DK174229B1 - Antibiotisk reuterin - Google Patents

Description

i DK 174229 B1

Oen foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum betegnet reuterin, fremgangsmåde til isolering og dyrkning af reuter i nproducerende stammer af Lactobacillus reuteri fra animalske kilder, samt fremgangsmåder til isolering og rens-5 ning af reuterin.

Lactobacillus reuteri, en fornylig navngivet art af Lactobacillus (nogle stammer af denne art blev tidligere identificeret som Lactobacillus fermentum (1, 2)) opholder sig symbio-10 tisk i mavetarmkanalen (GI) hos mennesker, svin og andre dyr.

Neotypestammen af L. reuteri er DSM 20016 (ATCC nr. 63609). Denne stamme og den fornyligt isolerede stamme 1063 (ATCC nr. 53606) er tilgængelige for offentligheden hos The American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA), idet den 15 er blevet deponeret der 17. april 1987. Fordøjelseskanalen hos dyr er et kompliceret økosystem, der rummer skønsmæssigt 300-500 mi kroorgan ismearter, der kollektivt er kendt som den indfødte mikrobiota. Til trods for over 100 års intensiv efterforskning inden for det tarmmi krobiologiske område, er der 20 stadig meget tilbage at lære om disse mikroorganismer, det komplicerede indbyrdes forhold, der eksisterer mellem de forskellige arter og naturen af de symbiotiske forhold, der eksisterer mellem mikrobiotaen og værten.

25 Under visse betingelser kan nogle medlemmer af den indfødte mikrobiota blive opportunistiske patogener, som forårsager forskellige enteriske sygdomme. Ofte opnår patogener imidlertid adgang til fordøjelseskanalen som forureninger i føde eller vand. Blandt de sidstnævnte kan nævnes et antal bakteri-30 er (f.eks. Eschericia coli, Salmonella-arter, Shigella-arter,

Yersina interocolitica, Vibrio cholera. Vibrio parahaemoly-ticus, Campylobacter jejuni og Clostridium difficile), vira (f.eks. roto-, astro- og cilicivira) og tarmparasitter (f.eks. arter af Giardia og Entamoeba). Akutte.og kroniske enteriske 35 sygdomme forårsaget af disse og andre mikroorganismer sker verden over og forårsager betydelige menneskelige lidelser og I tab af økonomisk vigtige dyr. Visse mikrobiel le aktiviteter DK 174229 B1 2 har også været forbundet med produktionen af mutagener inden i fordøjelseskanalen.

Det er også kendt, at den indfødte mikrobiota eksisterer i et 5 symbiotisk eller synergistisk forhold til deres vært og bidrager på mange positive (probiot i ske) måder til værtens generelle sundhed og velvære. Det er velkendt, at kimfrie dyr ikke er særligt sunde og har dårligt udviklede fordøjelseskanaler. I tilgift for det næringsrige og stabile økosystem, der er t i 1 -10 vejebragt for dem, giver den indfødte mikrobiota deres værter et udvalg af fordele indbefattet bl.a. (i) beskyttelse mod en-teriske patogener, {i i) stimulering af normal udvikling og funktion hos fordøjelseskanalens epitel-mucusal-system, (iv) produktion af forskellige vitaminer og andre næringsstoffer og 15 (v) genmetaboli ser ing af værtens rigeligt forekommende endo gene slimhindevæv.

For tiden er der meget lidt forståelse af, hvorledes sammensætningen og antallet af den indfødte mikrobiota reguleres.

20 Det ses, at disse reguleringer er konsekvensen af komplicerede indbyrdes indvirkninger mellem de talrige arter og involverer sådanne faktorer, som: redoxpotenti a 1e, overf1ade-pH, fedtsy rers i nhi berende virkninger, hydrogensulfid, dekonjugerede galdesalte og endnu uidentificerede inhiberende stoffer såvel 25 som sådanne faktorer, som konkurrence om begrænsede nærings stoffer og evnen hos mikrobiotaen til at forene sig med og klæbe til ep itel overf 1 aderne i fordøjelseskanalen.

Kort efter et dyrs fødsel er Eschericia coli og enteriske 30 streptokokker næsten universelt de første bakterier, der frem kommer i fordøjelseskanalen. Lactobaci 11 erne følger næsten altid med eller kommer umiddelbart efter i rækkefølge og bliver en bakteriegruppe, der findes dominerende i tarmene. Det ses, at de små tarmmikroorganismer, navnlig dem der hører til slæg-35 terne Lactobacillus og Streptococcus, har beskyttende virkning mod bakterielle og ikke-bakterielle patogener og fremmer sund vægtforøgelse hos dyr. Lactobaci 11 erne, der er blandt de mere DK 174229 B1 3 ernæringsmæssigt kræsne i den enteriske mikrobiota, antages at finde deres økologiske niche i de mere proksimale, næringsrige omrader snarere end i fordøjelseskanalens distale områder.

5 Det er blevet rapporteret ved talrige lejligheder, at lactoba-cillerne (3), der indbefatter et stort antal ikke-patogene, ugiftige bakterier, spiller en vigtig probiotisk rolle for helbredet og velværet hos mennesker og dyr. Arter af Lactobacillus sættes til menneskers og dyrs fødestoffer for at kon-10 servere dem, forøge deres smag og/eller til probiotiske formål, således at disse bakterier vil blive tilgængelige for fordøjelseskanalen. Stammer af Lactobacillus plantarum dyrkes f.eks. kommercielt i store mængder og anvendes som starterkulturer til kommerciel konservering af forskellige fødestoffer 15 til mennesker (kød, grøntsager og mejeriprodukter) og dyr (en silage). Stammer af Lactobacillus acidophilus dyrkes kommercielt i store mængder for at blive sat til fødevarer til mennesker (f.eks. mælk) eller til dyr (foder) som et middel til at indføre disse bakterier i fordøjelseskanalen for at opnå 20 probiotiske fordele. Rapporter om gunstige virkninger ved behandling med Lactobacillus er forøget i de senere år, hvor det er fundet at kostmæssig behandling med Lactobacillus (i) giver beskyttelse mod colonkræft til menneskepopulationer, der lever på vestlig kost (4), (i i) nedsætter forekomsten af eksperimen-25 talt fremkaldte store tarmtumorer hos rotter (5), (iii) redu cerer fæceskoncentrationen af bakterielle enzymer, der vides at katalysere omdannelsen af procarcinogener til proksimale carcinogener hos mennesker (6) og (iv) reducerer serumkole-steronniveauer hos svin (7).

30

De metaboliske slutprodukter af Lactobacillus-metabolisme. såsom eddikesyre, mælkesyre og hydrogenperoxid er velkendte for deres mikrobielle aktiviteter. To laboratorier har rapporteret, at de heterofermentati ve arter Lactobacillus brevis, 35 Lactobacillus buchneri (8) og Lactobacillus stamme 208-A (9, 10) metaboliserer glycerol anaerobt. Den sidstnævnte stamme gennemfører en anaerob dehydratisering (der involverer glyce- DK 174229 B1 4 roldehydratase) af 2 mol glycerol, hvilket giver 2 mol /3-hy-d roxyprop i ona 1 dehyd, som igen dismuteres til 1 mol β-hydro-xypropionsyre og 1 mol 1,3-propandiol , Nogle 1actobaci 11 er producerer også bakteriociner eller bakteriocin-lignende pro-5 teiner, der udviser bateriocid virkning mod andre medlemmer af arten eller nært beslægtede arter. Nogle ubekræftede rapporter er dukket op vedrørende lavmolekylære, ant imikrobie11e stoffer fremstillet af 1actobaci 11 er. Selv om deres eksistens har været forudsagt i nogen tid, er sådanne stoffer endnu ikke 10 blevet bekræftet eller isoleret.

Det følgende er en oversigt over det, der vides vedrørende anti mi krob i el 1 e aktiviteter forbundet med 1 actobaci11 er . I 1907 foreslog Metchniloff (11) at skadelige forrådnelsesbakterier, 15 der residerer i fordøjelseskanalen, blev inhiberet (eller an-tagoniseret) af syreudviklende 1actobaci 11 er. Siden da er forskellige sådanne antagonistiske virkninger forbundet med mælkesyr ebakter i er blevet rapporteret (12). Oftest er disse anti-mikrobielle aktiviteter blevet fundet at være forbundet med i 20 større mængde dannede slutprodukter af metabolismen, såsom mælkesyre, eddikesyre og hydrogenperoxid (13-18). Der er fremkommet andre rapporter vedrørende ant i mikrobiel1e aktiviteter forbundet med 1actobaci1 ler, men ikke forbundet med disse normale slutprodukter fra metabolismen. Gilliland og Speck (19) 25 rapporterede en bredspektret antagonisme, som varierede blandt forskellige afprøvede stammer af Lactobacillus acidophilus. Hydrogenperoxid var partielt ansvarlig for den inhiberende reaktion. Tramaer (20) viste at L. acidophi 1us-inhibering af E. coli skyldes mælkesyres kraftige germicide virkning ved lav 30 pH. Dannelsen af en yderligere inhibitor blev også antydet men ikke identificeret. Bredspektrede antagonistiske stoffer er også rapporteret af Shahani et al., Reddy og Shahani, og Hamdan og Mikolagcik (21-25). I hver af disse rapporter blev de antagonistiske stoffer fremstillet under vækst af Lactobacil-35 lus i 11¾ fedtfrie tørre mælketørstoffer og de var vanskelige at skelne fra mælkesyre og ses således at være fuldstændigt ubeslægtet med reuterin. Ved disse undersøgelser udførte Ham- DK 174229 B1 5 dan og Mikolagcik (24-25) den mest intensive oprensning og karakterisering af et stof, som de betegnede acidolin. De fandt, at det var en 1avmolekylær (ca. 200) forbindelse, fri for nitrogen, sur af natur, og yderst varmeresistent. De be-5 tingelser, hvorunder dette stof fremstilles og dets sure natur adskiller det klart fra reuterin. En oversigt over antagonistiske aktiviteter blandt yogurtkulturer (26) kunne ikke identificere andre inhiberende stoffer end mælkesyre i stammer af L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. helveticus og 10 L. lactis. En af de afprøvede stammer af L. bulgaricus er tidligere blevet rapporteret som fremkaldende et antibiotikum med betegnelsen bulgarican (23).

Et antal 1actobaci 1 ler vides at frembringe bakteriociner der 15 er proteiner, der udviser bakteriocide aktiviteter. De fleste bakteriociner eller bakteriocin-1ignende stoffer, der fremstilles af 1actobaci11 er, udviser en snævert afgrænset biologisk aktivitet. Vincent et al. (27) rapporterede imidlertid et bredspektret bakteriocin betegnet lactocidin som fremstilles 20 af et antal isolater af L. acidophilus. Der er ikke givet an dre rapporter om bredspektrede bakteriociner fremstillet af 1actobaci 11 er (12). Bacteriociner er polypeptider og deres inhiberende egenskaber ødelægges af proteaser. Reuterin er ikke et polypeptid og dets antimikrobielle aktivitet påvirkes ikke 25 af proteaser.

Ved siden af deres evne til at fremstille visse antibiotiske stoffer, har Sandine (28) foreslået et antal roller eller funktioner for 1 actobaci 1ler, som de udøver i menneskers (og 30 dyrs) tarmkanal. Disse indbefatter: produktion af organisk syre, sænkning af pH og oxidation-reduktion-potentiale, konkurrerende antagonister, galdedekonjugering og carcinogenun-dertrykkelse. Kostmæssig tilskud af 1actobaci1 ler bedømmes som gunstig ved at give sygdomsbehandling, forebyggende behandling 35 og som en kilde til nødvendige enzymer.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der biologisk rene stammer af L. reuteri. Under de kontrollerede dyrk- DK 174229 B1 6 ningsmetoder ifølge opfindelsen producerer disse stammer et nyt isoleret og karakteriseret bredspektret antimikrobielt stof med betegnelsen reuterin. Dette antibiotikum kan anvendes til at dræbe andre mikroorganismer under definerede be-5 tingelser under anvendelse af en mikroorganisme (L. reuter i), som er ikke-patogen for mennesker og andre dyr. Teknikken ifølge opfindelsen til isolering af reuter i nproducerende Lactobacillus reuter i-stammer kan også anvendes til at isolere stammer fra mennesker og landbrugsmæssigt vigtige dyr, således 10 at disse isolerede stammer kan anvendes som probiotiske midler til det specifikke dyr, hvorfra de er isoleret. Således har L. reuteri 1063, der er isoleret fra svin, potentiel anvendelse som et probiotisk middel til moderering af colibacil-losis hos svin og diarresygdom hos grise, der netop er vænnet 15 fra, samt til forøgelse af fodereffektiviten hos svin. I sam menligning med et antal andre homo- og heterofermentative lac-tobaciller isoleret direkte fra svins tyndtarm og også i sammenligning med L. reuter i-stammerne 20016 og 27273, som er blevet holdt som stamkulturer i lange perioder, udviser L.

