FI110366B - Menetelmä b-hydroksipropionaldehydin sekä sitä tuottavien mikro-organismikantojen valmistamiseksi - Google Patents

Description

110366

Menetelmä β-hydroksipropionaldehydin sekä sitä tuottavien mi kr o - or gani smi kant o j en valmistamiseksi 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu kantahakemuksesta 895197.

Tämä keksintö koskee menetelmiä reuteriinia tuottavien Lactobacillus reuteri -kantojen eläinlähteistä eristämiseen ja kasvatukseen ja menetelmiä reuteriinin ja sitä tuottavien 10 mikro-organismien valmistamiseksi.

Lactobacillus reuteri, Lactobacilluksen äskettäin nimetty laji (jotkin tämän lajin kannat identifioitiin äskettäin Lactobacillus fermentumiksi (1,2)), on ihmisen, sian ja mui-15 den eläinten ruoansulatuskanavan (GI-kanavan) symbioottinen asukas. L. reuterin neotyyppikanta on DMS 20016 (ATCC no. 53609). Tämä kanta ja äskettäin eristetty kanta 1063 (ATCC no. 53608) ovat yleisesti saatavissa American Type Culture Collection-laitoksesta (Rockville, MD), jonne se on talle-20 tettu 17. huhtikuuta 1987. Eläinten GI-kanava on monimutkainen ekojärjestelmä, jossa asustaa arviolta 300 - 500 mikro-organismilajia, jotka tunnetaan yhteisellä nimellä syntype-räiset mikrobit. Yli 100 vuoden intensiivisestä tutkimukses-ta huolimatta suoliston mikrobiologian alalla on näistä or- • 2·5 ganismeista edelleen paljon opittavaa, monimutkainen eri !!.* lajien välillä vallitseva suhde ja mikrobien ja niiden isän- • » nän välisen symbioottisen suhteen luonne.

• * · "·' * Määrätyissä olosuhteissa jotkin syntyperäisten mikrobien jä- 30 senet saattavat tulla opportunistisiksi patogeeneiksi, jotka • · :/·· aiheuttavat joukon enteerisiä sairauksia. Useimmiten pato-’ : geenit pääsevät GI-kanavaan kuitenkin ruoan tai veden saas- tuttajina. Merkittäviä jälkimmäisistä on joukko bakteereja • · • · 110366 2 (esimerkiksi Escherichia coli, Salmonella-lajit, Shigella-lajit, Yersina intercolitita, Vibrio cholera, Vibrio para-haemolyticus, Campylobacter jejuni ja Clostridium difficile) , viruksia (esimerkiksi roto-, astro- ja cilici-virukset) 5 ja suolistoparasiitit (esimerkiksi Giardia- ja Entamoeba-lajit) . Näiden ja muiden mikro-organismien aiheuttamia akuutteja ja kroonisia enteerisiä sairauksia, jotka aiheuttavat huomattavasti inhimillistä kurjuutta ja taloudellisesti merkittävien eläinten menetystä, esiintyy maailmanlaajuisesti.

10 Määrätty mikrobitoiminta saattaa myös liittyä GI-kanavan sisäiseen mutageenien muodostumiseen.

Tiedetään myös, että syntyperäiset mikrobit esiintyvät isäntiensä kanssa symbioottisessa tai synergisessä suhteessa 15 vaikuttaen monilla myönteisillä (probioottisilla) tavoilla isännän yleisterveyteen ja hyvinvointiin. Tiedetään hyvin, että bakteerittomat eläimet eivät ole erityisen terveitä ja että niillä on huonosti kehittynyt GI-kanava. Palautteena ravinnerikkaasta ja stabiilista ekojärjestelmästä syntype-20 räiset mikrobit tarjoavat isännilleen joukon etuja, joihin kuuluvat muun muassa (i) suoja enteropatogeeneja vastaan, (ii) GI-kanavan epiteelilimakalvon normaalin kehittymisen ja • V toiminnan stimuloiminen, (iv) erilaisten vitamiinien ja myös muiden ravintoaineiden tuotto ja (v) isännän ylenmääräisen • :'· 25 endogeenisen limakalvokudoksen uudelleenmetabolointi.

* · · • · · . .·. Nykyisin tiedetään vähän syntyperäisten mikrobien koostumuk- sen ja lukumäärän säätämisestä. Katsotaan, että näiden säätyminen ovat seurausta monimutkaisista, useiden lajien väli-30 sistä vuorovaikutuksista, joihin liittyvät sellaiset tekijät kuin: redoks-potentiaali, pinnan pH, rasvahappojen inhibi-tiovaikutukset, vetysulfidi, dekonjugoituneet sappisuolat ja toistaiseksi edelleen tunnistamattomat kasvua estävät aineet v kuten myös tekijät kuten kilpailu rajoittavista ravintoai- ,·, .35 neista ja mikrobien kyky liittyä ja tarttua GI-kanavan epi-,···. teelipinnoille.

♦ · » 110366 3

Pian eläimen syntymän jälkeen Escherichia coli ja enteeriset streptokokit ovat lähes aina ensimmäiset GI-kanavassa esiintyvät bakteerit. Laktobasillit seuraavat lähes aina tai seu-raavat välittömästi perässä ja tulevat määrääväksi sisäeli-5 missä esiintyväksi ryhmäksi. Katsotaan, että pienillä sisäelinten mikro-organismeilla, erityisesti Lactobacillus- ja Streptococcus-sukuihin kuuluvilla, on suojausmerkitystä bakteeri- ja ei-bakteeripatogeeneja vastaan ja ne edistävät eläimissä tervettä painonnousua. Laktobasillien, jotka ovat 10 ravinteellisesti enterobakteereista nirsoimpien joukossa, ekologisen paikan uskotaan olevan ravintorikkaammissa alueissa paremminkin kuin GI-kanavan distaalisella alueella.

Tiedetään lukuisia tapauksia, joissa laktobasilleilla (3), 15 jotka käsittävät laajan joukon ei-patogeenisiä, ei-toksisia bakteereja, on tärkeä probioottinen merkitys eläinten ja ihmisten terveydelle ja hyvinvoinnille. Lactobacillus-lajeja lisätään ihmisten ja eläinten ravintoon sen säilyttämiseksi, parantamaan sen makua ja/tai probioottisiin tarkoituksiin 20 niin, että nämä bakteerit ovat GI-kanavan saatavilla. Esimerkiksi Lactobacillus plantarum -kantoja kasvatetaan kaupallisesti suurissa määrissä ja käytetään käynnistysviljel- ♦ Y minä joukossa ihmisten (lihatuotteet, vihannekset ja meije- * /I rituotteet) ja eläinten (säilörehut) ravinnon kaupallisessa • :'· 25 säilönnässä. Lactobacillus acidophilus -kantoja kasvatetaan kaupallisesti suurina määrinä lisättäväksi ihmis- (esimer-. .* kiksi maito) tai eläinravintoon (rehut) keinona näiden bak teerien lisäämiseksi GI-kanavaan probioottisten etujen saa- I * miseksi. Ilmoitukset Lactobacillus-hoidon edullisista vaiku-30 tuksista ovat lisääntyneet viime vuosina havaintojen myötä, joiden mukaan Lactobacillus-ravintohoito (i) antaa länsimaista ruokaa syöville ihmisille suojan paksusuolen syöpää vastaan (4), (ii) vähentää rotilla kokeellisesti aiheutettu-v ja paksunsuolen kasvaimia (5), (iii) vähentää ulosteiden ,·, 35 bakteriaalisten entsyymien pitoisuutta, joiden entsyymien ,··· tiedetään katalysoivan prokarsinogeenien muuttumista proksi- maalisiksi karsinogeeneiksi ihmisillä (6) ja (iv) alentaa sioilla veren kolesterolitasoja (7).

110366 4

Lactobacillus-metabolian metabolisten lopputuotteiden, kuten etikkahappo, maitohappo ja vetyperoksidi, antimikrobiaaliset vaikutukset ovat hyvin tunnettuja. Kahdessa laboratoriossa on havaittu, että heterofermentoivat lajit Lactobacillus 5 brevis, Lactobacillus buchneri (8) ja Lactobacillus-kanta 208-A (9,10) metaboloivat glyserolia anaerobisesti. Jäljempi kanta suorittaa anaerobisesti 2 glyserolimoolin dehydraation (johon liittyy dehydrataasi), jolloin saadaan 2 moolia β-hydroksipropionaldehydiä, joka puolestaan pilkkoutuu yhdeksi 10 β-hydroksipropionihappomooliksi ja yhdeksi 1,3-propaanidio-limooliksi. Jotkin laktobasillit tuottavat myös bakterio-siineja ja bakteriosiinityyppisiä proteiineja, joilla on bakteriosidista vaikutusta tämän lajin tai läheisten lajien muita jäseniä kohtaan. On esitetty joitain varmistamattomia 15 raportteja koskien laktobasillien tuottamia alhaisen mole- kyylipainon omaavia, antimikrobiaalisia aineita. Vaikka näiden olemassaoloa on ounasteltu jo jonkin ajan, ei tällaisia aineita ole varmistettu tai eristetty.

20 Seuraavaksi esitetään yhteenveto laktobasillien antimikro- biaalisesta vaikutuksesta tiedetyistä seikoista. Vuonna 1907 Metchnikoff (11) esitti, että happoa tuottavat laktobasillit estävät (tai antagonisoivat) GI-kanavan haitallisten mädät- täjäbakteerien kasvua. Siitä lähtien on raportoitu joukko * ;'· 25 tällaisia maitohappobakteereihin liittyviä antagonistisia • . * > vaikutuksia (12) . Useimmiten näiden antimikrobiaalisten vai- « · * , , kutusten on havaittu liittyvän metabolian pääasiallisiin * » lopputuotteisiin kuten maitohappoon ja etikkahappoon ja ve- « * typeroksidiin (13 - 18). On esitetty muita tiedonantoja, 30 jotka koskevat laktobasilleihin liittyviä antimikrobiaalisia vaikutuksia, mutta jotka vaikutukset eivät ole yhteydessä näihin tavallisiin metabolialopputuotteisiin. Gilliland ja ;.i. Speck (19) raportoivat laajakirjöisen antagonian, joka vaih- v teli erilaisilla testatuilla Lactobacillus acidophilus -kan- .·. 35 noilla. Vetyperoksidi vastasi kasvua estävästä vasteesta • · ··· osittain. Tramer (20) osoitti, että E. colin kasvun esto L.

acidophilus il la johtui maitohapon voimakkaasta germisidises-tä vaikutuksesta alhaisessa pH:ssa. Ehdotettiin myös muun • ( » 110366 5 inhibiittorin muodostumista, mutta tällaista ei tunnistettu. Myös Shahani et ai., Reddy ja Shahani, ja Hamdan ja Mikolag-cik (21 - 25) ovat tiedottaneet laajakirjöisistä antagonistisista aineista. Kaikissa näistä raporteista antagonistiset 5 aineet tuotettiin kasvattamalla Lactobacillusta 11-% rasvattoman kuivamaidon kiintoainepitoisuudella, ja niitä oli vaikea erottaa maitohaposta ja ilmenivät siten olevan täysin erillään reuteriinista. Näistä tutkimuksista suorittivat Hamdan ja Mikolagcik (24 ja 25) tehokkaimman puhdistuksen ja 10 tunnistuksen aineelle, jolle he antoivat nimen acidolin. He havaitsivat sen olevan alhaisen molekyylipainon omaava (noin 200) yhdiste, jossa ei ole typpeä ja joka on luonteeltaan hapan ja äärimmäisen kuumuutta kestävä. Olosuhteet, jossa tätä yhdistettä muodostuu, ja yhdisteen hapan luonne erotta-15 vat sen selvästi reuteriinista. Selvityksessä yoghurt-kantojen antagonisista vaikutuksista (26) ei L. acidophilus-, L. bulgaricus-, L. casei-, L. helveticus- ja L. lactis -kannoissa identifioitu muita kasvua estäviä yhdisteitä kuin maitohappo. Erään testatuista L. bulgaricus-kannoista on 20 äskettäin raportoitu tuottavan bulgarikaani-nimistä antibioottia (23) .

Joukon laktobasilleja tiedetään tuottavan bakteriosiineja, .. . jotka ovat bakteriosidivaikutuksia omaavia proteiineja.

: 25 Useimmilla laktobasillien tuottamilla bakteriosiineilla tai ··- bakteriosiinityyppisillä aineilla on kapea biologisen vaiku- : tuksen alue. Vincent et ai. (27) esitteli kuitenkin laaja- kirjoisen bakteriosiinin, jota kutsutaan laktosiiniksi ja : : : jota tuottaa joukko L. acidophilus -isolaatteja. Muita lak- :':':30 tobasillien tuottamia laajakirj öisiä bakteriosiineja ei ole esitetty (12). Bakteriosiinit ovat polypeptidejä, ja niiden kasvua estävät vaikutukset tuhoutuvat proteaasien vaikutuksesta. Reuteriini ei ole polypeptidi, eivätkä proteaasit vaikuta sen antimikrobiaaliseen vaikutukseen.

:::35

Laktobasillien kyvyn lisäksi tuottaa antibioottisia aineita : ·.: Sandine (28) on esittänyt joukon merkityksiä tai tehtäviä, joita laktobasilleilla saattaa olla ihmisen (tai eläinten) κ 110366

D

ruoansulatuskanavassa. Näihin kuuluvat: orgaanisten happojen tuotto, alhaisempi pH ja hapetus/pelkistys-potentiaali, kom-petitiiviset antagonistit, sappihappojen dekonjugointi ja karsinogeenien määrän alentaminen. Ravintoon liittyviä lak-5 tobasilleja pidetään edullisina sairauksien hoitoon, sairauksien ennaltaehkäisyssä ja tarvittavien entsyymien lähteenä .

