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Die Erfindung betrifft Gen und Genprodukt eines in seiner Struktur und multivalenten Funktionalität neuen Schlüsselenzyms, welches die letzte Stufe der Biosynthese von Penicillin G und Penicillin V katalysiert. t Bereits 1953 beobachtete KATO (J. Antibiot. Ser. Tokyo, 2, 130-136,1953) in precursorlosen Penicillinfermentationen eine Akkumulierung des Penicillinnukleus. Dieses ss-Lactam wurde später von BATCHELOR et al. (Nature In, 257-258,1959) isoliert und als 6-Aminopenicillansäure (6-APA) identifiziert.
6-APA wird besonders in precursorlosen Penicillinfermentationen angehäuft. ERICKSON und BENNETT (Appl.
Microbiol. 13. 738-742,1965) betrachteten 6-APA als Nebenmetaboliten, der durch enzymatische 7-Desacylierung von Isopenicillin N in Abwesenheit von Phenyl- oder Phenoxyessigsäure als Precursor entsteht bzw. durch enzymatische Spaltung der natürlichen hydrophoben Penicilline gebildet wird. Später konnte nachgewiesen werden, dass die letzte Stufe der Penicillinbiosynthese in einem Austausch der L-AlphaAminoadipinsäureseitenkette von Isopenicillin N gegen Phenyl- oder Phenoxyessigsäure besteht, wobei die Seitenkettensäuren als Acyl-Coenzym A-Verbindungen in die Reaktion eintreten. Ein Enzym, das diesen
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P. chrysogenum nachgewiesen und als Penicillinacyltransferase (PAT) bezeichnet. Dieses Enzym wird in allen penicillinbildenden Pilzen gefunden und ist intrazellulär lokalisiert. Die Arbeiten von FAWCETT et al. (Biochem.
J. 151. 741-746,1975) bestätigen die Transacylierung von Isopenicillin N zu Penicillin G mit Enzymrohextrakten aus P. chrysogenum in Gegenwart von Phenylacetyl-Coenzym A.
Die Bedeutung der Penicillinacyltransferase für die Biosynthese von Penicillin G oder V ist durch die Beobachtungen von BRUNNER et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349, 95-103,1968), SPENCER (Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 170-175,1968), GATENBACK und BRUNSBERG (Acta. Chem. Scand. 22, 1059-1061,1968), SPENCER und MAUNG (Biochem. J. 118. 29-30,1970), MEESSCHAERT et al. (J. Antibiotics ll, 722-730,1980), KOGEKAR et al. (Indian J. of Biochemistry and Biophysics 2Q.,
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Hoechst, Gracht Castle, 12.-16. 5.85, Vol. 16, Weinheim, p. 115-132,1986), LUENGO et al. (J. Antibiotics 22, 1565-1573 sowie 1754-1759,1986) sowie ALVAREZ et al. (Antimicrob. Agents and Chemotherapy 3. 1, 1675-1682,1987) erhärtet.
Das thiolabhängige Enzym kann auch den Acylaustausch innerhalb verschiedener Penicilline katalysieren und ist in Penicillinstämmen mit hoher Syntheseleistung im vermehrten Masse gegenüber niedrig produzierenden Stämmen anzutreffen (PRUESS und JOHNSON : J. Bacteriology 94, 1502-1508,1967).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung, Charakterisierung und Aufklärung der Sequenz von Gen und Genprodukt dieses wichtigen Biosyntheseenzyms, womit wesentliche Voraussetzungen für gentechnologische Arbeiten sowohl in Richtung Titersteigerung als auch in Richtung Hybrid- bzw. Mutasynthese bzw.
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es heute Stand der Technik, die für Proteine kodierenden Gene zu lokalisieren (Rothstein et al., Cold Spring Harbor Symposia on quantitative Biology, Vol. XLV, 99-105, 1981) und zu sequenzieren (Maxam and Gilbert,
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Press No. 4 (Goldberger et al. 1979) bekannt.
Mehrere Enzyme der ss-Lectambiosynthese wurden bereits in reiner Form isoliert und strukturmässig charakterisiert. Ebenfalls wurden die kodierenden Genregionen mehrerer dieser Enzyme inzwischen isoliert, sequenziert, in entsprechende, für die Transformation geeignete Expressionsvektoren eingebaut und kloniert [z. B.
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Expressionsvektoren durchgeführte Transformation eines ss-Lactam produzierenden Mikroorganismus ist ebenfalls bereits beschrieben (Skatrud et al., Curr. Genet. 12 (5), 337-48, 1987).
Die Penicillinacyltransferase (PAT), welche den letzten Schritt in der Penicillinbiosynthese, nämlich die Transacylierung von Isopenicillin N bzw. dessen Spaltung zu 6-Aminopenicillansäure (6-APA) sowie deren Acylierung zu Penicillin nach folgendem Reaktionsschema
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L-K. Arninoadipinsäumultivalenten katalytischen Funktionalität beschrieben, konnte jedoch bisher infolge seiner extremen Instabilität nicht nachweisbar rein isoliert und struktunnassig charakterisiert werden. Die in penicillinbildenden Stämme von Penicillium chrysogenum zwischen 40 und 100 Stunden Fermentationsdauer vermehrt gebildete, hoch instabile und leicht saure, thiolabhängige Penicillinacyltransferase katalysiert einerseits den Acyltransfer von Coenzym A aktivierten fermentativen Seitenketten (z. B.
Acyl-Coenzym A-Verbindungen der hydrophoben Precursorsubstanzen Phenoxyessigsäure, Phenylessigsäure, Hexan- und Octansäure etc. ) auf natürliche Penicilline (z. B. Isopenicillin N, Penicillin V, Penicillin G, 6-APA etc. ) sowie andererseits zwischen natürlichen Penicillinen untereinander, d. h. bei dem über einen Acylenzymkomplex laufenden Acyltransfer fungieren die natürlichen Penicilline sowohl als Acyldonator als auch als Acylakzeptor, während die Coenzym A aktivierten hydrophoben Precursorverbindungen nur als Acyldonator in die enzymatische Reaktion eintreten können. Da der Acyltransfer im wässrigen Milieu stattfindet, konkurriert auch Wasser als Nukleophil mit dem Acylenzymkomplex, wobei die energiereichen Acyldonatoren einfach hydrolytisch gespalten werden.
Daher findet man im Kulturbrei von Penicillinfermentationen immer auch 6-APA, den ss-Lactamkern der natürlichen Penicilline.
Der Nachweis der Penicillinacyltransferase kann mit üblichen Analysenverfahren wie radioaktiven, mikrobiologischen oder chromatographischen Testmethoden durchgeführt werden. So wurden z. B. für die Bestimmung der 6-APA-Phenoxyacetyl-coenzym A-Acyltransferaseaktivität der PAT, welche folgende enzymatische Reaktion katalysiert, 6-APA + Phenoxyacetyl-Coenzym A- > Penicillin V + Coenzym A, folgende drei verschiedenen Testvarianten ausgearbeitet : - Nachweis von Penicillin V über mikrobiologischen Agardiffusionstest mit spezifisch produktsensitiven Teststämmen, z. B. hat Micrococcus luteus ATCC 9341 gegenüber Penicillin eine um mehr als drei Zehnerpotenzen grössere antibakterielle Senisitivität als gegenüber 6-APA.
- Bei Einsatz von S 35-markierter 6-APA (enzymatisch aus S 35-Penicillin G) Nachweis des extrahierbaren S 35-Penicillin V im ss-Counter.
- Nachweis des extrahierten Penicillin V mittels HPLC
Die enzymatische Transacylierungsreaktion erfolgt in Mikrotiterplatten mit folgendem Ansatzschema :
6-APA (2, 5 mg/ml im Reaktionspuffer) 20) il
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jeweils 20 Aliquots entnommen, in derselben Mikrotiterplatte 1 : 3 mit 50 % wässrigem Ethanol (= Stoppen der Enzymreaktion) bzw. 1 : 5 mit 5 U/ml Penicillinase von DIFCO (= ss-Lactam-Kontrolle) verdünnt und im
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Agardiffusionstest auf mit Micrococcus luteus ATCC 9341 bzw. mit dem lactamsupersensitiven Stamm Pseudomonas aeruginosa BC 248 beimpften Testplatten (Einsaat 0, 5 %, Antibiotic Medium 1 von DIFCO, 50 til pro Näpfchen, Bebrütung 15 Stunden bei 37 C) gegen Penicillin V getestet.
Zu verschiedenen Zeiten werden vom enzymatischen Transacylierungsansatz (gleicher Ansatz wie oben mit 2 ml Gesamtvolumen) Aliquots entnommen, 1 : 1 mit Diisopropylether bei pH 2, 0 (HCI) extrahiert, die organische Phase mit Stickstoff abgedampft, der Rückstand im gleichen Volumen Reaktionspuffer resuspendiert und über HPLC (Bedingungen wie bei der PaCoA Gehaltsbestimmung, nur als Eluens 40 % Methanol und 60 % 0, 01 M TBAS in 0, 025 M Phosphatpuffer pH 7, 0) auf Penicillin V getestet.
Retentionszeiten (min) : Phenoxyessigsäure 1, 10
Penicillosäure G 1, 62
Penicillosäure V 1, 92
Penicillin G 3, 00
Penicillin V 4, 92
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46Cephalosporin V 3, 24
Die anderen Aktivitäten des multispezifischen PAT-Enzyms können ebenfalls über HPLC bestimmt werden, wobei als Eluens für die polaren Substrate bzw. Produkte 0, 01 M TBAS in 0, 025 M Phosphatpuffer pH 7, 0 alleine Verwendung findet.