20 reuteri 1063 kraftig auto-agglutination og høj grad af over fladehydrofob i c i tet og binder bedre end andre stammer til svi-neepitelceller i kultur. Der tilvejebringes også en fremgangsmåde til fremstilling af reuterin og en metode til isolering af reuter i nproducerende stammer af L. reuteri fra fordøjelses-25 kanalen (eller afføring) fra alle dyr, der rummer denne art.

Produktion af store mængder af et naturligt forekommende bredspektret antibiotikum, som det der tilvejebringes med den foreliggende opfindelse, gør det muligt at anvende dette antibiotikum til behandling af forskellige sygdomme, og som et an-30 timikrobielt middel til almene formål.

Kort beskrivelse af tegningen.

Fig. 1 viser produktionen af reuterin under aerobe (rystning) 35 og semi-anaerobe (stillestående kultur) betingelser i et gly cerol medi um.

DK 174229 B1 7

Fig. 2 viser effekten af koncentrationen af L. reuteri (pg/ml tørvægt) på reuterinproduktion efter semi-anaerob inkubering af to stammer af L. reuteri med E. coli i et glycerolmedium.

5 Fig. 3 viser temperaturens effekt på reuter i nprodukt i on.

Fig. 4 viser effekten af dyrkningsmediets pH-værdi på reuterinproduktion .

10 Fig. 5 viser produktionen af reuterin og tegn på bakteriocid akt i vi tet.

Fig. 6 viser resultaterne fra analyser ved højtydende væskekromatografi (HPLC) af L. reuter i-prøver.

15

Fig. 7 viser positiv-ion-massespektret for reuterin.

Fig. 8 viser negativ-ion-massespektret for reuterin.

20 Fig. 9 viser det infrarøde spektrum for reuterin.

Fig. 10 viser carbon-NMR-spektret for reuterin.

Fig. 11 viser proton-NMR-spektret for reuterin.

25

Fig. 12 viser modellen af L, reuterin-reuterin-systemet.

Fig. 13A viser procenten af kolonidannende enheder (CFU'er) og plakdannende enheder (PFU'er) ved hvert reuterinniveau, når 30 reuterin sættes til fag-inficerede bakteriekulturer og fig.

13B viser det faktiske antal af CFU'er og PFU'er.

Fig. 14 viser effekten af reuterin på hakket oksekøds mikroflora .

Fig. 15 viser effekten af reuterin på E. coli-podet hakket oksekøds mikroflora.

35 8 DK 174229 B1

Fig. 16 viser infrarød Four i ertransformer ingsana1yse af reute-r i n.

Fig. 17 viser den væskekromatografiske/massespektrometri ske 5 analyse af reuterin.

Fig. 18 viser carbon-13-spektret for reuterin i deuteriumoxid. Fig. 19 viser protonspektret for reuterin i deuteriumoxid.

10

Fig. 20 viser den foreslåede struktur, der giver anledning til de på fig. 18 og 19 viste spektre.

Fig. 21 viser carbon-13-spektret for reuterin i deutereret me-15 thanol.

Fig. 22 viser proton-spektret for reuterin i deutereret metha nol .

20 Fig. 23 viser den foreslåede struktur, der giver anledning til de på fig. 21 og 22 viste spektre.

Fig. 24 viser massepektret for et tri methy1 s i 1y1 der ivatet af reuter i n.

25

Fig. 25 viser en foreslået struktur for fragmentet af M/E 147.

Fig. 26 viser foreslåede skemaer for reuter i ns struktur.

30 Fig. 27 viser fragmenter, der opfylder M/E-data og NMR-struk- turer.

Fig. 28 viser den foreslåede struktur af reuterin som det eksisterer i vandi g opløsning.

Beskrivelse af de foretrukne udførelsesformer og eksempler på de foretrukne udførelsesformer.

35 s DK 174229 B1 9

Isolering af antibiotikaproducerende stammer. Værtsspecifikke Lactobacillus reuteri stammer kan isoleres fra en dyrekilde, såsom fordøjelseskanalen eller afføring fra dyr, der rummer den pågældende art ved metoderne ifølge opfindelsen. L. reute-5 ri vokser bedst under anaerobe betingelser, men vil vokse ae-robt. Suspensioner fra fordøjelseskanalen eller afføring udspredes på agarplader med et medium, der er velegnet for vækst af Lactobacillus og agarpladerne inkuberes under betingelser, som vil fremme væskt af Lactobaci 11us-kolonier. Ved en fore-10 trukket udførelsesform ses der veludviklede kolonier på overfladen af agarplader med Lactobacillus Selection Medium (LBS) efter 48 timers anaerbob vækst (reduceret oxygenspænding) ved 37®C. LBS-medium indeholder (g/1): trypticase, 10; gæreks trakt, 5; KH2PO4, 61; ammoniumcitrat, 2; natriumacetat (trihy-15 drat) 34; MgS04, (heptahydrat), 1,2; MnS04 (monohydrat), 0,13;

FeS04, (heptahydrat), 0,06. pH-værdien indstilles til 5,5 med koncentreret HCL; agar (15 g) tilsættes. Glucose (10 g) tilsættes efter sterilisering af mediet. Der kan anvendes andre Lactobaci1 lus-vækstmedier. Ved en foretrukken udførelsesform 20 bliver LBS-pladerne overlagt med 10 ml 1% flydendegjort agar indeholdende 0,50 M glycerol og et podemateriale af Lactobacillus plantarum. For at sikre isolering af de respektive reuter i nproducerende kolonier fremstilles der enten replikatpla-der af alle voksende Lactobaci1 lus-kolonier på de indlednings-25 vis anvendte LBS-plader, før yderligere afprøvning under an vendelse af LBS-medium eller et andet Lactobaci11us-vækstme-dium, eller Lactobaci1 lus-cel ler overføres ved hjælp af en anden teknik fra hver af kolonierne på LBS-pladerne til et vækstmedium før tilsætning af overlaget (replikationsprocedu-30 re). Efter at overlaget er størknet bliver pladerne igen in kuberet ved 37"C i anaerobe krukker eller beholdere i 48 timer. Zoner med vækstinhibering af den podede L. plantarum iagttages omkring de kolonier, som producerer antibiotiket reuterin under disse betingelser.

Identifikationen af stammer af L. reuteri bekræftes under anvendelse af mikrobiologiske standardprøver og de taksonomiske 35 DK 174229 B1 10 egenskaber af arten. L. reuteri er en heterofermentativ art, der danner gas fra glucose og gluconat og acetat/ethanol fra glucose. Ved API 50 CH fermenter ingsprøven (Analytab Products, Sherwood Medical Co., New Brunsvick, NJ, USA) udviser en posi-5 tiv reaktion med ribose, arabinose, glucose, galactose, lactose, saccharose, melibiose og maltose (nogle stammer fermenterer også xylose). Arten har en mol% af guanin plus cyto-sin på 39-41, lysin er den mureine diaminosyre og arten vokser ved 4 5 ® C men ikke ved 15eC. Stammer med 80% eller højere 0NA-10 DNA-homolog i med neotypestammen DSM 20016 kan findes i fordø jelseskanalen hos dyr.

Under anvendelse af metoderne ifølge opfindelsen er Lactobacillus reuteri stamme 1063 blevet isoleret fra svinefordøje 1 -15 seskanalen, og det er vist (omtalt nedenfor) at det er i stand til at producere betydeligt højere koncentrationer af reuterin end de øvrige afprøvede stammer. Stammen 1063 og stammen DSM 20016 er blevet deponeret hos The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, under derespektive ATCC-20 numre 53608 og 53609 (deponeret 17. april 1987).

Trækkene og fordelene ved den foreliggende opfindelse vil blive forstået tydeligere ved henvisning til de følgende eksempler, der dog ikke udgør nogen begrænsning af opfindelsen.

25

Eksempel 1

Dyrkningsbetingelser ved fremstilling og påvisning af reuterin. Når celler af Lactobacillus reuteri, som er i stand til 30 at producere reuterin, anbringes under bestemte gunstige be- t i ngelser fremstilles der reuterin. Et antal bestemmelser er blevet udviklet til påvisning og kvantitativ bestemmelse af reuterin. En standardmetode til bestemmelse af den mindste inhiberende koncentration (MIC) blev tilpasset for at påvise 35 reuterin og for at belyse faktorer, der påvirker produktionen deraf. E. coli K12 anvendes som den følsomme prøvemikroorganisme og bestemmelsen gennemføres på følgende måde. Natten DK 174229 B1 11 over dyrkede kulturer af E. coli, høstes, vaskes to gange med steril 0,05 natriumphosphatpuffer {pH 7,5), suspenderes i denne puffer og indstilles til 60¾ transmission (A420 nm) under anvendelse af et Spectronic 70 instrument. Denne suspension 5 fortyndes 1:100 og portioner på 0,1 ml anvendes til podning af 1,0 ml af MIC-bestemmelsesmediet, der indeholder (g/1): vitaminfrit kaseinhydrolysat, 3; ammoniumcitrat, 1,9; citronsyre, 0,63; KH2PO4, 12,6; MgS04 (heptahydrat), 0,2; pH indstillet til 7,0 og 20 mM glucose tilsat efter sterilisering. Sterile 10 portioner på 1,0 ml af prøver, der skal afprøves for reuterin-aktivitet, sættes til 1,0 ml af dette podede MlC-bestemmelses-medium og blandes grundigt til opnåelse af en 1:2-fortynding. Sådanne fortyndinger fortsættes i serie efter behov. Oisse kulturer inkuberes derefter i 24 timer ved 37*C og undersøges 15 for vækst. Relative reuterinkoncentrationer (enheder af reu-terin) beregnes derefter som det reciprokke af den prøvefortynding, der går forud for den fortynding, der tillader synlig vækst af indikatorcellerne. Der er også udviklet en anden bestemmelse vedrørende MIC-værdier til reuterintophøjder bestemt 20 ved HPLC-analyser (beskrevet nedenfor).

Under betingelserne for metoden ifølge opfindelsen producerer L. reuteri det antimikrobielle stof ifølge opfindelsen som betegnes reuterin. Et antal heterofermentati ve og homofermenta-25 tive Lactobaci11us-stammer er blevet afprøvet for reuterin-produktion og ingen, bortset fra L. reuteri, producerer reuterin.

Oe betingelser, hvorunder reuterin produceres, er blevet be-30 stemt. Reuterin produceres ikke under aerobe betingelser (at mosfærisk oxygenkoncentration) men under reduceret oxygenspænding. Det produceres, når l. reuteri dyrkes anaerobt (eller semi-anaerobt i stillestående kultur), i MIC-bestemmelsemediet beskrevet ovenfor indeholdende 20-500 mM glycerol eller gly-35 ceraldehyd i stedet for glucose som hovedkilde for carbon og energi. Fig. 1 viser produktion af reuterin under aerobe betingelser (kurve 1) og semi-anaerobe betingelser (kurve 2) i DK 174229 B1 12 dette g 1ycerolmed ium. L. reuteri vokser ikke under disse betingelser, men producerer alligevel reuterin. 20 andre stoffer, indbefattet hexoser, hexitoler, pentoser, pentitoler, disacchari der og forskellige phosphorylerede og ikke-phospho-5 rylerede C3~stoffer afprøvedes for deres evne til at under støtte reuter i nproduktion. Tabel 1 viser resultaterne fra nogle af disse prøver. Mediet, der indeholder et substrat i koncentrationer på 20 mM (Cg- og C5~substrater) eller 40 mM (C3~substrater) podedes med 5 x 10® ko 1 on i dannende enheder 10 (CFU) pr. ml E. coli med og uden L. reuteri. Kun glycerol og g 1ycera1dehyd gav reuterin. Det vil sige, at reuter i nproduktionen fra glycerol inhiberes, når glucose eller et andet vækstsubstrat er inkluderet i produktionsmediet. Resultaterne vist i tabel 2 viser den procentuelle inhibering i levedygtigt 15 antal af 6,7 x 10? CFU pr. ml E. coli podemateriale af oven stående fraktioner af L. reuteri dyrket i forskellige angivne substrater ved koncentrationer på 40 mM.