Tämän keksinnön mukaisesti tuotetaan biologisesti puhtaita 10 L. reuteri -kantoja. Keksinnön kontrolloiduissa kasvatusolosuhteissa nämä kannat tuottavat äskettäin eristettyä ja karakterisoitua laajakirjoista antimikrobiaalista ainetta, joka on nimeltään reuteriini. Tätä antibioottia voidaan käyttää muiden mikro-organismien tappamiseen määritetyissä olo-15 suhteissa käyttäen mikro-organismia (L. reuteri), joka on ei-patogeeninen ihmisille ja muille eläimille. Keksinnön mukaista tekniikkaa reuteriinia tuottavien Lactobacillus reuteri -kantojen eristämiseksi voidaan käyttää myös muiden kantojen eristämiseen ihmisistä ja eläimistä niin, että näi-20 tä eristettyjä kantoja voidaan käyttää probioottisina aineina spesifiselle eläimelle, josta kannat eristettiin. Siten L. reuteri 1063:11a, joka on eristetty siasta, on mahdolli-sesti käyttöä probioottisena aineena hillitsemään kolibasil-loosia ja vieroitusripulitautia sioilla ja kasvattamaan nii- • ’25 den syöttötehoa. Verrattuna joukkoon muita suoraan sian ohutsuolesta eristettyjä homo- ja heterofermentatiivisia laktobasilleja ja myös L. reuteri -kantoihin 20016 ja 27273, ’···’ joita on pidetty kantaviljelmässä pitkiä ajanjaksoja, on L.

' reuteri 1063:11a voimakas autoagglutinoituminen, pinnan suu- 30 ri hydrofobisuusaste, ja se sitoutuu muita kantoja paremmin » · viljelmässä oleviin sian epiteelisoluihin. Annetaan myös me-netelmä reuteriinin tuottoon ja menetelmä reuteriinia tuottavien L. reuteri -kantojen eristämiseksi kaikkien tämän lajin asuttamien eläinten GI-kanavasta (tai ulosteista).

·3·5 Keksinnön käyttöön asettama luonnollisesti esiintyvän laaja- * i » | ‘ : kirjoisen antibiootin suurten määrien tuotto mahdollistaa ·;··; tämän antibiootin käytön laajan sairauksien joukon hoitoon ja antimikrobiaalisena aineena yleisiin tarkoituksiin.

7 110366

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

5 Kuvassa 1 esitetään reuteriinin muodostuminen aerobisissa (ravistus) ja semianaerobisissa (ravistelematta) oloissa glyseroliväliaineessa.

Kuvassa 2 esitetään L. reuteri -konsentraation vaikutus 10 (μg/τΐιl kuiva paino) reuteriinin muodostumiseen kahden L. reuteri -kannan semi-anaerobisen inkuboinnin jälkeen E. colin kanssa glyseroliväliaineessa.

Kuvassa 3 esitetään lämpötilan vaikutus reuteriinin muodos- 15 tumiseen.

Kuvassa 4 esitetään viljelyn pH:n vaikutus reuteriinin muo dostumiseen.

20 Kuvassa 5 esitetään reuteriinin tuotanto ja bakteriosidivai-kutuksen todistaminen.

*·*; Kuvassa 6 esitetään tulokset L. reuteri -näytteiden suuren * · suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC)-analyyseistä.

• « · · • 2.5 • · · II.* Kuvassa 7 esitetään reuteriinin positiivisen ionin massa-• · • · ··; spektri.

• · t • · · t · · • » · « * » '·* ' Kuvassa 8 esitetään reuteriinin negatiivisen ionin massa- 30 spektri.

• · » • · · ’t." Kuvassa 9 esitetään reuteriinin infrapunaspektri.

!!! Kuvassa 10 esitetään reuteriinin hiili-NMR-spektri.

• · •;35 : ’ Kuvassa 11 esitetään reuteriinin protoni-NMR-spektri.

110366 8

Kuvassa 12 esitetään L. reuterin-reuteriini-järjestelmän malli.

Kuvassa 13A esitetään kolonioita muodostavien yksiköiden 5 (CFU:t) ja täpliä muodostavien yksiköiden (PFU:t) prosenttiluku kullakin reuteriinitasolla lisättäessä reuteriinia faa-geilla infektoituihin viljelmiin ja kuvassa 13B esitetään CFU:iden ja PFUriden tosiasialliset määrät.

10 Kuvassa 14 esitetään reuteriinin vaikutus jauhelihan mikro-flooraan.

Kuvassa 15 esitetään reuteriinin vaikutus E. colilla siir-rostetun jauhelihan mikroflooraan.

15

Kuvassa 16 esitetään reuteriinin Fourier-muunnosinfrapuna-analyysi.

Kuvassa 17 esitetään reuteriinin nestekromatografia/massa-20 spektrianalyysi.

Kuvassa 18 esitetään reuteriinin hiili-13-spektri deuterium-oksidissa.

: .‘25 Kuvassa 19 esitetään reuteriinin protonispektri deuteriumok- sidissa.

Kuvassa 20 esitetään ehdotettu rakenne, joka saa aikaan ku- . vien 18 ja 19 spektrit.

30

Kuvassa 21 esitetään reuteriinin hiili-13-spektri deuteroi-dussa metanolissa.

Kuvassa 22 esitetään reuteriinin protonispektri deuteroidus-‘*’••35 sa metanolissa.

.'/· Kuvassa 23 esitetään ehdotettu rakenne, joka saa aikaan ku- ,···. vien 21 ja 22 spektrit.

9 110366

Kuvassa 24 esitetään reuteriinin trimetyylisilyylijohdannai-sen massaspektri.

5 Kuvassa 25 esitetään fragmentin M/E 147 ehdotettu rakenne.

Kuvassa 26 esitetään reuteriinin rakenteelle ehdotetut kaaviot .

10 Kuvassa 27 esitetään M/E-tiedoille ja NMR-rakenteille sopivat rakenteet.

Kuvassa 28 esitetään reuteriinin rakenne sen esiintyessä vesiliuoksessa.

15

Antibiootteja tuottavien kantojen eristys Isäntäspesifisiä Lactobacillus reuteri -kantoja voidaan eristää tämän keksinnön menetelmien mukaisesti eläinlähtees-tä kuten GI-kanavasta tai ulosteista eläimiltä, joissa kas-20 vaa kyseessä olevaa lajia. L. reuteri kasvaa parhaiten anaerobisissa olosuhteissa, mutta se voi kasvaa aerobisesti. GI-kanavan tai ulosteiden lietettä suspendoidaan agarlevyil-le, jossa on Lactobacilluksen kasvatukseen sopivaa väliai-netta, ja agarlevyjä inkuboidaan olosuhteissa, jotka edistä-•26 vät Lactobacillus-kolonioiden kasvua. Edullisessa suoritus-!!.’ muodossa hyvin kehittyneet koloniat ilmestyvät Lactobacil- " lus-valintaväliaine (LBS) -agarlevyjen pinnalle 48 h anaero-• · · lii’ bisen kasvatuksen jälkeen (alennettu hapen osapaine) 37°C: '* * ssa. LBS-väliaine sisältää (g/1) : tryptikaasi, 10; hiivauu- 30 te, 5; KH2PO4, 61; ammoniumsitraatti, 2; natriumasetaatti • · •,*·j (trihydraatti) 34; MgSC>4 (heptahydraatti) , 1,2; MnSC>4 (mono- • : hydraatti) , 0,13; FeSC>4 (heptahydraatti), 0,06. pH säädetään konsentroidulla HCl:llä arvoon 5,5; lisätään agaria (15 g).

!!! Väliaineen sterilisoinnin jälkeen lisätään glukoosia (10 g) .

# · '3*5 Muita Lactobacillus-kasvatusväliaineita voidaan käyttää.

• Edullisessa suoritusmuodossa LBS-levyt päällystetään 10

·:··; ml:lla 1 %:ista nestemäistä agaria, joka sisältää 0,50 M

10 110266 glyserolia ja Lactobacillus plantarum -siirroksen. Kunkin reuteriinia tuottavan kolonian eristyksen varmistamiseksi joko valmistetaan kaikista Lactobacillus-kolonioista repli-kaattilevyt tai Lactobacillus-soluja siirretään muulla tek-5 nilkalla kustakin LBS-levyillä olevasta koloniasta kasvatus-väliaineeseen ennen päällyksen lisäämistä (repiikointimene-telmä). Tämän päällyksen kiinteytymisen jälkeen levyjä in-kuboidaan jälleen 37°C:ssa anaerobisissa astioissa 48 h.

Näissä oloissa antibiootti reuteriinia tuottavien kolonioi-10 den ympärillä havaitaan siirrostetun L. plantarumin kasvu-inhibitioalueet.

L. reuteri -kantojen tunnistus varmistetaan standardimikro-biologisia kokeita ja lajin taksonomisia ominaispiirteitä 15 käyttäen. L. reuteri on heterofermentatiivinen laji, joka muodostaa kaasua glukoosista ja glukonaatista ja asetaatti/ etanolia glukoosista. API 50 CH -fermentaatiokokeessa (Ana-lytab Products, Sherwood Medical Co., New Brunswick, NJ) se näyttää positiivisen reaktion riboosilla, arabinoosilla, 20 glukoosilla, galaktoosilla, laktoosilla, sakkaroosilla, me-libioosilla ja maltoosilla (jotkin kannat fermentoivat myös ksyloosia). Lajilla on guaniini + sytosiini-mooli-% 39-41, lysiini on mureiinidiaminohappo, ja laji kasvaa 45°C:ssa, muttei 15°C:ssa. Eläinten GI-kanavista voidaan löytää kan- : ·' 25 toja, joilla DNA-DNA-homologia on 80 % tai yli neotyyppikan-nan DSM 20016 kanssa.

• · i · » I · : f Tämän keksinnön mukaista menetelmää käyttäen on eristetty ; Lactobacillus reuteri -kanta 1063 sian ruoansulatuskanavas- ,'.'•30 ta, ja se on osoitettu (selitetään jäljempänä) kykeneväksi tuottamaan huomattavasti korkeampia reuteriinitasoja kuin muut testatut kannat. American Type Culture Collection -laitokseen, Rockville, MD on talletettu kannat 1063 (ATCC no.

. 53608) ja kanta DSM 20016 (ATCC no. 53609) (talletettu 17.

’•’••35 huhtikuuta 1987).

» t » · » * I 1 I » * 110366' 11

Keksinnön ominaispiirteet ja edut käyvät paremmin selville seuraavien esimerkkien avulla, joita ei tule ymmärtää keksintöä rajoittavasti.

5 ESIMERKIT

ESIMERKKI I

Viljelyolosuhteet tuotannolle ja reuteriinin havaitseminen Lisättäessä reuteriinia tuottamaan pystyviä Lactobacillus reuteri -soluja määrättyihin edullisiin olosuhteisiin muo-10 dostuu reuteriinia. On kehitetty joukko määrityksiä reuteriinin havaitsemiseen ja kvantisoimiseen. Vakio pienin kasvua estävä konsentraatio (MIC) -menetelmää sovellettiin reuteriinin havaitsemiseen ja selvittämään sen tuotantoon vaikuttavia tekijöitä. E. coli K12:ta käytetään herkkänä tes-15 tiorganismina, ja määritys suoritetaan seuraavasti. E. co li -viljelmä kerätään yön yli kasvatuksen jälkeen, pestään kahdesti steriilillä 0,05 natriumfosfaattipuskurilla (pH 7,5), suspendoidaan tähän puskuriin ja säädetään 60 %:n transmissioon (A 420 nm) käyttäen Spectronic 70 -laitetta.

20 Tämä suspensio laimennetaan 1:100, ja käytetään 0,1 ml:n eriä siirrostettaessa 1,0 ml MIC-määritysväliainetta, joka sisältää (g/1): vitamiinitonta kaseiinihydrolysaattia, 3; ammoniumsitraattia, 1,9; sitruunahappoa, 0,63; KH2P04, 12,6; MgS04 (heptahydraatti), 0,2; pH säädetään arvoon 7,0 ja lisä- • 1 25 tään 20 mM glukoosia sterilisoinnin jälkeen. Reuteriiniak-« · tiivisuuden suhteen testattavia 1,0 ml:n näytteen osia lisä- • · tään 1,0 ml:aan tätä siirrostettua MIC-määritysväliainetta !t#. ja sekoitetaan läpikotaisin l:2-laimennokseksi. Tällaisia : ’ sarjalaimennuksia jatketaan tarvittaessa. Sitten näitä vil- 30 jelmiä inkuboidaan 24 h 37°C:ssa, ja kasvu tutkitaan. Sitten lasketaan suhteelliset reuteriinikonsentraatiot (reuteriini-yksiköt) käänteisarvona näytteen laimennoksesta ennen indi-kaattorisolujen näkyvän kasvun mahdollistavaa laimennosta.

. On kehitetty myös toinen määritys, joka suhteuttaa MIC-arvot ;;; 35 reuteriinin HPLC-analyysillä määritettyihin reuteriinin '·’ ( huippukorkeuksiin (kuvattu alla) .

< » » » i > » > 110366 12

Keksinnön mukaisen menetelmän olosuhteissa L. reuteri tuottaa tämän keksinnön mukaista antimikrobiaalista, reuterii-niksi kutsuttua ainetta. Joukon heterofermentatiivisten ja homofermentatiivisten Lactobacillus-kantojen reuteriinintuo-5 tanto on testattu, eikä mikään L. reuteria lukuunottamatta tuota reuteriinia.

On määritetty olosuhteet, joissa reuteriinia muodostuu. Reuteriinia ei muodostu aerobisissa olosuhteissa (ilmakehän 10 happikonsentraatio) vaan alhaisemmassa hapen osapaineessa. Sitä muodostuu, kun L. reuteria kasvatetaan anaerobisesti (tai semi-anaerobisesti ravistelematta) edellä kuvatussa MIC-määritysväliaineessa, joka sisältää 20-500 mM glyserolia tai glyseraldehydiä glukoosin sijasta päähiili- ja -energia-15 lähteenä. Kuvassa 1 esitetään reuteriinin muodostuminen tässä glyserolivällaineessa aerobisissa (käyrä 1) ja semiaero-bisissa (käyrä 2) olosuhteissa. L. reuteri ei kasva näissä olosuhteissa, mutta tuottaa siitä huolimatta reuteriinia. Testattiin 20 muun aineen, käsittäen heksoosit, heksitolit, 20 pentoosit, pentitolit, disakkaridit ja joukon fosforyloituja ja ei-fosforyloituja C3-aineita, kyky ylläpitää reuteriinin muodostumista. Taulukossa 1 esitetään tulokset joistain näistä testeistä. Väliaine, joka sisältää substraattia kon-,, , sentraation 20 mM (C6- ja C5-substraatteja) tai 40 mM (C3- i t • · 25 substraatteja), siirrostettiin 5 x 106 kolonianmuodostusyksi-köliä (CFU) ml:aa kohden E. colilla L. reuterin kanssa ja < 1 ;ilman. Ainoastaan glyseroli ja glyseraldehydi tuottivat reu- » i » teriinia. Reuteriinin tuotanto glyserolistakin estyy, kun t tuotantovällaineeseen lisätään glukoosia tai muuta subst- Y 30 raattia. Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista ilmenee 6,7 x t 107 CFU/ml elinkykyisten siirrossolujen esto-% supernatant-tijakeilla E. reuterista, joka oli kasvatettu erilaisilla esitetyillä substraateilla 40 mM konsentraatioilla.

