NO308982B1 - Anvendelse av Lactobacillus reuteri for ikke-terapeutiske formÕl - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av Lactobacillus reuteri for ikke-terapeutiske formål, spesielt som et probiotisk middel, samt anvendelse av Lactobacillus reuteri-cellekulturer og fortrinnsvis også stoffer som bidrar til Lactobacillus reuteri antibiotisk produksjon, for ikke-terapeutiske formål i matvarer som et probiotisk middel generelt.

Bakgrunnsinformasj on

Lactobacillus reuteri, en nydesignert art av Lactobacillus (noen stammer av denne art ble tidligere identifisert som Lactobacillus fermentum (1, 2)), er en symbiotisk beboer i mage- og tarmsystemene (GI) til mennesker, svin og andre dyr. Nytypen av L. reuteri er DSM 20016 (ATCC nr. 53609). Denne stammen og den nylig isolerte stamme 1063 (ATCC nr. 53608) er allment tilgjengelig ved American Type Culture Collection (Rockville, MD), hvor de ble deponert 17. april, 1987. Mage- og tarmsystemet til dyr er et komplekst økosystem som rommer anslagsvis 300-500 mikro-organismearter, kollektivt kjent som den hjemmehørende mikrobiota. Til tross for over 100 år med intensiv forsk-ning på området tarmmikrobiologi gjenstår det mye å lære om disse mikroorganismene, de komplekse gjensidige forhold som foreligger mellom de forskjellige artene og typen av de symbiotiske forhold som foreligger mellom mikrobiotaen og deres vert.

Under visse betingelser kan noen medlemmer av den hjemmehørende mikrobiota bli opportunistiske påtogener som forårsaker flere forskjellige tarmsykdommer. Oftere får imidlertid påtogener adgang til mage- og tarmsystemet som forurensninger i mat eller vann. Bemerkelsesverdig blant de sistnevnte er et antall bakterier (f.eks. Escherichia coli, Salmonella-arter, Shigella-arter, Yersina interocolitica, Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter

jejuni og Clostridium difficile), virus (f.eks. roto-,

astro- og cilicivirus) og tarmparasitter (f.eks. Giardia- og Entamoeba-arter). Akutte og kroniske tarmsykdommer forårsaket av disse og andre mikroorganismer oppstår over hele verden og forårsaker betydelig lidelse hos mennesker og tap

av økonomisk viktige dyr. Visse mikrobielle aktiviteter er også blitt forbundet med fremstilling av mutagener i mage-og tarmsystemet.

Det er også kjent at den hjemmehørende mikrobiota foreligger i et symbiotisk eller synergistisk forhold til sin vert og bidrar på mange positive (probiotiske) måter til vertens generelle helse og velbefinnende. Det er velkjent at mikrobefrie dyr ikke er særlig friske og har dårlig utviklede mage- og tarmsystemer. Som gjengjeld for det næringsrike og stabile økosystem som er tilveiebrakt for dem, gir de hjemmehørende mikrobiota sine verter et utvalg av fordeler, deriblant (i) beskyttelse mot tarmpatogener, (ii) stimulering av normal utvikling og funksjon av mage- og tarmsystemets epitelslimhinnesystem, (iv) produksjon av forskjellige vitaminer og andre næringsstoffer, og (v) re-metabolisme av vertens rikelige endogene slimhinnevev.

For tiden er det liten forståelse for hvordan sammensetningen og antallet av de hjemmehørende mikrobiota kontrolleres. Det synes som om disse kontrollene er følgene av komplekse reaksjoner blant det store antall arter som omfatter slike faktorer som: redokspotensial, overflate-pH, inhiberingsvirkninger av fettsyrer, hydrogensulfid, dekonju-gerte gallesalter og hittil uidentifiserte inhiberings-stoffer, samt slike faktorer som konkurranse med hensyn på begrensende næringsstoffer og mikrobiotaens evne til å inngå forbindelse med og feste seg til epiteloverflåtene i mage-og tarmsystemet.

Kort tid etter et dyrs fødsel er Escherichia coli og tarmstreptokokker nesten universelt de første bakterier som kommer til syne i mage- og tarmsystemet. Laktobasillene ledsager nesten alltid eller følger øyeblikkelig etter og blir en dominerende bakteriegruppe som finnes i tarmene. Det synes som om mikroorganismene i tynntarmen, særlig de som tilhører Lactobacillus- og Streptococcus-slektene, har beskyttelsesverdi mot bakterielle og ikke-bakterielle påtogener og fremmer sunn vekstøkning hos dyrene. Ettersom de er blant de mer næringsmessig kresne av tarmmikrobiotaen, antas laktobasillene å finne sin økologiske nisje i de mer proksimale, næringsrike områder enn i de distale områder av mage- og tarmsystemet.

Det er blitt rapportert i tallrike tilfeller at laktobasillene (3), som omfatter et stort antall ikke-patogene, ikke-toksiske bakterier, spiller en viktig probiotisk rolle i menneskenes og dyrenes helse og velbefinnende. Lactobacillus-arter tilsettes til humane og animalske matvarer for å konservere dem, øke deres smak og/eller for probiotisk formål slik at disse bakteriene vil bli tilgjengelige for mage- og tarmsystemet. Stammer av Lactobacillus plantarum dyrkes f.eks. kommersielt i store mengder og anvendes som starterkulturer for den kommersielle preservering av en rekke forskjellige matvarer for mennesker (kjøtt, vege-tabiler og melkeprodukter) og for dyr (ensilasje). Stammer av Lactobacillus acidophilus dyrkes kommersielt i store mengder for tilsetning til mat for mennesker (f.eks. melk) eller dyr (forstoffer) som et middel for å innføre disse bakteriene i mage- og tarmsystemet for probiotiske fordeler. Rapporter vedrørende de gunstige virkningene av Lactobacillus-terapi har økt i de senere år med funn som tilsier at diett med Lactobacillus-terapi (i) gir beskyttelse mot tykk-tarmkreft for humanpopulasjoner på vestlige dietter (4), (ii) reduserer hyppigheten av eksperimentelt induserte store tarmtumorer hos rotter (5), (iii) reduserer feceskonsentra-sjonen av bakterieenzymer som er kjent for å katalysere omdannelsen av prokarsinogener til proksimale karsinogener hos mennesker (6), og (iv) reduserer serumkolesterolnivåene hos svin (7).

De metabolske sluttprodukter i Lactobacillus-metabolisme, slik som eddiksyre, melkesyre og hydrogenperoksyd, er velkjente for sine antimikrobielle virkninger. To laboratorier har rapportert at de heterofermentative arter Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri (8) og Lactobacillus-stamme 208-A (9, 10) metaboliserer glyserol anaerobisk. Den sistnevnte stamme utfører en anaerob dehydratisering (som omfatter glyseroldehydratase) av 2 mol glyserol, hvorved det fås 2 mol p-hydroksypropionaldehyd som igjen dismuteres til 1 mol p-hydroksypropionsyre og 1 mol 1,3-propandiol. Noen laktobasiller produserer også bakteriociner eller bakteriocinlignende proteiner som utviser bakteriedrepende aktivitet mot andre medlemmer av den arten eller nært beslektede arter. Noen ubekreftede rapporter har fremkommet vedrørende antimikrobielle stoffer med lav molekylvekt som produseres av laktobasiller. Selv om deres eksistens er blitt forutsagt i noen tid, er slike stoffer ikke blitt bekreftet eller isolert.

Nedenunder er det gitt en oppsummering av hva som er kjent vedrørende antimikrobielle aktiviteter forbundet med laktobasiller. I 1907 foreslo Metchnikoff (11) at skadelige forråtnelsesbakterier som befinner seg i mage- og tarmsystemet, ble inhibert (eller antagonisert) ved hjelp av syreproduserende laktobasiller. Siden da er flere forskjellige slike antagonistiske aktiviteter forbundet med melkesyrebakterier blitt rapportert (12). Som oftest er disse antimikrobielle aktiviteter blitt funnet å være forbundet med viktige sluttprodukter i metabolisme, slik som melke- og eddiksyrer og hydrogenperoksyd (13-18). Andre rapporter har fremkommet vedrørende antimikrobielle aktiviteter forbundet med laktobasiller, men ikke forbundet med disse normale sluttproduktene i metabolisme. Gilliland og Speck (19) rapporterte en bredspektret antagonisme som varierte mellom forskjellige testede stammer av Lactobacillus acidophilus. Hydrogenperoksyd var delvis ansvarlig for den inhiberende respons. Tramaer (20) viste at L. acidop_hilus-inhiber ing av E. coli skyldtes den sterke mikrobe-drepende virkning av melkesyre ved lav pH. Dannelse av enYtterligere inhibitor ble også foreslått, men ikke identifisert. Bredspektrede antagonistiske stoffer er også blitt rapportert av Shahani et al., Reddy og Shahani, og Hamdan og Mikolagcik (21-25). I hver av disse rapportene ble de antagonistiske stoffene produsert under dyrking av Lactobacillus i 11 % ikke-fettholdige tørrmelkfaststoffer og var vanskelig å skjelne fra melkesyre, og synes således å være totalt uten slektskap til reuterin. Av disse undersøkelsene utførte Hamdan og Mikolagcik (24-25) den sterkeste rensing og karakterisering av stoffet som de kalte acidolin. De fant at det var en forbindelse med lav molekylvekt (omtrent 200), fritt for nitrogen, surt av natur og svært varmeresistent. Betingelsene hvorunder dette stoffet produseres og dets sure natur skiller det klart fra reuterin. En undersøkelse av antagonistiske aktiviteter blant yoghurtkulturer (26) kunne ikke identifisere andre inhibitorstoffer enn melkesyre i stammer av L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. helveticus og L. lactis. En av de testede L. bulgaricus-stammer var blitt rapportert tidligere å produsere et anti-biotikum kalt bulgarican (23).

