JPH02503385A - 抗生物質レウテリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 仄匡重区とヱヱ互ヱ これは、１９８７年５月１日提出のｇ理番号０７１０４６，０２’１の一部継続 である、１９８７年９月２２日提出の整理番号０７／１０２゜８３０号の一部継 続である。

発明の分野 本発明は、レウテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）と表示する新規な抗生物質、動物源 からラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｊｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の レウテリン産生菌株の分離および培養の手順、およびレウテリンの分離および精 製の手１１７二関する。

背景の情報 ラクトバシルスｅレウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）、 すなわち、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）（この種のある菌株はＮｊ ｉｌｌｆｌ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）として以前ｊ ；同定された（１．２））の新規に表示する種、は、ヒト、ブタおよび他の動物 の胃腸（Ｇｌ）管の共生存在体（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）である。ラクトバテルス・ レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）のネオタイプ（ｎ　ｅ　ｏ　ｔ　ｙ　ｐ　ｅ） の菌株は、ＤＳＭ２００１６　（ＡＴＣＣＮｏ。

５３６０９）である。この菌株および新規に分離されｔ；菌株１０６３（ＡＴＣ ＣＮｏ、５３６０８）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・フレクシ日ン（ｔ ｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎｓ米国マリイランド州ロックビレ）に１９８７年４月１７日に受託され、公衆 に入手可能である。動物の胃腸管は、集合的に土着のミクロビオタ（ｉｎｄｉｇ ｅｎｏｕｓ　　ｍ１ｃｒｏｂｉｏｔａ）として知られている、推定３００〜５０ ０種の微生物を収容する複雑な生態系である。腸の微生物学の分野における１０ ０年の徹底的な研究にかかわらず、これらの微生物、異なる種の間ｊこ存在する 相互関係およびミクロビオタとそれらの宿主との間の共生の関係の性質Ｉ；つい て知るべきことがたくさん残っている。

ある条件下に、土着のミクロビオタのある１ｌｉＩＲ員は種々の腸の病気を引き 起こす日和見性のｆｆｒＩｉ体となることができる。しかしながら、より頻繁に 、ｇＩｉｉ体は胃腸管に食物または水中の汚染物として入る。後者のなかで顕著 なものはある数のバクテリア（例えば、大腸菌、サルモネラ属の種、赤痢菌属、 エルジニア・イテロコリチ力（ＹｅｒｓＬｎｉａｉｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ）、コレラ菌、ビブリオ−バラへモリチフス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐａｒａｈａｅ ｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カンピロバクチル・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃ ｔｅｒ　　ｊｅｊｕｎｉ）およびクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔ ｒｉｄｉｕｍ　　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、ウィルス（例えば、ロタウィルス、 アストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）およびシリシウィルス（ｃｉｌｉｃ ｉｖｉｒｕｓ））および腸寄生生物（例えば、シアルシア属およびアメーバ属の 種）である。これらおよび他の微生物により引き起こされる急性および慢性の腸 の病気は世界中で起こり、かなりのヒトの苦痛および経済的に重要な動物の損失 を引き起こす。ある種の微生物の活性は、また、胃腸管内の突然変異原の産生と 関連づけられてきている。

また、土着のミクロビオタはそれらの宿主と共生または共力の関係で存在して、 宿主の一般の健康および良好な生活に多くの積極的な（共生の）方法で寄与する 。微生物（ｇｅｒｍ）不含の動物は、とくに健康であるというわけではなく、そ して発育に劣った胃腸管を有する。それらに提供された栄養に富んだ安定な生態 系の報酬として、土着のミクロビオタはそれらの宿主になかでも次のものを包含 する＝（ｉ）腸の病原体に対する保護、（目）胃腸管の上皮粘膜系の正常の発育 および機能の刺激、（ｉｖ）種々のビタミンおよび他の栄養物質の産生および（ Ｖ）宿主の豊富な内因性粘膜組織の再代謝。

現在において、土着のミクロビオタの組成および数が制御される方法は殆ど理解 されていない。これらの制御は次のような因子をふくむ多数の種の間の複雑な相 互作用の結果であるニレドックス電位、表面のｐＨｓ脂肪酸の阻害作用、硫化水 素、脱接合（ｄｅｅｎｊｕｇａｔｅｄ）胆汁塩類およびなおさらに同定されない 阻害物質、ならびに因子、例えば、栄養物質を制限するための競合およびミクロ ビオタが胃腸管の上皮表面と関連しかつ前記表面へ付着する能力。

動物の誕生後短い時間で、大腸菌および腸の連鎖球菌は胃腸管内に現れるほとん ど広く最初のバクテリアである。乳酸杆菌属はほとんど常に伴うか、あるいは順 序が直後であり、そして腸内に見いだされる支配的なバクテリアの群となる。小 腸の微生物、とくに乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）および連鎖球菌属 （Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属するものはバクテリアおよび非バクテリ アの病原体に対する保護的価値を有し、そして動物における健康な体重の増加を 促進するようである。栄養条件にめんどうな腸内バクテリアであるので、乳酸杆 菌は胃腸管の末端領域よりはむしろ、より近接の栄養に冨んだ領域において、そ れらの生態学的地位を見いだすと信じられる。

多数の場合について報告されているように、乳酸杆菌（３）は、太きい数の非病 原性の無毒のバクテリアを包含し、ヒトおよび動物の健Ｊ［８よび良好な生活に おいて重要な共生の役割を演する。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）種 はヒトおよび動物の食物に添加して、食物を保護し、食物の風味を増大しおよび ／または共生の目的で添加されるので、これらのバクテリアは胃腸管に存在する ようになるであろう。例えば、ラクトバテルス・ブランタルム（Ｌａｃｔｏｂｃ ｉｌｌｕｓ　　ｐｉａｎｔａｒｕｍ）菌株は、商業的に大量に増殖され、そして 種々のヒト（肉類、植物および毎日の製品）および動物（サイレージ）の食物の 商業的保存のための關始培養物として使用される。ラクトバテルス・アシドア４ ルス（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）菌株は、商業的 に大量に増殖されて、ヒト（例えば、ミルク）または動物（飼料）の食物に、こ れらのバクテリアを共生の利益のために胃腸管に導入する手段として添加される 。乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕ杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）の 治療は（ｉ）西洋食のヒトの集団を結腸癌から保護しく４）、（ｉ　ｉ）ラット におし１て実験的に誘発した大腸の腫瘍の発生を減少しく５）、（ｉ　ｉ　ｉ） ヒトにおいて近位発癌物質への前発癌物質の転化を触媒することが知られている バクテリアの酵素の賀濃度を減少しく６）、そして（ｉｖ）ブタにおける血清コ レステロールのレベルを減少する（７）ことが発見された。

乳酸杆菌属の代謝の代謝最終生成物、例えば、酢酸、乳酸および過酸化水素は、 それらの抗微生物活性Ｉこついてよく知られている。２つの研究所の報告による と、異種発酵性の種、乳酸短杆菌（Ｌａｃｔｏｂｃｉｆｌｕｓ　　ｂｒａｖｉｓ ）、ブ７ナー１１（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｂｕｃｈｎｅｒｉ）（８）および 乳厳杆Ｍ属（ＬａｃｔｏｂｅｉｌｌｕＳ）菌株２０８−Ａ（９，１１）はグリセ ロールを嫌気的に代謝する。

後者の菌株は２モルのグリセロールを嫌気的に脱水して（グリセＣ１−４デヒド ロゲナーゼを含む）２モルのβ−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを生成し、こ れは不均化して１モルのβ−ヒドロキシプロピオン酸および１モルの１．３−プ ロパンジオールとなる。ある乳酸杆菌は、また、バクテリオシンまたはバクテリ オシン様タンパク質を産生じ、これらのタンパク質はその種または密接に関係す る種の他の構成員に対して殺バクテリア活性を示す、乳酸杆菌により産生された 低分子量の抗微生物物質に関する、いくつかの寅証されていない報告が現れた。

それらの存在はあるとき予測されｌ；が、このような物質は寅証または分離され て米ていない。

乳酸杆菌属に関連する抗微生物活性に関した何が知られているかについての要約 は、次のとおりである。１９０７年において、メトチニコフ（Ｍｅｔｃｈｎｉｋ ｏｆｆ）（１１）は、胃腸管内に住む有害な腐敗性バクテリアは酸度生性乳酸杆 菌により阻害（または拮抗）されることを報告した。それ以来、乳酸のバクテリ アに関連する種々のこのような拮抗活性は報告された（１２）。最もしばしば、 これらの抗微生物活性は、代謝の主要な最終産生物、例えば、乳酸および酢酸お よび過酸化水素に関連することが発見された（１３〜１８）。乳酸杆菌に関連す るが、代謝のこれらの最終産生物に関連しない、抗バクテリア活性に関する他の 報告が現れた。ギリランド（Ｇｉ　Ｉ　ｌ　ｉ　１ａｎｄ）およびスペック（Ｓ ｐｅａｋ）（１９）は、試験したラクトバテルス・アシドフィルス（Ｌａｅｔｏ ｂｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦ株の間で変化する、広いスペ クトルの拮抗を報告しｌ；。過酸化水素は阻害の応答の部分的原因でありだ。ト ラメア（Ｔｒａｍａｅｒ）（２０）は、Ｅ、ｃｏｌｉのラクトバテルス・アシド フィルス（Ｌ、ａｃｊｄｏｐｈｉ　１ｕｓ）の阻害は、低いｐＨにおける乳酸の 強い殺菌作用のためであることを示した。追加の阻害因子の形成は、また、示唆 されｌ；が、同定されなかった。広いスペクトルの拮抗物質は、シャハニ（Ｓｈ ａｎｉ）も、レディー（Ｒｅｄｄｙ）およびシャハニ（Ｓｈａｎｉ）、およびハ ムダン（Ｈａｍｄ　ａｌ）およびミコラグチク（Ｍｉｋｏｌａｇｃｉｋ）（２１ 〜２５）により報告され！；。これらの報告の各々において、拮抗物質は１１％ の非脂肪のドライミルクの固体中で乳酸杆菌属（ＬａｃｔｏｂｃｉｌＩｕｓ）を 増殖させる間産生され、そして乳酸と区別することが困難であり、こうして完全 にレウテリンと無関係であるように思われた。これらの研究において、ハムダン （Ｈａｍｄａｎ）およびミコラグチク（Ｍｉｋｏｌａｇｃｉｋ）（２４〜２５） は、シトリンと彼らが名付けｔ；物質の最も強い精製および特徴づけを実施しｔ ；。それは低分子量の化合物であり、窒素を含有せず、酸性であり、そして極め て耐熱性であることを、彼らは発見しｔ；。この物質が産生される条件およびそ の酸性の性質は、それをレウテリンと明確に区別する。ヨーグルト培養物の間の 拮抗活性についての外観（２６）は、ラクトバテルス・アシドフィルス（Ｌ。

ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルガリアＷ（Ｌ、ｂｕｌｇａｒｉａｕｓ）、カセ イ菌（Ｌ、ｃａｓｅｉ）、乳酸杆菌（Ｌ、Ｉａｃｔｉｓ）の菌株におけるｈ酸二 外の阻害物質を同定することができなかった。試験したブルガリア菌（Ｌ、ｂｕ 　Ｉｇａｒ　１ｃｕｓ）菌株の１つは、前に、プルカリカンと命名した抗生物質 を産生じたと報告された（２３）。

ある数の乳酸杆菌は、殺バクテリア活性を示すタンパク質であるバクテリオシン を産生ずることが知られている。乳酸杆菌により産生されたほとんどのバクテリ オシンまたはバクテリオシン様物質は、狭い範囲の生物学的活性を示す。しかし ながら、ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら（２７）は、ある数のラクトバテルス ・アシドフィルス（Ｌ、ａｃｉｄｏｐｈｊｌｕｓ）分離物ｌこより産生された、 ラクトシジンと命名された、広いスペクトルのバクテリオシンを報告した。乳酸 杆菌により産生された広いスペクトルのバクテリオシンの他の報告はない（１２ ）。バクテリオシンはポリペプチドであり、そしてそれらの阻害性質はプロテア ーゼにより破壊される。レウテリンはポリペプチドではなく、そしてその抗微生 物活性はプロテアーゼにより影響されない。

ある種の抗生物質を産生ずるそれらの能力に加えて、ダンプイン（Ｓａｎｄｉｎ ｓ）（２８）は、乳酸杆菌がヒト（および動物）の腸管における演することがで きる、ある数の役割または機能を報告した。これらは次のものを包含する：有機 酸の産生、低いｐＨおよび酸化−還元電位、競合的拮抗、胆汁の脱接合および発 癌物質の抑制。食事の付加物の乳酸杆菌は、病気の治療、予防的治療を提供する ことによりおよび必要な酵素源として有益であると思われる。

久盟立！控 本発明によれば、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、　　ｒｅｕ　ｔ　ｅ　ｒ　ｉ ）の生物学的に純粋な菌株が提供される。本発明の制御された培養方法の下で、 これらの菌株は、レウテリンと呼ぶ、新しく分離され、特徴づけられた、広いス ペクトルの抗微生物物質である。この抗生物質は、定められた条件下に、ヒトお よび他の動物に対する病原性ではない、微生物（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）を使用し て他の微生物を殺すためｌ二値用することができる。レウテリン産生性うクトバ シルス・レウテリ（Ｌａｃｔ。

ｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株を分離する本発明の技術は、また、使 用してヒトおよび農業上重要な動物から菌株を分離することができるので、これ らの分離されｊ；菌株はそれらが分離されｔ；特定の動物のための共生因子とし て使用することができる。こうして、ブタから分離されたラクトバテルス・レウ テリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３は、ブタｌ二おける大腸菌および離乳した 若いブタの下痢の病気の緩和における、およびブタの飼料効率を増加するための 共生因子として、潜在的用途を有する。ブタの小腸から直接分離した他の同種お よび異種発酵性乳酸杆菌の乳酸杆菌と比較して、およびまた、長い期間の間厚培 養物中に保持されてきたラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）Ｗ株 ２００１６および２７２７３と比較して、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅ ｕｔｅｒｉ）１０６３は、強い自動凝集反応、高度の表面疎水性を寅証し、そし て他の菌株より良好に培養中のブタ上皮細胞に結合する。レウテリンを産生ずる 方法およびこの種を収容するすべての動物の胃腸管（または便）からラクトバテ ルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）のレウテリン産生菌株を分離する手順は 、また、提供される。本発明により提供される自然に産出する広いスペクトルの 抗生物質の大量の産生は、種々の病気の処置のためにおよび一般の目的の抗微生 物剤として、この抗生物質の使用を可能とする。

図面の簡単な説明 第１図は、グリセロール培地中における好気的（震盪）および半嫌気的（静置培 養）条件下のレウテリンの産生を示す。

！２Ｓは、グリセロール培地中でラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、　　ｒｅｕｔ ｅｒｉ）の２つの菌株をＥ、ｃｏｌｉと半嫌気的インキュベーションした後、レ ウテリンの産生へのラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）濃度（μ ｇ　／　ｍ　Ｑ乾燥重量）の効果を示す。

第３図は、レウテリンの産生への温度の効果を示す。

第４図は、レウテリンの産生へのｐＨの効果を示す。

第５図は、レウテリンの産生および生物学的活性の証拠を示す。

第６図は、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）（７）試Ｎの高性 能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）の結果を示す。

第７図は、レウテリンの正イオンの質量スペクトルを示す。

第８図は、レウテリンの負イオンの質量スペクトルを示す。

第９図は、レウテリンの赤外スペクトルを示す。

菓１０図は、レウテリンの炭素ＮＭＲスペクトルを示す。

＄１１図は、レウテリンのプロトンＮＭＲスペクトルを示す。

第１２図は、ラクトバテルス・レウテリン（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉｎ）−レウテリ ンの系のモデルを示す。

ｍｌ　３Ａ図はレウテリンをファージ感染バクテリアの培養物に添加したときの 、コロニー形成単位（ＣＦ　Ｕ）およびプラーク形成単位（ＰＦＵ）を示し、そ して第１３Ｂ図はＣＦＵおよびＰＦＵの寅際の計数を示す。

第１４図は、粉砕しＩ；牛肉ミクロフロラ（ｍｉｃｒｏｆ　１ｏｒａ）へのレウ テリンの効果を示す。

第１５図は、Ｅ、ｃｏｌｉ接種した粉砕牛肉ミクロフロラへのレウテリンの効果 を示す。

第１６１１ｆｆｌは、レウテリンのフーリエ変換赤外分析を示す。

第１７図は、レウテリンの液体クロマトグラフィー／質量スペクトル分析を示す 。

第１８図は、酸化シュウチリウム中のレウテリンの炭素−１３スペクトルを示す 。

第」９図は、酸化シュウチリウム中のレウテリンのプロトンのスペクトルを示す 。

第２０図は、第１８図および第１９図のスペクトルを生ずる提案した構造を示す 。

第２１図は、ジュウテリン化メタノール中のレウテリンの炭素−１３スペクトル を示す。

第２２図は、ジュウテリン化メタノール中のレウテリンのプロトンスペクトルを 示す。

第２３図は、第２１図および第２２図を生ずる、提案しｔ；構造を示す。

第２４図は、レウテリンのトリメチルシリル誘導体の質量スペクトルを示す。

第２５図は、Ｍ／Ｅ　１４７の断片の提案した構造を示す。

第２６図は、レウテリン構造のための提案した概要を示す。

＊２７ＩＥｌは、Ｍ／ＥデータおよびＮＭＲの構造を満足する断片を示す。

第２８図は、水溶液中に存在するときの、提案した構造を示す。

好ましい　施、様の説明および好ましい　施　様の例抗生物質産生性菌株の分離 宿主特異的ラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉ　１１ｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）菌株を、動物源、例えば、種を収容する動物の胃腸管または便から、本発 明の方法より、分離することができる。ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕ ｔｅｒｉ）は、嫌気的条件下に最もよく増殖するが、好気的に増殖するであろう 。胃腸管または便からの懸濁液を、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）の 増殖に適当な寒天平板上に広げ、そして寒天平板を乳酸杆菌属のコロニーの増殖 を促進する条件下にインキュベーシヨンする。好ましい実施態様において、よく 発育しＩ；コロニーは、３７℃において４８時間の嫌気的増殖（酸素の圧力を減 少した）後、乳酸杆菌選択培地（Ｌ　Ｂ　Ｓ）の寒天平板上に現れる。ＬＢＳは 次の成分を含有する（ｇ／ｆｆ）：）リプチカーゼ。ｌＯ：酵母エキス、５　； 　ＫＨ，ＰＯい　６１；クエン酸アンモニウム、２；酢酸ナトリウム（三水和物 ）、３４：ＭｇＳＯ４（七水和物）、１．２；Ｍｎ５Ｏａ（−水利物）、０．１ ３；Ｆｅ５Ｏ４（七水和物）、０．０６゜ｐＨを濃ＨＣＩで５．５に調節する： 寒天（１５ｇ）を添加する。培地の滅菌後、グルコースＣ１ｏｇ）を添加する。

他の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）の成長培地を使用することができ る。好ましい実施態様において、ＬＢＳ平板を、０．５０モルのグリセロールお よびラクトバテルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｐｌａｎｔ ａｒｕｍ）接種物を含有する１％の液化寒天の１０ｍＱでオーバーレイする。

それぞれのレウテリン産生性コロニーの分離を保証するために、試験前に、ＬＢ Ｓ培地または他の乳酸杆菌属成長培地を使用する、初期のＬＢＳ平板上で増殖す るすべての乳酸杆菌のコロニーの平板を調製するか、あるいはオーバーレイの添 加前にＬＢＳ平板上のコロニーの各々から成長培地へ乳酸杆菌の細胞を他の技術 により移す（複製手順）。このオーバーレイが固化した後、平板を再び３７℃に おいて嫌気的びん内で４８時間インキュページＢンする。接種したラクトバテル ス・プランタルム（Ｌ、ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の増殖の阻害のゾーンは、これら の条件下に抗生物質、レウテリン、を産生するコロニーのまわりに観察される。

ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株の同定は、標準の微生物 学的試験および種の指標形質の特性を使用して実証される。

ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）は異種発酵性種であり、グル コースからガスおよびグルコースからグルコネートおよびアセテート／エタノー ルを形成する。ＡＰＩ５０ＣＨ発酵試験（Ａｎａｌｙｔａｂ　　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｃｏ、、二ニージャーシイ州ニュ ーブルンスウィック）において、それはリポース、アラビノース、グルコース、 ガラクトース、ラクトース、スクロース、メリボースおよびマルトースと陽性の ズ応を示す（ある菌株は、また、キシロースを発酵させる）。種は３９〜４１の グアニン士シトシンのモル％を有し、リジンはムレインのジアミノ酸であり、そ して種は４５℃において増殖するが、１５℃において増殖しない。ネオタイプの 菌株、ＤＳＭ２００１６と８０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡの相同性を有する菌株は 動物の胃腸管内に見いだすことができる。

本発明の方法を使用するとき、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌ ｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｊ）菌株１０６３は、ブタの胃腸管から分離され、そし て試験した他の菌株より非常に高いレベルのレウテリンを産生ずることができる ことが示された（後述する）。菌株１０６３および菌株ＤＳＭ２００１６は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ膠ン（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国マリイランド州ロッ クビレ）に１９８７年４月１７日に受託された（それぞれ、ＡＴＣＣＮｏ、５３ ６０８８よび５３６０９）。

本発明の特徴および利点を、以下の５ｉ！施例を参照すると、いっそう明瞭に理 解されるであろう。これらの寅施例は本発明を限定するものと解釈すべきでない 。

衷稟■ 天真！土 レウテリンの産生の培養条件および検出レウテリンを産生ずることができるラク トバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）細胞を ある種の好適な条件下にに配置すると、レウテリンは産生される。ある数のアッ セイを開発してレウテリンを検出しかつ定量した。標準の最小阻止濃度（ＭＩＣ ）の手順を応用して、レウテリンを検出し、そしてその産生に影響する因子を明 らかにした。Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２を感受性試験微生物として使用し、そして アッセイを次のようにして寅施する。Ｅ、ｃｏｌｉの一夜の培養物を収穫し、無 菌の０．０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄し、この 緩衝液中に懸濁し、そしてスペクトロニツタ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）７０計器 を使用する６０％の透過率（Ａ４２０ｎｍ）に調節する。この懸濁を使用して１ ：１００に希釈し、そして０．１ｍ１２のアリコートを使用して、無菌後、次の 成分を含有する１゜０ｍＱのＭＩＣ培地を接種する（ｇ／ｆｆ）：ビタミン不合 力ゼインヒドロリゼイト、３；クエン酸アンモニウム、ｌ−９；クエン酸、０． ６３；ＫＨ，ＰＯい　１２−６　；Ｍｇ５ｏ、（七水和物）、０．２　：　７． ０１：調節したｐＨおよび２０ミリモルのグルコース、レウテリン活性について 試験すべき試料の無菌の１．０ｍ１２の部分を、１．０ｍ４のこの接種したＭＩ Ｃアッセイ培地に添加し、そしてよく混合してｌ：２の希釈物を得る。次いで、 このような希釈物を３７℃において２４時間インキュベージコンし、そして増殖 について検査する。次いで、相対的レウテリン濃度（レウテリンの単位）を、イ ンジケーター細胞の可視の増殖を可能とする希釈に先行する試料希釈の逆数とし て、計算する。ＨＰＬＣ分析（後述する）により決定して、ＭＩＣ値をレウテリ ンビーク高さに関係づける他のアッセイを、また、報告する。

本発明の方法の条件下に、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）は レウテリンと呼ぶ本発明の抗微生物物質を産生ずる。ある数の異種発酵性および 同種発酵性の乳酸杆菌属（ＬａｃｔｏｂｃｉｌｌｕＳ）菌株をレウテリンの産生 について試験し、そしてラクトバテルス・レウテリンが産生される条件を決定し た。レウテリンは減少した酸素の条件下を除外して圧力好気的条件（大気の酸素 の濃度）下に産生されない。ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ） を、主要な炭素およびエネルギー源としてグルコースの代わりに、２０〜５００ ミリモルのグリセロールまたはグリセルアルデヒドを含有する前述のＭＩＣアッ セイ培地中で嫌気的（まｔ；は静置培養において半嫌気的）に培養したとき、そ れは産生される。Ｍ１図は、このグリセロール培地ｌ：おける好気的（曲線ｌ） および半嫌気的（曲線２）条件下のレウテリンの産生を示す。ラクトバテルス・ レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）はこれらの条件下に増殖しないが、それにもか かわらずレウテリンを産生する。ヘキソース、ヘキシトール、ペントース、ベン チトール、二糖ａｈよび種々のリン酸化および非リン際化ＣＪ−物質を包含する １２の他の物質を、レウテリンの産生を支持するそれらの能力について試験した 。表１はこれらの試験のいくつかの結果を示す。２０ミリモル（ｃｉおよびＣ６ の基質）または４０ミリモル（ＣＳの基質）の濃度で基質を含有する培地を、ラ クトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）の不存在下まｊ；は存在下に５ ×１０″コロニ一形成単位（ＣＦＵ）７ｍＩ２のＥ、ｃｏｌｊで接種した。グリ セロールおよびグリセルアルデヒドのみがレウテリンを産生じた。また、グリセ ロールからのレウテリンの産生は産生培地中に含められた。表２に示す結果は、 ４０ミリモルの濃度で種々の示した基質上で増殖したラクトバテルス・レウテリ （Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）の上澄み液分画による、６．７ＸｌＯ’ＣＦｔＪ／ｍ１ ２のＥ、ｃｏｌｉの生存可能な計数の阻害％を示す。

レウテリンは２つの方法で産生ずることができる。一方の手順は相同法であり、 そして他方は異種法である。相同法はラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔ ｅｒｉ）細胞を静置培養で３７℃において２５０ミリモルのグリセロール溶液中 でインキュページ盲ンした。例えば、ＩＱのラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒ ｅｕｔｅｒｉ）細胞は乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）を有する培地（ ＬＣＭ）中で３７℃において２４〜４８時間増殖することができる。ＬＣＭは次 の成分を含有するＣｇ／（１）：　）リプチカーゼ、１０；酵母エキス、５；ト リプトース、３　：　ＫＨ，ＰＯ，，３：クエン酸アンモニウム、１．５；酢酸 ナトリウム、１．０：塩類（ＬＢＳにおけるような）システィン−ＭＣＩ、０． ２；およびツイーン−８０，１ｍＱ　＊　ｐ　Ｈを７．０に調節する。グルコー ス（２０ミリモルの最終濃度）を無菌後に添加する。細胞を遠心により収穫し、 １０ｍ１２の２５０ミリモルのグリセロール溶液中に懸濁し、静置培養で３７℃ において６時間インキュページ冒ンし、次いで遠心により除去する。レウテリン はこの上澄み液分画中！＝存在する。この手順およびその多くの明らかな態様（ 例えば、変更した細胞濃度およびインキュページ１２時間）は、レウテリンを産 生ずる簡単なかつ有効な方法を提供する。

