーゼおよびS1−ヌクレアーゼによ
る処理を行う（20ミリモルのトリス−Cl（pH7.5）、10
ミリモルMgCl₂、10ミリモルのジオトレイトール、４種
のdTNA各々0.8ミリモル、１ミリモルATPに２単位のクレ
ノウ・ポリメラーゼおよび３単位のT4−DNA−リガーゼ
を含む10μの溶液、42゜で１時間）。EDTAを加えるこ
とにより（最終濃度25ミリモル）反応を止め、10分間70
゜に加熱する。エタノールにより沈澱後、沈澱物を10μ
のトリス−HCl（pH8）、１ミリモルEDTAに溶かす。15
μの30ミリモル酢酸カリウム（pH4.6）、0.25モルNaC
l、１ミリモルZnCl₂、５％グリセリン、７単位のS1ヌク
レアーゼを加えた後、室温で20分間インキュベーション
を行う。反応調製物により適当なエシェリヒア・コリ株
（例、JM101、ヤニシュ−ペロン等、「ジーン」33、10
3、1985年）をトランスフェクションし、RF−DNAを単離
した後、変化したDNAがNcol開裂により同定され得る。

ｄ）pat−cDNAを有するNcol−Hind IIIフラグメントの
プラスミドpKK233−２へのクローニング。

挿入されたNcol交差部位を有するpat−cDNAを含む組換
えM13クローンのRF−DNAを、NcolおよびHind IIIにより
開裂する。同様に、プラスミドpKK233−２（アマンおよ
びブロシウス、「ジーン」40、183、1985年）をNcolお
よびHind IIIにより開裂する。66ミリモルのトリス−HC
l（pH7.5）、１ミリモルのスペルミジン、10ミリモルMg
Cl₂、15ミリモルのジチオトレイトール、0.2mg/mlBSA、
0.5ミリモルATP中14゜で20時間、2UのT4−DNA−リガー
ゼを加えることにより、２つの上記DNAのライゲーショ
ンを行う。適当なエシェリヒア・コリ株の形質転換後
（例、JM83、ヤニシュ−ペロン等、「ジーン」33、10
3、1985年）、個々のプラスミド−DNAを単離し、制限地
図法により特性検定する。プラスミドpKK233−２におい
てpat−cDNAを有するNcol−Hind III制限フラグメント
を含むプラスミドをpBC2001と称する。

ｃ）エシェリヒア・コリにおけるpat−遺伝子の発現。

エシェリヒア・コリRB791（アマンおよびブロシウス、
「ジーン」40、183、1985年）をpB2001により形質転換
する。50mlのLB培地（１リットル当たり、10gのバト−
トリプトン、8gのNaCl、5gの酵母抽出物。NaOHによりpH
7.5に設定する）に、株BR791の個々のコロニーを播種し
（pB2001）、0.5の光学密度が得られるまで（600nmで測
定）、200rpm、37゜で振り混ぜる。5mlの0.1モルIPTG
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を加え
る。続いて、200rpmで３時間37゜で振り混ぜる。次い
で、細胞を遠心分離（10分間、5000rpm、20゜ベックマ
ンJA20）にかけ、後処理することにより、エシェリヒア
・コリにおいて発現した蛋白質の同定を行う。この同定
は、エシェリヒア・コリ総蛋白質のSDSポリアクリルミ
ドゲル電気泳動、PAT−特異抗体を用いたウエスタン−
ブロットまたは酵素検出法により行なわれ得る。

実施例20 ペニシリウム・クリソゲヌムのpat−遺伝子の形質転
換。

ａ）プラスミドpBC2002の構築。

プラスミドpHS103（コラー等、「ジーン」62、127、198
8年）をEcoR1により全体的に開裂し、EcoR1−Sal1開裂M
13mp19−RF−DNAの存在下で再びライゲーションする（6
6ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、１ミリモルのセペ
ルミジン、10ミリモルMgCl₂、15ミリモルのジオトレイ
トール、0.2mg/mlBSA、0.5ミリモルATP、20時間14゜で2
UのT4−DNA−リガーゼを加える）。形質転換後、Sal1フ
ラグメントのクローニングに適したプラスミドが利用可
能である。完全なpat−遺伝子を含む4.8kgのSal1フラグ
メントを有する組換えプラスミドの場合と同様に（実施
例13参照）。このプラスミドをSal1により開列する。ラ
イゲーションおよび形質転換後、修飾pHS103およびpat
−遺伝子を含む4.5kbのSal1フラグメントから成るプア
スミドが同定され得る。このプラスミドをpBC2002と称
する。