Et antall laktobasiller er kjent for å produsere bakteriociner som er proteiner som utviser bakteriedrepende virkninger. De fleste bakteriociner eller bakteriocinlignende stoffer produsert av laktobasiller utviser et snevert område av biologisk aktivitet. Vincent et al. (27) rapporterte imidlertid et bredspektret bakteriocin kalt lactocidin, produsert av flere isolater av L. acidophilus. Ingen andre rapporter av bredspektrede bakteriociner produsert av laktobasiller er blitt rapportert (12). Bakteriociner er polypeptider, og deres inhibitoregenskaper øde-legges av proteaser. Reuterin er ikke et polypeptid, og dets antimikrobielle aktivitet er upåvirket av proteaser.

I tillegg til deres evne til å produsere visse anti-biotiske stoffer, har Sandine (28) foreslått en rekke roller eller funksjoner som laktobasillene kunne spille i tarmkanalen til mennesker (og dyr). Disse omfatter: produksjon av organisk syre, lavere pH og oksydasjons-reduksjons-potensial, konkurrerende antagonister, galledekonjugering og karsinogensuppresjon. Laktobasiller som diettilskudd antas å være gunstig ved å gi sykdomsterapi, preventiv terapi og som en kilde for påkrevde enzymer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en anvendelse av Lactobacillus reuteri for ikke-terapeutiske formål, spesielt som et probiotisk middel, for å oppnå forøkt f6ringsaktivitet.

Videre er det tilveiebrakt en anvendelse av Lactobacillus reuteri-cellekulturer og fortrinnsvis også stoffer som bidrar til Lactobacillus reuteri antibiotisk produksjon, for ikke-terapeutiske formål i matvarer som et probiotisk middel generelt, for å øke antallet Lactobacillus reuteri-celler i mage-tarmkanalen hos dyr, fortrinnsvis under optimalisering av betingelsene for antimikrobiell produksjon ved hjelp av Lactobacillus reuteri-cellene. særskilt med tanke på forøkt får-ingsef fektivitet, bedret tilvekst og bedre vekst av jur (brystmuskulatur).

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser fremstilling av reuterin under aerobe (risting) og halvanaerobe (stille kultur) betingelser i et glyserolmedium.

Figur 2 viser virkningen av konsentrasjon av L^

reuteri (<y>.g/ml tørrvekt) for reuterinproduksjon etter halv-anaerobisk inkubasjon av to stammer av L. reuteri med E.

coli i et glyserolmedium.

Figur 3 viser virkningen av temperatur på reuterin-produks jon. Figur 4 viser virkningen av kultur-pH på reuterinproduksjon. Figur 5 viser produksjon av reuterin og tegn på bakteriedrepende aktivitet. Figur 6 viser resultatene av "High Performance Liquid Chromatography" (HPLC) analyser av L. reuteri-prøver♦ Figur 7 viser massespekteret for positivt ion til reuterin. Figur 8 viser massespekteret for negativt ion til reuterin. Figur 9 viser det infrarøde spekter til reuterin. Figur 10 viser karbon-NMR-spekteret til reuterin. Figur 11 viser proton-NMR-spekteret til reuterin. Figur 12 viser modellen av L♦ reuterin/ reuterin-systemet. Figur 13A viser prosenten av de kolonidannende enheter (CFU-er) og plakkdannende enheter (PFU-er) på hvert reute-rinnivå når reuterin tilsettes til faginfiserte bakterie-kulturer, og figur 13B viser de aktuelle tellinger av CFU-er og PFU-er. Figur 14 viser virkningen av reuterin på mikroflora i oppmalt oksekjøtt. Figur 15 viser virkningen av reuterin på E. Coli-inokulert mikroflora i oppmalt oksekjøtt. Figur 16 viser "Fourier Transform Infrared"-analysen av reuterin. Figur 17 viser vaeskekromatografi/massespektrometri-analysen av reuterin. Figur 18 viser karbon-13-spekteret til reuterin i deuteriumoksyd. Figur 19 viser protonspekteret til reuterin i deuteriumoksyd. Figur 20 viser den foreslåtte struktur som gir opphav til spektrene i figurene 18 og 19. Figur 21 viser karbon-13-spekteret til reuterin i deuterisert metanol. Figur 22 viser protonspekteret til reuterin i deuterisert metanol. Figur 23 viser den foreslåtte struktur som gir opphav til spektrene i figurene 21 og 22. Figur 24 viser massespektraene til et trimetylsilyl-derivat av reuterin. Figur 25 viser en foreslått struktur for fragmentet av M/E 147. Figur 26 viser foreslåtte skjemaer for reuterin-strukturen. Figur 27 viser fragmenter som oppfyller M/E-data og NMR-strukturer. Figur 28 viser den foreslåtte struktur til reuterin slik det foreligger i vandig oppløsning.

Beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer og eksempler på de foretrukne utførelsesformer

Isolering av antibiotikaproduserende stammer. Vertspesi-fikke stammer av Lactobacillus reuteri kan isoleres fra en animalskK.Llde, slik som mage- og tarmsystemet eller avføringer fra dyr som huser artene, ved hjelp av fremgangs-måtene ifølge denne oppfinnelse. L. reuteri vokser best under anaerobe betingelser, men vil vokse aerobt. Suspen-sjoner fra mage- og tarmsystemet eller avføringer spres ut på agarplater av et medium som er egnet for dyrking av Lactobacillus, og agarplatene inkuberes under betingelser som fremmer vekst av Lactobacillus-kolonier. Ved den foretrukne utførelsesform kommer godt utviklede kolonier til syne på overflaten av agarplater med Lactobacillus selek-sjonsmedium (LBS) etter 48 timer ved anaerob dyrking (redusert oksygenspenning) ved 37°C. LBS-medium inneholder: 10 g/l tryptikase, 5 g/l gjærekstrakt, 61 g/l KH2P04, 2 g/l ammoniumcitrat, 34 g/l natriumacetat (trihydrat), 1,2 g/l MgS04(heptahydrat), 0,13 g/l MnS04(monohydrat), 0,06 g/l FeS04(heptahydrat). pH reguleres til 5,5 med konsentrert HC1, og 15 g agar tilsettes. 10 g glukose tilsettes etter sterilisering av mediet. Det kan anvendes andre dyrkings-medier for Lactobacillus. Ved den foretrukne utførelsesform overtrekkes LBS-platene med 10 ml 1 % flytendegjort agar som inneholder 0,50 M glyserol, og et inokulum av Lactobacillus plantarum. For å sikre isolering av de respektive reuterinproduserende kolonier, fremstilles det replikaplater av alle Lactobacillus-kolonier som vokser på de opprinnelige LBS-plater før ytterligere testing, ved å bruke LBS-medium eller et annet dyrkingsmedium for Lactobacillus, eller Lactobacillus-celler overføres ved hjelp av hvilken som helst annen teknikk fra hver av koloniene på LBS-platene til et dyrkingsmedium før overtrekket tilsettes (replikasjonsfremgangs-måte). Etter at overtrekket har størknet, inkuberes platene på nytt ved 37°C i anaerobe beholdere i 48 timer. Soner med vekstinhibering av den inokulerte L. plantarum observeres rundt koloniene som produserer antibiotikumet reuterin under disse betingelser.

Identifiseringen av stammer av L. reuteri bekreftes

ved å bruke standard mikrobiologiske tester og de takso-nomiske kjennetegn til arten. L. reuteri er en hetero-fermentativ art som danner gass av glukose og glukonat, og acetat/ eta. iol av glukose. I API 50 CH fermentasjonstesten

(Analytab Products, Sherwood Medical Co., New Brunswick, NJ)

oppviser den en positiv reaksjon med ribose, arabinose, glukose, galaktose, laktose, sukrose, melibiose og maltose (noen stammer fermenterer også xylose). Arten har en guanin pluss cytosin mol-% på 39-41, lysin er murein-diaminosyren, og arten vokser ved 45°C, men ikke ved 15°C. Stammer med 80 % eller mer DNA-DNA-homologi med nytypestamme, DSM 20016, kan finnes i mage- og tarmsystemet til dyr.

Lactobaci1lus- reuteri-stammen 1063 er blitt isolert fra mage- og tarmsystemet til svin og er blitt påvist (omtalt nedenunder) å være i stand til å produsere mye høyere nivåer av reuterin enn de øvrige testede stammer. Stamme 1061 og stamme DSM 20016 er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD (hhv. ATCC nr. 53608 og 53609 (deponert 17. april, 1987).

Trekkene og fordelene ved foreliggende oppfinnelse vil forstås bedre under henvisning til de følgende eksempler.

Eksempler

Eksempel I

Dyrkingsbetingelser for produksjon og påvisning av reuterin

Når celler av Lactobacillus reuteri som er i stand til å produsere reuterin plasseres under visse gunstige betingelser, produseres reuterin. Det er blitt utviklet et antall analyser for å påvise og kvantifisere reuterin. En standard fremgangsmåte for minimal inhiberingskonsentrasjon (MIC) ble tatt i bruk for å påvise reuterin og for å klarlegge faktorer som påvirker dets produksjon. E. coli Kl2 anvendes som den følsomme testmikroorganisme, og analysen utføres på følgende måte. Kulturer av E. coli som har stått over natten høstes, vaskes to ganger med steril 0,05 natriumfosfatbuffer (pH 7,5), oppslemmes i denne buffer og reguleres til 60 % transmisjon (A 420 nm) under anvendelse av et Spectronic 70 instrument. Denne suspensjon fortynnes 1:100, og 0,1 ml aliguoter anvendes til å inokulere 1,0 ml av MIC-analyse-mediet som inneholder: 3 g/l vitaminfritt kaseinhydrolysat, 1,9 g/l ammoniumcitrat, 0,63 g/l sitronsyre, 12,6 g/l KH2PO4, 0,2 g/l MgSC>4 (heptahydrat), pH reguleres til 7,0, og 20 mM glukose tilsettes etter sterilisering. Sterile 1,0 ml porsjoner av prøver som skal testes for reuterin-aktivitet, tilsettes til 1,0 ml av dette inokulerte MIC-analysemedium og blandes grundig, hvorved man får fortynning i forholdet 1:2. Det fortsettes med å gjøre slike fortynninger i serie etter behov. Disse kulturene inkuberes så i 24 timer ved 37°C og undersøkes med hensyn på vekst. Relative reuterinkonsentrasjoner (reuterinenheter) beregnes så som den resiproke verdi av prøvefortynningen som går forut for fortynningen som gir synlig vekst av indikator-cellene. Det er også blitt utviklet en annen analyse som setter MIC-verdier i forhold til høyder av reuterintopp bestemt ved hjelp av HPLC-analyser (beskrevet nedenunder).

