DK144658B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum c-15003 p-4 - Google Patents

Description

144658

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum C-15003 P-4 med formlen H3C ^CH3 nch CH„ I 2

CO

o o

Cl CH- II o

Il ch, I 1 0 n CH3 och3 ho ved dyrkning af en mikroorganisme, som hører til den art, hvortil stammen Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) hører, i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare carbon-kilder og omsættelige nitrogenkilder.

Antibiotikum C-15003 P-4 er i det følgende forkortet til P-4.

De ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendte mikroorganismer frembringer, når de dyrkes i konventionelle dyrkningsmedier, almindeligvis forskellige komponenter af antibiotikum C-15003 samtidigt, se beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4588/77. Til fraskillelse af den enkelte komponent fra dyrkningsmediet kræves meget komplicerede processer, som uundgåeligt giver et lavere udbytte af den ønskede komponent.

For at overvinde denne ulempe er der foretaget omfattende undersøgelser, især med henblik på specifik udvinding af P-4, og det har vist sig, at P-4 kan produceres i en bemærkelsesværdig stor mængde i forhold til det totale indhold 2 144658 af antibiotikum C-15003, hvis der anvendes et dyrkningsmedium med en specifik sammensætning.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at dyrkningsmediet indeholder leucin og/eller derivater deraf.

I sammenhæng med denne opfindelse er udtrykket "antibiotikum C-15003" eller "C-15003" en fællesbetegnelse for de fire forbindelser med den følgende almene formel som en gruppe eller en blanding af to eller tre af disse forbindelser eller enhver af disse forbindelser hver for sig.

R

Gi CH3 o bo "ννιγ1''ί'^Υχγ“ί

Y X

CH3 och3 ho /CH3 (hvori E står for -ΟΟ-ΟΗγ-ΟΗ·^, -CO-CH , CH, ^CH.

-C0-CH2-CH2-CH3 eller -C0-CH2-CH )

Idet der henvises til den almene formel I, kaldes den forbindelse, hvori R er -CO-CH2-CH3, heri "antibiotikum C-15003 P-2" eller mere kortfattet "P-2", den forbindelse, /CH3 hvori R er -CO-CH , kaldes heri "antibiotikum C-15003 P-3" eller mere kortfattet "P-3", den forbindelse, hvori R er 3 144658 -CO“CH2-CH2-CH3, kaldes heri "antibiotikum C-15003 P-3' " eller mere kortfattet "P-31 ", og den forbindelse, hvori CH-/ 3 R er -CO-CH0-CH , kaldes heri "antibiotikum C-15003 P-4" 1 \ ch3 eller mere kortfattet "P-4". Antibiotikum C-15003 P-2 er den samme forbindelse som maytansinolpropionat, der er beskrevet i Kupehan et al.'s rapport [The Journal of American Chemical Society 9_7, 5294 (1975) ], med hensyn til elementar-analyse, specifik drejning, absorption af ultraviolet lys, absorption af infrarødt lys, massespektrum m.m.

De mikrobiologiske karakteristika af stamme nr. C-15003 undersøgtes ved metoder, der er analoge til dem, der foreslås af Shirling & Gottlieb (international Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)). Resultaterne af observationerne ved 28UC i 21 dage er som følger: l) Morfologiske karakteristika.

Det vegetative mycelium er veludviklet og forgrenet, både på agar og i flydende medium. Mange af hyferne måler 0,8 til 1,2 μ i diameter og kan i visse tilfælde dele sig i fragmenter, som ligner stavformede bakterier eller forgrenede korte hyfestykker. Stammen giver god vækst på forskellige taksonomiske medier, idet luftmyceliet er overlejret på det vegetative mycelium,selv om den ofte danner coremia-lignende legemer (50-200 x 200-1000u), ovenpå hvilken luftmyceliet vokser videre. Mange af luftmycelierne er bugtede, og lige eller åbaat spirallignende konfigurationer træffes ved nogle få lejligheder. Mikroskopisk undersøgelse af ældre kulturer afslører, at de konidielignende celler kun i få tilfælde optræder i kæder, medens de cellesuspensioner, der opnåedes fra overfladerne af sådanne kulturer, ved mikroskopisk undersøgelse viste sig at indeholde mange langstrakt ellipsoide (0,8-1,2 μ x 4,8-6,8 μ) og ellipsoide (0,8-1,2 x 1,0-2,0 μ) legemer, som lignede arthrosporer.

