KR100715730B1 - 유해 병원성 미생물에 대한 항균활성을 갖는 신규비피도박테리움 롱검 ａ24 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 유산균인 비피도박테리움 롱검 A24(Bifidobacterium longum A24) 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명의 비피도박테리움 롱검 A24는 내산소성, 항생제(ampicillin)에 대한 감수성이 높고, 플라스미드 DNA를 가지며, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 비롯한 유해 병원성 미생물에 대하여 높은 항균활성을 나타낸다. 본 발명의 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물은 의약품, 사료 조성물, 식품 조성물 등에 사용할 수 있다.

비피도박테리아, 항리스테리아 활성, 플라스미드 DNA, 배양조건, 분리 및 정제

Description

유해 병원성 미생물에 대한 항균활성을 갖는 신규 비피도박테리움 롱검 Ａ24{A novel Bifidobacterium longum A24 with anti-bacterial activity against toxigenic pathogens}

도 1은 비피도박테리움 종과 다른 박테리아 속간의 진화적 관계를 보여주는 계통도를 나타낸다(Benzkorovainy et al ., CRC Press, 1989).

도 2는 트랜스알돌라제(transaldolase)의 면역학적 교차반응을 기초으로 하여 비교한 비피도박테리움속의 종간 진화적 관계를 보여주는 계통도를 나타낸다.

도 3a은 TYP 한천배지 상에서 자란 비피도박테리움속 균종의 형태를 보여주는 위상차현미경(phase-contrast microscope) 사진(×1500)이다. (A) B. bifidum; (B) B. longum; (C) B. breve; (D) B. angulatum; (E) B. catenulatum; (F) B. globosum (Benzkorovainy et al., CRC Press, 1989).

도 3b는 TYP 한천배지 상에서 자란 비피도박테리움속 균종의 형태를 보여주는 위상차현미경(phase-contrast microscope) 사진(×1500)이다. (A) B. pullorum; (B) B. animalis; (C) B. cuniculi; (D) B. magnum; (E) B. subtile; (F) B. minimum (Benzkorovainy et al ., CRC Press, 1989).

도 3c는 TYP 한천배지 상에서 자란 비피도박테리움속 균종의 형태를 위상차 현미경(phase-contrast microscope) 아가(한천)에서 생장하는 비피도박테리움 속의 세포 형태를 보여주는 위상차(phase-contrast) 현미경 사진(×1500)이다. (A) B. asteroides; (B) B. indicum; (C) B. coryneforme; (D) B. infantis (Benzkorovainy et al ., CRC Press, 1989).

도 4는 비피도박테리움에 의해서 포도당으로부터 초산(acetate)와 젖산(lactate)이 생성되는 것을 보여준다. 1. 헥소키나제와 글루코즈-6-인산 이소머라제; 2. 포럭토즈-6-인산 포스포케톨라제(XFP); 3. 트랜스알돌라제; 4. 트란스케톨라제; 5. 리보즈-5-인산 이소머라제; 6. 리보오즈-5-인산-3-에피머라제; 7. 자일루로즈-5-인산 포스포케톨라제; 8. 아세테이트 키나제; 9. EMP 경로 효소들 (Gottschalk, Bacterial metabolism, 1979).

도 5는 유아 분변에서 분리된 균주의 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)에 대한 항균활성을 paper disc 법으로 실험한 결과를 나타낸다. A: A24, B: B1, C: B6, D: B10, E: B12, F: control

도 6은 유아분변에서 분리된 비피도박테리움 롱검 A24의 그람 염색 결과를 보여주는 현미경 사진이다.

도 7은 비피도박테리움 롱검 A24의 주사 전자현미경 사진(scanning electron micrograph)을 보여준다.

도 8은 API 50 CHL kit를 이용하여 실시한 비피도박테리움 A24(a)와 B. longum ATCC157T(b)의 생화학적 동정 비교를 보여준다.

도 9는 당발효성을 기초로 한 비피도박테리움속 세균의 종간의 차이를 보여 준다 (Mitsuoka, Zentralbl . Bakteriol . parasitenkd . Infektionskr . Hyg . Abt . 1: Orig ., 210, 52, 1969).

도 10은 분리된 균주서의 PCR 생산물의 아가로즈 겔 전기영동을 나타낸다. PCR 생산물은 비피도박테리움 속-특이적 프라이머로 증폭되었다. 레인 M: 분자 크기 DNA 마커 100 bp와 DNA 사다리, 레인 1: B. longum ATCC 15707^T, 레인 2 :A24. 레인 3: B1, 레인 4: B6, 레인 5: B10, 레인 6: B12를 나타낸다.

도 11은 비피도박테리움 롱검 A24에 대하여 종-특이적 프라이머로 총 박테리아 DNA의 증폭 후 얻어진 PCR 산물을 보여주는 결과이다. 레인 M: 분자 크기 DNA 마커 100 bp 와 DNA 사다리, 레인 1: B. longum ATCC 15707^T, 레인 2 : A24.

도 12는 비피도박테리움 롱검 A24의 플라스미드 DNA 프로필을 보여주는 아가로즈 겔 전기영동 결과이다. 레인 M; E. coli V517의 분자 크기 마커, 레인 1; A24의 플라스미드 DNA.

도 13은 비피도박테리움 롱검 A24의 증식에 미치는 탄소원의 영향을 보여준다. 배지: 증류수 1 리터당 각 탄소원 20g, 프로테오즈 펩톤 10g, 쇠고기 엑기스(beef extract) 5g, 효모 추출물 2.5g, 트윈 80 1g, 암모니움 설페이트 2g, 소듐 아세테이드 5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g, 디포타슘 포스페이트 2g, L_시스테인 0.5g. pH 7, 혐기성 조건, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

도 14는 포도당 농도가 비피도박테리움 A24 증식에 미치는 효과를 보여준다. 배지 : 증류수 1 리터당 글루코즈의 각 농도, 프로테오즈 펩톤 10g, 쇠고기 엑기스 5g, 이스트 추출물 2.5g, 트윈 80 1g, 암모니윰 사이트레이트 2g, 쇼듐 아세테이드 5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g, 디포타슘 포스페이트 2g, L-시스테인 0.5g pH 7, 혐기성 조건, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

도 15는 질소원의 농도가 비피도박테리움 롱검 A24 증식에 미치는 효과를 보여준다. 배지 : 증류수 1 리터당, 각 질소원 20g, 글루코즈 20g, 트윈 80 1g, 소듐 아세테이트 2.5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g, 디포타슘 포스페이트 2g. pH는 7.0이고 배양은 혐기성 조건, 37℃에서 24시간 수행하였다.

도 16은 쇠고기 엑기스(추출물)의 농도가 비피도박테리움 롱검 A24의 증식에 미치는 효과를 측정하였다. 배지: 증류수 1 리터당, 각 쇠고기 엑기스 농도, 글루코즈 20g, 트윈 80 1g, 소듐 아세테이트 2.5g, 마그네슘 설페이트 0.1g, 망간 설페이트 0.05g, 디포타슘 포스페이트 2g, pH는 7.0이고 배양은 혐기성 조건, 37℃에서 24시간 수행하였다.

도 17은 비피도박테이룸 롱검 A24 PCFS(pH 조정 배양여액: pH-controlled filtrate supernatant)의 시간별 성장과 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 항균 활성을 보여준다. 배지는 0.05% L-시스테인을 포함하는 MRS 액체배지(broth)이고 배양은 혐기성 조건에서 48시간 동안 37℃에서 수행하였다.

도 18은 비피도박테리움 롱검 A24의 항생제 감수성을 보여준다. GM: 겐타마이신 CL: 콜리스틴, N: 네오마이신, AM: 암피실린, S: 스트렙토마이신 T: 옥시테트라사이클린, E: 에리트로마이신.

도 19는 비피도박테리움 롱검 A24 PCFS(pH 조정 배양여액)의 리스테리아 모 노사이토제네스에 대한 열 안정성을 보여준다. 열처리 후, 혐기성 조건, 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.

도 20은 비피도박테리움 롱검 A24 PCFS(pH 조정 배양여액)의 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 pH 안정성을 보여준다. 각 pH에 노출 후, 혐기성 조건, 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.

도 21은 항리스테리아 물질의 DEAE-세포로즈 이온교환 크로마토그램을 보여준다. 항리스테리아 물질은 0-1 N 쇼듐 클로라이드로 0.5ml/min 속도로 용출하였다. 각 분획은 5 ml씩 분취하였다.

도 22는 이온 교환 크로마토그램에서 복구된 비피도박테리움 롱검 A24의 부분적으로 정제된 항리스테리아균 물질의 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 23은 분리 정제된 항리스테리아균 물질의 분자량을 SDS-PAGE로 측정한 결과이다. M, 분자량 마커; 1. 항리스테리아균 물질

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인체의 장내에는 약 100여종의 세균이 존재하고, 총 미생물수는 10¹⁴ colony-foming unit (CFU) 이상이며, 분변 고형물의 약 30%를 차지한다고 알려져 있다. 이들 세균 중에서 99% 이상은 절대혐기성 균주인 박테로이드(Bacteroides ), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 유박테리윰(Eubacterium) 등이고 이 대장균(E. coli), 락토바실러스(Lactobacillus), 장구균(Enterococcus) 등과 같은 통성혐기성 세균은 절대혐기성 세균의 1/100～1/1000에 불과하다(Cummings and Macfarlane, 1991). 보고 된 바에 의하면 장내의 상재 세균들 중에는 외부로부터 해로운 유해세균의 침입을 막아주는 방어 작용을 하거나 비타민 등을 생산하여 인체에 공급하는 유용한 세균들이 있는 반면에, 암모니아, 아민, 인돌 등과 같은 독성 물질을 생성하거나 암 발생에 관여하는 유해효소를 생산하는 유해세균들이 상존한다(박과 지, 1999). 또한 장내 세균들은 섭취하는 음식물, 생활환경, 스트레스에 의해 영향을 받으며 질병의 발생과 밀접한 관계가 있다. 따라서 건강을 유지하기 위해서는 유해한 장내 세균들을 제어하는 것이 중요하다고 인식되고 있다(Kim 등, 1998).