Under betingelsene ved fremgangsmåten

produserer L. reuteri det antimikrobielle stoff kalt reuterin. Et antall heterofermentative og homofermentative Lactobacillus-stammer er blitt testet med hensyn på reuterinproduksjon, og ingen, bortsett

fra L. reuteri, produserer reuterin.

Betingelser hvorunder reuterin produseres er blitt bestemt. Reuterin produseres ikke under aerobe betingelser (atmosfærisk oksygenbetingelse), men under redusert oksygenspenning. Det fremstilles når L. reuteri dyrkes anaerobt (eller semianaerobt i stillestående kultur) i MIC-analyse-medium beskrevet ovenfor, inneholdende 20-500 mM glyserol eller glyseraldehyd i stedet for glukose som hovedkarbon-og energikilde. Figur 1 viser produksjon av reuterin under aerobe (kurve 1) og semianaerobe (kurve 2) betingelser i dette glyserolmedium. L. reuteri vokser ikke under disse betingelsene, men produserer ikke desto mindre reuterin. Tyve andre stoffer, inkludert heksoser, heksitoler, pentoser, pentitoler, disakkarider og flere fosforylerte og ikke-fosforylerte C3-stoffer, ble testet med hensyn på evne til å understøtte reuterinproduksjon. Tabell 1 viser resultatene av noen av disse testene. Mediet som inneholder et substrat ved 20 mM (C6- og C5-substrater) eller 40 mM (C3-substrater) konsentrasjoner, ble inokulert med 5 x IO<6>kolonidannende enheter (CFU) pr. ml E. coli med og uten L. reuteri. Bare glyserol og glyseraldehyd gav reuterin. Reuterinproduksjon fra glyserol inhiberes dessuten når glukose eller annet dyrkingssubstrat er inkludert i produk-sjonsmediet. Resultatene vist i tabell 2 indikerer den prosentvise inhibering ved synlig telling av et 6,7 x IO<7>CFU pr. ml E. coli-inokulum av supernatantfraksjoner av L. reuteri dyrket på forskjellige angitte substrater ved konsentrasjoner på 40 mM.

Reuterin kan fremstilles på to måter. En fremgangsmåte er betegnet som den homologe metode og den andre som den heterologe metode. Ved den homologe metode anvendes celler av L. reuteri inkubert i stillestående kultur ved 37°C i en 250 mM glyseroloppløsning. For eksempel kan 1 1 celler av L. reuteri dyrkes i 24-48 timer ved 37°C i Lactobacillus- bærende medium (LCM). LCM inneholder: 10 g/l tryptikase, 5 g/l gjærekstrakt, 3 g/l tryptose, 3 g/l KH2PO4, 1,5 g/l ammoniumcitrat, 1,0 g/l natriumacetat,

0,2 g/l salter (som i LBS) cystein-HCl, og 1 ml "Tween 80".

pH reguleres til 7,0. Glukose (20 mM sluttkonsentrasjon) tilsettes etter sterilisering. Cellene høstes ved sentrifugering, oppslemmes i 10 ml av en 250 mM glyseroloppløs-ning, inkuberes i 6 timer ved 37°C i stillestående kultur og fjernes så ved sentrifugering. Reuterin er til stede i denne supernatantfraksjon. Denne fremgangsmåte og dens mange åpenbare variasjoner (f.eks. endrede cellekonsentrasjoner og inkubasjonstider) gir en enkel og effektiv måte for fremstilling av reuterin.

Den heterologe fremgangsmåte omfatter samdyrking av L. reuteri med visse andre (heterologe) reuterinstimulerende mikroorganismer. Ved denne fremgangsmåte oppslemmes f.eks. lavere konsentrasjoner av L. reuteri (f.eks. 20-300 ug celletørrvekt pr. ml) i et glyserolholdig dyrkingsmedium (som beskrevet ovenfor) sammen med celler av en levedyktig heterolog mikroorganisme (f.eks. E. coli K12), og det inkuberes som beskrevet ovenfor. Ved forhold mellom levedyktige celler (CFU E. coli pr. ml/CFU L. reuteri pr. ml) på 0,5 eller høyere produseres reuterin ved en stimulert hastighet (i forhold til fravær av den heterologe mikroorganisme), og produksjonshastigheten pr. biomasseenhet av L. reuteri øker i direkte forhold til biomassen av den heterologe mikroorganisme. Denne oppdagelse av rollen som heterologe mikroorganismer spiller i reuterinsyntese, var en nøkkel til utviklingen av modellen med "feedback-regulering" beskrevet ovenfor. Denne "heterologe" cellestimulering synes å kreve celle-til-celle-kontakt mellom levedyktige celler ettersom denne stimulering ikke oppstår når de to artene er atskilt fra hverandre av en dialysemembran i et ellers identisk samdyrkingssystem (tabell 3). Muligheten for at de heterologe arter involveres i det minste delvis ved å senke redokspotensialet i mikroomgivelsene til L. reuteri og derved stimulere reuterinproduksjon, er ikke blitt utelukket som bidragsgivende til denne stimulator-effekt. Reuterinproduksjon stimuleres ikke dersom den heterologe E. coli ikke er levedyktig (tabell 4), eller dersom L. reuteri ikke er levedyktig. Reuterinproduksjon ved hjelp av den heterologe fremgangsmåte er ikke avhengig av den stimulerende organismes evne til å metabolisere glyserol. Mutanter av E. coli som ikke er i stand til å metabolisere glyserol, stimulerer reuterinproduksjon like effektivt som villtypeceller.

Reuterin produseres under de fysiologiske betingelser som oppstår i levende dyr. Reuterinproduksjon (under anvendelse av den heterologe fremgangsmåte) er fra starten av hurtig og proporsjonal med biomassen av L. reuteri (figur 2), men produksjonshastigheten pr. biomasseenhet avtar deretter, sannsynligvis på grunn av en reduksjon i forholdet mellom levedyktige celler ( E. coli/ L. reuteri) og/eller føl-somheten til L. reuteri-celler for den høyere konsentrasjon av reuterin produsert under disse betingelser. Som det også vil ses i figur 2, produserer L. reuteri-stamme 1063 (X) større mengder reuterin ved hjelp av den heterologe fremgangsmåte enn nytypen gjør, stamme 20016 (0). Reuterin-resistente mutanter av L. reuteri kan produsere enda større mengder reuterin. Reuterinproduksjon oppstår ved maksimale hastigheter ved temperaturer mellom 25 og 37°C. Figur 3 viser effekten av inkubasjonstemperatur på reuterin-produks jon under semianaerob inkubasjon av L. reuteri i et glyserolmedium ved 4, 25, 37 og 45°C. Reuterin produseres i pH-området 5-9 med optimal produksjon ved pH 6-8. Figur 4 viser effekten av kultur-pH på reuterinproduksjon under semianaerob inkubasjon av L. reuteri med E. coli.i et glyserolmedium i 3 timer (kurve 3) og 24 timer (kurve 4). Hittil produserer alle tre testede stammer av L. reuteri reuterin: nytypen, DSM 20016, ATCC 27273 (tidligere klassi-fisert som L. fermentum) og den nylig isolerte stamme 1063. Alle tre stammene produserer reuterin ved hjelp av den homologe fremgangsmåte (tabell 5). Reuterinproduksjon ved hjelp av den heterologe fremgangsmåte varierer blant disse stammene på følgende måte: Produksjon stimuleres mye, middels og bare svakt av den heterologe mikroorganisme for hhv. stamme 1063, 27273 og 20016.

Eksempel II

Antibiotikumets karakteristika

Reuterinproduksjon oppstår i fravær av en pH-endring i dyrkingsmediet og i nærvær av eksogent tilsatt katalase. Dets antimikrobielle aktivitet er derfor ikke forbundet med velkjente sluttprodukter i melkesyrefermentasjoner, slik som melke- og eddiksyre eller hydrogenperoksyd, eller med andre sure stoffer funnet av andre (24, 25). Reuterin forblir i dyrkingsvæsken etter fjerning av cellene ved sentrifugering eller filtrering. Reuterin kan separeres fra dyrkingsmediet og renses ved hjelp av HPLC under anvendelse av vann (avionisert) eller 10 mM H2SO4som oppløsningsmiddelsystemer, og C-18 fast fase-kolonner. Reuterin og andre produkter som er til stede, påvises under HPLC ved å bruke et detektor-system for brytningsindeks (RI). En RI-topp som utviser MIC-aktivitet elueres i dette system mellom glyserol og 1,3-propandiol. Når -^C- (enhetlig merket) glyserol anvendes i det reuterinproduserende system, er det reuterin som utvinnes ved hjelp av HPLC,<14>C-merket, noe som viser at dette stoff er (i det minste delvis) et vannoppløselig derivat av glyserol.

Eksempel III

Antimikrobiell aktivitet

Reuterin er et bredspektret antimikrobemiddel. Reuterin virker som et bakteriedrepende middel. Produksjon av reuterin og bevis for deres kraftige bakteriedrepende aktivitet er begge klart demonstrert ved hjelp av dataene som er oppsummert i figur 5. De angitte konsentrasjoner (CFU pr. ml) av E. coli (heltrukne linjer) og L. reuteri 1063 (prikkede linjer) ble inokulert (nulltid) i glyserol-kasein-hydrolysatmediet beskrevet ovenfor (o), det samme medium minus citrat (•) og det samme medium minus glyserol (X). Samkulturene ble inkubert semianaerobt (stillestående kultur) ved 37°C med prøver fjernet ved de angitte inter-valler for å bestemme antallene (CFU pr. ml) av E. coli og L. reuteri som er til stede. Det kan ses av disse data at når glyserol var til stede, ble det produsert et stoff i løpet av de første 3-4 timer som resulterte i en 7-8 log reduksjon i levedyktige celler av E. coli i løpet av de neste få timer. Alle gramnegative bakterieslekter testet så langt ( Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus og Pseudo-monas), og alle grampositive slekter testet ( Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, Leuconostoc og Lactobacillus ) er følsomme for reuterin. Noe høyere konsentrasjoner av reuterin er imidlertid påkrevet for å drepe representanter for de sistnevnte tre slekter. En lavere eukaryot, gjæren Saccharomyces cerevisiae, drepes også av reuterin. Disse oppdagelser er oppsummert i tabell 6. I denne tabellen er det også vist evnen til forskjellige testede arter når det gjelder å stimulere reuterinproduksjon ved hjelp av den heterologe fremgangsmåte. Det legges også merke til at L. reuteri selv er følsom for reuterin dersom den eksponeres for konsentrasjoner på 32 MIC-enheter eller mer. Vi har også data som viser at reuterin (ved en sluttkonsentrasjon på omtrent 20 MIC-enheter ml-<1>) inhiberer in vitro vekst av protozoparasitten som forårsaker Chagas sykdom, Trypanosoma cruzi. Mens kontrollkulturer utviste normal vekst og oppførsel, mistet reuterinbehandlede celler bevegelighet og evne til å dele seg og oppviste morfologisk "samling i en rund masse", noe som indikerer tap av leve-dyktighet .