Reuterin kan fremstilles på to måder. Den ene metode betegnes 20 som den "homologe metode" og den anden betegnes den "heterolo ge metode". Ved den homologe metode anvendes L. reuteri celler inkuberet i en stillestående kultur ved 37®C i en 250 mM glycerolopløsning. F.eks. kan 1 1 L. reuteri celler dyrkes i 24-48 timer ved 37eC i Lactobacillus Carrying Medium (LCM).

25 LCM indeholder (g/1): trypticase, 10; gærekstrakt, 5; trypto-

se, 3; KH2PO4, 3; ammon iumcitrat, 1,5; natri umacetat, 1,0; salte (som ved LBS) cystein-HCl, 0,2; og Tween 80, 1 ml. pH

indstilles til 7,0. Glucose (20 mM s 1 utkoncentrat i on) tilsættes efter sterilisering. Cellerne høstes ved centrifugering, 30 suspenderes i 10 ml 250 mM glycerol opl øsn i ng, inkuberes i 6 timer ved 37®C i stillestående kultur og fjernes derefter ved centrifugering. Reuterin er til stede i den ovenstående fraktion. Denne fremgangsmåde og dens meget nærliggende variationer (f.eks. ændrede cellekoncentrationer og inkuberingstider) 35 giver en simpel og effektiv metode til fremstilling af reute rin.

DK 174229 B1 13

Den heterologe metode indebærer co-dyrkning af L. reuteri sammen med visse andre (heterologe) reuterinstimulerende mikroorganismer. Ved denne metode suspenderes f.eks. lavere koncentrationer L. reuteri (f.eks. 20-300 pg celletørvægt pr. ml) i 5 et glycerolholdigt dyrkningsmedium (som beskrevet ovenfor) sammen med celler af levedygtige heterologe mikroorganismer (f.eks. E. coli K12) og inkuberes som beskrevet ovenfor. Ved et forhold mellem de levedygtige celler (CFU E. coli pr. ml/ CF L. reuteri pr. ml) på 0,5 eller derover, produceres reute-10 rin med en stimuleret hastighed (i forhold til fravær af den heterologe mikroorganisme) og produktionsgraden pr. L. reuteri biomasseenhed stiger i direkte forhold til biomassen af den heterologe mikrooganisme. Denne opdagelse af den rolle som heterologe mikroorganismer spiller ved reuter i nsyntese var en 15 nøgle til udviklingen af den "tilbageføringsregulerings"-mo- del der beskrives nedenfor. Denne "heterologe" cellestimulering ses at kræve celle-ti 1-celle-kontakt mellem levedygtige celler, fordi denne stimulering ikke forekommer, når de to arter er adskilt fra hinanden med en dialysemembran i et 20 ellers identisk co-dyrkningsystem (tabel 3). Den mulighed, at den heterologe art er involveret i det mindste delvis til at sænke redoxpotenti al et i mikromiljøet omkring L. reuteri, og at den derved stimulerer reuterinproduktionen, har ikke kunnet udelukkes som et bidrag til denne stimulerende effekt. Reute-25 ri nprodukt i on stimuleres ikke, hvis den heterologe E. coli ikke er levedygtig (tabel 4) eller hvis L. reuteri ikke er levedygtig. Reuterinproduktion ved den heterologe metode afhænger ikke af evnen hos den stimulerende organisme til at me-tabolisere glycerol. Mutanter af E. coli som er ude af stand 30 til at metabolisere glycerol stimulerer reuterinproduktion lige så effektivt som viIdtypeceller.

Reuterin produceres under de fysiologiske betingelser der forekommer i levende dyr. Reuterinproduktionen (under anvendelse 35 af den heterologe metode) er i starten hurtig og proportional med biomassen af L. reuteri (fig. 2), men derefter falder produktionshastigheden pr. biomasseenhed, sandsynligvis på grund DK 174229 B1 14 af en nedsættelse af forholdet af levedygtige celler (E. coli/ L. reuteri) og/eller L. reuter i-cel lers følsomhed over for den højere koncentration af reuterin, som produceres under disse betingelser. Det ses også på fig. 2 at l. reuteri stamme 1063 5 (X) producerer større mængder reuterin ved den heterologe metode i sammenligning med neotype stamme 20016 (0). Reuterin- resistente mutanter af L. reuteri kan producere endnu højere koncentrationer af reuterin. Reuter i nprodukt i on sker ved maksimale hastigheder ved temperaturer mellem 25 og 37°C. Fig. 3 10 viser i nkuber ingstemperaturens effekt på reuterinproduktion under semi-anaerob inkubering af L. reuteri i et glycerolmedium ved 4, 25, 37 og 45*0. Reuterin produceres i pH-området 5 til 9 med optimal produktion ved pH 6-8. Fig. 4 viser effekten af dyrkningsmediets pH-værdi på reuterinproduktion under 15 semi-anaerob inkubering af L. reuteri med E. coli i et glyce rolmedium i 3 timer (kurve 3) og 24 timer (kurve 4). Alle de tre til dato afprøvede stammer af L. reuteri producere reuterin. Neotypen, DSM 20016, ATCC 27273 (tidligere klassificeret som L. fermentum) og den nyligt isolerede stamme 1063. Alle 20 tre stammer producerer reuterin ved den homologe metode (tabel 5). Reuter i nprodukt ionen ved den heterologe metode varierer blandt disse stammer på følgende måde. Produktionen stimuleres henholdsvis i høj grad, moderat og kun lidt af den heterologe mikroorganisme for stammerne henholdsvis 1063, 27273 og 20016.

25

Eksempel II

Egenskaber ved antibiotikumet. Reuterinproduktion sker i fravær af pH-ændring i dyrkni ngsmed i et og i nærværelse af exogent 30 tilsat katalase. Dets anti mikrobie11e aktivitet er derfor ikke forbundet med velkendte slutprodukter af mælkesyrefermenteringer såsom mælkesyre og eddikesyre eller hydrogenperoxid eller med andre sure stoffer, der er fundet af andre (24, 25). Reuterin forbliver i dyrkningsvæsken efter fjernelse af cel-35 lerne ved centrifugering eller filtrering. Reuterin kan ad skilles fra dyrkningsmediet og oprenses ved HPLC under anvendelse af vand (deioniseret) eller 10 mM H2SO4 som opløsnings- DK 174229 B1 15 middel systemer og C-18 fastfase-kolonner. Reuterin og andre tilstedeværende produkter detekteres under HPLC under anvendelse af et detektorsystem, der bestemmer refraktionsindex (RI). En Ri-top som udviser MIC-aktivitet elueres med dette 5 system mellem glycerol og 1,3-propandiol. Når der anvendes (ensartet mærket) 14C-glycerol i det reuterinproducerende system, udvindes reuterinet ved HPLC som l4C-mærket, hvilket viser, at dette stof (i det mindste delvis) er et vandopløseligt derivat af glycerol.

10

Eksempel III

Anti mikrobiel aktivitet. Reuterin er et bredspektret antimi-krobielt middel. Reuterin fungerer som et bakteriocid. Pro-15 duktion af reuterin og tegn på dets kraftige bakteriocide aktivitet er begge tydeligt demonstreret af de på fig. 5 opsum-merede resultater. De angivne koncentrationer (CFU pr. ral) af E. coli (fuldt optrukne linier) og L. reuteri 1063 (stiplede linier) podedes (tid nul) i det ovenfor beskrevne glycerolka-20 seinhydrolysatmedium (0), det samme medium minus citrat (·) det samme medium minus glycerol (X). Co-kulturerne inkuberedes semi-anaerobt (stillestående kulturer) ved 37°C med prøver udtaget med de angivne mellemrum for at bestemme antallet (CFU pr. ml) af E. coli og L. reuteri der er til stede. Det kan ses 25 fra disse resultater, at når glycerol var til stede fremstil ledes et stof i løbet af de første 3-4 timer, som resulterer i en 7-8 log nedsættelse af levedygtige E. coli-celler i løbet af de næste få timer. Alle de hidtil afprøvede bakterieslægter (Eschericia, Shigella, Salmonella, Proteus og Pseudomonas) og 30 aller afprøvede grampositive slægter (Staphylococcus, Strepto coccus, Clostridium, Bacillus, Leuconostoc og Lactobacillus) er følsomme over for reuterin. Der behøves imidlertid noget højere koncentrationer af reuterin for at dræbe repræsentanter for de sidstnævnte tre slægter. En lavere eukaryot, gæren Sac-35 charomyces cerevisiae, dræbes også af reuterin. Disse opdagel ser er opsummeret i tabel 6. I denne tabel vises også evnen hos forskellige afprøvede arter til at stimulere reuterinpro- DK 174229 B1 16 duktion ved den heterologe metode. Det bemærkes også at L. reuteri selv er følsom over for reuterin, hvis den udsættes for koncentrationer på 32 MIC-enheder eller derover. Der haves også resultater, der viser at reuterin (ved en siutkoncentra-5 tion på ca. 20 ΜIC-enheder/m1) inhiberer væksten in vitro af den protozoparasit, som forårsager Chaga's sygdom, Trypanosoma cruzi. Mens kontro 1 ku 11urer udviser normal vækst og adfærd taber reuter i nbehandlede celler motiliteten og evnen til at dele sig, og de udviser morfologisk oprunding (eng.: round-10 ing-up), hvilket viser tab af levedygtighed.

Eksempel IV

Antiviral aktivitet. Reuterin er også effektiv til forhindring 15 af virusreplikation. Fig. 13 viser resultaterne fra forsøg, hvor 0 til 50 enheder pr. ml reuterin blev sat til voksende bakterieceller af Escherichia coli eller Lactobacillus plan-tarum inficeret med bakterievira (henholdsvis λ fag eller fag 8014-B2). Det ses i de indledende resultater med l^C-mærket 20 glycerol, at 4 μg reuterin i 0,5 ml opløsning er ca. ækviva lenten for 1 reuter i nenhed. Efter fire timer blev antallet af ko 1 on i dannende enheder (CFU) af værtscelle og antallet af plakdannende enheder (PFU) af viraene bestemt under anvendelse af mi krobi olog i ske standardmetoder. Uden tilsat reuterin 25 var antallet af mikrobielle celler forøget ca. 100 gange i en periode på 4 timer. Med E. coli forårsagede tilsætningen af 10 enheder reuterin en ca. 100-foldig nedsættes i antallet af celler og mere end 1000-foldig nedsættelse af antallet af PFU af λ fag sammen 1ignet med den reuter i nfrie kontrolkultur efter 30 inkubering i 4 timer. Skønt faldet af CFU og PFU for Lactoba cillus på grund af reuterin var mindre betydelig og behøvede højere reuterinkoncentrationer end med E. coli, blev der iagttaget tilsvarende mønstre med endnu større fald i PFU end for CFU ved reuter i nmængder på eller over 25 enheder. Disse resul-35 tater viser, at reuterin er effektiv til inhibering af virus- produktion, og denne effektivitet er større end og ud over re-uterins effekt på bakterieværtscellerne.

DK 174229 B1 17

Eksempel V

Probiotisk aktivitet. Når Lactobacillus reuteri indfødes til svin er den stand til at kolonisere deres mavetarmkanal. Ved 5 indledningsvise forsøg blev celler af L. reuteri 1063 i koncentrat i oner liggende fra 10® til 1010 CFU pr. dyr inkluderet i kosten til nyfødte smågrise og der blev udvundet levedygtige celler af L. reuteri 1063 fra disse dyrs afføring. Disse indpodninger af L. reuteri havde ingen skadelig virkning på dyre-10 ne.