» 1 » 1 ;;;35 Reuteriinia voidaan tuottaa kahdella tavalla. Toinen mene- Y . telmä on homologinen menetelmä ja toinen on heterologinen menetelmä. Homologisessa menetelmässä käytetään L. reuteri-soluja, joita inkuboidaan sekoittamatta 37°C:ssa 250 mM gly- * I t 1 i i 110366 13 seroliliuoksessa. Saatetaan esimerkiksi kasvattaa 1 1 L. reuteri-soluja 24-48 h 37°C:ssa lactobacillusta ylläpitävällä väliaineella (Lactobacillus Carrying Medium) (LCM):llä.

LCM sisältää (g/1): tryptikaasi, 10; hiivauute, 5; tryptoo-5 si, 3; KH2P04, 3; ammoniumsitraatti, 1,5; natriumasetaatti, 1,0; suoloja (kuten LBS:ssä); kysteiini-HCl, 0,2; ja Tween 80, 1 ml. pH säädetään arvoon 7,0. Glukoosi (20 mM lopullinen konsentraatio) lisätään sterilisoinnin jälkeen. Solut kerätään sentrifugoimalla, suspendoidaan 10 ml:aan 250 mM 10 glyseroliliuosta, inkuboidaan 6 h 37°C:ssa ravistelematta, ja poistetaan sitten sentrifugoimalla. Reuteriini on tässä supernatanttijakeessa. Tämä menetelmä ja sen monet ilmeiset muunnelmat (esimerkiksi vaihtelevat solukonsentraatiot ja inkubointiajat) antavat käyttöön yksinkertaisen ja tehokkaan 15 tavan reuteriinin tuottamiseksi.

Heterogeenisessä menetelmässä L. reuteri sekaviljellään yhdessä määrättyjen muiden (heterologisten) reuteriinia stimuloivien mikro-organismien kanssa. Tässä menetelmässä esimer-20 kiksi alhaisempia L. reuteri -konsentraatioita (esimerkiksi solujen kuivapaino 20-300 μg ml:ssa) suspendoidaan glyserolia sisältävään viljelyväliaineeseen (edellä kuvattuun) yhdessä elinkykyisen heterologisen mikro-organismin solujen : .· kanssa (esimerkiksi E. coli K12) ja inkuboidaan edellä kuva- 25 tulla tavalla. Elinkykyisten solujen suhteilla (CFU E. co-: ; : li/CFU L. reuteri mlrssa) 0,5 tai yli muodostuu reuteriinia stimuloidulla nopeudella (suhteessa heterologisen mikro-or-. ganismin puuttumiseen) ja muodostumissuhde L. reuterin bio- massayksikköä kohden kasvaa suoraan suhteessa heterologisen 30 mikro-organismin biomassaan. Tämä heterologisten mikro-organismien reuteriinin synteesissä esittämän merkityksen keksiminen oli avain alla kuvattuun "feedbacksäätely"-malliin. Tämä "heterologinen" solustimulointi näyttää vaativan elävi--·' en solujen solu solua vastaan -kontaktia, koska tätä stimu- ·.· 35 lointia ei esiinny, kun nämä kaksi lajia on erotettu toisis- : taan dialyysimembraanilla muuten identtisessä viljelyväliai- .···. neessa (taulukko 3) . Sitä mahdollisuutta, että heterologinen laji on osallisena ainakin osittain alentamalla redoks-po- 14 110266 tentiaalia L. reuterin mikroympäristössä ja stimuloi siten reuteriinin tuotantoa, ei ole suljettu pois osatekijänä tähän stimuloivaan vaikutukseen. Reuteriinin tuotanto ei sti-muloidu, jos heterologinen E. coli ei ole elinkykyinen (tau-5 lukko 4) tai jos L. reuteri ei ole elinkykyinen. Reuteriinin muodostuminen heterologisella menetelmällä ei ole riippuvaista stimuloivan organismin kyvystä metabolisoida glyserolia. E. coli -mutantit, jotka eivät pysty metabolisoimaan glyserolia, stimuloivat reuteriinin muodostusta yhtä tehok-10 kaasti kuin villityypin solut.

Reuteriinia muodostuu elävissä eläimissä vallitsevissa fysiologisissa olosuhteissa. Reuteriinin muodostuminen (hete-rologista menetelmää käyttäen) on aluksi nopeaa ja suhteessa 15 L. reuterin biomassaan (kuva 2) mutta sen jälkeen tuotan-tonopeudet biomassaa kohden laskevat johtuen oletettavasti elinkykyisten solujen (E. coli/L. reuteri) suhteen laskemisesta ja/tai L. reuteri -solujen herkkyydestä näissä olosuhteissa tuotetun reuteriinin korkeampiin konsentraatioihin.

20 Kuten myös kuvasta 2 nähdään, tuottaa L. reuteri -kanta 1063 (X) suuremman määrän reuteriinia heterologisella menetelmällä kuin neotyyppi, kanta 20016 (0). Reuteriiniresistentit L. reuteri -mutantit voivat tuottaa myös reuteriinin korkeampia : tasoja. Reuteriinin muodostuminen tapahtuu maksiminopeuksil- 25 la lämpötiloissa välillä 25 ja 37°C. Kuvasta 3 ilmenee inku-: bointilämpötilan vaikutus reuteriinin muodostumiseen L. reu- terin semianaerobisen inkuboinnin aikana glyseroliväliai-,·. neessa 4, 25, 37 ja 45°C:ssa. Reuteriinia muodostuu pH-alu- eella 5-9 optimituoton ollessa pH-alueella 6-8. Kuvassa 4 30 nähdään kasvatuksen pH:n vaikutus reuteriinin muodostumiseen L. reuterin semianaerobisen inkuboinnin aikana E. colin kanssa glyseroliväliaineessa 3 h ajan (käyrä 3) ja 24 h ajan (käyrä 4). Kaikki 3 tähän mennessä testattua L. reuteri-kan-taa tuottavat reuteriinia: neotyyppi, DSM 2 0016, ATCC 27273 '·.· 35 (luokiteltiin äskettäin nimellä L. fermentum) ja äskettäin : eristetty kanta 1063. Kaikki 3 kantaa tuottavat reuteriinia .···. homologisella menetelmällä (taulukko 5) . Reuteriinin muodos tuminen heterologisella menetelmällä vaihtelee näillä 3 kan- 110366 15 nalla seuraavasti: heterologinen mikro-organismi stimuloi muodostumista kannalla 1063 huomattavasti, kannalla 27273 kohtuullisesti ja kannalla 20016 vain hieman.

5 ESIMERKKI II

Antibiootin ominaisuudet

Reuteriinin tuotanto tapahtuu viljelyväliaineen vakio-pH:ssa ja ulkoisesti lisätyn katalaasin läsnäollessa. Siksi sen an-timikrobiaalinen vaikutus ei ole yhteydessä hyvin tunnettui-10 hin maitohappofermentaation lopputuotteisiin kuten maitohap po tai vetyperoksidi tai muihin muiden (24, 25) löytämiin happamiin aineisiin. Reuteriini jää viljelyväliaineeseen sentrifugoimalla tai suodattamalla tapahtuvan solujen poiston jälkeen. Reuteriini voidaan erottaa viljelyväliaineesta 15 ja puhdistaa HPLC.-llä käyttäen vettä (deionisoitua) tai 10 mM H2S04:ää liuotinjärjestelminä ja C-18 kiintofaasikolonne-ja. Reuteriini ja muut läsnäolevat tuotteet havaitaan HPLCrn aikana refraktioindeksi (Rl) -detektorijärjestelmää käyttäen. MIC-aktiivisuuden ilmaiseva RI-huippu eluoituu tässä 20 järjestelmässä glyserolin ja 1,3-propaanidiolin välillä. Kun reuteriinin tuotannossa käytetään 14C (kokonaan leimattua) glyserolia, on HPLC:llä takaisin saatu reuteriini 14C-leimat-tua, mikä osoittaa, että tämä aine on (ainakin osittain) : ·' glyserolin vesiliukoinen johdannainen.

25

j.i ; ESIMERKKI III

: Antimikrobiaalinen aktiivisuus ; Reuteriini on laajakirjöinen antimikrobiaalinen aine. Reute- riini toimii bakteriosidina. Reuteriinin muodostuminen ja 30 sen voimakas bakteriosidinen aktiivisuus käyvät selvästi ilmi kuvaan 5 kerätyistä tiedoista. Ilmoitetut E. colin (jatkuva viiva) ja L. reuteri 1063:n (katkoviiva) konsentraatiot (CFU/ml) siirrostettiin (0-hetkellä) edellä kuvattuun glyse-roli/kaseiinihydrolysaatti-väliaineeseen (o), samaan väliai-35 neeseen ilman sitraattia (·) ja samaan väliaineeseen ilman : glyserolia (X) . Sekaviljelmiä inkuboitiin semianaerobisesti (ravistelematta) 37°C:ssa ottaen ilmoitetuilla aikaväleillä näytteitä E. colin ja L. reuterin määrien määrittämiseksi 110366 16 (CFU/ml). Näistä tiedoista nähdään, että kun läsnä oli glyserolia, muodostui ensimmäisten 3-4 h aikana ainetta, joka sai seuraavien muutaman tunnin aikana aikaan elävien E. coli -solujen 7-8 log-laskun. Kaikki tähän mennessä testatut 5 Gram-negatiiviset bakteerisuvut (Escherichia, Shigella, Sal monella, Proteus ja Pseudomonas) ja kaikki testatut Gram-positiiviset suvut (Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, Leuconostoc ja Lactobacillus) ovat reute-riinille herkkiä. Viimeisten kolmen suvun kaikkien jäsenten 10 tappamiseksi tarvitaan kuitenkin jonkin verran suurempia reuteriinikonsentraatioita. Reuteriini tappaa myös alemman ; eukariootin, Saccaromyces cerevisiaen. Nämä havainnot on esitetty yhteenvetona taulukossa 6. Tässä taulukossa esitetään myös eri testattujen lajien kyky stimuloida reuteriinin 15 muodostumista heterologisessa menetelmässä. Huomautetaan myös, että L. reuteri on itse herkkä reuteriinille, jos se altistetaan konsentraatiolle 32 MIC-yksikköä tai yli. Esitetään myös arvot, joista käy ilmi, että reuteriini (loppukon-sentraatiossa noin 20 MIC-yksikköä ml:ssa) estää in vitro 20 Trypanosoma cruzin, Chagan taudin aiheuttaman alkueläinpa- rasiitin, kasvun. Siinä kun kontrolliviljelmissä oli normaali kasvu ja käyttäytyminen, menettivät reuteriinilla käsitellyt solut motiliteettinsa ja jakautumiskykynsä, ja niissä : '.· ilmeni muodon "pyöristymistä" merkkinä elinkyvyn menetykses- 25 tä.

ESIMERKKI IV

• * · . .·. Antiviraalinen aktiivisuus

Reuteriini on tehokas myös viruksen replikaation estossa.

30 Kuvassa 13 esitetään tulokset kokeista, joissa 0-50 yksikköä reuteriinia ml:ssa lisättiin joko kasvaviin, bakteeriviruk-silla infektoituihin E. coli (lambda-faagilla) tai Lactobacillus plantarum -bakteerisoluihin (faagi 8014-B2). Alusta-vista tuloksista 14C-merkityllä glyserolilla käy ilmi, että 4 35 /*g reuteriinia 0,5 ml:ssa liuosta vastaa suunnilleen 1 reu- .·. : teriiniyksikköä. 4 h kuluttua isäntäsolujen kolonioita muo dostavien yksikköjen (CFU) ja virusten täpliä muodostavien yksiköiden (PFU) lukumäärät määritettiin vakio mikrobiologi- 17 1103(16 siä tekniikkoja käyttäen. Ilman reuteriinin lisäystä mikro-bisolujen lukumäärä kohosi noin 100-kertaisesti 4 h:n aikana. E. colilla reuteriinin 10 yksikön lisäys sai aikaan noin 100-kertaisen solujen lukumäärän vähenemisen ja yli 1000-5 kertaisen vähenemisen lambdafaagin PFUtiden lukumäärässä verrattuna kontrolliviljelyyn ilman reuteriinia 4 h:n inku-boinnin jälkeen. Vaikka Lactobacilluksen CFU:n ja PFU:n reu-teriinista johtuva pieneminen on vähemmän merkittävää, ja se vaatii suurempia konsentraatioita kuin E. coli, havaittiin 10 samanlainen tai jopa suurempi muoto reuteriinin yli 25 yksikön määrillä. Nämä tulokset osoittavat, että reuteriini on tehokas viruksen muodostumisen estossa ja tämä teho on suurempi ja ylittää tehon, joka reuteriinilla on bakteeri-isän-täsoluissa.

15

ESIMERKKI V

Probioottinen aktiivisuus

Syötettäessä Lactobacillus reuteria sioille se pystyy muodostamaan kolonian niiden ruoansulatuskanavassa. Alustavissa 20 kokeissa L. reuteri 1063 -soluja sisällytettiin vastasyntyneiden pikkuporsaiden ravintoon konsentraatioalueilla 108-1010 CPU eläintä kohden, ja elinkykyisiä L. reuteri 1063 -soluja saatiin takaisin eläinten ulosteista. Näillä L. reuteri-: siirrostuksilla ei ollut eläimiin haitallisia vaikutuksia.

