JP3007092B2

JP3007092B2 - 抗生物質レウテリン

Info

Publication number: JP3007092B2
Application number: JP63504168A
Authority: JP
Inventors: ドブロゴスズ，ウオルター・ジエイ; リンドグレン，スベン・イー
Original assignee: バイオガイア・バイオロジクス・エイビー
Priority date: 1987-05-01
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 2000-02-07
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: DE3855664D1; DK542889A; FI960543A; CA1314255C; DK542889D0; NO885833D0; EP0698347A2; DE3856591D1; EP0357673A4; JPH11137292A; JPH02503385A; EP0698347B1; NO301430B1; JP3244659B2; AU1724588A; NO308982B1; ATE145243T1; DK174229B1; FI895197A0; AU620807B2

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、レウテリン（reuterin）と表示する新規な
抗生物質の産生能を有するラクトバシルス・レウテリ
（Lactobacillus reuteri）およびその組成物に関す
る。

背景の情報ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuter
i）、すなわち、乳酸杆菌属（Lactobacillus）（この種
のある菌株はラクトバシルス・フアーメンタム（Lactob
acillus fermentum）として以前に同定された（１、
２））の新規に表示する種、は、ヒト、ブタおよび他の
動物の胃腸（GI）管の常在性微生物（resident）であ
る。ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）の新基準
（neotype）の菌株は、DSM20016（ATCC No.53609）で
ある。この菌株および新規に分離された菌株1063（ATCC
No.53608）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（the American Type Culture Collecti
on、米国マリイランド州ロックビレ）に1987年４月17日
に受託され、公衆に入手可能である。動物の胃腸管は、
集合的に土着のミクロビオタ（indigenous microbiot
a）として知られている、推定300〜500種の微生物を収
容する複雑な生態系である。腸の微生物学の分野におけ
る100年の徹底的な研究にかかわらず、これらの微生
物、異なる種の間に存在する相互関係およびミクロビオ
タとそれらの宿主との間の共生の関係の性質について知
るべきことがたくさん残っている。

ある条件下に、土着のミクロビオタのある構成員は種
々の腸の病気を引き起こす日分見性の病原体となること
ができる。しかしながら、より頻繁に、病原体は胃腸管
に食物または水中の汚染物として入る。後者のなかで顕
著なものはある数のバクテリア（例えば、大腸菌、サル
モネラ属の種、赤痢菌属、エルジニア・イテロコリチカ
（Yersinia interocolitica）、コレラ菌、ビブリオ・
パラヘモリチクス（Vibrio parahaemolyticus）、カン
ピロバクテル・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）
およびクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium
difficile））、ウイルス（例えば、ロタウイルス、
アストロウイルス（astrovirus）およびシリシウイルス
（cilicivirus））および腸寄生生物（例えば、ジアル
ジア属およびアメーバ属の種）である。これらおよび他
の微生物により引き起こされる急性および慢性の腸の病
気は世界中で起こり、かなりのヒトの苦痛および経済的
に重要な動物の損失を引き起こす。ある種の微生物の活
性は、また、胃腸管内の突然変異原の産生と関連づけら
れてきている。

また、土着のミクロビオタはそれらの宿主と共生また
は共力の関係で存在して、宿主の一般の健康および良好
な生活に多くの積極的な（共生の）方法で寄与する。微
生物（germ）不含の動物は、とくに健康であるというわ
けではなく、そして発育に劣った胃腸管を有する。それ
らに提供された栄養に富んだ安定な生態系の報酬とし
て、土着のミクロビオタはそれらの宿主に、なかでも次
の各種利益を提供する：（ｉ）腸の病原体に対する保
護、（ii）胃腸管の上皮粘膜系の正常の発育および機能
の刺激、（iv）種々のビタミンおよび他の栄養物質の産
生および（ｖ）宿主の豊富な内因性粘膜組織の再代謝。

現在において、土着のミクロビオタの組成および数が
制御される方法は殆ど理解されていない。これらの制御
は次のような因子をふくむ多数の種の間の複雑な相互作
用の結果である：レドックス電位、表面のpH、脂肪酸の
阻害作用、硫化水素、脱接合（decnjugated）胆汁塩類
およびなおさらに同定されない阻害物質、ならびに因
子、例えば、栄養物質を制限するための競合およびミク
ロビオタが胃腸管の上皮表面と関連しかつ前記表面へ付
着する能力。

動物の誕生後短い時間で、大腸菌および腸の連鎖球菌
は胃腸管内に現れるほとんど普遍的な最初のバクテリア
である。乳酸杆菌属はほとんど常に同時か、あるいは直
後に伴い、その後腸内に見いだされる支配的なバクテリ
アの群となる。小腸の微生物、とくに乳酸杆菌属（Lact
obcillus）および連鎖球菌属（Streptococcus）に属す
るものはバクテリアおよび非バクテリアの病原体に対す
る保護的価値を有し、そして動物における健康な体重の
増加を促進するようである。栄養条件にめんどうな腸内
バクテリアであるので、乳酸杆菌は胃腸管の末端領域よ
りはむしろ、より近接の栄養に富んだ領域において、そ
れらの生態学的地位を見いだすと信じられる。

多数の場合について報告されているように、乳酸杆菌
（３）は、大きい数の非病原性の無毒のバクテリアを包
含し、ヒトおよび動物の健康および良好な生活において
重要な共生の役割を演ずる。乳酸杆菌属（Lactobacillu
s）種はヒトおよび動物の食物に添加して、食物を保護
し、食物の風味を増大し、そして／または共生の目的で
添加されるので、これらのバクテリアは胃腸管に存在す
るようになるであろう。例えば、ラクトバシルス・プラ
ンタルム（Lactobacillus plantarum）菌株は、商業的
に大量に増殖され、そして種々のヒト（肉類、植物およ
び毎日の製品）および動物（サイレージ）の食物の商業
的保存のための開始培養物として使用される。ラクトバ
シルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilu
s）菌株は、商業的に大量に増殖されて、ヒト（例え
ば、ミルク）または動物（飼料）の食物に、これらのバ
クテリアを共生の利益のために胃腸管に導入する手段と
して添加される。乳酸杆菌属（Lactobacillus）の治療
の有益な効果についての報告は、近年増加し、規定食の
乳酸杆菌属（Lactobacillus）の治療は（ｉ）西洋食の
ヒトの集団を結腸癌から保護し（４）、（ii）ラットに
おいて実験的に誘発した大腸の腫瘍の発生を減少し
（５）、（iii）ヒトにおいて近位発癌物質への前発癌
物質の転化を触媒することが知られているバクテリアの
酵素の便濃度を減少し（６）、そして（iv）ブタにおけ
る血清コレステロールのレベルを減少する（７）ことが
発見された。

乳酸杆菌属の代謝の代謝最終生成物、例えば、酢酸、
乳酸および過酸化水素は、それらの抗微生物活性につい
てよく知られている。２つの研究所の報告によると、ヘ
テロ発酵性の種、乳酸短杆菌（Lactobacillus brevi
s）、ブフナー菌（Lactobacillus buchneri）（８）お
よび乳酸杆菌属（Lactobacillus）菌株208−Ａ（９、1
1）はグリセロールを嫌気的に代謝する。後者の菌株は
２モルのグリセロールを嫌気的に脱水して（グリセロー
ルデヒドロゲナーゼを含む）２モルのβ−ヒドロキシプ
ロピオンアルデヒドを生成し、これは不均化して１モル
のβ−ヒドロキシプロピオン酸および１モルの1,3−プ
ロパンジオールとなる。ある乳酸杆菌は、また、バクテ
リオシンまたはバクテリオシン様タンパク質を産生し、
これらのタンパク質はその種または密接に関係する種の
他の構成員に対して殺バクテリア活性を示す。乳酸杆菌
により産生された低分子量の抗微生物物質に関する、い
くつかの実証されていない報告が現れた。それらの存在
はあるとき予測されたが、このような物質は実証または
分離されて来ていない。

乳酸杆菌属に関連する抗微生物活性に関した何が知ら
れているかについての要約は、次のとおりである。1907
年において、メトチニコフ（Metchnikoff）（11）は、
胃腸管内に住む有害な腐敗性バクテリアは酸産生性乳酸
杆菌により阻害（または拮抗）されることを報告した。
それ以来、乳酸菌に関連する種々のこのような拮抗活性
は報告された（12）。最もしばしば、これらの抗微生物
活性は、代謝の主要な最終産生物、例えば、乳酸および
酢酸および過酸化水素に関連することが発見された（13
〜18）。乳酸杆菌に関連するが、代謝のこれらの最終産
生物に関連しない、抗バクテリア活性に関する他の報告
が現れた。ギリランド（Gilliland）およびスペック（S
peck）（19）は、試験したラクトバシルス・アシドフィ
ルス（Lactobacillus acidophilus）菌株の間で変化す
る、広いスペクトルの拮抗を報告した。過酸化水素は阻
害の応答の部分的原因であった。トラメア（Tramaer）
（20）は、E.coliのラクトバシルス・アシドフィルス
（L.acidophilus）による阻害は、低いpHにおける乳酸
の強い殺菌作用のためであることを示した。追加の阻害
因子の形成は、また、示唆されたが、同定されなかっ
た。広いスペクトルの拮抗物質は、シャハニ（Shani）
ら、レディー（Reddy）およびシャハニ（Shani）、およ
びハムダン（Hamdan）およびミコラグチク（Mikolagci
k）（21〜25）により報告された。これらの報告の各々
において、拮抗物質は11％の非脂肪のドライミルクの固
体中で乳酸杆菌属（Lactobacillus）を増殖させる間産
生され、そして乳酸と区別することが困難であり、こう
して完全に抗生物質レウテリンと無関係であるように思
われた。これらの研究において、ハムダン（Hamdan）お
よびミコラグチク（Mikolagcik）（24〜25）は、シドリ
ンと彼らが名付けた物質の最も強い精製および特徴づけ
を実施した。それは低分子量の化合物であり、窒素を含
有せず、酸性であり、そして極めて耐熱性であること
を、彼らは発見した。この物質が産生される条件および
その酸性の性質は、それを抗生物質レウテリンと明確に
区別する。ヨーグルト培養物の間の拮抗活性についての
外観（26）は、ラクトバシルス・アシドフィルス（L.ac
idophilus）、ブルガリア菌（L.bulgaricus）、カセイ
菌（L.casei）、乳酸杆菌（L.lactis）の菌株における
乳酸以外の阻害物質を同定することができなかった。試
験したブルガリア菌（L.bulgaricus）菌株の１つは、前
に、ブルカリカンと命名した抗生物質を産生したと報告
された（23）。