Eksempel IV

Antivirus- aktivitet

Reuterin er også effektiv når det gjelder å forhindre virusreplikasjon. Figur 13 viser resultatene av forsøk hvor 0-50 enheter pr. ml reuterin ble tilsatt til voksende bakterieceller enten av Escherichia coli eller Lactobacillus plantarum infisert med bakterievirus (hhv. lambdafag og fag 8014-B2). Det synes fra foreløpige resultater med<14>C-merket glyserol som om 4 ug reuterin i 0,5 ml oppløsning er omtrent ekvivalent med 1 enhet reuterin. Etter 4 timer ble antallet kolonidannende enheter (CFU-er) av vertcellen og antallet

plakkdannende enheter (PFU-er) av virusene analysert ved å bruke standard mikrobiologiske teknikker. Uten noe reuterin

tilsatt hadde antallet mikrobielle celler økt ca. 100 ganger i løpet av det 4 timer lange tidsrom. Med E. coli forårsaket tilsetning av 10 enheter reuterin en omtrentlig 100 ganger reduksjon i antallet celler, og mer enn 1000 ganger reduksjon i antallet PFU-er av lambdafagen sammenlignet med den reuterinfrie kontrollkultur etter inkubasjon i 4 timer. Selv om Lactobacillus-CFU- og Lactobacillus-PFU-reduksjoner på grunn av reuterin var mindre bemerkelsesverdige og krevde høyere reuterinkonsentrasjoner enn med E. coli, ble et lignende mønster med til og med større fall i PFU-ene enn i CFU-ene observert ved reuterinmengder på 25 enheter eller mer. Disse resultatene viser at reuterin er effektiv når det gjelder å inhibere virusproduksjon, og denne effektivi-tet går ut over virkningen av reuterin på bakterievert-cellene.

Eksempel V

Probiotisk aktivitet

Når svin fores med Lactobacillus reuteri, er den i stand til å kolonisere deres mage- og tarmsystem. I preliminære forsøk ble celler av L. reuteri 1063 ved konsentrasjoner som varierte fra IO<8>til 10<10>CFU pr. dyr, tatt med i diettene til nyfødte grisunger, og levedyktige celler av L. reuteri 1063 ble utvunnet fra avføringene til disse dyrene. Disse inokuleringer av L. reuteri hadde ingen ugunstige virkninger på dyrene.

Forsøk under anvendelse av enten voksne griser, grisunger (mindre enn 5 dager gamle) eller gnotobiotiske grisunger ble utført, hvor dyrene ble foret med store mengder celler (ca. IO<9>celler) av L. reuteri-stamme 1063. Etter 5-7 dager ble fortsatt tilstrekkelige mengder celler av L. reuteri utvunnet fra dyrenes avføring, noe som viser at L. reuteri overlevde passering gjennom mage- og tarmsystemet og forble i dyret tilstrekkelig lenge til å indikere at koloni-sering har oppstått, og at reuterin kan produseres. Reuterinproduksjon ved hjelp av L. reuteri-stamme 1063 ville forventes i miljøet i mage- og tarmsystemet, idet dette systemet er det miljø hvorfra stammen av L. reuteri opp- rinnelig ble isolert. Visse mediumbestanddeler eller andre stoffer, slik som glyserol, som bidrar til reuterinproduksjon av L. reuteri, kan tilsettes til dyreforet for å optimalisere betingelsene for reuterinproduksjon i mage- og tarmsystemet. Stammer av Lactobacillus reuteri isolert fra flere forskjellige arter av dyr, inkludert fugler (uttrykket "dyr" omfatter klart mennesker og fugler), kan gis som for i store mengder til dyreartene hvorfra stammene ble isolert, eller til dyr av andre arter enn den hvorfra de ble isolert.

Eksempel VI

Inhibering av ribonukleotidreduktase

Reuterin inhiberer ribonukleotidreduktase, det første trinn i deoksyribonukleinsyre-syntesen (DNA). I naturen er det bare ett spor for deoksyribonukleotid-syntese, nemlig den direkte reduksjon av de tilsvarende ribonukleotider. Deoksyribonukleotider er svært spesialiserte metabolitter og tjener bare som byggeblokker for DNA. Enzymet som kata-lyserer reduksjonen av ribonukleotider til deoksyribonukleotider, er ribonukleotidreduktase. Denne reduksjon er det første nødvendige trinn i DNA-syntese og spiller derved en vesentlig rolle for vekst og formering av prokaryote og eukaryote celler og virus.

Beviset for at reuterin inhiberer aktivitet av ribonukleotidreduktase (EC 1.17.4) ble oppnådd ved å bruke fremgangsmåten beskrevet av Thelander, sjøberg og Eriksson i Methods in Enzymology (volum LI), s. 227-237, 1978. Rensede Bl- og B2-underenheter av enzymet, kodet for av nrdA- og nrdB-genene, ble brukt, og den spektrofotometriske analyse ble anvendt som beskrevet av forfatterne ovenfor. I korte trekk er denne fremgangsmåte som følger: Enzymet ble inkubert ved 25°C i en reaksjonsblanding som inneholdt 200 nmol ATP, 1,6 umol MgCl2, 80 nmol NADPPH, 5 umol N-2-hydroksyetyl-piperazin-N'2-estansulfonsyre-buffer (pH 7,6), 300 pmol tioredoxin, 40 pmol tioredoxin-reduktase, 10 nmol EDTA og 65 nmol ditiotreitol i et sluttvolum på 0,13 ml. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 75 nmol CDP, og oksydasjonen av NADPH ble overvåket ved 340 nm med et Zeiss spektrofotometer med automatisk måling, utstyrt med mikro-kyvetter. Før tilsetning av CDP ble bakgrunnsoksydasjonen av NADPH målt, og denne bakgrunnsverdi ble trukket fra NADPH-oksydasjonen som ble observert etter tilsetning av

CDP.

Det reuterin som ble anvendt i disse testene, ble fremstilt ved hjelp av den homologe fremgangsmåte og inneholdt 256 MIC-enheter aktivitet pr. ml. Ufortynnet og forskjellige fortynninger av reuterin ble tilsatt (i 1 y.1 mengder) til reaksjonsblandingen for å bestemme effekten av dette stoff på ribonukleotidreduktase-aktivitet. Resultatene av dette forsøk er oppsummert i tabell 7. De viser at reuterin er en effektiv inhibitor for Bl-underenheten av dette enzym. Det ble også lagt merke til at tioredoxin (påkrevet for enzymaktivitet) også var følsom for reuterin.

Reuterins evne til å inhibere vekst av bakterier, gjær, sopper, protozoer, virus og neoplastiske og normale dyreceller, kan således i det minste delvis tilskrives dets evne til å inhibere DNA-syntese ved å inhibere de novo produksjon av deoksyribonukleotider.

Eksempel VII

Reuterin er et effektivt konserveringsmiddel for mat

Oppmalt oksekjøtt levert fra et lokalt supermarked ble oppdelt i fire porsjoner. Én porsjon var ubehandlet. De øvrige ble behandlet med 10, 50 og 100 enheter reuterin pr. gram kjøtt. Alle prøvene ble lagret ved 4°C/og prøver ble tatt ved de angitte dager for bakteriologisk analyse.

Oksekjøttprøver ble fjernet og fortynnet 1:10 (1 g oksekjøtt:9 ml steril H2O). Etterfølgende desimalfortyn-ninger ble gjort etter behov, og prøver ble platet ut på Difco næringsagar. Disse prøvene ble inkubert ved 27°C i 24 timer og tellet som kolonidannende enheter pr. gram oppdelt oksekjøtt (CFU/g). Dataene viser at reuterin signi-

fikant reduserte CFU/g (figur 14)

kontroll; 10 enheter reuterin; 50 enheter reuterin; og

100 enheter reuterin). Ved de høyere reuterinnivåer (50 og 100 enheter pr. g) ble den opprinnelige populasjon av

bakterier redusert og forble mer enn 4 log-enheter lavere enn kontrollprøven gjennom den 6 dager lange testperioden.

Oppmalt oksekjøtt levert fra et lokalt supermarked ble grundig inokulert og blandet med omtrent IO<5>CFU/ml celler av E. coli K12. Etter blanding ble materialet oppdelt i to porsjoner. Én porsjon var en ubehandlet kontroll (ingen reuterin), den andre porsjon mottok 75 enheter (U) reuterin pr. gram oksekjøtt. Prøver ble lagret ved 4°C, idet porsjoner ble fjernet ved angitte tidspunkter for bakterio-logiske analyser. I dette forsøket ble bestemmelsen av levedyktige celler (CFU/g oksekjøtt) utført som beskrevet for figur 14, bortsett fra at Difco McConkeys agar (forholdsvis spesifikk for koliformlignende bakterier) ble

brukt. Det kan ses av figur 15

kontroll; 75 enheter reuterin) at reuterin reduserte startpopulasjonen av bakterier og holdt disse antall lave gjennom den 9 dager lange inkubasjonsperioden.