Forsøg under anvendelse af enten voksne svin, smågrise (mindre end 5 dage gamle) eller gnotobiote (kimfrie) smågrise blev udført, hvor store mangder (ca. 109 celler) celler af L. reute-15 ri stamme 1063 blev indfødet til dyrene. Efter 5-7 dage kunne der stadig udvi ndes t i 1 strække 1igt med L. reuteri celler fra dyrenes fæces, hvilket viser at L. reuteri overlevede passagen gennem fordøjelseskanalen og forblev længe nok i dyret til at vise, at der var sket kolonisering, og at der kan fremstilles 20 reuterin. Produktion af reuterin af L. reuteri stamme 1063 kunne forventes i fordøjelseskanalens miljø, idet denne kanal er det miljø, hvorfra stammen af L. reuteri oprindeligt blev isoleret. Visse med iebestandde1e eller andre stoffer, såsom glycerol, som er ledende for reuterinproduktion af L. reuteri 25 kan sættes til dyrefoderet for at optimere betingelserne for reuterinproduktion i fordøjelseskanalen. Stammer af Lactobacillus reuteri isoleret fra forskellige dyrearter indbefattet fugle (betegnelsen "dyr" indbefatter naturligvis mennesker og fugle) kan indfødes i en mængde til den dyreart, hvorfra stam-30 merne blev isoleret, eller til andre dyrearter end den, hvor fra de blev isoleret.

Eksempel VI

35 Inhiberinq af ribonukleotid-reduktase. Reuterin inhiberer ri- bonukleotid-reduktase, det første trin i syntesen af desoxy-ribonukleinsyre (DNA). I naturen er der kun en reaktionsvej DK 174229 B1 18 for desoxyribonukleotid-syntese, nemlig den direkte reduktion af de tilsvarende ribonukleoti der. Desoxyribonukleoti der er højspec i a 1 i serede metabolitter og tjener kun som bygningsblokke for DNA. Det enzym, som katalyserer reduktionen af ribonu-5 kleotider til desoxyribonuk1eotider er ribonuk1eotid-redukta- se. Denne reduktion er det første nødvendige trin ved DNA-syntese og spiller derfor en essentiel rolle ved vækst og multiplikation af prokaryote og eukaryote celler og vira.

10 Bevis for at reuter in inhiberer ri bonukleot i d-reduktase (EC

1.17.4)-aktivitet blev opnået under anvendelse af den metode, der er beskrevet af Thelander, Sjoberg og Eriksson i Methods in Enzytnology (bind LI), side 227-237, 1978. Rensede underen- heder Bl og B2 af enzymet kodet af generne nrdA og nrdB blev 15 anvendt og den spektrofotometri ske bestemmelse blev anvendt som beskrevet af de ovennævnte forfattere. I korte træk er denne procedure som følger: enzymet inkuberedes ved 25°C i en reaktionsblanding indeholdende 200 nmo 1 ATP, 1,6 pmol MgCl2, 80 nmol NaDPPH, 5 pmol N-2-hydroxyethy1-piperazin-N'-2-esthan- . 20 sul fonsyre-puffer (pH 7,6), 330 pmol thioredoxin, 40 pmol thi- oredoxinreduktase, 10 nmol EDTA og 65 nmol dithiothreitol i et slutrumfang på 0,13 ml. Reaktionen startedes ved tilsætning af 75 nmol CDP og oxidationen af NADPH blev overvåget ved 340 nm med et Zeiss automatisk registrerende spektrofotometer forsy-25 net med mikrokyvetter. Før tilsætning af CDP registreredes baggrundsoxidationen af NADPH og denne baggrund blev trukket fra den iagttagede NADPH-οχ i dati on efter tilsætning af CDP.

Det ved disse prøver anvendte reuterin var fremstillet ved den 30 homologe metode og indeholdt 256 MIC-enheder aktivitet pr. ml.

Ufortyndet og forskellige fortyndinger af reuterin blev sat (i portioner på 1 μΐ) til reaktionsblandingen for at bestemme effekten af dette stof på ribonukleotidreduktase-aktiviteten. Resultaterne fra dette forsøg er opsummeret i tabel 7. De 35 viser, at reuterin er en effektiv inhibitor for dette enzyms underenhed Bl. Det bemærkedes også, at thioredoxin (der behøves til enzymakt i vi tet) også var følsom over for reuterin.

DK 174229 B1 19

Reuterins evne til at inhibere væskt af bakterier, gærarter, skimmelsvampe, protozoer, vira og neoplastiske og normale dyreceller kan således i det mindste delvis tilskrives dets evne til at inhibere ONA-syntese ved at inhibere produktionen de 5 novo af desoxyribonukleotider.

Eksempel VII

Reuterin er et effektiv fødevarekonserverinosmiddel. Hakket 10 oksekød købt fra et lokalt supermarked blev delt i 4 portioner. 1 portion var ubehandlet, de øvrige blev behandlet med 10, 50 og 100 enheder reuterin pr. g kød. Alle prøver blev opbevaret ved 4°C med prøver udtaget på de angivne dage til bakteriologisk analyse.

15

Oksekødsprøver blev udtaget og fortyndet 1:10 (1 g oksekød: 9 ml sterilt vand). Efterfølgende decimalfortyndinger blev foretaget efter behov og prøver blev udstrøget på Difco næringsagar. Disse prøver blev inkuberet ved 27*C i 24 timer og talt 20 som kolonidannende enheder pr. g hakket oksekød (CFU/g). Resultaterne viser at reuterin i signifikant omfang reducerede CFU/g (fig. 14) (dj , kontrol; ψ , 10 enheder reuterin;« 50 enheder reuterin; og O 100 enheder reuterin). Med de højere koncentrationer af reuterin (50 og 100 enheder pr. g) blev den 25 i forvejen tilstedeværende population af bakterier reduceret og forblev mere end 4 log enheder lavere end kontrolprøven gennem prøveperioden på 6 dage.

Hakket oksekød købt i et lokalt supermarked blev helt igennem 30 podet og blandet med ca. 105 CFU/ml celler af E. coli K12. Efter blandingen deltes materialet i 2 portioner. Den ene portion var en ubehandlet kontrol (ingen reuterin), den anden portion modtog 75 enheder (U) reuterin pr. g oksekød. Prøverne opbevaredes ved 4°C med udtagning af portioner på de angivne 35 tidspunkter til bakteriologisk analyse. Ved dette forsøg gennemførtes bestemmelsen af levedygtige celler (CFU/g oksekød) som beskrevet for fig. 14 bortset fra, at der anvendtes Difco DK 174229 B1 20

McConkey's agar (forholdsvis specifik for col iformlignende bakterier). Det ses på fig. 15 (Q, kontrol; + , 75 enheder reuterin) at reuterin reducerede den i indledningen værende population af bakterier og holdt disses antal lavt over hele 5 i nkuber ingsperi oden på 9 dage.

Eksempel VIII

Lactobacillus reuteri plus glycerol giver en ny effektiv føde-10 midde1 konserver ingsproces. Bevis for dette blev opnået ved an vendelse af lagring af fisk som et modelsystem. Denne undersøgelse gennemførtes på følgende måde: fiskefileter (sild, Clu-pea harengas) dyppedes i følgende behandlingsopløsning: 15 Kontrol: ingen behandling glycerol: 250 mM giycerolopløsning stamme 1068: 250 mM g 1ycero1 op 1øsning indeholdende 4 x 109 CFU pr. ml L. reuteri 1068 (en ikke-reuterinfremstillende stamme) 20 stamme 1063: 250 mM g 1ycero 1 op 1øsning indeholdende 4 x 109 CFU pr. ml L. reuteri 1063.

Fileterne (2 paral 1 el prøver hver) blev holdt i store petriskåle ved 8*0 i 4 dage i et køleskab. Ammoniakindholdet og CFU 25 for relevante bakterier (dvs. ødelæggende pseudomonader og tilsatte lactobaciller) analyseredes for at bedømme levnedsmiddelproduktets lagerlevetid. Resultaterne, som er opsummeret i tabel 8, viser: 30 (i) CFU for de tilsatte lactobaciller (talt som det samlede antal lactobaciller under anvendelse af det tidligere beskrevne glycoseholdige Lactobacillus Selection Medium) og for L. reuteri (talt som samlede heterofermentati ve lactobaciller på-35 vist under anvendelse af L-arabinoseholdigt Lac tobacillus Selection Medium) overlever udmærket ved 8eC men multi pi i kerer ikke i noget signifikant omfang.

DK 174229 B1 21 N.

(i i) l. reuteri 1063 retarderede signifikant væksten af de ødelæggende pseudomonader. L. reuteri 1068 gjorde lige sådan i et vist omfang, men ikke tilstrækkeligt til at forhindre ødelæggelse, hvilket S generelt indikeres ved et log 8,4 pseudomonade- i ndhold.

(iii) den retarderende effekt af L. reuteri og glycerol på ødelæggende bakterier har en kraftigt reduce-10 rende effekt på ammoniakfrigørelse.

(iv) der er indikeret en fødevarekonserverende effekt af L. reuteri plus glycerol for alle typer af fødevareøde lægge Ise.

15

Eksempel IX

Reuterin er et produkt af glvcerolferroenterinq. Reuterin er et nyt produkt forbundet med den samme type af heterolaktisk fer-20 mentering af glycerol, som sker hos andre arter af Lactobacil lus. Reuterin kan isoleres og identificeres som et produkt af glycerolfermentering ved hjælp af L. reuteri under anvendelse af HPLC. Glycerol, 1,3-propandiol og Ø-hydroxypropionsyre (alle i form af rene kommercielle præparater) viste sig at 25 være i det væsentlige fri for antimikrobiel aktivitet, når de blev afprøvet i koncentrationer så høje som 0,125 M.

Produktionen ved hjælp af L. reuteri af reuterin plus 1,3-propandiol og /5-hydroxypropionsyre under fermenteringen af 30 glycerol blev fastslået under anvendelse af HPLC-analyse. Re præsentative data er vist på fig. 6. Til fremstilling af prøven høstes 1 1 kultur af L. reuteri (dyrket i LCM indholdende 20 mM glycose ved 37°C i 48 timer) ved centrifugering, der vaskedes to gange med steril natriumphosphatpuffer (pH 7,5) 35 og suspenderedes i 10 ml 0,25 M sterilt glycerol. Efter 6 ti mers inkubering ved 37*c fjernedes cellerne ved centrifugering og den ovenstående væske (i det følgende betegnet som prøven) DK 174229 B1 22 analyseredes for reuterin ved den tidliger beskrevne MIC-prøve og ved HPLC som beskrevet nedenfor. Ved nogle forsøg inkluderedes der 5 μϋυπ’β 14C (U)-g 1 ycero 1 med de 0,25 M glycerol. Prøverne førtes genmem et 0,2 til 0,45 μπ> bakteriologisk f i 1 -5 ter og opbevaredes aseptisk ved 2°C før indsprøjtning i HPLC- apparatet.

HPLC-analysen gennemførtes på følgende måde. En 20-100 μΐ fraktion af hver prøve indsprøjtedes i et 8eckman HPLC-apparat 10 forsynet med en enkelt eller to tandemana1ysekolonner af C-18.

Prøverne elueredes med desti 11eret-de i on i seret vand, ført gennem et 0,2 til 0,45 pm filter. E1ueringshastigheden var 1,0 til 1,5 ml pr. minut, og prøverne blev overvåget under anvendelse af et Waters 410 different i a 1refrakt ometer. Ændringer i 15 refrakt i ons index (RI) blev automatisk registreret og afbildet som RI (ordinat) mod elueringsrumfang/tid (abscisse) forløbende fra højre mod venstre på de viste kurver. Den samlede elu-eringstid for hver prøve var ca. 15 minutter med toppe 1, 2, og 3 eluerende ved henholdsvis ca. 8, 7 og 6 minutter.

20 HPLC-analyseprøver fremstillet som beskrevet ovenfor og elue-ret med vand er vist på fig. 6A - 6E, Indbefattet her er prøver fremstillet under anvendelse af L. reuteri 1063 ved 128 og 512 MIC-enheder (kurverne henholdsvis 6A og 6B), L. reuteri 25 20016 (kurve 6C) og L. reuteri ATCC 27273 (kurve 6D og 6 H) -

Kun de stoffer, der er betegnet som top 1, 2 og 3, blev identificeret ved disse elueringer. Top 1 og 3 blev identificeret som henholdsvis 1,3-propandiol og glycerol ved anvendelse af referencestandarder og ved IR-spektra 1 i dentifikati on af de re-30 spektive isolerede toppe. Under disse betingelser elueres top 2 altid som den karakteristiske brede top, der ses på disse kurver, og det er det eneste stof, der elueres fra prøver, der har biologisk aktivitet under anvendelse af MIC-bestemmelsen.