25 : : ; Joko täysikasvuisia sikoja, porsaita (alle 5 päivän ikäisiä) tai gnotobioottisia porsaita käytettiin kokeissa, joissa ; eläimille syötettiin suuria määriä (noin 109 solua) L. reute- ri kanta 1063 -soluja. 5-7 päivän kuluttua saatiin eläinten 30 ulosteista vielä riittävä määrä L. reuteri -soluja, mikä osoitti, että L. reuteri selvisi GI-kanavan läpi kulkemisesta ja pysyi eläimessä riittävän pitkään osoittamaan, että oli tapahtunut kolonianmuodostusta, ja että reuteriinia voi muodostua. L. reuteri kanta 1063:n reuteriininmuodostusta .* 35 voidaan odottaa GI-kanavan ympäristössä, tämän kanavan ol-lessa ympäristö, josta L. reuteri-kanta alunperin eristet-,···. tiin. Eläinten ravintoon voidaan lisätä määrättyjä väli- ainekomponentteja tai muita aineita kuten glyserolia, jotka 110366 18 komponentit ja aineet vaikuttavat L. reuterilla reuteriinin muodostumiseen optimoimaan reuteriininmuodostusta GI-kanavassa. Lactobacillus reuteri -kantoja, jotka on eristetty joukosta eläinlajeja käsittäen linnut (käsite "eläimet" si-5 sältää selvästi ihmiset ja linnut), voidaan syöttää riittävässä määrin eläinlajeille, joista kannat eristettiin, tai muille eläinlajeille kuin lajille, josta kannat eristettiin.

ESIMERKKI VI

10 Ribonukleotidin inhibitio

Reuteriini inhiboi ribonukleotidireduktaasia, deoksiribonuk-leiinihappo (DNA) -synteesin ensimmäistä vaihetta. Luonnossa deoksiribonukleotidin synteesille on vain yksi reitti, nimittäin vastaavien ribonukleotidien suora pelkistys. Deoksi-15 ribonukleotidit ovat pitkälle erikoistuneita metaboliitteja ja toimivat ainoastaan DNA:n rakennusosasina. Ribonukleotidien pelkistystä deoksiribonukleotideiksi katalysoiva entsyymi on ribonukleotidireduktaasi. Tämä pelkistys on DNA-synteesin ensimmäinen välttämätön vaihe, ja sillä on sen 20 vuoksi olennainen merkitys prokarioottisten ja eukarioottis- ten solujen ja virusten kasvulle ja monistumiselle.

Todiste siitä, että reuteriini inhiboi ribonukleotidireduk-: V taasia (EC 1.17.4) saatiin käyttämällä menetelmää, jonka ku- 25 vaavat Thelander, Sjöberg ja Eriksson; Methods in Enzymology : :'· (vuosikerta LI), s. 227-237, 1978. Entsyymin puhdistettuja

Bl- ja B2-alayksiköitä, joita koodittavat entsyymit nrdA ja « * * . .·, nrdB, käytettiin ja edellä mainittujen kirjoittajien kuvaa maa spektrometristä määritystä. Lyhyesti, menetelmä on seu-30 raava: entsyymiä inkuboidaan 25°C:ssa reaktioseoksessa, jossa on 200 nmol ATP, 1,6 μπιοί MgCl2, 80 nmol NADPPH, 5 μπιοί N- 2-hydroksietyylipiperatsiini-N'2 -estaanisulfonihappopuskuria (pH 7,6), 300 pmol tioredoksiinia, 40 pmol tioredoksiinire-:.t. duktaasia, 10 nmol EDTA ja 65 nmol ditiotreitolia lopulli- ·.· 35 sessa tilavuudessa 0,13 ml. Reaktio käynnistettiin lisäämällä 75 nmol CDP, ja NADPH:n hapettumista seurattiin 340 nm:-.··· llä Zeissin automaattisesti rekisteröivällä spektrofotomet- rillä, joka oli varustettu mikrokyveteillä. Ennen CDP:n li- 110366 19 säystä mitattiin NADPH:n taustahapettuminen, ja tämä tausta vähennettiin CDP:n lisäyksen jälkeen havaitusta NADPH:n hapettumisesta .

5 Testeissä käytetty reuteriini valmistettiin homologisella menetelmällä, ja se sisälsi 256 MIC-yksikköä mlrssa. Laimen-tamatonta ja eri lailla laimennettua reuteriinia lisättiin (1 μ1:η määrissä) reaktioseokseen tämän aineen vaikutuksen määrittämiseksi ribonukleotidireduktaasiaktiivisuuteen. Tä-10 män kokeen tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 7.

Tulokset osoittavat, että reuteriini on tämän entsyymin Bl-alayksikön tehokas inhibiittori. Havaittiin myös, että tio-redoksiini (tarvitaan entsyymiaktiivisuuteen) oli myös herkkä reuteriinia kohtaan.

15

Reuteriinin kyvyn estää bakteerien, hiivojen, homeiden, virusten ja neoplastisten ja normaalien eläinsolujen kasvua voidaan siten katsoa riippuvan ainakin osittain sen kyvystä inhiboida DNA-synteesiä inhiboimalla deoksiribonukleotidien 20 de novo -muodostumista.

ESIMERKKI VII

Reuteriini on tehokas ruoan säilöntäaine < · · ! '.· Paikallisesta supermarketista ostettu jauheliha jaettiin 4 25 osaan. Yksi osa oli käsittelemätön, muut kolme käsiteltiin : : ; 10, 50 ja 100 yksiköllä reuteriinia lihagrammaa kohden.

Kaikkia näytteitä varastoitiin 4°C:ssa ottaen ilmoitettuina . päivinä näytteitä bakteriologiseen analyysiin.

Il» 30 Lihanäytteet poistettiin ja laimennettiin 1:10 (1 g lihaa: 9 ml steriiliä H20:ta). Seuraavia desimaalilaimennoksia tehtiin tarvittaessa, ja näytteet asetettiin Difco-ravintoagarille. Näitä näytteitä inkuboitiin 27°C:ssa 24 h ja laskettiin ko-•:· lonioita muodostavina yksikköinä jauhelihagrammaa kohden 35 (CFU/g). Tulokset osoittavat, että reuteriini alensi CFU/g-:aa merkittävästi (kuva 14) (_□_, kontrolli; ♦ . 10 yksik- .·*. köä reuteriinia; B . 50 yksikköä reuteriinia; ja O . 100 yksikköä reuteriinia). Korkeammilla reuteriinin tasoilla (50 I · I t · 110366 20 ja 100 yksikköä/g) bakteerien syntyperäiset populaatiot alenivat ja pysyivat koko 6-päiväisen testiajanjakson yli 4 log-yksikköä alempina kuin kontrollinäytteet.

5 Paikallisesta supermarketista ostettu jauheliha siirrostet-tiin ja sekoitettiin läpikotaisin noin 105 CFU/ml:lla E. coli K12 -soluilla. Sekoituksen jälkeen materiaali jaettiin 2 osaan. Toinen osa oli käsittelemätön kontrolli (ilman reute-riinia), toiseen osaan lisättiin 75 yksikköä (U) reuteriinia 10 lihagrammaa kohden. Näytteitä säilytettiin 4°C:ssa ottaen ilmoitettuina aikoina näytteitä bakteriologiseen analyysiin. Tässä kokeessa elinkykyisten solujen (CFU/g lihaa) määritys suoritettiin kuvalle 14 kuvatulla tavalla paitsi, että käytettiin Difco McConkey'n agaria (suhteellisen spesifinen 15 koliform-bakteereille). Kuvasta 15 nähdään (_□_, kontrolli; ♦ . 75 yksikköä reuteriinia), että reuteriini alensi bakteerien alkuperäispopulaatiota ja piti nämä luvut alhaisina koko 9-päiväisen inkuboinnin ajan.

20 ESIMERKKI VIII

Lactobacillus reuteri plus glyseroli käsittää uuden tehokkaan ruoansäilöntämenetelmän. Todistus tästä saatiin käyttämällä kalan säilömistä mallijärjestelmänä. Tämä koe suori-: tettiin seuraavasti: kalafileet (silli, Clupea harengas) 25 kastettiin seuraavaan käsittelyliuokseen: • « * » · kontrolli: ei käsittelyä : glyseroli: 250 mM glyseroliliuos

t I I

·.1 kanta 1068: 250 mM glyseroliliuosta, joka sisälsi 4xl09 CFU

30 ml:ssa L. reuteri 1068:aa (reuteriinia muodostamaton kanta) kanta 1063: 250 mM glyseroliliuosta, joka sisälsi 4xl09 CFU ml:ssa L. reuteri 1063:a 1 1 Fileet (kulloinkin 2 rinnakkaisnäytettä) pidettiin suurissa ’ ·1 35 petrimaljoissa 8 °C:ssa 4 päivää jääkaapissa. Ammoniakkisi-sältö ja kyseessä olevien bakteerien (ts., saastepseudomo-nadien ja lisättyjen laktobasillien) CFU analysoitiin sitten 21 110366 ruokatavaran eliniän arvioimiseksi. Taulukkoon 8 kootut tulokset osoittavat: (i) lisätty laktobasilli (laskettuna kokonaislaktobasilleina 5 käyttäen glukoosi Lactobacillus Selection Medium -väliainet ta, joka on kuvattu edellä) ja L. reuteri CFU (laskettuna kokonaisheterofermentatiivisina laktobasilleina käyttäen L-arabinoosi Lactobacillus Selection Medium -väliainetta) pysyvät hyvin elossa 8°C:ssa, mutteivät lisäänny merkittävässä 10 määrin.

(ii) L. reuteri 1063 hidastutti saastepseudomonadien kasvua merkittävästi. L. reuteri 1068 hidastutti jonkin verran, muttei tarpeeksi estämään saastumista, joka yleensä ilmenee 15 log 8,4-pseudomonadimääränä.

(iii) L. reuterin ja glyserolin hidastavalla vaikutuksella saastuttaviin bakteereihin on voimakkaasti alentava vaikutus ammoniakin vapautumiseen.

20 (iv) L. reuterin plus glyserolin ruokaa säilyttävä vaikutus ilmenee kaikenlaisia ruoan saastuttajia kohtaan.

I t t

; ESIMERKKI IX

25 Reuteriini on glyserolin fermentointituote j : * * Reuteriini on uusi tuote, joka liittyy saman tyyppiseen muilla Lactobacillus-lajeilla tapahtuvaan glyserolin hetero- » I » . ,* laktiseen fermentointiin. Reuteriini voidaan eristää ja * * I t · identifioida HPLC:tä käyttäen L. reuterin glyserolifermen-

> I

30 toinnin tuotteeksi. Glyserolin, 1,3-propaanidiolin ja S-hyd-roksipropionihapon (kaikki kaupallisia tuotteita) havaittiin olevan olennaisesti ilman antimikrobiaalista aktiivisuutta testattaessa niin korkeilla konsentraatioilla kuin 0,125 M.

»

t I I

35 L. reuterin reuteriinin plus 1,3-propaanidiolin ja β-hydrok-sipropionihapon tuotto glyserolin fermentoinnin aikana mää- i ,··* ritettiin HPLC-analyysiä käyttäen. Kuvassa 6 esitetään esi- merkinomaiset tulokset. Näytteen valmistamiseksi 1 1 L. reu- 110366 22 teri -viljelmää (kasvatettu LCMissä, joka sisältää 20 mM glukoosia 37°C:ssa 48 h ajan) kerätään sentrifugoimalla, pestään kahdesti steriilillä natriumfosfaattipuskurilla (pH 7,5) ja suspendoidaan 10 ml:aan 0,25 M steriiliä glyserolia.

5 6 h inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa solut poistetaan sentrifu- goinnilla ja supernatanttineste (johon viitataan tämän jälkeen näytteenä) analysoidaan reuteriinin suhteen aiemmin kuvatulla MIC-testillä ja alla kuvatulla HPLCtllä. Joissain kokeissa 0,25 M glyseroliin sisällytettiin 5 /xCurieta 14C(U)-10 glyseroliin. Näytteet suodatettiin 0,2-0,45 μτα bakteerisuo-dattimella ja säilytettiin aseptisesti 2°C:ssa ennen HPLC-laitteeseen injektointia.

HPLC-analyysi suoritettiin seuraavasti: 20-100 μΐ jae kuta-15 kin näytettä injektoitiin Beckman HPLC -laitteeseen, johon oli sovitettu yksinkertainen tai peräkkäiset C-18-analyytti-set kolonnit. Näytteet eluoitiin tislatulla/deionisoidulla vedellä, joka oli suodatettu 0,2-0,45 μπκη suodattimena. Eluointinopeudet olivat 1,0-1,5 ml/min, ja näytteitä seurat-20 tiin Waters 410 .differentiaalirefraktometrillä. Refraktio-indeksin (Rl) muutokset rekisteröitiin automaattisesti ja kuvattiin Rl (ordinaatta) vs. eluointitilavuus/aika (abskis-sa) edeten esitetyissä kuvissa oikealta vasemmalle. Kunkin näytteen kokonaiseluointiaika oli noin 15 min huipun 1 ol- : .-.25 lessa noin 8 min kohdalla, huipun 2 noin 7 min kohdalla ja .···. huipun 3 noin 6 min kohdalla.

Kuvissa 6A-6E esitetään edellä kuvatulla tavalla ja vedellä ·’ eluoitujen näytteiden HPLC-analyysit. Näihin sisältyvät 30 näytteet, jotka valmistettiin käyttäen L. reuteri 1063:a 128 MIC-yksiköllä (kuva 6A) ja 512 MIC-yksiköllä (kuva 6B), L. reuteri 20016:ta (kuva 6C ja L. reuteri ATCC 27273:a (kuvat : : : 6D ja 6E). Näissä eluoinneissa identifioitiin vain huippuina 1, 2 ja 3 merkityt aineet. Huippu 1 identifioitiin 1,3-pro-35 paanidioliksi ja huippu 2 glyseroliksi vertailustandardien ja eristettyjen huippujen IR-spektrien avulla. Näissä olo-'···’ suhteissa huippu 2 eluoituu aina näissä kuvissa nähtynä tun- : nusomaisen leveänä huippuna, ja se on ainoa aine, joka elu- 110366 23 oituu näytteistä, joilla on MIC-testiä käyttäen määritettyä biologista aktiivisuutta. Se on sen vuoksi identifioitu an-timikrobiaalisena aineena nimeltään reuteriini. Edelleen 3 analyysiä tukee johtopäätöstä, että huippu 2 on reuteriini.