비피도박테리움속 세균은 편성혐기성, 그람양성의 간균이며, 1몰(mole)의 포도당을 발효하여 초산 1.5몰(mole)과 젖산 1몰(mole)을 생성한다. 보통 25～40℃에서 생장하나, 최적온도는 37℃, 최적 pH는 6～7이며, 45℃ 이상, 또는 pH 5.5 이하에서는 증식이 억제된다. 인체의 장내 세균 중 주요 균총 중의 하나로 특히, 모유를 섭취하는 유아의 장내 균총 중의 90% 이상은 비피도박테리아로 이루어져 있다. 그러나 이유식 섭취 이후에 비피도박테리아의 숫자는 감소하며 전체 균총 중의 10～20% 수준으로 존재하다가 노인이 되면서 더욱 감소한다(정, 2004). Bergey's Manual에는 총 32종이 기재되어 있는데, 유아에서는 B. bifidum , B. longum , B. infantis, B. breve 등이, 성인에서는 B. bifidum , B. longum , B. adolescentis 등이 검출되며, 동물의 장내에서 B. pseudolongum , B. thermophilum 등이, 그리고 꿀벌에서 B. coryneforme, B. indicum , B. asteroides 등이 검출되었다(Holt, 1977). 현재까지 보고 된 바에 의하면 비피도박테리아는 장내 세균 중 가장 유익한 균으로 알려져 있는데, 그 이유는 비피도박테리가 유해 물질을 거의 생산하지 않고, 병원성 세균에 대한 길항 작용이 있으며, 비타민 B군 등을 합성하여 인체에 공급하고 유당을 분해하여 유당불내증(lactose intolerance)을 개선하는 효과가 있다고 한다(박과 지, 1999). 모유를 섭취하는 유아의 경우 설사와 같은 질병 이환율이 낮은데 그 이유 중의 하나로서 모유아의 장내에는 비피도박테리가 우점종으로 증식하고 있 기 때문이다. 이러한 작용 이외에도 비피도박테리의 항돌연변이 효과(Lee와 Ji, 1996; Kim 등, 1998; Jung 등, 1999), 면역기능 증강효과(Kim 등, 1998; Jung 등, 1999), 항암효과(Kim 등, 2003), 혈중 콜레스테롤의 감소효과(Kim 등, 1998; Jung 등, 1999) 등 인간의 건강 유지에 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 비피도박테리의 기능성이 점차 널리 알려지게 됨에 따라 비피도박테리아를 이용한 발효유와 정장 캡슐제 등 다양한 프로바이오틱(probiotic) 기능을 위한 비피도박테리아의 이용 제품들이 개발되어 왔다(Ryu 등, 1998). 특히, 최근에는 각 균주마다의 특성과 능력의 상이함에 근거하여 보다 우수한 형질의 비피도박테리아를 개발하기 위한 노력을 하고 있으며 또한 생존성, 안정성 및 장 정착성을 증진시키기 위한 연구도 보고되었다(Park과 Heo, 1995; Park과 Heo, 1996).

식중독(Food-poisoning)은 경구를 통한 병원체의 장관내 감염에 의하여 구토, 설사와 같은 증상과 장내 균총의 변화를 나타나게 되는데, 이러한 증상의 원인이 되는 대표적인 병원균으로는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes, Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus : 일명 포도상 구균) 등이 있다. 특히 리스테리아 모노사이토제네스는 육류, 어패류, 치즈, 아이스크림, 냉동식품 등 대부분의 식품을 오염시키며 임산부, 신생아, 노약자에게 유산, 패혈증, 수막염, 식중독을 일으키는 치명적인 병원균이다. 리스테리아가 처음 발견된 것은 1926년이었으나 리스테리아증 (listeriosis)을 일으키는 매개체란 것이 밝혀진 것은 1980년대 이후였다. 리스테리아에는 7가지의 균종이 있으나 사람과 동물에 다같이 질병을 일으킬 수 있는 것은 리스테리아 모노사 이토제네스 한 가지 뿐이다(Faber and Johnston, 1989). 리스테리아 모노사이토제네스는 그람 양성세균으로서 열악한 환경조건에서도 살아남아 식중독을 일으키는 독특한 특성을 가지고 있다. 특히 고염분, 고당분, 건조 등 삼투압 스트레스를 받을 경우 세포내에 삼투보호물질인 osmolyte를 축적함으로써 세포내 팽압을 유지하여 증식할 수 있으며(Ko 등, 1994), 또 저온(4℃)에서도 증식이 가능하며 열처리 공정에서 생존할 수 있어 식품 위생학적인 측면에서 관심이 집중되고 있다. 식중독 미생물의 증식을 억제하는 보존제로 화학제재가 상업적으로 사용되고 있으나 근래 소비자의 건강 지향적 욕구의 증대와 안정성의 문제로 인해 합성 보존제의 기피 현상이 두드러지고 있다. 이러한 문제점에 대처하기 위해서는 인체에 무해한 천연 항균활성 물질의 개발에 관심이 집중되고 있다.

이러한 관점에서 비피도박테리아는 인체 내에서 정상 미생물군으로 존재하고 있기 때문에 독성이 비교적 적다고 판단된다. 비피도박테리아가 생산하는 항균물질은 식품 등의 새로운 생물학적 보존제로서 효용이 크며 축산 산업이나 의약품 산업에의 응용도 기대될 것이다.

따라서 본 연구는 생후 10개월 미만의 건강 상태가 양호한 유아들의 분변으로부터 식중독을 유발하는 병원성 세균을 저해하는 비피도박테리움 속 균주를 탐색하고 이를 분자생물학방법을 사용하여 신속한 동정하였고, 분리균주가 생산하는 항균물질의 특성을 연구한 결과이다.

비피도박테리움속 세균은 1900년 프랑스의 Pateure 연구소의 Tissier가 건강한 모유영양아의 분변에서 처음으로 분리하여 그 독특한 형태에서 Bacillus bifidus communis라고 명명(Csonka, 1989)된 후, 수많은 연구자들에 의해 연구되는 과정에서 많은 분류상의 혼란이 일어난바 있다. 1924년에 Oral-Jensen은 이 균을 독립된 속으로 하여 비피도박테리움 속으로 분류(Tissier, 1899)할 것을 제안하였으나 일반적으로 받아들이지 않았다. 1934년에 Weiss와 Retter는 모유영양아의 분변에서 분리된 비피도박테리움속에 대하여 그 생화학적 특성을 정리하여 Lactobacillus acidophilus의 한 변종으로서 분류하였다(Oral-Jensen, 1924). 그 후 1965년에 Werner 등은 이 균종을 Lactobacillus 속에서 분리하여 별도로 비피도박테리움 속으로 할 것을 제안하였다(Weiss and Rettger, 1934). 그 결과 1977년에 출판된 Bergey's Manual(8th ed.)에서는 이 속을 Lactobacillus 속에서 독립하여 비피도박테리움 속으로 명명하고 Actinomycetaceae Family에 포함시켰다(Holt, 1977). Stackenbrandt 등은 1981년에 16S rRNA 분석에 기초한 계층분류 체계에 따라 도 1과 도 2에 나타낸 바와 같이 분류하였다(Werner et al., 1965).

비피도박테리움 속 세균은 다양한 형태의 그람 양성 간균으로, 단간상(short rod), V자형과 Y자형의 모양, 만곡상, 수지상, 구근상, 곤봉상 등의 여러 가지 세포 형상을 나타내며 비운동성이고 포자를 형성하지 않는다. 한쪽 끝은 둥글거나 racket 모양을 하고 있으며 한쪽 또는 양쪽 끝이 세로로 절단되어 2개의 짧은 분지 효과를 나타내는데 이러한 형상을 분지상이라고 하며 형태학적으로 비피도박테리움 속의 가장 특이적인 형상(도. 3a, 3b, 3c)이다(Stackenbrandt and Woese, 1981). 형태는 배양 시 영양 조건에 의해 변형되어질 수 있으며, 계대 배양함에 따라 직간균 혹은 만곡상으로 변화되기도 한다(Sneath et al ., 1986). 분리 시 절대혐기성의 조건이 필요하고 계대에 따라 cysteine 등의 환원물질을 함유하기도 한다. 또 탄산가스는 여러 비피도박테리움 속의 생육에 촉진적으로 작용한다. 콜로니의 표면은 미끈하게 융기된 모양으로 가장자리가 원활하고 혈액을 함유하지 않는 배지에서는 유백색-백색을 띤다. 포자를 형성하지 않고 항산성은 없는 비운동성 세균이다. 최적 배양온도는 37～41℃, 보통 최저 배양온도는 25～28℃, 최고 배양온도는 43～46℃이다. 최적 pH는 6.0～7.0 사이며, pH 4.5～5.0 혹은 8.0～8.5에서는 생육하지 않는다.