異種法は、ある種の他の（異種）レウテリン刺激微生物と一緒にラクトバテルス ・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）を同時培養することを包含する。この手順に おいて、例えば、低い濃度のラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ） （例えば、２０−３００μｇの細胞乾燥重量／ｍ＜１）を、生存可能な異種微生 物（例えば、Ｅ、ｃｏｌｊ　　Ｋ１２）の細胞と一緒にグリセロール含有培地（ 前述の）中に懸濁し、そして前述したようにインキュページ胃ンした。０．５ま たはそれ以上の生存可能の細胞の比（ＣＦＵ　　Ｅ、ｃｏｌｔ／ｍ１２／ＣＦＵ 　　Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ／ｍ１２）において、レウテリンは刺激した速度（異種 微生物の不存在に関して）において産生され、そして産生速度／ラクトバテルス ・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）バイオマス単位は異種微生物のバイオマスに 鷹接比例して増加する。レウテリンの合成において異種微生物が演する役割のこ の発見は、後述の「飼料の１１節」のモデルの開発に重要であった。この「異種 」細胞の刺激は、生存可能な細胞の間の細胞対細胞の接触を必要すると思われる 。なぜなら、２つの種がお互いにそれ以外同一の同時培養系Ｉ；おいて透析膜に より分離するとき、この刺激は起こらないからである（表３）、７４種種は少な くとも一部分うクトバシルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）の微小環境にお いてレドックス電位を低下し、これによりレウテリンの産生を刺激するという可 能性は、この刺激作用に寄与するとして除外されていない。レウテリンの産生は 、異種Ｅ、ｃｏｌｉが生存可能でない場合、あるいはラクトバテルス・レウテリ （Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）が生存可能でない場合、刺激されない。異種法によるレ ウテリンの産生は、グリセロールを代謝する刺激有機体の能力に依存しない、Ｅ 、ｃｏｌｉの突然変異体は、野生盤の細胞はど有効にグリセロールを代謝して、 レウテリンの産生を刺激することができない。

レウテリンは、生きている動物において起こる生理学的条件下に産生される。レ ウテリンの産生（異種法を使用する）は最初に急速であり、そしてラクトバテル ス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）のバイオマスｊ二比例する（第２図）が、 その後、産生速度／バイオマス単位は、多分、生存可能な細胞（Ｅ、ｃｏｌｉ／ Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）比の減少および／またはこれらの条件下にいん産生される レウテリンのより高い濃度に対するラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅ ｒｉ）細胞の感受性のために減少する。また第２図に見られるように、ラクトバ テルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株１０６３（Ｘ）は、異種法により 、ネオタイプ菌株２００１６（０）が産生ずるより大きい量のレウテリンを産生 する。ラクトバテルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）のレウテリン抵抗性突 然変異体は、なおさらに高いレベルのレウテリンを産生ずる。レウテリンの産生 は、２５〜３７℃の温度において最大速度で起こる。第３図は、グリセロール培 地中で４．２５．３７および４５ａｘＣラクトバシルス・レウテリ（Ｌ、ｒｅｕ ｔｅｒｉ）の半嫌気的インキュベージ３ンの間のレウテリンの産生へのインキュ ページ３ン温度の効果を示す。レウテリンはｐＨ５〜９において産生され、最適 な産生はｐＨ６〜８においてである。第４図は、グリセロール培地中で３時間（ 曲線３）および２４時間（曲線４）のＥ、ｃｏｌｉとのラクトバテルス・レウテ リ（Ｌ、ｒｅｕｔｓｒｉ）の半嫌気的インキュベージ１ンの間のレウテリン産生 への培１１ｐＨの効果を示す。今日まで、試験したすべてのラクトバテルス・レ ウテリ（Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ）の３つの菌株は、レウテリンを産生しｔ；：ネオ タイプ、ＤＳＭ　　２００１６、ＡＴＣＣ２７２７３［前に発酵菌（Ｌａｃｔｏ ｂｃｉｌｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）と分類された］および新しく分離され た撹拌１０６３゜すべての３つの菌株は、相同手順によりレウテリンを産生ずる （表５）、異種手順によるレウテリンの産生は、次の方法でこれらの菌株の間で 変化する二産生は、それぞれ、菌株１０６３．２７２７３および２００１６につ いて異種微生物により、大きく、中程度におよびほんのわずかに刺激される。

択土豊！Ω竺捻 レウテリンの産生は、培地中のｐＨの変化の不存在および外部から添加したカタ ラーゼの存在下に起こる。したがって、その抗微生物活性は、乳酸発酵のよく知 られた最終産生物、例えば、乳酸および酢酸または過酸化水素と関連しないか、 あるいは他の人により発見された他の酸性物質（２４，２５）と関連しない。レ ウテリンは遠心または濾過による細胞の除去後培養液中に残る。レウテリンは培 地から分離し、モしてＨＰＬＣにより溶媒系として水（脱イオンしｔ；）または １０ミリモルのＨ２ＳＯ４を使用するか、あるいはＣ−１８固相カラムにより精 製することができる。レウテリンおよび存在する他の産生物は、ＨＰＬＣの間、 屈折率（Ｒ１）検出器システムを使用して検出される。ＭＩＣ活性を示すＲＩビ ークは、この系においてグリセロールと１．３−プロパンジオールとの間で溶離 する　１４Ｃ（均一に標識された）グリセロールをレウテリン産生系において使 用するとき、ＨＰＬＣにより回復されるレウテリンはＩ４０標識され、この物質 が（少なくとも一部分）グリセロールの水溶性誘導体であることを示す。

寒箆！土上１ 抗微生物活性 レウテリンは広いスペクトルの抗微生物剤である。レウテリンは殺バクテリア剤 として機能する。レウテリンの産生およびその強力な殺バクテリア活性の証拠は の両者は、第５図に要約したデータにより明瞭に実証される。示した濃度ＣＣＦ Ｕ／ｍＡ＞のＥ、ｃｏｌｉ（実線）およびり、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３　（ 破線）は前述のグリセロールカゼイン加水分解物（Ｏ）、同一培地マイナスクエ ン酸塩（・）および同一培地マイナスグリセロール（×）中に接種（時間ゼロ） した。同時培養物を半嫌気的に（静置培養）３７℃においてインキニベーシ層ン し、試料を示した間隔で取り出して、存在するＥ、ｃｏｌｉｊ５よびり、１ｅｕ ｔｅｒｉの数（ＣＦＵ／ｍＱ）を決定した。これらのデータから理解することが できるように、グリセロールが存在するとき、ある物質が最初の３〜４時間の間 に産生され、これは次の数時間の間に生存可能なＥ、ｃ。

１１細胞の７〜ｇｌｏｇ減少を生じた。こうしてさらに試験したすべてのダラム 陰性バクテリアの属（Ｅｓｃｈｅ　ｒ　ｉｃｈ　ｉａ、Ｓｈ　ｆｇｅ　ｌ１ａｔ 　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｑ　ＰｒｏｔｅｕｓおよびＰ　ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏｍ。

ｎａｓ）および試験したすべてのダラム陽性の属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ。

ＢａｃｉｌｌｕｓｌｌＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ ｓ）はレウテリンに対して感受性であった。しかしながら、多少より高い濃度の レウテリンは、後者の３つの属の代表的な菌を殺すために必要である。低級の真 核細胞、酵母菌５ａｃｃｈａ　ｒ’ｏｍｙｃｅ　５ｃｅｒｖｉｓｉａｅは、また 、レウテリンにより殺される。これらの発見は表６に要約されている。また、こ の表に、異種手順によるレウテリンの産生を刺激する試験した種々の種の能力が しめされている。また、認められるように、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉそれ自体は、３ ２ＭＩＣ単位以上の濃度に暴露する場合、レウテリンに対して感受性である。ま ｔ；、レウテリン（はぼ２０ＭＩＣ単位／ａｍの最終濃度において）は、シャー ガス病を引き起こす原生動物の寄生生物、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　　ｃｒｕｚ ｉの生体外の増殖を阻害することを示すデータをわれわれは有する。対照の培養 物は正常の増殖および行動を示したが、レウテリン処置した細胞は移動性および 分割する能力を失い、そして生存可能性の損失を示す形態学的「ラウンディング −アップ（ｒｏｕｎｄｉｎｇ−ｕｐ）Ｊを示した。

里簾輿１ｙ 抗ウィルス活性 レウテリンは、また、ウィルスの複製の防止において有効である。第１３図は実 験の結果を示し、ここでＯ〜５０単位／ｍ１２のレウテリンを、バクテリアのウ ィルス（それぞれ、ラムダファージまたはファージ８０１４−Ｂ２）で感染した Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｐ ｌａｎｔａｒｕｍの増殖するバクテリア細胞に添加した。１４標識グリセロール を使用する予備的結果から明らかなように、０．５ｍ（ｉの溶液中の４μｇのレ ウテリンはほぼ１単位のレウテリンに等しい。４時間後、宿主細胞のコロニー形 成単位（ＣＦ　Ｕ）およびウィルスのプラーク形成単位（Ｐ　Ｆ　Ｕ）を標準の 微生物学技術によりアッセイした。レウテリンを添加しないと、微生物細胞の数 は４時間の期間で約１００倍増加した。Ｅ、ｃｏｌｉでは、ｌＯ単位のレウテリ ンの添加は、４時間のインキュベーション後、レウテリン不含対照培養物に比較 して、細胞の数のほぼ１００倍の減少およびラムダファージのＰＦＵの数の１０ ００倍以上の減少を引き起こした。乳酸杆菌属のＣＦＵおよびＰＦＵのレウテリ ンによる減少はめざましくなく、モしてＥ。

ｃｏｌｉを使用するよりより高いレウテリン濃度を必要したが、ＣＦＵにおける よりＰＦＵのなおさらに大きい傾斜をもつ同様なノくターンは２５単位以上のレ ウテリンの量において観察された。これらの結果が示すように、レウテリンはウ ィルスの産生の阻害において有効であり、そしてこの有効性はバクテリアの宿主 細胞へのレウテリンの効果以上でありそれを越える。

天産！ｙ 共生活性 ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）を ブタに与えるとき、それはそれらの胃腸管コロニー化することができる。予備実 験において、１０８〜１０”ＣＦＵ／動物の範囲の濃度においてり、ｒｅｕｔｅ ｒｉ　　１０６３細胞を新しく生まれたコツタの規定食中に含め、そして生存可 能なり、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３細胞をこれらの動物の便から回復した。こ れらのり、ｒｅｕｔｅｒｉの接種は動物に悪影響を与えなかった。

成体のブタ、コツタ（生後５日）またはノドパイオートのコツタを使用する実験 を実施し、ここで大量（約１０”の細胞）のり、ｒｅｕｔｅｒｉ菌株１０６３細 胞を動物に与えた。約５〜７日後、十分なり、ｒｅｕｔｅｒｉ細胞はなお動物の 便から回復され、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉが胃腸管の通過において生存し、そして動 物において十分に長く止まり、コロニー化が起こり、そしてレウテリンが産生さ れうろことが示された。

Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ菌株１０６３によるレウテリンの産生は胃腸管の環境におい て期待され、この胃腸管はり、ｒｅｕｔｅｒｉ菌株を本来分離した環境である。

ある種の培地成分またはり、ｒｅｕｔｅｒ＋によるレウテリンの産生に対して条 件付けられた他の物質、例えば、グリセロールを動物の食物に添加して、胃腸管 内のレウテリンの産生のための条件を最適化することができる。鳥類を包含する 動物の種々の種（用語「動物」は明らかにヒトおよび鳥類を包含する）から分離 しｔ；ラクトｌ（シルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅ ｒｉ）菌株を、菌株を分離した動物の種に、か、あるいはそれらを分離した以外 の種の動物にをある量で供給することができる。

天罠！ｙ± リボヌクレオチドリダクターゼの阻害 レウテリンはりポヌクレオチドリダクターゼを阻害する、デオキシリボ核酸（Ｄ ＮＡ）の合成において第１工程。自然において、デオキシリボヌクレオチドの合 成だめの唯一の通路、すなわち、対応するりボヌクレオチドの直接還元が存在す る。デオキシリボヌクレオチドは高度に特殊化されｔ；代謝物であり、そしてＤ ＮＡのブロックを構成する役目のみをする。リボヌクレオチドのデオキシリボヌ クレオチドへの還元を触媒する酵素は、リボヌクレオチドリダクターゼである。

この還元はＤＮＡ合成における最初の前もって必要な工程であり、これにより原 核細胞および真核細胞およびウィルスの成長および増殖において必須の役割を演 する。

レウテリンがリボヌクレオチドリダクターゼ（ＥＣ１，１７，４）活性を阻害す るという証拠は、次の文献に記載されている手順を使用して得られた＝Ｔｈｅｌ ａｎｄｅｒ、ＳｊｏｂｅｒｇおよびＥｒ１ｋｓｓｏｎ、メソッズ・イン・エンジ モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、（Ｖｏｌ、Ｌ ｌ）、ｐｐ、２２７−２３７．１９７８゜ｎｒｄＡおよびｎ　ｒｄＢ遺伝子によ りエンコードされる、この酵素の精製したＢ１およびＢ２サブユニットを使用し 、そして分光光度測定アッセイを上の文献に記載されているように使用した。簡 潔的には、この手順は次のとおりである；酵素を２５℃において２００ナノモル のＡＴＰ、１．６ナノモルのＭｇＣ＋、、８０ナノモルのＮＡＤＰＰＨ。

５μモルのＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ′　２−ニスタンスルホ ン酸緩衝液（ｐＨ７，６）、３００ピコモルのチオレドキシン、４０ピコモルの チオレドキシンリダクターゼ、ｌＯナノモルのＥＤＴＡ。

および６５ナノモルのジチオスレイトールを含有するする反応混合物中で０−１ ３ｍ１２の最終の体積でインキュベーションした。反応は７５ナノモルのＣＤＰ の添加により介しし、モしてＮＡＤＰＨの酸化は３４０ｎｍにおいてマイクロク ベットを装備したラフイス自動記録分光光度計を使用して監視した。ＣＤＰの添 加前に、ＮＡＤＰＨのバックグラウンドの酸化を記録し、そしてこのパックグラ ウンドをＣＤＰの添加後観測されたＮＡＤＰＨの酸化から減じた。

これらの実施例において使用するレウテリンは、相同法により調製し、そして２ ５６ＭＩＣ単位／ｍΩの活性を含有した。レウテリンの非希釈および種々の希釈 したものをＣＬｐＱの量で）で反応混合物に添加して、リボヌクレオチドリダク ターゼ活性へのこの物質の効果を決定しｔ；。この実験の結果を表７に要約する 。示されるように、レウテリンは酵素のＢｌサブユニットの有効な阻害剤である 。また、認められるように、チオレドキシン（酵素活性に要求される）は、また 、レウテリンに対して感受性である。

バクテリア、酵母菌、かび、原生動物、ウィルスおよび新形成および正常の動物 細胞の生長を阻害するレウテリンの能力は、こうして少なくとも一部分、デオキ シリボヌクレオチドの新しい産生を阻害することによりＤＮＡ合成の阻害するそ の能力に帰属させることができる。

特定の地方のスーパーマーケットから購入しｌ；粉砕した牛肉を４つの部分に分 けた。１つの部分は未処置であり、他の部分は肉１ｇ当たり１０．５０および１ ００単位のレウテリンで処置した。すべての試料は４℃において貯蔵し、試料は 生物学的分析のために示しｔ；日に取った。

牛肉の試料を取り出し、モして１：１０に希釈した（Ｉｇの牛肉：９ｇの無菌Ｈ ，Ｏ）。引き続いて小数の希釈物を゛必要に応じて作り、そして試料をディ７コ 栄養寒天上に配置した。これらの試料を２７℃において２４時間インキュベーシ ョンし、そしてコロニー形成単位／ｇ粉砕牛肉（ｃＦＵ／ｇ）として計数した。

データが示すように、レウテリンはＣＦ　Ｕ／ｇを有意に減少した（第１４図） （口、対照：◆、ｌＯ単位のレウテリン；■、５０単位のレウテリン；および◇ 、１００単位のレウテリン）。より高いレベルのレウテリン（５０および１００ 単位／ｇ）では、バクテリアの土着の集団は減少し、そして６日間の試験期間を 通じて対照試料により４１ｏｇ単位より大きく低く止まった。

特定の地域のスーパーマーケットから購入した粉砕牛肉は、完全に接種し、そし てほぼ１０　’ＣＦ　Ｕ／ｒ１２のＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２細胞と混合した。混 合後、この物質を２つの部分に分割した。一方の部分は未処置対照（レウテリン なし）であり、他方の部分は７５単位（Ｕ）／ｇ生牛肉レウテリンを供給した。

試料を４℃で貯蔵し、一部分を示した時間に生物学的分析のために取り出した。

この実験において、生存可能な細胞（ＣＦＵ／ｇ牛肉）の決定を第１４図に記載 するようにして実施したが、ただしディフコのマクコンキー寒天（ＭｃＣｏｎｋ ｅｙ’　Ａｇａｒ）（腸内様バクテリアに対して比較的特異的）を使用した。第 １５図から理解することができるように（口、対照；◆、７５単位のレウテリン ）、レウテリンはバクテリアの初期の集団を減少し、そしてこれらの数を９日の インキュベージＩン期間を通じて低く保持した。

実施例Ｖｌｌｌ ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅこの証拠 は、モデル系として魚を貯蔵して得られた。この研究は次のようにして実施した ：魚の切身（タイセイヨウニシン、Ｃ１ｕｐｅａ　　ｈａｒｅｎｇａｓ）を、次 の処置用溶液中に浸漬した：対照：処置なし グリセロール＝２５０ミリモルのグリセロール溶液菌株１０６８　：　２５０ミ リモルのグリセロール溶液、４Ｘ１０”ＣＦＵ／ｍＱのり、ｒｅｕｔｅｒｉ　　 １０６８を含有する（非しウテリン産生菌株） 菌株１０６３：２５０ミリモルのグリセロール溶液、４Ｘ１０’ＣＦＵ／ｍＱの り、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３を含有する切身（各々２つの並列試料）を大き いペトリ皿中に８℃において４日間冷蔵庫内で保持した。次いで、アンモニアの 含量および関連するバクテリアのＣＦＵ　（すなわち、腐敗性シュードモナスお よび添加した乳酸杆菌）を分析して、食物製品の貯蔵寿命を評価した。表８に要 約する結果は、次のことを示す： （ｉ）　　添加した乳酸杆菌（グルコース乳酸杆菌属選択培地、前述、を使用し て合計の乳酸杆菌として計数した）およびり、ｒｅｕｔｅｒｉ　　ＣＦＵ（Ｌ− アラブ二ノース乳酸杆菌属選択培地を使用して検出しｔ；合計異種発酵性乳酸杆 菌として計数した）は、８℃において良好に生存するが、有意の程度に増殖しな い。

（ｉ　ｉ）　　Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３は腐敗性シュードモナスの増殖 を有意に遅延した。Ｌ、ｒａｕｔｅｒｉ　　１０６３は多少遅延したが、腐敗を 防止するためには十分でなく、それは一般にｌｏｇ８．４シユードモナス計数に より示される。

（ｉ　ｉ　ｉ）　　腐敗性バクテリアへのり、ｒｅｕｔｅｒｉおよびグリセロー ルの遅延作用は、アンモニアの有利に強い減少作用を有する。

（ｖｉ）　　Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ＋グリセロールの食物防腐作用は、すべての種 類の腐敗について示される。

黒黒！土Ｘ レウテリンはグリセロール発酵の産生物である。

レウテリンは、他の乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）種において起こる グリセロールの異種発酵の同一の型と関連する新しい産生物である。レウテリン を分離し、モしてＨＰＬＣを使用してり、ｒｅｕｔｅｒｉによりグリセロール発 酵の産生物として同定することができる。

グリセロール、ｌ、３−プロパンジオールおよびβ−ヒドロキシプロピオンｌ！ （すべて純粋な商業的調製物）は、０．１２モル程度に高い濃度で試験したとき 、本質的に抗微生物活性を欠くことが示された。

グリセロールの発酵の間のレウテリン＋１．３−プロパンジオールおよびβ−ヒ ドロキシプロピオン酸のり、ｒｅｕｔｅｒｉによる産生は、ＨＰＬＣ分析を使用 して確立された。代表的データは第６図に示す。試料を調製するために、ＩＩ２ のり、ｒｅｕｔｅｒｉ培養物（２０ミリモルのグルコースを含有するＬＣＭ中で ３７℃において４８時間増殖させた）を遠心により収穫し、無菌のリン酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄し、そしてｌ０ｍ１２の０．２５モルの無 菌グリセロール中に懸濁させた。３７℃において６時間インキニベーシ１ンした 後、細胞を遠心により収穫し、そして上澄み液（以後、試料と呼ぶ）を前述のＭ ＩＣおよび後述のＨＰＬＣによりレウテリンについて分析した。いくつかの実験 において、５μＣｉの１４（（（Ｊ）のグリセロールを０．２５モルのグリセロ ール中に含めた。試料を０．２〜０．４５ミクロンの生物学的フィルターに通過 させ、そして２℃において無菌的に貯蔵した後ＨＰＬＣ装置中に注射した。

ＨＰＬＣ分析は、次のようにして実施した：試料の各々の２０〜１００μＱの分 画をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＨＰＬＣ装置（単一のまｔ；は２つの並列の 分析用Ｃ−１８カラムを装備した）中に注入した。試料を０．２〜０．４５ミク ロンのフィルターを通過させＩ；蒸留した脱イオン水で溶離した。溶離速度は１ −０〜１゜５ｍ４／分であり、そして試料はウォーターズ４１０示差屈折計を使 用して監視した。屈折率（Ｒ■）の変化を自動的に記録し、モしてＲ１（縦座標 ）対溶離体積／時間（横座標）をプロットした（示すグラフ上で右から左に進行 する）。試料の各々についての合計の溶離時間はほぼ１５分であり、ピークＬ　 ２および３は、それぞれ、はぼ８．７および６分であった。

前述したように調製しそして水で溶離した試料のＨＰＬＣ分析は第６Ａ図〜第６ Ｅ図に示す。ここには、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３を１２８および５１２ ＭＩＣ単位で（それぞれ、グラフ６Ａおよび６Ｂ）、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ　　２ ００１６（グラフ６Ｃ）およびり、ｒｅｕｔｅｒ　ｉ　　ＡＴＣＣ２７２７３（ グラフ６Ｄおよび６Ｅ）を使用して調製した試料を含める。ピーク１８よび３は 、それぞれ、参照標準の使用および分離したピークのＩＲスペクトルの同定ｌ二 より、１．３−プロパンジオールおよびグリセロールと同定されｔ；。これらの 条件下に、ピーク２は常にグラフにおいて見られる特徴ある広いピークとして溶 離し、そしてそれはＭＩＣアッセイを使用して決定して生物学的活性を有する試 料から溶離する唯一の基質である。こうして、それはレウテリンと呼ぶ抗微生物 物質として同定される。３つのそれ以上の分析はピーク２がレウテリンであると いう結論を支持する。第１に、ピーク２中に存在する物質の量はもとの試料のＭ ＩＣ値に直接比例して増加する。これは、それぞれ、１２８および５１２のＭＩ Ｃ力価を有する試料中で、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ　　１０６３により産生されたレ ウテリンを表すグラフ６Ａおよび６Ｂにおいて見られる。第２に、こうして試験 したすべてのり、　ｒｅｕｔｅｒｉ菌株は、さらに、ＭＩＣにより決定してレウ テリンを産生じ、そして各場合においてピーク２は存在する（参照、グラフ６Ａ 〜６Ｅ）。今日まで試験しｔ：すべての他の乳酸杆菌属（ＬａｃｔｏｂｃｉｌＩ ｕｓ）種は匹敵する生物学的活性（ＭＩＣ活性）を欠き、モしてＨＰＬＣにより 分析したとき、ピーク２の領域において溶離する物質をほとんどあるいは全く示 さない。第３に、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ　　ＡＴＣＣ２７２７３の自発豹変ＪＩ型 または突然変異体を分離し、そして精製した。

この変異聾はかなり低いレベルのレウテリンを産生じＣＭＩＣアッセイにより決 定して）、グリセロール−Ｅ、ｃｏｌｉオーバーレイ平板において弱い阻害ゾー ンを示すか、あるいは全く示さず、そしてグラフ６において見られるように、そ の親（野生盤）菌株に比較してピーク２領域において溶離する物質を非常に少な く産生ずる（グラフ６Ｄ）。

０．０１モルのＨ！Ｓｏ、を溶離溶媒として使用するとき、β−ヒドロキシプロ ピオン酸のピークは第６Ｆ図Ｉ：おいて見られるように分解される。この実験に おいて使用した試料は菌株１０６３から得られ、そして１０２４単位のレウテリ ンを有した。１４（（［Ｊ）−グリセロールを本質的に同一の実験において含め 、ＨＰＬＣにより溶媒として０．０１モルのＨ２ＳＯ，を使用して分離し、そし て放射能の決定（パラカード液体シンチレーシ１ン分光光度計）だめの別々のピ ークとして集めると、次の結果が得られた：２５．７７６；５３．４２８および ６１．４２８の合計のｃｐｍは、それぞれ、β−ヒドロキシプロピオン酸（ピー ク４）、１．３−プロパンジオール（ピークｌ）、レウテリン（ピーク２）およ び使用しないグリセロール（ピーク３）として回収された。これらの結果オよび 下に表すレウテリンについてのデータが示すように、グリセロ−ルはこれらの条 件下に次の反応に従って発酵された：５　グリセロール−２１，３−プロパンジ オ−Ｊし＋１　β−ヒドロキシプロピオンａ＋１　　レウテリン 里菖豊Ｘ 予備的レウテリンの特徴づけ 粗製調製物中のレウテリンの特徴づけは、次のことを示した。レウテリンは高度 に水溶性であり、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対して抵抗性であり、モし て熱（１００℃、１０分間）に対して、とくにｐＨ９，０以上において不安定で ある。レウテリンは明らかにバクテリオシンではない。予備分析的分析を、前述 したようにＨＰＬＣにより分離され！二本質的に純粋なレウテリン（多少のグリ セロールが存在する）について実施した。試料をリサーチ・トライアングル・イ ンスチチュート（Ｒｅｓｅａｃｈ　　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ （Ｒｅｓｅａｃｈ　　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　　Ｐａｒｋ、ノースカロリナ州）およ びデパートメント・オブ・ケミストリー（ノースカロリナ州立大学、ノースカロ リナ州うレイ）に、質量、ＮＭＲおよび赤外スペクトル分析ために提出した。こ れらのデータを第７図〜ｇｌｌｒｇＪに要約する。ＬＣＭＳ分析はフインニガン （Ｆ　ｉｎｎ　ｉｇａｎ）４５００ＨＰＬＣ／ＭＳシステムでベステク・インタ ーフェース（Ｖｅｓｔｅｃ　　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を使用して実施した。分離 はアミネックス（Ａｍｉｎｅｗ）８７Ｈカラムを使用して実施し、溶離液は０− ８ｍ１２／分の流速であった。正イオン（第７図）８よび負イオン（第８図）の 両者について、質量スペクトル（縦座標上にプロットした相対強度、質量対エネ ルギー電荷、ｍ／ｅ値、横座標）はほぼ１６２ｇ１モルの分子量を示しｔ；。（ ｉ）前述のラジオアイソトープの分析および（ｉ　ｉ）レウテリンが陽性のシッ プ反応を与えるという観察（アルデヒドの官能基の存在を示す）と−緒に、この 予備的情報が示すように、レウテリンは分子量式〇　ａ　Ｈｌｅ　Ｏ＊を有し、 そして次の構造を有する： 第９図に示す赤外スペクトル分析、第１Ｏ図に示す炭素核磁気共鳴（ＮＭＲ）ス ペクトル分析および第１１図に示す２５０メガヘルツのプロトンＮＭＲ分析は、 レウテリンについてのこの提案する構造と一致する。