Den identificeres således som det antimikrobielle stof med be-35 tegneisen reuterin. Tre yderligere analyser underbygger den konklusion at top 2 er reuterin. For det første stiger mængden af det materiale, der er til stede i top 2 direkte proportio- DK 174229 B1 23 nalt med MIC-værdien hos den oprindelige prøve. Dette ses på kurve 6A og 6B, som repræsenterer reuterin fremstillet af L. reuteri 1063 i prøver, der har MIC-titere på henholdsvis 128 og 512. For det andet producerer alle de hidtil afprøvede 5 stammer af L. reuteri reuterin bestemt ved MlC-bestemmelse, og i hvert tilfældet er top 2 til stede (se kurverne 6A-6E). Alle de andre til dato afprøvede arter af Lactobacillus mangler sammenlignelig biologisk aktivitet (MIC-bestemmelse) og når de analyseres ved HPLC udviser de lidt eller intet materiale, som 10 eluerer i området for top 2. For det tredje er der isoleret og oprenset en spontan variant eller mutant af L. reuteri ATCC 27273. Denne variant producerer betydeligt lavere niveauer af reuterin (bestemt ved MIC-bestemmelsen), udviser svage eller ingen inhibererende zoner ved glycerol-E. coli-overlagsplade-15 bestemmelsen, og som det ses på kurve 6E frembringer den betydeligt mindre af det stof, der eluerer i området for top 2 sammenlignet med dets moderstamme (vildtype) (kurve 6D).

Når der anvendtes 0.01M H2SO4 som elueringsopløsningsmiddel 20 blev en β-hydroxypropionsyretop opspaltet som vist på fig. 6F.

Den ved dette forsøg anvendte prøve var opnået fra stamme 1063 og havde 1024 MIC-enheder reuterin. Når 14C(U)-glycerol var inkluderet ved et i det væsentlige identisk forsøg separeret med HPLC under anvendelse af 0,01M H2SO4 som opløsningsmiddel 25 og opsamlet som separate toppe til radioaktivitetsbestemmel ser (Packard Liquid Scintillation Spectrometer) blev der opnået følgende resultater: henholdsvis 25.777; 40.776; 53.228 og 61.428 totalt cpm blev udvundet som henholdsvis /3-hydroxy-propionsyre (top 4), 1,3-propandiol (top 1) reuterin (top 2) 30 og ubrugt glycerol (top 3). Disse resultater og analytiske data for reuterin vist nedenfor viser, at glycerol fermenteres under disse betingelser i overensstemmel se med følgende reaktion: 35 5 glycerol --> 2 1,3-propandiol + 1 β-hydroxypropionsyre + 1 reuterin DK 174229 B1

Eksempel X

24

Indledende karakterisering af reuter in. Karakteriseringer af reuter in i rå præparater viste at det er i høj grad op 1 øse-5 ligt i vand, resistent over for nukleaser og proteaser og føl somt for varme (100°C i 10 minutter) navnlig ved pH-værdier på 9,0 eller derover. Reuterin er tydeligt ikke et bakteriocin. Indledningsvise analyser er gennemført på i det væsentlige rent reuterin (med noget glycerol til stede) isoleret med HPLC 10 som beskrevet ovenfor. Prøver blev givet til The Research Triangle Institute (Research Triangle Park, NC) og the Department of Chemistry (N. C. State University, Raleigh, NC) til analyse af massespektre, kernemagnetisk resonanspekter og infrarødt spekter. Disse resultater er opsummeret på fig. 7-11. LCMS-15 analyser gennemførtes på et Finnigan 4500 HPLC/MS-system under anvendelse af en Vestec Interface. Separation blev gennemført under anvendelse af en Aminex 87H kolonne med en eluerings-strømningshastighed på 0,8 ml/minut. Massespektre både for positiv ion (fig. 7) og negativ ion (fig. 8) (relativ intensi-20 tet afbildet på ordinatsaksen, masse til energi 1adning, m/e- værdi på abscisseaksen) viste en molekylvægt på ca. 162 g/mol. Denne foreløbige oplysning sammen med (i) de ovenfor beskrevne rad ioisotopana1yser og (i i) den iagttagelse at reuterin giver en positiv Schiffsk reaktion (viser tilstedeværelse af en 25 funktionel aldehydgruppe) viser at reuterin har en molekylfor- mel på CgHiøOs og følgende struktur;

»HH 0H H

30 Nil III/ c-c-c-o-c-c-c /11 1 \

H0 ·0Η Η Η H

— 0 — ...

Den infrarøde spektralanalyse vist på fig. 9, carbon-kernemagnetisk resonans (NMR)-spektralanalysen vist på fig. 10, og 250 35 DK 174229 B1 25 MHz-proton-NMR-analysen vist på fig. 11 er i overensstemmelse med denne foreslåede struktur for reuterin. Oisse NMR-spek-traldata er computerberegnede afbildninger af strålingsabsorption (ordinatakse) mod magnefeltstrækning (abscisseakse). Op-5 lysning om den nøjagtige struktur blev opnået, da store mængder af absolut rent reuterin blev tilgængeligt.

Baseret på den carbohydrat1ignende struktur hos reuterin postuleret ud fra de indledningsvise resultater indbefattet et 10 aldehydcarbonatom i den ene ende af molekylet og et alkoholatom i den anden ende indikeredes eksistensen af dette stof som et hemiacetal svarende til reaktionsproduktet mellem aldehydgruppen og den terminale hydroxyIgruppe. Den tredimensionale molekylmodel for en sådan struktur viste et molekyle der har 15 stor lighed med en pentose såsom 0-ribose.

På basis af dette blev det postuleret, at reuterin kunne være en D-riboseanalog, der er i stand til at konkurrere med ribo-nukleotider om deres ribose-genkendelsessted (steder) på det 20 første enzym, der specifikt er involveret i DNA-syntese, ri bon ukleot i d-redukt ase . Reuter i n kunne således i nh ibere det første trin specifikt for DNA-syntese ved at inhibere omdannelsen af ribonukleotider til desoxynuk1eoti der. Hvis reuterin var en pentoseana1 og og bundet til et reduktasested, vil-25 le det forventes, at den ville binde med præference i hurtigt voksende maligne celler såsom kræftceller. Disse udsagn er i overensstemmelse med (i) den foreslåede struktur for reuterin, {i i) den hastighed, hvormed reuterin udøver sin bakteriocide effekt (forsøgsresultater viser inhibering af vækst af E. coli 30 kort tid efter tilsætningen af reuterin) og (iii) den kends gerning, at både prokaryoter og eukaryoter (S. cerevisiae og Trypanosoma cruzi) er følsomme over for reuterin. Reuterin kunne således betragtes som værende et antifungalt, antipara-sitisk, antiviralt og anticarci nogent middel, såvel som et 35 antibakterielt middel.

Eksempel XI

DK 174229 B1 26

Fremstilling af renset reuterin til kemisk analyse. Et 1¾ podemateriale af en natten over dyrket kultur af Lactobacillus 5 reuteri 1063 (1) dyrkedes i modificeret Lactobacillus Carrying

Medium med glucose (LCMG) i 24 timer. Det modificerede LCMG består af følgende pr. liter opløsning: 5 g gærekstrakt, 10 g trypticase, 3 g tryptose, 3 g ka1 iumphosphat (monobasisk), 3 g kaliumphosphat (dibasisk), 2 g ammoniumcitrat, 1,15 g natrium-10 acetat,3H2O, 5 mg magnesiumsulfat,7H20, 0,31 mg mangansulfat, 0,2 mg ferrosul fat,7H2O, og 0,5 mg L-ascorbi nsyre. Dette medium blev derefter autklaveret og der sattes 10 ml filtersteriliseret 2M glucose til det afkølede medium. Celler af L. reuteri høstedes ved centrifugering ved 4000 x g i 10 minutter og 15 vaskedes to gange med 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,5).

Efter vask suspenderes L. reuteri til en koncentration på 10 mg celler/ml deioniseret vand. Sterilt glycerol tilsattes indtil en koncentration på 250 mM var opnået. Denne cellesuspen-20 sion blev derefter inkuberet ved 37“C i 3 timer for at produ cere og akkumulere reuterin. Cellerne blev derefter bundfældet ved 4000 x g i 10 minutter og kastet bort. Den ovenstående væske filtreredes gennem et 0,45 pm filter (Acrodisc) for at fjerne tilbageværende celler og anvendtes derefter til isole-25 r i ng af reuter i n.

Oprensning af reuterin gennemførtes under anvendelse af en 1 x 30 cm glaskolonne pakket med Ag 50 W, 8% tværbundet, -400 mesh harpiks fra Biorad (Richmond, California, USA). Et opløsnings-30 middel sammensat af 60% acetonitri 1/40% destilleret deionise ret vand indeholdende 1,1 g trif1uoreddikesyre pr. liter blev leveret gennem en Beckman 110 A HPLC-pumpe. Opløsningsmidlets strømningshastighed var 1,5 ml/minut og detektering blev udført med et Waters 410 differenti al refraktometer under an-35 vendelse af en følsomhed på 2 x og en skalafaktor på 5. 400 μΐ ovenstående væske blev indsprøjtet under anvendelse af Altex 210 injektor (Beckman) med en 500 μΐ prøvesløjfe og fraktioner DK 174229 B1 27 blev opsamlet manuelt. Fraktioner blev derpå rotationsinddampet under udsugning ved stuetemperatur for at fjerne acetoni-tril. Prøver blev derefter lyofiliseret til tørhed under anvendelse af en Virtis 10-030 lyofi 1 isator. Renheden blev fast-5 slået ved at føre portioner af fraktionerne gennem en Aminex 87H analysekolonne (Biorad).

Oe første to fraktioner elueredes fra kolonnen ved 15 og 19 minutter, og reuterin viste sig at være til stede i den første 10 top. Den anden fraktion havde en elueringstid på ca. 19 minutter. Den forreste portion af den reuterinholdige fraktion indeholdt en tung skulder, som blev bestemt til at være ø-hydro-xypropionsyre og blev derfor ikke opsamlet. Middelportionen af reuterintoppen opsamledes og tørredes ved rotationsinddampning 15 efterfulgt af lyofi 1isering. Denne proces gav en vandklar, viskos væske, som, da den genkromatograferedes under analytiske betingelser under anvendelse af en Aminex 87H kolonne, gav en enkelt top, som co-elueredes med aktivitetstoppen. Den op-samlede fraktion indeholdt også bakteriocid aktivitet bestemt 20 ved MIC-bestemmelse. Ingen af de øvrige opsamlede fraktioner udviste bakteriocid aktivitet. Den rensede fraktion underkastedes også analyse for tilstedeværelse af proteiner under anvendelse af Bio-Rad-proteinbestemmelsen (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Tilstedeværelsen af protein kunne ikke påvises.

25

Eksempel XII

Infrarød Fouriertransformationsanalvse af renset reuterin. Reuterin underkastedes infrarød Four i ertransformat ionsanalyse 30 (FTIR) for at bestemme de kemiske grupper, der er til stede i molekylet. Prøverne analyseredes på en Perkin Elmer 1550 FTIR med en Perkin Elmer 7500 data station. De opnåede resultater er vist på fig. 16. Det ses, at molekylet indeholdt hydroxyl-funktional itet ved infrarød tilstedeværelse af et stort C-0 35 strækningsbånd ved 1050-1150 cm"1 og et bredt 0-H strækningsbånd ved 3450 cm"1. En C=D strækning, der viser aldehyder, blev iagttaget ved 1730 cm-1. Typiske al kan C-H strækn i nger var til stede ved 2880 og 1380 cm"1.

Ekeseropel XIII

DK 174229 B1 28 Væskekromatoqrafi/massespektrometri. Analyse af det rensede reuterin ved LC-separation blev gennemført på en Ami nex 87H 5 analysekolonne (Biorad, Richmond, California, USA) med en strømningshastighed på 0,8 ml/minut af 65% destilleret deio-niseret vand og 35% acetonitril indeholdende 1,0 g koncentreret svovlsyre pr. 1. Opløsningsmiddelstrømmen blandedes med 0,3 M ammoniumacetat efter kolonnen og indførtes via en Vestec 10 interface (Vestec, Houston, Texas, USA) i et Finnigan 4500 HPLC/MS-system (Finnegan, San Jose, California, USA). Detek-tion af positiv ion anvendtes med en fordamper temperat ur på 210°C og en kildetemperatur på 250°C. Kildens elektronenergi var 1000 eV.