Retentionszeiten (min) : Isoplin 1, 67
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Isopenicillin N kann aus precursorlosen Penicillinfermentationen über Adsorberharz (DIAION-HP 20) und Reverse Phase Chromatographie (Nucleosil C 18, 10 pm) gewonnen werden.
Je nach Enzympräparation ist dabei besonders auf die Wahl der Indikatorreaktion zu achten, mit der die eigentliche Aktivität des multispezifischen Biosyntheseenzyms erfasst werden soll. So ist es z. B. nicht besonders zielführend, als Indikatorreaktion für die PAT im Rohextrakt die 6-APA-Phenoxyacetyl-CoenzymA Acyltransferase-Aktivität zu verwenden, da in dieser rohen Enzympräparation anwesende Störaktivitäten sowohl Phenoxyacetyl-CoenzymA (abgekürzt PaCoA) und Penicillin V (Plin V) rasch hydrolysieren als auch 6-APA mit dem energiereichen Seitenkettenderivat PaCoA zu Plin V acylieren, was z. B. auch bekannte proteolytische Enzyme wie Chymotrypsin katalysieren. Diese interferierenden Aktivitäten unterscheiden sich jedoch deutlich von der eigentlichen thiolabhängigen PAT. Sie zeigen z.
B. ein anderes chromatographisches Elutionsverhalten, Stabilitätsprofil und Inhibierungsmuster. Diese interferierenden Störaktivitäten erklären einerseits die bisher in
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mit zunehmender Enzymverdünnung bis zu einem Aktivitätsmaximum stark ansteigt. Ein essentieller Faktor im Nachweis der PAT ist die Anwesenheit von reduzierenden Verbindungen, wie Dithiothreitol oder ss-Mercaptoethanol, welche das hoch oxidationsempfindliche SH-Enzym aktivieren bzw. stabilisieren.
Die hohe Temperaturinstabilität der PAT erschwert die Enzymreinigung ebenfalls wesentlich. So verliert z. B. eine frisch hergestellte Enzympräparation trotz Anwesenheit von verschiedenen Stabilisatoren (z. B. 5 mM Dithiothreitol + 5 % Sorbit + 0, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid) nach einstündiger stationärer Inkubation bei 37 C die gesamte thiolabhängige 6-APA-PaCoA-Acyltransferaseaktivität. Es ist daher angebracht, alle Reinigungsarbeiten in einem Arbeitskühlraum bei 4 C unter Oxidationsschutz durchzuführen. Grob vorgereinigte Enzymlösungen können über mehrere Wochen in Anwesenheit der Stabilisatoren ohne merklichen Aktivitätsverlust eingefroren (-196 C,-20 C) werden, wobei jedoch mehrere Einfrier-Auftauschritte die PATAktivität sofort vollständig desaktivieren. Ammonsulfatpräzipitate sind ebenfalls einige Tage bzw.
Wochen bei 4 C in Anwesenheit der genannten Stabilisatormischung mehr oder minder stabil.
Das in der Erfindung angewandte Reinigungsverfahren der PAT liefert, ausgehend von jungem, penicillinpositivem Penicillium-Myzel, nach Myzelaufschluss, Nukleinsäurefällung, Proteinfällung, hydrophober Interaktions-und Affinitätschromatographie stabile, mindestens 50 %ige, aktive Enzympräparationen, wie sie für die enzymkinetische bzw. proteinchemische Charakterisierung notwendig sind. Die Aufarbeitung bis zur lagerfähigen Proteinpräzipitation kann mit üblichen Reinigungsverfahren durchgeführt werden, z. B. durch Zellaufschluss mit einem Hochdruckhomogenisator oder Glaskugelmühle bzw. die Nukleinsäurefällung mit Cetyltrimethylammoniumbromid, Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat. Für die Proteinfällung eignet sich u. a. Ammonsulfat, wobei eine 50 %ige Sättigung ausreicht, um die gesamte nachweisbare PAT-Aktivität zu präzipitieren.
Von Ammonsulfatpräzipitat ausgehend, wird die thiolabhängige PAT an Phenylsepharose Cl 4 B über hydrophobe Interaktion gebunden und nach Entfernung von über 90 % des Ballastproteins, mit einer wässrigen Stabilisatorlösung niedriger Ionenstärke eluiert, über eine 10 kD cut off Ultrafiltrationsmembran
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konzentriert und vorzugsweise über Affinitätschromatographie bzw. alternativ nach einem Gelfiltrationsschritt (Ultrogel Aca 54) über Anionenaustauscher- (DEAE-Sepharose FF) bzw. Adsorptionschromatographie (Hydroxylapatit) bis zu einer mindestens 50 %igen aktiven Enzympräparation weitergereinigt, was einem Anreicherungsfaktor von ca. 1000, bezogen auf das Ammonsulfatpräzipitat, entspricht.
Als Affinitätsmatrix können übliche makroporöse Trägermaterialien wie Sepharose, Zellulose, Polymermaterialien, stabilisiertes Kieselgel, Aluminiumoxid etc. eingesetzt werden. Als Affinitätsliganden, welche über einen C2 bis C10-Spacer bzw. ohne Spacer kovalent, oder durch hydrophobe bzw. ionogene Wechselwirkung an den Träger gebunden werden, eignen sich vorzugsweise Acyl- bzw. Amino-ssLactamverbindungen. Die Bindung dieser Liganden an den Spacer bzw. die Matrix muss derart erfolgen, dass die Bindungsstelle am Liganden für das zu reinigende Enzym zugänglich bleibt. Erfindungsgemäss zeigen besonders Affinitätsmatrizes mit terminalen Amino-Spacem wie AH-Sepharose 4 B bzw.
HMD-Ultrogel Aca 34, an die über N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l, 2-dihydrochinolin (EEDQ) Liganden wie natürliche Penicilline, vorzugsweise 6-APA, Plin V oder Plin G bzw. die analogen stabilen 3-Desacetoxycephalosporinverbindungen wie 7-Amino-3desacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) bzw. 7-Phenoxyacetamido- oder 7-Phenylacetamido-3desacetoxycephalosporansäure (3-Desacetoxycephalosporin V und G) gebunden werden, einen besonders starken Reinigungseffekt. Die Amino-ss-Lactamaffinitätsmatrizes können dabei ohne aufwendige Schutzgruppentechnologie mit löslicher Penicillin G-Acylase von E. coli aus den entsprechenden Phenylacetamido-ss-Lactammatrizes hergestellt werden.
Die benötigten Mikroorganismen werden für die Enzymproduktion in üblichen Nährmedien für die Penicillinbildung herangezüchtet. Als Nährmedienbestandteile eignen sich alle Substrate, die ganz allgemein zur Züchtung von Pilzen verwendet werden. Zusätzlich zu diesen Nährstoffen kann man in geeigneter Kombination jene Additive verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern und die Penicillinacyltransferaseaktivität steigern. Additive sind z. B. Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate und ähnliche organische Salze sowie Wuchsstoffe, Vitamine und Spurenelemente. Durch Zusatz verschiedener Induktoren, vorzugsweise Phenoxy- bzw. Phenylessigsäure und deren Derivate oder Analoga können die erzielten Enzymtiter erheblich gesteigert werden.
Die Anzucht erfolgt vorwiegend submers unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 35 C und einem pH-Wert zwischen 4 und 8. Die Zeit, in der die Kulturbrühe die maximale Enzymaktivität erreicht, hängt von der Art des verwendeten Mikroorganismus ab, und die optimale Zeit für die Kultivierung ist daher vorzugsweise für jeden einzelnen Stamm getrennt zu bestimmen. Im allgemeinen liegt die Kultivierungsdauer im Bereich von vorzugsweise 2 bis 5 Tagen. Für die Transacylierung kann man die Kulturbrühe bzw. ein daraus bereitetes aktives Sekundärpräparat einsetzen.
Beispiele für solche aktiven Sekundärpräparate sind die aus der Kulturbrühe gewonnenen und gewaschenen, nativen bzw. permeabilisierten Zellen ; zellfreie Extrakte, die man durch physikalische, chemische oder enzymatische Behandlung des Myzels erhält (beispielsweise die Zellhomogenate, die man durch Aufschluss oder durch Ultraschallbehandlung des Myzels erhält, und Zellysate, die man durch Behandlung mit oberflächenaktiven Substanzen oder Enzymen bildet) ;
teilweise oder vollständig gereinigte Präparate des gewünschten Enzyms, die man durch Reinigen der zellfreie Extrakte mit Hilfe üblicher Enzymreinigungsmethoden erhält, beispielsweise durch Aussalzen, durch fraktionierte Fällung, durch Dialyse, durch Gelfiltration, durch Ionenaustausch-, Adsorptions- und durch Affinitätschromatographie ; stabilisierte Penicillinacyltransferasepräparate, die man dadurch erhält, dass man das Enzym bzw. die nativen bzw. permeabilisierten Zellen entweder physikalisch oder chemisch mit wasserunlöslichen hochmolekularen Trägersubstanzen durch Adsorption, Kovalentbildung, Quervemetzen, Einschluss oder Einkapseln immobilisiert.
Die enzymkinetische bzw. physikochemische Charakterisierung der oben resultierenden Enzymkonzentrate kann mit klassischen Methoden wie Chromatographie, Elektrophorese, N-terminale Sequenzierung, Untersuchungen hinsichtlich Substratspezifität, pH-und Temperaturprofil für Aktivität und Stabilität, Aktivierung-, Inhibierungs- und Stabilisierungsstudien etc. durchgeführt werden.