これらのＮＭＲスペクトルのデータは、輻射線の吸収（縦軸）対磁場のスイープ （ｓｗｅｅｐ）（槓軸）のコンピューター処理したプロットである。正確な構造 についての情報は、大量の絶対に純粋なレウテリンが入手可能となったとき、得 られた。

分子の１端上のアルデヒド炭素および他端のアルコール炭素を包含する、予備的 データから推定したレウテリンについての炭水化物様構造に基づいて、アルデヒ ド基および末端ヒドロキシル基の間の反応に対応するヘミアセタールとしてこの 物質が存在することが示された。このような構造の三次元の分子モデルは、ペン トース、倒えば、Ｄ−リポースに対する密接な類似を有する分子を明らかにした 。

この基準に基づいて、レウテリンはＤＮＡ合成において特異的ｌ二含まれる第１ 酵素、リボヌクレオチドリダクターゼ上のそれらの認識部位についてリボヌクレ オチドと競争することができるＤ−リポース類似体でありうると推定されＩ；。

こうして、レウテリンはＤＮＡ合成に対して特異的な第１工程を、リボヌクレオ チドのデオキシリボヌクレオチドへの転化を阻害することによって阻害すること ができるであろう。レウテリンがペントース類似体であり、そしてリダクターゼ 部位で結合する場合、急速に増殖する悪性細胞、例えば、癌細胞Ｊ：８いて優先 的Ｉ：結合することが期待されるであろう。これらの仮定は、（ｉ）レウテリン の提案された構造、（ｉｉ）レウテリンがその殺バクテリア作用を発揮する速度 （！！！験のデータはレウテリンの添加直後Ｅ、ｃｏｌｉの増殖の阻害を実証す る）および（ｉ　ｉ　ｉ）原核細胞および真核細胞（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　　ｃｒｕｚｉ）の両者がレウテリンに対して 感受性であるという事実と一致する。こうして、レウテリンは抗禁・かび、抗寄 生生物、抗ウィルスおよび抗癌剤ならびに抗バクテリア剤であると考えらること ができるであろう。

罠産五Ｘ工 化学分析のための精製したレウテリンの産生ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃ ｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）１０６３の一夜の培養物の１％の接種 物（１）を、グルコースを有する変性乳酸杆菌属担持培地（ＬＣＭＧ）中で２４ 時間増殖させた。

変性ＬＣＭＧは溶液ｌＱにつき次の成分から成る２５ｇの酵母エキス、１０ｇの トリブチカーゼ、３ｇのトリプトース、３ｇのリン酸カリウム（−塩基性）、３ ｇのリン酸カリウム（二塩基性）、２ｇのクエン酸アンモニウム、１．１５ｇの 酢酸ナトリウム・３Ｈ２０，５ｍｇの硫酸マグネシウム−７Ｈ，Ｏｌｏ、３１ｍ ｇの硫酸マンガン、０．２ｍｇの硫酸第一鉄・７Ｈ３０および０．５ｍｇのＬ− アスコルビン酸。次いで、この培地をオートクレーブ処理し、モしてｌ　Ｏｍｇ の濾過滅菌しＩ；２モルのグルコースを冷却した培地に添加した。Ｌ、ｒｅｕｔ ｅｒｉの細胞を４０００Ｘｇで１０分間収穫し、そして５０ミリモルのリン酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で２回洗浄した。

洗浄後、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉを１０ｍｇ細胞／ｍ（ｌ脱イオン水の濃度に懸濁し た。無菌のグリセロールを２５０ミリモルの濃縮物が達成されるまで添加した。

この細胞懸濁液を３７℃において３時間インキニベーションして、レウテリンを 産生および蓄積した。次いで、細胞を４０００Ｘｇで１０分間沈澱させ、そして 廃棄した。上澄み液を０．４５ミクロンのフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）で濾 過して、残留する細胞を除去し、引き続いてレウテリンの分離に使用した。

レウテリンの精製は、ｌＸ３０ｃｍのガラスカラム、バオラド（Ｂｉｒ　ａ　ｄ 　ｓ、カリフォルニア州すッチモンド）からのＡＧ５０Ｗ、８％の架橋した一４ ００メツシュの槙脂を充填した、を使用して達成した。６０％のアセトニトリル ４０％の蒸留脱イオン水から構成され、１．１ｇ／ρのトリフルオロ酢酸を含有 する溶媒を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１１０Ａ　　ＨＰＬＣポンプを経て 供給した。溶媒の流速は１．５ｍ１２／分であり、そして検出はウォーターズ（ Ｗａｔｅｒｓ）４１０示差屈折計で２×の感度および５の目盛り倍率を使用して 達成した。４００μｇの上澄み液をアトレックス（Ａｔｌｅｘ）２１０注入装置 （Ｂｅｃｋｍａｎ）を、５００μｇの試料ループをもつ、使用して注入し、そし て分画を手動的に集めた。次いで、分画を吸引下に周囲温度において回転蒸発し てアセトニトリルを除去した。試料を引き続いてビルチス（Ｖｉｒｔ　１ｓ）１ ０−０３０凍結乾燥装置を使用して凍結乾燥乾固しｔ；。分画の一部分をアミネ ックス（Ａｍｉｎｅｘ）８７Ｈ分析用カラム（Ｂｉｒａｄ）に通過させることに よって、純度をアッセイした。

２つの分画のうち最初のものはカラムから１５および１９分に溶離され、そして レウテリンは第１ピーク中に存在することが分かった。第２分画はほぼ１９分の 溶離時間を有した。レウテリンを含有する分画の前の部分は重い肩を有し、これ はβ−ヒドロキシプロピオン酸であると推定され、それゆ集めなかった。レウテ リンビークの中央部分を集め、そして回転蒸発により乾燥し、次いで凍結乾燥し た。このプロセスは無色透明の粘性の液体を生成し、この液体は、分析条件下に アミネックス８７ｈカラムを使用して再クロマトグラフィーにかけると、単一の ピークを生成し、これは活性ピークと同時に溶離された。集め！二分画は、また 、ＭＩＣアッセイにより決定して、生物学的活性を含有した。他の集めた分画は 生物学的活性を示さなかった。精製した分画を、また、バイオ−ラドのタンパク 質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチ　　。

モンド）を使用してタンパク質の存在について分析した。タンパク質の存在は検 出できなかった。

実施例Ｘｌ！ 精製したレウテリンの７一リエ変換赤外分析レウテリンをフーリエ変換赤外分析 （ＰＲＩＲ）にかけて、分子内に存在する化学基を決定した。試料はパーキンエ ルマー７５００データステージ２ンを有するパーキンエルマー１５５０ＦＲＩＲ で分析した。得られた結果を第１６図に示す。理解できるように、分子は１０５ １０５Ｏ−１１５０’に８ける大きいＣ−Ｏのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）の バンドおよび３４５０ｃｍ”’における広いＯ−Ｈのストレッチの存在により示 されるように、ヒドロキシル官能を含有した。アルデヒドを示すＣ−Ｄストレッ チは１７３０ｃｍ−’に観察された。典型的なアルカンＣ−Ｈのストレッチは２ ８８０および１３８０ｃｍ”に存在した。

寒厘！Ｘ上エユ 精製したレウテリンのＬＣ分離の分析は、アミネックス８７Ｈカラム（Ｂｉｏ− Ｒａｄ、カリフォルニア州すッチモンド）で６５％の蒸留脱イオン水および３５ ％のアセトニトリル（１，０ｇ／ρの濃ＷＬ酸を含有する）の０．８ｍＱ１分の 流速で達成した。溶媒系を０．３モルの酢酸アンモニウムとカラム後に混合し、 そしてベステフク（Ｖｅｓｔｅｃ）インターフェース（Ｖｅｓｔｅｃ、テキサス 州ポウストン）を経てフイニンガン４５００ＨＰＬＣ／ＭＳ系ＣＦ＋ｎｎｅｇａ ｎ、カル７ｆルニア州サンジＳ−ス）中に導入しｔ；。正イオンの検出は、２１ ０℃の蒸発温度および２５０℃の源温度で使用しｔ；。源の電子エネルギーは１ ０００ｅＶであった。

ＬＣ／ＭＳ分析は、レウテリンについて酢酸アンモニウムのカラム後の添加で実 施した。基本ピークは、第１７図に示すデータにより示されるように、１６６Ｍ ／Ｅ単位において起こった。このイオンは分子イオンのアンモニウム付加物であ ると解釈された。これはレウテリンの分子量に相当する１４ｇの分子量を示すで あろう。１４８に８いてシグナルは付加物のイオンからの水の損失であると予測 され、モして１３０におけるシグナルは２分子の水が損失しｔ；付加物のイオン を表した。１０１１；存在するシグナルは、バックグラウンドの溶媒の効果から であると信じられた。

寒＾豊ｙ 精製したレウテリンの核磁気共鳴スペクトル分析プロトンおよび炭素のＮＭＲの 研究は、アルドリッヒ（Ａ　］　ｄ　ｒ　ｉ　ｃｈ）（ウィスコンシン州ミルク オーキー）からの酸化シュウチリウムおよびジュウテリン化メタノールの両者中 において実施した。プロトンＮＭＲは、２５０ＭＨｚで作動するブルーカー（Ｂ ｒｕｋｅ　ｒ）ＷＭ２５０ＦＲＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ）で実施した。炭素１３２ ベクトルは、ｌＢＭ　　ＮＲ−１００ＡＦ　　ＦＲＮＭＲ（ＩＢＭ　　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ１カルフォルニア州サンジ暦−ス）、２５ＭＨｚで作動し、超伝 導磁石を有する、で発生させた。データの処理は、アスペクト（Ａｓｐｅｃｔ） ３０００で達成した。酸化シュウチリウム中のＮＭＲ研究において、炭素１３Ｎ ＭＲスペクトルは、４０．１．４６．３．５６．２．５８゜７．８９．７および ２０７．７ｐｐｒｎの化学シフトにおいて６つのシグナルを有した。２０７．７ ｐｐｍにおけるシグナルはアルデヒド炭素として解釈され、８９．５８、および ５６ｐｐｍにおけるシグナルは結合した酸素として、モして４６および４０ｐｐ ｍにおけるシグナルは脂肪族部分として解釈された。

炭素およびプロトンのスペクトルは、第１８図および第１９図に示されている。

脱カップリングならびにシグナルのスズリフトパターンは、第２０図に示す構造 の初期の提案に導いた。９−５ｐｐｍにおけるプロトンのシグナル（炭素ｌ）は 、２．６ｐｐｍにおけるシグナル°（炭素２）が飽和されているとき、影響を受 けることがわかっＩ；。炭素２に関連するプロトンは、トリプレットであると思 われるものにスプリットしたが、よく検査すると、実際にはセクステット（ｓｅ ｘｔｅｔ）として見えた（炭素１上の等ししくないトリプレットのスプリット） 。炭素２上のプロトンのカップリングパターンは、９．５Ｈ１われる３、７ｐｐ ｍにおけるシグナルの飽和により変更することがわかり（炭素ｌおよび３）、し たがって両者の炭素ｌおよび３に隣接して存在することが予測されＩ；。

３．７ｐｐｍにおけるシグナルのスプリットパターン（炭素３）は、トリプレッ トであり、そして２．６ｐｐｍにおけるシグナルの飽和により影響された。これ らのパターンは、ＣＨＯ−ＣＨ３−ＣＨ２−０−Ｒとして炭素１．２および３に ついて提案された予測した構造に適合する。

５．０ｐｐｍにおけるプロトン（炭素４）は、トリプレットとして現れ、モして １−６ｐｐｍにおけるシグナルの飽和によりのみ影響を受けた。５．０および３ ．５ｐｐｍにおけるシグナルの飽和は、１．６ｐｐｍにおけるスズリフトパター ン（炭素５）の変更に導いた。炭素５上のプロトンは、カルチット（ｑｕａｒｔ ｅｔ）として評価される複雑なスプリットパターンを有する。３．５ｐｐｍにお けるトリプレット（炭素６）を生ずるプロトンは、１．６ｐｐｍにおけるシグナ ル（炭素５）の飽和によってのみ影響を受けた。レウテリンのこの半分について のシグナルのパターンおよび化学シフトのデータは、炭素４．５８よび６に関連 する構造Ｒ−０−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＣＨ２０Ｈの解釈に導イｆ＝。この分子の 中央に存在するヘミアセタール酸素（第２０図）は、観察されたように、２つの は半分のカップリングを防止するであろう。予測した構造のプロトンの化学シフ トは、既知の値についてのそれらと合致する。