15 LC/MS-ana 1yser gennemførtes på reuterin ved efter kolonnen at tilsætte ammoniumacetat. Grundtoppe forekom ved 166 M/E-enhe-der, som vist med resultaterne vist på fig. 17. Denne ion blev fortolket som værende ammoniumadduktet af den molekylære ion.

20 Dette ville indikere en molekylvægt på 148, hvilket svarer til molekyl vægten for reuterin. Signalet ved 148 blev forudsagt som værende et tab af vand fra adduktionen, og signalet ved 130 repræsenterede adduktionen med tab af 2 molekyler vand. Signalet der er til stede ved 101 blev antaget som værende fra 25 baggrundsopløsningsmiddeleffekter.

Eksempel XIV

Kernemaqneti sk resonansspektroskop i af renset reuterin. Pro-30 ton- og carbon-NMR-undersøgelser gennemførtes både i deuteri umoxid og i deutereret methanol fra Aldrich (Milwaukee, Wis, USA). Protron-NMR blev kørt på en Bruker WM 250 FTNMR (Bruker) betjent ved 250 MHz. Carbon 13-spektre blev genereret på en IBM NR-100 AF FTNMR (IBM Instruments, San Jose, California, 35 USA) betjent ved 25 MHz med en superledende magnet. Databe arbejdning gennemførtes på en Aspect 3000. Ved NMR-undersøgel-serne i deuteriumoxid havde carbon-13-NMR-spektre 6 signaler DK 174229 B1 29 for kemiske forskydninger pd 40,1; 46,3; 56,2; 58,7; 89,7; og 207,7 ppm. Signalet ved 207,7 ppm blev fortolket som et alde-hydisk carbon, dem ved 89, 58 og 56 ppm som oxygenbundet, og dem ved 46 og 40 ppm som alifatiske dele.

5

Carbon- og proton-spektrene er vist på fig. 18 og 19. Afkop-ling såvel som signalopslitningsmønstre førte til det indledende forslag til strukturen vist på fig. 20. Protonsignalet ved 9,5 ppm (carbon 1) viste sig at være påvirket, da signa-10 let ved 2,6 ppm (carbon 2) blev mættet. Protoner forbundet med carbon 2 spalter til det, der ses at være en triplet, men ved tæt undersøgelse sås det faktisk som en sekstet (triplet splittet af ikke-ækvivalent proton på carbon 1). Koplingsmønstre for protoner på carbon 2 viste sig at være ændret ved 15 mætning af signaler ved 9,5 og 3,7 ppm (carboner 1 og 3) og forudsås derfor som eksisterende naboliggende til de to car-bonatomer 1 og 3. Spaltningsmønstre for signalet ved 3,7 ppm (carbon 3) er en triplet og var påvirket af mætning af signalet ved 2,6 ppm. Disse mønstre passer til den forudsagte 20 struktur foreslået for carbonatomerne 1, 2 og 3 som CH0-CH2- ch2-o-r.

Protonsignalet ved 5,0 ppm (carbon 4) sås som en triplet og var kun påvirket af mætning af signalet ved 1,6 ppm. Mætning 25 af signaler ved 5,0 og 3,5 ppm førte til ændr i nger i spalt ningsmønstrene ved 1,6 ppm (carbon 5). Protonerne på carbon 5 har et kompliceret spaltningsmønster som blev fastslået som en kvartet. Protoner der giver anledning til tripletten ved 3,5 ppm (carbon 6) blev kun påvirket ved mætning af signalet ved 30 1,6 ppm (carbon 6). Signalmønstre og kemiske forskydningsdata for denne halvdel af reuterin førte til forudsigelse af strukturen R-O-CHOH-CH2-CH2OH forbundet med carbonatomerne 4, 5 og 6. Hemiacetaloxygenatomet, der er til stede i midten af molekylet (fig. 20), ville forhindre kopling af de to halvdele, 35 som det observeredes. Protonkemiske forskydninger af den for udsagte struktur passer med dem for kendte værdier.

DK 174229 B1 30

Bredden af signalerne ved 1,7; 3,6; og 5,0 ppm forhindrede beregning af arealet under hver top, der anvendes til bestemmelse af antallet af protoner som giver anledning til hvert signal. Sådanne bredder kan være resultatet af beslægtede eller 5 forbigående former af molekylet, som eksisterer i ligevægt, når der anvendes vand som opløsningsmiddel.

Signa1 mønstrene for reuterin i deutereret methanol var tydeligt forskelligt fra det, der blev iagttaget fra deuteriumo-10 xid. Carbon-13-mønsteret indeholdt kun tre sæt signaler ved 36,8; 58,9; og 103,9 ppm. Carbon-13-signaler omkring 104 ppm har været iagttaget i disacchari der såsom lactose for det nedenfor viste carbonatom

15 - OH

C CH,0H

»Ο-f S f "ί\ / o-SxW" 20 0H H0~£ OH C O" 25 Protonspektrene bestemt i deutereret methanol indeholdt også tre sæt signaler, som fremkom omkring 1,8; 3,6; og 4,5 ppm med et forhold mellem toparealerne på henholdsvis 2:2:1. Carbon- 13- og proton-spektrene er vist på henholdsvis f i g. 21 og 22.

Et hydrogenforhold på 2:2:1 blev antydet på grund af de rela-30 tive toparealer i protonspektrene. Protonsignalet til stede ved 1,8 ppm eksisterer som en kvartet, og koplingsstudier viser dets tilstedeværelse som naboliggende til carbonatomer-ne, der indeholder protoner, som giver signaler, der forekommer ved 3,6 og 4,5 ppm. Signaler fundet ved 3,6 og 4,5 ppm ek-35 sisterer begge som tripletter og koplingsforsøg medfører kun indbyrdes virkning med protoner med et signal ved 1,8 ppm. Strukturen vist på fig. 23 blev foreslået til at svare til DK 174229 B1 31 dette sæt af resultater (indbefattet carbon-13-signalet, der er karakteristisk for disaccharider).

Eksempel XV 5

Gaskromatoqrafi/massespektrometri af renset reuterin. Trime-thylsilering gennemførtes med N,O-bi s-(trimethylsi ly 1)-trif1u-oracetamid (BSTFA) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). To ml rå reuterinekstrakt rensedes ved semipræparativ 10 kromatografi som beskrevet ovenfor og frysetørredes til tør hed. 1 ml BSTFA sattes til det lyofi 1 i serede reuterin og sila-niseringsreaktionen gennemførtes ved stuetemperatur. Prøven rystedes forsigtigt i hånden i 5 minutter, indtil der påvistes et hvidt bundfald. Der tilsattes netop tilstrækkeligt 15 acetonitril af HPLC-kvalitet (Fisher Scientific, Raleigh,

North Carolina, USA) til at opløse bundfaldet. Prøven blev derefter overskyllet med nitrogen, forseglet i et hætteglas med skruetop og underkastedes gaskromatografi-massespektrometr i .

20

En Hewlett Packard 59858 GC/MS (Hewlett Packard, San Jose, California, USA) anvendtes ved undersøgelse af silylerede reuter i nderivater. GC-betingelserne var en strømningshastighed på 1,1 ml/minut og en indsprøjtningstemperatur på 280°C. Det til 25 analysen anvendte program bestod af en indledende holdeperiode på 3 minutter ved 40eC med en jævn stigning til 260°C med en hastighed på 6°C pr. minut. Den valgte kolonne til at effektuere separation var 15 M DBS sammensmeltet si 1icakapi1larkolon-ne fra J & W Scientific (Folsum, California, USA). Masseområ-30 det var 40-400, en ionkiIdetemperatur på 200eC, elektronener gi på 70 eV, elektronstødionisering med spaltningsfri injektion og en spaltningstid på 0,8 minutter.

Reuterin viste sig at være ustabil ved de høje temperaturer, 35 der forelå i GC-injektoren. Et stabilt reuterinderivat frem stilledes ved silanisering med BSTFA ved stuetemperatur. Kro-matografer ing af den derivatiserede prøve gav et kompliceret DK 174229 B1 32 GC-spor (resultater ikke vist), men forbindelser med en tilsyneladende molekylvægt på 292 (148 plus 2 trimethylsilylgrup-per) fandtes ved retentionstider på mellem 9 og 14 minutter.

To toppe blev identificeret som mulige isomerer (retentions-5 tid på 11,7 og 13,3 minutter). Et monos i ly 1 eret derivat blev opdaget ved en retentionstid på 9,3 minutter og dets spektre er vist på fig. 24. Fragmentationsmønsteret for denne forbindelse består af signaler ved 205, 177, 163, 147, 130 og 115 M/E-enheder. Et reuter inmo1eky1e, der indeholder en TMS-grup-10 pe (molekylvægt = 220), kunne tabe en methylgruppe for at give en M/E-værdi på 205. Fragmentet ved 147 enheder kunne antages at komme fra tabet af TMS-gruppen, men mønsteret af fragmenter omkring M/E på 147 viser tilstedeværelsen af naturlige isotoper af silicium, carbon og oxygen. Mere præcist var for-15 holdet mellem fragment i oner på 147: 148:149 M/E-enheder 100:16:9, nøjagtigt det som man ville forudsige for et molekyle med sammensætningen CeHjsC^Si . Dette fragment blev fortolket som havende den struktur, der er vist på fig. 25 og ikke som et reuterinmolekyle, der havde tabt TMS-gruppen.

20 Kraftige signaler ved M/E 219 og 189, der er til stede i spek tret af isomerer af derivat i serede molekyler indeholder 2 TMS-grupper, der eluerer ved 11,7 og 13,3 minutter (resultater ikke vist). Il lustrationer af fragmenter, der opfylder M/E data såvel som strukturelle detaljer bestemt ved NMR-undersøgel-25 ser, er vist på fig, 27.

Baseret på FT IR og LCMS-data (fig. 16 og 17) for renset reu-terin blev reuterin tilskrevet en molekylvægt på 148 indeholdende både hydroxyl funkt ioner og a 1dehydfunkti oner. Disse an-30 tageiser passer udmærket med NMR-data (prøver i D2O). En mole- kylformel på C6H12O4 og strukturen vist på fig. 20 blev foreslået. Imidlertid var det klart, at visse revisioner var nødvendige, når NMR-undersøgelser af reuterin blev gennemført i deutereret methanol. Data i dette tilfælde medførte, at mole-35 kylet kun havde tre carbonatomer eller var symmetrisk omkring en akse (dvs. 2x3=6). To mulige skemaer blev foreslået for at forklare disse resultater (fig. 26).

'"s DK 174229 B1 33

Skema A ville kræve dannelsen af en anden hemiacetalbinding mellem aldehydegruppen og hydroxy1 gruppen. $1 utstrukturen ville da eksistere som en otteleddet ring, hvor begge halvdele ville være symmetriske. Denne foreslåede struktur tager ikke 5 højde for carbonsignalerne, der er til stede ved 207 ppm, når reuterin analyseres i deutereret methanol. Strukturen passer ikke til spaltningsmønstrene, proportionaliteten af tilstedeværende protoner {2:2 :1-forhold af hydrogener på carbonatomer) og de iagttagne kemiske forskydninger for protonspektret i me-10 thanol. Hemiacetalerne ville frit kunne åbne og lukke i nær værelse af vand (i høj grad ligesom sukkerarter, der underkastes mutarotation i løbet af tiden) og der kunne være et antal former til stede på et hvilket som helst tidspunkt i en reuter i nprøve. Dette kan føre til de brede toppe, der iagt-15 tages i D20-spektret og manglen på nøjagtig integration af signaler.

Skema B ville skride frem gennem en mere strukturelt begunstiget seksleddet ring og koblet med tab af vand, ville den ek-20 sistere som en bicyklisk ring i methanol. Dette molekyle vil le også have den nødvendige symmetri til at forklare de i methanol iagttagede NMR-spektre. Yderligere ville denne struktur indbefatte et carbonatom, som ville give et signal ved 104 ppm i et carbon-13-spektrum. Kemiske forskydninger og spal-25 ningsmønstre, der er fundet i protonspektrene (kørt i D2O), ville passe til den foreslåede struktur med en seksleddet ring og åbning af hemiacetalen ville give en situation, ligesom den der er beskrevet ovenfor, nemlig eksistensen af flere former af reuterin, hvilket førte til komplicerede spektre.