ｂ）ペニシリウム・クリソゲヌム・プロトプラストの単
離および形質転換。

ペニシリウム・クリソゲヌムP2/ATCCの濃厚胞子懸濁液2
mlを、１のエルレンマイヤー・フラスコ中、ペニシリ
ウム・クリソゲヌム用の無菌最小培地（１リットル当た
り、3gのNaNO₃、0.5gのMgSO₄・7H₂O、0.5gのKCl、10mg
のFeSO₄・7H₂O、20gのサッカロース、13gのKH₂PO₄およ
び1mgの微量元素混合物（100ml当たり、0.1gのFeSO₄・7
H₂O、0.04gのZnSO₄・7H₂O、0.04gのCuSO₄・5H₂O、0.01g
のMnSO₄・H₂O、0.01gのH₃BO₃、0.01gのNa₂HPO₄・2H
₂O））200mlに加え、250rpmで20時間25゜で振り混ぜ
る。プロトプラストの単離および精製は、イェルトン等
の方法（「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー
・エス・エイ」、81、1470、1984年）により行なわれ
る。菌糸体を遠心分離にかけ、0.9モルNaCl中で２回洗
浄し、5mg/mlのノボザイム234を含む0.9モルNaCl20mlに
再懸濁する。30゜で1.5時間イキュベーションを行う。
反応調製物を遠心分離にかる（ベックマン冷却遠心分離
JS7.5、1500rpm、20゜、５分間）。プロトプラスト沈澱
物を0.9モルNaClにより２回、次いで1.0モルのソルビト
ール、50ミリモルのCaCl₂に１回洗浄する。プロトプラ
ストを、0.2mlの1.0Mソルビトール、50ミリモルCaCl
₂（約0.5〜5.10⁸プロトプラスト/ml）に再懸濁する。10
ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、１ミリモルEDTA中５
μｇのpBC2002を、形質転換に使用し、プロトプラスト
懸濁液に加える。12.5μの25％リエチレングリコール
（BDH）、10ミリモルのトリス−HCl（pH7.5）、50ミリ
モルのCaCl₂（滅菌ろ過済み）を加える。氷中で20分間
イキュベーションを行う。0.5mlの12.5μ25％ポリエ
チレングリコール（BDH）、10ミリモルのトリス−HCl
（pH7.5）、50ミリモルCaCl₂（滅菌ろ過済）を加える。
混合物を20゜で５分間インキュベーションする。1mlの
0.9モルNaCl、50ミリモルCaCl₂を加えた後、徹底的に混
合し、混合物を、0.5％寒天および20μｇのフレオマイ
シン/mlを含む最小培地3mlに加える（48゜）。形質転換
調製物を最小培地プレートに移して培養する（上記の最
小培地、1.6％寒天および20μｇフエオマイシン/ml）。

様々なコロニーから単離されるDNAは、放射性標識pat−
DNAとのサザーン・ハイブリダイゼーションにより特性
検定され得る。形質転換体の中から、多重組み込みの発
生によってpat−遺伝子の幾つかのコピーを含むこのが
発見される。続いて、ペニシリン形成増加に関する試験
発酵によりそれらの株を試験する。

以下、図面の説明を行う。

第１図：ペニシルウム・クリソゲヌムP2/ATCC48271から
のチオール依存性PATの精製。

モノＰにおけるアフィニティー−クロマトグラフィーに
より製造されたPAT酵素調製物A1 278/2のクロマトフォ
ーカシング（＝AL310）。

カラム：ファーマシア・モノＰ基礎体積:4ml 溶離緩衝液:A:25ミリモルのビス・トリス緩衝液pH6.3、
HCl B:10mlのポリバファー74/100ml、pH4.0、HCl 試料：アフィニティー試料AL278/2 試料体積：緩衝液ａと1mlの緩衝液交換、その2mlは電荷
状態紙送り速度:30cm/時流速:60ml/時光学密度:0.1、280nm、HR−10−細胞フラクション：標識参照第２図：ペニシルウム・クリソゲヌムP2/ATCC48271のチ
オール依存性PATの精製。

AL310からのフラクション３−５のRPC（MNヌクレオジル
300−5/C₄）／モノＰにおける活性プールAL278/2（アフ
ィニティー・クロマトグラフィー後）のクロマトフォー
カシング。

第３図：ペニシルウム・クリソゲヌムP2/ATCC48271のチ
オール依存性PATの電気泳動特性検定。

AL310の勾配SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およ
びアンホリン（pH3.5−9.5）またはインモビリン（pH4.
5−6.5）における等電点電気泳動／モノＰにおけるアフ
ィニティー・クロマトグラフィーにより製造されたPAT
酵素調製物AL278/2のクロマトフォーカシング。