5 Ensiksi, huipussa olevan materiaalin määrä kasvaa suorassa suhteessa alkuperäisen näytteen MIC-arvoon. Tämä nähdään kuvissa 6A ja 6B, jotka edustavat L. reuteri 1063:11a tuotettua reuteriinia näytteissä, joiden MIC-tiitterit ovat 128 (kuva 6A) ja 512 (kuva 6B). Toiseksi, kaikki tähän mennessä 10 testatut L. reuteri -kannat tuottavat MIC-testillä määritettyä reuteriinia, ja huippu 2 on läsnä kaikissa tapauksissa (katso kuvat 6A-6E). Kaikki muut tähän mennessä testatut Lactobacillus-lajit ovat ilman verrattavissa olevaa biologista aktiivisuutta (MIC-testi), ja niillä on HPLC:llä ana-15 lysoituna vähän tai ei lainkaan materiaalia, joka eluoituu huipun 2 alueella. Kolmanneksi, on eristetty L. reuteri ATCC 27273:n spontaani variantti tai mutantti. Tämä variantti tuottaa huomattavasti pienempiä määriä reuteriinia (määritettynä MIC-testillä), näyttää glyseroli/E. coli -päällys-20 tyslevymäärityksissä heikkoja - ei-inhiboivia vyöhykkeitä ja tuottaa emo (villityyppi)kantaan (kuva 6D) verrattuna paljon vähemmän huipun 2 alueella eluoituvaa ainetta (kuva 6E).

··· Käytettäessä eluointiliuottimena 0,01 M H2S04:ää, erottui ku- } 25 vassa 6F näkyvä S-hydroksipropionihappohuippu. Tässä kokees- .···. sa käytetty näyte saatiin kannasta 1063, ja siinä oli 1024 ,·. MIC-yksikköä reuteriinia. Sisällytettäessä olennaisen identic tiseen kokeeseen 14C(U)-glyserolia erottaen HPLC:llä käyttäen liuottimena 0,01 M H2S04:ää ja kerättäessä erillisinä huip-30 puina radioaktiivisuusmäärityksiin (Packard Liquid Scintillation Spectrometer -tuikelaskuria) saatiin seuraavat tulokset: 25777 kokonais-cpm saatiin β-hydroksipropionihappona (huippu 4); 40776 cpm 1,3-propaanidiolina (huippu 1); 53228 cpm reuteriinina (huippu 2) ; ja 61428 cpm käyttämättömänä ,·. ;35 glyserolina (huippu 3) . Nämä tulokset ja alla esitetyt reu-teriinin analyyttiset tiedot osoittavat, että glyseroli fer-mentoituu näissä olosuhteissa seuraavan reaktion mukaisesti: 110366 24 5 glyseroli -->2 1,3-propaanidioli + 1 β-hydroksipropioni-happo + 1 reuteriini

ESIMERKKI X

5 Alustava reuteriinin karakterisointi

Raakatuotteiden reuteriinin karakterisoinnit osoittavat, että se on hyvin vesiliukoinen, kestävä nukleaaseja ja pro-teaaseja vastaan ja lämpölabiili (100°C 10 min ajan) erityisesti pH-arvossa 9,0 tai yli. Reuteriini ei selvästikään ole 10 bakteriosiini. HPLC:llä edellä kuvatulla tavalla eristetyllä olennaisen puhtaalla reuteriinilla (jossa on jonkin verran glyserolia) on suoritettu alustavia analyyttisia analyysejä. Näytteet annettiin Research Triangle Institutelle (Research Triangle Park, NC) ja kemian osastolle (N.C. State Universi-15 ty, Raleigh, NC) massa-, ydinmagneettinen resonanssi- ja in-frapunaspektrianalyysejä varten. Nämä tiedot on esitetty yhteenvetona kuvissa 7-11. LCMS-analyysit suoritettiin Finni-gan 4500 HPLC/MS-järjestelmällä Vestec-liitäntää käyttäen. Erotus saatiin aikaan Aminex 87H -kolonnia käyttäen eluentin 20 virtausnopeudella 0,8 ml/min. Sekä positiivisen ionin (kuva 7) että negatiivisen ionin (kuva 8) massaspektri (suhteellinen intensiteetti on kuvattu ordinaatta-akselille, massa/ : · : energiavaraus, m/e-arvo, abskissa-akselille) osoitti mole- ··· kyylipainoksi noin 162 g/mol. Alustavat tiedot yhdessä (i) : .'.25 edellä kuvattujen isotooppianalyysien ja (ii) huomion kans-.···. sa, että reuteriini antaa positiivisen Schiffin reaktion (osoittaa aldehydifunktionaalisen ryhmän esiintymisen), osoittivat, että reuteriinilla on molekyylikaava C6H10O5 ja seuraava rakenne: 30

H H H OH H

\ I I II I X

c-c-c-o-c-c-c : /11 I \

•••35 HO OH H H H

- 0 -

Kuvassa 9 esitetty infrapunaspektrianalyysi kuvassa 10 esi-tetty hiiliydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektrianalyy-. .*40 si ja kuvassa 11 esitetty 250 MHz protoni NMR -analyysi ovat 110366 25 yhtäpitäviä tämän reuteriinin ehdotetun rakenteen kanssa.

Nämä NMR-spektritiedot ovat säteilyabsorption (ordinaatta-akseli) laskennallisia kuvaajia magneettikentän pyyhkäisyn (abskissa-akseli) suhteen. Täsmällisen rakenteen informaatio 5 saatiin, kun saatiin suuria määriä ehdottoman puhdasta reu-teriinia.

Pohjautuen alustaviin tietoihin, joiden mukaan reuteriinilla on hiilihydraatin tapainen rakenne, käsittäen aldehydihiilen 10 molekyylin toisessa päässä ja alkoholihiilen molekyylin toisessa päässä, ilmeni, että tämä aine esiintyy hemiasetaali-na, mikä vastaa aldehydiryhmän ja terminaalisen hydroksyyli-ryhmän välistä reaktiota. Tällaisen rakenteen kolmiulotteinen molekyylimalli ilmaisi molekyylin, jolla on läheinen sa-15 mankaltaisuus pentoosin, kuten D-riboosin kanssa.

Tältä pohjalta esitettiin, että reuteriini saattaisi olla D-riboosianalogi, joka pystyy kilpailemaan ribonukleotidien kanssa DNA-synteesiin spesifisesti liittyvän ensimmäisen 20 entsyymin, ribonukleotidireduktaasin kanssa riboosintunnis- tuskohdassa tai -kohdissa. Reuteriini pystyisi siten inhiboimaan DNA-synteesille spesifisen ensimmäisen vaiheen inhi-boimalla ribonukleotidien muuttumista deoksiribonukleoti-· deiksi. Jos reuteriini olisi pentoosianalogi ja sitoutunut ; .·. 25 reduktaasikohtaan, sen voisi odottaa sitoutuvan edullisesti ,···. nopeasti kasvaviin pahanlaatuisiin soluihin, kuten syöpäso- lut. Nämä ehdotukset ovat yhtäpitäviä (i) reuteriinin ehdo-tetun rakenteen, (ii) reuteriinin bakteriosidisen vaikutuksen nopeuden (kokeelliset tiedot osoittavat E. colin kasvun 30 estymisen pian reuteriinin lisäyksen jälkeen) ja (iii) sen tosiseikan kanssa, että sekä prokariootit ja eukariootit (S. cerevisiae ja Trypanosoma cruzi) ovat herkkiä reuteriinille. Siten reuteriinia voitaisiin pitää antifungaalisena, anti-:‘parasiitti-, antivirus- ja syövän vastaisena aineena, kuten -35 myöskin antibakteriaalisena aineena.

110366 26

ESIMERKKI XI

Puhdistetun reuteriinin tuottaminen kemialliseen analyysiin Yön yli kasvatetun Lactobacillus reuteri 1063 -viljelmän (l) 1 %:n siirrostusta kasvatettiin modifioidulla Lactobacillus 5 Carrying Medium -väliaineella glukoosin kanssa (LCMG) 24 h. Modifioitu LCMG sisältää seuraavat aineet litrassa liuosta: 5 g hiivauutetta, 10 g tryptikaasia, 3 g tryptoosia, 3 g kaliumfosfaattia (yksiemäksistä), 3 g kaliumfosfaattia (kak-siemäksistä), 2 g ammoniumsitraattia, 1,15 g natriumasetaat-10 ti-3H20, 5 mg magnesiumsulfaatti· 71^0, 0,31 mg mangaani(2)- sulfaattia, 0,2 mg ferrosulfaatti7H20 ja 0,5 mg L-askorbii-nihappoa. Sitten tämä väliaine autoklavoitiin, ja jäähdytettyyn väliaineeseen lisättiin 10 ml steriilisuodatettua 2 M glukoosia. L. reuteri -soluja kerättiin sentrifugoimalla 15 4000 x g:llä 10 min ja pestiin kahdesti 50 mM natriumfos- faattipuskurilla (pH 7,5).

Pesun jälkeen L. reuteri suspendoitiin konsentraatioon 10 mg soluja/ml deionisoitua vettä. Lisättiin steriiliä glyserolia 20 kunnes saavutettiin lopullinen konsentraatio 250 mM. Sitten tätä solususpensiota inkuboitiin 37°C:ssa 3 h reuteriinin tuottamiseksi ja kumuloimiseksi. Sitten solut pelletöitiin • V 4000 x g:llä 10 min ja poistettiin. Supernatanttiliuos suo- datettiin 0,45 /xm:n suodattimena (Acrodisc) loppujen solu- • :*· 25 jen poistamiseksi ja käytettiin seuraavaksi reuteriinin • * ♦ » eristykseen.

Reuteriinin puhdistus suoritettiin 1 x 30 cm lasikolonnia käyttäen, joka oli pakattu AG 50 W:llä, 8 %:n ristiliitetyl-30 lä, -400 mesh hartsilla, jota toimittaa Biorad (Richmond, Kalifornia). Liuotin, jossa oli 60 % asetonitriiliä / 40 % tislattua, deionisoitua vettä, ja joka sisälsi 1,1 g trifu-loritikkahappoa litrassa, lisättiin Beckman 110 A HPLC-pum-pulla. Liuottimen virtausnopeus oli 1,5 ml/min ja detektio -35 suoritettiin Waters 410 -differentiaalirefraktometrillä käyttäen herkkyyttä 2x ja asteikkotekijää (scale factor) 5.

“Λ 400 μΐ supernatanttinestettä injektoitiin Altex 210 -ruis- kulia (Beckman) 500 μ1:η näytesilmukan kanssa ja kerättiin »· · 110366 27 näytteitä manuaalisesti. Jakeet haihdutettiin rotavaporilla imien huoneenlämpötilassa asetonitriilin poistamiseksi. Seu-raavaksi näytteet lyofilisoitiin kuiviin Vitris 10-030 -lyo-filisaattorilla. Puhtaus määritettiin kuljettamalla osa ja-5 keistä Aminex 87H analyyttisen kolonnin läpi (Biorad).

Ensimmäiset 2 jaetta eluoituivat kolonnista 15 min ja 19 min kohdalla, ja reuteriini havaittiin ensimmäisessä huipussa. Toisen jakeen eluoitumisaika oli noin 19 min. Reuteriinin 10 sisältävän jakeen etuosa käsitti suuren olkapään, jonka otaksuttiin olevan β-hydroksipropionihappoa, eikä sitä sen vuoksi otettu talteen. Reuteriinihuipun keskiosa otettiin talteen ja kuivattiin rotavaporilla, ja lyofilisoitiin sitten. Tällä menetelmällä saatiin vesivalkoinen, viskoosi nes-15 te, joka kromatografoitaessa sitten analyyttisissä olosuhteissa Aminex 87H -kolonnia käyttäen tuotti yhden ainoan huipun, joka eluoitui aktiivisuushuipun kanssa. Talteen kerätyllä jakeella oli myös bakteriosidaalista aktiivisuutta MIC-kokeella määritettynä. Muut talteen kerätyt jakeet eivät 20 osoittaneet bakteriosidaalista aktiivisuutta. Puhdistetusta I jakeesta analysoitiin myös proteiinit käyttäen Bio-Rad-pro- teiinimääritystä (Bio-Rad, Richmond, Ca). Ei voitu havaita | läsnäolevaa proteiinia.

; :'· 25 ESIMERKKI XII

Puhdistetun reuteriinin Fourier-muunnosinfrapuna-analyysi Suoritettiin reuteriinille Fourier-muunnosinfrapuna-analyysi !*! molekyylissä olevien kemiallisten ryhmien määrittämiseksi.

Näytteet analysoitiin Perkin Elmer 1550 FTIR:llä Perkin El-30 mer 7500 Data Stationin kanssa. Saadut tulokset esitetään kuvassa 16. Voidaan nähdä, että molekyyli sisältää hydroksi-funktionaalisuutta, jonka ilmaisee suuren C-O-venytyssignaa-Iin esiintyminen 1050 -1150 emissä ja leveän O-H-venytyssig-v naalin esiintyminen 3450 emissä. 1730 emissä havaittiin ,·. ;35 aldehydit osoittava C=D-venytys. Tyypillisiä aikaani-C-H-ve-nytyksiä oli 2880 emissä ja 1380 cm^rssä.

110366 28

ESIMERKKI XIII

Nestekromatografia/massaspektrometria

Puhdistetun reuteriinin LC-erotuksen analyysi suoritettiin Aminex 87H analyyttisellä kolonnilla (Biorad, Richmond, Ca-5 lifornia) virtausnopeudella 0,8 ml/min 65 % tislatulla vedellä ja 35 % aseto-nitriilillä, joka sisälsi 1,0 g konsentroitua rikkihappoa litrassa. Liuotinvirta sekoitettiin 0,3 M ammoniumasetaatin kanssa kolonnin jälkeen ja ohjattiin Ves-tec-liitännän (Vestec, Houston, Texas) kautta Finnigan 4500 10 HPLC/MS -järjestelmään (Finnigan, San Jose, California). Positiivisen ionin detektioon käytettiin höyrystyslämpötilaa 210°C ja lähdelämpötilaa 250°C. Lähteen elektronienergia oli 1000 eV.

15 LC/MS-analyysit suoritettiin reuteriinilla lisäämällä kolonnin jälkeen ammoniumasetaattia. Perushuippu oli kohdalla 166 M/E kuten kuvan 17 tiedoista ilmenee. Tämä ioni tulkitaan molekyyli-ionin ammoniumadduktiksi. Tämä ilmaisisi molekyy-lipainoksi 148, joka vastaa reuteriinin molekyylipainoa.

20 Signaalin 148 arveltiin olevan veden menetyksestä seuraava addukti-ioni, ja signaalin 130 addukti-ioni kahden vesimole-kyylin menetyksestä. Signaalin 101 uskotaan johtuvan taus-;·’· taliuotinvaikutuksista.