Für die Isolierung von Genen existieren zahlreiche Methoden. Einen allgemeinen Überblick dazu geben die Bücher von Watson et al. (Rekombinierte DNA - Eine Einführung, Heidelberg, 1983) und Winnacker (Gene und Klone - Eine Einführung in die Gentechnologie, Weinheim, 1984). Im Falle des pat-Gens (Gen für das Enzym Penicillinacyltransferase, PAT) scheint es am sinnvollsten, synthetische DNA-Sonden zu verwenden, da die dazu nötigen Aminosäuresequenzen vorliegen. Dazu kann man aus der Aminosäuresequenz des Polypeptides (1) der PAT eine DNA-Sequenz auf Grund des genetischen Kodes ableiten und die entsprechenden Oligonukleotide
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(16) Oligonukleotide, welche der RNA komplementär sind, kann man als vier Gemische mit je vier Oligonukleotiden synthetisieren (Oligonukleotidgemische (1), (2), (3), (4) in Abbildung 5).
Eine sichere Identifizierung des Gens ist mit diesen Oligonukleotiden vermutlich nicht möglich, da im Genom von Penicillium chrysogenum weitere DNA-Sequenzen vorkommen, die diesen DNA-Sequenzen sehr ähnlich sind. Eine Unterscheidung dieser unterschiedlichen DNA-Sequenzen kann methodisch sehr aufwendig sein. Deshalb ist
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es ratsam, über ein weiteres Oligonukleotid als Suchsequenz zu verfügen.
Die Strategie, Gene mit Hilfe von DNA-Sonden zu isolieren, wird von Lathe (J. Mol. Biol. 183 [1985] 1-12) diskutiert. Sind z. B. Informationen über die Häufigkeit bestimmter Kodons oder bestimmter Dinukleotidfolgen bekannt, kann eine längere DNA-Sequenz synthetisiert werden. Für Penicillium chrysogenum sind solche Informationen nicht verfügbar. Um trotzdem ein längeres Oligonukleotid als Sonde zu erhalten, kann man die vorhandenen Oligonukleotide als Sequenzierprimer verwenden : Das Enzym Reverse Transcriptase kann einen DNA-Strang synthetisieren, der zu einer vorgegebenen RNA komplementär ist, aber nur dann, wenn ein geeignetes Startermolekül (= Primer) vorhanden ist. Im beschriebenen Fall können als Primer die Oligonukleotidgemische 1 bis 4 eingesetzt werden.
Dadurch wird es möglich, nur die pat mRNA zu sequenzieren, obwohl zahlreiche andere mRNAs in der Präparation vorhanden sind. Die Sequenzierreaktion wird in Gegenwart von basenspezifischen Kettenabbruch-Reagentien durchgeführt (Dideoxynucleosid-Triphosphate). Dadurch entstehen zahlreiche verlängerte Oligonukleotide, deren gelelektrophoretische Analyse es erlaubt, die Basenabfolge einer DNA zu ermitteln, die zur pat mRNA komplementär ist. Der Vorteil dieser Methode ist, dass die erhaltene Sequenzinformation erlaubt, direkt neue Oligonukleotide zu synthetisieren. Zusätzlich ist es sehr bedeutsam, dass diese Sequenz mit der Sequenz, die aus der Aminosäuresequenz abgeleitet wird, übereinstimmen muss und so absichert, dass tatsächlich eine pat spezifische Sequenz vorliegt.
Die eigentliche Isolierung des Gens kann dann aus einer Genbank erfolgen. Eine Genbank ist eine Sammlung rekombinanter DNA-Vektoren, die jeweils einen kleinen Teil der DNA von Penicillium chrysogenum enthalten (im Falle einer Lambda EMBL3-Genbank sind dies je rekombinantem Molekül ca. 0, 05 %). Mittels Plaquehybridisierung kann man Lambda-Klone isolieren, die mit der radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisieren. Von der DNA dieser Klone kann eine physikalische Karte angefertigt werden. Eine solche Restriktionskarte gibt die Anordnung von Restriktionsendonuclease-Schnittstellen an, die als Orientierungshilfe dienen können. Durch DNA-Hybridisierungstechniken lässt sich ermitteln, mit welchem Teilbereich der DNA die DNA-Sonden hybridisieren.
Die entsprechenden Teilfragmente werden in Plasmid- oder BakteriophagenVektormoleküle eingebaut und mit molekulargenetischen Methoden weiter charakterisiert. Die Einklonierung eines DNA-Segmentes in den Vektor M13mp19 erlaubt dann die Bestimmung einer DNA-Sequenz, wobei die pat-spezifische DNA-Sonde als Primer verwendet werden kann. Eine weitere Sequenzierung der DNA erlaubt es, den kodierenden Anteil des Gens und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der PAT zu ermitteln. Die bereits bestimmten Aminosäure-Teilsequenzen können die dazu erforderliche Information liefern.
Das pat-Gen aus Penicillium chrysogenum kann aufgrund der DNA-Sequenz-Information in Expressionsvektoren eingebaut werden, die eine Expression der PAT in gut bekannten Produktionsorganismen erlauben (Reznikoff und Gold, Maximizing Gene Expression, Boston, 1986). Die DNA mit dem pat-Gen kann in Vektoren eingebaut werden, mit denen eine Transformation von Penicillium chrysogenum oder anderen ss-Lactam produzierenden Mikroorganismen möglich ist (z. B. Kolar et al., Gene 62 (1988) 127-134). Da Transformanten häufig die eingebrachte DNA in mehreren Kopien enthalten (z. B. Kolar et al. ) ist auch eine stärkere Transkription des Gens möglich, die in einer gesteigerten Penicillinausbeute resultiert. Weiterhin ist die Manipulation der DNA denkbar (z. B. der Austausch von Promotorabschnitten), die ebenfalls die Transkription verbessern.
Der Austausch spezieller Aminosäurereste durch ortsspezifische Mutagenese (z. B. Winnacker) würde es ermöglichen, spezielle Mutanten zu isolieren, die die Stabilität des Enzyms oder seine Aktivität oder Spezifität verändern.
Die DNA der vorliegenden Erfindung wurde aus Penicillium chrysogenum isoliert. Die Vorgangsweise ist in den Beispielen 10 bis 13 beschrieben und durch die Fig. 4,5 und 6 illustriert. Ausgehend von der
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Die ersten 29 Basen der so ermittelten Sequenz (Fig. 6 D) stimmen mit der postulierten pat mRNA Sequenz überein (Fig. 6 B). Aufgrund dieser Information wurde ein 30mer synthetisiert (Fig. 6 E), das als radioaktive Sonde zur Isolierung eines Lambda-Klons aus der Penicillium chrysogenum Genbank (Beispiele 12 und 13) verwendet wurde. Nach einer Subklonierung in M13-Vektoren wurde die DNA sequenziert (Fig. 6 F). Die ersten 75 Basen dieser Sequenz stimmen mit den Basen 35 bis 109 der zur mRNA komplementären Sequenz (Fig. 6 D) überein. Die Zusammenhänge zwischen diesen einzelnen Sequenzen demonstrieren, dass tatsächlich das pat-Gen isoliert wurde.
Die PAT hat ein Molekulargewicht von ca. 38. 000 D. Aus einem mittleren Aminosäure-Molekulargewicht von 110 D lässt sich für den kodierenden Anteil des Gens eine Grösse von 1100 bp schätzen. Da Gene von filamentösen Pilzen meist nur wenige und wenn, dann kleine Introns enthalten (Ballance, Yeast 2 [1986] 229), kann man davon ausgehen, dass das vollständige Gen auf dem beschriebenen DNA-Molekül liegt und dass Kontrollregionen ebenfalls vollständig vorhanden sind.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken. In den Beispielen stehen die Abkürzungen ml, l, mg, g, Upm, TS, GV %, U für Milliliter, Liter, Milligramm, Gramm, Umdrehungen pro Minute, Trockensubstanz, Gewicht/Volumsprozent und Internationale Enzymeinheit (1 Internationale Enzymeinheit = 1 Mol Substrat/min). Gewichtsteile verhalten sich zu Volumsteilen wie g zu ml, die Temperatur wird in Celsiusgraden angegeben. Die Charakterisierung der Produkte wurde unter Verwendung der folgenden Techniken bestimmt : Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC), Hochdruck-
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Flüssigchromatographie (HPLC), Ultraviolett-Spektrophotometrie (UV), Infrarotspektrometrie (IR) und magnetische Kemresonanz (NMR).
Die den in den Beispielen angeführten Stammnamen beigefügten Nummern entsprechen den eingetragenen Stammbezeichnungen jener Kultursammlungen, bei denen die Stämme als solche deponiert sind, z. B. bei ATCC (= American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, USA).
Herstellung und Gehaltsbestimmung von Phenoxyacetyl-coenzym A (PaCoA)
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901 mg CoA werden unter Eiskühlung in 15 ml bidestilliertem Wasser gelöst und mit Natronlauge auf pH
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insgesamt 235 mg Phenoxyessigsäurechlorid unter kräftigem Rühren zugesetzt und der pH-Wert auf 7, 0 gehalten (Verbrauch 1, 8 ml l N NaOH). Nach einstündigem Rühren unter Eiskühlung wird 3 x mit je 40 ml Diethylether bei pH 2, 0 (6 bzw. 1 N HCI) extrahiert, dann die wässrige Phase mit NaOH neutralisiert, im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur vom restlichen Ether befreit, kurz mit Stickstoff begast, anschliessend 1 : 50 mit bidest. Wasser verdünnt, in Portionen zu je 500 p. l ampulliert und in Flüssigstickstoff eingefroren.