비피도박테리움 속은 질산염을 환원하지 않고 인돌(indole), 젤라틴(gelatin) 액화, 벤지딘(benzidine) 반응, 아르기니(arginine)의 분해성은 언제나 음성이다. 당질 분해성이고 2분자의 포도당을 발효하여 초산 3 몰과 젖산 2 몰으로 전환된다. 포도당은 Bifidum 경로(도 4)를 통하여 분해되고 이 경로 중에서 프록토즈-6-포스페이트 케토라제(fructose-6-phosphate ketolase: G6PPK)는 퍼럭토즈-6-포스페이트(fructose-6-phosphate를 acetylphosphate)와 에리트로즈-4-포스페이트(erythrose-4-phosphate)로 분해한다. 전자에서 아세트산과 에탄올이 생성이 되고 후자와 프럭토즈-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)는 트랜스알도라제(transaldolase)와 트랜스케토라제(transketolase)의 작용으로 펜토즈 포스페이트(pentose phosphate)가 생성이 된다. 펜토즈 포스포케토라제(Pentose phosphoketolase)는 이 기질을 아세틸 포스페이트(acetyl phosphate)와 글리세르알데하이드-3-포스페이트(glyceraldehyde-3-phosphate)로 분해하고 글리세르알데하이드-3-P(glyceraldehyde-3-P)에서 EMP 경로에 의하여 젖산이 생성된다(정, 2004). 소량의 포르믹산(formic acid), 에탄올(ethanol), 수씨닉산(succinic acid)을 생산하나 탄산가스, 부트릭산(butyric acid), 프로파오닉산(propionic acid)은 생산되지 않는다.

일반적으로 비피도박테리아는 인체내 분변 균총의 대부분을 점유하고 연령층에 따라서 커다란 차이를 나타낸다. 즉, 비피도박테리아는 출생 후 2～5일 경에 출현하여 건조분변당 10¹⁰ CFU/g 이상의 균수를 유지하는데 성인의 경우에는 비피도박테리아의 출현 정도와 균수가 현저하게 감소한다. 한편 연령층에 따라서 우점종인 비피도박테리아도 커다란 차이를 나타내는데 유아에게 가장 일반적인 균종은 B. infantis , B. breve , B. bifidum 등이며 유아가 성장함에 따라서 B. infantis와 B. breve는 B. adolescentis와 B. longum으로 천이된다(Sneath et al ., 1986).

비피도박테리아는 일반 유산균에 비해 혐기적인 배양조건을 필요로 하며 영양 요구성도 매우 까다롭기 때문에 생육을 촉진하기 위한 배양조건의 연구가 많이 보고되고 있다. 박과 허(1996)는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)의 최적 배양조건과 안정성을 증진시킬 수 있는 배양조건을 연구하였다. pH와 L-cysteine HCl의 첨가 효과를 조사하였는데, 최대 균체수를 얻기 위해 pH 6.0～6.5가 최적조건이었고 0.05% L-cysteineㆍHCl의 첨가로 증식이 촉진되었으며, 과산화수소에 대한 내성은 0.05～0.10% L-cysteineㆍHCl을 첨가한 배지에서 증식한 B. breve가 가장 우수하였다고 보고하였다. 박과 허(1995)의 다른 연구에서는 비피도 박테리아의 산업적 이용을 위해 유청배지에서 최적증식 조건, 스타터와 생균제제로 이용을 위해 저장시 pH에 대한 균주의 안정성 및 동결건조 시 냉동보호제의 효과에 대한 연구를 각각 수행하였다. 그 결과 0.5% yeast extract가 첨가된 유청배지에서 B. bifidum , B. longum , B. infantis 와 B. breve 균주 모두 우수한 증식효과를 나타냈으며 β-갈락토시다제의 활성도 증가하였고, 냉장저장시 pH 6.0～6.5에서 안정성이 우수하였다. 동결건조의 경우 냉동보호제로는 5% NaHCO₃가 효과적이었다고 보고하였다. Kim 등(1999)은 B. bifidum , B. longum , B. infantis 는 갈락토올리고당(galactooligosaccharide)와 라피노즈(raffinose)가 첨가된 배지에서 48시간 배양 후 글루코즈(포도당)와 갈락토즈를 첨가한 배지보다 증식이 6～18%씩 각각 증가하였다고 보고하였다. Jin(1997)은 성인 및 유아의 분변으로부터 48주의 비피도박테리아를 분리하고 10% 탈지유(skim milk) 배지에서의 계대배양 적성을 조사하였다. 0.5% 이스트 추출물과 0.05% 시스테인 등에 의해 생육이 촉진되었으나 배양용기를 CO₂ 가스로 치환하였을 때는 거의 영향을 미치지 않았고 보강된 탈지유 배지에서 30시간 배양 후 5℃에서 12일간의 냉장보존하는 과정중에는 생균수 감소가 적었다고 보고하였다.

한편, 최근 비피토박테리아의 다양한 건강증진효과가 밝혀지고 있다. 첫째로, 비피도박테이아의 항돌연변이 효과를 가진다. Lee와 Ji (1996)은 비피도박테리아 21종에 대하여 Salmonella typhimurium TA 98 균주를 이용한 in vitro 항돌연변이능을 조사하였는데 동결건조된 균체들은 평균적으로 Trp-p-1(3-amino-1,4- dimethyl-⁵H-pyrido(4,3-b) indole), benzopyrene, NQO (4-nitroquinoline oxide), IQ(2-amino-3-methylimidazo [4,5-f] quinoline)에 대하여 64, 38, 29, 20%의 항돌연변이능을 나타내었다. 특히 NQO에 대하여는 12시간 배양세포가 5일 배양세포보다 항돌연변이능이 우수한 것으로 보고하였다. Kim 등(1998)은 건강한 한국인의 분변으로부터 분리한 200여종의 비피도박테리아 중에서 선발한 20종과 상업균주 3종을 대조군으로 하여 비피도박테리아의 특성을 비교 분석하였는데, 돌연변이원인 NQO와 IQ에 대하여 분리균주 2종과 상업균주 1종에서 70% 이상 항돌연변이 작용을 나타내었다고 보고하였다. Jung 등(1999)은 한국인으로부터 200여종의 비피도박테리아를 분리 동정하여 생리활성이 우수하고 한국인에게 적합한 비피도박테리움 롱검 MK-G7(Bifidobacterium longum MK-G7) 균주를 선발하였으며 상용 비피도박테리움 속 균주와 비교분석한 결과, 돌연변이 억제능은 IQ에 대해서 75%, NQO에 대해서 78%를 나타내었다고 각각 보고하였다.

둘째, 비피도박테리아는 면역증강 효과를 가진다. Kim 등(1998)이 분리한 비피도박테리아의 면역능 분석은 파고사이토시스(phagocytosis), TNF-α 생성, IL-6 생성에 있어서 분리균주 4종에서 높게 나타났으며 Jung 등(1999)이 분리한 비피도박테리움 롱검 MK-2 균주는 기존의 상용 비피도박테리움 속 균주보다 매크로파아지(macrophage)와 TNF-α 생성능에 있어서 3배 이상 높은 것으로 보고하였다.

셋째, 비피도박테리아는 항암 효과 및 항종양 효과를 가진다. 비피도박테리아는 항종양 효과를 가지고 있는데, 이는 세포벽 성분 및 다당류와 밀접한 관계가 있는데 이것은 비피도박테리아가 장점막을 자극하여 항체 생성을 유도하는 면역부활 작용을 가지고 있기 때문인 것으로 보고되고 있다(Jin, 1997). Kim 등(2003)의 보고에 의하면, 대장암 세포(SNU-C2A)와 위암세포(SNU-1)에 대한 70% 이상의 항암역가를 가지는 B. adolescentis Maeil-K8과 B. infantis Maeil-K9에 대한 기초 생리활성을 비교하고 이용성을 확인하였다.

넷째, 비피도박테리아는 항균활성을 가진다. 비피도박테리아는 최종 대사산물로서 유산과 초산을 생성하여 대장의 pH를 조절하는 중요한 역할을 담당하며 여러 가지 병원성 및 부패성 세균의 생육을 억제한다. 이렇듯 장내 pH를 조절함으로써 페놀(phenol), 암모니아(ammonia), 스테로이드(steroid) 대사산물과 같은 세균성 독소 등과 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 아그마틴(agmatine) 등과 같은 혈관 압축성 아민류의 생성을 억제할 수 있다고 보고하였다(Yoshiyuki et al.). Ahn 등(1997)에 의하면, 비피도박테리아도 젖산균과 유사한 E. coli 와 Salmonella의 생장 억제 효과를 나타냈으며 B. longum 8001과 혼합배양한 E. coli 와 Salmonella는 배양 후 5시간까지 생장하다가 감소하였고 B. longum 8025과 혼합배양시에 시험균들은 배양 후 10시간까지 생장하다가 감소하기 시작하였다고 보고하였다. Melanie et al. (2004)에 의하면, 유아의 분변에서 분리된 B. bifidum RBL 460가 Caco-2 cells에 E. coli O157:H7의 부착을 감소시키므로 저해작용을 나타낸다고 보고하였다. Kim 등(2001)도 비피도박테리아와 E. coli O157:H7을 혼합 배양했을 때의 억제효과, 비피도박테리아의 Caco-2 세포정착에 따른 억제효과 등을 조사하였는데, B. infantis K9에 의한 산성물질이 생성되면서 E. coli O157:H7의 균수는 급격히 감소되는 것으로 나타났고 B. infantis K9와 E. coli O157:H7이 정착 부위를 동일하게 이용하지만 비피도박테리아가 우선적으로 정착이 되었을 때 E. coli O157:H7의 정착율이 저하되는 결과를 보고하였다. Kim 등(2002)은 B. infantis 와 B. breve의 배양 상등액을 취해서 pH 7.0으로 조정한 후 Salmonella typhimurium과 E. coli O157:H7의 저해활성을 알아보았는데, 산에 의한 저해가 아닌 비피도박테리아가 생산하는 항균물질의 가능성을 확인하였다. Bae 등(2000)은 비피도박테리아가 생산하는 열에 불안정한 박테이오신(bacteriocins)와 같은 항생제(antibiotic) 유사물질이 Helicobacter pylori를 저해한다고 보고하였다. 또한 Toure et al. (2003)은 유아의 분변으로부터 L. monocytogens을 저해하는 6종의 Bifidobacterium 속 균주를 분리하고 메탄올 추출에 의해서 항균물질을 추출하였다. 이 항균물질은 100℃의 열처리를 한 후에도 안정하였지만 단백질 분해 효소인 프로나제 E(pronase E), 프로테이나제 K(proteinase K) 그리고 트립신(trypsin)에 의해서는 활성을 상실하였다고 보고하였다.