25 ESIMERKKI XIV

’!!. Puhdistetun reuteriinin ydinmagneettinen resonanssi-spekt- roskopia

Protoni- ja hiili-NMR-tutkimukset suoritettiin sekä deute- i * riumoksidissa että deuteroidussa metanolissa, joita toimit-30 taa Aldrich (Milwaukee, Wis). Protoni-NMR ajettiin Bruker WM 250 FTMNR:llä (Bruker), jota käytettiin 250 MHzrllä. Hiili- 13-spektrit aiheutettiin IBM NR-100 AF FTNMR:llä (IBM Inst-: ruments, San Jose, California), jota käytettiin 25 MHzillä suprajohtavalla magneetilla. Tietojenkäsittely suoritettiin / 35 Aspect 3000:11a. NMR-tutkimuksissa deuteriumoksidissa hiili- » i ’> '· NMR-spektreissä oli 6 signaalia kemiallisissa siirtymissä 40,1, 46,3, 56,2, 58,7, 89,7 ja 207,7 ppm. Signaali 207,7 ; ppm tulkittiin aldehydihiileksi, signaalit 89, 58 ja 56 ppm » i · 110-:6 6 29 olivat happisidoksista, ja signaalit 46 ja 40 ppm alifaatti-sia osia.

Hiili- ja protonispektrit esitetään kuvissa 18 ja 19. Irro-5 tuskytkentä kuten myös signaalienhajotus johti alkuperäiseen kuvassa 20 esitetyn rakenteen ehdotukseen. Havaittiin, että vaikutettiin protonisignaaliin 9,5 ppm:ssä (hiili 1), kun signaali 2,6 ppmrssä (hiili 2) oli saturoitu. Hiileen 2 liittyneet protonit hajoavat joksikin, joka ilmenee triplet-10 tinä, mutta tarkemmin tutkittaessa havaitaan tosiasiassa sekstetti (tripletti hajoaa hiilen 1 ei-ekvivalentin protonin vuoksi). Hiilen 2 protonien kytkentämallin havaittiin muuttuvan signaalien 9,5 ppm ja 3,7 ppm saturoinnilla (hiilet 1 ja 3) ja sen arvioitiin siksi olevan molempien hiilien 15 l ja 3 vieressä. Signaalin 3,7 ppm (hiili 3) hajoamismalli on tripletti, ja siihen vaikutettiin signaalin 2,6 ppm saturoinnilla. Nämä mallit sopivat ennustetulle rakenteelle hiilille 1, 2 ja 3 kuten CHO-CH2-CH2-R.

20 Protonisignaali 5,0 ppm (hiili 4) ilmeni triplettinä, ja siihen vaikutti ainoastaan signaalin 1,6 saturointi. Signaalien 5,0 ppm ja 3,5 ppm saturointi johti signaalin 1,6 ppm !’*’ (hiili 5) hajoamismallin muutoksiin. Hiilen 5 protonilla on ·· monimutkainen hajoamismalli, joka määritettiin kvartettina.

« · t · : 25 Protoneihin, jotka aiheuttavat tripletin 3,5 ppm (hiili 6), i * t ,*·’ vaikutti ainoastaan signaalin 1,6 ppm (hiili 5) saturointi.

Reuteriinin tämän puolen signaalimallit ja kemialliset siir- » tymät johtivat ennustamaan, että hiiliin 4, 5 ja 6 liittyvä rakenne on R-0-CH0H-CH2-CH20H. Molekyylin keskellä oleva he-30 miasetaalihappi (kuva 20) estäisi kahden puolen kytkennät, kuten havaittiin. Ennustetun rakenteen protonien kemialliset siirtymät sopivat tunnettujen ryhmien siirtymille.

* < > · : : Signaalien 1,7, 3,6 ja 5,0 ppm leveys esti kunkin huipun *35 alla olevan alueen laskemisen, jota käytetään määrittämään i * protonien lukumäärä, jotka protonit aiheuttavat kunkin sig-;·, naalin. Tällainen leveys saattaa riippua transienttimuodois- » i » » » i » * » » · t I » 30 110266 ta molekyylillä, joka on tasapainossa käytettäessä vettä liuottimena.

Reuteriinin signaalimalli deuteroidussa metanolissa oli mer-5 kittävästi erilainen kuin deuteriumoksidissa havaittu. Hiili- 13 -malli sisälsi ainoastaan 3 signaaliryhmää 36,8, 58,9 ja 103,9 ppm. Hiili-13-signaali 104 ppm:n lähellä on havaittu disakkarideilla kuten laktoosilla alla esitetylle hiilelle : 10

OH

C ^ CH,OH = 104 ppm \ =-<\ f

HO—C-C^\J /C CH20H

/ \\i

15 OH C-O \ C-O

HO—C-C. \

OH ^C—OH

Deuteroidussa metanolissa määritetty protonispektri sisälsi 20 myös 3 signaaliryhmää, jotka olivat kohdissa 1,8 (huipun ala 2), 3,6 (huipun ala 2) ja 4,5 (huipun ala 1). Hiili-13-spek-tri esitetään kuvassa 21 ja protonispektri esitetään kuvassa 22. Vetysuhteen 2:2:1 ehdotettiin johtuvan protonispektrin '.· suhteellisista huippualoista. Protonisignaali 1,8 ppm esiin- : .-.25 tyy kvartettina ja kytkentätutkimukset osoittavat sen olevan ···. 3,6 ja 4,5 ppm:ssä olevien signaalien aiheuttamien protonien "! sisältämien hiilien vieressä. Signaalit 3,6 ja 4,5 ovat mo- ;;; lemmat triplet teinä ja kytkentätutkimukset viittaavat aino- ’·’ ' astaan vuorovaikutukseen signaalin 1,8 ppm aiheuttamien pro- 30 tönien kanssa. Kuvassa 23 esitetyn rakenteen ehdotettiin vastaavan tätä tosiseikkojen sarjaa (käsittäen disakkaridien hiili-13-ominaispiirteet).

ESIMERKKI XV

‘.35 Puhdistetun reuteriinin kaasukromatografia/massaspektromet- ' ria '···’ Trimetyylisilylointi suoritettiin N,O-bis (trimetyylisilyy- : li) trif luoriasetamidilla (BSTFA) (Pierce Chemical Co., Rock- 110366 31 ford, 111.). 2 ml raakaa reuteriiniuutetta puhdistettiin edellä kuvatulla semipreparatiivisella kromatografiällä ja lyofilisoitiin. Lyofilisoituun reuteriiniin lisättiin 1 ml BSTFA:ta ja silanisointireaktio suoritettiin ympäristön läm-5 pötilassa. Näytettä ravistettiin varovasti käsin 5 min, kunnes havaittiin valkoinen sakka. Lisättiin juuri riittävä määrä HPLC-laatuista asetonitriiliä (Fisher Scientific, Raleigh, North Carolina) sakan liuottamiseksi. Sitten näytteeseen puhallettiin typpeä, se suljettiin kierrekorkilla 10 varustettuun pulloon ja annettiin kaasukromatografia/massa-pektrin ajoon.

Silyloitujen reuteriinijohdannaisten tutkimuksiin käytettiin Hewlett Packard GC/MS -laitetta (Hewlett Packard, San Jose, 15 California). GC-olosuhteet olivat virtausnopeus 1,1 ml/min ja injektiolämpötila 280°C. Analyysiin käytetty ohjelma käsitti alussa 3 min pitämisen 40°C:ssa, ja sitten porrastetun nousun 260°C:een 6°C/min portain. Erottumisen aikaansaamiseksi valittu kolonni oli 15 M DBS -kvartsilasikapillaariko-20 lonni, jonka toimitti J & W Scientific (Folsum, California). Massa-alue oli 40-400, ionilähdelämpötila 200°C, elektroni-energia 70 eV, elektronitörmäysionisointi katkeamattomalla injektiolla ja hajoamisaika 0,8 min.

· · 25 Reuteriini havaittiin pysymättömäksi GC-injektorissa olevis-· sa korkeissa lämpötiloissa. Kestävä reuteriinijohdannainen '···’ valmistettiin silanisoinnilla BSTFArlla ympäristön lämpöti- loissa. Derivatisoidun näytteen kromatograf iällä saatiin : monimutkainen GC-tulos (aivoja ei esitetä) , mutta yhdistei- 30 tä, joilla on näennäinen molekyylipaino 292 (148 + 2 trime-tyylisilyyliryhmää) havaittiin retentioajoilla välillä 9 ja 14 min. Kaksi huippua tunnistettiin mahdollisiksi isomee-. . . reiksi (retentioajat 11,7 ja 13,3 min). Monosilyloitu joh- • J. dannainen havaittiin retentioajalla 9,3 min ja sen spektri ’.35 on esitetty kuvassa 24. Tämän yhdisteen fragmentoitumismalli koostuu signaaleista 205, 177, 163, 147, 130 ja 115 M/E-yk-sikköä. Yhden TMS-ryhmän sisältävä reuteriini (mp = 220) voisi menettää metyyliryhmän, jolloin muodostuu M/E-arvo 110366 32 205. Fragmentti 147 yksikön kohdalla voisi mahdollisesti tulla TMS-ryhmän menetyksestä, mutta fragmenttien mallit kohdalla M/E 147 ilmaisi piin, hiilen ja hapen luonnollisten isotooppien läsnäolon. Täsmällisemmin, fragmentti-ionien 5 147:148:149 M/E-yksikköä suhde oli 100:16:9, tarkalleen suh de, joka olisi ennustettavissa molekyylille, jolla on koostumus C6H,502Si. Tämän fragmentti tulkittiin rakenteeksi, joka on esitetty kuvassa 25, eikä reuteriinimolekyyliksi, joka on menettänyt TMS-ryhmän. Spektrissä olevat voimakkaat signaa-10 lit M/E 219 ja 189 kuuluvat 2 TMS-ryhmää sisältäville joh- dannaismolekyyli-isomeereille, jotka eluoituvat 11,7 ja 13,3 minuutissa (arvoja ei esitetä). Fragmenttien kuvat, jotka toteuttavat M/E-tiedot, kuten myös rakenteelliset NMR-tutkimusten yksityiskohdat, on esitetty kuvassa 27.

15

Puhdistetun reuteriinin FTIR- ja LCMS-tietojen (kuvat 16 ja 17) pohjalta reuteriinille määrättiin molekyylipainoksi 148, ja sekä hydroksyyli- että aldehydifunktionaalisuutta. Oletukset sopivat hyvin NMR-tietojen kanssa (näytteet D20:ssa). Eh-20 dotettiin molekyylikaavaa C6H1204 ja kuvassa 20 esitettyä rakennetta. Oli kuitenkin selvää, että määrättyä tarkastelua tarvittiin, kun reuteriinin NMR-tutkimukset suoritettiin deuteroidussa metanolissa. Tiedot tässä tapauksessa osoitti-··· vat, että molekyylissä oli ainoastaan 3 hiiltä tai että mo- : .‘.25 lekyyli oli symmetrinen akselin suhteen (ts. 2x3 = 6). Kah- .···, den mahdollisen kaavion esitettiin selittävän nämä tiedot “! (kuva 26) .

Kaavio A vaatisi toisen hemiasetaalisidoksen muodostumista 30 aldehydin ja hydroksyylin välille. Lopullinen rakenne olisi joko 8-jäsenisenä renkaana, jolloin molemmat puolet olisivat symmetrisiä. Tämä esitetty rakenne ei ottaisi hyvin huomioon ; : : hiilisignaalia 207 ppm kun reuteriini analysoidaan deuteroi- dussa metanolissa. Rakenne ei sovi hajoamismalleihin, läsnä 35 olevien protonien suhteisiin (hiilissä olevien vetyjen suhde 2:2:1) eikä metanolissa saadun protonispektrin kemiallisiin '·;·[ siirtymiin. Hemiasetaalit olisivat vapaita avautumaan ja ; sulkeutumaan uudelleen veden läsnäollessa (pitkälle kuten 110366 33 sokerit, joissa tapahtuu ajan myötä mutarotaatiota), ja reu-teriininäytteessä voisi olla joka hetki joukko muotoja. Tämä voi johtaa D20-spektreissä havaittuihin leveisiin signaaleihin ja täsmällisten integrointisignaalien puutteeseen.

5

Kaavio B etenisi rakenteellisesti paljon edullisemman 6-renkaan kautta, ja esiintyisi veden lohkeamisen myötä metano-lissa bisyklisenä renkaana. Tällä molekyylillä olisi myös tarvittava symmetria metanolissa havaittujen NMR-spektrien 10 selittämiseen. Edelleen tämä rakenne sisältäisi hiilen, joka voisi antaa hiili-13-spektrin signaalin 104 ppm. Protoni-spektrissä (D20:ssa ajetussa) esiintyvät kemialliset siirtymät sopisivat esitetylle 6-jäseniselle rengasrakenteelle, hemiasetaalin avautuminen saisi aikaan edellä kuvatun kal-15 täisen tilanteen, nimittäin monimutkaisiin spektreihin johtavien monien muotojen esiintymisen.

Reuteriinin D20:ssa ajetun protonispektrin (kuva 19) edelleen tarkastelu antaa tietoja, jotka tukevat kaaviota B (kuva 20 26). Reuteriinin suoraketjuinen muoto ottaisi huomioon sig naalit, jotka esiintyvät kemiallisissa siirtymissä 1,6, 2,6, 3,5, 3,7, 5,0 ja 9,5 ppm. Näiden signaalien pinta-alasuhde ei selvästikään ole sama kuin molekyylin vetyatomien (ts. 1:2:2:1:2:2 hiilille 1-6). Jos myös syklinen muoto esiintyi-: .-.25 si jossain tasapainokonsentraatiossa suoraketjuisen muodon . ···. kanssa, olisivat hiilien 1 ja 4 protonit hyvin erilaisessa ’1! ympäristössä verrattuna samoihin protoneihin ketjumuodossa.

;·; Tämä aiheuttaisi näille protoneille uuden kemiallisen siir tymän. Hiilien 3, 5 ja 6 hiilien protonien ympäristö olisi 30 suhteellisen vakio kummassakin muodossa, eikä signaalien odotettaisi siirtyvän merkittävästi. Kuten odotetaan, ovat hiilissä 3, 4 ja 6 olevat protonit leveitä, ja niillä on : : : merkittävä poikkeama odotetuista pinta-alaintegraaliarvois- ta. Heikkojen signaalimallien muodostuminen noin 5 ppm:ään .' 35 seuraa protoneista odotetuissa rengashiilissä, joihin on kiinnittynyt 2 happea. Kahden reuteriinimuodon esiintyminen ’·;·] vesiliuoksessa ottaa huomioon havaitun protonispektrin, kun 110366 34 taas reuteriinin irreversiibeli hajoaminen 2 hydroksipro-pionalhehydimolekyyliksi selittäisi myös protonispektrit.