ある数の乳酸杆菌は、殺バクテリア活性を示すタンパ
ク質であるバクテリオシンを産生することが知られてい
る。乳酸杆菌により産生されたほとんどのバクテリオシ
ンまたはバクテリオシン様物質は、狭い範囲の生物学的
活性を示す。しかしながら、ビンセント（Vincent）ら
（27）は、ある数のラクトバシルス・アシドフィルス
（L.acidophilus）分離物により産生された、ラクトシ
ジンと命名された、広いスペクトルのバクテリオシンを
報告した。乳酸杆菌により産生された広いスペクトルの
バクテリオシンの他の報告はない（12）。バクテリオシ
ンはポリペプチドであり、そしてそれらの阻害性質はプ
ロテアーゼにより破壊される。抗生物質レウテリンはポ
リペプチドではなく、そしてその抗微生物活性はプロテ
アーゼにより影響されない。

ある種の抗生物質を産生するそれらの能力に加えて、
ダンディン（Sandine）（28）は、乳酸杆菌がヒト（お
よび動物）の腸管において発揮することができる、ある
数の役割または機能を報告した。これらは次のものを包
含する：有機酸の産生、低いpHおよび酸化−還元電位、
競合的拮抗、胆汁の脱接合および発癌物質の抑制。食事
の付加物の乳酸杆菌は、病気の治療、予防的治療を提供
することによりおよび必要な酵素源として有益であると
思われる。

発明の要約本発明によれば、ラクトバシルス・レウテリ（L.reut
eri）の生物学的に純粋な菌株が提供される。本発明の
制御された培養方法の下で、これらの菌株は、抗生物質
レウテリンと呼ぶ、新たに分離され、特徴づけられた、
広いスペクトルの抗微生物物質である。この抗生物質
は、定められた条件下に、ヒトおよび他の動物に対する
病原性ではない、微生物（L.reuteri）を使用して他の
微生物を殺すために使用することができる。抗生物質レ
ウテリン産生性ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacil
lus reuteri）菌株を分離する本発明の技術は、また、
使用してヒトおよび農業上重要な動物から菌株を分離す
ることができるので、これらの分離された菌株はそれら
が分離された特定の動物のための共生因子として使用す
ることができる。こうして、ブタから分離されたラクト
バシルス・レウテリ（L.reuteri）1063は、ブタにおけ
る大腸菌および離乳した若いブタの下痢の病気の緩和に
おける、およびブタの飼料効率を増加するための共生因
子として、潜在的用途を有する。ブタの小腸から直接分
離した他のホモ発酵性およびヘテロ発酵性乳酸杆菌の乳
酸杆菌と比較して、およびまた、長い期間の間原培養物
中に保持されてきたラクトバシルス・レウテリ（L.reut
eri）菌株20016および27273と比較して、ラクトバシル
ス・レウテリ（L.reuteri）1063は、強い自己凝集反
応、高度の表面疎水性を示し、そして他の菌株より良好
に培養中のブタ上皮細胞に結合する。抗生物質レウテリ
ンを産生する方法およびこの種を収容するすべての動物
の胃腸管（または便）からラクトバシルス・レウテリ
（L.reuteri）の抗生物質レウテリン産生菌株を分離す
る手順も、また、提供される。本発明により提供される
自然に産出する広いスペクトルの抗生物質の大量の産生
は、種々の病気の処置のためにおよび一般の目的の抗微
生物剤として、この抗生物質の使用を可能とする。

好ましい実施態様の説明および好ましい実施態様の例抗生物質産生性菌株の分離宿主特異的ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillu
s・reuteri）菌株を、動物源、例えば、種を収容する動
物の胃腸管または便から、本発明の方法より、分離する
ことができる。ラクトバシルス・レウテリ（L.reuter
i）は、嫌気的条件下に最もよく増殖するが、好気的に
増殖するであろう。胃腸管または便からの懸濁液を、乳
酸杆菌属（Lactobacillus）の増殖に適当な寒天平板上
に広げ、そして寒天平板を乳酸杆菌属のコロニーの増殖
を促進する条件下にインキュベーションする。好ましい
実施態様において、よく発育したコロニーは、37℃にお
いて48時間の嫌気的増殖（酸素の圧力を減少した）後、
乳酸杆菌選択培地（LBS）の寒天平板上に現れる。LBSは
次の成分を含有する（g/）：トリプチカーゼ。10;酵
母エキス、5;KH₂PO₄、61;クエン酸アンモニウム、2;酢
酸ナトリウム（三水和物）、34;MgSO₄（七水和物）、1.
2;MnSO₄（一水和物）、0.13;FeSO₄（七水和物）、0.0
6。pHを濃HClで5.5に調節する；寒天（15g）を添加す
る。培地の滅菌後、グルコース（10g）を添加する。他
の乳酸杆菌属（Lactobacillus）の成長培地を使用する
ことができる。好ましい実施態様において、LBS平板
を、0.50モルのグリセロールおよびラクトバシルス・プ
ランタルム（Lactobacillus plantarum）接種物を含有
する１％の液化寒天の10mでオーバーレイする。それ
ぞれのレウテリン産生性コロニーの分離を保証するため
に、試験前に、LBS培地または他の乳酸杆菌属成長培地
を使用する、初期のLBS平板上で増殖するすべての乳酸
杆菌のコロニーの平板を調製するか、あるいはオーバー
レイの添加前にLBS平板上のコロニーの各々から成長培
地へ乳酸杆菌の細胞を他の技術により移す（複製手
順）。このオーバーレイが固化した後、平板を再び37℃
において嫌気的びん内で48時間インキュベーションす
る。接種したラクトバシルス・プランタルム（L.planta
rum）の増殖の阻害のゾーンは、これらの条件下に抗生
物質レウテリン、を産生するコロニーのまわりに観察さ
れる。

ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）菌株の同定
は、標準の微生物学的試験および種の指標形質の特性を
使用して実証される。ラクトバシルス・レウテリ（L.re
uteri）はヘテロ発酵性種であり、グルコースからガス
およびグルコースからグルコネートおよびアセテート／
エタノールを形成する。API50CH発酵試験（Analy tab
Products、Sherwood Medical Co.、ニュージャージイ
州ニューブルンスウィック）において、それはリボー
ス、アラビノース、グルコース、ガラクトース、ラクト
ース、スクロース、メリボースおよびマルトースと陽性
の反応を示す（ある菌株は、また、キシロースを発酵さ
せる）。種は39〜41のグアニン＋シトシンのモル％を有
し、リジンはムレインのジアミノ酸であり、そして種は
45℃において増殖するが、15℃において増殖しない。ネ
オタイプの菌株、DSM20016と80％以上のDNA−DNAの相同
性を有する菌株は動物の胃腸管内に見いだすことができ
る。

本発明の方法を使用するとき、ラクトバシルス・レウ
テリ（Lactobacillus reuteri）菌株1063は、ブタの胃
腸管から分離され、そして試験した他の菌株より非常に
高いレベルのレウテリンを産生することができることが
示された（後述する）。菌株1063および菌株DSM20016
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（the American Type Culture Collection、米国マ
リイランド州ロックビレ）に1987年４月17日に受託され
た（それぞれ、ATCC No.53608および53609）。

本発明の特徴および利点を、以下の実施例を参照する
と、いっそう明瞭に理解されるであろう。これらの実施
例は本発明を限定するものと解釈すべきでない。

実施例実施例１レウテリンの産生の培養条件および検出抗生物質レウテリンを産生することができるラクトバ
シルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）細胞をあ
る種の好適な条件下に配置すると、レウテリンは産生さ
れる。ある数のアッセイを開発してレウテリンを検出し
かつ定量した。標準の最小阻止濃度（MIC）の手順を応
用して、レウテリンを検出し、そしてその産生に影響す
る因子を明らかにした。E.coli K12を感受性試験微生
物として使用し、そしてアッセイを次のようにして実施
する。E.coliの一夜の培養物を収穫し、無菌の0.05モル
のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で２回洗浄し、こ
の緩衝液中に懸濁し、そしてスペクトロニック（Spectr
onic）70計器を使用する60％の透過率（A420nm）に調節
する。この懸濁を使用して1:100に希釈し、そして0.1m
のアリコートを使用して、滅菌後、次の成分を含有す
る1.0mのMIC培地を接種する（g/）：ビタミン不含
カゼインヒドロリゼイト、3;クエン酸アンモニウム、1.
9;クエン酸、0.63;KH₂PO₄、12.6;MgSO₄（七水和物）、
0.2;7.0に調節したpHおよび20ミリモルのグルコース。
レウテリンの活性について試験すべき試料の無菌の1.0m
の部分を、1.0mのこの接種したMICアッセイ培地に
添加し、そしてよく混合して1:2の希釈物を得る。次い
で、このような希釈物を37℃において24時間インキュベ
ーションし、そして増殖について検査する。次いで、相
対的レウテリン濃度（レウテリンの単位）を、インジケ
ーター細胞の可視の増殖を可能とする希釈に先行する試
料希釈の逆数として、計算する。HPLC分析（後述する）
により決定して、MIC値をレウテリンピーク高さに関係
づける他のアッセイを、また、報告する。

本発明の方法の条件下に、ラクトバシルス・レウテリ
（L.reuteri）は抗生物質レウテリンと呼ぶ本発明の抗
微生物物質を産生する。ある数のヘテロ発酵性および同
種発酵性の乳酸杆菌属（Lactobacillus）菌株をレウテ
リンの産生について試験したところ、ラクトバシルス・
レウテリ（L.reuteri）以外はレウテリンを産生しない
ことが確認された。