Elektronmikroskopiske undersøgelser viste, at disse legemer havde glatte overflader.

4 144658 2) Cellebestanddele.

Stammen dyrkedes under omrystning i modificeret ISP nr. 1 medium ved 28°C i 66 til 90 timer, hvorefter cellerne opsamledes og skylledes. Ved metoden ifølge B.Becker et al.

(Applied Microbiology 12, 421 (1964)) og metoden ifølge M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (1963)) undersøgtes de ovennævnte hele celler for diaminopimelinsyre og sukkersammensætning. Førstnævnte viste sig at være meso-formen, medens der pivistes pletter, som svarede til galactose og arabinose.

3) Karakteristika for taksonomiske medier.

Stammen viste forholdsvis god vækst på forskellige medier, idet det vegetative mycelium var farveløst til bleggult i de indledende dyrkningsfaser og lyst gulbrunt til gulbrunt i senere faser. Stammen producerer opløselige pigmenter, gule til gulbrune, i forskellige taksonomiske medier. Luftmyceliet er pulveragtigt og giver generelt moderat vækst, idet det er hvidt til gult eller lyst gulbrunt. Karakteristika for stammen i forskellige taksonomiske medier er opført i tabel 1.

Tabel 1.

Dyrkningskarakteristika for stamme nr. C-15003 på taksonomiske medier.

(A) Sucrose-nitrat-agar: Vækst (G): Moderat, "Brite Melon Yellow" (3 ia)* til "Amber Tan" (3 lc)*, coremialignende legemer dannet.

Luftmycelium (AM): Sparsomt, hvidt.

Opløseligt pigment (SP): Intet eller blegt gulbrunt.

'(B) Glycerol-nitrat-agar: G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)*, coremialignende le gemer-dannet.

AM: Moderat, hvidt.

SP: Intet.

U4658 5 (C) Glucose-asparagin-agar: G: Moderat, "Brite Marigold" (3 pa)* til "Brite

Yellow" (2 pa)*.

AM: Sparsomt, hvidt.

SP: "Brite Yellow" (2 pa)*.

(D) Glycerol-asparagin-agar: G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)*, coremialignende le gemer dannet.

AM: Sparsomt, hvidt.

SP: Intet.

(E) Stivelsesagar: G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Lt Wheat" (2 ea)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Rigeligt, "Lt Ivory" (2 ca)*.

SP: Intet.

(E) Næringsagar: G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Colonial Yellow" (2 ga)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Sparsomt, hvidt.

SP: Intet.

(G) Calciummalatagar: G: Moderat,"Lt Ivory" (2 ca)* til "Lt Wheat" (2 ea)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)*.

SP: Intet.

(H) Gærekstrakt-malt ekstrakt-agar: G: Moderat, "Amher" (3 lc)* til "Brite Yellow" (3 la)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)*.

SP: Intet.

(i) Havremelagar: G: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)* til "Colonial Yellow" (2 ga)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Sparsomt, hvidt til lysegult.

SP: Intet.

(J) Pepton-gærekstrakt-jern-agar: G: Moderat, "Colonial Yellow" (2 ga)*.

AM: Intet.

SP: "Colonial Yellow" (2 ga)*.

6 U4658 (K) Tyrosinagar: G·: Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)^ til "Lt Melon Yellow" (3 ea)*, coremialignende legemer dannet.

AM: Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)#.

SP: "Camel" (3 ie)*.

* Farvekoderne svarer til "Color Harmony Manual", 4. udgave. (Container Corporation of America, 1958).

4) Fysiologiske karakteristika:

De fysiologiske karakteristika af stammen er vist i tabel 2. Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C. Temperaturområdet, hvori der optræder god luftvækst på agar (ISP nr. 2), er 20 til 35°C.