30

Yderligere nøje undersøgelse af protonspektret for reuterin kørt i D2O (fig. 19) giver oplysning til gunst for skema B (fig. 26). Den ligekædede form for reuterin ville give anledning til signaler til stede ved kemiske forskydninger på 1,6; 35 2,6; 3,5; 3,7; 5,0; og 9,5 ppm. Areal forhol det mellem disse signaler er tydeligt ikke ækvivalent med forholdet mellem hydrogenatomer i molekylet (dvs. 1:2:2:1:2:2 for carbon 1-6).

DK 174229 B1 34

Hvis den cykliske form også var til stede i en ligevægtskoncentration med den ligekædede form ville protoner på carbon-atornerne 1 og 4 i ringen eksistere i et miljø meget forskelligt fra de samme protoner i kædeformen. Dette ville give an-5 ledning til nye kemiske forskydninger for disse protoner. Mil jøet for protoner på carbonatomerne 3, 5 og 6 ville være forholdsvis konstant i de to former, og signalerne ville ikke forventes at være forskudt signifikant. Som forventet er signalerne fra protonerne på carbonatomerne 3, 5 og 6 brede og 10 viser signifikant afvigelse fra forventede areal integrations- værdier. Udvikling af svage s igna1mønstre omkring 5 ppm sker på grund af protoner fra de forudsete ringcarbonatomer med to tilknyttede oxygenatomer. Tilstedeværelsen af to former af reuter in, når det er i vandig opløsning, er skyld i det pro-15 tonspektrum som iagttages, mens en lille irreversibel nedbryd ning af reuterin til 2 molekyler β-hydroxypropionaldehyd også ville forklare protonspektrene.

Massespektrene opnået fra silylanerede prøver giver en andet 20 niveau af detaljer for reuterins struktur, når man betragter dem sammen med resultater opnået fra NMR-undersøgelser. Signaler, der er til stede ved M/E 147, repræsenterer fragmenter, som kunne forudses ud fra en hvilken som helst af de strukturer, der er vist i skema A og B (fig. 26). Det fragment, der 25 iagttages ved M/E 177 ville imidlertid ikke være til stede ved fragmentering af en otteleddet ring eller en lige kæde. Tilsvarende ville man ikke forudsige et signal ved M/E 163 for disse molekyler. Fragmenter af M/E 177 og 163 er mulige, hvis der anvendes en seksleddet ring som modermolekylet. Fig. 27 30 viser detaljer af foreslået fragmentering af den siliniserede seksleddede ring, som passer med resultaterne tilvejebragt ved GCMS-analyse.

Der kan gøres regnskab for alle iagttagede M/E-signaler, enten 35 som et fragment af -CH2-CH2"0-TMS-halen eller som et fragment af den seksleddede ring. Yderligere kunne fragmentet af M/E 147 blive dannet ud fra et antal forskellige fragmenteringer, DK 174229 B1 35 hvor enhver indeholder tre grundcarbonatomer, et oxygenatom og gruppen -O-TMS. Dette punkt er vigtigt, da signalerne fra fragmenterne på M/E 147 er kraftige i spektrene for begge forudsete isomerer (såvel som det monosilylerede molekyle) sepa-5 reret ved GC, hvilket viser at begge isomerer giver de samme basisringfragmenter i nger (dvs. har lignende struktur).

På basis af de indtil nu opsamlede resultater er den mest sandsynlige struktur for reuterin den, der er vist på f i g. 28.

10 Når reuterin er til stede i en vandig opløsning, må den eksistere i en ligevægt mellem den åbnede kæde (baseret på NMR-resultater), mens den, når den er der i vat i seret med BSTFA, er låst udelukkende i den cykliske form (GCMS-undersøgelser). Proton-NMR-undersøgelser af reuterins struktur i acetone falls der sammen med resultater, opsamlet når reuterin var opløst i vand (resultater ikke vist). Yderliger NMR-analyse af reuterin opløst i en 50/50 blanding af methanol og vand gav resultater, ligesom methanol resul taterne vist ovenfor. Yderligere analyse af former overvejende i methanol behøves for at be-20 kræfte teorien om den bicykliske struktur. Desuden er oganisk syntese af reuterin (som dets struktur er forudsagt) og en efterfølgende strukturanalyse den eneste absolutte metode til at bekræfte den her fremførte strukturelle hypotese.

25 Eftersøgning i litteraturen, efter at reuterins struktur var klarlagt, viste, at en forbindelse med de samme kemiske bestanddele som reuterin, var til stede i en sur opløsning efter hydrat i sering af acrolein (29). Det er også tidligere blevet beskrevet som destillatet fra en fremstilling af p-hydroxy-30 propaldehyd med navnet 4-hydroxy-2-2'-hydroxyethyl-1:3-dio- xan (30).

Da 4-hydroxy-2-2'-hydroxyethyl-1:3-dioxan blev syntetiseret på ansøgerens laboratorium som beskrevet af Hall (30), elueredes 35 det ved samme HPLC-top som reuterin og udviste en identisk MIC-værdi som det biologisk syntetiserede reuterin. Derfor er den struktur, der er vist på fig. 27, strukturen af reuterin.

DK 174229 B1 36 ø-hydroxypropaldehyd (også betegnet: 3-hydroxypropanal , hydra-craldehyd, Ø-hydroxypropiona1dehyd, 3-hydroxypropan-l-al) har stor potentiel værdi på området for opløsningsmidler og b 1 ød-gøringsmidler (R. H. Hall og E. S. Stern, Journal Chemical 5 Society, Jan-Mar, 1950 side 490-498). Det er fastslået, at det dimere Ø-hydroxypropaldehyd (dvs. reuterin eller 4-hydroxy-2-21-hydroxyethy1-1:3-dioxan) og det monomere Ø-hydroxypropal-dehyd er i ligevægt i opløsning (samme reference). Derfor udgør den biologiske fremstilling af reuterin ud fra glycerol 10 ved hjælp af L. reuteri en ny fremgangsmåde til dannelse af såvel monomeren (Ø-hydroxypropa1dehyd) såvel som den dimere form af dette stof.

L. reuteri-reuter i n-systemet: en regulator for enteriske mi-15 krobiotiske populationer. Opdagelsen af dette system har ført til en ny konceptionsmodel, der beskriver, hvorledes mikrobi-otiske populationer kan reguleres i mavetarmkanalen hos dyr. Denne model er vist i de fire dele på fig. 12. I fase 1 indeholder et tarmsegment hypotetiske bakterier (art A og B) og L-20 reuteri (R) eksisterende i en tilstand af populat ionshomeosta- se. Under fase 2 mærkes en stigning i populationen af heterologe mikrober (i dette tilfælde organisme A) (ved hjælp af en ukendt cel 1e-1i 1-ce11e-kontaktmekanisme) af de residerende celler af L. reuteri. I fase 3 syntetiseres reuterin i nærvæ-25 relse af glycerol (eller glyceraldehyd) sandsynligvis tilgæn geligt via pankreatisk og/eller mikrobiel lipolytisk aktivitet. Den bakteriocide virkning af reuterin reducerer den enteriske mikrobielle population i fase 4, og populationshomeo-stasen i fase 1 genetableres. Denne model antyder, at tilbage-30 føringsreguleringsprincippet, som opererer så effektivt på det metaboliske niveau, kan fungere på et celleniveau til opretholdelse af enterisk populat ionshomeostase.

Som bestemt ved de givne forsøgsresultater og set i lyset af 35 tilbageføringsmodellen bedømmes L. reuteri stamme 1063 som bedst egnet blandt L. reuter i stammer til at virke som et pro-biotisk middel til at moderere enteriske sygdomme og forøge DK 174229 B1 37 fødeeffekt i vitet hos svin. Denne konklusion udledes af (i) opdagelsen af, at stamme 1063 producerer høje niveauer af reu-terin < f i g. 2) og at den er mere reaktionsdygtig på heterolog stimulering end andre stammer (tabel 6), (ii) den kendsgerning 5 at stamme 1063 isoleredes direkte fra svinetyndtarme og derfor er en svineværtsspecifik stamme og (iii) de iagttagelser, at stamme 1063 har en kraftig autoaggregationsevne og klæber bedre end andre stammer, der er afprøvet, til svineepitelceller.

10 Bedste udførelsesform for opfindelsen

Reuterin opnås ved den homologe metode, hvor L. reuteri-celler dyrkes i en stillestående kultur ved 37eC i Lactobacillus Carrying Medium med glucose i 24 timer. Cellerne høstes ved cen-15 trifugering og suspenderes i 250 mM glycerol. Efter inkubering i 6 timer ved 37eC i stillestående kultur fjernes cellerne ved centrifugering og filtrering. Reuterinopløsningen sættes derefter til et miljø, der indeholder reuteri nfølsomme mikroorganismer for at dræbe mikroorganismerne.

20

Industriel anvendelighed

Reuterin er anvendelig til antiviral, antibakteriel, anti parasitisk og antifungal anvendelse på laboratorier. Desuden kan 25 reuterin sættes til fødevareprodukter for at nedsætte den mikrobielle flora. Reuterin kan også fødes til dyr, for at nedsætte den mikrobielle population i dyrenes mave-tarmkanal. Celler af Lactobacillus reuteri kan inkuberes under betingelser, der fører til reuterinproduktion for at forøge den anti-30 bakterielle aktivitet.

35 DK 174229 B1 38

Tabel 1.

Reuterin fremstilles i nærværelse af glycerol eller glyceral- dehyd.

5 Substitut Tilsætning af E. coli % sat til dyrk- L reuter i (CFU/ml) n i nqsmed i um 1063 efter 6 timer i n h i b e r i n g giucose - 1,3x10® 0 + 1,3 x 10® mannose - 7,2 x 107 0 10 + 9,0 x 10? fructose - 2,1 x 10® 0 + 3,0x10® mannitol - 2,3x10® 0 + 2,7 x 10® 15 sorbitol - 2,1x10® 0 + 1,9x10® gluconat - 3,5x10® 0 + 3,2x10® xylose - 6,7 x 107 0 20 + 6,9 x 107 ribitol - 5,7x10® 0 + 4,9x10®

arabi tol - 2,7x10® O

+ 2,9x10® 25 dihydroxyacetone-P - 3,4 x 10® 0 + 4,1x10® /3-glycerol-P - 5,1 x 10® 0 + 6,5x10® glycerol - 1,2 x 107 99 + 5,5 x 104 g 1ycera1dehyd - 2,8 x 10® 99 + 3,2 x 104 35 DK 174229 B1 39

Tabel 2

Reuterin findes i dvrkningsvæsken efter fjernelse af celler ved centrifugering 5 Vækst af E. coli tilstedeværelse af

Substrater til stede centrifugeret dyrknings- i dyrkningsmedium medium CFU/ml efter % 6 timer inhiberinq

10 pyruvat 4,1 x 10® O

phosphoenolpyruvat 3,7 x 10® 0 phosphoglycerat 3,3 x 10® 0 Ø-glycerol-P 3,2 x 10® 0 dihydroxyacetone-P 3,7 x 10® 0 15 glycerol 4,5 x 105 99,9 glyceralderhyd 6,1 x 105 98,9 uden substrat 3,6 x 10® 0 20 Tabel 3

Produktion af reuterin under forskellige dyrkningsbetingelser _Fremstillede reuterinenheder_ E. coli i E. coli Brugt 25 Tid Komplet Minus dialyserer kultur væske (timer) system E. coli ind - ud + 1063 -1063 0 0 0 0 0 0 0 1 16 - 1 1 2 24 - 4 4 30 3 32 - 6 4 4 32 - 8 6 5 32 - 8 8 6 32 8 4 8 8 0 35 DK 174229 B1 40

Tabel 4

Effekt af dyrkningsmedium og E. co1 i - 1evedyqtiqhed på reutere i nprodukt i on af L. reuteri 1063 5 _Reuter i nenheder_

Varmedræbt

Dyrknings- E. coli L. reuteri E. coli plus E. coli + betingelser alene 1063 alene L. reuteri 1063 L. reuteri ___ _ _ _ 1063 10 komp1 et medium 0 6 49 6 glycerol- vand 066 2 15 20 25 30 35 DK 174229 B1 41

Tabel 5

Homolog og heterolog produktion af reuterin af tre stammer af L. reuteri ved varierende koncentrationer 5 Enheder af reuterin fremstillet ____(6 timers inkubation)_____ L. reuteri Stamme 1063 Stamme 23272 Stamme 20016 CPU E. coli E. coli E. coli 1_L±1 JjJ_Lil JLzJ_LU- 1.2 x 1010 96 - 4.0 x 109 48 - 1/3 X 109 24 - - 4.4 x 108 4 2.0 X 108 0 96 4 48 48 96 15 7,0 x 107 0 48 2 32 16 48 2.3 x 107 0 32 0 16 6 32 7,6 X 106 0 12 0 63 12 2.5 x 108 0 0 0 0 0 1 20 +: E. coli B co-inkubering af 20 CPU E. coli pr. CFU L. reuteri ingen E. coli 25 30 35

Tabel 6 42 DK 174229 B1 Følsomhed over for reuter in og stimulering af reuterinproduk-tion hos forskellige bakteriearter.