レウテリンが産生される条件を決定した。レウテリン
は減少した酸素の条件下を除外して圧力好気的条件（大
気の酸素の濃度）下に産生されない。ラクトバシルス・
レウテリ（L.reuteri）を、主要な炭素およびエネルギ
ー源としてグルコースの代わりに、20〜500ミリモルの
グリセロールまたはグリセルアルデヒドを含有する前述
のMICアッセイ培地中で嫌気的（または静置培養におい
て半嫌気的）に培養したとき、それは産生される。第１
図は、このグリセロール培地における好気的（曲線１）
および半嫌気的（曲線２）条件下のレウテリンの産生を
示す。ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）はこれ
らの条件下に増殖しないが、それにもかかわらずレウテ
リンを産生する。ヘキソース、ヘキシトール、ペントー
ス、ペンチトール、二糖類および種々のリン酸化および
非リン酸化C₃−物質を包含する12の他の物質を、レウテ
リンの産生を支持するそれらの能力について試験した。
表１はこれらの試験のいくつかの結果を示す。20ミリモ
ル（C₆およびC₅の基質）または40ミリモル（C₃の基質）
の濃度で基質を含有する培地を、ラクトバシルス・レウ
テリ（L.reuteri）の不存在下または存在下に５×10₆コ
ロニー形成単位（CFU）/mのE.coliで接種した。グリ
セロールおよびグリセルアルデヒドのみがレウテリンを
産生した。また、グリセロールからのレウテリンの産生
は産生培地中に含められた。表２に示す結果は、40ミリ
モルの濃度で種々の示した基質上で増殖したラクトバシ
ルス・レウテリ（L.reuteri）の上澄み液分画による、
6.7×10⁷CFU/mのE.coliの生存可能な計数の阻害％を
示す。

レウテリンは２つの方法で産生することができる。一
方の手順は相同法であり、そして他方は異種法である。
相同法はラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）細胞
を静置培養で37℃において250ミリモルのグリセロール
溶液中でインキュベーションした。例えば、１のラク
トバシルス・レウテリ（L.reuteri）細胞は乳酸杆菌属
（Lactobacillus）を有する培地（LCM）中で37℃におい
て24〜48時間増殖することができる。LCMは次の成分を
含有する（g/）：トリプチカーゼ、10;酵母エキス、
5;トリプトース、3;KH₂PO₄、3;クエン酸アンモニウム、
1.5;酢酸ナトリウム、1.0;塩類（LBSにおけるような）
システイン−HC1、0.2;およびツイーン−80、1m。pH
を7.0に調節する。グルコース（20ミリモルの最終濃
度）を無菌後に添加する。細胞を遠心により収穫し、10
mの250ミリモルのグリセロール溶液中に懸濁し、静置
培養で37℃において６時間インキュベーションし、次い
で遠心により除去する。レウテリンはこの上澄み液分画
中に存在する。この手順およびその多くの明らかな態様
（例えば、変更した細胞濃度およびインキュベーション
時間）は、レウテリンを産生する簡単なかつ有効な方法
を提供する。

異種法は、ある種の他の（異種）レウテリン刺激微生
物と一緒にラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）を
同時培養することを包含する。この手順において、例え
ば、低い濃度のラクトバシルス・レウテリ（L.reuter
i）（例えば、20〜300μｇの細胞乾燥重量/m）を、生
存可能な異種微生物（例えば、E.coli K12）の細胞と
一緒にグリセロール含有培地（前述の）中に懸濁し、そ
して前述したようにインキュベーションした。0.5また
はそれ以上の生存可能の細胞の比（CFU E.coli/m/CF
U L.reuteri/m）において、レウテリンは刺激した速
度（異種微生物の不存在に関して）において産生され、
そして産生速度／ラクトバシルス・レウテリ（L.reuter
i）バイオマス単位は異種微生物のバイオマスに直接比
例して増加する。レウテリンの合成において異種微生物
が演ずる役割のこの発見は、後述の「飼料の調節」のモ
デルの開発に重要であった。この「異種」細胞の刺激
は、生存可能な細胞の間の細胞対細胞の接触を必要する
と思われる。なぜなら、２つの種がお互いにそれ以外同
一の同時培養系において透析膜により分離するとき、こ
の刺激は起こらないからである（表３）。異種種は少な
くとも一部分ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）
の微小環境においてレドックス電位を低下し、これによ
りレウテリンの産生を刺激するという可能性は、この刺
激作用に寄与するとして除外されていない。レウテリン
の産生は、異種E.coliが生存可能でない場合、あるいは
ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）が生存可能で
ない場合、刺激されない。異種法によるレウテリンの産
生は、グリセロールを代謝する刺激有機体の能力に依存
しない。E.coliの突然変異体は、野生型の細胞ほど有効
にグリセロールを代謝して、レウテリンの産生を刺激す
ることができない。

レウテリンは、生きている動物において起こる生理学
的条件下に産生される。レウテリンの産生（異種法を使
用する）は最初に急速であり、そしてラクトバシルス・
レウテリ（L.reuteri）のバイオマスに比例する（第２
図）が、その後、産生速度／バイオマス単位は、多分、
生存可能な細胞（E.coli/L.reuteri）比の減少および／
またはこれらの条件下で産生されるレウテリンのより高
い濃度に対するラクトバシルス・レウテリ（L.reuter
i）細胞の感受性のために減少する。また第２図に見ら
れるように、ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）
菌株1063（Ｘ）は、異種法により、新基準菌株20016
（Ｏ）が産生するより大きい量のレウテリンを産生す
る。ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）のレウテ
リン抵抗性突然変異体は、なおさらに高いレベルのレウ
テリンを産生する。レウテリンの産生は、25〜37℃の温
度において最大速度で起こる。第３図は、グリセロール
培地中で４、25、37および45axcラクトバシルス・レウ
テリ（L.reuteri）の半嫌気的インキュベーションの間
のレウテリンの産生へのインキュベーション温度の効果
を示す。レウテリンはpH5〜９において産生され、最適
な産生はpH6〜８においてである。第４図は、グリセロ
ール培地中で３時間（曲線３）および24時間（曲線４）
のE.coliとのラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）
の半嫌気的インキュベーションの間のレウテリン産生へ
の培養pHの効果を示す。今日まで、試験したすべてのラ
クトバシルス・レウテリ（L.reuteri）の３つの菌株
は、レウテリンを産生した：新基準、DSM 20016、ATCC
27273［前に発酵菌（Lactobacillus fermentum）と
分類された］および新しく分離された撹拌1063。すべて
の３つの菌株は、相同手順によりレウテリンを産生する
（表５）．異種手順によるレウテリンの産生は、次の方
法でこれらの菌株の間で変化する：産生は、それぞれ、
菌株1063、27273および20016について異種微生物によ
り、大きく、中程度におよびほんのわずかに刺激され
る。

実施例II 抗生物質の特性レウテリンの産生は、培地中のpHの変化の不存在およ
び外部から添加したカタラーゼの存在下に起こる。した
がって、その抗微生物活性は、乳酸発酵のよく知られた
最終産生物、例えば、乳酸および酢酸または過酸化水素
と関連しないか、あるいは他の人により発見された他の
酸性物質（24、25）と関連しない。レウテリンは遠心ま
たは濾過による細胞の除去後培養液中に残る。レウテリ
ンは培地から分離し、そしてHPLCにより溶媒系として水
（脱イオンした）または10ミリモルのH₂SO₄を使用する
か、あるいはＣ−18固相カラムにより精製することがで
きる。レウテリンおよび存在する他の産生物は、HPLCの
間、屈折率（RI）検出器システムを使用して検出され
る。MIC活性を示すRIピークは、この系においてグリセ
ロールと1,3−プロパンジオールとの間で溶離する。¹⁴C
（均一に標識された）グリセロールをレウテリン産生系
において使用するとき、HPLCにより回復されるレウテリ
ンは¹⁴C標識され、この物質が（少なくとも一部分）グ
リセロールの水溶性誘導体であることを示す。

実施例III 抗微生物活性レウテリンは広いスペクトルの抗微生物剤である。レ
ウテリンは殺バクテリア剤として機能する。レウテリン
の産生およびその強力な殺バクテリア活性の証拠の両者
は、第５図に要約したデータにより明瞭に実証される。
示した濃度（CFU/m）のE.coli（実線）およびL.reute
ri1063（破線）は前述のグリセロールカゼイン加水分解
物（○）、同一培地マイナスクエン酸塩（●）および同
一培地マイナスグリセロール（×）中に接種（時間ゼ
ロ）した。同時培養物を半嫌気的に（静置培養）37℃に
おいてインキュベーションし、試料を示した間隔で取り
出して、存在するE.coliおよびL.reuteriの数（CFU/m
）を決定した。これらのデータから理解することがで
きるように、グリセロールが存在するとき、ある物質が
最初の３〜４時間の間に産生され、これは次の数時間の
間に生存可能なE.coli細胞の７〜8log減少を生じた。こ
うしてさらに試験したすべてのグラム陰性バクテリアの
属（Escherichia、Shigella、Salmonella、Proteusおよ
びPseudomonas）および試験したすべてのグラム陽性の
属（Streptococcus、Staphylococcus、Clostridium、Ba
cillus、LeuconostocおよびLactobacillus）はレウテリ
ンに対して感受性であった。しかしながら、多少より高
い濃度のレウテリンは、後者の３つの属の代表的な菌を
殺すために必要である。低級の真核細胞である酵母菌
（Saccharomyces cervisiae）は、また、レウテリンに
より殺される。これらの発見は表６に要約されている。
また、この表に、異種手順によるレウテリンの産生を刺
激する試験した種々の種の能力がしめされている。ま
た、認められるように、L.reuteriそれ自体は、32MIC単
位以上の濃度に暴露する場合、レウテリンに対して感受
性である。また、レウテリン（ほぼ20MIC単位/cmの最終
濃度において）は、シャーガス病を引き起こす原生動物
の寄生生物、トリパノソーマ・クルジー（Trypanosoma
cruzi）の生体外の増殖を阻害することを示すデータ
をわれわれは有する。対照の培養物は正常の増殖および
行動を示したが、レウテリン処置した細胞は移動性およ
び分割する能力を失い、そして生存可能性の損失を示す
形態学的「ラウンディング−アップ（rounding−up）」
を示した。