또한, 프로바이오틱(probiotics: 생균제재)로 작용한다. 저 농도에서 다른 미생물의 생육을 억제하는 저분자량의 미생물 대사생성물인 항생물질과 달리 프로바이오틱이란 숙주의 장내 미생물 균형을 향상시킴으로서 건강 증진 효과를 나타내는 활성 미생물 식이 보충제를 말한다(Havenaar and Huis, 1992). 이러한 프로바이오틱 균주의 선발을 위한 이론적인 근거는 안전성, 기능성 측면(생존성, 장 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, antigenotoxic 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, bacteriophage 저항성, 제조과정 중의 생존성) 등을 들 수 있다. 유용한 probiotics 균주를 선택하기 위해서 여러 가지 선발기준이 사용되고 있는데 여기에는 내산성, 내담즙성, 장내 세포에의 정착성 및 서식성, 분변에서의 검출능, 면역 증가능, 항돌연변이원성, 콜레스테롤 저하능, 항암 및 항종양 활성, 병원성 세균의 생육 억제능, 그리고 안전성 등이 포함된다. 최근 몇 년 동안에 새로운 프로바이오틱 미생물의 분리와 개발에 커다란 관심을 가지게 되었다. 향후 프로바이오틱 미생물 개발 기술은 기술집약형 방식으로 전개될 것이고 이에 따라서 유제품 산업의 발효유, 유아식, 유산균 강화 우유류 제품, 의약용 제제, 건강 보조식품, 축산용 사료 첨가제, 화장품 등에 광범위하게 응용될 수 있을 것이다. 최근에는 보다 새롭고 효과적인 프로바이오틱 미생물의 개발과 임상 연구를 통한 생리활성 효과의 입증이 주요한 강조점으로 부각되고 있다.

이런 배경 하에, 본 발명자는 유해 미생물을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 프로바이오틱 미생물의 탐색을 시도한 결과, 유아분변으로부터 산소내성이 강하고 대표적인 식중독 세균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 내열성 항균물질을 생산하는 비피도박테리움 롱검 A24 (Bifidobacterium longum A24)를 분리 및 동정하였고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 (Bifidobacterium longum A24(KCCM-10683P)을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 유해 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 가지는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 A24 (Bifidobacterium longum A24) (KCCM-10683P)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검 A24의 분리 및 동정은 다음 방법에 의해 수행되었다. 유아 분변으로부터 분리한 균주로부터 45% 이상 높은 항균 활성을 나타내는 균주를 분리하였다. 분리한 균주를 형태학적 분석, 당 이용성 조사, 16S ribosomal DNA 분석 결과 비피도박테리움 롱검으로 동정되었다. 분리된 비피도박테리움 롱검 균주는 그람 양성의 세균으로 카탈레이즈 (catalase) 음성을 나타 내고 스포어를 형성하지 않고 CO₂를 생성하지 않으며 운동성은 없는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 분리된 미생물을 비피도박테리움 롱검의 새로운 균주 비피도박테리움 롱검 A24(Bifidobacterium longum A24)로 동정하고, 상기 미생물을 2005년 10월 1일자로 서울시 홍제동 유림1동 유림빌딩 소재의 한국미생물보존세터(KCCM: Korean Culture Center of Microorganisms) 에 기탁번호 KCCM-10683P로 기탁하였다.

선별 균주의 최적배양 조건을 살펴보았다. 비피도박테리움 롱검 A24은 글루코즈를 탄소원으로 할 때 우수한 증식을 보이고, 바람직하게는 0.5 내지 4.0%(w/v)의 농도로 첨가할 때 우수하였다. 또한, 무기 질소원 외에도 쇠고기 엑기스(beef extract)를 첨가할 때 증식이 우수하며, 바람직하게는 0.5 내지 5.0%(w/v)의 농도로 첨가할 때 우수하였다. 비피도박테리움 롱검 A24는 보다 바람직하게는 2.0%(w/v) 글루코즈, 질소원으로 3.0%(w/v) 비피 추출물 첨가시 증식이 가장 우수하였다.

또한, 본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검 A24는 플라스미드 DNA를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 비피도박테리움 롱검 A24는 항생제 내성을 가지는 것을 특징으로 한다. 비피도박테리움 롱검 A24의 항생제 감수성을 비교한 결과 암피실린, 에리트로마이신에 감수성을 보이고 콜리스틴에 내성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 장내 유해 미생물의 생육을 억제하기 위해서 항생제와 같이 또는 기존 항생제의 대체용으로도 비피도박테리움 롱검 A24는 인체 또는 동물에게 투여할 수 있다.

또한, 비피도박테리움 롱검 A24은 유해 병원성 미생물의 생육 억제활성, 특히 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 우수한 특성을 가지는 프로바이오틱의 특성을 가진다. 비피도박테리움 롱검 A24의 생육 및 항균 물질 생산을 0.05%(w/v) L-시스테인(L-cysteine)이 첨가된 MRS 액체배지에서 검토하였을 때 균체의 생육은 28시간 배양시 최고에 도달하였고 항균 활성은 36시간 배양시 최고를 나타내었다.

비피도박테리움 롱검 A24의 항균 물질은 60 내지 121℃에서 열에 안정하고, pH, TCA, 단백질 분해 효소에 의해 항균 활성이 감소하였다. 비피도박테리움 롱검 A24이 생산하는 항균 물질을 정제하기 위하여 배양액을 울트라필퍼레이션(ultrafiltration), 황산 암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과, 분리된 활성분획물은 약 0.03 mg/ml의 단백질을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 항균물질의 분자량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, DEAE-Sepharose CL-6B 젤 크로마토그래피에서 얻어진 항균활성 분획 시료는 레인 1에서 단일 밴드로 확인되며 분자량은 9.5 KDa으로 추정되었다. Klaenhammer(1993)가 보고한 젖산균 박테리오신의 네 가지 분류법에 따르면, 박테리오신의 분자량이 10 KDa 미만이므로 classⅡ에 속함을 알 수 있다.

본 발명의 미생물은 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해, 이와 동등한 활성을 갖고 안정성이 뛰어나거나 보다 뛰어난 항균 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있음은 당업자에게 충분히 이해될 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 유해 병원성 미생물에 대하여 항균 활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명자는 비피도박테리움 롱검 A24가 유해 병원성 미생물에 대하여 항균 활성을 가지는 프로바이오틱스임을 밝혔다.

본 발명에서 용어, “프로바이오틱스(Probiotics)”는 사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물 또는 이의 배양물을 의미하며, 나아가 위장관 이외의 체내 또는 체외의 미생균 균형을 개선할 수 있는 미생물 또는 이의 배양물을 의미할 수 있다. 상기 사용된 용어 “배양물”은 미생물 배양액로부터 미생물만을 제거하여 수득하거나 미생물을 포함하는 미생물 배양액으로부터 추출 용매를 사용하여 분리한 물질을 의미한다. 미생물 배양액으로부터 미생물을 제거하는 방법으로는 원심분리, 유기용매처리 등이 있으며 유용활성 성분을 분리 추출하기 위해서는 세포를 초음파로 처리하거나, 메탄올 아세톤 등의 용매 처리 후 농축할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 A24는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 생육을 억제하는 항균 활성을 가진다. 리스테리아 모노사이토제네스는 식중독을 유발하는 대표적인 미생물이다. 따라서, 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물은 식중독에 대한 예방 또 는 치료효과를 가지게 된다. 상기 조성물은 통상적인 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 유효량의 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체와 혼합하여 제조할 수 있다. 유효량의 비피도박테리움 롱검 A24는 바람직하게는 10⁸ 마리/g 이상을 의미한다. 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 혼합할 수 있다. 본 발명의 조성물은 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer), 산제, 과립제, 연고제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 경구, 비경구, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 설하, 비강내, 복강내, 직장내 등 다양한 투여 경로로 투여될 수 있으며, 경구 투여가 바람직하게 이용될 수 있다. 투여 용량은 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태 및 치료할 질병의 중증정도에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 조성물은 기존 항생제를 대체하고 유해한 미생물을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과, 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료에 첨가되는 비피도박테리움 롱검 A24의 유효량은 10⁶ 개/g 이상이며, 바람직하게는 10⁸ 개/g 이상이다. 발효사료는 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 비피도박테리움 롱검 A24를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 발효사료는 습식발효 사료화 방법과 발효건조 사료화 방법에 의해 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율 혼합한 후 50℃ 내지 60℃ 내외의 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 음식물쓰레기 등과 같은 유기물에 에너지, 단백질, 섬유소 및 미생물을 적당량 첨가하여 60℃ 내외의 온도에서 24시간 이상의 발효 및 건조과정을 통하여 생산된 사료의 수분함량이 30% 내지 40%정도로 조절하여 제조할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 식품(또는 건강기능식품) 조성물을 제공한다.

유산균은 젖산 발효를 함으로써 식품의 부패를 방지하고, 항균 물질을 분비하여 식중독균을 억제하는 등 인체에 유익한 균으로 활동한다. 유산균 발효를 이용하여 제조되는 식품으로는 치즈, 버터밀크, 요구르트, 유청(Whey)등이 있으며, 최근에는 유산균 발효에 의한 기능성 요구르트도 널리 시판되고 있다. 또한, 유산균 발효 식품들은 정장제로서의 정제, 과립제제 등으로 제조되어 식품 조성물, 의약품 등으로 시판되고 있다.