１．７．３．６および５．０ｐｐｍにおけるシグナルの広さは、シグナルの各々 を生ずるプロトンの数の決定に使用するピークの各々の下の面積の計算を妨害し た。このような広さは、水を溶媒として使用したとき、平行で存在する分子の関 係するまたは一時的形態の結果であろう。

ジュウテリン化メタノール中のレウテリンのシグナルのパターンは、酸化シュウ チリウムにおいて観察されるものと明確の異なった。炭素−１３のパターンは、 ３６．８．５８．９および１０３．９ｐｐｍにおけるわずかに３組のシグナルを 含有したｓ　１１０４ｐｐ付近の炭素−１３のシグナルは、下に示す炭素につい て二糖類、例えば、ラクトースにおいて観察された： ジュウテリン化メタノールにおいて決定されｔ；プロトンのスペクトルは、また 、１．８．３．６および４．５ｐｐｍ付近に存在する３組のシグナルを含有し、 ピークの面積の比は、それぞれ、２：２：　１であった。

炭素−１３およびプロトンのスペクトルは、それぞれ、８２１図および第２２図 に表されている。プロトンのスペクトルの相対的面積のために、２：２：ｌの水 素の比が示唆された＊　１．８ｐｐｍに存在するプロトンのシグナルはカルチッ トとして存在し、そしてカップリングの研究は３゜６および４．５ｐｐｍに起こ るシグナルを生ずるプロトンを含有する次素；；隣接するとして、その存在を示 した。３．６８よび４．５ｐｐｍに見いだされるシグナルの両者は、トリプレッ トとして存在し、そしてカップリングの賓験は１−８ｐｐｍにおけるシグナルを もつプロトンとの相工作用のみを説明する。第２３図に示す構造は、この組のデ ータに相当することを示唆した（二Ｎ類の炭素−１３のシグナルの特性を包含す る）。

衷真男盈ヱ 精製したレウテリンのガスクロマトグラフィー／質量スペクトルトリメチルシリ ル化をＮ、Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦ Ａ）（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ９、イリノイ州ロックフォー ド）を使用して実施した。２ｍｆｆの粗製レウテリン抽出物を、前述したように 、半調製用クロマトグラフィーにより精製し、そして凍結乾燥乾固した。１ｒ＋ ＪのＢＳＴＦＡを凍結乾燥したレウテリンに添加し、モしてシラン化反応を周囲 温度において実施した。試料を、白色沈澱が検出される゛まで、手で穏やかに５ 分間震盪した。ちょうど十分なＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ　 　５ｃｊｅｎｔｉｆｉｃ、ノースカロリナ州うレイ）を添加して、沈澱を溶解し た。次いで、試料を窒素でスパージし、ねじ付きバイアル中に密閉し、そしてガ スクロマトグラフィー−質量スペクトルにかけｔ；。

ヘラレット・パラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　　Ｐａｃｋａｒｄ）５９８５８ＧＣ ／ＭＳ　（Ｈｅｗｌ　ｅ　ｔ　ｔ　　Ｐａｃｋａ　ｒｄｓカリフォルニア州サン す２ウズ）、シリル化しウテリン誘導体についての研究において使用した。ＧＣ の条件はｌ−１ｍ２７分の流速および２８０℃の注入温度であった。分析に使用 したプログラムは、４０℃において３分の初期の保持期間から成り、ランプは６ ℃／分で２６０℃までであった。分離の実施に選択したカラムは、Ｊ＆Ｗ　　サ イアントフィック（Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ）（カリ７オルニア州７オルサム）から の１５Ｍ　　ＤＢＳ溶融シリカの毛管カラムであった。質量の範囲は４０〜４０ ０．２００℃のイオン源の温度、７０ｅＶの電子エネルギー、スプリットレス注 入（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ　　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）の電子衝撃イオン化および０ ゜８分のスプリット時間であった。

レウテリンはＧＣインゼクター内に存在する高い温度において不安定であること がわかった。安定なレウテリン誘導体は、周囲温度においてＢＳＴＦＡでシラン 化しｔ；とき産生された。誘導化試料のクロマトグラフィーは複雑なＧＣトレー スを生成した（データは示されていない）が、２９２　（１４８＋２つのトリメ チルシリル基）をもつ化合物が９〜１４分の保持時間ｌ：おいて見いだされた。

２つのピークは可能な異性体として同定されｔ：（１１，７および１３．３の保 持時間）。モノシリル化誘導体は９．３分の保持時間に発見され、そしてそのス ペクトルは第２４図に表されている。この化合物の断片化パターンは、、２０５ ．１７７．１６３．１４７．１３０および１１５Ｍ／Ｅ単位から成る。１つの７ ＭＳ基を含有するレウテリン分子（分子量−２２０）は、メチル基を失って２０ ５のＭ／Ｅ値を生成することができた。１４７における断片は、ＴＭＳ期間の損 失から来ることができたと想像されたが、１４７付近のＭ／Ｈの断片のパターン はケイ素、炭素、および酸素の天然のアイソトープの存在を示しｔ；。より正確 には、１４７　：１４８　：　ｌ　４９Ｍ／Ｅ単位の断片イオンの比は１００： １６＝９であり、正確にｍ成ＣＩ　Ｈｌ　＄　０８５＋の分子について予測され るであろうものであった。この断片は第２５図に示す構造を有するとして解釈さ れ、そして７ＭＳ基を失っｔ；レウテリン分子として解釈されなかった。誘導化 された分子の異性体のスペクトル中に存在するＭ／Ｅ　２１９および１９８にお ける強いシグナルは、１】、７および１３．３分において溶離する２つのＴＭＳ を含有する（データは示されていない）。Ｍ／ＥのデータならびにＮＭＲにより 決定した構造の細部を満足する断片の例示は、第２７図に表されている。

精製したレウテリンのＦＴＩＲおよびＬＣＭＳのデータ（第１６図および第１７ 図）に基づいて、レウテリンはヒドロキシルおよびアルデヒドの官能性を含有す る１４８の分子が与えられた。この推定はＮＭＲデータ（Ｄ、０中の試料）とよ く一致する。Ｃｉ　Ｈｌ　！　０４の分子式および第２０図に示す構造が提案さ れた。しかしながら、レウテリンのＮＭＲ研究をジュウテリン化メタノール中で 実施するとき、修正が必要であることが明瞭であった。この場合においてデータ は、分子が３つのみの炭素を有するか、あるいは軸のまわりで対称であることを 説明した（すなわち、２Ｘ３−６）。２つの可能な概要はこのデータを説明する ｔ；めに提案された（第２６図）。

概要Ａはアルデヒドとヒドロキシルとの間の第２へミアセタール結合の形成を必 要とするであろう。そのとき、最終の構造は８つの構成員の環として存在し、そ の半分の両者は対称であろう。この提案された構造は、レウテリンをジュウテリ ン化メタノール中で分析するとき、２０７ｐｐｍに存在する炭素のシグナルをよ く説明しない。この構造は、メタノール中でプロトンのスペクトルについて観測 されたスゲリットパターン、存在するプロトンの比例性（炭素上の水素の２：２ ：１）ｊ；よび化学シフトと合致する。ヘミアセタールは水の存在下に自由に開 きそして再び閉じ（時間にわｔ；って変旋光する糖に非常に類似する）そしであ る数の形態はレウテリン試料内にいずれの瞬間においても存在しうるであろう。

これはり、Ｏ中で観測される広いピークおよびシグナルの正確な解釈の欠乏に導 くことがある。

概要Ｂはより構造的に好適な６員の環を通して進行し、損失しｔ；水と結合し、 メタノール中で二環の環として存在するであろう。この分子は、また、メタノー ル中で観測されるＮＭＲスペクトルを説明するために必要な対称を有するであろ う。さらに、この構造は炭素−１３のスペクトルにおいて１０４　ｐ　ｐｍｒ： ８けるシグナルを与える炭素を含むであろう。

プロトンのスペクトル中に見いだされる化学シフトおよびスプリットパターン（ Ｄ、Ｏ中における実験）は提案された６員の環構造と合致し、そしてヘミアセタ ールの開環は前述のものに類似する場合、すなわち、複雑なスペクトルに導くレ ウテリンの多数の形態の存在を表すであろう。

Ｄ、Ｏ中で実施したレウテリンの実験のプロトンのスペクトルのそれ以上の精密 な検査（第１９図）は、概要Ｂ（第２６図）に好都合な情報を提供する。直鎖の 形態のレウテリンは、１．６．２．６．３．５．３゜７．５，０および９．５ｐ ｐｍの化学シフトに存在するシグナルを説明できるであろう。これらのシグナル の面積の比は、明らかに、分子中の水素原子の比（すなわち、炭素１〜６につい てｌ：２：２：：１：２：２）に等しくない。環状の形態がまた直鎖の形態と多 少平衡した濃度で存在する場合、環の炭素１８よび４上のプロトンは鎖の形態の 同一プロトンと非常に異なる環境中に存在するであろう。これはそれらのプロト ンについて新しい化学シフトを生ずる。炭素３．５８よび６上のプロトンの環境 はいずれの形態においても比較的一定であり、そしてシグナルは有意にシフトす ることは期待されない。期待されるように、炭素３、５および６上のプロトンか らのシグナルは広く、そして期待される積分の値からの有意の逸脱を示す。５ｐ ｐｍ付近の弱いシグナルのパターンの発生は、２つの酸素が結合した予測される 環炭素からのプロトンのために起こる。水溶液中にある間のレウテリンの２つの 形態の存在は観測されるプロトンのスペクトルを説明するが、２分子のβ−ヒド ロキシプロピオンアルデヒドへのレウテリンの不可逆的分解は、また、プロトン のスペクトルを説明する。

シラン化した試料から得られた質量スペクトルは、ＮＭＲの研究から得られたデ ータと一緒に考慮したとき、レウテリンの構造についての他のレベルの細部を提 供しｌ：。Ｍ／Ｅ　ｌ　４７に存在するシグナルは、概要Ａ８よびＢに示す構造 のいずれかから予測されうる断片を表す（第２６図）。しかしながら、Ｍ／Ｅ１ ７７において観測される断片は８員の環または直鎖の断片化において存在しない であろう。同様に、Ｍ／Ｅ　ｌ　６３におけるシグナルはこれらの分子について 予測されないであろう。Ｍ／Ｅ　１７７および１６３の断片は、６員環を親分子 として使用する場合、可能である。第２７ｒｇＪは、ＧＣＭＳ分析から生成され たデータと合致する、シラン化６員環の提案された断片化を詳細に示す。

すべての観測されｆ：、Ｍ／Ｅシグナルは、−Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−０−Ｔのテ イルの断片としであるいは６員環の断片として説明することができる。さらに、 断片Ｍ／Ｅ　ｌ　４７の断片はある数の異なる断片化から形成されることができ 、それらのいずれも３つの基本炭素、酸素、および−Ｏ−ＴＭＳを含有する。こ の点は重要である。なぜなら、Ｍ／Ｅ　１４７の断片からのシグナルはＧＣによ り分離された両者の予測された異性体（ならびにモノシリル化分子）のスペクト ルにおいて強く、両者の異性体が同一の基本環断片化を生ずる（すなわち、同様 な構造を有する）からである。

今日までに集められたデータに基づいて、最も起こり得るレウテリンの構造は第 ２８図に与えられものである。レウテリンが水溶液中に存在するとき、それは開 いた鎖ど平衡して存在しなくてはならなす（ＮＭＲ分析に基づく）、これに対し てそれがＢＳＲＦＡから誘導されるとき、それは環状の形態にもっばらロックさ れる（ＧＣＭＳの研究）。アセトン中のレウテリンの構造のプロトンＮＭＲの研 究は、レウテリンを水中に溶解するとき集めＩ；データと一致する（データはし めされていない）。

メタノールと水との５０１５０混金物中に溶解しＩ；レウテリンのそれ以上のＮ ＭＲ分析は、上に表したメタノールの結果に類似する結果を与えた。メタノール 中で優先する形態のそれ以上の分析は、二環の構造の理論を確証するために要求 される。さらに、レウテリンの有機合成（その構造は予測されるので）および引 き続く構造の分析はわれわれの構造の仮説を確証する唯一の絶対の方法である。

レウテリンの構造を明らかにしｔ；後の文献におけるサーチは、レウテリンと同 一の化学的成分を有する化合物がアクロレインの水利のとき酸性溶液中に存在し たことを明らかにした（２９）。また、それは名称４−ヒドロキシ−２−２゛− ヒドロキシエチル−Ｉ：３−ジオキサンを使用するβ−ヒドロキシプロバルデヒ ドの調製からの蒸留物として前に記載され？：（３０）。

４−ヒドロキシ−２−２゛−ヒドロキシエチル−１：３−ジオキサンをハル（Ｈ ａｌｌ）が記載するように（３０）われわれの実験室で合成しｔ；とさ、それは レウテリンと同一のＨＰＬＣピークで溶離され、そして生物学的に合成されたレ ウテリンと同一のＭＩＣ値を示した。したがって、第２７図に示す構造はレウテ リンのそれである。

β−ヒドロキシプロバルデヒド（また、３−ヒドロキシプロパナール、ヒドラク ラルデヒド、β−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプバンー１ −アールと呼ばれる）は溶媒または可塑剤の分野において大きい潜在的価値をも つ（Ｈａｌｌ、Ｒ，Ｈ，および５ｔｅｒｎ。