実施例IV 抗ウイルス活性レウテリンは、また、ウイルスの複製の防止において
有効である。第13図は実験の結果を示し、ここで０〜50
単位/mのレウテリンを、バクテリアのウイルス（それ
ぞれ、ラムダファージまたはファージ8014−B2）で感染
したEscherichia coliまたはLactobacillus plantaru
mの増殖するバクテリア細胞に添加した。14標識グリセ
ロールを使用する予備的結果から明らかなように、0.5m
の溶液中の４μｇのレウテリンはほぼ１単位のレウテ
リンに等しい。４時間後、宿主細胞のコロニー形成単位
（CFU）およびウイルスのプラーク形成単位（PFU）を標
準の微生物学技術によりアッセイした。レウテリンを添
加しないと、微生物細胞の数は４時間の期間で約100倍
増加した。E.coliでは、10単位のレウテリンの添加は、
４時間のインキュベーション後、レウテリン不含対照培
養物に比較して、細胞の数のほぼ100倍の減少およびラ
ムダファージのPFUの数の1000倍以上の減少を引き起こ
した。乳酸杆菌属のCFUおよびPFUのレウテリンによる減
少はめざましくなく、そしてE.coliを使用するよりより
高いレウテリン濃度を必要したが、CFUにおけるよりPFU
のなおさらに大きい傾斜をもつ同様なパターンは25単位
以上のレウテリンの量において観察された。これらの結
果が示すように、レウテリンはウイルスの産生の阻害に
おいて有効であり、そしてこの有効性はバクテリアの宿
主細胞へのレウテリンの効果以上でありこれを越える。

実施例Ｖ共生活性ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuter
i）をブタに与えるとき、それはそれらの胃腸管コロニ
ー化することができる。予備実験において、10⁸〜10¹⁰C
FU/動物の範囲の濃度においてL.reuteri1063細胞を新し
く生まれたコブタの規定食中に含め、そして生存可能な
L.reuteri1063細胞をこれらの動物の便から回復した。
これらのL.reuteriの接種は動物に悪影響を与えなかっ
た。

成体のブタ、コブタ（生後５日）またはノトバイオー
トのコブタを使用する実験を実施し、ここで大量（約10
⁹の細胞）のL.reuteri菌株1063細胞を動物に与えた。約
５〜７日後、十分なL.reuteri細胞はなお動物の便から
回復され、L.reuteriが胃腸管の通過において生存し、
そして動物において十分に長く止まり、コロニー化が起
こり、そしてレウテリンが産生されうることが示され
た。L.reuteri菌株1063によるレウテリンの産生は胃腸
管の環境において期待され、この胃腸管はL.reuteri菌
株を本来分離した環境である。ある種の培地成分または
L.reuteriによるレウテリンの産生に対して条件付けら
れた他の物質、例えば、グリセロールを動物の食物に添
加して、胃腸管内のレウテリンの産生のための条件を最
適化することができる。鳥類を包含する動物の種々の種
（用語「動物」は明らかにヒトおよび鳥類を包含する）
から分離したラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillu
s reuteri）菌株を、菌株を分離した動物の種に、か、
あるいはそれらを分離した以外の種の動物にある量で供
給することができる。

実施例VI リボヌクレオチドリダクターゼの阻害レウテリンはリボヌクレオチドリダクターゼを阻害す
る、デオキシリボ核酸（DNA）の合成において第１工
程。自然において、デオキシリボヌクレオチドの合成た
めの唯一の通路、すなわち、対応するリボヌクレオチド
の直接還元が存在する。デオキシリボヌクレオチドは高
度に特殊化された代謝物であり、そしてDNAのブロック
を構成する役目のみをする。リボヌクレオチドのデオキ
シリボヌクレオチドへの還元を触媒する酵素は、リボヌ
クレオチドリダクターゼである。この還元はDNA合成に
おける最初の前もって必要な工程であり、これにより原
核細胞および真核細胞およびウイルスの成長および増殖
において必須の役割を演ずる。

レウテリンがリボヌクレオチドリダクターゼ（EC1.1
7.4）活性を阻害するという証拠は、次の文献に記載さ
れている手順を使用して得られた:Thelander、Sjoberg
およびEriksson、メソッズ・イン・エンジモロジー（Me
thods in Enzymology）、（Vol.L1）、pp.227−237、
1978。nrdAおよびnrdB遺伝子によりエンコードされる、
この酵素の精製したB1およびB2サブユニットを使用し、
そして分光光度測定アッセイを上の文献に記載されてい
るように使用した。簡潔的には、この手順は次のとおり
である：酵素を25℃において200ナノモルのATP、1.6ナ
ノモルのMgCl₂、80ナノモルのNADPPH、５μモルのＮ−
２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′２−エスタン
スルホン酸緩衝液（pH7.6）、300ピコモルのチオレドキ
シン、40ピコモルのチオレドキシンリダクターゼ、10ナ
ノモルのEDTA、および65ナノモルのジチオスレイトール
を含有する反応混合物中で0.13mの最終の体積でイン
キュベーションした。反応は75ナノモルのCDPの添加に
より開始し、そしてNADPHの酸化は340nmにおいてマイク
ロクベットを装備したツァイス自動記録分光光度計を使
用して監視した。CDPの添加前に、NADPHのバックグラウ
ンドの酸化を記録し、そしてこのバックグラウンドをCD
Pの添加後観測されたNADPHの酸化から減じた。

これらの実施例において使用するレウテリンは、相同
法により調製し、そして256MIC単位/mの活性を含有し
た。レウテリンの非希釈および種々の希釈したものを
（１μの量で）で反応混合物に添加して、リボヌクレ
オチドリダクターゼ活性へのこの物質の効果を決定し
た。この実験の結果を表７に要約する。示されるよう
に、レウテリンは酵素のB1サブユニットの有効な阻害剤
である。また、認められるように、チオレドキシン（酵
素活性に要求される）は、また、レウテリンに対して感
受性である。

バクテリア、酵母菌、かび、原生動物、ウイルスおよ
び新形成および正常の動物細胞の生長を阻害するレウテ
リンの能力は、こうして少なくとも一部分、デオキシリ
ボヌクレオチドの新しい産生を阻害することによりDNA
合成の阻害するその能力に帰属させることができる。

実施例VII レウテリンは有効な食物防腐剤である。

特定の他方のスーパーマーケットから購入した粉砕し
た牛肉を４つの部分に分けた。１つの部分は未処置であ
り、他の部分は肉1g当たり10、50および100単位のレウ
テリンで処置した。すべての試料は４℃において貯蔵
し、試料は生物学的分析のために示した日に取った。

牛肉の試料を取り出し、そして1:10に希釈した（1gの
牛肉:9gの無菌H₂O）。引き続いて小数の希釈物を必要に
応じて作り、そして試料をディフコ栄養寒天上に配置し
た。これらの試料を27℃において24時間インキュベーシ
ョンし、そしてコロニー形成単位/g粉砕牛肉（CFU/g）
として計数した。データが示すように、レウテリンはCF
U/gを有意に減少した（第14図）（□、対照；◆、10単
位のレウテリン；■、50単位のレウテリン；および◇、
100単位のレウテリン）。より高いレベルのレウテリン
（50および100単位/g）では、バクテリアの土着の集団
は減少し、そして６日間の試験期間を通じて対照試料に
より4log単位より大きく低く止まった。

特定の地域のスーパーマーケットから購入した粉砕牛
肉は、完全に接種し、そしてほぼ10⁵CFU/mのE.coli
K12細胞と混合した。混合後、この物質を２つの部分に
分割した。一方の部分は未処置対照（レウテリンなし）
であり、他方の部分は75単位（Ｕ）/g牛肉のレウテリン
を供給した。試料を４℃で貯蔵し、一部分を示した時間
に生物学的分析のために取り出した。この実験におい
て、生存可能な細胞（CFU/g牛肉）の決定を第14図に記
載するようにして実施したが、ただしディフコのマクコ
ンキー寒天（McConkey'Agar）（腸内様バクテリアに対
して比較的特異的）を使用した。第15図から理解するこ
とができるように（□、対照；◆、75単位のレウテリ
ン）、レウテリンはバクテリアの初期の集団を減少し、
そしてこれらの数を９日のインキュベーション期間を通
じて低く保持した。

実施例VIII ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuter
i）＋グリセロールは、新規な有効な食物防腐プロセス
を構成する。この証拠は、モデル系として魚を貯蔵して
得られた。この研究は次のようにして実施した：魚の切
身（タイセイヨウニシン、Clupea harengas）を、次の
処置用溶液中に浸漬した：対照：処置なしグリセロール:250ミリモルのグリセロール溶液菌株1068 :250ミリモルのグリセロール溶液、４×
10⁹CFU/mのL.reuteri1068を含有する（非レウテリン
産生菌株）菌株1063 :250ミリモルのグリセロール溶液、４×
10⁹CFU/mのL.reuteri1063を含有する切身（各々２つの並列試料）を大きいペトリ皿中に８
℃において４日間冷蔵庫内で保持した。次いで、アンモ
ニアの含量および関連するバクテリアのCFU（すなわ
ち、腐敗性シュードモナスおよび添加した乳酸杆菌）を
分析して、食物製品の貯蔵寿命を評価した。表８に要約
する結果は、次のことを示す：（ｉ）添加した乳酸杆菌（グルコース乳酸杆菌属選択
培地、前述、を使用して合計の乳酸杆菌として計数し
た）およびL.reuteri CFU（Ｌ−アラブニノース乳酸杆
菌属選択培地を使用して検出した合計異種発酵性乳酸杆
菌として計数した）は、８℃において良好に生存する
が、有意の程度に増殖しない。

（ii） L.reuteri1063は腐敗性シュードモナスの増殖
を有意に遅延した。L.reuteri1063は多少遅延したが、
腐敗を防止するためには十分でなく、それは一般にlog
8.4シュードモナス計数により示される。