Eksempel VIII

Lactobacillus reuteri pluss glyserol utgjør en ny effektiv matkonserveringsprosess. Bevis for dette ble oppnådd ved å bruke lagring av fisk som et modellsystem. Denne undersøkelse ble utført på følgende måte: Fiskefileter (sild, Clupea harengas) ble dyppet i den følgende behand-lingsoppløsning:

kontroll: ingen behandling

glyserol: 250 nM glyseroloppløsning stamme 1068: 250 mM glyseroloppløsning som inneholdt 4 x IO<9>CFU pr. ml L. reuteri 1068 (en ikke-reuterinproduserende stamme)

stamme 1063: 250 mM glyseroloppløsning inneholdende 4

x IO<9>CFU pr. ml L. reuteri 1063.

Filetene (to parallelle prøver hver) ble holdt i store Petri-skåler ved 80°C i 4 dager i et kjøleskap. Ammoniakk-innholdet og CFU av relevante bakterier (dvs. forråtnelsespseudomonader og tilsatte laktobasiller) ble så analysert for å evaluere holdbarhetstiden til matproduktet. Resultatene oppsummert i tabell 8 indikerer: (i) de tilsatte laktobasiller (tellet som totalt antall laktobasiller under anvendelse av glukose- Lactobacillus-seleksjonsmedium, beskrevet tidligere) og CFU for L. reuteri (tellet som totalt antall heterofermentative laktobasiller påvist ved å bruke L-arabinose- Lactobacillus-seleksjonsmedium) overlever godt ved 80°C, men formerer seg ikke i noen betydelig utstrekning. (ii) L. reuteri 1063 retarderte signifikant vekst av forråtnelsespseudomonader. L. reuteri 1068 gjorde dette i en viss utstrekning, men ikke tilstrekkelig til å forhindre forråtnelse, noe som er generelt indikert ved en log 8,4 pseudomonadtelling. (iii) den retarderende effekt av L. reuteri og glyserol på forråtnelsesbakterier har en sterkt reduserende effekt på ammoniakkfrigjørelse. (iv) en matkonserverende effekt av L. reuteri pluss glyserol er indikert for alle typer matforråtnelse.

Eksempel IX

Reuterin er et produkt av glyserolfermentering

Reuterin er et nytt produkt forbundet med den samme type heterolaktisk fermentering av glyserol som opptrer i andre Lactobacillus-arter♦ Reuterin kan isoleres og identifiseres som et produkt av glyserolfermentering ved hjelp av L. reuteri under anvendelse av HPLC. Glyserol, 1,3-propandiol og p-hydroksypropionsyre (alle rene kommersielle preparater) ble vist å være i det vesentlige frie for antimikrobiell aktivitet når de ble testet i så høye konsentrasjoner som 0,125 M.

Produksjonen til L. reuteri av reuterin pluss 1,3-propandiol og 3-hydroksypropionsyre under fermenteringen av glyserol ble fastslått ved å bruke HPLC-analyse. Represen-tative data er vist i figur 6. For å fremstille prøven, høstes 1 1 L. reuteri-kultur (dyrket i LCM inneholdende 20 mM glukose ved 37°C i 48 timer) ved sentrifugering, vaskes to ganger med steril natriumfosfatbuffer (pH 7,5) og oppslemmes i 10 ml 0,25 M steril glyserol. Etter 6 timers inkubasjon ved 37°C fjernes cellene ved sentrifugering, og supernatantvæsken (heretter referert til som prøven) analyseres med hensyn på reuterin ved hjelp av MIC-testen beskrevet tidligere, og ved hjelp av HPLC som beskrevet nedenunder. I noen forsøk ble det sammen med de 0,25 M glyserol tatt med 5 y.Curie<14>C(U) glyserol. Prøver ble sendt gjennom et 0,2-0,45 mikrometer bakteriologisk filter og lagret aseptisk ved 2°C før injeksjon i HPLC-apparatet.

HPLC-analysen ble utført på følgende måte: En 20-

100 y.1 fraksjon av hver prøve ble injisert i et Beckman HPLC-apparat utstyrt med en enkelt eller to tandem C-18 analytiske kolonner. Prøvene ble eluert med destillert/avionisert vann sendt gjennom et 0,2-0,45 mikrometer filter. Elueringshastigheter var 1,0-1,5 ml pr. min., og prøvene ble overvåket ved å bruke et Waters 410 differensialrefraktometer. Endringer i brytningsindeks (RI) ble målt automatisk og plottet som RI (ordinat) vs. elueringsvolum/tid (abs-cisse), idet man går fra høyre mot venstre i de viste kurver. Den samlede elueringstid for hver prøve var omtrent 15 min., idet toppene 1, 2 og 3 eluerte ved hhv. omtrent 8,

7 og 6 min.

HPLC-analyser av prøver fremstilt som beskrevet ovenfor og eluert med vann, er vist i figurene 6A-6E. Her er det tatt med prøver fremstilt ved å bruke L. reuteri 1063 ved 128 og 512 MIC-enheter (hhv. kurve 6A og 6B), L. reuteri 20016 (kurve 6C) og L. reuteri ATCC 2727 3 (kurvene 6D og 6E). Bare stoffer betegnet som toppene 1, 2 og 3 ble identifisert i disse elueringer. Toppene 1 og 3 ble identifisert som 1,3-propandiol og glyserol ved å bruke hhv. refe-ransestandarder og IR-spektralidentifisering av de isolerte topper. Under disse betingelser eluerer topp 2 alltid som den karakteristiske brede topp som ses i disse kurvene, og det er det eneste stoff som eluerer fra prøvene som har biologisk aktivitet bestemt under anvendelse av MIC-analysen. Det identifiseres således som det antimikrobielle stoff som kalles reuterin. Tre ytterligere analyser under-støtter den konklusjon at topp 2 er reuterin. For det første øker mengden av materiale som er til stede i topp 2 i direkte forhold til MIC-verdien til den opprinnelige prøve. Dette ses i kurvene 6A og 6B som representerer reuterin produsert av L. reuteri 1063 i prøvene med MIC-tider på hhv. 128 og 512. For det andre produserer alle hittil testede stammer av L. reuteri reuterin bestemt ved MIC-analyse, og i hvert tilfelle er topp 2 til stede (kurvene 6A-6E). Alle andre Lactobacillus-arter testPt hittil, mangler sammenlign-bar biologisk aktivitet (MIC-analyse) og utviser liten eller ingen materiell eluering i området til topp 2 når de analyseres ved hjelp av HPLC. For det tredje er en spontan variant eller mutant av L. reuteri ATCC 27273 blitt isolert og renset. Denne variant produserer betydelig lavere mengder reuterin (bestemt ved hjelp av MIC-analysen), utviser svake til ingen inhiberingssoner i analysen med glyserol/ E. coli-overtrekksplate, og som det ses i kurve 6E, produseres mye mindre av stoffet som eluerer i området til topp 2 sammenlignet med dens opphavsstamme (villtype) (kurve 6D).

Når 0,01 M H2SO4ble brukt som elueringsoppløsnings-middel, ble en (3-hydroksypropionsyre-topp oppløst som det ses i figur 6F. Den anvendte prøve i dette forsøk ble erholdt fra stamme 1063 og hadde 1024 MIC-enheter reuterin. Når<14>C(U)-glyserol ble tatt med i et i det vesentlige identisk forsøk separert ved hjelp av HPLC under anvendelse av 0,01 M H2SO4som oppløsningsmiddel, og samlet opp som separate topper for radioaktivitetsbestemmelser (Packard væskescintillasjonsspektrometer), ble de følgende resultater oppnådd: 25.777, 40.776, 53.228 og 61.428 total cpm ble utvunnet som hhv. p-hydroksypropionsyre (topp 4), 1,3-propandiol (topp 1), reuterin (topp 2) og ubrukt glyserol (topp 3). Disse resultater og analytiske data for reuterin gjengitt nedenunder, indikerer at glyserol fermenteres under disse betingelser i henhold til den følgende reaksjon:

Eksempel X

Preliminær reuterinkarakterisering

Karakteriseringer av reuterin i råpreparater indikerte at det er svært oppløselig i vann, motstandsdyktig overfor nukleaser og proteaser og varmelabilt (100°C i 10 min.), særlig ved pH-verdier på 9,0 eller høyere. Reuterin er klart ikke et bakteriocin. Preliminære analytiske analyser er blitt utført på i det vesentlige rent reuterin (med noe glyserol til stede), isolert ved hjelp av HPLC som beskrevet ovenfor. Prøver ble sendt til Research Triangle Institure (Research Triangle Park, NC) og Department of Chemistry (N.C. State University, Raleigh, NC) for masse-, kjernemagnetisk resonans- og infrarød spektralanalyse. Disse data er oppsummert i figurene 7-11. LCMS-analysene ble utført på et Finnigan 4500 HPLC/MS-system under anvendelse av Vestec "interface". Separasjon ble utført ved å bruke Aminex 87H-kolonnen ved en strømningshastighet for elueringsmiddel på 0,8 ml/min. Massespektra (relativ styrke plottet på ordinat-aksen, masse-til-energi-ladning, m/e-verdi, på abscisse-aksen) for både det positive ion (figur 7) og det negative ion (figur 8) indikerte en molekylvekt på omtrent 162 g pr. mol. Denne foreløpige informasjon sammen med (i) radio-isotopanalysene beskrevet ovenfor og (ii) den iakttakelse at reuterin gir en positiv Schiffs reaksjon (som indikerer tilstedeværelse av en funksjonell aldehydgruppe), indikerte at reuterin har en molekylformel som er CgH^o°5°9den følgende strukturformel:

Den infrarøde spektralanalyse vist i figur 9, spektralanalysen for karbon-kjernemagnetisk resonans (NMR) vist i figur 10 og 250 MHz proton-NMR-analysen vist i figur 11 er i samsvar med denne foreslåtte strukturformel for reuterin. Disse NMR-spektraldata er datamaskinbehandlede plottinger av strålingsabsorpsjon (ordinatakse) i forhold til avsøkning av magnetfelt (abscisseakse). Informasjon vedrørende den nøyaktige struktur ble erholdt når store mengder absolutt rent reuterin ble tilgjengelig.