5 ____

Stimulering af reuterin-produktion med de angivne stammer i g 1ycero1 med ium, produktion af de indicerede stammer i glycerolmedium

Afprøvede bak- Følsomhed over ter iestammer_ for reuterin Reuter i nenheder_ I. Gramnegative bakterier:

Escherichia coli K12 (vildtype) VS 32

Escherichia col i 431 15 (svineenteropatogen) VS 64

Escherichia coli 73 (svineenteropatogen) VS 64

Escherichia coli P155 (svineenteropatogen) vs 64

Escherichia coli 263 (svineenteropatogen) VS

Escherichiaco1 i P159 (svineenteropatogen) VS

Escherichia coli CII-P7 (svineenteropatogen) VS

Salmonella typhimurium VS 64

Shigella art VS 64

Proteus art VS 32

Pseudomonas fluorescens VS 64 25 II. Grampositive bakterier:

Staphylococcus epidermidis VS 32

Streptococcus cremoris VS 8

Clostridium sporogenes s 8

Bacillus megaterium S 12 ,Q Pediococcus cerevisiae S 8

Leuconostoc mesenteroides S 8 III. Gær:

Saccharomyces cerevisiae S 12 VS = meget følsom; S = følsom 35 DK 174229 B1 43

Tabel 7

Inhibering af underenheden Bl af ribonukleotidreduktase og inhibering af thioredoxin med reuterin 5 Reuterin, μΐ/nmol protein til

Enzym/underenhed at give 50% inhibering_

Bl 53 B2 555

Thioredoxin 34 10 Thioredoxin-reduktase > 5000

Tabel 8 NH3 (mg pr. Log CFU-bakterier q

IS 100 g) Pseudomonader LAB

LAB

_(kings agar) total total

Kontrol 164 9,5 <5,0 <4,0 glycerol 64 9,4 5,5 g 1068 36 8,4 8,5 ^ 20 1063 28 6,7 7,7 7,8 25 30 35 DK 174229 B1 44

Referencer 1. Kandler, O-, et al., Zbl. Bak t. Hen·, I.Abt. orig..

Cl, 264-269 (1980).

2. Bergey1 s Hanua1 o i Systenat ic Bactet iologv, Vol .

5 2. Ed by P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. S harpc og' J.G. Holt, Williams 3nd Wilkins, Baltimore (1986).

3. Sand i ns, W.E., et al., Milk F ood Techno 1 ., 25:691 (1972).

4. Goldin, B.R., et al., N a 11. Cancer Institute, 10 6£:255 (1980).

5. Goldin, B.R.’, et al., Developmon t i η Γ ndus t rial M icrob ioloqy, 2_i: 139 ( 1 984).

6. Goldin, B.R., et al., Am. J. C1 in . Nutr., 39:756 (1984).

15 7. Gilliland, S.E., et al., Λρρ1. Env i ron .

M icrob iol . , 29 : 377 ( 1985).

8. Schutz, H., et al., Sys tem. App 1. Microbiol..

2:169 (1984).

9. Soboiov, M., et al., Bacteriol. , 7_9 : 2 61 (I960).

20 10. Smiley, K.L., et al., A rch B iochem. B iophys., 97:538 (1962).

11. Metchnikoff, Prolongation o C Life, C. P. Putnam’s Sons, New York, NY, 1970.

12. Klaenhammer, T.R., et al., i ru Science, 25 12:1339 ( 1982).

DK 174229 B1 45 N, 13. Dahiya, R.S., et al., Oalcv Science, 51:1360 ( 1968)'.

14. Gilliland, S.E., et al., H i 1 k Food Technol. , 25:307 (1972).

5 15. Pinhoi.ro, A.J.p.., ot al., -K, Da i ry Science, 57:103 (1968).

16. Price, R.J., et al., M i l k F ood Techno l. , 3 3:18 (1970) .

17. Sorrels, Κ.Μ.» et al., J. Dairy Science, 53:239 10 (1970).

18. Talon, R.J., et al., Zentralbl. Bakteriel. Abt.

Orig. Bl70r 133 ( 1980 ).

19. Gilli-land, S.F., et al., J. Food Pretection, 40:820 (1977).

15 20 . Tramer, J., et al., Mature, 21 1:204 ( 1966).

21. Shahani, K.M., et al., Cult. Dairy Prod. J. , 12:8 ( 1977 ).

22. Shahani, K.M., et al., Cult. Da i ry Prod. J ..

11:14 (1976).

20 23 . Reddy, G.V., et al., Dairy Science, 54: 748 (1971) .

24. Hamdan, I.Y., et a)., J. Antibiotics, 27:631 (1974).

25. Hamdan, I.Y., et al., Cult Da i ry Prod. J., 10:10 25 (1975).

DK 174229 B1 46 26. Spilimann, H., et al., Π iIchwissenschaf t, 3 3 ; 14 3 ( 1978 ).

27. Vincent, J.G., et al., J_;_ Bacteriol. , 73:477 (1959).

5 28 . SandLne, W.E., Jj_ Food Protection, 4 2:259 (1979).

29. Nielsen, A.T., et al., Pol i sh Journal of Chems try , 5_5 : 1 39 3 ( 1981 ).

30. Hall, R.H., et al., J. Chem. Society, 1950:490 10 (1950).

Claims (12)

10 Xh-Ch2 og blandinger deraf til brug som et antimikrobielt middel, såsom et antibakterielt, et 15 antiviralt, antiparasitisk og antifiingalt middel og som et middel, der inhiberer ribonukleotid-reduktase-aktivitet, navnlig som et probiotisk middel. 2. β-hydroxypropionaldehyd ifølge krav 1 og dets dimere form indeholdende grund-2 o stofferne carbon, hydrogen og oxygen i det væsentlige i følgende vægtprocenter: carbon 48,65%, hydrogen 8,11% og oxygen 43,24%, hvilken dimere form har en molekylvægt på ca. 148 g pr. mol, er opløselig i vand og resistent mod proteaser og nukleaser, og udviser karakteristisk eluering med vand eller 0,1 M H2S04 mellem 1,3-propandiol og 25 glycerol ved højtryksvæskechromatografi, navnlig med formlen C6H1204 til anvendelse som et antimikrobielt middel, der er effektiv til at hæmme gram-positive og gram-negative bakterier og eucaryote organismer, Saccharomyces cerevisiae og Trypanosoma cruzi.

3. Lactobacillus reuteri til anvendelse som et antimikrobielt middel såsom et antibak-30 terielt, antiviralt, antiparasitisk og antifiingalt middel og som et middel, der inhiberer ribonukleotid-reduktase-aktivitet, navnlig som et probiotisk middel.

4. Lactobacillus reuteri stamme 1063, ATCC 53608 til brug som et antimikrobielt 35 middel, såsom et antibakterielt, antiviralt, antiparasitisk og antifiingalt middel og et middel, der inhiberer ribonukleotid-reduktase-aktivitet, navnlig som et probiotisk middel. DK 174229 B1

5. Lactobacillus reuteri-cellekulturer og fortrinsvis også substanser, der bidrager til antibiotisk fremstilling af Lactobacillus reuteri til anvendelse i fødevarer til forøgelse af antallet af Lactobacillus reuteri-celler i fordøjelseskanalen hos dyr, fortrinsvis under optimering af betingelserne for antimikrobiel produktion ved hjælp af Lactobacillus 5J reuteri-celler.

6. Anvendelse af β-hydroxypropionaldehyd, dets dimere form 10 cri \ CH2-0 HO-CH — O \ lh-ch2 ^hb-OH 15 og blandinger deraf som fødevarekonserveringsmiddel.

7 Anvendelse af β-hydroxypropionaldehyd og dets dimere form indeholdende grund- 20 stofferne carbon, hydrogen og oxygen i det væsentlige i følgende vægt%: carbon 48,65%, hydrogen 8,11%, oxygen 43,24%, hvilken dimere form har en molekylvægt på ca. 148 g pr. mol, er opløselig i vand og resistens mod proteaser og nukleaser, og udviser karakteristisk eluering med vand eller 0,5 M H2S04 mellem 1,3-propandiol og 25 glycerol ved højtryksvæskechromatografi, navnlig med formlen C6H1204, som et anti-mikrobielt middel, der er effektivt til at inhibere gram-positive og gram-negative bakterier og eucaryote organismer, Saccharomyces cerevisiae og Trypanosoma cruzi i fødevare.

8. Anvendelse af Lactobacillus reuteri som et fødevarekonserveringsmiddel. 30

9. Anvendelse af Lactobacillus reuteri stamme 1063, ATCC 53608 som et fødevarekonserveringsmiddel . 35

10. Biologisk ren stamme af Lactrobacillus reuteri kendetegnet ved, at den er stamme 1063 med ATCC deponeringsnummer 53608. DK 174229 B1

11. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne ifølge krav 1,kendete g- n e t ved, at man identificerer isolater af Lactobacillus reuteri som producerer β-hy-droxypropionaldehyd eller dimerer deraf og anbringer dem under betingelser der er gunstige for produktion af det antibiotiske stof, fortrinsvis i nærværelse af glycerol 5' og/eller glyceraldehyd, og en reduceret oxygenspænding, navnlig i nærværelse af glycerol i en koncentration på 20-500 raM og inkuberer cellerne af Lactobacillus reuteri ved 37°C i stillestående kultur og eventuelt under nærværelse af heterologe mikroorganismer i den stillestående kultur, hvorefter det således producerede antibiotiske stof om ønsket 10 isoleres i en i det væsentlige ren form.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at isolater af Lactobacillus reuteri, der producerer β-hydroxypropionaldehyd eller dimerer deraf, identificeres ved, 15 at man (a) poder en suspension af mikroorganismer fra en dyrekilde på et fast vækstmedium for Lactobacillus, idet mediet kan have en høj selektivitet for lactobaciller ved tilsætning af natriumacetat og indstilling af mediets pH til 5,5, 2o (b) inkuberer det podede vækstmedium under betingelser, der fremmer vækst for koloni er af Lactobacillus, fortrinsvis ved en temperatur på 37°C i 48 timer ved en nedsat oxygenspænding, (c) replikerer kolonierne af Lactobacillus, 2 g (d) over det podede vækstmedium lægger et lag med en flydendegjort halvfast blanding, der indeholder en suspension af en levende prøveorganisme, fortrinsvis Lactobacillus plantarum, og en carbonkilde valgt blandt glycerol og glyceraldehyd, fortrinsvis glycerol, (e) inkuberer det med overlag forsynede podede medium under betingelser, der fremmer 30 vækst for prøveorganismen, og (f) in situ identificerer de kolonier af Lactobacillus, som fremstiller det antibiotiske stof ved at påvise zoner med vækstinhibering som omgiver kolonierne. 3S 13. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at isoleringen omfatter følgende trin:

50 DK 174229 B1 (a) separation af ceiier af Lactobacillusreuteri fra en prøve af en opløsning, der har antibiotisk aktivitet, (b) analysering af prøven under anvendelse af højtryksvæskechromatografi, (c) eluering af prøven, og 5' (d) opsamling af det materiale, der elueres fra et topmellemprodukt mellem toppene for referenccstandardeme for 1,3-propandiol og glycerol, eller (e) bestemmer tilstedeværelsen af en mellemliggende top i elueringstid mellem dem for referencestandardeme for 1,3-propandiol og glycerol ved at overvåge ændringer i refrak-10 tionsindex. 15 20 25 30 35