（iii）腐敗性バクテリアへのL.reuteriおよびグリセ
ロールの遅延作用は、アンモニアの有利に強い減少作用
を有する。

（vi） L.reuteri＋グリセロールの食物防腐作用は、
すべての種類の腐敗について示される。

実施例IX レウテリンはグリセロール発酵の産生物である。

レウテリンは、他の乳酸杆菌属（Lactobacillus）種
において起こるグリセロールのヘテロ発酵の同一の型と
関連する新しい産生物である。レウテリンを分離し、そ
してHPLCを使用してL.reuteriによりグリセロール発酵
の産生物として同定することができる。グリセロール、
1,3−プロパンジオールおよびβ−ヒドロキシプロピオ
ン酸（すべて純粋な商業的調製物）は、0.12モル程度に
高い濃度で試験したとき、本質的に抗微生物活性を欠く
ことが示された。

グリセロールの発酵の間のレウテリン＋1,3−プロパ
ンジオールおよびβ−ヒドロキシプロピオン酸のL.reut
eriによる産生は、HPLC分析を使用して確立された。代
表的データは第６図に示す。試料を調製するために、１
のL.reuteri培養物（20ミリモルのグルコースを含有
するLCM中で37℃において48時間増殖させた）を遠心に
より収穫し、無菌のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）
で２回洗浄し、そして10mの0.25モルの無菌グリセロ
ール中に懸濁させた。37℃において６時間インキュベー
ションした後、細胞を遠心により収穫し、そして上澄み
液（以後、試料と呼ぶ）を前述のMICおよび後述のHPLC
によりレウテリンについて分析した。いくつかの実験に
おいて、５μCiの¹⁴C（Ｕ）のグリセロールを0.25モル
のグリセロール中に含めた。試料を0.2〜0.45ミクロン
の生物学的フィルターに通過させ、そして２℃において
無菌的に貯蔵した後HPLC装置中に注射した。

HPLC分析は、次のようにして実施した：試料の各々の
20〜100μの分画をベックマン（Beckman）HPLC装置
（単一のまたは２つの並列の分析用Ｃ−18カラムを装備
した）中に注入した。試料を0.2〜0.45ミクロンのフィ
ルターを通過させた蒸留した脱イオン水で溶離した。溶
離速度は1.0〜1.5m／分であり、そして試料はウォー
ターズ410示差屈折計を使用して監視した。屈折率（R
I）の変化を自動的に記録し、そしてRI（縦座標）対溶
離体積／時間（横座標）をプロットした（示すグラフ上
で右から左に進行する）。試料の各々についての合計の
溶離時間はほぼ15分であり、ピーク１、２および３は、
それぞれ、ほぼ８、７および６分であった。

前述したように調製しそして水で溶離した試料のHPLC
分析は第6A図〜第6E図に示す。ここには、L.reuteri106
3を128および512MIC単位で（それぞれ、グラフ6Aおよび
6B）、L.reuteri20016（グラフ6C）およびL.reuteri A
TCC27273（グラフ6Dおよび6E）を使用して調製した試料
を含める。ピーク１および３は、それぞれ、参照標準の
使用および分離したピークのIRスペクトルの同定によ
り、1,3−プロパンジオールおよびグリセロールと同定
された。これらの条件下に、ピーク２は常にグラフにお
いて見られる特徴ある広いピークとして溶離し、そして
それはMICアッセイを使用して決定して生物学的活性を
有する試料から溶離する唯一の基質である。こうして、
それはレウテリンと呼ぶ抗微生物物質として同定され
る。３つのそれ以上の分析はピーク２がレウテリンであ
るという結論を支持する。第１に、ピーク２中に存在す
る物質の量はもとの試料のMIC値に直接比例して増加す
る。これは、それぞれ、128および512のMIC力価を有す
る試料中で、L.reuteri1063により産生されたレウテリ
ンを表すグラフ6Aおよび6Bにおいて見られる。第２に、
こうして試験したすべてのL.reuteri菌株は、さらに、M
ICにより決定してレウテリンを産生し、そして各場合に
おいてピーク２は存在する（参照、グラフ6A〜6E）。今
日まで試験したすべての他の乳酸杆菌属（Lactobacillu
s）種は匹敵する生物学的活性（MIC活性）を欠き、そし
てHPLCにより分析したとき、ピーク２の領域において溶
離する物質をほとんどあるいは全く示さない。第３に、
L.reuteri ATCC27273の自発的変異型または突然変異体
を分離し、そして精製した。この変異型はかなり低いレ
ベルのレウテリンを産生し（MICアッセイにより決定し
て）、グリセロール−E.coliオーバーレイ平板において
弱い阻害ゾーンを示すか、あるいは全く示さず、そして
グラフ６において見られるように、その親（野生型）菌
株に比較してピーク２領域において溶離する物質を非常
に少なく産生する（グラフ6D）。

0.01モルのH₂SO₄を溶離溶媒として使用するとき、β
−ヒドロキシプロピオン酸のピークは第6F図において見
られるように分解される。この実験において使用した試
料は菌株1063から得られ、そして1024単位のレウテリン
を有した。¹⁴C（Ｕ）−グリセロールを本質的に同一の
実験において含め、HPLCにより溶媒として0.01モルのH₂
SO₄を使用して分離し、そして放射能の決定（パッカー
ド液体シンチレーション分光光度計）ための別々のピー
クとして集めると、次の結果が得られた:25,776;53,428
および61,428の合計のcpmは、それぞれ、β−ヒドロキ
シプロピオン酸（ピーク４）、1,3−プロパンジオール
（ピーク１）、レウテリン（ピーク２）および使用され
ていないグリセロール（ピーク３）として回収された。
これらの結果および下に表すレウテリンについてのデー
タが示すように、グリセロールはこれらの条件下に次の
反応に従って発酵された：５グリセロール→２ 1,3−プロパンジオール＋１
β−ヒドロキシプロピオン酸＋１レウテリン実施例Ｘ予備的レウテリンの特徴づけ粗製調製物中のレウテリンの特徴づけは、次のことを
示した。レウテリンは高度に水溶性であり、ヌクレアー
ゼおよびプロテアーゼに対して抵抗性であり、そして熱
（100℃、10分間）に対して、とくにpH9.0以上において
不安定である。レウテリンは明らかにバクテリオシンで
はない。予備分析的分析を、前述したようにHPLCにより
分離された本質的に純粋なレウテリン（多少のグリセロ
ールが存在する）について実施した。試料をリサーチ・
トライアングル・インスチチュート（Reseach Triangl
e Institute（Reseach Triangle Park、ノースカロ
リナ州）およびデパートメント・オブ・ケミストリー
（ノースカロリナ州立大学、ノースカロリナ州ラレイ）
に、質量、NMRおよび赤外スペクトル分析のために提出
した。これらのデータを第７図〜第11図に要約する。LC
MS分析はフィンニガン（Finnigan）4500HPLC/MSシステ
ムでベステク・インターフェース（Vestec Interfac
e）を使用して実施した。分離はアミネックス（Amine
x）87Hカラムを使用して実施し、溶離液は0.8m／分の
流速であった。正イオン（第７図）および負イオン（第
８図）の両者について、質量スペクトル（縦座標上にプ
ロットした相対強度、質量対エネルギー電荷、m/e値、
横座標）はほぼ162g/モルの分子量を示した。（ｉ）前
述のラジオアイソトープの分析および（ii）レウテリン
が陽性のシッフ反応を与えるという観察（アルデヒドの
官能基の存在を示す）と一緒に、この予備的情報が示す
ように、レウテリンは分子量式C₆H₁₀O₅を有し、そして
次の構造を有することが推測される：第９図に示す赤外スペクトル分析、第10図に示す炭素
核磁気共鳴（NMR）スペクトル分析および第11図に示す2
50メガヘルツのプロトンNMR分析は、レウテリンについ
てのこの提案する構造と一致する。これらのNMRスペク
トルのデータは、輻射線の吸収（縦軸）対磁場のスイー
プ（sweep）（横軸）のコンピューター処理したプロッ
トである。正確な構造についての情報は、大量の絶対に
純粋なレウテリンが入手可能となったとき、得られた。

分子の１端上のアルデヒド炭素および他端のアルコー
ル炭素を包含する、予備的データから推定したレウテリ
ンについての炭水化物様構造に基づいて、アルデヒド基
および末端ヒドロキシル基の間の反応に対応するヘミア
セタールとしてこの物質が存在することが示された。こ
のような構造の三次元の分子モデルは、ペントース、例
えば、Ｄ−リボースに対する密接な類似を有する分子を
明らかにした。

この基準に基づいて、レウテリンはDNA合成において
特異的に含まれる第１酵素、リボヌクレオチドリダクタ
ーゼ上のそれらの認識部位についてリボヌクレオチドと
競争することができるＤ−リボース類似体でありうると
推定された。こうして、レウテリンはDNA合成に対して
特異的な第１工程を、リボヌクレオチドのデオキシリボ
ヌクレオチドへの転化を阻害することによって阻害する
ことができるであろう。レウテリンがペントース類似体
であり、そしてリダクターゼ部位で結合する場合、急速
に増殖する悪性細胞、例えば、癌細胞において優先的に
結合することが期待されるであろう。これらの仮定は、
（ｉ）レウテリンの提案された構造、（ii）レウテリン
がその殺バクテリア作用を発揮する速度（実験のデータ
はレウテリンの添加直後E.coliの増殖の阻害を実証す
る）および（iii）原核細胞および真核細胞（S.cerevis
iae）およびTrypanosoma cruzi）の両者がレウテリン
に対して感受性であるという事実と一致する。こうし
て、レウテリンは抗菌・かび、抗寄生生物、抗ウイルス
および抗癌剤ならびに抗バクテリア剤であると考えらる
ことができるであろう。

実施例XI 化学分析のための精製したレウテリンの産生ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuter
i）1063の一夜の培養物の１％の接種物（１）を、グル
コースを有する変性乳酸杆菌属担持培地（LCMG）中で24
時間増殖させた。変性LCMGは溶液１につき次の成分か
ら成る:5gの酵母エキス、10gのトリプチカーゼ、3gのト
リプトース、3gのリン酸カリウム（一塩基性）、3gのリ
ン酸カリウム（二塩基性）、2gのクエン酸アンモニウ
ム、1.15gの酢酸ナトリウム・3H₂O、5mgの硫酸マグネシ
ウム・7H₂O、0.31mgの硫酸マンガン、0.2mgの硫酸第一
鉄・7H₂Oおよび0.5mgのＬ−アスコルビン酸。次いで、
この培地をオートクレーブ処理し、そして10mgの濾過滅
菌した２モルのグルコースを冷却した培地に添加した。
L.reuteriの細胞を4000×ｇで10分間収穫し、そして50
ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で２回洗
浄した。