Tabel 2.

De fysiologiske karakteristika af stamme nr. C-15003.

Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C.

Temperaturområde for luftvækst: 20 til 35 C.

Gelatinesmeltning: Positiv.

Hydrolyse af stivelse: Positiv.

Reduktion af nitrater: Positiv.

Peptonisering af mælk: Positiv.

Koagulation af mælk: Negativ.

Dekomposition af kasein: Positiv.

Produktion af melanoide pigmenter:

Negativ: (pepton-gærekstrakt-jem-agar), positiv: (tyrosinagar).

Dekomposition af tyrosin: Positiv.

Dekomposition af xanthin: Negativ.

Dekomposition af hypoxanthin: Negativ.

Tolerance overfor lysozym: Positiv.

Tolerance overfor natriumchlorid: 2$. 1

Udnyttelse af forskellige carbonkilder:

Udnyttelsen af forskellige carbonkilder undersøgtes under anvendelse af et medium beskrevet i Pridham og Gottlieb (Journal of Bacteriology _56, 107 (1948)) og et basalmedium med samme, sammensætning plus 0,1$ gærekstrakt. Det resulterende spektrum er vist i tabel 3.

7 144658

Tabel 3.

Udnyttelsen af carbonkilder af stamme nr. C-15003.

Carbonkilde Vækst Carbonkilde Vækst D-Xylose + ++* Raffinose ± ± * L-Arabinose + + Melibiose + + D-Glucose ++ ++ i-Inositol D-Galactose + + D-Sorbitol - - D-Fructose +++ ++ D-Mannitol ++ ++ L-Rhamnose + + Glycerol - ± D-Mannose +++ ++ Opløselig stivelse + +

Sucrose ++ ++ Kontrol - -

Lactose - -

Maltose ± +

Trehalose + ++ * Basalmedium med 0,1$ gærekstrakt tilsat.

Note: +++: Rig vækst ++: God vækst +: Vækst ±; Ringe vækst Ingen vækst 6) Andre karakteristika.

Cellerne· opsamledes ved den tidligere i 2) beskrevne metode, og DEA'et præpareredes analogt med metoden ifølge J. Marmur et al. (Journal of Molecular Biology 3,, 208, 1961). G-C (guanin-cytosin)-indholdet i DNA'et fandtes at være ca. 71 mol-$.

Gram-farvning af det vegetative mycelium af denne stamme var positiv.

De ovenstående karakteristika for stamme nr. C-15003 sammenlignedes med beskrivelserne i S.A. Waksman's "The Actino-mycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co., 1961), R.E.

Buchanan og R.E'. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., 1974", og anden litteratur.

8 1ΛΛ658

Da denne stamme formodedes at høre til gruppe III i slægten Noeardia, og da man ikke fandt arter med de hidtil beskrevne karakteristika blandt de kendte stammer, konkluderede man, at denne stamme repræsenterer en ny mikroorganismeart .

Den foreliggende stamme nr. C-15003 er deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Japan, under accessionsnummeret FERM-P nr. 3992, hos The Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, under accessionsnummeret IFO 13726 og hos The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A., under accessionsnummeret ATCC-31281.

En mikroorganisme af slægten Noeardia er ligesom mikroorganismer generelt tilbøjelig til at undergå variationer og mutationer, enten spontant eller induceret. De mange varianter af stammen, hvilke varianter er opnåelige ved bestråling med røntgenstråler, gammastråler, ultraviolet lys og lignende, ved isolering af enkelte celler, ved dyrkning på medier indeholdende forskellige kemikalier eller ved enhver anden mutagen behandling, såvel som de mutanter, der spontant afledes af stammen, og hvis egenskaber ikke af-. viger væsentligt fra de givne karakteristika, og som er i stand til at frembringe C-15003 P-2, P-3, P-3' og/eller P-4, kan udnyttes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

Når stamme nr. C-15003 eksempelvis underkastes forskellige mutagene behandlinger,dannes mutanter, som i det væsentlige mangler evnen til at producere opløselige pigmenter, mutanter med substratmycelier, som er farveløse, gulgrønne, rødbrune eller orangerøde, mutanter, hvis hyfer er rede til at fragmentere i bacillare elementer eller forgrenede korte hyfefragmenter, og mutanter med rigeligt, hvidt luftmycelium eller i det væsentlige uden luftmycelier.