Basert på den karbohydratlignende struktur for reuterin postulert ut fra de foreløpige data, inkludert et aldehyd-karbonatom på en ende av molekylet og et alkohol-karbonatom i den andre enden, ble eksistensen av dette stoff som et hemiacetal svarende til reaksjon mellom aldehydgruppen og ende-hydroksylgruppen indikert. En tredimensjonal molekylmodell av en slik struktur avslørte et molekyl som har en stor likhet med en pentose, slik som D-ribose.

På dette grunnlag ble det postulert at reuterin kunne være en D-riboseanalog som er i stand til å konkurrere med ribonukleotider for deres ribosegjenkjenningssted(er) på det første enzym som er spesifikt involvert i DNA-syntese, ribonukleotidreduktase. Reuterin kunne således inhibere det første trinn som er spesifikt for DNA-syntese ved å inhibere omdannelsen av ribonukleotider til deoksyribonukleotider. Dersom reuterin var en pentoseanalog og ble bundet til reduktasestedet, ville det forventes å bli bundet fortrinnsvis i hurtigvoksende maligne celler, slik som kreftceller. Disse forslag er i overensstemmelse med (i) den foreslåtte strukturformel for reuterin, (ii) hastigheten hvorved reuterin utøver sin bakteriedrepende virkning (forsøksdata viser inhibering av E. coli-vekst kort tid etter tilsetning av reuterin), og (iii) det faktum at både prokaryoter og eukaryoter ( S. cerevisiae og Trypanosoma cruzi) er følsomme for reuterin. Reuterin kunne således anses for å være et antisopp-, antiparasitt-, antivirus- og antikreftmiddel samt et antibakterielt middel.

Eksempel XI

Fremstilling av renset reuterin for kjemisk analyse

Et 1 % inokulum av en kultur av Lactobacillus reuteri 1063 (1) som hadde stått over natten, ble dyrket i modi fisert Lactobacillus-bærende medium med glukose (LCMG) i 24 timer. Modifisert LCMG består av følgende pr. liter oppløsning: 5 g gjærekstrakt, 10 g tryptikase, 3 g tryptose,

3 g kaliumfosfat (enbasisk), 3 g kaliumfosfat (tobasisk),

2 g ammoniumcitrat, 1,15 g natriumacetat•3 H20, 5 mg magnesiumsulfat«7 H2O, 0,31 mg mangan(II)sulfat, 0,2 mg jern(II)sulfat«7 H20 og 0,5 mg L-askorbinsyre. Dette medium ble så autoklavert, og 10 ml filtersterilisert 2 M glukose ble tilsatt til det avkjølte medium. Celler av L. reuteri ble høstet ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 min. og vasket to ganger med 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,5). Etter vasking ble L. reuteri oppslemmet til en konsentrasjon på 10 mg celler/ml avionisert vann. Steril glyserol ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 250 mM var nådd. Denne cellesuspensjon ble så inkubert ved 37°C i 3 timer for å produsere og akkumulere reuterin. Celler ble så pelletert • ved 4000 x g i 10 min. og kassert. Supernatantvæsken ble filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter ("Acrodisc") for å fjerne gjenværende celler og deretter brukt til isolering av reuterin.

Rensingen av reuterin ble utført ved å bruke en 1 x 30 cm glasskolonne pakket med AG 50 W, 8 % kryssbundet,

-5-400 mesh harpiks fra Biorad. Et oppløsningsmiddel sammen-satt av 60 % acetonitril/40 % destillert avionisert vann som inneholdt 1,1 g trifluoreddiksyre pr. liter, ble levert via en Beckman 110 A HPLC-pumpe. Strømningshastigheten til

oppløsningsmidlet var 1,5 ml/min., og påvisning ble utført med et Waters 410 differensialrefraktometer under anvendelse av en følsomhet på 2 ganger og en skalafaktor på 5. 400 y.1 supernatantvæske ble injisert under anvendelse av en Altex 210 injektor med en 500 y.1 prøve-"loop", og fraksjoner ble samlet opp manuelt. Fraksjoner ble så rotasjonsinndampet under avsugning ved omgivelsestemperatur for å fjerne acetonitril. Prøver ble deretter lyofilisert til tørrhet under anvendelse av et Virtis 10-030 lyofiliseringsapparat. Renhet ble fastlagt ved å sende porsjoner av fraksjonene gjennom en Aminex 87H analytisk kolonne.

Den første av to fraksjoner eluerte fra kolonnen etter 15 og 19 min., og reuterin ble funnet å være til stede i den første topp. Den andre fraksjon hadde en elueringstid på omtrent 19 min. Frontdelen av den reuterinholdige fraksjon inneholdt en tung skulder, som ble antatt å være (3-hydroksypropionsyre, og ble derfor ikke samlet opp. Midtdelen av reuterintoppen ble samlet opp og tørket ved rotasjons-inndampning etterfulgt av lyofilisering. Denne fremgangsmåte gav en vannhvit, viskøs væske som, når den ble rekromato-grafert under analytiske betingelser under anvendelse av en Aminex 87H-kolonne, gav en enkelt topp som koeluerte med aktivitetstoppen. Den oppsamlede fraksjon inneholdt også bakteriedrepende aktivitet bestemt ved hjelp av MIC-analyse. Ingen andre oppsamlede fraksjoner utviste bakteriedrepende aktivitet. Den rensede fraksjon ble også underkastet analyse med hensyn på tilstedeværelse av proteiner under anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse. Tilstedeværelsen av protein kunne ikke påvises.

Eksempel XII

Fourier transform infrarød analyse av renset reuterin

Reuterin ble underkastet Fourier transform infrarød

analyse (FTIR) for å bestemme de kjemiske grupper som er til stede i molekylet. Prøvene ble analysert på en Perkin Eimer 1550 FTIR med en Perkin Eimer 7500 datastasjon. De oppnådde resultater er vist i figur 16. Det kan ses at molekylet

inneholdt hydroksylgrupper utledet ved tilstedeværelsen av et stort C-O-strekkbånd ved 1050-1150 cm"<1>og et bredt O-H-strekkbånd ved 3450 cm"<1>. En C-dobbeltbinding-D-strekk som gir indikasjon på aldehyder, ble observert ved 1730 cm"<1>. Typiske alkan-C-H-strekk var til stede ved 2880 og

1380 cm"<1>.

Eksempel XIII

Væskekromatografi/ massespektrometri

Analyse av LC-separasjon av renset reuterin ble utført på en Aminex 87H analytisk kolonne med en strømningshastig-het på 0,8 ml/min. av 65 % destillert avionisert vann og 35 % acetonitril inneholdende 1,0 g konsentrert svovelsyre pr. liter. Strømmen av oppløsningsmiddel ble blandet med 0,3 M ammoniumacetat etter kolonnen og innført via et Vestec "interface" i et Finnigan 4500 HPLC/MS-system. Positiv ion-påvisning ble utført med en fordampningstemperatur på 210°C og en kildetemperatur på 250°C. Elektronenergien til kilden var 1000 eV.

LC/MS-analyser ble utført på reuterin med tilsetning av ammoniumacetat etter kolonnen. Grunntoppen oppstod ved 166 M/E-enheter, slik det er angitt ved dataene vist i figur 17. Dette ion ble fortolket til å være ammoniumadduktet av det molekylære ion. Dette ville indikere en molekylvekt på 148 som svarer til molekylvekten til reuterin. Signalet ved 148 ble forutsagt å være et tap av vann fra adduktionet, og signalet ved 130 representerte adduktionet med tap av to molekyler vann. Signalet som er til stede ved 101, ble antatt å skrive seg fra bakgrunnseffektene av oppløsnings-middel.

Eksempel XIV

Kjernemagnetisk resonansspektroskopi av renset reuterin

Proton- og karbon-NMR-undersøkelser ble utført både i deuteriumoksyd og deuterert metanol fra Aldrich. Proton-NMR ble utført på en Bruker WM 250 FTNMR drevet ved 250 MHz. Spektra av karbon 13 ble generert på en IBM NR-100 AF FTNMR drevet ved 25 MHz med en superledende magnet. Databearbeid-ing ble utført på et Aspect 3000. I NMR-undersøkelsene i deuteriumoksyd hadde NMR-spektra for karbon 13 seks signaler ved kjemiske skift på 40,1, 46,3, 56,2, 58,7, 89,7 og 207,7 ppm. Signalet ved 207,7 ppm ble fortolket som et aldehyd-karbon, signalene ved 89, 58 og 56 ppm som oksygenbundet, og signalene ved 46 og 40 ppm som alifatiske rester.

Karbon- og protonspektraene er vist i figurene 18 og 19. Frakobling samt signal-oppsplittingsmønsteret førte til det opprinnelige forslaget til strukturen vist i figur 20. Protonsignalet ved 9,5 ppm (karbon 1) ble funnet å bli påvirket når signalet ved 2,6 ppm (karbon 2) var mettet. Protoner forbundet med karbon 2 delte seg i det som viste seg å være en triplett, men som etter nøye undersøkelse i virkeligheten ble sett på som en sekstett (triplett-splitt ved ikke-ekvivalent proton på karbon 1). Koblingsmønsteret til protoner på karbon 2 ble funnet å være endret ved metning av signaler ved 9,5 og 3,7 ppm (karbonene 1 og 3) og ble derfor forutsagt å foreligge ved siden av både karbonatomene 1 og 3. Splittingsmønsteret til signalet ved 3,7 ppm (karbon 3) er en triplett og ble påvirket ved metning av signalet ved 2,6 ppm. Disse mønstre passer til den forutsagte struktur foreslått for karbonatomene 1, 2 og 3 som CHO-CH2-CH2-0-R.

Protonsignalet ved 5,0 ppm (karbon 4) fremkom som en triplett og ble påvirket bare ved metning av signalet ved 1,6 ppm. Metning av signaler ved 5,0 og 3,5 ppm førte til endringer i splittingsmønsteret ved 1,6 ppm (karbon 5). Protonene på karbon 5 har et komplisert splittingsmønster som ble fastlagt som en kvartett. Protoner som gir opphav til tripletten ved 3,5 ppm (karbon 6), ble påvirket bare ved metning av signalet ved 1,6 ppm (karbon 5). Signalmønsteret og data for kjemiske skift for denne halvdelen av reuterin førte til forutsigelse av strukturen R-O-CHOH-CH2-CH2-OH forbundet med karbonatomene 4, 5 og 6. Hemiacetaloksygenet som er til stede i midten av molekylet (figur 20), ville forhindre kobling av de to halvdelene slik de ble observert. Protonkjemiske skift av den forutsagte struktur passer til kjente verdier.