본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 미생물 또는 이의 배양물 외에 적절한 담체 및 부형제 또는 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의하여 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 드링크제의 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 식품 조성물은 표준 담체를 사용하여 동결 건조시키는 등, 공지된 방법의 사용하여 분말제 및 과립제로 제형화 될 수 있으며, 통상적인 정제 및 캡슐화 방법을 사용하여 정제 또는 캡슐 형태로도 제형화 될 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복되어 제품화될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 제형에 사용되기에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유 등이 포함된다. 본 발명의 식품 조성물의 제품화를 위하여 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 추가로 더 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 A24의 배양물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

일반적으로 유산균의 발효유를 피부에 도포하면 피부를 희게하고, 피부의 건조를 막을 수 있다는 것도 이미 널리 알려져 있다. 인체의 피부 세포에는 피부의 습윤 상태를 조절하는 자연보습인자라는 물질(예를 들면, 아미노산, 젖산나트륨, PCA-나트륨 및 요소등)이 존재하여 피부의 습윤상태(15 내지 25%의 수분)를 적절하게 조절할 뿐 아니라 피부의 pH 조절기능도 하고 있다. 그런데 이러한 자연보습인자가 피부에 부족할 경우에는 외기가 건조하고, 피부의 노화상태가 심할수록 피부의 습윤 상태를 정상적으로 유지할 수 없다. 최근, 유산균 발효액은 상기 자연보습인자의 조성비와 거의 유사한 상태의 조성비를 이루고 있어, 최근 들어 피부미용에 대한 영양 및 보습효과를 나타내는 액상 화장품에 많이 이용되고 있다. 그 이유는 유산균의 발효에 의하여 생성되는 유산균 발효액의 영양 및 보습효과가 일반적으로 유산, 유당, 및 프로테오스펩톤(proteose-peptone)등의 성분에 의하여 얻어진다는 것이 잘 알려져 있었기 때문이다. 따라서, 본 발명의 미생물인 비피도박테리움 롱검 A24의 배양물은 상기와 같은 영양 및 보습 효과가 뛰어난 화장품으로 사용될 수 있다.

보다 바람직한 양태로서, 본 발명의 미생물 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물을 포함하는 의학 조성물, 사료 조성물, 식품 조성물, 및 화장료 조성물은 비피도박테리움 롱검 A24 외에 1종 이상의 다른 유익한 균주를 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 사람이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취 시 병원성 유해 미생물을 억제하거나 포유동물의 장관 내 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미시스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 톨루롭시스(Torulopsis) 등과 같은 효모(yeasts), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 무코(Mucor), 페니실리움(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 뉴코노스톡 (Leuconostoc ), 박테로이즈(Bacteroides), 스타필로코커스(Staphylococcus), 락토코커스(Lactococcus),바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 푸조박테리움(Fusobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 그리고 마이크로코커스 (Micrococcus) 속 세균들이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리쉐니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 스브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 엔테로코커스 피케일리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 컬바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락 토바실러스 팔시미누스 (Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 게세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 세이크(Lactobacillus sake), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 마이크로코커스 베어리언스(Micrococcus varians), 페디오코커스 에시디락티시 (Pediococcus acidilactici) 및 스타필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus )등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예

1. 시료의 채취 및 보존

본 실험에 사용된 균주 분리시료는 강원도 원주소재의 소아과 병원으로부터 건강 상태가 양호한 약 100여명의 유아 분변을 채취한 후 냉장고에 보관하면서 12시간 이내에 분리용 시료로 사용하였다.

2. 균주의 분리

유아의 분변을 멸균된 면봉으로 채취하여 0.05%(w/v) L-cysteine (Sigma, St. Louis, MO)을 함유한 MRS (Difco, Detroit, MI) 액체배지에 현탁하고 펩톤수(peptone water)을 사용하여 순차적으로 십진희석한 후 BL 한천 평판배지 (Eiken chemical, Tokyo, Japan)에 100 ㎕씩 도말하여 혐기 배양기에 혐기성 시스템(anaerobic system)(Gaspack; Oxoid, Basingstoke, Hampshire. England)을 이용하여 혐기적 조건을 만든 후 37℃에서 36시간동안 배양하였다. 배양한 후에 한천 배지상에 자란 유백색의 콜로니를 취하여 그람 염색한 후 형태를 관찰하여 분리하였다.

3. 피검균주의 배양

실험에 사용된 피검균주로는 식중독을 유발하는 병원성 세균인 리스테리아 모노사이토제네스 KCCM 40307^T(Listeria monocytogenes KCCM 40307^T), 바실러스 케레우스 KCCM 11204^T(Bacillus cereus KCCM 11204^T), 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 25923^T(Staphylococcus aureus ATCC 25923^T)을 사용하였다. 리스테리아 모노사이토제네스는 brain heart infusion (BHI; Difco, Detroit, MI) 액체배지를 사용하여 37℃에서 12시간동안 배양하였고 바실러스 세레우스와 스타필로코커스 아우레우스는 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)(TSB; Difco, Detroit, MI)를 사용하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.

4. 항균활성 물질 생산 균주의 선별

항균활성이 높은 균주를 선별하기 위해서 각 분리균주들은 0.05% L-cysteine 이 첨가된 MRS 액체배지에 2%(v/v)를 접종한 후 3회 계대배양을 하였다. 원심분리(10,000×g / 15min)를 하여 상등액을 취하고 pH 7.0 으로 조정한 후 여과제균(0.45㎛, Whatman, Springfield Mill, England)을 하였다. 리스테리아 모노사이토제네스는 BHI 액체배지 4 ㎖에 2%를 접종하고 상기 여과 제균한 상등액 (pH-controlled filtrate supernatant; PCFS) 1 ㎖을 첨가한 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. B. cereus 와 Staph . aureus는 TSB 4 ㎖에 각각 2%(v/v)를 접종하고 PCFS (pH 7.0)를 1 ㎖씩 첨가한 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 대조군은 위와 같은 조건에서 PCFS(pH 7.0) 대신에 0.05% L-cysteine을 함유한 MRS 액체배지 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 다음 Jack 등(1995)의 방법에 따라 항균활성을 측정하여 균주를 선발하였다. 분리균주들의 PCFS(pH 7.0)에 대한 항균활성은 배양액을 UV-Visible spectrophotometer (AnaLab Co. Korea)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정한 후 증식저해 정도를 항균활성으로 표시하였다. 즉 수학식 1과 같이 대조군의 배양 상등액의 흡광도와 PCFS를 첨가한 배양 상등액의 흡광도의 차를 백분율로 계산하여 선별하였다.

또한 Tagg 와 McGiven (1971)의 페이퍼 디스크(paper disc) 방법을 사용하여 선별균주의 항균활성 정도를 확인하였다. 항균활성의 효과를 결정하기 위해 리스테리아 모노사이토제네스를 피검균주로 1%(v/v) 접종한 TSB에 직경 8 mm의 페이퍼 디스크(paper disc) (Advantec, Japan)를 올려놓은 후 20배 농축 (Micro cenvac, n-Biotek, Korea)한 선별균주의 PCFS(pH 7.0) 80 ㎕을 조심스럽게 적가한 다음 37℃에서 12시간동안 배양한 후 생성된 저지환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하였다.

5. 균주의 동정

(1) 형태학적 동정

선별균주의 동정은 그람 염색, 카탈라제(catalase) 반응실험, 스포어(spore) 형성유무, CO₂ 생성유무, 이동(motility) 시험 등을 수행하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(8th ed.)에 따라 분류하였다. 그람 염색한 후 현미경을 통해 형태학적 특성을 관찰하였고, 카탈라제 반응 실험은 3% H₂O₂ 용액을 배양액과 반응시킨 후 기포의 발생 유무에 따라 양성(positive)과 음성(negative)으로 판정하였다. 포자(spore)형성 유무시험은 배양액을 0.05% L-cycteine이 함유된 MRS 액체배지에 접종하고 80℃에서 10분간 가열처리한 후, 새로운 배지에서 24시간 배양하면서 균체가 생성되면 포자형성 균주로 판정하였다. CO₂ 생성유무는 균주의 액체배양 중 Durham tube (Ø 8LXL /35mm, 대한)를 이용하여 판정하였다. 운동성은 MRS 고체배지 (0.75%, w/v)에 천자배양하여 증식 형태에 따라 운동성 여부를 판정하였다.

(2) 주사전자현미경 촬영

선별균주들의 형태를 정밀하게 관찰하기 위하여 24시간 배양한 균체를 2.5% 글루타알데하이드(glutaraldehyde)가 함유된 0.1M 인산염 완충액을 사용하여 4℃에서 4시간 전고정시킨 후 0.1M 인산염 완충액 버퍼로 3～4회 세척하고 1% osmium tetraoxide (OsO₄)가 함유된 완충액를 사용하여 90분간 처리 후 고정하였다. 다시 0.1M 인산염 완충액으로 세척한 후 30～100% 알코올을 사용하여 순차적으로 탈수하였다. 이를 시료대에 부착하고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 리드 사이트레이트(lead citrate)로 이중 염색한 후 주사전자현미경 사진기 (Scanning electron micrograph; 50A-MRH, Japan)를 이용하여 촬영하였다.

(3) 당 이용성 실험

선별균주의 당 이용성 조사는 Kim 등(1999)의 방법에 따라 BL 한천 평판배지에서 취한 콜로니를 API 50 CHL 배지(API, Biomeriuex, France)에 현탁시키고 이 현탁액을 API 50 CH 스트립(strip)에 접종하여 37℃에서 72시간동안 배양한 후 각각의 당 이용성을 각각 실험하였다.