Silyloiduista näytteistä saadut massaspektrit muodostivat 5 reuteriinin rakenteelle toisen yksityiskohtien tason tarkasteltaessa yhdessä NMR-tutkimuksista saatujen tietojen kanssa. Signaalit 147 M/E edustavat fragmentteja, joita voitaisiin odottaa miltä hyvänsä kaavioissa A ja B (kuva 26) esitetyiltä rakenteilta. M/E:ssä 177 havaittu fragmentti ei 10 kuitenkaan esiintyisi 8-jäsenisen renkaan tai suoran ketjun fragmentoinnissa. Samoin signaalia M/E 163 ei odotettaisi näille molekyyleille. Fragmentit M/E 177 ja 163 ovat mahdollisia, jos 6-jäsenistä rengasta käytetään emomolekyylinä. Kuvassa 27 esitetään yksityiskohtaisesti silanisoidun 6-jä-15 senisen renkaan ehdotettu fragmentoituminen, joka sopii GCMS-analyysin tuottamiin tietoihin.

Kaikkien havaittujen M/E-signaalien voidaan katsoa olevan joko -CH2-CH2-0-TMS-hännän fragmentteja tai 6-jäsenisen ren-20 kaan fragmentteja. Edelleen fragmentti M/E 147 voisi muodostua joukosta erilaisia fragmentoitumisia, joista jokainen sisältää 3 perushiiltä, hapen ja ryhmän -0-TMS. Tämä huomio on tärkeä, koska fragmenttien M/E 147 signaalit ovat voimak-| kaita molempien odotettujen GC:llä erotettujen isomeerien 25 (kuten myös monosilyloidun molekyylin) spektreissä, mikä osoittaa, että molemmat isomeerit antavat samat perusrengas-'··' fragment oi tumi set (ts. niillä on samanlainen rakenne) . 1 Tähän mennessä koottujen tietojen perusteella reuteriinin 30 todennäköisin rakenne on kuvassa 28 esitetty. Reuteriinin esiintyessä vesiliuoksessa sen on oltava tasapainossa avoimen ketjun kanssa (NMR-tulosten perusteella) kun taas sen . · ollessa BSTFA-johdannaisena se on yksinomaan rengasmuotoon .·:· sulkeutuneena (GCMS-tutkimukset) . Reuteriinin rakenteen pro- 35 töni-NMR-tutkimukset asetonissa sopivat yhteen veteen liuo- ·. · tetulta reuteriinilta kerättyjen tietojen kanssa (tietoja ei esitetty) . Edelleen metanolin ja veden 50/50-seokseen reute-. riinin NMR-analyysi antoi samanlaiset tulokset kuin edellä 110366 35 esitetyt metanolissa saadut. Tarvitaan metanolissa vallitsevien muotojen edelleen analysointia bisyklisen rakenteen teorian varmistamiseksi. Lisäksi reuteriinin (sen oletettuna rakenteena) orgaaninen synteesi ja seuraava rakenneanalyysi 5 on ainoa ehdoton menetelmä oletetun rakenneolettamuksen varmistamiseksi .

Kirjallisuustutkimukset reuteriinin rakenteen arvioinnin jälkeen antoivat tulokseksi, että yhdiste, jolla on samat 10 kemialliset komponentit kuin reuteriinilla, oli läsnä happamassa liuoksessa akroleiinin hydratoinnin yhteydessä (29). Se on edelleen äskettäin kuvattu β-hydroksipropanaldehydin valmistuksen distillaattina nimellä 4-hydroksi-2-2'-hydrok-sietyyli-l:3-dioksaani (30).

15

Kun 4-hydroksi-2-2'-hydroksietyyli-l:3-dioksaani syntetisoitiin hakijoiden laboratoriossa tavalla, jonka Hall (30) on kuvannut, se eluoitui samoissa HPLC-huipuissa kuin reuterii-ni ja sillä oli identtinen MIC-arvo kuin biologisesti synte-20 tisoidulla reuteriinilla. Siksi kuvassa 27 esitetty rakenne on reuteriinin rakenne.

β-hydroksipropaldehydillä (myös nimillä: 3-hydroksipropanaa-li, hydrakraldehydi, β-hydroksipropionaldehydi ja 3-hydrok- » 25 sipropan-1-aali) on suuri potentiaalinen arvo liuotin- tai < k 'II.' pehmitinalalla (Hall, R.H. ja Stern, E.S., Journal Chemival ’·; Society, tammikuu-maaliskuu, 1950 s. 490-498) . On varmistet- ;:· tu, että dimeerinen β-hydroksipropaldehydi (ts. reuteriini eli 4-hydroksi-2-2' -hydroks ie tyyli-1:3-dioksaani) ja mono-30 meerinen β-hydroksipropaldehydi ovat liuoksessa tasapainossa (sama). Siksi reuteriinin biologinen muodostuminen glyserolista L. reuterilla käsittää uuden menetelmän monomeerin (β-; hydroksipropaldehydi) kuten myös tämän aineen dimeerisen muodon valmistamiselle.

/ ;35 ‘· ’· L. reuteri/reuteriini-järjestelmä: enteeristen mibrobiaalis- *.·· ten populaatioiden säätelijä. Tämän järjestelmän havaitsemi- : :'· nen on johtanut uuteen käsitteelliseen malliin, joka selit- 110366 36 tää, miten mikrobipopulaatioita voidaan säädellä eläinten ruoansulatuskanavassa. Tämä malli on kuvattu kuvan 12 neljässä osassa: vaiheessa 1 suolen osa, joka sisältää oletettavia bakteereja (lajit A ja B) ja L. reuterin (R), joka on 5 populaation homeostaasitilassa. Vaiheen 2 aikana läsnä olevat L. reuteri -solut havaitsevat heterologisen mikrobin populaation (tässä tilanteessa organismi A) kasvun. Vaiheessa 3 oletettavasti haiman ja/tai mikrobiaalisen aktiivisuuden kautta saatavilla olevan glyserolin (tai glyseraldehydin) 10 läsnäollessa syntetisoituu reuteriinia. Reuteriinin bakte- riosidinen vaikutus pienentää enteerisiä mikrobipopulaatioita vaiheessa 4, ja vaiheen 1 populaatiohomeostaasi säilyy. Tämän mallin mukaan feedback-säätelyperiaate, joka toimii niin tehokkaasti metabolisella tasolla, voi toimia solu-15 tasolla enteerisen populaation homeostaasin ylläpitämiseksi.

Esitettyjen kokeellisten tietojen pohjalta ja feedback-mallin valossa tarkasteltuna L. reuteri -kannan 1063 arvioidaan sopivan parhaiten toimimaan probioottisena aineena ja paran-20 tamaan ruokintatehoja sioilla. Tämä johtopäätös johtuu (i) havainnosta, että kanta 1063 tuottaa suuria määriä reuteriinia (kuva 2) ja että se vastaa heterologiseen stimulointiin muita kantoja helpommin (taulukko 6) , (ii) tosiseikasta, että kanta 1063 eristettiin suoraan porsaan ohutsuolesta, ja 25 se on sen vuoksi sian isäntäspesifinen kanta, ja (iii) ha-vainnoista, että kannalla 1063 on voimakas kyky autoaggre-·*·* goitua, ja se tarttuu muita testattuja kantoja paremmin por saan epiteelisoluihin.

* · 30 Keksinnön paras suoritusmuoto

Reuteriinia saadaan homologisella menetelmällä, jolloin L. reuteri -soluja kasvatetaan 24 h ravistelematta 37°C:ssa , .·. Lactobacillus Carrying Medium-väliaineessa glukoosin kanssa.

,·;· Solut kerätään sentrifugoimalla ja suspendoidaan 250 mM gly- • 35 seroliin. 6-h inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa ravistelematta \ ’ solut poistetaan sentrifugoimalla ja suodattamalla. Reute- riiniliuos lisätään sitten ympäristöön, joka sisältää reute- 110366 37 riinille herkkiä mikro-organismeja mikro-organismien tappamiseksi.

Teollinen sovellettavuus 5 Reuteriini on sovellettavissa antiviraaliseen, antibakteri-aaliseen, antiparasiittiseen ja antifungaaliseen käyttöön laboratorioissa. Lisäksi reuteriinia voidaan lisätä ruokatavaroihin mikrobikasvuston vähentämiseksi. Reuteriinia voidaan myös syöttää eläimille mikrobipopulaation vähentämisek-10 si eläimen ruoansulatuskanavassa. Lactobacillus reuteri -soluja voidaan inkuboida reuteriinintuotantoon vaikuttavissa olosuhteissa antimikrobiaalisen aktiivisuuden parantamiseksi .

15 Taulukko 1. Reuteriinia muodostuu glyserolin tai alyseral-dehydin läsnäollessa i Korvaava aine % E. coli lisätty kasva- L. reuteri (CFU/ml) 20 tusvällaineeseen 1063:n lisäys 6 h kuluttua esto-% glukoosi - 1,3x10* 0 + 1,3xl08 .. . 25 mannoosi - 7,2xl07 0 * V + 9,0x107 » fruktoosi - 2,lxl08 0 : + 3, OxlO8 30 ... mannitol i - 2,3xl08 0 + 2,7x10* • * · :,*· sorbitoli - 2,lxl08 0 35 + 1,9x10* glukonaatti - 3,5x10* 0 + 3,2x10* .’40 ksyloosi - 6,7xl07 0 ;;; + 6,9xl07 '· · ribitoli - 5,7x106 0 i + 4,9xl06 :./45 arabitoli - 2,7xl06 0 + 2,9xl06 t » « 110366 38 dihydroksiasetoni-P - 3,4xl06 0 + 4, lxl 06 β-glyseroli-P - 5,lxl06 0 5 + 6,5xl06 glyseroli - l,2xl07 99 + 5,5x104 10 glyseraldehydi - 2,8xl06 99 + 3,2xl04 TAULUKKO 2. Reuteriinia löydetään vilielvnesteessä solujen 15 poiston jälkeen sentrifugoimalla E. colin kasvatus sent-rifugoidun viljelyalustan viljelyväliaineessa läsnäollessa CFU/ml 6 h olevat substraatit_kuluttua_esto-% 20 pyruvaatti 4,lxl09 0 fosfoenolipyruvaatti 3,7xl09 0 fosfoglyseraatti 3,3xl09 0 β-glyseroli-P 3,2xl09 0 25 dihydroksiasetoni-P 3,7x109 0 glyseroli 4,5xl05 99,9 glyseraldehydi 6,lxl05 98,9 ilman substraattia 3,6xl09 0 30 TAULUKKO 3. Reuteriinin muodostuminen erilaisissa viljely- » » · ! ' olosuhteissa 1 f 1 - · · % i i t t j :' · _muodostuneet reuteriiniyksiköt_ II1 .··1. E. coli dia- E. coli kulunut • 1 1 35 aika täydellinen miinus lyysiputkessa viljely neste ' (h) järjestelmä E. coli s isällä-ulkona +1063 -1063 . ’! 0 0 0 0 0 0 0 1 16 - -11-2 24 - - 4 4 - 40 3 32 - - 6 4 - 4 32 - - 8 6 - 5 32 - - 8 8 - 6 32 8 4 8 8 0 t » ! i · .·:· 45 » I » i » · » · * 1 f · > t · » 4 · 110366 39 TAULUKKO 4. Vilielyväliaineen ia E. colin elinkyky isyyden vaikutus reuteriinin muodostumiseen L. reuteri 1063:11a _reuteriinivksiköitä_ 5 E. coli plus lämpötapettuja kasvatus- E. coli L. reuteri L. reuteri E. coleja plus olosuht. yksin 1063 yksin 1063_ L. reuteri 1063 täydellinen väliaine 06 48 6 10 glyseroli- vesi 0 6 6 2 15 j TAULUKKO 5. Reuteriinin homologinen ia heterologinen tuotto kolmella L. reuteri-kannalla erilaisissa konsentraatioissa 20 tuotettuna reuteriiniyksiköitä (6-h inkubointi) L. reuteri kanta 1063 kanta 23272 kanta 20016 CFU E. coli E. coli E. coli ml:ssa (-) ( + ) (-) ( + ) (-)_i+1 1,2xl010 96 - - - - 25 4, OxlO9 48 - - - - - 1,3xl09 24 - - - - - 4,4xl08 4 - - - - - 2,0x108 0 96 4 48 48 96 7, OxlO7 0 48 2 32 16 48 30 2,3xl07 0 32 0 16 6 32 7,6xl06 0 12 0 6 3 12 2,5xl06 0 0 0 0 0 1 ; +: E. coli = sekainkubointi 20 CFU E. coli/CFU L. reuteri .•••.35 -: ilman E. colia TAULUKKO 6. Herkkyys reuteriinille ia reuteriinintuotannon stimuloiminen eri bakteerilaieilla reuteriinintuotannon stimuloiminen 40 ilmoitetuilla kannoilla glyseroli- väliaineissa 1 testatut herkkyys reuteriini- ;;; bakteerikannat reuteriinille yksikkönä : : ‘45 I. Gram-negatiiviset bakteerit:

Escherichia coli K12 (villi tyyppi) VS 32

Escherichia coli 431 ·'...·’ (sian enteropatogeeni) VS 64 •.50 Escherichia coli 73 110366 40 (sian enteropatogeeni) VS 64

Escherichia coli P155 (sian enteropatogeeni) VS 64

Escherichia coli 263 5 (sian enteropatogeeni) VS

Escherichia coli P159 (sian enteropatogeeni) VS

Escherichia coli CII-P7 (sian enteropatogeeni) VS

10 Salmonella typhimurium VS 64

Shigella-lajit VS 64

Proteus-lajit VS 32

Pseudomonas fluorescens VS 64 15 II. Gram-negatiiviset bakteerit:

Staphylococcus epidermidis VS 32

Streptococcus cremoris VS 8

Clostridium sporogenes S 8

Bacillus megaterium S 12 20 Pediococcus cerevisiae S 8

Leuconostoc mesenteroides S 8 III. Hiivat:

Saccharomyces cerevisiae S 12 25__ VS = hyvin herkkä; S = herkkä TAULUKKO 7. Ribonukleotidireduktaasin Bl-alayksikön inhibi-tio ia tioredoksiinin inhibitio reuteriinilla 30 reuteriini, μΐ/nmol proteiinia entsyymi/alayksikkö 50-% inhibition aiheuttamiseksi :··. Bl 53 : B2 555 35 tioredoksiini 34 ; ’·. tioredoksiinireduktaasi >5000 TAULUKKO 8 ,:::.4° NH3 (mg per log CFU bakteereita per g_

100 g Pseudomonadit LAB LAB

_(kings agar)_yhteensä hetero_ kontrolli 164 9,5 <5,0 <4,0 45 glyseroli 64 9,4 5,5 5,1 1068 36 8,4 8,5 8,6 1063 28 6,7 7,7 7,8 .·. 5° 110366 41

VIITTEET

I. Kandler, O., et ai., Zbl. Bakt. Hgg., I.Abt. orig. Cl, 264-269 (1980).

5 2. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, osa 2. Toim.