Bredden av signalene ved 1,7, 3,6 og 5,0 ppm for-hindret beregning av området under hver topp brukt til å bestemme antallet protoner som gir opphav til hvert signal. Slik bredde kan være resultatet av beslektede eller skiftende former av molekylet som foreligger i likevekt når vann anvendes som oppløsningsmiddel.

Signalmønsteret til reuterin i deuterert metanol var klart forskjellig fra det som ble observert i deuteriumoksyd. Karbon-13-mønsteret inneholdt bare tre signalsett ved 36,8, 58,9 og 103,9 ppm. Karbon-13-signaler rundt 104 ppm var blitt observert i slike disakkarider som laktose for karbonatomet vist nedenunder:

Protonspektraene bestemt i deuterert metanol inneholdt altså tre sett signaler som oppstår rundt 1,8, 3,6 og 4,5 ppm med et forhold mellom topparealer på hhv. 2:2:1. Karbon-13- og protonspektraene er vist hhv. i figur 21 og 22. Et hydrogenforhold på 2:2:1 ble foreslått på grunn av de relative topparealer i protonspektraene. Protonsignalet som var til stede ved 1,8 ppm, foreligger som en kvartett, og koblingsundersøkelser indikerte dets tilstedeværelse ved siden av karbonatomene med protoner som gir signaler som oppstår ved 3,6 og 4,5 ppm. Signaler funnet ved 3,6 og 4,5 ppm foreligger begge som tripletter, og koblingsforsøk gir bare reaksjon med protoner med et signal på 1,8 ppm. Strukturen vist i figur 23 ble foreslått å svare til dette sett av data (inkludert karbon-13-signalet som er karakter-istisk for disakkarider).

Eksempel XV

Gasskromatografi/ massespektrometri av renset reuterin

Trimetylsilering ble utført med N,0-bis(trimetyl-silyl)trifluoracetamid (BSTFA). 2 ml uren reuterinekstrakt ble renset ved hjelp av semipreparativ kromatografi som beskrevet ovenfor og lyofilisert til tørrhet. 1 ml BSTFA ble tilsatt til det lyofiliserte reuterin, og silaniserings-reaksjonen ble utført ved omgivelsestemperatur. Prøven ble forsiktig ristet for hånd i 5 min. inntil en hvit utfelling ble påvist. Akkurat tilstrekkelig acetonitril av HPLC-finhetsgrad ble tilsatt for å oppløse utfellingen. Prøven ble så gjennomboblet med nitrogen, forseglet i en flaske med

skrukork og sendt til gasskromatografi/massespektrometri.

En Hewlett-Packard 59858 GC/MS ble brukt i undersøkel-ser vedrørende silylerte reuterinderivater. GC-betingelser var en strømningshastighet på 1,1 ml/min. og en injeksjons-temperatur på 280°C. Programmet som ble brukt for analyse, bestod av en innledende tilbakeholdelsesperiode i 3 min. ved 40°C med en økning til 260°C ved 6°C pr. min. Den kolonne som ble valgt til å bevirke separasjon, var en 15 M DBS sammensmeltet silika-kapillærkolonne. Masseområdet var 40-400, en ionekildetemperatur på 200°C, elektronenergi på 70 eV, ionisering ved elektronkollisjon med splittfri injeksjon og en splittid på 0,8 min.

Reuterin ble funnet å være ustabilt ved de høye temperaturer som er til stede i GC-injektoren. Et stabilt reuterinderivat ble fremstilt etter silanisering med BSTFA ved omgivelsestemperaturer. Kromatografi av den derivatiserte prøve gav et komplekst GC-spor (data ikke vist), men forbindelser med en tilsynelatende molekylvekt på 292 (148 pluss 2 trimetylsilylgrupper) ble funnet ved retensjonstider på mellom 9 og 14 min. To topper ble identifisert som mulige isomerer (retensjonstid 11,7 og 13,3 min.). Et monosilylert derivat ble oppdaget ved en retensjonstid på 9,3 min., og dets spekter er vist i figur 24. Fragmenteringsmønsteret til denne forbindelse består av signaler ved 205, 177, 163, 147, 130 og 115 M/E-enheter. Et reuterinmolekyl som inneholder én TMS-gruppe (molekylvekt = 220) kunne gjennomgå tap av en metylgruppe, slik at det fås en M/E-verdi på 205. Fragmentet ved 147 enheter kunne muligens ha kommet fra tapet av TMS-gruppen, men mønsteret til fragmenter rundt M/E på 147 indikerte tilstedeværelsen av de naturlig forekommende silisium-, karbon- og oksygenisotoper. Nærmere bestemt var forholdet mellom fragmentioner ved 147:148:149 M/E-enhetene 100:16:9, nøyaktig det som ville bli forutsett for et molekyl med sammensetningen CgH^C^Si. Dette fragmentet ble fortolket til å ha den strukturformel som er vist i figur 25, og ikke som et reuterinmolekyl som hadde tapt TMS-gruppen. Sterke signaler ved M/E 219 og 189 som er til stede i spektraene til isomerer av derivatiserte molekyler,

inneholder to TMS-grupper som eluerer ved 11,7 og 13,3 min.

(data ikke vist). Illustrasjoner av fragmenter som oppfyller M/E-data samt strukturell detalj bestemt ved hjelp av NMR-undersøkelser, er vist i figur 27.

Basert på FTIR- og LCMS-dataene (figurene 16 og 17) til renset reuterin, fikk reuterin fastsatt en molekylvekt på 148, inneholdende både hydroksyl- og aldehydgrupper. Disse antakelser passer godt med NMR-data (prøver i D2O).

En molekylformel som er C6H12°4'oa strukturformelen vist i figur 20, ble foreslått. Det var imidlertid klart at visse revisjoner var påkrevet når NMR-undersøkelser av reuterin ble utført i deuterert metanol. Dataene i dette tilfelle betyr at molekylet bare hadde tre karbonatomer eller var symmetrisk rundt en akse (dvs. 2x3=6). To mulige systemer ble foreslått for å forklare disse data (figur 26).

System A ville kreve dannelse av en andre hemiacetal-binding mellom aldehydgruppen og hydroksylgruppen. Den endelige struktur ville så foreligge som en 8-ring, hvor begge halvdelene ville være symmetriske. Denne foreslåtte struktur passer ikke godt til karbonsignalet som er til stede ved 207 ppm når reuterin analyseres i deuterert metanol. Strukturen passer til splittende mønstre, propor-sjonalitet av tilstedeværende protoner (2:2:1-forhold mellom hydrogenatomer på karbonatomer) og kjemiske skift observert for protonspekteret i metanol. Hemiacetalene ville være frie til å åpnes og lukkes igjen i nærvær av vann (svært likt sukkeret som gjennomgår mutarotasjon over tid), og et antall former kunne være til stede på ethvert tidspunkt i en reuterinprøve. Dette kan føre til de brede toppene observert i D20-spektraene og mangelen på nøyaktig integrering av signaler.

System B ville utvikles gjennom en strukturelt mer favorisert 6-ring og ville, sammenkoblet med tap av vann, foreligge som en bicyklisk ring i metanol. Dette molekylet ville også ha den nødvendige symmetri til å forklare NMR-spekteret observert i metanol. Dessuten ville denne struktur omfatte et karbonatom som ville gi et signal ved 104 ppm i et karbon-13-spekter. Kjemiske skift og splittingsmønstre funnet i protonspekteret (kjørt i D20), ville passe til den foreslåtte 6-ringstruktur, og åpning av hemiacetalet ville gi en lignende situasjon som den som er beskrevet ovenfor, nemlig eksistens av multiple former av reuterin som fører til kompliserte spektra.

Nærmere gransking av protonspekteret til reuterin kjørt i D20 (figur 19) gir informasjon som favoriserer system B (figur 26). Reuterinformen med rett kjede kunne tilskrives signalene som er til stede ved kjemiske skift på 1,6, 2,6, 3,5, 3,7, 5,0 og 9,5 ppm. Arealforholdet mellom disse signalene er klart ikke ekvivalent med forholdet mellom hydrogenatomer i molekylet (dvs. 1:2:2:1:2:2 for karbon 1-6). Dersom den cykliske form også var til stede i en likevektskonsentrasjon med den rettkjedede form, ville protoner på karbonatomene 1 og 4 i ringen foreligge i et miljø som er svært forskjellig fra miljøet til de samme protonene i kjedeformen. Dette ville gi opphav til et nytt kjemisk skift for disse protonene. Omgivelsene til protonene på karbonatomene 3, 5 og 6 ville være forholdsvis konstante i begge formene, og signalene ville ikke forventes å skifte vesentlig. Som forventet er signalene fra protonene på karbonatomene 3, 5 og 6 brede og utviser betydelig avvik fra forventede verdier for arealintegrasjon. Utvikling av svake signalmønstre rundt 5 ppm oppstår på grunn av protoner fra forutsagte ringkarbonatomer med to oksygenatomer bundet. Tilstedeværelsen av to former av reuterin når det er i en vandig oppløsning, taler for det observerte protonspekter, mens svak irreversibel nedbrytning av reuterin til to molekyler (3-hydroksypropionaldehyd også ville forklare protonspektraene.

Massespektraene som ble oppnådd fra silylaniserte prøver gav et annet detaljnivå for strukturen til reuterin når de ble betraktet sammen med dataene som ble oppnådd fra NMR-undersøkelser. Signaler som var til stede ved M/E 147 representerer fragmenter som kunne forutsis ut fra enhver av de strukturene som er vist i systemene A og B (figur 26). Fragmentet observert ved M/E 177 skulle imidlertid ikke være til stede i fragmenteringen av 8-ringen eller den rette kjede. Likeledes ville signalet ved M/E 163 ikke bli forutsagt for disse molekylene. Fragmentene ved M/E 177 og 163 er mulige dersom 6-ringen anvendes som opphavsmolekylet. Figur 27 viser nærmere den foreslåtte fragmentering av den silaniserte 6-ring som passer til dataene frembrakt ved GCMS-analyse.