Die Gehaltsbestimmung erfolgt über HPLC, wobei als Standard Phenylacetyl Coenzym A (PeCoA) verwendet wird.
HPLC-System : HP 1090 Liquid Chromatogram (Hewlett Packard)
Säule : Hypersil ODS 5 pm, C 18,150 x 200 mm
Integrator : Modell 3392 (Hewlett Packard) 1 ATT 3
Fluss : 0, 5 ml/min
Detektion : 230 nm
Eluens : 35 % Methanol
65 % 0, 01 M Tetrabutylammoniumsulfat (TBAS) in 0, 025 M Phosphatpuffer pH 7, 0
Auswertung :
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<tb> Probe <SEP> Retentionszeit <SEP> Fläche <SEP> Höhe
<tb> (min) <SEP> (Flächencounts+) <SEP> (Höhencounts++)
<tb> 400g/mlPeCoA <SEP> 9, <SEP> 41 <SEP> 8466900 <SEP> 210692
<tb> 200-"-9, <SEP> 68 <SEP> 4105400 <SEP> 107689
<tb> 100-"-9, <SEP> 88 <SEP> 2092100 <SEP> 54990
<tb>
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<tb>
<tb> 25PaCoA <SEP> Stlsg. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 200 <SEP> 10, <SEP> 53 <SEP> 1966600 <SEP> 47737
<tb> PaCoAStlsg. <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 50 <SEP> 10, <SEP> 68 <SEP> 7850700 <SEP> 172983
<tb> PaCoASdsg. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 40 <SEP> 10, <SEP> 47 <SEP> 1038900 <SEP> 222475
<tb>
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1000 ml mit H20 destilliert, pH 4, 85, Sterilisation : 20 min bei 120 ) suspendiert. Mit 2 ml dieser Sporensuspension wird ein 2 L Erlenmeyerkolben mit 225 ml Gerste beimpft.
Die Gerste wird vor dem Abfüllen mit Wasser klar gewaschen, 20 bis 30 Minuten in Medium A gequollen, über ein Sieb filtriert und ca. eine Stunde auf Filterpapier getrocknet, anschliessend in 2 L Erlenmeyerkolben zu je 225 ml abgefüllt, dreimal bei 100 , jeweils ca. eine Stunde, mit eintägigen Intervallen sterilisiert und vor dem Animpfen noch 2 Tage bei 40-45 0 getrocknet. Nach der Sporeneinsaat werden die Erlenmeyerkolben kurz geschüttelt, dann ungefähr 8 Tage bei 24 11 und 60 10 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Nach dieser stationären Bebrütungszeit werden die Pilzsporen mit 250 ml 0, 9 % NaCl +0, 1% Polyethoxysorbitanoleat auf einem vertikalen Schüttler für 3-5 Minuten bei 140 Upm resuspendiert. Nach erneutem Zusatz von 250 ml 0, 9 %iger NaCI-Lösung (polyethoxysorbitanoleat) wird die Sporensuspension in eine 1 L Impfkanne steril dekantiert. Mit je 8 ml von diesem bei 4 ca. einen Monat lagerfähige Impfgut werden jeweils 50 Stück 2 L Erlenmeyerkolben zu je 200 ml Medium B (Zusammensetzung pro Liter : 9 g Kaliumphenoxyacetat, 150 g Lactose Monohydrat, 2, 25 g Stickstoff als Pharmamedia, 10, 5 g (NH) SO, 4 g
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5Schüttelinkubation werden 1820 g an enzymatisch aktiver Biomasse geerntet.
Der Penicillintiter beträgt 1, 9 g Penicillin V pro L Brei.
Beispiel 2 : Herstellung einer enzymatisch aktiven Enzymrohpräparation :
1786 g feuchtes Mycel (= 220 g TS), erhalten gemäss Beispiel 1, werden in 3, 5 L 0, 1 M Phosphatpuffer pH
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resuspendiert und unter Kühlung bei 2/3 0 kontinuierlich in der Glaskugelmühle (600 ml Stahlmahlbehälter mit 510 ml 500-750 pm Glasperlen, Drehzahl 2000 Upm, 0, 1 mm Reibspaltbreite, Durchfluss 30 L/Stunde, Vorlauf 2 bis 3 , Rücklauf 5 , Solekühlung mit Vorlauf -20/80 und Rücklauf -5/-1 0) homogenisiert Das Homogenat wird anschliessend 30 Minuten bei 15. 000 Upm und 4 zentrifugiert, der Überstand mit 0, 5 GV % Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) bei 0'versetzt und 30 Minuten gerührt.
Die präzipitierte Nukleinsäure wird durch Zentrifugation (10 Minuten, 15. 000 Upm, 4 ) abgetrennt, der Überstand durch Zugabe von festem Ammonsulfat auf 50 GV % Sättigung gebracht und zur Vervollständigung der Proteinfällung über Nacht bei 4 0 gehalten. Der Niederschlag wird anschliessend zentrifugiert, mit kalter gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und nach Zusatz von 5 GV % Sorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA und 0, 1 mM PMSF bis zum nächsten Chromatographieschritt bei 40 gelagert. Der Aufschluss bzw. die beiden Fällungsstufen werden mit Protein- (Bradford) bzw. Aktivitätsbestimmung (mikrobiologische Erfassung der 6-APA-PaCoA-Acyltransferaseaktivität mit dem lactamsuspensitiven Pseudomonas aeruginosa Stamm BC 248) verfolgt. Die gefundenen Werte sind in der Tabelle 1 angeführt.
(Es folgt Tabelle 1)
<Desc/Clms Page number 8>
Tabelle 1 : Aufschluss und Fällung der thiolabhängigen Penicillin-Acyltransferase aus Penicillum chrysogenum P2/ATCC 48271
EMI8.1
<tb>
<tb> Reinigung <SEP> Auf- <SEP> Gesamt- <SEP> Protein <SEP> Mikrobiologische <SEP> 6-APA-PaCoA-Acyltransferaseschluss- <SEP> vo- <SEP> Aktivität <SEP> (mm <SEP> HH <SEP> # <SEP> gegen <SEP> BC <SEP> 248)
<tb> dauer <SEP> lumen <SEP> (mg <SEP> ges.) <SEP> (mg/ml)
<tb> (min) <SEP> (ml) <SEP> 1) <SEP> OST <SEP> unverdünnt <SEP> OST <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> OST <SEP> l <SEP> :
<SEP> SO <SEP>
<tb> sofort <SEP> 30'30+ <SEP> sofon <SEP> 30'30'+ <SEP> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP>
<tb> Penase <SEP> Penase <SEP> Penase <SEP>
<tb> Zellaufschluss <SEP> mit <SEP> 0 <SEP> 4900 <SEP> 676 <SEP> 0, <SEP> 138 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Dyno <SEP> mill <SEP> Type
<tb> KDL <SEP> (1786g
<tb> Bfm <SEP> 220 <SEP> g <SEP> TS <SEP>
<tb> in <SEP> 3,5 <SEP> 1)
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> Phosphat- <SEP> 30 <SEP> 20776 <SEP> 4, <SEP> 24 <SEP> SPUR <SEP> 18, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 24, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0
<tb> Puffer <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> +
<tb> + <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> + <SEP>
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Triton
<tb> X <SEP> 100 <SEP> +0,
<SEP> 1 <SEP> mM <SEP>
<tb> PMSF
<tb> 600 <SEP> ml <SEP> Stahlmantelbehälter
<tb> mit <SEP> 510 <SEP> ml <SEP> 500 <SEP> - <SEP>
<tb> 750 <SEP> m <SEP> Glasperlen <SEP> 60 <SEP> 25431 <SEP> 5, <SEP> 19 <SEP> SPUR <SEP> 17, <SEP> 19 <SEP> 0 <SEP> SP <SEP> 27, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 15, <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> im <SEP> kont. <SEP> Betrieb <SEP> ; <SEP>
<tb> Drehzahl <SEP> : <SEP> 2000 <SEP> Upm
<tb> (# <SEP> 6,7 <SEP> m/sek. <SEP> )
<tb> Reibspaltbreite <SEP> ;
<SEP> 90 <SEP> 29204 <SEP> 5, <SEP> 96 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP> 29, <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> lmm <SEP>
<tb> Flussrate <SEP> - <SEP>
<tb> Mahlgut <SEP> =30 <SEP> l/h <SEP>
<tb> Temp. <SEP> MahlgutVL2/3 C
<tb> RL5 C
<tb> Temp.
<SEP> Kühlung- <SEP> 120 <SEP> 29302 <SEP> 5, <SEP> 98 <SEP> SPUR <SEP> 17, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 24, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> VL-20/-8 C
<tb> RL-5/-1 C
<tb> OST <SEP> nach
<tb> Nucleinsäurefällung <SEP> 4650 <SEP> 12927 <SEP> 2,78 <SEP> 14,4 <SEP> 26,0 <SEP> 0- <SEP> 25,8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> mit <SEP> 05,% <SEP> CTAB
<tb> PRoteinpräzipitat
<tb> mit <SEP> 50 <SEP> GV <SEP> % <SEP> 480 <SEP> 10965 <SEP> 22, <SEP> 8 <SEP> 27, <SEP> 42) <SEP> 28, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 18, <SEP> 4 <SEP> 28, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 1 <SEP> 27, <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Ammonsulfat
<tb> (AS <SEP> #
<SEP> 16/12)
<tb> (# <SEP> 544 <SEP> g)
<tb>
1) Die unverdünnten Aufschlussproben wurden von der Aktivitätstestung über PD 10 Säulen pufferausgetauscht (Abtrennung des Plin V-Restgehaltes, 2, 5 ml OST-Probe mit 3, 5 ml 0, 1 M Phosphatpuffer pH 7, 5 + 1 mM DTT)
EMI8.2
EMI8.3
<Desc/Clms Page number 9>
(NHBeispiel 3 : Mikrobiologischer Nachweis der Transacylierungs-bzw. Plin V-Spaltungsaktivität in der Enzympräparation AS-Präzipitat mit bzw. ohne Zusatz von Inhibitoren :
Die, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellte Enzymrohpräzipitation wird im mikrobiologischen Agardiffusionstest hinsichtlich Transacylierung von 6-APA bzw.