洗浄後、L.reuteriを10mg細胞/m脱イオン水の濃度
に懸濁した。無菌のグリセロールを250ミリモルの濃縮
物が達成されるまで添加した。この細胞懸濁液を37℃に
おいて３時間インキュベーションして、レウテリンを産
生および蓄積した。次いで、細胞を4000×ｇで10分間沈
澱させ、そして廃棄した。上澄み液を0.45ミクロンのフ
ィルター（Acrodisc）で濾過して、残留する細胞を除去
し、引き続いてレウテリンの分離に使用した。

レウテリンの精製は、１×30cmのガラスカラム、バオ
ラド（Birad、カリフォルニア州リッチモンド）からのA
G50W、８％の架橋した−400メッシュの樹脂を充填し
た、を使用して達成した。60％のアセトニトリル40％の
蒸留脱イオン水から構成され、1.1g/のトリフルオロ
酢酸を含有する溶媒を、ベックマン（Beckman）110A H
PLCポンプを経て供給した。溶媒の流速は1.5m／分で
あり、そして検出はウォーターズ（Waters）410示差屈
折計で２×の感度および５の目盛り倍率を使用して達成
した。400μの上澄み液をアトレックス（Atlex）210
注入装置（Beckman）を、500μの試料ループをもつ、
使用して注入し、そして分画を手動的に集めた。次い
で、分画を吸引下に周囲温度において回転蒸発してアセ
トニトリルを除去した。試料を引き続いてビルチス（Vi
rtis）10−030凍結乾燥装置を使用して凍結乾燥乾固し
た。分画の一部分をアミネックス（Aminex）87H分析用
カラム（Birad）に通過させることによって、純度をア
ッセイした。

２つの分画のうち最初のものはカラムから15および19
分に溶離され、そしてレウテリンは第１ピーク中に存在
することが分かった。第２分画はほぼ19分の溶離時間を
有した。レウテリンを含有する分画の前の部分は重い肩
を有し、これはβ−ヒドロキシプロピオン酸であると推
定され、それゆえ集めなかった。レウテリンピークの中
央部分を集め、そして回転蒸発により乾燥し、次いで凍
結乾燥した。このプロセスは無色透明の粘性の液体を生
成し、この液体は、分析条件下にアミネックス87hカラ
ムを使用して再クロマトグラフィーにかけると、単一の
ピークを生成し、これは活性ピークと同時に溶離され
た。集めた分画は、また、MICアッセイにより決定し
て、生物学的活性を含有した。他の集めた分画は生物学
的活性を示さなかった。精製した分画を、また、バイオ
ーラドのタンパク質アッセイ（Bio−Rad、カリフォルニ
ア州リッチモンド）を使用してタンパク質の存在につい
て分析した。タンパク質の存在は検出できなかった。

実施例XII 精製したレウテリンのフーリエ変換赤外分析レウテリンをフーリエ変換赤外分析（FRIR）にかけ
て、分子内に存在する化学基を決定した。試料はパーキ
ンエルマー7500データステーションを有するパーキンエ
ルマー1550FRIRで分析した。得られた結果を第16図に示
す。理解できるように、分子は1050−1150cm^-1における
大きいＣ−０のストレッチ（stretch）のバンドおよび3
450cm^-1における広いＯ−Ｈのストレッチの存在により
示されるように、ヒドロキシル官能を含有した。アルデ
ヒドを示すＣ＝Ｄストレッチは1730cm^-1に観察された。
典型的なアルカンＣ−Ｈのストレッチは2880および1380
cm^-1に存在した。

実施例XIII 精製したレウテリンのLC分離の分析は、アミネックス
87Hカラム（Bio−Rad、カリフォルニア州リッチモン
ド）で65％の蒸留脱イオン水および35％のアセトニトリ
ル（1.0g/の濃硫酸を含有する）の0.8m／分の流速
で達成した。溶媒系を0.3モルの酢酸アンモニウムとカ
ラム後に混合し、そしてベステック（Vestec）インター
フェース（Vestec、テキサス州ホウストン）を経てフィ
ニンガン4500HPLC/MS系（Finnegan、カルフォルニア州
サンジョース）中に導入した。正イオンの検出は、210
℃の蒸発温度および250℃の源温度で使用した。源の電
子エネルギーは1000eVであった。

LC/MS分析は、レウテリンについて酢酸アンモニウム
のカラム後の添加で実施した。基本ピークは、第17図に
示すデータにより示されるように、166M/E単位において
起こった。このイオンは分子イオンのアンモニウム付加
物であると解釈された。これはレウテリンの分子量に相
当する148の分子量を示すであろう。148においてシグナ
ルは付加物のイオンからの水の損失であると予測され、
そして130におけるシグナルは２分子の水が損失した付
加物のイオンを表した。101に存在するシグナルは、バ
ックグラウンドの溶媒の効果からであると信じられた。

実施例XIV 精製したレウテリンの核磁気共鳴スペクトル分析プロトンおよび炭酸のNMRの研究は、アルドリッヒ（A
ldrich）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）からの酸
化ジュウテリウムおよびジュウテリン化メタノールの両
者中において実施した。プロトンNMRは、250MHzで作動
するブルーカー（Bruker）WM25OFRNMR（Bruker）で実施
した。炭素13スペクトルは、IBM NR−100AF FRNMR（I
BM Instruments、カルフォルニア州サンジョース）、2
5MHzで作動し、超伝導磁石を有する、で発生させた。デ
ータの処理は、アスペクト（Aspect）3000で達成した。
酸化ジュウテリウム中のNMR研究において、炭素13NMRス
ペクトルは、40.1、46.3、56.2、58.7、89.7および207.
7ppmの化学シフトにおいて６つのシグナルを有した。20
7.7ppmにおけるシグナルはアルデヒド炭素として解釈さ
れ、89、58、および56ppmにおけるシグナルは結合した
酸素として、そして46および40ppmにおけるシグナルは
脂肪族部分として解釈された。

炭素およびプロトンのスペクトルは、第18図および第
19図に示されている。脱カップリングならびにシグナル
のスプリットパターンは、第20図に示す構造の初期の提
案に導いた。9.5ppmにおけるプロトンのシグナル（炭素
１）は、2.6ppmにおけるシグナル（炭素２）が飽和され
ているとき、影響を受けることがわかった。炭素２に関
連するプロトンは、トリプレットであると思われるもの
にスプリットしたが、よく検査すると、実際にはセクス
テット（sextet）として見えた（炭素１上の等しくない
トリプレットのスプリット）。炭素２上のプロトンのカ
ップリングパターンは、9.5および3.7ppmにおけるシグ
ナルの飽和により変更することがわかり（炭素１および
３）、したがって両者の炭素１および３に隣接して存在
することが予測された。3.7ppmにおけるシグナルのスプ
リットパターン（炭素３）は、トリプレットであり、そ
して2.6ppmにおけるシグナルの飽和により影響された。
これらのパターンは、CH0−CH3−CH2−Ｏ−Ｒとして炭
素１、２および３について提案された予測した構造に適
合する。

5.0ppmにおけるプロトン（炭素４）は、トリプレット
として現れ、そして1.6ppmにおけるシグナルの飽和によ
りのみ影響を受けた。5.0および3.5ppmにおけるシグナ
ルの飽和は、1.6ppmにおけるスプリットパターン（炭素
５）の変更に導いた。炭素５上のプロトンは、カルテッ
ト（quartet）として評価される複雑なスプリットパタ
ーンを有する。3.5ppmにおけるトリプレット（炭素６）
を生ずるプロトンは、1.6ppmにおけるシグナル（炭素
５）の飽和によってのみ影響を受けた。レウテリンのこ
の半分についてのシグナルのパターンおよび化学シフト
のデータは、炭素４、５および６に関連する構造Ｒ−Ｏ
−CHOH−CH2−CH2OHの解釈に導いた。この分子の中央に
存在するヘミアセタール酸素（第20図）は、観察された
ように、２つのは半分のカップリングを防止するであろ
う。予測した構造のプロトンの化学シフトは、既知の値
についてのそれらと合致する。

1.7、3.6および5.0ppmにおけるシグナルの広さは、シ
グナルの各々を生ずるプロトンの数の決定に使用するピ
ークの各々の下の面積の計算を妨害した。このような広
さは、水を溶媒として使用したとき、平行で存在する分
子の関係するまたは一時的形態の結果であろう。

ジュウテリウム化メタノール中のレウテリンのシグナ
ルのパターンは、酸化ジュウテリウムにおいて観察され
るものと明確に異なった。炭素−13のパターンは、36.
8、58.9および103.9ppmにおけるわずかに３組のシグナ
ルを含有した。104ppm付近の炭素−13のシグナルは、下
に示す炭素について二糖類、例えば、ラクトースにおい
て観察された：ジュウテリウム化メタノールにおいて決定されたレウ
テリンのプロトンのスペクトルは、また、1.8、3.6およ
び4.5ppm付近に存在する３組のシグナルを含有し、ピー
クの面積の比は、それぞれ、2:2:1であった。炭素−13
およびプロトンのスペクトルは、それぞれ、第21図およ
び第22図に表されている。プロトンのスペクトルの相対
的面積のために、2:2:1の水素の比が示唆された。1.8pp
mに存在するプロトンのシグナルはカルテットとして存
在し、そしてカップリングの研究は3.6および4.5ppmに
起こるシグナルを生ずるプロトンを含有する炭素に隣接
するとして、その存在を示した。3.6および4.5ppmに見
いだされるシグナルの両者は、トリプレットとして存在
し、そしてカップリングの実験は1.8ppmにおけるシグナ
ルをもつプロトンとの相互作用のみを説明する。第23図
に示す構造は、この組のデータに相当することを示唆し
た（二糖類の炭素−13のシグナルの特性を包含する）。