Leucin kan ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes i form af et derivat. Eksempler på deriva- 9 144658 ter er alkylestere med 1 til 2 carbonatomer (f.eks. methyl-esteren og ethylesteren) af leucin, amider, såsom amidet, eller alkylamider med 1 til 2 carbonatomer (f.eks. N-methyl-amidet og N-ethylamidet) af leucin, dets ketosyrer (f.eks. α-ketoisocapronsyre) eller salte af de ovennævnte forbindelser (f.eks. hydrochlorider). L-formen af leucin er ønskelig. Blandingen af leucin i fri form og dets derivater eller en blanding af derivater kan også anvendes.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes de ovennævnte stoffer generelt i mediet i en mængde på ca. 0,01 til 1,0% (vægt/vol.), fortrinsvis ca. 0,1 til 0,5% (vægt/vol.), på ethvert tidspunkt af dyrkningen, så længe dyrkningen af Nocar-dia sp. nr. C-15003 finder sted, fortrinsvis under den indledende dyrkningsfase.

Mediet, der anvendes til dyrkningen af en sådan antibiotikum C-15003 P-4-producerende stamme, kan være et hvilket som helst flydende eller fast medium, hvis det blot indeholder næringsstoffer, som stammen kan udnytte. Til større produktioner foretrækkes almindeligvis et flydende medium.

Mediet skal indeholde det nævnte tilsætningsstof samt carbon- og nitrogenkilder, som den antibiotikum C-15003 P-4-producerende stamme kan assimilere og omsætte. Desuden kan mediet indeholde uorganisk stof, mikronæringsstoffer og lignende. Som eksempler på carbonkilder kan nævnes glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, stivelse, glycerol, mannitol, sorbitol, fedtstoffer og olier (f.eks. sojabønneolie, svinefedt og hønsefedt). Nitrogenkilderne kan f.eks. være kødekstrakt, gærekstrakt, tørgær, sojabønnemel, majsstøbevand, pepton, bomuldsfrømel, melasse, urinstof, ammoniumsalte (f.eks. ammoniumsulfat, ammoni-umchlorid og ammoniumnitrat) og nitratsalte (f.eks. natriumnitrat og kaliumnitrat). Mediet kan yderligere indeholde salte af natrium, kalium, calcium, magnesium og lignende, salte af jern, mangan, zink, cobalt, nikkel og lignende og salte af phosphorsyre, borsyre m.m. Endvidere kan mediet indeholde vitaminer (f.eks. B^, nicotinsyre, B·^' C og E) , nuclein-syrer (f.eks. af purin, pyrimidin og derivater deraf) m.m. Til ίο 144658 indstilling af mediets pH kan der f.eks. tilsættes en mineralsyre og/eller et alkali eller ammoniak såvel som de tilsvarende baser som pH-justerende midler. Endvidere kan olier og fedtstoffer, overfladeaktive midler og antiskummidler også sættes til mediet, om ønsket.

Dyrkningen kan gennemføres stationært, under omrystning, submers aerobt og under enhver anden dyrkningsbetingelse.

Til større produktioner foretrækkes selvfølgelig submers aerob dyrkning. Selv om dyrkningsbetingelserne naturligvis afhænger af fermentationsbetingelserne og sammensætningen af mediet, den anvendte stamme, dyrkningsmetoden og andre faktorer, foretrækkes det normalt at gennemføre inkubationen ved 20 til 35°C med et udgangs-pH på ca. 5,5-8,5, især ved 23 til 30°C med et udgangs-pH på 6,5 til 7,5. Da dyrkningstiden også er variabel ifølge de samme faktorer som nævnt ovenfor, er det tilrådeligt at fortsætte dyrkningen, indtil styrken af P-4 bliver maksimal. I tilfælde af en rystekultur eller en aerob submers kultur i flydende medium er den nødvendige tid normalt fra ca. 48 til 240 timer.