第４図:pat−遺伝子を含むペニシルウム・クリソゲヌム
の制限地図。

制限地図は、DNA分子における制限交差部位の大体の再
現である。制限交差部位の示された距離は現実の距離に
比例するが、現実の観察される距離はこれらとは相異し
得る。全ての制限交差部位が与えられている訳ではな
く、さらに別の交差部位も全体を通じて存在し得る。

Ａ＝実施例14および15の配列Ｂ＝実施例18の配列第５図：選択されたオリゴヌクレオチド混合物の配置お
よび配列。

第６図：配列決定された領域（Ｄ、Ｆ、Ｇ）、オリゴヌ
クレオチド（Ｃ、Ｅ）、PATのポリペプチド１およびそ
こから誘導された暗号化DNA鎖（Ｂ）の配列間の関係の
図示。

Ｄ＝実施例11の配列Ｆ＝実施例13の配列Ｇ＝実施例14および15の配列の一部分第７図：プラスミドpBC2001の構築。

完全なpat−cDNAクローンのDNAから出発して（最上
線）、２つのEcoR1フラグメントをベクターM13mp19にク
ローン化する。オリゴヌクレオチドを用いてNcol交差部
位を挿入する。次いで、Ncol−Hind III−フラグメント
を発現ベクターpKK233−２に組み込む。EcoR1、Hind II
I、Ncolは、対応する酵素の交差部位、M13mp19のmcs多
重クローニング部位、pKK233−２のp trc trp−lac融合
プロモーター、pKK233−２のrrnBT1T2転写ターミネータ
ー、pKK233−２のblaアンピシリン耐性遺伝子を示す。

第８図：プラスミドpBC2002。

フレオマイシン耐性遺伝子（ble）とアスペルギルス・
ニデュランス・プロモーターp gdp（グリセリン・アル
デヒド燐酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター）と
の融合を含むこのプラスミドの構築は、pHS103（コラー
等）から出発するアンピシリン耐性遺伝子（bla）は、
エシェリヒア・コリにおける選択マークとしての役割を
果たす。pHS103におて、4.8kgのSal1フラグメントは、
ペニシリウム・クリソゲヌムpat−遺伝子と共に組み込
まれる。Sal1、EcoR1は、対応する制限酵素の交差部位
である。

第９図：ペニシリン・アシル・トランスフェラーゼ（PA
T）が、イソペニシリンＮのアシル基転移またはその６
−APAへの開裂およびペニシリンへのそのアシル化を触
媒する場合に従う反応式。

この発明によって実施可能となるものを列挙すると次の
通りである。

（１）酵素ヘニシリン・アシル・トランスフェラーゼ
（PAT）をコードする。精製および単離形態のDNA。

（２）第４図において図式的に再現された制限地図を有
する、１記載のペニシリウム・クリソゲニヌムのDNA。

（３）下記配列（解読鎖）を有する、１および２記載の
DNA。

（４）ペニシリウム・クリソゲヌムpat−遺伝子の転写
および翻訳に必要な配列を有する、１〜３記載のDNA。

（５）下記配列を有する、４記載のDNA。

（６）下記部分配列を有する、４記載のDNA。

（７）形質転換に使用され得るベクターDNAに組み込ま
れた、１〜６記載のDNAまたはこのDNAの一部分。

（８）１〜５記載のDNAによりコードされる、精製およ
び単離形態の蛋白質。

（９）下記アミノ酸部分配列を含むことを特徴とする、
８記載の蛋白質： AS−部分配列（ポリペプチド１のＮ−末端AS−配列）： AS−部分配列２（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列３（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列４（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列５（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列６（ポリペプチド２のＮ−端末配列）： AS−部分配列７（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列８（ポリペプチド１のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列９（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列10（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列11（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列12（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列13（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列14（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列15（リシル−エンドペプチダーゼを含むポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列16（リシル−エンドペプチダーゼを含むポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列17（リシル−エンドペプチダーゼを含むポ
リペプチド２のペプチド・ラグメント）： AS−部分配列18（リシル−エンドペプチダーゼを含むポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列19（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列20（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列21（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列22（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）： AS−部分配列23（リシル−エンドペプチダーゼを含むポ
リペプチド２のペプチド・フラグメント）： AS−部分配列24（ポリペプチド２のトリプチック・ペプ
チド・フラグメント）：（10）下記アミノ酸配列を有することを特徴とする、８
記載の蛋白質。

（11）蛋白質が、変性条件下ポリアクリルアミドゲル電
気泳動における非修飾酵素として約30kDの分子量でＮ−
末端アミノ酸部分配列１を有するポリペプチド１、並び
に分子量約8kDでＮ−末端アミノ酸部分配列６を有する
ポリペプチド２に分解することを特徴とする、８〜10記
載の蛋白質。