実施例XV 精製したレウテリンのガスクロマトグラフィー／質量ス
ペクトルトリメチルシリル化をN,O−ビス（トリメチルシリ
ル）トリフルオロアセトアミド（BSTFA）（Pierce Che
mical Co.、イリノイ州ロックフォード）を使用して実
施した。2mの粗製レウテリン抽出物を、前述したよう
に、半調製用クロマトグラフィーにより精製し、そして
凍結乾燥乾固した。1mのBSTFAを凍結乾燥したレウテ
リンに添加し、そしてシラン化反応を周囲温度において
実施した。試料を、白色沈澱が検出されるまで、手で穏
やかに５分間震盪した。ちょうど十分なHPLC等級のアセ
トニトリル（Fisher Scientific、ノースカロリナ州ラ
レイ）を添加して、沈澱を溶解した。次いで、試料を窒
素でスパージし、ねじ付きバイアル中に密閉し、そして
ガスクロマトグラフィー−質量スペクトルにかけた。

ヘウレット・パッカード（Hewlett Packard）59858G
C/MS（Hewlett Packard、カリフォルニア州サンジョウ
ズ）、シリル化レウテリン誘導体についての研究におい
て使用した。GCの条件は1.1m／分の流速および280℃
の注入温度であった。分析に使用したプログラムは、40
℃において３分の初期の保持期間から成り、ランプは６
℃／分で260℃までであった。分離の実施に選択したカ
ラムは、Ｊ＆Ｗサイアントフィック（Scientfic）
（カリフォルニア州フォルサム）からの15M DBS溶融シ
リカの毛管カラムであった。質量の範囲は40〜400、200
℃のイオン源の温度、70eVの電子エネルギー、スプリッ
トレス注入（splitless injection）の電子衝撃イオン
化および0.8分のスプリット時間であった。

レウテリンはGCインゼクター内に存在する高い温度に
おいて不安定であることがわかった。安定なレウテリン
誘導体は、周囲温度においてBSTFAでシラン化したとき
産生された。誘導化試料のクロマトグラフィーは複雑な
GCトレースを生成した（データは示されていない）が、
292（148＋２つのトリメチルシリル基）をもつ化合物が
９〜14分の保持時間において見いだされた。２つのピー
クは可能な異性体として同定された（11.7および13.3の
保持時間）。モノシリル化誘導体は9.3分の保持時間に
発見され、そしてそのスペクトルは第24図に表されてい
る。この化合物の断片化パターンは、205、177、163、1
47、130および115M/E単位から成る。１つのTMS基を含有
するレウテリン分子（分子量＝220）は、メチル基を失
って205のM/E値を生成することができた。147における
断片は、TMS期間の損失から来ることができたと想像さ
れたが、147付近のM/Eの断片のパターンはケイ素、炭
素、および酸素の天然のアイソトープの存在を示した。
より正確には、147:148:149M/E単位の断片イオンの比は
100:16:9であり、正確に組成C₆H₁₅O₅Siの分子について
予測されるであろうものであった。この断片は第25図に
示す構造を有するとして解釈され、そしてTMS基を失っ
たレウテリン分子として解釈されなかった。誘導化され
た分子の異性体のスペクトル中に存在するM/E219および
198における強いシグナルは、11.7および13.3分におい
て溶離する２つのTMSを含有する（データは示されてい
ない）。M/EのデータならびにNMRにより決定した構造の
細部を満足する断片の例示は、第27図に表されている。

精製したレウテリンのFTIRおよびLCMSのデータ（第16
図および第17図）に基づいて、レウテリンはヒドロキシ
ルおよびアルデヒドの官能性を含有する148の分子が与
えられた。この推定はNMRデータ（D₂O中の試料）とよく
一致する。C₆H₁₂O₄の分子式および第20図に示す構造が
提案された。しかしながら、レウテリンのNMR研究をジ
ュウテリウム化メタノール中で実施するとき、修正が必
要であることが明瞭であった。この場合においてデータ
は、分子が３つのみの炭素を有するか、あるいは軸のま
わりで対称であることを説明した（すなわち、２×３＝
６）。２つの可能な概要はこのデータを説明するために
提案された（第26図）。

概要Ａはアルデヒドとヒドロキシルとの間の第２ヘミ
アセタール結合の形成を必要とするであろう。そのと
き、最終の構造は８つの構成員の環として存在し、その
半分の両者は対称であろう。この提案された構造は、レ
ウテリンをジュウテリウム化メタノール中で分析すると
き、207ppmに存在する炭素のシグナルをよく説明しな
い。この構造は、メタノール中でプロトンのスペクトル
について観測されたスプリットパターン、存在するプロ
トンの比例性（炭素上の水素の2:2:1）および化学シフ
トと合致する。ヘミアセタールは水の存在下に自由に開
きそして再び閉じ（時間にわたって変旋光する糖に非常
に類似する）そしてある数の形態はレウテリン試料内に
いずれの瞬間においても存在しうるであろう。これは酸
化ジユウテリウム（D₂O）中で観測される広いピークお
よびシグナルの正確な解釈の欠乏に導くことがある。

概要Ｂはより構造的に好適な６員の環を通して進行
し、損失した水と結合し、メタノール中で二環の環とし
て存在するであろう。この分子は、また、メタノール中
で観測されるNMRスペクトルを説明するために必要な対
称を有するであろう。さらに、この構造は炭素−13のス
ペクトルにおいて104ppmにおけるシグナルを与える炭素
を含むであろう。プロトンのスペクトル中に見いだされ
る化学シフトおよびスプリットパターン（D₂O中におけ
る実験）は提案された６員の環構造と合致し、そしてヘ
ミアセタールの開環は前述のものに類似する場合、すな
わち、複雑なスペクトルに導くレウテリンの多数の形態
の存在を表すであろう。

D₂O中で実施したレウテリンの実験のプロトンのスペ
クトルのそれ以上の精密な検査（第19図）は、概要Ｂ
（第26図）に好都合な情報を提供する。直鎖の形態のレ
ウテリンは、1.6、2.6、3.5、3.7、5.0および9.5ppmの
化学シフトに存在するシグナルを説明できるであろう。
これらのシグナルの面積の比は、明らかに、分子中の水
素原子の比（すなわち、炭素１〜６について1:2:2::1:
2:2）に等しくない。環状の形態がまた直鎖の形態と多
少平衡した濃度で存在する場合、環の炭素１および４上
のプロトンは鎖の形態の同一プロトンと非常に異なる環
境中に存在するであろう。これはそれらのプロトンにつ
いて新しい化学シフトを生ずる。炭素３、５および６上
のプロトンの環境はいずれの形態においても比較的一定
であり、そしてシグナルは有意にシフトすることは期待
されない。期待されるように、炭素３、５および６上の
プロトンからのシグナルは広く、そして期待される積分
の値からの有意の逸脱を示す。5ppm付近の弱いシグナル
のパターンの発生は、２つの酸素が結合した予測される
環炭素からのプロトンのために起こる。水溶液中にある
間のレウテリンの２つの形態の存在は観測されるプロト
ンのスペクトルを説明するが、２分子のβ−ヒドロキシ
プロピオンアルデヒドへのレウテリンの不可逆的分解
は、また、プロトンのスペクトルを説明する。

シラン化した試料から得られた質量スペクトルは、NM
Rの研究から得られたデータと一緒に考慮したとき、レ
ウテリンの構造についての他のレベルの細部を提供し
た。M/E147に存在するシグナルは、概要ＡおよびＢに示
す構造のいずれかから予測されうる断片を表す（第26
図）。しかしながら、M/E177において観測される断片は
８員の環または直鎖の断片化において存在しないであろ
う。同様に、M/E163におけるシグナルはこれらの分子に
ついて予測されないであろう。M/E177および163の断片
は、６員環を親分子として使用する場合、可能である。
第27図は、GCMS分析から生成されたデータと合致する、
シラン化６員環の提案された断片化を詳細に示す。

すべての観測されたM/Eシグナルは、−CH2−CH2−Ｏ
−TMSのテイルの断片としてあるいは６員環の断片とし
て説明することができる。さらに、断片M/E147の断片は
ある数の異なる断片化から形成されることができ、それ
らのいずれも３つの基本炭素、酸素、および−Ｏ−TMS
を含有する。この点は重要である。なぜなら、M/E147の
断片からのシグナルはGCにより分離された両者の予測さ
れた異性体（ならびにモノシリル化分子）のスペクトル
において強く、両者の異性体が同一の基本環断片化を生
ずる（すなわち、同様な構造を有する）からである。

今日までに集められたデータに基づいて、最も起こり
得るレウテリンの構造は第28図に与えられものである。
レウテリンが水溶液中に存在するとき、それは開いた鎖
と平衡して存在しなくてはならなず（NMR分析に基づ
く）、これに対してそれがBSRFAから誘導されるとき、
それは環状の形態にもっぱらロックされる（GCMSの研
究）。アセトン中のレウテリンの構造のプロトンNMRの
研究は、レウテリンを水中に溶解するとき集めたデータ
と一致する（データはしめされていない）。メタノール
と水との50/50混合物中に溶解したレウテリンのそれ以
上のNMR分析は、上に表したメタノールの結果に類似す
る結果を与えた。メタノール中で優先する形態のそれ以
上の分析は、二環の構造の理論を確証するために要求さ
れる。さらに、レウテリンの有機合成（その構造は予測
されるので）および引き続く構造の分析はわれわれの構
造の仮説を確証する唯一の絶対の方法である。

レウテリンの構造を明らかにした後の文献におけるサ
ーチは、レウテリンと同一の化学的成分を有する化合物
がアクロレインの水和のとき酸性溶液中に存在したこと
を明らかにした（29）。また、それは名称４−ヒドロキ
シ−2,2′−ヒドロキシエチル−1:3−ジオキサンを使用
するβ−ヒドロキシプロパルデヒドの調製からの蒸留物
として前に記載された（30）。

４−ヒドロキシ−２−２′−ヒドロキシエチル−1:3
−ジオキサンをハル（Hall）が記載するように（30）わ
れわれの実験室で合成したとき、それはレウテリンと同
一のHPLCピークで溶離され、そして生物学的に合成され
たレウテリンと同一のMIC値を示した。したがって、第2
7図に示す構造はレウテリンのそれである。