(4) Polymerase Chain Reaction ( PCR )을 이용한 동정

16S ribosomal rDNA 분석을 위한 게노믹(genomic) DNA 추출은 Sambrook 등(1989)의 방법을 변형하여 사용하였다. STE 완충액 (10M NaCl, 10mM TrisㆍCl, pH8.0 and 1mM EDTA)에 배양한 균체를 현탁하고 라이소좀 용액 (20mg/ml in 10mM TrisㆍCl, pH8.0)을 첨가하였다. 40초 동안 열처리를 한 후 5분 동안 빙냉수(ice-cold water)에서 냉각을 하였다. 그 후에 원심분리(25,000×g / 30min)를 하고 비피도박테리움 속을 확인하기 위하여 속-특이적 프라이머(genus-specific primer)와 종-특이적 프라이머(species-specific primer)를 사용하여 PCR을 각각 수행하였다. 전자는 정방향 프라이머 Bif164-PCR (5'-GGGTGGTAATGCCGGATG-3')와 역방향 프라이머 Bif662-PCR (5'-CCACCGTTACACCGGGAA-3')를 사용하였고(Langendijk et al., 1995), 94℃/2 min(1 회), 94℃/1 min, 55℃/30 sec 그리고 72℃/ 2 min (25 회) 72℃/7 min(1 회) 그리고 나서 1분 동안 4℃의 조건에서 후자는 정방항 프라이머 (5'-TCATCGACGGCAAGAAGAC-3')와 역방향 프라이머(5'-GACGGCCGGTGAGCAGGTA-3')를 사용하여 94℃/5 min(1 회), 94℃/30sec, 52℃/ 30sec(1회에 0.2℃씩 상승), 그리고 72℃/2 min(35 회), 72℃/5 min(1 회)의 조건에 PCR (programmable thermal cycler PTC-100, MJ Research, U.S.A)로 증폭하였다.

(6) Plasmid DNA 분리

플라스미드 DNA를 신속하게 분리하기 위하여 미니-프렙(mini-prep)법(Sambrook 등, 1989)을 변형하여 사용하였다. 선발균주를 0.05%(w/v) L-cysteine이 함유된 MRS 액체배지에서 37℃, 16시간 배양한 후 원심분리(10,000×g / 5min)를 하여 균체를 침전시킨다. 침전된 균체를 냉각된 200 ㎕의 solution Ⅰ 완충액 (50mM glucose, 10mM EDTA, 25mM TrisㆍHCl, pH 8.0)에 현탁한 후 37℃에서 1시간정도 반응시킨 후 solution Ⅱ (1% SDS, 0.2N NaOH) 200 ㎕를 첨가하여 얼음에서 10분간 방치하였다. 여기에 solution Ⅲ (0.5M potassium acetate buffer, pH 4.8) 150 ㎕를 첨가하여 얼음에서 10분간 방치한 뒤 원심분리(10,000×g / 15min)를 하여 상등액을 얻고 여기에 RNase 3 ㎕를 첨가하고, 37℃ 수욕에서 15분간 반응시켰다. 그리고 각각 50 ㎕씩의 페놀과 클로로포름을 가하여 혼합한 후 원심분리(10,000×g / 15 min)를 하였다. 그 후 상등액을 350 ㎕ 취하여 동량의 차가운 이소프로판올(cold isopropanol)을 첨가한 후 -70℃ deep freezer에서 30분 이상 방치한다. 원심분리(10,000×g / 15min)를 하여 DNA를 침전시키고 이를 70% 에탄올로 세척한 후 상온에서 건조하고 적당량의 증류수에 녹여 플라스미드 DNA로 사용하였다.

(7) 젤 전기영동( Gel electrophoresis )

PCR 생산물과 플라스미드 DNA를 확인하기 위해서 2% 아가로즈와 0.8% 아가로즈를 각각 TAE(Tris-Acetate-EDTA) 완충액(pH 8.3)에 녹여 사용하였으며, 시료 5 ㎕와 3 ㎕의 로딩 버퍼(6X; Sambrook 등, 1989)를 젤에 주입하여 100 볼트에서 30분간 전기영동을 수행하여 확인하였다. 전기영동이 끝난 DNA는 UV transilluminator (Spectroline TR-302, U.S.A) 위에서 관찰하였다. 전기영동한 젤 사진은 EtBr(ethidium bromide)(0.5 mg/ml)에 염색을 하였으며 마이크로 렌즈와 UV 및 적색 필터를 부착한 디지털사진기 (Olympus, C-4000, Japan)를 사용하여 자외선 조명 하에서 촬영하였다.

(8) 최적배양 조건

선별균주의 최적배양 조건 검토를 위하여 탄소원 측정을 위한 기본배지(proteose peptone 10g, beef extract 5g, yeast extract 2.5g, Tween 80 1g, ammonium citrate 2g, sodium acetate 5g, magnesium sulfate 0.1g, manganese sulfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, L-cysteine 0.5g)에 탄소원 (glucose, fructose, lactose, galactose, sucrose)을 농도별 (0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0%(w/v))로 각각 첨가하였다. 질소원 측정을 위한 기본배지 (glucose 20g, Tween 80 1g, sodium acetate 2.5g, magnesium sulfate 0.1g, manganese sulfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g)에는 유기 질소원 (proteose peptone, beef extract, yeast extract, soytone, tryptone)와 무기 질소원 ((NH₄)₂SO_{4 ,} urea, NH₄Cl, NH₄NO₃)을 농도별(0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0%(w/v))로 각각 첨가하고 dir 하루동안 배양한 종배양액을 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 혐기적 조건으로 24시간 배양하였다.

(9) 균체증식 및 항균활성 물질 생산조건

선별균주는 0.05%(w/v) L-cysteine이 첨가된 MRS 액체배지에 2%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간동안 정치 배양하였다. 선별균주의 생육 정도는 48시간동안 4시간 간격으로 배양액을 취해서 UV-Visible spectrophotometer(AnaLab Co. Korea)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였고 피검균주에 대한 항균활성은 Jack et al.(1995)의 방법을 사용하여 측정하였다.

(10) 선별균주의 항생제 감수성

분리된 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 분리주의 항생제 감수성을 Sensi-Disc^TM susceptibility test disc (Becton, Dickinsion and Company, Sparks, MD, USA)을 이용하여 상법(Bauer et al., 1966)에 따라 실시하였다. 페이퍼 디스크(paper disc)에 들어 있는 항생제의 종류와 농도는 겐타마이신(gentamycin) 10 ㎍, 콜리스틴(colistin) 10 ㎍, 네오마이신(neomycin) 30 ㎍, 암피실린(ampicillin) 10 ㎍, 스트렙타마이신(streptomycin) 10 ㎍, 옥시테트라사이클린(oxytetracycline) 30 ㎍, 에리트로마이신(erythromycin) 15 ㎍이었다.

(11) 항균활성 물질의 특성 실험

항균물질의 특성 중 열안정성 조사를 위해 선별균주의 배양 상등액을 60℃에서 30 min, 80℃에서 20 min, 100℃에서 10 min, 121℃에서 15 min으로 열처리를 하여 피검균주에 대한 항균활성을 측정하였다. pH 안정성은 pH 3.0～11.0 범위로 변경한 후 다시 pH 7.0으로 조정하여 항균활성을 측정하였다. 단백질 변성 내성을 알아보기 위해 배양 상등액에 10% TCA를 첨가하여 원심분리(1,000×g / 15min)한 후 상등액을 취해 pH 7.0으로 조정하여 항균활성을 측정하였다. 단백질 분해 효소의 내성을 조사하기 위해서는 프로네이즈 E(pronase E)(Sigma, St.Louis, MO)와 프로테이네이즈 K(proteinase K)(Sigma, St. Louis, MO)를 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 10 mg/ml 농도로 녹인 후 배양 상등액에 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 100℃에서 5분 동안 열처리를 하여 반응을 정지하였다. 그리고 피검균주에 대한 항균활성을 측정하였다.

(12) 항균활성 물질의 분리 및 정제

항균물질의 정제는 선별균주의 배양액을 원심분리(10,000×g / 15min)한 후 상등액을 취하고 pH 7.0으로 조정하였다. 한외여과장치(ultrafiltration: Amicon, Beverly, MA; cut-off 3,000 Da)를 사용하여 잔류한 층을 모아서 농축하였다. 그 농축액은 에 황산암모늄(ammonium sulfate)를 50% 포화농도로 첨가한 후 4℃에서 6시간동안 방치하고 원심분리(18,000×g / 20min)한 후 침전물을 50mM 인산염 완충액(potassium phosphate buffer)(pH 7.0)에 현탁하였다. 투석(dialysis) 장치(Sigma ; cut-off 2,000 Da)를 사용하여 1ℓ의 멸균증류수를 8시간마다 2회 교환하여 4℃에서 24시간동안 방치하였다.

위의 과정에서 얻어진 시료는 음이온 교환수지 DEAE-Sepharose CL-6B (Sigma Co.) 컬럼(16×380 mm)을 사용하여 0.1M Tris-HCl buffer(pH 7.0)에 NaCl을 0～1M 농도 구배로 1 ml/min 유속으로 용출하였다. 얻어진 정제 시료는 동결건조한 후, 단백질 정량과 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(HPLC, Waters, Milford, MA, USA) 분석을 위한 시료로 사용하였다.

(13) 고성능 액체 크로마토그래피( High performance liquid chromatography )

Symmetry C18 컬럼(4.6×250 mm)을 이용한 역상 고성능 액체크로마토그래피(HPLC, Waters, Milford, MA, USA) 분석을 하였다. 용출용매로는 메탄올과 증류수를 1 : 9 비율의 용매를 사용하였으며 1.0 ml/min의 유속으로 용출하였다. 검출기는 UV-2075(Jasco Inc. Japan)을 사용하여 280 nm에서 측정하였고 시료는 20 ㎕를 주입하였다.