（12）非修飾酵素が、約5.1の等電点を有する幾つかの
イソ変異体により構成されることを特徴とする、８〜10
記載の蛋白質。

（13）塩基性イソ変異体のポリペプチド１が、変性条件
下ポリアクリルアミドゲル電気泳動において酸性イソ変
異体のポリペプチド１よりも迅速に移動することを特徴
とする、８〜10記載の蛋白質。

（14）酵素として還元性化合物、例えばジチオトレイト
ール、β−メルカプトエタノール、グルタチオンおよび
システインにより活性化されるか、またはソルビトー
ル、サッカロースもしくはグリセリンにより安定化さ
れ、ヨードアセトアミドにより不活性化されることを特
徴とする、８〜10記載の蛋白質。

（15）ペニシリウム属のペニシリンＧおよびペニシリン
Ｖ生産株により形成されることを特徴とする、８〜10記
載の蛋白質。

（16）酵素イソペニシリンＮの活性形態が、フェニルア
セチル−またはフェノキシアセチル−補酵素Ａの存在下
でペニシリンＧまたはヘニシリンＶにアシル基転移され
ることを特徴とする、８〜10記載の蛋白質。

（17）酵素ペニシリンＶの活性形態が、フェニルアセタ
ール−補酵素Ａの存在下でペニシリンＧにアシル基転移
されるか、またはこれがフェノキシアセチル−補酵素Ａ
の存在下でエニシリンＶにアシル基転移されることを特
徴とする、８〜10記載の蛋白質。

（18）酵素６−アミノペニシラン酸の活性形態が、フェ
ニルアセチル−補酵素Ａまたはフェノキシアセチル−補
酵素Ａの存在下でペニシリンＧまたはペニシリンＶにア
シル化されることを特徴とする、８〜10記載の蛋白質。

（19）酵素７−アミノ−３−デシアセトキシセファロス
ポラン酸の活性形態が、フェニルアセチル−補酵素Ａま
たはフェノキシアセチル−補酵素Ａの存在下で７−アシ
ル−３−デスアセトキシセファロスポリン化合物にアシ
ル化されることを特徴とする、８〜10記載の蛋白質。

（20）酵素イソペニシリンＮ、ペニシリンＶまたはペニ
シリンＧの活性形態が、活性化アシル基供与体の非存在
下で６−アミノペニシラン酸に開裂されることを特徴と
する、８〜10記載の蛋白質。

（21）７記載のDNAを含むベクター。

（22） 21記載のベクターを含む細胞。

（23）遺伝子発現を可能にする調節要素の制御下でpat
−遺伝子を含むDNA配列を供給する、21記載のベクタ
ー。

（24）プラスミドpBC2001に関するものである、22記載
のベクター。

（25）β−ラクタム−生産微生物におけるプラスミドの
選択を可能にするさらに別の遺伝子を含む、21記載のベ
クター。

（26）プラスミドpBC2002に関するものである、25記載
のベクター。

（27） 21〜26のいずれか１項記載のベクターの助けに
よる宿主の形質転換および発現されたPATの単離から成
る、酵素ペニシリアシラーゼ−トラスフェラーゼ（PA
T）の製造方法。

（28）組換えPAT。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:82）Ｃ１２Ｒ 1:82） (72)発明者ヴェベル、ゲルハルトオーストリア国アー‐6322 ウンターラングカムプフェン 437番 (56)参考文献Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．，31（1987）Ｐ. 1675−1682

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ペニシリウム属のペニシリン・アシル・ト
ランスフェラーゼ（PAT）をコードする、精製および単
離形態のDNA。
【請求項２】ペニシリウム属のペニシリン・アシル・ト
ランスフェラーゼ（PAT）をコードするDNAの少なくとも
一部を含むベクター。
【請求項３】DNAが次の配列を有する酵素をコードする
請求項２記載のベクター：
【請求項４】次の配列のヌクレオチド162〜197,262〜43
6,505〜656および726〜1436を含む請求項２記載のベク
ター：
【請求項５】次の配列のヌクレオチド162〜1436を含む
請求項２記載のベクター：
【請求項６】次の配列のヌクレオチドを含む請求項２記
載のベクター：
【請求項７】次の配列のヌクレオチドを含む請求項２記
載のベクター：
【請求項８】イソペニシリンＮシンテターゼをコードす
るDNAを含む請求項２記載のベクター：
【請求項９】請求項２記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０】請求項２記載のベクターを含む細胞を培
養し、発現したペニシリン・アシル・トランスフェラー
ゼ（PAT）を分離することを特徴とする、ペニシリン・
アシル・トランスフェラーゼの製造法。
【請求項１１】請求項２記載のベクターを担持するペニ
シリン生産性宿主細胞を培養することを特徴とするペニ
シリンの製造法。