β−ヒドロキシプロパルデヒド（また、３−ヒドロキ
シプロパナール、ヒドラクラルデヒド、β−ヒドロキシ
プロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプパン−１−ア
ールと呼ばれる）は溶媒または可塑剤の分野において大
きい潜在的価値をもつ（Hall、R.H.およびStern、E.
S.、Journal Chemical Society、Jan−Mar、1950pp.4
90−498）。二量体のヒドロキシプロピオンアルデヒド
（すなわち、レウテリンまたは４−ヒドロキシ−２−
２′−ヒドロキシエチル−1:3−ジオキサン）およびモ
ノマーのヒドロキシプロパルデヒドは溶液中で平衡して
いる（Ibid）。したがって、L.reuteriによるグリセロ
ールからのレウテリンの生物学的産生はモノマー（β−
ヒドロキシプロピオンアルデヒド）ならびに二量体の形
態のこの物質の新規な産生方法を構成する。

L.reuteri−レウテリン系：腸の微生物集団の調節因子この系の発見は、微生物の集団が動物の胃腸管内で調
節される方法を記載する新規な概念的モデルに導いた。
このモデルは第12図に４つの部分で例示されている。相
１において、腸のセグメントは集団のホメスタシスの状
態で存在する仮説のバクテリア（種ＡおよびＢ）および
L.reuteri（Ｒ）を含有する。相２の間、異種微生物の
集団の増加（この場合において有機体Ａ）は住んでいる
L.reuteri細胞により感知される（未知の細胞対細胞の
接触の機構による）。相３において、グリセロール（ま
たはグリセルアルデヒド）の存在下に、多分膵臓および
／または微生物の脂肪分解活性を経て存在する、の存在
下に、レウテリンは合成される。レウテリンのバクテリ
アの作用は相４における腸内微生物の集団を減少し、そ
して相１の集団のホススタシスは回復する。このモデル
が示唆するように、代謝レベルにおいてそのように効果
的に働くフィードバック調節の原理は、腸内集団のホメ
スタシスの維持のために細胞レベルで機能することがで
きる。

与えられた実験のデータにより決定しかつフィードバ
ックのモデルに照らして見て、L.reuteri菌株1063はL.r
euteri菌株に最もよく適して、共生因子と機能して、ブ
タの腸の病気と緩和しかつ飼料の効率を増強する。この
結論は、次の事から誘導される：（ｉ）菌株1063は高い
レベルのレウテリンを産生し（第２図）そしてそれは他
の菌株より異種刺激に対して感受性であるという発見
（表６）、（ii）菌株1063はブタの小腸から直接分離さ
れ、したがってブタ宿主特異的菌株であるという事実、
および（iii）菌株1063は強い自己凝縮能力を有し、そ
して試験した他の菌株よりよくブタの上皮細胞に付着す
るという観察。

発明を実施するための最良のモードレウテリンは相同法により得られ、ここでL.reuteri
細胞はグルコースを有する乳酸杆菌属担持培地中で37℃
において静置培養で増殖する。細胞を遠心により収穫
し、そして250ミリモルのグリセロール中に懸濁する。
静置培養において37℃で６時間インキュベーションした
後、細胞を遠心および濾過により除去する。次いで、レ
ウテリン溶液を、レウテリン感受性微生物を含有する環
境に添加して微生物を殺す。

工業上の応用レウテリンは、実験室において抗ウイルス、抗バクテ
リア、抗寄生生物および抗菌・かびの使用のための用途
を有する。さらに、レウテリンは食物製品に添加して微
生物のフローラを減少することができる。レウテリン
は、また、動物の胃腸管内の微生物の集団を減少するた
めに供給することができる。ラクトバシルス・レウテリ
（Lactobacillus reuteri）の細胞は、レウテリンの産
生を誘導する条件下ににインキュベーションして抗バク
テリア活性を増強することができる。

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0）．図面の簡単な説明第１図は、グリセロール培地中における好気的（震
盪）および半嫌気的（静置培養）条件下の構造物質レウ
テリン（以下、単に「レウテリン」ともいう）の経時的
産生量の変化を示す。

第２図は、グリセロール培地中でラクトバシルス・レ
ウテリ（L.reuteri）の２つの菌株をE.coliと半嫌気的
インキュベーションした後、レウテリンの産生へのラク
トバシルス・レウテリ（L.reuteri）濃度（μg/m乾燥
重量）の効果を示す。

第３図は、レウテリンの産生への温度の効果を示す。

第４図は、レウテリンの産生へのpHの効果を示す。

第５図は、レウテリンの産生および生物学的活性の証
拠を示す。

第６図は、ラクトバシルス・レウテリ（L.reuteri）
の試料の高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）の結果
を示す。

第７図は、レウテリンの正イオンの質量スペクトルを
示す。

第８図は、レウテリンの負イオンの質量スペクトルを
示す。

第９図は、レウテリンの赤外スペクトルを示す。

第10図は、レウテリンの炭素NMRスペクトルを示す。

第11図は、レウテリンのプロトンNMRスペクトルを示
す。

第12図は、ラクトバシルス・レウテリン（L.reuteri
n）−レウテリンの系のモデルを示す。

第13A図はレウテリンをファージ感染バクテリアの培
養物に添加したときの、コロニー形成単位（CFU）およ
びプラーク形成単位（PFU）を示し、そして第13B図はCF
UおよびPFUの実際の計数を示す。

第14図は、粉砕した牛肉ミクロフロラ（microflora）
へのレウテリンの効果を示す。

第15図は、E.coli接種した粉砕牛肉ミクロフロラへの
レウテリンの効果を示す。

第16図は、レウテリンのフーリエ変換赤外分析を示
す。

第17図は、レウテリンの液体クロマトグラフィー／質
量スペクトル分析を示す。

第18図は、酸化ジュウテリウム中のレウテリンの炭素
−13スペクトルを示す。

第19図は、酸化ジュウテリウム中のレウテリンのプロ
トンのスペクトルを示す。

第20図は、第18図および第19図のスペクトルを生ずる
提案した構造を示す。

第21図は、ジュウテリン化メタノール中のレウテリン
の炭素−13スペクトルを示す。

第22図は、ジュウテリン化メタノール中のレウテリン
のプロトンスペクトルを示す。

第23図は、第21図および第22図を生ずる、提案した構
造を示す。

第24図は、レウテリンのトリメチルシリル誘導体の質
量スペクトルを示す。

第25図は、M/E147の断片の提案した構造を示す。

第26図は、レウテリン構造のための提案した概要を示
す。

第27図は、M/EデータおよびNMRの構造を満足する断片
を示す。

第28図は、水溶液中に存在するときの、提案した構造
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/357 Ａ６１Ｋ 31/335 ６０３Ｃ０７Ｄ 313/18 Ｃ０７Ｄ 313/18 319/06 319/06 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 ＡＣ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｐ 7/24 17/06 17/06 //(Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:225） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/08 C12N 1/20 C07D 313/18 C07D 319/06 A23L 3/3481 A23L 3/3544 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】水溶液中でβ−ヒドロキシプロピオンアル
デヒドの二量体と単量体との平衡状態で存在し、かつａ）フーリエ変換赤外分析により、 1050、1150、1380、1730、2880および3450cm^-1付近に吸
収を示し、ｂ）酸化ジユウテリウム中でのC¹³NMR分析により、 40.1、46.3、56.2、58.7、87.7および207.7ppm付近にシ
グナルを有し、ｃ）ジユウテリウム化メタノール中でのC¹³NMR分析に
より、 36.8、58.9および103.9ppm付近にシグナルを有する抗生
物質レウテリン産生能を有するラクトバシルス・レウテ
リ（Lactobacillus reuteri）1063（ATCC53608）株ま
たはその変異株。
【請求項２】水溶液中でβ−ヒドロキシプロピオンアル
デヒドの二量体と単量体との平衡状態で存在し、かつａ）フーリエ変換赤外分析により、 1050、1150、1380、1730、2880および3450cm^-1付近に吸
収を示し、ｂ）酸化ジユウテリウム中でのC¹³NMR分析により、 40.1、46.3、56.2、58.7、87.7および207.7ppm付近にシ
グナルを有し、ｃ）ジユウテリウム化メタノール中でのC¹³NMR分析に
より、 36.8、58.9および103.9ppm付近にシグナルを有し、そしてラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）
に由来する抗生物質レウテリン。
【請求項３】請求項２記載の抗生物質レウテリンの産生
能を有するラクトバシルス・レウテリ種に属する細菌の
培養物を有効成分として含有する微生物の増殖を阻害す
るための組成物。
【請求項４】前記培養物が、前記抗生物質レウテリンの
産生に適する条件下で培養されたものである請求項３記
載の組成物。
【請求項５】請求項２記載の抗生物質レウテリンの産生
能を有するラクトバシルス・レウテリ種に属する細菌の
培養物を有効成分として含有するウイルスの増殖を阻害
するための組成物。
【請求項６】前記培養物が、前記抗生物質レウテリンの
産生に適する条件下で培養されたものである請求項５記
載の組成物。
【請求項７】請求項２記載の抗生物質レウテリンの産生
能を有するラクトバシルス・レウテリ種に属する細菌の
培養物を有効成分として含有する共生剤。
【請求項８】前記培養物が、前記抗生物質レウテリンの
産生に適する条件下で培養されたものである請求項７記
載の組成物。
【請求項９】請求項２に記載の抗生物質レウテリンの産
生能を有するラクトバシルス・レウテリ種に属する細菌
の培養物を有効成分として含有する食品。
【請求項１０】請求項２記載の抗生物質レウテリンの製
造方法であって、抗生物質レウテリンの産生能を有する
ラクトバシルス・レウテリ種に属する細菌を該抗生物質
レウテリンの産生に適する条件下で培養することを特徴
とする方法。
【請求項１１】該抗生物質レウテリンの産生に適する条
件が、グリセロールまたはグリセルアルデヒドを含む培
地において、低減した酸素濃度下である請求項10記載の
方法。