(14) 항균활성 물질의 단백질 정량

단백질의 정량은 Ohnishi와 Barr (1978)의 정량법에 따라 실시하였다. 검체성분 용액 50 ㎕에 Biuret reagent(0.75 mmol/l cupric sulfate, 94 mmol/l sodium hydroxide)를 550 ㎕ 넣고 서서히 교반한 후, 실온에서 10분 동안 방치하였다. 그 다음에 25㎕의 Folin-Ciocalteau 시약을 넣어 서서히 교반하고 실온에서 30분 동안 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 단백질은 BSA(Sigma)을 사용하여 표준곡선(standard curve)을 작성하였고 시료의 흡광도로 단백질 함량을 계산하였 다.

(15) SDS - PAGE 분석

분리정제된 항균물질을 20% SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동을 한 후 표준단백질과의 이동속도를 비교하여 분자량을 계산하였다. SDS-PAGE는 Laemmli 등(1970)의 방법을 사용하였으며 알부민(albumin)(M.W. 66,000), 오브알부민(ovalbumin)(M.W. 45,000), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(M.W. 36,000), 카르보닉 안하이드라제(carbonic anhydrase)(M.W. 29,000), 트립시노겐(trypsinogen)(M.W. 24,000), 트립신 억제제(trypsin inhibitor)(M.W. 20,000), α-락트알부민(α-lactalbumin)(M.W. 14,200), 아프로티닌(aprotinin (M.W. 6,500) 이었다. 시료는 2× 샘플버퍼(1 M Tris-HCl buffer(pH 6.8) 1.2 ml, 10% SDS 4 ml, β-mercaptoethanol 1 ml, glycerol 5 ml, 1% bromphenol blue 2 ml in distilled water 20 ml)와 1 : 1로 혼합하여 100℃에서 3분간 가열한 후 시료를 준비하였다. 20 ㎕의 시료와 표준단백질(Sigma co. USA) 6 ㎕를 각각의 레인에 주가하여 60V로 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 염색용액 (0.1% Coomassie brilliant blue R-250, 45% methanol, 10% acetic acid, 45% D.W.)에서 2시간 동안 염색하고 탈색 용액 (45% methanol, 10% acetic acid, 45% D.W.)에서 1시간 동안 탈색시킨 다음 밴드를 관찰하였다.

실시예 2: 유아의 분변으로부터 균주의 분리 및 선별

BL 한천 평판배지를 사용하여 100명의 유아분변으로부터 총 52 균주를 분리하였다. 피검균주에 대한 항균물질 생산 균주에 관한 선별은 대조군의 배양액 흡광도와 PCFS(pH 7.0)를 첨가한 배양액의 흡광도 차를 백분율로 계산하였는데, 대부분의 분리균주들은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 보다 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 대한 항균활성이 높았고 그 중에서도 항균활성이 45% 이상을 나타낸 5 균주(A24, B1, B6, B10, B12)를 선별하였다(표 1).

그리고 배양시간 차이에 따른 항균활성의 정도를 알아보기 위해 선별된 5 균주와 피검균주인 리스테리아 모노사이토제네스의 배양시간을 각각 다르게 한 후 항균활성을 측정하였는데(표 2), 선별된 5 균주를 36시간 배양하였을 때 항균활성이 가장 높게 나타났다. 또한 페이퍼 디스크를 사용하여 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 항균활성을 측정한 결과(도 5)를 보면, 대부분의 저지환(clear zone)이 유사하여 이 방법으로는 선별된 5 균주의 항균활성 정도 차이를 거의 구별할 수 없어 항균활성 측정방법으로 Jack et al.(1995)의 방법을 선택하여 사용하였다.

실시예 3: 선별균주의 동정

형태학적 분석을 위해서 선별균주 A24를 현미경으로 관찰한 결과 그람 양성, 간균, Y자, 곤봉 형태를 보였다(도 6). 주사전자현미경(SEM; Scanning electron micrograph)을 통하여 선별균주를 관찰한 결과 Y-모양 과 V-모양의 부정형(도 7)을 나타냈으며, 길이는 3～5.5 ㎛ 이고 폭은 0.8～1 ㎛ 이였다. 생화학적 동정 결 과 카탈라아제(catalase) 음성과 내생포자(spore)를 형성하지 않고 CO₂를 생성하지 않으며 운동성을 가지고 있지 않음을 확인하였다. 이 결과를 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(8th ed.)의 분류에 따라 전형적인 비피도박테리움 속의 균주로 판단되었다.

당 이용성을 조사한 결과, 선별균주는 L-아라비노즈(L-arabinose), 리보즈(ribose), D-자일로즈(D-xylose), 갈락토즈(galactose), 글루코즈(glucose), 만노즈(mannose), 소르비톨(sorbitol), 프럭토즈(fructose), 에스쿨린(esculin), 말토즈(maltose), 락토오즈(lactose), 멜리비오즈(melibiose), 사카로즈(saccharose), 라피노즈(raffinose), 투라노즈(turanose) 등의 당에 대한 이용성이 양호하였으며(표 3), Kim 등(1999)이 분리한 비피도박테리움 롱검 MK-G7과 당 이용 양상이 매우 유사하였고, A24 균주와의 상호 비교를 위해 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707^T의 당 이용 결과를 확인하였다(도 8). 또한 Mitsuoka(1969)에 의해 보고한 당 발효 특성에 비교했을 때 (도 9)에서 보는바와 같이 비피도박테리움 롱검으로 잠정적으로 동정되었다.

보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA 분석을 하였다. 속-특이적 프라이머는 비피도박테리움 16S rDNA의 변이 V2와 V4의 영역에 위치한 18개 올리고뉴클레오타이드인 정방향 프라이머 Bif164-PCR (5′-GGGTGGTAATGCCGGATG-3′)와 역방향 프라이머 Bif662-PCR (5′-CCACCGTTACACCGGGAA-3′)을 각각 사용하였다(도 10). 이 프로브의 타겟 영역은 속 특이적 인 시츄 하이브리제이션(genus specific in situ hybridization) 실험에 유용한 16S rRNA의 비피토박테리움-특이적 영역(Bifidobacterium-specific regions)로서 이전에 기술되었다(Langendijk et al., 1989). 본 연구에서는 종-특이적 프라이머로서 정방향 프라이머(5'-TCATCGACGGCAA GAAGA-3')와 역방향 프라이머 (5'-GACGGCCGGTGAGCAGGTA-3')를 각각 사용하였다(도 11).

실시예 4: 플라스미드 DNA 분석

분리균 A24의 유전자를 확인하기 위하여 플라스미드 DNA를 분리하여 전기 영동한 결과는 (도 12)에 나타내었다. 그 결과 3개의 플라스미드를 가지고 있으며 각각의 플라스미드 크기는 약 37.2 kb, 3.5 kb 그리고 2.3 kb이였다. 인체에서 분리된 비피도박테리아 중에서는 현재까지 B. longum과 B. breve 만이 플라스미드를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다(Sgorbati et al., 1986; Sgorbati et al., 1982). 그리고 또한 플라스미드 DNA와 유산균의 기능성에 대한 연관성의 유무는 이후 더 많은 연구를 통해 규명될 필요성이 있다.

실시예 5: 선별균주의 최적배양 조건 검토

(1) 최적배양 조건을 위한 탄소원의 영향

비피도박테리움 롱검 A24의 배양 시 최적의 탄소원을 알아보기 위하여 기본배지에 각종 탄소원의 농도를 2%(w/v)로 첨가하고 37℃에서 24시간 배양한 결과는 (도 13)와 같다. 탄소원의 종류로는 글루코즈(glucose), 프럭토즈(fructose), 락토오즈(lactose), 갈락토즈(galactose), 수크로즈(sucrose)를 사용하였는데 비피도박테리움 롱검 A24는 글루코즈를 탄소원으로 하였을 때의 증식이 가장 우수하여 최적 탄소원을 글루코즈로 선정하였다.

글루코즈를 기본배지에 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0%(w/v)의 농도로 각각 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 결과(도 14) 탄소원으로 글루코즈가 2.0% 첨가하였을 때 가장 우수하였다.

(2) 최적배양 조건을 위한 질소원의 영향

탄소원으로 글루코즈를 2.0%(w/v) 첨가한 기본배지에 여러 종류의 질소원을 1%(w/v)로 첨가하여 비피도박테리움 롱검 A24를 37℃에서 24시간 배양한 결과는 (도 15)과 같다. 질소원을 유기 질소원과 무기 질소원으로 구분하여 실험한 결과, 비프 추출물 첨가시 월등히 우수한 반면에 무기 질소원만으로는 증식이 매우 미약하다는 것을 확인하였다.

질소원 중에서 가장 우수한 쇠고기 엑기스를 사용하여 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0%(w/v)의 농도로 기본배지에 각각 첨가하여 24시간 배양한 결과를 (도 16)에 나타내었다. 쇠고기 엑기스가 3%(w/v)의 농도로 기본배지에 함유되었을 때 증식이 가장 우수한 것으로 나타났고 4%와 5%의 농도에서는 오히려 증식이 감소되었다.

실시예 6: 균체의 증식 및 항균활성 물질 생산조건

비피도박테리움 롱검 A24를 0.05%(w/v) L-시스테인(L-cysteine)이 첨가된 MRS 액체배지에서 37℃, 48시간동안 정치 배양한 후 4시간 간격으로 배양액을 취해서 흡광도와 항균활성을 측정한 결과는 (도 17)에 나타내었다. 균체의 생육은 28시간 배양시 최고에 도달하였지만 항균활성은 그 보다 늦은 36시간 배양에서 최고를 나타내었으며 그 이후에는 활성이 약간 감소하는 경향을 보였다. 박과 허(1996)에 의하면 0.05% 이상의 L-시스테인을 첨가하였을 때 비피도박테리아 생육이 높게 나타났으나, 0.10 ～ 0.20% 나 0.05%의 L-시스테인을 첨가시, 유사한 증식율을 나타낸다고 보고하였다. 또한 비피도박테리아를 혐기적으로 배양하는 이유는 과산화수소(H₂O₂)의 축적을 방지하기 위해서인데, 과산화수소가 축적되면 프럭토즈-6-인산 포스포케토레이즈(fructose-6-phosphate phosphoketolase)를 불활성화시켜 발효과정의 경로가 저해된다고 보고되었다(Leyer and Johnson, 1992). 이러한 이유로 비피도박테리아를 배양함에 있어 MRS 액체배지에 0.05%(w/v) L-시스테인을 첨가하여 균을 배양하였다.