Ｅ、Ｓ−１Ｊｏｕｒｎａｌ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｙ％Ｊａｎ− Ｍａｒ、１９５０　　ｐｐ、４．９Ｏ−４９８）ｏ二量体のヒドロキシプロバル デヒド（すなわち、ｋウテリンまたは４−ヒドロキシ−２−２′−ヒドロキシエ チル−１：３−ジオキサン）および七ツマ−のヒドロキシプロバルデヒドは溶液 中で平衡している（Ｉ　ｂ　ｉ　ｄ）。したがって、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉによる グリセロールからのレウテリンの生物学的産生はモノマー（β−ヒドロキシプロ バルデヒド）ならびに二量体の形態のこの物質の新規な産生方法を構成する。

Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ−レウテリン系：腸の微生物集団の調節因子この系の発見は 、微生物の集団が動物の胃腸管内で調節される方法を記載する新規な概念的モデ ルに導いた。このモデルは第１２図に４つの部分で例示されている。相１におい て、腸のセグメントは集団のホメスタシスの状態で存在する仮説のバクテリア（ 種ＡおよびＢ）およびり。

ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｒ）を含有する。相２の間、異種微生物の集団の増加（この場 合において有機体Ａ）は住んでいるり、ｒｅｕｔｅｒｉ細胞により感知される（ 未知の細胞対細胞の接触の機構による）。相３において、グリセロール（または グリセルアルデヒド）の存在下に、多分膵臓および／または微生物の脂肪分解活 性を経て存在する、の存在下に、レウテリンは合成される。レウテリンのバクテ リアの作用は相４における腸内微生物の集団を減少し、モして相ｌの集団のホメ スタシスは回復する。このモデルが示唆するように、代謝レベルにおいてそのよ うに効果的に働くフィードバック調節の原理は、腸内集団のホメスタシスの維持 の！こめに細胞レベルで機能することができる。

与えられた実験のデータにより決定しかつフィードバックのモデルに照らして見 て、Ｌ、ｒｅｕｔｅｒｉ菌株１０６３はり、ｒｅｕｔｅｒｉ菌株に最もよく適し て、共生因子と機能して、ブタの腸の病気と緩和しかつ飼料の効率を増強する。

この結論は、次の事から誘導される：　（ｉ）菌株１０６３は高いレベルのレウ テリンを産生じ（第２図）そしてそれは他の菌株より異種剰激に対して感受性で あるという発見（表６）、（ｉｉ）菌株１０６３はブタの小腸から直接分離され 、したがってブタ宿主特異的菌株であるという事実、および（ｉ　ｉ　ｉ）菌株 １０６３は強い自己凝縮能力を有し、そして試験した他の菌株よりよくブタの上 皮細胞に付着するという観察。

発明を実施するための最良のモード レウテリンは相同法により得られ、ここでり、ｒｅｕｔｅｒｉ細胞はグルツース を有する乳酸杆菌馬担持培地中で３７℃において静置培養で増殖する。細胞を遠 心により収穫し、そして２５０ミリモルのグリセロール中に懸濁する。静置培養 において３７℃で６時間インキュベーションした後、細胞を遠心および濾過によ り除去する。次いで、レウテリン溶液を、レウテリン感受性微生物を含有する環 壇に添加して微生物を殺す。

工業上の応用 レウテリンは、寅験室において抗ウィルス、抗バクテリア、抗寄生生物および抗 菌・かびの使用のための用途を有する。さらに、レウテリンは食物製品に添加し て微生物の７０−ラを減少することができる。レウテリンは、また、動物の胃腸 管内の微生物の集団を減少するために供給することができる。ラクトバテルス・ レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞は、レウテリ ンの産生を誘導する条件下ににインキュページ層ンして抗バクテリア活性を増強 することができる。

表１．レウテリンはグリセロールまたはグリセルアルデヒドの存在下に産生され る 培地に添加し　　　　　　　　Ｌ、　ｒｅｕｔｅｒｉ　　Ｅ、　ｃｏｌｉ（ＣＦ Ｕ／ｍｆｆ）た代替物％　　　　　　　　　１０６３の添加　６時間後　　　　 　風！西グルコース　　　　　　　　　　　　−１，３Ｘ１０’　　　　　　０ 十　　　　　　　１．３×１０′ マンノース　　　　　　　　　　　−７，２Ｘ１０’　　　　　　０＋　　　　 　　９．０ＸｌＯ’ フルクトース　　　　　　　　　　　　−２，１ＸｌＯ’　　　　　　０＋　　 　　　　３．０ＸｌＯ’ マンニトール　　　　　　　　　　−２，３ＸｌＯ’　　　　　　０＋　　　　 　　２．７Ｘ１０’ ソルビトール　　　　　　　　　　−２，１ＸＩＯ’　　　　　　０＋　　　　 　　１．９ＸＩＯ’ グルコネート　　　　　　　　　　　−３−５ＸＩＯ’　　　　　　０十　　　 　　　　３．２ＸＩＯ’ キシロース　　　　　　　　　　　−６，７ＸＩＯ’　　　　　　０＋　　　　 　　６．９に１０’ リビトール　　　　　　　　　　　−５，７ＸｌＯ’　　　　　　０十　　　　 　　　４．９ＸＩＯ″ アラビトール−２，７Ｘ１０″　　　　０＋　　　　　　２．９Ｘ２０’ ジヒドロキシアセトン　　　　　　−３，４Ｘ］０’　　　　　　０＋　　　　 　４．１ｘｌＯ″ 表１．レウテリンはグリセロールまたはグリセルアルデヒドの存在下に産生され る（！き） β−グＬｌセｒ：ｙ−ルーＰ　　　　　　　−５，１ＸｌＯ’　　　　　　０＋ 　　　　　６．５Ｘ１０’ グリセロ−ルー　　　　　１．２Ｘ１０’　　　　　９９＋　　　　　　　　　 　５．５ＸｌＯ番グリセルアルデヒド　　　　　　　−２，８Ｘ１０’　　　　 　９９＋　　　　　３．２ＸｌＯ’ 表２．レウテリンは遠心による細胞の除去後培養液中で産生されるピルベート　 　　　　　　　　　　　　　　　　　４．ｌＸ１０’　　　　　　０ホスフエノ ールピルベート　　　　　　　　　３．７ＸｌＯ會　　　　　０ホスホグリセレ ート　　　　　　　　　　　　　３．３ＸｌＯ”　　　　　　０β−グリセロー ル−Ｐ　　　　　　　　　　　３．２ＸｌＯ’　　　　　０ジヒドロキシアセト ン−Ｐ　　　　　　　　　　３．７Ｘ１０’　　　　　　０グリセロール　　　 　　　　　　　　　　　４．５Ｘ１０″　　　　９９．９グリセルアルデヒド　 　　　　　　　　　　６．１ＸｌＯ″　　　　９８．９基質なし　　　　　　　 　　　　　　　　　　３．６Ｘ１０”　　　　　　０表３．異なる培養条件下の レウテリンの産生産生されたレウテリン単位 ｏ　　　　　　ｏｏｏｏｏ。

表４　、Ｌ、　ｒｅｕｔｅｒｉ　１０６３によるレウテリンの産生への培地およ びＬ五見の生存能力の効果 レウテリン単位 完全な培地　　　　　０　　　　６　　　　　４８　　　　　６グリセロールー 水　　０　　　６　　　　６　　　　２表５．変化する濃度におけるり、　ｒｅ ｕｔｅｒｉの３つの菌株によるレウテリン１．２Ｘ１０”　　　　　　　９６　 　−４．０ＸｌＯ”　　　　　　　４８　　−１．３Ｘ１０’　　　　　　　２ ４　　−４．４ＸｌＯ”　　　　　　　　４　　−２．０ＸＩＯ’　　　　　　 　　０　　９６　　　　４　　４８　　　　４８　　９６７．０Ｘ１０’　　　 　　　　　０　　４８　　　　２　　３２　　　　１６　　４８２．３ＸｌＯ’ 　　　　　　　　０　　３２　　　　０　　１６　　　　６　　３２７．６Ｘｌ Ｏ’　　　　　　　　０　　１２　　　　０　　６　　　　３　　１２２．５Ｘ ｌＯ”　　　　　　　　００　　　　００　　　　０１ヨン 表６．レウテリンに対する感度および種々のバクテリア種によるレウテン産生の 刺激 ■、ダラム陰性バクテリア： 表６．続き ■、ダラム陽性バクテリア： Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　　　　　　　　　　　Ｓ　　　　　 　　１２ｍ、酵母菌： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　　　　　　Ｓ　　　 　　　　１２ＶＳ−非常に感受性；　Ｓ−感受性 表７： レウテリンによるレボヌクレオチドレダクターゼのＢ１サブユニットの阻害およ びチオレドキシンの阻害 チオレドキシン　　　　　　　　　　　３４チオレドキシンレダクターゼ　　　 　＞ｓｏｏ。

表８＝ Ｎｕｓ　（ｍｇ／１００ｇ）　　　　　Ｌｏｇ　ＣＦＵバクテリアｇ対照　　　 　　１６４　　　　　　　９．５　　　　　＜５．０　　　＜４．０グリセロー ル　６４　　　　　　　９．４　　　　　５．５　　　５．１１０６８　　　　 　　３６　　　　　　　　８．４　　　　　　８．５　　　　８．６１０６３　 　　　　　２８　　　　　　　　６．７　　　　　　７．７　　　　７．８参考 文献 １、　Ｋａｎｄｌｅｒ、Ｏ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、　ＨＨ， 、１，Ａｂｔ、ｏｒｉｇ、　Ｃ１１、２６４−２６９（１９８０）。

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１８、７ａｌｏｎ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ、　Ｂ ａｋｔｅｒｉｏｌ、　Ａｂｔ、　Ｏｒｉｇ、　Ｂ１７０：１３３（１９８０）。

１９、　Ｇ１１ｌｉＪａｎｄ、　Ｓ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｆｏｏｄ 　Ｐｒｅｔｅｃｔｉｏｎ、　４０：８２０（１９７７）。

２０、　Ｔｒａｍｅｒ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２１１： ２０４（１９６６）。

２１、５ｈａｈａｎｉ、　Ｋ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕ１ｔ、　Ｄ凪ユＰ ｒｏｄ、　Ｊ、、　１２：８（１９７７）。

’ｌ’１．５ｈａｈａｎｉ、　Ｋ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕ１ｔ、　Ｄ１ 二ＰｒｏｄＪ、、旦：１４（１９７６）。

２３、　Ｒｅｄｄｙ、　Ｇ、Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ−Ｄａｉｒｙ　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　５４ニア＋８（１９７１）。

２４、　Ｈａｍｄａｎ、　１．Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、、ムＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓ、　２７：６３１（１９７４）。

２５゜Ｈａｍｄａｎ、　１．Ｙ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｕ１ｔ　Ｄａｉｒｙ　 Ｐｒｏｄ　Ｊ、、　１０：１０（１９７５）。

２６、　Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉｌｃｈｖｉｓｓｅ ｎｓｃｈａｆｔ、　３３：１４８（１９７８）。

２７、　Ｖｉｎｃｅｎｔ、　Ｊ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、、　７８：４７７（１９５９）。

２８、５ａｎｄｉｎｅ、　Ｗ、Ｅ、、　Ｊ、　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｅｔｅｃｔｉｏｎ 、　４２：２５９（１９７９）。

２９、　Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ａ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｏ１ｉｓｈ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　５５：１３９３i１ ９８１）。

３Ｑ−Ｈａｌｌ、　Ｒ，Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、ムＣｈｅｗ、　５ｏｃｉｅｔｙ、 　１９５０：４９０（１９５０）−時間 り、　ｒｅｕｔｅｒｉ　（ｕｇ／ｍｌ）時間 ＦＩＧ、２４ ｈ 口 １１！！ｇｌ　　優 １１表平２−５０３３８５　（２０） ＦＩＧ、　１９ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の７第１項） 平成１年１１月ｌ”ｌｉｉ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１４２３ ２、発明の名称 抗生物質レウテリン ３、特許出願人 インコーホレーテッド ４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正音の提出年月日 １９８８年９月１２日 ６、添付書類の目録 （１）補正音の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通補正した請求の範囲 １６、微生物をラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃ、ｉ　ｌ１ｕｓ　　 ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞により産生された抗生物質に暴露することからなる、微 生物の増殖を阻害する方法。

１７、ラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒ ｉ）ＡＴＣＣＮｏ、５３６０８　（Ｉｆ１株１０６３）の生物学的に純粋な菌株 。

１８、ウィルスをラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒ ｅｕｔｅｒｉ）の細胞により産生されｌ；抗生物質に暴露することからなる、ウ ィルスの産生を阻害する方法。

１９、動物にラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）の細胞の培養物を供給することからなる、動物の胃腸管内のラクトバチル ス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞の数を増 加し、そしてラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕ ｔｅｒｉ）の細胞による抗生物質の産生の条件を最適化する方法。

２０、さらにラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）の抗生物質の産生を促す物質を動物に与えることからなる、上記第１９” Ｊ記載の動物の胃腸管内のラクトバテルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕ ｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞の数を増加し、そしてラクトバテルス・レウテリ （Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）細胞による抗生物質の産生の 条件を最適化する方法。

２Ｌ７クトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕ　ｔ　ｅ 　ｒ　ｉ）の細胞により産生された抗生物質に、リボヌクレオチドリダクターゼ を暴露することからなる、リボヌクレオチドリダクターゼの活性およびリボヌク レオチドリダクターゼの活性に依存するＤＮＡの合成を阻害する方法。