Alle observerte M/E-signaler kan tilskrives enten et fragment av -CH2-CH2-O-TMS-halrn eller et fragment av 6-ringen. Fragmentet i M/E 147 kunne dessuten være dannet fra et antall forskjellige fragmenteringer, hvorav hvilken som helst inneholder tre basiskarbonatomer, ett oksygenatom og -O-TMS-gruppen. Dette punktet er viktig fordi signalene fra fragmentene i M/E 147 er sterke i spektraene til begge de forutsagte isomerer (samt det monosilylerte molekyl) som ble separert ved hjelp av GC, noe som indikerer at begge iso-merene gir de samme fragmenteringer av basisringen (dvs. har lignende struktur).

Basert på de data som er samlet hittil, er den mest sannsynlige strukturformel for reuterin den som er gjengitt i figur 28. Når reuterin er til stede i en vandig opp-løsning, må det foreligge i likevekt med den åpne kjede (basert på NMR-resultater), mens når det er derivatisert med BSTFA, er det utelukkende låst i ringformen (GCMS-under-søkelser). Proton-NMR-undersøkeIser av reuterins struktur i aceton faller sammen med data samlet opp når reuterin ble oppløst i vann (data ikke vist). Ytterligere NMR-analyse av reuterin oppløst i en 50/50 blanding av metanol og vann gav lignende resultater som de metanolresultatene som er frem-lagt ovenfor. Ytterligere analyse av former som dominerer i metanol, er påkrevet for å bekrefte teorien om den bicyk-liske struktur. I tillegg er organisk syntese av reuterin (ettersom dens struktur er forutsagt) og etterfølgende strukturanalyse den eneste absolutt sikre fremgangsmåte for å bekrefte vår strukturhypotese.

Granskninger i litteraturen etter at strukturformelen til reuterin var belyst, avslørte at en forbindelse med de samme kjemiske bestanddelene som reuterin var til stede i sur oppløsning etter hydratisering av akrolein (29). Det var også tidligere blitt beskrevet som destillatet fra en fremstilling av p-hydroksypropaldehyd med navnet 4-hydroksy-2-2'-hydroksyetyl-1:3-dioksan (30).

Når 4-hydroksy-2-2'-hydroksyetyl-1:3-dioksan ble syntetisert i vårt laboratorium som beskrevet av Hall (30), eluerte det ved den samme HPLC-topp som reuterin og utviste en identisk MIC-verdi som det biologisk syntetiserte reuterin. Strukturformelen vist i figur 27 er derfor formelen til reuterin.

p-hydroksypropaldehyd (også kalt: 3-hydroksypropanal, hydrakraldehyd, (3-hydroksypropionaldehyd, 3-hydroksypropan-1-al) har stor potensiell verdi innenfor oppløsningsmiddel-eller mykningsmiddelområdet (Hall, R.H. og Stern, E.S., Journal Chemical Society, jan.- mars, 1950, s. 490-498). Det er blitt bekreftet at det dimere hydroksypropaldehyd (dvs. reuterin eller 4-hydroksy-2-2'-hydroksyetyl-1:3-dioksan) og det monomere (3-hydroksypropaldehyd er i likevekt i oppløsning (ibid). Den biologiske fremstilling av reuterin fra glyserol ved hjelp av L. reuteri utgjør derfor en ny fremgangsmåte for dannelse av monomeren (0-hydroksypropaldehyd ), samt den dimere form av dette stoff.

L. reuteri/ reuterin- systemet: en regulator for enteriske mikrobiotiske populasjoner

Oppdagelsen av dette system har ført til en ny begrepsmodell som beskriver hvordan mikrobiotiske populasjoner kan reguleres i mage- og tarmsystemene til dyr. Denne modellen er illustrert i de fire delene av figur 12.

I fase 1 inneholder et tarmsegment hypotetiske bakterier

(artene A og B), og L. reuteri (R) foreligger i en tilstand av populasjonshomeostase. I løpet av fase 2 registreres en økning i populasjonen av en heterolog mikrobe (organisme A i dette tilfelle) (ved hjelp av en ukjent celle-til-celle-kontaktmekanisme) av de hjemmehørende celler av L. reuteri. I fase 3 i nærvær av glyserol (eller glyseraldehyd), antakelig tilgjengelig via pancreatis og/eller mikrobiell lipolytisk aktivitet, syntetiseres reuterin. Den bakteriedrepende virkning av reuterin reduserer den mikrobielle

tarmpopulasjon i fase 4, og populasjonshomeostasen i fase 1 gjenopprettes. Denne modellen foreslår at feedback-regu-leringsprinsippet som virker så effektivt på det metabolske nivå, kan virke på et cellulært nivå for opprettholdelsen av tarmpopulasjonshomeostase.

Som bestemt ved hjelp av forsøksdata gjengitt og sett i lys av feedback-modellen, synes L. reuteri-stamme 1063 å være best egnet av stammer av L. reuteri til å virke som et probiotisk middel til å mildne tarmsykdommer og øke for-effektivitet hos svin. Denne konklusjon skriver seg fra (i) oppdagelsen av at stamme 1063 produserer høye nivåer av reuterin (figur 2), og at den gir mer respons på heterolog stimulering enn de øvrige stammene (tabell 6), (ii) det faktum at stamme 1063 ble isolert direkte fra tynntarmer fra svin og derfor er en svinvertspesifikk stamme, og (iii) observasjonene av at stamme 1063 har sterk autoaggregerende evne og fester seg bedre enn andre testede stammer til epitelceller hos gris.

Beste utførelsesform for oppfinnelsen

Reuterin erholdes ved hjelp av den homologe fremgangsmåte hvor L. reuteri-celler dyrkes i stillestående kultur ved 37°C i Lactobacillus-bærende medium med glukose i 24 timer. Cellene innhøstes ved sentrifugering og oppslemmes i 250 mM glyserol. Etter inkubasjon i 6 timer ved 37°C i stillestående kultur, fjernes cellene ved sentrifugering og filtrering. Reuterinoppløsningen tilsettes så til et miljø som inneholder reuterinfølsomme mikroorganismer for å drepe mikroorganismene.

Industriell anvendbarhet

Reuterin har anvendbarhet til antiviral, antibakteriell, antaparasittisk og antifungal bruk i laboratorier. I tillegg kan reuterin tilsettes til matprodukter for å redu-sere den mikrobielle flora. Reuterin kan også gis til dyr for å nedsette den mikrobielle populasjon i dyrets mage- og tarmsystem. Celler av Lactobacillus reuteri kan inkuberes under betingelser som bidrar til reuterinproduksjon for å

• øke antibakteriell aktivitet.

Litteraturhenvisninger

1. Kandler, 0. et al., Zbl. Bakt. Hgg., I. Abt. orig. Cl, 264-269 (1980). 2. Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, red. av P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe og J.G. Holt, Williams and Wilkins, Baltimore (1986). 3. Sandine, W.E. et al., J. Milk Food Technol., 35;691

(1972).

4. Goldin, B.R. et al., J. Nati. Cancer Institute, 64:255

(1980) . 5. Goldin, B.R. et al., Development in Industrial Micro-biology, 25:139 (1984). 6. Goldin, B.R. et al., Am. J. Clin. Nutr., 39:756 (1984). 7. Gilliland, S.E. et al., Appl. Environ. Microbiol., 49:377 (1985). 8. Schutz, H. et al. System Appl. Microbiol., 5:169 (1984).

9. Sobolov, M. et al., J. Bacteriol., 79:261 (1960).

10. Smiley, K.L. et al., Arch. Biochem. Biophys., 97:538

(1962). 11. Metchnikoff, Prolongation of Life, G.P. Putnan<T>s Sons, New York, NY, 1970. 12. Klaenhammer, T.R. et al., J. Dairy Science, 65:1339

(1982). 13. Dahiya, R.S. et al., J. Dairy Science, 51:1568 (1968). 14. Gilliland, S.E. et al., J. Milk Food Technol., 35:307

(1972). 15. Pinheiro, A.J.R. et al. J. Dairy Science, 57:183 (1968). 16. Price, R.J. et al., J. Milk Food Technol., 33:18 (1970). 17. Sorrels, K.M. et al., J. Dairy Science, 53:239 (1970). 18. Talon, R.J. et al., Zentralbl. Bakteriol. Abt. Orig. B170:133 (1980). 19. Gilliland, S.E. et al., J. Food Protection, 40:820

(1977).

20. Tramer, J. et al., Nature, 211:204 (1966).

21. Shahani, K.M. et al., Cult. Dairy Prod. J., 12:8 (1977). 22. Shahani, K.M. et al., Cult. Dairy Prod. J., 11:14

(1976).

23. Reddy, G.V. et al., J. Dairy Science, 54:748 (1971).

24. Hamdan, I.Y. et al., J. Antibiotics, 27:631 (1974).

25. Hamdan, I.Y. et al., Cult Dairy Prod. J., 10:10 (1975). 26. Spillmann, H. et al., Milchwissenschaft, 3_3:148 (1978).

27. Vincent, J.G. et al., J. Bacteriol., 78:477 (1959).

28. Sandine, W.E., J. Food Protection, 42:259 (1979).

29. Nielsen, A.T. et al., Polish Journal of Chemistry, 55:1393 (1981).

30. Hall, R.H. et al., J. Chem. Society, 1950:490 (1950).

Claims (2)

1. Anvendelse av Lactobacillus reuteri for ikke-terapeutiske formål, spesielt som et probiotisk middel, for å oppnå forøkt f6ringseffektivitet.

2. Anvendelse av Lactobacillus reuteri-cellekulturer og fortrinnsvis også stoffer som bidrar til Lactobacillus reuteri antibiotisk produksjon, for ikke-terapeutiske formål i matvarer som et probiotisk middel generelt, for å øke antallet Lactobacillus reuteri-celler i mage-tarmkanalen hos dyr, fortrinnsvis under optimalisering av betingelsene for antimikrobiell produksjon ved hjelp av Lactobacillus reuteri-cellene, særskilt med tanke på forøkt foringseffektivitet, bedret tilvekst og bedre vekst av jur (brystmuskulatur).