실시예 7: 항생제 감수성 측정

항생제 감수성을 조사하기 위해서 BL 한천평판배지에 비피도박테리움 롱검 A24를 접종하여 중층한 후 항생제 페이퍼 디스크(BBL^TM Sensi-Disc^TM, BD Biosciences, U.S.A)를 사용하여 항생제 감수성을 비교 조사하였다. 7여 종의 항생제(gentamycin, colistin, neomycin, ampicillin, streptomycin, oxytetracycline, erythromycin)를 페이퍼 디스크 방법으로 조사한 결과는 (도 18)에 나타내었다. 항생제 중에서 앰피실린(ampicillin)(10 ㎍)과 에리트로마이신(erythromycin)(15 ㎍)의 농도에서 감수성을 나타내었고, 반면에 콜리스틴(colistin)에 대해서는 항생제 내성을 가지고 있다는 것이 확인되었다. 콜리스틴의 특성은 그람 음성균에만 감수성을 가지고 있기 때문에 비피도박테리움 롱검 A24이 그람 양성균이라는 사실을 입증해 주었다. Kim 등(1999)이 분리한 비피도박테리움 롱검 MK-G7 균주는 페닐실린-G(penicillin-G)와 에리트로마이신(erythromycin)에 대한 선택적 내성이 가장 강한 것으로 밝혀졌고 농도 범위(31.25～2,000 ㎍/ml)에서 생육 억제환을 전혀 나타내지 않았다고 보고하였다. Zhou et al.(2005)이 분리한 락토바실러스와 비피도박테리움 속 균주들은 β-락탐계 항생제(penicillin, ampicillin, cephalothin)와 그람 양성균 항생제(erythromycin, novobiocin) 및 광범위한 항생제(chloramphenicol, rifampin, spectinomycin, tetracycline) 등에 감수성을 나타낸 반면에 그람 음성균 항생제(fusidic acid, nalidixic acid, polymyxin B)와 aminoglycoside계 항생제(gentamicin, kanamycin, neomycin, streptomycin)등에 내성을 가지고 있다고 보고하였다. Yazid 등(2000)은 10종의 비피도박테리움 속으로 항생제 내성 실험을 수행하였는데, B. longum ATCC 15707^T과 B. longum ATCC 15708^T은 B. longum A24와 유사하게 콜리스틴에 대한 항생제 내성을 가진 반면에 젠타마이신(gentamycin), 네오마이신(neomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline) 등의 항생제에 대해서도 내성이 있다고 보고하였다. 비록 같은 종의 B. longum 이라도 서로 다른 항생제 내성의 균주가 있음을 나타내었다.

실시예 8: 항균활성 물질의 특성

항균물질의 특성 중에서 열안정성 실험을 위하여 비피도박테리움 롱검 A24의 배양 상등액을 60℃에서 30min, 80℃에서 20 min, 100℃에서 10min, 121℃에서 15 min으로 열처리를 한 후 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 항균활성을 측정하였다.

(도 19)에서 보듯이 60℃～121℃까지 대체로 열에 안정한 물질로 확인되었다. pH 안정성은 pH 7.0에서 가장 항균활성이 높았으며(도 20), 이 항균물질은 산과 알칼리에 영향을 받았을 때 활성이 감소한다는 것을 확인하였다. 10% TCA를 첨가하여 단백질 변성 내성을 알아보았는데 항균활성이 조금 감소하였고 단백질 분해 효소에 대한 내성을 조사하기 위해서 프로네이즈 E(pronase E)와 프로테이네즈 K(proteinase K)를 처리한 결과, 역시 항균활성이 현저히 감소하였다. 이로써 비피도박테리움 롱검 A24가 생산하는 항균물질은 열에는 안정하지만 산과 알칼리의 pH, TCA, 단백질 분해 효소에 의해서 항균활성이 소실되는 경향을 나타내어 저분자 펩티드 물질인 것으로 생각되었다.

실시예 9: 항균활성 물질의 분리 및 정제

비피도박테리움 롱검 A24이 생산하는 항균물질을 분리정제하기 위하여 배양액을 한외여과(ultrafiltration) 장치(cut-off 3,000 Da)를 사용하여 농축한 후 황산암모늄으로 50% 포화시켜 침전시키고 강제 여과장치(cut-off 2,000 Da)를 사용하여 4℃에서 24시간 방치하였다.

분리 과정에서 얻어진 시료는 음이온 교환수지 DEAE-Sepharose CL-6B column을 사용하여 0.1 M Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)에 NaCl을 0～1 M 농도 구배로 1 ml/min 유속으로 용출하여 5 ml 씩 80개 분획을 받았다. 이때 각 분획의 항균활성은 Jack et al.(1995)의 방법에 따라 측정하였으며 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 항균활성이 높게 나타난 19～27번 분획 시험관들의 용액(도 21)을 모아서 동결건조를 하였다.

이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리된 활성분획물을 증류수에 녹여Symmetry C18 컬럼을 이용한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 하였다. 용출용매의 종류와 linear gradient 조건, flow rate의 변화 등 여러 가지 조건으로 반복 실험한 결과 이동상으로 메탄올과 증류수를 1 : 9 비율의 용매를 사용하여 1.0 ml/min의 유속으로 용출하였을 때 가장 분리가 잘되는 것으로 관찰되어 이 조건으로 preparative HPLC를 행하였다. 그 결과 도 22에서와 같이 3개의 피크로 나타났고 이 분획들을 취하여 Jack et al.(1995)의 방법에 따라 항균활성을 측정하였는데 B번 피크에서 리스테리아 모노사이토제네스에 대해 38%의 항균활성을 나타내었고 다른 피크에서는 거의 항균활성을 나타내지 않았다.

실시예 10: 항균활성 물질의 단백질 함량

이온 교환 크로마토그래피를 통해 분리된 활성분획물 50 ㎕에 biuret reagent를 550 ㎕ 넣고 서서히 교반한 후 실온에 10분 동안 방치하였다. 25 ㎕의 Folin-Ciocalteu 시약을 넣고 서서히 교반하고 실온에 30분간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)을 사용하여 표준 그래프를 작성하였고 이 표준 곡선 그래프에 흡광도를 적용시킨 결과 0.03 mg/ml의 단백질 함량을 함유하고 있었다.

실시예 11: 항균활성 물질의 분자량 측정

항균물질의 분자량을 측정하기 위하여 20% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하였다. 도 23의 전기영동 결과에서 DEAE-Sepharose CL-6B 젤 크로마토그래피에서 얻어진 항균활성 분획 시료는 레인 1에서 단일 밴드룰 보여주므로 정제가 되었음을 보여주고 있다. 또한 표준단백질들로 구성된 분자량 마커들과 비교하여 분자량을 측정한 결과 비피도박테리움 롱검 A24이 생산하는 항균물질의 분자량은 9.5 KDa 추정되었다.

Klaenhammer(1993)가 보고한 젖산균 박테리오신의 네 가지 분류법에 따르면, 위 같은 결과로 보아 박테리오신의 분자량이 10 KDa 미만이므로 classⅡ에 속함을 알 수 있었다. ClassⅡ 박테리오신으로는 락토바실러스 속의 경우 락타신 F(lactacin F)(6.3 KDa; Klaenhammer 1993, Muriana and Klaenhammer 1991)와 락타신 B(lactacin B)(6.0 KDa; Barefoot and Klaenhammer 1991, 1994), 락토코커스 속의 경우 디플로코신(diplococcin)(5.3 KDa; Davey and Richardson 1991), 락토코신 A(lactococcin A)(5.8 KDa; Holo et al. 1991), 락토코신(lactococcin)(2.3 KDa; Dufour et al. 1991) 및 락티신 481(lacticin 481)(1.7 KDa; Piard et al. 1993)등이 보고되었으며, 페디코커스 속의 경우 패디오신 AcH(pediocin AcH)(2.7 KDa; Bhunia et al. 1987, 1988, 1990) 레우코노스톡 속의 경우 레우코신 A-UAL 187(leucocin A-UAL 187)(3.9 KDa; Hastings et al. 1991) 메센테리신 5(mesentericin 5)(4.5 KDa; Daba et al. 1991) 및 메센테리신 Y105(mesentericin Y105)(2.5～3.0 KDa; Hechard et al. 1992) 등이 지금까지 보고되었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 유해 병원성 미생물, 특히, 대표적인 식중독균인 비피도박테리움 롱검 A24에 대한 항균 효과가 뛰어난 본 발명의 신규 균주인, 비피도박테리움 롱검 A24 또는 이의 배양물은 의약 조성물, 사료 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

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Claims (7)

1. 비피도박테리움 롱검 A24 (Bifidobacterium longum A24) (KCCM-10683P).
2. 제1항에 있어서, 플라스미드를 포함하는 비피도박테리움 롱검 A24.
3. 비피도박테리움 롱검 A24(KCCM- 10683P) 또는 이의 배양물을 포함하는, 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 항균활성을 가지는 조성물.
4. 삭제
5. 비피도박테리움 롱검 A24 (KCCM-10683P) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물.
6. 비피도박테리움 롱검 A24 (KCCM-10683P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물.
7. 비피도박테리움 롱검 A24 (KCCM-10683P) 또는 이의 배양물을 포함하는 화장료 조성물.

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