Det følgende er et konkret eksempel på metoden til fremstilling af P-4.

Stamme nr. C-15003 inokuleredes i et dyrkningsmedium (I), indeholdende 3$ opløselig stivelse, 0,2$ ammoniumchlorid, 0,05$ magnesiumsulfat, 1,09$ kaliumdihydrogenphosphat, 2,09$ dikaliumhydrogenphosphat, 0,001$ ferrosulfat og tilsætningsstoffet, eller et dyrkningsmedium (II),indeholdende 5$ dextrin, 3$ majsstøbevand, 0,1$ pepton, 0,5$ caleiumcarbonat og tilsætningsstoffet, og dyrkedes ved 28°C i 144 timer i en roterende rystemaskine (200 omdr/min.) eller i en fermentor.

11 144658

Tabel 4 og 5 viser resultaterne under anvendelse af mediet (I) henholdsvis (II).

Styrken af det totale C-15003 prøvedes med Talaromyces avellaneus IFO 7721 som prøveorganisme med papirskivemeto-den. Prøvemediet bestod af 3,5 g dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g kaliumdihydrogenphosphat, 5 g gærekstrakt (Difco), 10 g glucose, 15 g agar og 1000 ml destilleret vand (pH 7,0),

Bestemmelsen af det i dyrkningsmediet akkumulerede P-2, P-3 og P-4 udførtes som følger:

Dyrkningsmediet ekstraheredes med det samme volumen ethyl-acetat. Opløsningsmiddellaget koncentreredes og tørredes.

Det tørrede stof opløste i ethylacetat til et volumen på 1/100 af dyrkningsmediet. Produkterne elueredes ved silica-geltyndtlagskromatografi (silicagelplade 60F254 med vandmættet ethylacetat. Mængden af antibiotikumet og forholdet mellem komponenterne bestemtes ved hjælp af en "Shimazu Dual-wave length TIC-scanner", model CS-910, på basis af integraltættieden af hver plet på kroma togrammet ved 254 nm. Forholdet mellem komponenterne er angivet som vægt/vægt-% i det totale produkt af P-2, P-3 og P-4.

Som vist i tabel 4 og 5 producerede stamme nr. C-15003 antibiotikum P-4 i en mængde på 65 til 84% af det totale under tilstedeværelse af de specifikke additiver og 25% eller mindre under fravær af sådanne komponenter. Derfor bliver udvindingen af P-4 fra dyrkningsmediet mere effektiv i det førstnævnte tilfælde end i det sidstnævnte.

14Å658 12

Tabel 4·

Forhold mellem komponenterne (vægt/vægt-$)

Pilsæt- Tilsæt- Tilsæt- Forhold mellem Total aings- nings- nings- komponenterne styrke stof mængde tids- (%) \ _ w ?gg). ^ψψτ (U8/M1)

Ikke tilsat — - 10 65 25 10 L-Leucin 0,1 0 5 28 67 13,5 L-Leucin . 0,3 0 8 13 79 11,5 L-Leucin 0,1 72 5 30 65 10 * Tidspunktet 0 betyder, at tilsætningsstoffet sattes til mediet som en af bestanddelene.

Tabel 5.

Forhold mellem komponenterne (vægt/vægt-$)

Tilsæt- Tilsæt- Tilsæt- Forhold mellem Total ningsstof nings- nings- komponenterne styrke mængde tids- , (%) _ (ua/rn!) W P-2 P-3 P-4 ^ (time)*

Ikke tilsat - - 15 60 25 18 L-leucin 0,3 0 7 21 72 20 L-Leucin 0,5 0 5 11 84 15 * Tidspunktet 0 har samme betydning som i noten til tabel 4.