Isoplin N mit PaCoA und Spaltung von Kalium Plin V mit bzw. ohne Inhibitorzusatz folgendermassen getestet :
Testkeime : Micrococcus luteus ATCC 9341/BC 85, 0, 5 % Einsaat Testmedium : Antibiotic Medium 1 (Difco), 110 ml
Testplatte : Nunc 243 x 243 x 18 mm
Probe : 50 pJ pro Näpfchen (6 mm #) Inkubation : 370, 15 Stunden Enzym : AS-Präzipitat (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) :
1 ml zentrifugiert (20. 000 Upm 10 min) Überstand verworfen, Pellet in 20 ml RP + Z resuspendiert
RP + Z 0, 1 M Phosphatpuffer pH 7, 5 + 1 mM DTT + 10 mM MgCl2
A Transacylierung
Ansatz in Mikrotiterplatten
Substrat 6-APA bzw.
Iso Plin N (2, 5 mg/mi) 10 J. Ù
PACoA (ca. 15 mg 15 nl
Enzym bzw. RP + Z mit bzw. ohne Inhibitor 75 lui
Inhibitor : a) ohne Inhibitor (= Kontrolle) b) 2 mM Jodacetamid d) 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
Sofort bzw. nach 7,30 und 60 min Inkubationszeit werden 20 {il Aliquots der Ansätze entnommen, 1 : 5 mit 50 % Ethanol (Stoppen der Enzymreaktion) verdünnt und im Agardiffusionstest auf Penicillingehalt getestet.
TRansacylierung von Iso-Plin N(# 28 und 36) mit PaCoAfHH 0 mm)
EMI9.1
<tb>
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c)
<tb> S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> s <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> s <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60'
<tb> #28 <SEP> 22,5 <SEP> 25,5 <SEP> 26,0 <SEP> 23,0 <SEP> 21,1 <SEP> 20,8 <SEP> 18,3 <SEP> 14,3 <SEP> 22,7 <SEP> 24,7 <SEP> 25,7 <SEP> 20,7
<tb> #36 <SEP> 27,0 <SEP> 28,3 <SEP> 30,8 <SEP> 28,7 <SEP> 25,2 <SEP> 25,0 <SEP> 23,6 <SEP> 22,1 <SEP> 26,3 <SEP> 27,2 <SEP> 27,7 <SEP> 26,7
<tb> Iso <SEP> N <SEP> Std. <SEP> g/ml <SEP> Plin <SEP> V <SEP> Std. <SEP> g/ml
<tb> 50 <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 2,0 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,25
<tb> #
28 <SEP> 20 <SEP> 16, <SEP> 5 <SEP> 12, <SEP> 4 <SEP> 25, <SEP> 3 <SEP> 24. <SEP> 0 <SEP> 21. <SEP> 7 <SEP> 17. <SEP> 8 <SEP> 9, <SEP> 7 <SEP>
<tb> #36 <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP> 22. <SEP> 1 <SEP> 18, <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Transacylierung von 6-APA mit PaCoA in Abhängigkeit von der Enzymverdünnung
EMI9.2
<tb>
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 51 <SEP> : <SEP> 101 <SEP> : <SEP> 501 <SEP> : <SEP> 100 <SEP>
<tb> S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60'
<tb> 18,3 <SEP> 24,4 <SEP> 24,3 <SEP> 15,7 <SEP> 18,6 <SEP> 25,4 <SEP> 28,5 <SEP> 25,4 <SEP> 16,0 <SEP> 24,2 <SEP> 30,7 <SEP> 30,7 <SEP> 14,5 <SEP> 21,3 <SEP> 26,7 <SEP> 27,0
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 500 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 1000 <SEP> Plin <SEP> V <SEP> Std. <SEP> ns/ml
<tb> S <SEP> 7'30'60'S <SEP> 7' <SEP> 30' <SEP> 60' <SEP> 2,0 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,25
<tb> 148 <SEP> 17. <SEP> 8 <SEP> 20. <SEP> 6 <SEP> 228 <SEP> 0 <SEP> 9,6 <SEP> 10,5 <SEP> 11,1 <SEP> 25,3 <SEP> 24,0 <SEP> 21,7 <SEP> 17,8 <SEP> 9,7
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
B Penicillin V-Spaltung
Ansatz in Mikrotiterplatten :
EMI10.1
a) ohne Inhibitor (= Kontrolle) b) + 2 mM Jodacetamid c) + 2 mM Ethylmaleinimid d) + 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid e) + RP + Z Spaltung von K-Plin V (RH 0 mm) in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren
EMI10.2
<tb>
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c) <SEP> d)
<tb> S <SEP> 7'30'60'S <SEP> 7'30'60'S <SEP> 7'30'60 <SEP> S <SEP> 7'30'60' <SEP>
<tb> 25, <SEP> 7 <SEP> 21, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 7 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 25, <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C)
<tb> S <SEP> 7'30'60'K-Plin <SEP> V <SEP> Std.
<SEP> ig/ml <SEP> Als <SEP> Vergleich
<tb> 26,9 <SEP> 25,8 <SEP> 26,2 <SEP> 26,4 <SEP> 2,0 <SEP> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 0,5 <SEP> 0,25 <SEP> Transaclierung <SEP> S <SEP> 7'30'60'
<tb> 27,4 <SEP> 24,7 <SEP> 23,4 <SEP> 18,4 <SEP> 11,9 <SEP> 6-APA+PACoA#Plin <SEP> V <SEP> 17,0 <SEP> 23,2 <SEP> 26,9 <SEP> 25,9
<tb>
Beispiel 4: Aktivierungs-, Inhibierungs-, Stabilisierungs und p-Profil der PAT :
Das, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellte PAT-Ammonsulfatpräzipitat wird 1 : 10 mit 0, 1 M Reaktionspuffer, in Anwesenheit verschiedener Aktivatoren bzw. Inhibitoren oder Stabilisatoren verdünnt und sofort bzw. nach eintägiger Inkubation bei 4 bzw.-20 im mikrobiologischen Testmodell auf 6-APA-PaCoAAcyltransferaseaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
(Es folgt Tabelle 2)
<Desc/Clms Page number 11>
Tabelle 2 Stabilität bzw. Aktivität der thiolabhängigen Penicillinacyltransferase aus Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271 in Abhängigkeit von der Temperatur. Zeit. pH-Wert und Stabilisatorzusätzen
EMI11.1
<tb>
<tb> Testung <SEP> sofort <SEP> 24 <SEP> h <SEP> bei+4 <SEP> C <SEP> 24 <SEP> h <SEP> bei-20 <SEP> C <SEP>
<tb> Stabilisierungskonditionen <SEP> Mikrobiologische <SEP> 6-APA-PaCoA <SEP> Transacylierungsaktivität <SEP> (mm <SEP> HH <SEP> # <SEP> gegen <SEP> Micrococcus <SEP> lueteus)
<tb> ATCC <SEP> 9341/BC <SEP> 85
<tb> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> + <SEP> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> + <SEP>
<tb> Peni- <SEP> Peni- <SEP> Penicillase <SEP> cillase <SEP> cillase
<tb> Aktivierung
<tb> ohne <SEP> Zusatz <SEP> 11 <SEP> 15, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> - <SEP> -
<tb> +1 <SEP> mM <SEP> 1, <SEP> 4-Dithiothreitol <SEP> (DTT) <SEP> 23, <SEP> 5 <SEP> 37, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> +10 <SEP> mmM <SEP> 1,4-dithiothreitol <SEP> (DTT) <SEP> 22,7 <SEP> 39,0 <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 6 <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 33 <SEP> 0
<tb> + <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> Mercaptoäthanol <SEP> (Beta-ME) <SEP> 15, <SEP> 4 <SEP> 27, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 28,
<SEP> 3 <SEP> 0
<tb> +10 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> 9,8 <SEP> 17,1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 18, <SEP> 5 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> EDTA <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> -
<tb> +1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> +10 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> 26,9 <SEP> 36,7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 2 <SEP> 37 <SEP> 0
<tb> + <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> MgCl2 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> EDTA <SEP> 16, <SEP> 3 <SEP> 25, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 14, <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 23 <SEP> 0
<tb> +%% <SEP> Sorbit, <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT, <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> EDTA, <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> PMSF <SEP> 26,0 <SEP> 38,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 3 <SEP> 33 <SEP> 0
<tb> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Sorbit.
<SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> PMSD <SEP> 25,5 <SEP> 36,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 8 <SEP> 36 <SEP> 0
<tb> pH-Profil
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> HEPES <SEP> pH7, <SEP> 5+ <SEP> 1 <SEP> mMDTT <SEP> 26, <SEP> 6 <SEP> 37, <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 33, <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> NaH2PO4/Na2HPO4 <SEP> pH6,0+ <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> 0 <SEP> 17,3 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> NaH2PO4/Na2HPO4 <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> 22,1 <SEP> 32,7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 29, <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> NaH2PO4/Na2HPO4 <SEP> pH <SEP> 8,0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> 33,8 <SEP> 35,0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 36,
<SEP> 5 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> M <SEP> TRIS/HC1 <SEP> pH <SEP> 8,0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> 14,3 <SEP> 19,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 0
<tb> 0, <SEP> M <SEP> TRIS/HCl <SEP> pH <SEP> 9,0 <SEP> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> DTT <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle 2 (Fortsetzung)
EMI12.1
<tb>
<tb> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> + <SEP> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> +
<tb> Peni <SEP> Peni- <SEP> Penicillase <SEP> cillase <SEP> cillase <SEP>
<tb> Inhibierung
<tb> ohne <SEP> Zusatz <SEP> 22,6 <SEP> 33,6 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 34 <SEP> 0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> Phenylmethansulfonylfluorid <SEP> (PMSF) <SEP> 22,1 <SEP> 32,
3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP> 27 <SEP> 0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> Diisopropylfluorphosphat <SEP> (DIPFP) <SEP> 22,6 <SEP> 34,5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 35 <SEP> 0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> 2,2' <SEP> bipyridyl <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0--0--0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> Hydroxychinolin <SEP> n.
<SEP> 34, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 13, <SEP> 5 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> + <SEP> 2 <SEP> mMO-Phenanthrolin <SEP> 18, <SEP> 9 <SEP> 29, <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 33 <SEP> 0
<tb> +2 <SEP> mM <SEP> N-Äthylmaleinimid <SEP> (NEM) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0--0--0
<tb> + <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> 4-Hydroxymercuri-Na-benzoat <SEP> 19,4 <SEP> 32,3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 11,6 <SEP> 0 <SEP> 2,2 <SEP> 39 <SEP> 0
<tb> Stabilisierung
<tb> ohne <SEP> Zucker <SEP> 21, <SEP> 5 <SEP> 33, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> +5% <SEP> Sorbit <SEP> 23, <SEP> 3 <SEP> 34, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 12, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 3 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> +20% <SEP> Sorbit <SEP> 21, <SEP> 9 <SEP> 34, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 0 <SEP> 15,
<SEP> 2 <SEP> 37 <SEP> 0
<tb> + <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> PMSF <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> 33, <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 40 <SEP> 0
<tb> +1% <SEP> BSA <SEP> SPUR <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 18 <SEP> 0
<tb> +10% <SEP> Glycerin <SEP> 22, <SEP> 0 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 15, <SEP> 2 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> +5% <SEP> Mannit <SEP> 24, <SEP> 0 <SEP> 36, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> SPUR <SEP> 0 <SEP> 16, <SEP> 8 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> +100 <SEP> g <SEP> 6-APA/ml <SEP> 26,8 <SEP> 35,4 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 24 <SEP> 0 <SEP> 17. <SEP> 2 <SEP> 38 <SEP> 0
<tb> gg/ml <SEP> Plin <SEP> V <SEP> Standard <SEP> mm <SEP> HH <SEP> 3 <SEP> gegen <SEP> BC <SEP> 85
<tb> 2 <SEP> 27,4
<tb> 1,5 <SEP> 24,7
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 18, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 0.
<SEP> 25 <SEP> 11. <SEP> 9 <SEP>
<tb>
Enzym : PAT-Ammonsulfatpräzipitat Lagerung und Testung - > 1 + 10 mit 0, 1 M HEPES Reaktionspuffer PH 7, 5 unter verschiedenen Stabilisierungskonditionen
<Desc/Clms Page number 13>
Beispiel 5 : Temperaturstabilität der PAT :
Das, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellte PAT-Ammonsulfatpräzipitat wird 1 : 20 mit 0, 1 M Phosphatpuffer pH 7, 5 inkl. 1 bzw. 10 mM DTT verdünnt, scharf zentrifugiert, der Überstand bei -196, -20, +4, +20 und +37 stationär inkubiert und sofort bzw. nach 1, 4,26 und 120 Stunden im mikrobiologischen Testmodell auf 6-AP A-PaCoA-Acyltransferaseaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.
(Es folgt Tabelle 3)
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle 3
EMI14.1
EMI14.2
<tb>
<tb> DTT <SEP> Inkubationsdauer- <SEP> 196 C-20 C <SEP> +4 C <SEP> RT <SEP> 37 C
<tb> (mM)
<tb> Mikrobiologische <SEP> 6-APA-PaCoA <SEP> Transacylierungsaktivität <SEP> (mm <SEP> HH <SEP> # <SEP> gegen <SEP> Micrococcus <SEP> lueteus <SEP> ATCC <SEP> 9241/BC <SEP> 85)
<tb> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP> sofort <SEP> 30'30'+ <SEP>
<tb> Peni- <SEP> Peni- <SEP> Peni- <SEP> Peni- <SEP> Peni- <SEP>
<tb> cillinase <SEP> cillinase <SEP> cillinase <SEP> cillinase <SEP> cillinase
<tb> I
<tb> sofort <SEP> 14 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 40 <SEP> 0
<tb> 1h <SEP> 14 <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 38 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 38 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 4h <SEP> 12 <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 26h <SEP> 17 <SEP> 33 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 14 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 120h <SEP> 26 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP>
23 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> sofort <SEP> 24 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> 40 <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> 40 <SEP> 0
<tb> 1h <SEP> 15 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 4h---12 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 26h <SEP> 18 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 17 <SEP> 34 <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 27 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 120h <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 28 <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> Sp <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
EMI14.3
EMI14.4
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
:
AS-Präzipitat/1 : 20(HIC-Lauf und Affinitätschromatographie auf 6-APA-AH-Sepharose 4 B (Affinitätslauf) : , 240 g der, wie in Beispiel 2 beschrieben, gewonnenen Ammonsulfatpräzipitation werden in 2000 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 5 inklusive 1 M (NH) SO sowie l mM DTT gelöst und im Arbeitskühlraum bei +40 auf eine BP 113-Säule mit 2000 ml äquilibrierter Phenylsepharose CI-4B aufgegeben.
Anschliessend wird die Säule mit einem Fluss von 50 ml/min mit 3 Bettvolumen an 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 5 inklusive 1 M
EMI15.2
2S04inklusive 1 mM DTT das Ballastprotein entfernt, sodann mit 3 Bettvolumen entionisiertem Wasser (E-H20) inklusive 1 mM DTT das PAT-Enzym eluiert, die aktive Fraktion im PELLICON-Kassettensystem über eine Polysulfanultrafiltrationsmembran mit einem cutoff von 10 kD auf ein Zehntel Volumen konzentriert, mit 1 GV % Sorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA und 0, 1 mM PMSF stabilisiert und bei-20 bis zum nächsten Chromatographieschritt eingefroren.
Die mikrobiologisch erfasste 6-APA-PaCoA-Acyltransferaseaktivität sowie der Gesamtproteingehalt der einzelnen, je ein Bettvolumen umfassenden Fraktionen sind anschliessend wiedergegeben :
EMI15.3
<tb>
<tb> Probe <SEP> Mikrobiologische <SEP> PAT-Aktivität <SEP> Gesamtprotein/Bradford
<tb> (mm <SEP> HH <SEP> 0 <SEP> gegen <SEP> Pseudom. <SEP> aerug.
<SEP> BC <SEP> 248) <SEP> (mg)
<tb> sofort <SEP> 30 <SEP> min <SEP> 30 <SEP> min <SEP> +
<tb> Penicillinase
<tb> Einsatz <SEP> 19 <SEP> 24 <SEP> 0 <SEP> 5483 <SEP>
<tb> PL <SEP> 150/1 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 0 <SEP> 230 <SEP>
<tb> PL <SEP> 150/2 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> IM
<tb> PL <SEP> 150/3 <SEP> 14 <SEP> 15098
<tb> PL <SEP> 150/4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2750
<tb> PL <SEP> 15015 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 390 <SEP>
<tb> PL <SEP> 150/6 <SEP> Spur <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 52 <SEP>
<tb> PL <SEP> 150/7 <SEP> 18 <SEP> 31 <SEP> 0 <SEP> 389
<tb> PL <SEP> 150/8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP>
<tb>
Das aktive Retentat der HIC-Fraktion wird am nächsten Tag unter schonenden Bedingungen aufgetaut und auf eine K 26/40 Pharmacia-Säule mit 50 ml Affinitätsmatrix 6-APA-AH-Sepharose 4 B, welche durch Kuppeln von Penicillin G an AH-Sepharose 4 B (Pharmacia)
mit N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1, 2-dihydrochinolin (EEDQ) nach dem LKB-Protokoll "Practical guide for use in affinity chromatography and related techniques", Reactifs IBF-Societe Chimique Pointet-Girard, France 1983, S. 133, und durch anschliessende Abspaltung der Phenylessigsäure mit löslicher Penicillin-G Amidase von E. coli hergestellt wurde, aufgegeben. Die Säule wird darauf mit einem Fluss von 3 mVmin mit folgenden Medien bei 4 eluiert :
AL 278/1 : 12 Bettvolumen 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 5 + 1 mM DTT + 0, 1 M NaCl
AL 278/2 : 3 Bettvolumen 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 5 + 1 mM DTT + 0, 1 mM NaCI + 1 mM 6-APA
EMI15.4
aufkonzentriert, erneut mit der Stabilitätsmischung 1 GV % Sorbit, 5 mM DTT, 2 mM EDTA und 0, 1 mM PMSF versetzt und in Portionen tiefgefroren.
Die über HPLC bestimmte Substratspezifität dieser mindestens zu 50 % reinen Enzympräparation ist in Tabelle 4 festgehalten.