P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe ja J.G.Holt, Williams and Williams, Baltimore (1986).

3. Sandine, W.E., et ai., J. Milk. Food Technol., 35:691 10 (1972) .

4. Goldin, B.R., et ai., J. Natl. Cancer Institute, 64:255 (1980).

15 5. Goldin, B.R., et al., Development in Industrial Microbio logy, 25:139 (1984).

6. Goldin, B.R., et al., Am. J. Clin. Nutr., 39:756 (1984).

20 7. Gilliland, S.E., et al., Appi. Environ. Microbiol., 49:377 (1985).

8. Schutz, H., et al., System. Appi. Microbiol., 5:169 • ·/ (1984).

25 :.: ! 9. Sobolov, M., et al., J. Bacteriol., 79:261 (1960).

: :: 10. Smiley, K.L., et al. , Arch. Biochem. Biophys., 97:538 :Y; (1962) .

30 II. Metnikoff, Prolognation of Life, G. P. Putnam's Sons,

New York, NY, 1970.

;;; 12. Klaenhammer, T.R., et al., J. Dairy Science, 65:1339 ’·; 35 (1982) .

13. Dahiya, R.S. et al., J. Dairy Science, 51:1568 (1968).

110366 42 14. Gilliland, S.E., et ai., J. Milk Food Technol., 35:307 (1972) .

15. Pinheiro, A.J.R., et ai., J. Dairy Science, 57:183 5 (1968) .

16. Price, R.J., et ai., J. Milk Food Technol., 33:18 (1970).

10 17. Sorrels, K.M., et ai., J. Dairy Science, 53:239 (1970).

18. Talon, R.J., et ai., Zentralbl. Bakteriol. Abt. Orig.

B170:133 (1980) .

15 19. Gilliland, S.E., et ai., J. Food Pretection, 40:820 (1977).

20. Tramer, J., et ai., Nature, 211:204 (1966).

20 21. Shahani, K.M. et ai., Cult. Dairy Prod. J., 12:8 (1977).

22. Shahani, K.M., et al., Cult. Dairy Prod. J., 11:14 (1976).

25 23. Reddy, G.V., et al., J. Dairy Science, 54:748 (1971).

24. Hamdan, I.Y., et al., J. Antibiotics, 27:631 (1974).

25. Hamdan, I.Y., et al. , Cult Dairy Prod. J., 10:10 (1975).

30 26. Spillmann, H., et al., Milchwissenschaft, 33:148 (1978).

27. Vincent, J.G., et al., J. Bacteriol., 78:477 (1959).

;;; 28. Sandine, W.E., J. Food Protection, 42:259 (1979).

35 : 29. Nielsen, A.T., et al. , Polish Journal of Chemistry, 55:1393 (1981).

;;; 30. Hall, R.H., et al., J. Chem. Society, 1950:490 (1950).

!

Claims (6)

43 110 3 6 6

1. Menetelmä β-hydroksipropionaldehydin valmistamiseksi, jolla on antimikrobiaalinen vaikutus, kuten antibakteriaa- 5 linen, antiviraalinen, antiparasiittinen, antifungaalinen ja probioottinen vaikutus ja joka inhiboi ribonukleotidire-duktaasiaktiivisuutta, tunnettu siitä, että Lactobacillus reuteri -soluja, jotka pystyvät tuottamaan antibioottia, pannaan olosuhteisiin, jotka ovat suotuisat antibiootin 10 tuotannolle, edullisesti glyserolin ja/tai glyseraldehydin läsnäollessa ja alennetussa hapen osapaineessa, erityisesti glyserolin läsnäollessa konsentraatiossa 20 - 500 mM, ja Lactobacillus reuteri -soluja inkuboidaan 37 °C:ssa ja mahdollisesti heterologisten mikro-organismien läsnäollessa 15 ravistelemattomassa viljelmässä, minkä jälkeen näin tuotettu antibiootti voidaan eristää olennaisen puhtaassa muodossa.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, käimetecknat av att 5 man framställer ett ämne som effektivt inhiberar Gram-posi-tiva och Gram-negativa bakterier och eukariotiska organis-mer, Saccharomyces cerevisiae och Trypanosoma cruzia, var-vid β-hydroxipropionaldehyden och dess dimeriska form inne-häller grundämnena koi, väte och syre väsentligt i följande 10 viktförhällanden: koi 48,65 %, väte 8,11 % och syre 43,24 %, och den dimeriska formen har en molekylvikt pä ca 148 g/mol; den är vattenlöslig och resistent mot proteaser och nukleaser; och som har en specifik eluering med vatten och 0,01 M H2SO4 mellan 1,3-propandiol och glycerol med hög-15 effektiv vätskekromatografi, särskilt med formeln C5H12O4.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että valmistetaan aine, joka on tehokas inhiboimaan l ** Gram-positiivisia ja Gram-negatiivisia bakteereja ja euka- . ·· rioottisia organismeja, Saccharomyces cerevisiaeta ja Try- j panosoma cruzia, jolloin β-hydroksipropionaldehydi ja sen ,···. dimeerinen muoto sisältävät alkuaineita hiili, vety ja hap- ,-.25 pi olennaisesti seuraavissa paino-%-osuuksissa: hiili !!! 48,65 %, vety 8,11 % ja happi 43,24 %, dimeerisen muodon molekyylipainon ollessa noin 148 g/mol; ollen vesiliukoinen ja resistentti proteaaseja ja nukleaaseja kohtaan; ja jolla on ominainen eluoituminen vedellä ja 0,01 M I^SO^llä 1,3-V 30 propaanidiolin ja glyserolin välissä suuren suorituskyvyn . nestekromatografiällä, erityisesti kaavalla • · ·

3. Förfarande enligt patentkrav 1, käimetecknat av att isoleringen omfattar följande steg: (a) Lactobacillus reuteri-cellerna separeras i ett lös-20 ningsprov med antibiotisk aktivitet; (b) provet analyseras med högeffektiv vätskekomatografi; (c) provet elueras; och *·*: (d) materialet insamlas vid toppen, som ligger mellan • · ··· standardtopparna för 1,3-propandiol och glycerol; eller • 2*5 (e) Förekomsten av toppen fastställs i form av eluerings- • · · .···, tiden mellan 1,3-propandiol- och glycerolstandardtopparna genom att iaktta förändringar i refraktionsindex. a 1 ·

3. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu • i « : ·’ siitä, että eristys käsittää seuraavat vaiheet: : 35 (a) erotetaan Lactobacillus reuteri -solut liuosnäytteestä, jolla on antibioottista aktiivisuutta; (b) analysoidaan näyte suuren suorituskyvyn nestekromatograf iällä; 44 1 10 3 6 6 (c) eluoidaan näyte; ja (d) kerätään materiaali huipusta, joka on 1,3-propaanidio-li- ja glyserolistandardihuippujen välissä; tai (e) määritetään huipun esiintyminen 1,3-propaanidioli- ja 5 glyserolistandardihuippujen välisenä eluutioaikana seuraamalla refraktioindeksin muutoksia.

4. Förfarande för framställning av β-hydroxipropionalde-30 hyd, dess dimeriska form eller derivat producerande mikro- *. organismstammar, vilket ämne har formeln effekt, CH2 \ ^ch2^o :v. HO-CH-\ CH—ch2v. ^CH2—OH « 110366 och som har en antimikrobiell, säsom en antibakteriell, antiviral, antiparasitisk, antifungal och probiotisk effekt, och som inhiberar ribonukleotidreduktasaktivitet, 5 kännetecknat av att Lactobacillus reuteri-celler, som för-mär producera antibiotika, försätts i förhällanden som är gynnsamma för produktionen av antibiotika, företrädesvis i närvaro av glycerol och/eller glyceraldehyd och vid sänkt syredeltryck, synnerligen i närvaro av glycerol i en kon-10 centration pä 20 - 500 mM, och Lactobacillus reuteri-celler inkuberas vid 37 °C och eventuellt i närvaro av heterologa mikroorganismer i en icke omskakad odling, varefter de sä-lunda producerade odlingar isoleras. 15

5. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 4, kännetecknat av att cellerna är Lactobacillus reuteri-stam 1063, ATCC 53608.

4. Menetelmä β-hydroksipropionaldehydiä, sen dimeeristä muotoa tai johdannaista tuottavien mikro-organismikantojen 10 valmistamiseksi, jolla aineella on kaava CH? \ ''"λ HO-CH-0-^^ \ CH — CH2 ^CH2—OH ja jolla on antimikrobiaalinen vaikutus, kuten antibakteri-15 aalinen, antiviraalinen, antiparasiittinen, antifungaalinen .. . ja probioottinen vaikutus ja joka inhiboi ribonukleotidire- I · duktaasiaktiivisuutta, tunnettu siitä, että Lactobacillus • · · ;··; reuteri -soluja, jotka pystyvät tuottamaan antibioottia, ·’·* : pannaan olosuhteisiin, jotka ovat suotuisat antibiootin '...20 tuotannolle, edullisesti glyserolin ja/tai glyseraldehydin läsnäollessa ja alennetussa hapen osapaineessa, erityisesti V : glyserolin läsnäollessa konsentraatiossa 20 - 500 mM, ja Lactobacillus reuteri -soluja inkuboidaan 37°C:ssa ja mah-dollisesti heterologisten mikro-organismien läsnäollessa ;·:·25 ravistelemattomassa viljelmässä, minkä jälkeen näin tuotetut kannat eristetään. » I · *...· 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat Lactobacillus reuteri ....’SO -kanta 1063, ATCC 53608.

6. Menetelmä Lactobacillus reuteri -isolaatin seulomiseksi antibioottia tuottavien isolaattien identifioimi- 110366 seksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) siirrostetaan mikro-organismien suspensio eläinlähteestä kiinteälle Lactobacillus-kasvatusväliaineelle; jolloin väli- 5 aine voi olla erittäin selektiivinen laktobasilleille lisäämällä natriumasetaattia ja säätämällä väliaineen pH arvoon 5,5; (b) inkuboidaan mainittua siirrostettua kasvatusväliainetta olosuhteissa, jotka edistävät Lactobacillus-kolonioiden kas- 10 vua, edullisesti lämpötilassa 37 °C 48 h alennetussa hapen osapaineessa; (c) replikoidaan Lactobacillus-koloniat,- (d) päällystetään siirrostettu kasvatusväliaine nesteytetyl-lä puolikiinteällä seoksella, joka sisältää elävän testior- 15 ganismin suspension, edullisesti Lactobacillus plantarumin, ja hiililähteen ryhmästä glyseroli ja glyseraldehydi, edullisesti glyserolin; (e) inkuboidaan päällystettyä väliainetta olosuhteissa, jotka edistävät testimikro-organismin kasvua; ja 20 (f) identifioidaan in situ ne Lactobacillus-koloniat, jotka tuottavat antibioottia havainnoimalla mainittuja kolonioita ympäröivät kasvuinhibitiovyöhykkeet. • · "?:5 • · · !!.’ 1. Förfarande för framställning av β-hydroxipropionalde- hyd, som har en antimikrobiell, säsom en antibakteriell, « · f ( , | antiviral, antiparasitisk, antifungal och probiotisk • · · '·* ’ effekt, och som inhiberar ribonukleotidreduktasaktivitet, 30 kännetecknat av att Lactobacillus reuteri-celler, som för-mär producera antibiotika, försätts i förhällanden som är gynnsamma för produktionen av antibiotika, företrädesvis i närvaro av glycerol och/eller glyceraldehyd och vid sänkt .'!! syredeltryck, synnerligen i närvaro av glycerol i en kon- '25 centration pä 20 - 500 mM, och Lactobacillus reuteri-celler ; '.· inkuberas vid 37 °C och eventuellt i närvaro av heterologa *:*': mikroorganismer i en icke omskakad odling, varefter den 46 110 3 6 6 sälunda producerade antibiotikan kan isoleras i en väsent-ligt ren form.

6. Förfarande för screening av Lactobacillus reuteri-iso-20 later för att identifiera isolater som producerar antibiotika, kännetecknat av att förfarandet omfattar följande steg: (a) en suspension av mikroorganismer transplanteras frän en animal källa till ett fast Lactobacillus odlingsmedium; • · · · * 2*5 varvid mediet kan vara ytters selektivt med avseende pä • · · ,···, laktobaciller genom tillsats av natriumacetat och regiering av mediets pH till 5,5; "I (b) nämnda transplanterade odlingsmedium inkuberas i för- »tl ’·’ ' hällanden som gynnar Lactobacillus-koloniernas tillväxt, 30 företrädesvis vid en temperatur pä 37 °C 48 h under sänkt • · oxygendeltryck; • · · (c) Lactobacillus-kolonierna replikeras; . .·. (d) det transplanterade odlingsmediet täcks med en vätske- ···. formig halvfast blandning, som innehäller en suspension av • · '25 levande testorganism, företrädesvis Lactobacillus planta-: ’.· rum, och i kolkällans grupp glycerol och glyceraldehyd, företrädesvis glycerol; 110366 (e) det täckta mediet inkuberas under förhallanden, som gynnar testmikroorganismens tillväxt; och (f) de Lactobacillus-kolonier som producerar antibiotika identifieras in situ genom att iaktta de tillväxtinhiber- 5 ande zoner som omger nämnda kolonier. • · « t · t · • « · • » · » 1 • · »tl • · • » · • · » 1 · • · · * » 1 • I ·