２２、微生物を抗生物質に暴露することからなり、前記抗生物質は、元素の炭素 、水素および酸素を実質的に次のパーセントで含有し：炭素、４８．６５％、水 素、８．１１％、酸素４３．２４％：はぼ１４８ｇ１モルの分子量を有し：水溶 性であり、ｐＨ９，０において熱に対して非抵抗性であり、そしてプロテアーゼ およびヌクレアーゼに対して抵抗性であり；そして高性能液体クロマトグラフィ ーで１，３−プロパンジオールおよびグリセロールの間で水または０．０１モル のＨ，ＳＯ，による溶離特性を示す、ダラム陰性バクテリアおよびダラム陰性バ クテリアおよび真核有機体、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｊｓｉａｅ）ｊ；よびトリパノソマ・クルジ（Ｔｒｙ ｐａｎｏｓｏｍａ　　ｃｒｕｚｉ）の阻害において有効である、抗生物質および その誘導体からなる、微生物の増殖を阻害する方法。

２３、前記抗生物質は式Ｃ＠Ｈ１１０４を有し、前記抗生物質は実質的に純粋な 形態である、上記第２２項記載の微生物を抗生物質微生物に暴露することからな る微生物の増殖を阻害する方法。

２４、ウィルスを抗生物質に暴露することからなり、前記抗生物質は、元素の炭 素、水素および酸素を実質的に次のパーセントで含有し：炭素、４８．６５％、 水素、８．１１％、酸素４３．２４％；はぼ１４８ｇ１モルの分子量を有し；水 溶性であり、ｐＨ９，０において熱に対して非抵抗性であり、そしてプロテアー ゼおよびヌクレアーゼに対して抵抗性であり；そして高性能液体クロマトグラフ ィーで１．３−プロパンジオ−ルおよびグリセロールの間で水またはｏ、ｏｉモ ルのＨ２ＳＯ，にょる溶離特性を示す、ダラム陰性バクテリアおよびダラム陰性 バクテリアおよび真核有機体、サツカロミセス・セレビシアユ（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）８よびトリバノンマ・クルジ（Ｔｒｙ ｐａｎｏｓｏｍａ　　ｃｒｕｚｉ）の阻害において有効である、抗生物質および その誘導体からなる、ウィルスの産生を阻害する方法。

２５、前記抗生物質は弐Ｃ＊Ｈｒ＊Ｏａを有し、前記抗生物質は実質的に純粋な 形態である、上記第２４項記載のウィルスを抗生物質ウィルスに暴露することか らなるウィルスの産生を阻害する方法。

２６、微生物を抗生物質に暴露することからなり、前記抗生物質は、元素の炭素 、水素および酸素を実質的に次のパーセントで含有し二度素、４８．６５％、水 素、８．１１％、酸素４３．２４％；はぼ１４８ｇ１モルの分子量を有し；水溶 性であり％ＰＨ９，０において熱に対して非抵抗性であり、そしてプロテアーゼ およびヌクレアーゼに対して抵抗性であり；そして高性能液体クロマトグラフィ ーで１．３−プロパンジオールおよびグリセロールの間で水または０．０１モル の）Ｉ　ｘ　Ｓ　Ｏａにょる溶離特性を示す、ダラム陰性バクテリアおよびダラ ム陰性バクテリアおよび真核有機体、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍＦＣＩ！Ｓ　　（６ｒｅｖｉｓｉａｅ）およびトリバノソマ・クルジ （Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｒｎａ　　ｃｒｕｚｉ）の阻害において有効である、抗生 物質およびその誘導体からなる、食物中の微生物の増殖を阻害する方法。

２８、前記抗生物質は式Ｃ＠　Ｈｌ　！　０４を有し、前記抗生物質は実質的に 純粋な形態である、上記第２６項記載の微生物を抗生物質微生物に暴露すること からなる微生物の増殖を阻害する方法。

２８、上記第１４項記載の抗生物質からなる抗微生物食物防腐剤。

２９、微生物を抗生物質に暴露することにより微生物の増殖を動物において阻害 し、前記抗生物質は、元素の炭素、水素および酸素を実質的に次のパーセントで 含有し：炭素、４８．６５％、水素、８．１１％、酸素４３．２４％；はぼ１４ ８ｇ１モルの分子量を有し：水溶性であり、ｐＨ９，０において熱に対して非抵 抗性であり、そしてプロテアーゼおよびヌクレアーゼに対して抵抗性であり；そ して高性能液体クロマトグラフィーで１．３−プロパンジオールおよびグリセロ ールの間で水または０．０１モルのＨ２ＳＯ，による溶離特性を示す、ダラム陰 性バクテリアおよびダラム陰性バクテリアおよび真核有機体、サツカロミセス・ セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および トリパノラマ０クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　　ｃｒｕｚｉ）の阻害におい て有効である、抗生物質およびその誘導体からなる、微生物の増殖を阻害する方 法。

３０．４−ヒドロキシ−２−２′−ヒドロキシエチル−１：３−ジオキサンの産 生に好適な条件下に、ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　 　ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞を配置することからなる、４−ヒドロキシ−２−２′ −ヒドロキシエチル−１：３−ジオキサンを生物学的に合成する方法。

３１、β−ヒドロキシプロパルデヒドの産生に好適な条件下に、フタトバシルス ・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞を配置する ことからなる、β−ヒドロキシグロバルデヒドを生物学的に合成する方法。

国際調査報告 ＰＣＴ／Ｕ５ａｊノ０Ｌ４２３ ４　ｈｖｄｒｏｘｖ　ｄｉｏｘＪＩｎ ｒｉｂｏｎｕｃＬｅｏｔｉｄｅ　　ｒ会ａｕｅｔａｓ＊１３　ｄｉｏｘａｎｅ　 　−２−＠ｔｈａｎｏｌ　　４−ｈｖａｉｏｘｖＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　 　ｆｅｒｍｅｎｔｕ＋＋＋Ａｎｔｉｂａｃｔ龜ｒｉａＬ ｌ＃ｌ四′＄Ｉ＋１１１１１６＋ｔ＠Ｉ°−１・クー〒ＩＴ・ｑρ貴ｌ＾・！つ １ＰＣＴ／Ｌ！ＳｂＩ５１０１４２３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗生物質を産生することができるラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂ ｃｉ１１ｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞を前記抗生物質の産生に好適な件下に配置 することからなる、抗生物質を産生する方法。 ２、好適な条件はグリセロールの存在および酸素の圧力の減少（ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｘｙｇｅｎｔｅｎｓｉｏｎ）からなる、上記第１項記載の抗生物質を産生する 方法。 ３、グリセロールの濃度は２０〜５００ミリモルであり、そしてラクトバシルス ・レウテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞は静置培養において３７℃でインキュ ペーションする、上記第２項記載の抗生物質を産生する方法。 ４、好適な条件けグリセルアルデヒドの存在および酸素の圧力の減少からなる、 上記第１項記載の抗生物質を産生する方法。 ５、好適な条件は静置培養中の異種機生物の存在からなる、上記第２項記載の抗 生物質を産生する方法。 ６、グリセロール溶液中で抗生物質を産生することができるラクトバシルス・レ ウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の菌株の細胞を減少した酸 素の条件下に配置して、前記溶液に実質的な活性を付与し、そしてそのように産 生された抗生物質を実質的に純粋な形態で分離することからなる、抗生物質を産 生する方法。 ７、分離は、工程： （ａ）抗生活性を有する溶液の試料からラクトバシルス・レウテリ（Ｌ．ｒｅｕ ｔｅｒｉ）の細胞を分離し、（ｂ）高性能液体クロマトグラフィーを使用して試 料を分析し、（ｃ）試料を溶離し、そして （ｄ）１，３−プロパンジオールおよびグリセロールについての参照標準のピー クの間の中間のピークから溶離する物質を集める、からなる、上記第６項記載の 抗生物質を産生する方法。 ８、工程： （ａ）溶液の試料からラクトパシルス・レウテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞 を分離し、 （ｂ）高性能液体クロマトグラフィーを使用して試料を分析し、（ｃ）試料を溶 離し、そして （ｄ）１，３−プロパンジオールおよびグリセロールについての参照標準のピー クの間の溶離時間の中間のピークの存在を、屈折率の変化を監視することによっ て、決定する、 からなる、ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒ ｉ）の溶液中の抗生物質の存在を決定する方法。 ９、工程： （ａ）動物源からの微生物の懸濁液を固体の乳酸扞菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌ ｕｓ）の成長培地上に接種し、（ｂ）乳酸扞菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ） のコロニーの増殖を促進する条件下に、前記接種した成長培地をインキュペーシ ョンし、（ｃ）乳酸扞菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）のコロニーを複製し、 （ｄ）生きている試験微生物の懸濁液およびグリセロールおよびグリセルアルデ ヒドから成る群より選択される炭素源を含有する液化半固体の混合物を、前記接 種した成長培地にオーバーレイし、（ｅ）試験微生物の増殖苑を促進する条件下 に、前記オーバーレイした接種培地をインキュベーションし、そして（ｆ）乳酸 扞菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ）のコロニーを取り囲む増殖阻害のゾーンを 検出することによって、抗生物質を産生する乳酸扞菌属（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌ ｕｓ）のコロニーをその場で同定する、からなる、抗生物質を産生するものを同 定するための、ラクトバシルスレウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）の分離物をスクリーニングする方法。 １０、乳酸扞菌属の成長培地を、酢酸ナトリウムの添加および培地のｐＨの５． ５への調節により、乳酸扞菌属について高度に選択性とし、炭素源はグリセロー ルであり、そして生きている試験微生物けうクトバシルス・プランタルム（Ｌａ ｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）である、上記第９項記載の抗生物質 のラクトパシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉ１１ｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の分 離物をスクリーニングする方法。 １１、接種した成長培地のインキュペーションの条件は、酸素の圧力の減少にお ける４８時間の３７℃のインキュベーション温度からなる、上記第１０項記載の うクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の分離 物をスクリーニングする方法。 １２、元素の炭素、水素および酸素を実質的に次のパーセントで含有し：炭素、 ４８．６５％、水素、８．１１％、酸素４３．２４％；ほぼ１４８ｇ／モルの分 子量を有し；水溶性であり、ｐＨ９．０において熱に対して非抵抗性であり、そ してプロテアーゼおよびヌクレアーゼに対して抵抗性であり；そして高性能液体 クロマトグラフィーで１，３−プロバンジオールおよびグリセロールの間で水ま たは０．０１モルのＨ２ＳＯ４による溶離特性を示す、グラム陰性バクテリアお よびグラム陰性バクテリアおよび真核有機体、サッカロミセス・セレビシアエ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびトリバノソマ・クル ジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｚｉ）の阻害において有効である、抗生物質お よびその誘導体。 １３、実質的に純粋な形態である、上記第１２項記載の抗生物質。 １４、式Ｃ６Ｈ１２Ｏ４を有する、上記第１３項記載の抗生物質。 １５、式： ▲数式、化学式、表等があります の抗生物質。 １６、微生物をラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔ ｃｒｉ）の細胞により産生された抗生物質に暴露することからなる、微生物の増 殖を阻害する方法。 １７、ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ） ＡＴＣＣＮｏ．５３６０８（菌株１０６３）の生物学的に純粋な菌株。 １８、ウイルスをラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕ ｔｅｒｉ）の細胞により産生された抗生物質に暴露することからなる、ウイルス の産生を阻害する方法。 １９、動物にラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）の細胞の培養物を供給することからなる、動物の胃腸管内のラクトバシル ス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞の数を増加し 、そしてラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ ）の細胞による抗生物質の産生の条件を最適化する方法。 ２０、さらにラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）の抗生物質の産生を促す物質を動物に与えることからなる、上記第１９項 記載の動物の胃腸管内のラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞の数を増加し、そしてラクトバシルス・レウテリ（Ｌａ ｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）細胞による抗生物質の産生の条件を最適 化する方法。 ２１、ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ） の細胞により産生された抗生物質に、リポヌクレオチドリダクターゼを暴露する ことからなる、リポヌクレオチドリダクターゼの活性およびリポヌクレオチドリ ダクターゼの活性に依存するＤＮＡの合成を阻害する方法。 ２２、微生物を上記第１２項記載の抗生物質に暴露することからなる、微生物の 増殖を阻害する方法。 ２３、微生物を上記第１４項記載の抗生物質に暴露することからなる、微生物の 増殖を阻害する方法。 ２４、ウイルスを上記第１２項記載の抗生物質に暴露することからなる、ウイル スの増殖を阻害する方法。 ２５、ウイルスを上記第１４項記載の抗生物質に暴露することからなる、ウイル スの増殖を阻害する方法。 ２６、微生物の増殖を食物中で阻害する、上記第２２項記載の微生物の増殖を阻 害する方法。 ２７、上記第１２項記載の抗生物質からなる抗微生物食物防腐剤。 ２８、上記第１４項記載の抗生物質からなる抗微生物食物防腐剤。 ２９、微生物の増殖を動物中で阻害する、上記第２２項記載の微生物の増殖を阻 害する方法。 ３０、４−ヒドロキシ−２−２′−ヒドロキシエチル−１：３−ジオキサンの産 生に好適な条件下に、ラクトバシルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒ ｅｕｔｅｒｉ）の細胞を配置することからなる、４−ヒドロキシ−２−２′−ヒ ドロキシエチル−１：３−ジオキサンを生物学的に合成する方法。 ３１、β−ヒドロキシプロバルデヒドの産生に好適な条件下に、ラクトバシルス ・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）の細胞を配置すること からなる、β−ヒドロキシブロバルデヒドを生物学的に合成する方法。