<Desc/Clms Page number 16>
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P 2/ATCC 48271 (aktive Fraktion Al 278/2 nach Affinitätschromatographie)
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<tb>
<tb> mittels <SEP> HPLC <SEP> bestimmte
<tb> Substrat <SEP> spezifische <SEP> Enzymaktivität
<tb> Produkt <SEP> (mU/mg <SEP> Protein)
<tb> Acylakzeptor <SEP> Acyldonator <SEP> Al <SEP> 278/2
<tb> Iso <SEP> Penicillin <SEP> N <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> 146
<tb> Iso <SEP> Penicillin <SEP> N <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> G <SEP> 80
<tb> 6-APA <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> 393
<tb> 6-APA <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> G <SEP> 329
<tb> 7-ADAC <SEP> PaCoA <SEP> 3-Desacetoxy- <SEP> 49 <SEP>
<tb> cephalosporin <SEP> V
<tb> 7-ACA <SEP> PaCoA <SEP> Cephalosporin <SEP> V <SEP> 0
<tb> Cephalosporin <SEP> C <SEP> PaCoA <SEP> Cephalosporin <SEP> V <SEP> 0
<tb> Penicillin <SEP> G <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> 25
<tb> Penicillin <SEP> V <SEP> PaCoA <SEP> Penicillin <SEP> G <SEP> 99
<tb> H20 <SEP> Iso <SEP> Penicillin <SEP> N <SEP> 6-APA <SEP> 150
<tb> H20 <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> 6-APA <SEP> 75
<tb> H20 <SEP> Penicillin <SEP> G <SEP> 6-APA <SEP> 17
<tb> H20 <SEP>
7-Glutaryl-APA <SEP> 6-APA <SEP> 106 <SEP>
<tb>
PaCoA = Phenoxyacetyl-Coenzym A PeCoA = Phenylacetyl-Coenzym A
EMI16.3
Mono P/Pharmacia (Chromatofocussing AL 310) :
Eine 1 ml Portion der, wie in Beispiel 6 beschrieben, über Affinitätschromatographie gereinigten und konzentrierten PAT-Enzympräparation wird unter schonenden Bedingungen aufgetaut, über eine äquilibrierte PD 10 Sephadex G 25 Fertigsäule gegen 25 mM bis Tris/HCI Puffer pH 6, 3 pufferausgetauscht, dann auf eine mit demselben Puffer äquilibrierte 4 ml FPLC Mono P-Fertigsäule aufgegeben, anschliessend sofort mit einem Fluss von 60 ml/Stunde mit 100 ml eines 1 :
10 verdünnten und auf pH 4, 0 gestellten Polypuffers 74 eluiert, peakweise fraktioniert und die Fraktionen original bzw. über Centricon 10 zehnfach konzentriert über Reverse Phase Chromatographie, SDS-Gradientenpolyacrylamidgelelektrophorese isoelektrische Fokussierung auf Immobiline Basis und Gelfiltration analysiert.
Abbildung 1 zeigt das Elutionsprofil des PAT-Enzyms auf der Mono P. Das multifunktionelle Enzym wird in mindestens drei isoelektrische Formen (PAT 310/3, PAT 310/4 und PAT/310/5) aufgespalten. Diese verschieden geladenen Enzymvarianten können entweder echte Isoenzyme oder verschiedene Redoxformen desselben Enzyms darstellen.
Wie der Abbildung 2 zu entnehmen ist, zerfällt die thiolabhängige PAT aus Penicillium chrysogenum unter den denaturierenden Bedingungen der Reverse Phase Chromatographie (Säule = Biorad Hi Pore RP 304,250 x
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6linearer Gradient zwischen Eluens A : 35 %iges wässriges Acetonitril mit 0, 01 % Trifluoressigsäure und Eluens B : 80 %iges wässriges Acetonitril inkl. 0, 01 % Trifluoressigsäure, 30 min) in ein Polypeptid (1) und je nach Isobzw. Redoxvariante in ein bzw. zwei unterschiedlich hydrophobe Polypeptidvarianten (2a) und (2b).
In der SDS-Gradienten Polyacrylamidgelelektrophorese (siehe Abb. 3a, Bedingungen nach Laemmli, Nature 227, p. 680-685, 1970 ; aber Gradientengel mit 8-20 % T) zerfällt das PAT-Enzym in zwei verschieden grosse Polypeptide mit einem MG um 30 und 8 kD. Durch RPC und anschliessende SDS-Gradienten-PAGE kann gezeigt werden, dass das in der RPC zuerst eluierende Polypeptid (1) mit der ca. 30 kD Komponente und die beiden stärker retentierten, hydrophoben Polypeptide (2a) und (2b) mit der 8 kD Komponente identisch sind. Weiters kann durch solche multidimensionalen Analysen gezeigt werden, dass die kleinen Polypeptide (2a) und (2b) auf der SDS-Gradienten PAGE dieselbe Wanderungsstrecke besitzen, während das grosse ca. 30 kD Polypeptid (1) der basischen Iso- bzw.
Redoxvariante etwas schneller wandert als das entsprechende Polypeptid (1) der mehr sauren Form.
Bei der isoelektrischen Fokussierung (IEF) auf Ampholinebasis (siehe Abb. 3b, methodische Durchführung nach LKB Application Note 1804) zeigt der aktive Affinitätspool drei eng beisammenliegende Banden mit einem isoelektrischen Punkt um 5, 1.
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Im engen pH-Bereich der hochauflösenden IEF auf Immobilinebasis (siehe Abb. 3c, methodische Durchführung nach LKB Application Note 1819) zeigen die über Chromatofokussierung getrennten PATVarianten pI-Werte um 5, 15, 5, 06 und 5, 32.
Bei der MG-Bestimmung über Gelfiltration wird auf Superose 12 von Pharmacia (Eluens 0, 1 M Phosphatpuffer pH 7, 5 inkl. 1 mM DTT, 0, 4 ml/min) ein MG von 36, 5 kD bzw. auf der TSK-G2000 SW von LKB (dasselbe Eluens mit 0, 5 ml/min) ein MG von 38 kD bestimmt, was mit der Summe beider denaturierten Polypeptide (1) und (2) gut korreliert.
Beispiel 8 : N-terminale Sequenzierung der Polypeptide (1) und < sowie (2b) :
Eine weitere Portion (2 mg Protein) der, wie in Beispiel 6 beschrieben, über Affinitätschromatographie gereinigten PAT-Enzympräparation wird nach schonendem Auftauen unter zweimal über RPC (dieselbe Säule und Bedingungen wie in Beispiel 7 angeführt, aber mit flacher ansteigendem Gradienten : min/% B 0/0,8/0, 20/12, 25/12,30/100, 33/100,36/0, 40/0) getrennt, die Fraktionen mit den Polypeptiden (1) sowie (2a) und (2b) lyophilisiert und im Protein Sequenator N-terminal sequenziert :
N-terminale Aminosäuren-Sequenz
30 kD Einheit / Polypeptid (1)
5 10 15 20 25
1-Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys-Gln-Leu-Pro-Asn-Gly-Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Asn-Trp-Asp-Phe-Phe-Ser-Ala-Thr-Lys-
30 35 37 Glu-Asn-Leu-Ile-Arg- -Gln--Gly-
8 kD Einheit I/Polvpeptid (2 a)
1 5 10 15 20 25 Met-Leu-His-Ile-Leu-Cys-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-Ile-Gly-Tyr-GIu-His-Gly-Ser-Ala-Ala-Lys-Ala-Val-Ile-
30
Ala-Arg-Ser-Ile-Asp-Phe-Ala-Val-Asp-
8 kD Einheit n/Poivpeptid f2 b)
1 5 10 15 20 25 Met-Leu-His-Ile-Leu-Cys-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu-ne-Gly-Tyr-Glu-His-Gly-Ser-Ala-Ala-Lys--Val-Ile-Ala-
30 35 Arg--lle-Asp-Phe-Ala-Val-Asp-Leu- -Gly--Thr-
Wie in der SDS-Gradienten PAGE unterscheiden sich die in der RPC unterschiedlich retentierten kleinen Polypeptide (2a) und (2b)
im sequenzierten Molekülschnitt nicht.
Beispiel 9: Sequenzierung tryptischer Peptidfragmente von Polvpeptid (D : Eine, wie im Beispiel 8 beschrieben, hergestellte lyophilisierte Fraktion von Polypeptid (1) wird nach J. M.
Wilkmson (Practical Protein Chemistry-A Handbook, edited by A. Darbre, 1986, J. Wiley & Sons Ltd. ) mit Trypsin enzymatisch gespalten, einzelne Peptidfragmente werden über Reverse Phase Chromatographie isoliert und im Protein Sequenator sequenziert.
Folgende Aminosäure-Teilsequenzen werden u. a. erhalten :
AS-Teilsequenz 2 (tryptisches Peptidfragment von Polypeptid (l)) : 1 5 10
Gly-ala-Thr-Len-Phe-Asn-Ile-Ile-tyr-Asp-His-Ala-Arg AS-Teilsequenz 3 (tryptisches Peptidfragment von Polypeptid (l)) :
1 5 10 Pro-Thr-Asn-Pro-Asp-Glu-Met-Phe-Val-Met-Arg
<Desc/Clms Page number 18>
AS-Teilsequenz 4 (tryptisches Peptidfragment von Polypeptid (l)) : 1 5 10 Glu-Leu-Asp-Pro-Leu-Pro-Asp-Ser-Trp-Asn-Arg AS-Teilsequenz 5 (tryptisches Peptidfragment von Polypeptid (l)) :
1 5 10 Met-Glu-Phe-Leu--Asp-Gly-Phe-Asp-Gly-Thr-Lys AS-Teilsequenz 7 (trypdsches Peptidfragment von Polypeptid (1)): 1 5 10 14
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8 (trypdsches Pepddfragment1 5 10 15 20 Val-Gly-Phe-Asn-Ser-Ala-Gly-Val-Ala-Val-Asn-Tyr-Asn-Als-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro-Thr-Gly-
25 30 32 Val-Pro-Ser-His-ne-Ala-Leu-Arg Beispiel 10 : Isolierung von polyfATRNA aus Mycel von Penicillium chrysogenum :
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mittels eines Büchner-Trichters abfiltriert, kurz mit TE gewaschen (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben.
Dieses Pulver wird in Lyse-Puffer (5 M Guanidinmonothiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,8 % ss-Mercatoethanol) suspendiert (3 ml Lyse-Puffer pro g Mycelfeuchtmasse) und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Isolierung der Gesamt-RNA erfolgt nach einer beschriebenen Methode (Cathala et al., DNA 2 [1983], 329-335). 60 g Mycel-Feuchtmasse erlauben es, etwa 18 mg Roh-RNA zu isolieren, die mit Ethanol gefällt und bei-70 aufbewahrt wird. Die
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(A)'enthalten, erneut mit Ethanol gefällt und bei-70 aufbewahrt. Die Integrität der poly(A)+RNA wird durch Gelelektrophorese in Gegenwart von Glyoxal (Maniatis et al. ) überprüft, die Konzentration durch UVAbsorption.
Beispiel 11 : Partielle Sequenzierung einer RNA. die für das Enzym PAT kodiert :
Aus der Aminosäuresequenz des Polypeptides (1) der PAT (Beispiel 8) lässt sich aufgrund des genetischen Codes eine DNA-Sequenz ableiten (Fig. 5). Ein Bereich von 17 bp, der eine minimale Anzahl von unterschiedlichen Sequenzen zulässt, wird für die Synthese von Oligonukleotidgemischen ausgewählt, 4 Gemische mit je 4 unterschiedlichen Oligonukleotiden, die zu dem Sinn-Strang und damit auch zur RNA komplementär sind, werden synthetisiert (Oligonukleotidgemische (1), (2), (3), (4) in Fig. 5).
Diese Oligonukleotide werden enzymatisch phosphoryliert und dadurch radioaktiv markiert (Maniatis et al. ). 150 ng Oligonukleotide werden in 12 tu Reaktionsansatz (50 mM Tris-HCI, pH 9, 5, 10 mM MgCt, 5 mM DTE, 5 % Glycerin) mit 250 Ci ATP (Amersham PB 10218) mit 16 Einheiten Polynukleotidkinase für 30 Minuten bei 37 inkubiert. 10 g der poly(A)+RNA (Beispiel 10) werden in 250 mM KCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8, 3 mit 2 go 32p markiertem Oligonukleotidgemisch in einem 0, 5 ml Reaktionsgefäss vermischt. Die Mischung wird 2 Minuten auf 75
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ddCTP oder 1 l 1 mM ddTTP gegeben.
Nach der Zugabe von je 2) 1 poIy (A) RNA-OIigonukleotid-Gemisch wird der Inhalt des Eppendorfgefässes kurz zentrifugiert und 45 Minuten bei 50 erwärmt. Die Reaktion wird durch 2 Stop-Puffer (99 % Formamid, 0, 3 % Bromphenol-Blau, 0, 3 % Xylencyanol) und dreiminütiges Kochen beendet. Je 4 pl der Proben werden auf ein 8 %iges Polyacrylamid/Harnstoffgel aufgetragen und 2, 5 Stunden bei 40 W aufgetrennt. Nach dem Lauf wird das Gel für 20 Minuten in 5 % Methanol, 5 % Essigsäure gelegt und 1 Stunde bei 80 0 getrocknet. Das abgekühlte Gel wird in Haushaltsfolie eingeschlagen. Ein Röntgenfilm (Kodak XOmat AR) wird für 20 Stunden aufgelegt.
Die Sequenz, die sich von diesem Röntgenfilm ablesen lässt, ist wiedergegeben : 5'-CCATTTGGAAGTTGACAATAGGCAGTGGTG
CAGCCATCACGGGCTCCTTGAGCCCGTATG CAAATTCCGTGCGGGTATTAAGCATGACAA TCTGGAGACATCGCGTTCA-3'
Die Positionen 1 bis 29 sind komplementär zur DNA-Sequenz, die sich aus der Aminosäuresequenz des Polypeptides (1) der PAT ableiten lässt (Fig. 5,6 D). Ein Oligonukleotid, das die ersten 30 Nukleotide dieser Sequenz umfasst, wird synthetisiert.
Beispiel 12 : Konstruktion einer genomischen Genbank von Penicillium chrysogenum :
Aus dem Mycel einer in CDS Medium gewachsenen Penicillium chrysogenum-Kultur (Beispiel 10) wird DNA isoliert. Das Mycel wird in flüssigem Stickstoff zerrieben, dann in 1 % Sarkosyl, 0, 1 M EDTA, pH 8, 100 p. g Proteinase K/ml gegeben (1 g Mycel/25 ml) und 48 Stunden bei 37'geschüttelt. Die Mischung wird dreimal mit Phenol extrahiert und nach Zugabe von 0, 1 Volumenanteilen 3 M Natriumazetat, pH 5, 2, mit Ethanol gefällt. Anschliessend wird eine CsCI-EtBr-Zentrifugation durchgeführt (Maniatis et al. ) und nach Extraktion mit Isoamylalkohol und Dialyse gegen TE die Konzentration durch UV-Absorption bestimmt.
Die DNA wird ausserdem durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. 300 pg Penicillium chrysogenum DNA werden
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200 jg/ml, Vektor zu Penicillium chrysogenum-DNA im molaren Verhältnis von 1 : 1). Das Ligationsgemisch wird mit Hilfe von Proteinextrakten ("packaging mixes", Maniatis et al. ) in vitro verpackt Die entstandenen Lambda-Lysate werden auf dem Indikatorstamm NM539 (Frischhauf et al. ) getitert. Erhalten werden etwa 106 plu.
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13 :40. 000 rekombinante Phagen der Penicillium chrysogenum Genbank in EMBL3 (Beispiel 12) werden mit dem Stamm NM538 (Frischhauf et al. ) auf 90 mm TB-Platten in 0, 7 % Agarose ausgegossen (TB Medium enthält 10 g Bacto Trypton und 5 g NaCI pro l, der pH 7, 5 wird mit NaOH eingestellt).
Von diesen Platten werden je 2 Abdrücke auf Nylon-Filter hergestellt (Amersham Hybond N-Filter).
Nach der UV-Fixierung der DNA werden diese Filter für die Hybridisierung eingesetzt. Das in Beispiel 11 beschriebene 30mer, dessen Sequenz komplementär zu der DNA-Sequenz ist, die aus der Aminosäuresequenz des Polypeptides (1) der PAT ist, wird radioaktiv markiert (T4-Polynukleotid-Kinase-Reaktion wie in Beispiel 11).
Die Hybridisierung wird bei 37 in 6xSSPE (lxSSPE ist 0, 15 M NaCl, 10 mM NaHPO, l mM EDTA, pH 7, 4), 30 % Formamid, 5x Denhard, 0, 1 % SDS, 100 g/ml Heringssperma-DNA, 0, 1 mM ATP, 3 ng/ml 32P-markiertes Oligonukleotid für etwa 20 Stunden durchgeführt. Die Filter werden dann dreimal 10 Minuten bei Raumtemperatur in 2x SSC (lxSSC ist 0, 3 m NaCI, 0, 03 M Natriumcitrat, pH 7, 0), 0, 1 % SDS und anschliessend dreimal 20 Minuten bei 56 in Ix SSC, 0, 1 % SDS gewaschen und nach dem Trocknen autoradiografiert. Regionen in der Agaroseschicht der ursprünglichen Platte, die positiven
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8geeignete Verdünnung wird mit NM538 als Indikatorstamm erneut auf TB-Platten ausgegossen.
Die Phagen auf diesen Platten werden auf Nylonfilter übertragen und wie oben beschrieben hybridisiert. Aus Plaques, die zum zweiten Mal positive Signale ergeben, werden die entsprechenden rekombinanten Lambda-Phagen isoliert. Die
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gereinigte DNA dieser Phagen wird für Restriktionsanalysen und Southernhybridisierungen verwendet. Ausserdem werden Subklonierungen in Plasmide (pUC 12, Messing, Methods Enzymol. 101, 20,1983) und M13-Vektoren durchgeführt (M13mpl8, M13mpl9, Norrender et al., Gene 26, 101,1983).
Die Sequenzierung eines M13mpl9-Subklons mit dem Oligonukleotid ergibt folgende Sequenz :
5'-CATCACGGGCTCCTTGAGCCCGTATGCAAA
TTCCGTGCGGGTATTAAGCATGACAATCTG GAGACATCGCGTTCACCCCTTTGCAATACC
TGGTTTTTCGGGGGTCATCGGTCAGCATTG
GTGCAGAAAATGTAGGAAAGACCGAAGTGG
CACTCACCGCGAATCTCCTCGTAGTATTTG
GGCCATCTTTCCTCGATC-3'
Die Nukleotide 35 bis 109 der DNA-Sequenz, die mit Hilfe der RNA bestimmt werden (Beispiel 11), stimmen mit den Nukleotiden 1 bis 75 dieser DNA-Sequenz überein (Fig. 6 F).