Da P-4, som således produceres i fermentati onsvæsken er et lipofilt, neutralt stof, kan det bekvemt udvindes fra fermentationsvæsken ved adskillelses- og rensningsmetoder, som normalt anvendes til udvinding af sådanne mikrobielle metaboliter.P-4 ekstraheres let fra kulturfiltratet med med vand ikke blandbare - organiske opløsningsmidler, såsom fedtsyreestere, f.eks. ethylacetat og amylaeetat, alkoholer, f.eks. butanol, halogenerede carbonhydrider, f.eks. chloroform, og ketoner, f.eks. methylisobutylketon. Ekstraktionen af P-4 fra filtratet udføres ved et pH nær 13 144658 neutralpunktet, fortrinsvis med ethylacetat ved pH 7.

Ekstrakten vaskes med vand og koncentreres under reduceret tryk. Derefter sættes et upolært opløsningsmiddel, såsom petroleumsether eller hexan, til koncentratet,og råproduktet, der indeholder den aktive forbindelse, udvindes som et bundfald. Råproduktet -underkastes fortløbende passende rensningsmetoder, om ønsket. Som en rutinemæssig rensningsmetode er adsorptionskromatografi således nyttig, og til dette formål kan anvendes almindelige adsorptionsmidler, såsom silicagel, aktivt aluminiumoxid og makroporøs, ikke-ionisk, adsorberende harpiks. P-4 i råproduktet underkastes silicagelkromatografi, f.eks. med petroleumsether og hexan, og elueres ved tilsætning af et polært opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, acetone, ethanol eller methanol, eller et halogeneret carbonhydrid, såsom dichlormethan eller chloroform, indeholdende et polært opløsningsmiddel, såsom en alkohol, f.eks. methanol eller ethanol, en keton, f.eks. acetone eller methylethylketon, eller lignende. På denne måde elueres, fraskilles og udvindes P-4.

Hår en makroporøs, adsorberende harpiks anvendes til rensning af P-4, udføres elueringen af P-4 fra søjlen med en blanding af vand og en lavere alkohol, en lavere keton eller en ester. Den lavere alkohol kan f.eks. være methanol, ethanol, propanol eller butanol, og den lavere keton kan f.eks. være acetone eller methylethylketon. Esteren kan f.eks. være ethylacetat eller butylacetat. I en typisk fremgangsmåde opløses råproduktet II i 60fo' s methanol-vand og adsorberes på en søjle af "Diaion HP-10", som er en non-ionisk makroporøs ionbytterharpiks. Søjlen vaskes med 70%'s methanol-vand, og P-4 elueres med 90%'s methanol-vand.

I den ovenfor beskrevne fremgangsmåde samles fraktionerne, der indeholder P-4, og de koncentreres under reduceret tryk. Til det tørre produkt sættes 5 til 8 volumen ethylacetat, og blandingen henstår, hvorefter P-4 udskilles som krystaller.

14 144658

Ifølge den omhandlede fremgangsmåde når produktionsandelen af P-4 i C-15003-produkteme ca. 65$ eller mere, og P-4 udvindes let fra dyrkningsmediet. Den omhandlede fremgangsmåde er derfor meget fordelagtig til en industriel fremstilling af P-4.

De fysisk-kemiske egenskaber af det i eksempel 1 opnåede P-4 er vist i tabel 6.

Tabel 6.

Antibiotikumet C-15003 P-4 C^H^CtlTgOg = 649.196

Smeltepunkt (C°) 177-180

Specifik drejning [a]^ -142° - 10° ( c = 0,522 CHCt3)

Elementaranalyse C 60,65

Fundet ($) H 7,05 N 4,25 Cl 5,23

Elementaranalyse C 61,05

Beregnet ($) H 6,99 N 4,32

Cl 5,46

Ultraviolet absorptions- 233 (29900) 240 (sh 28240) spektrum nm (e) 252 (27590) 280 (5712) (i methanol) 288 (5680)

Infrarødt absorotions- 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, o ,4. TTR-r* 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, spektrum (cm ) KBr uoo) lQ80j 1038

Uuclearmagnetisk resonans- 1,03(d) (6H) spektrum (ppm) 100 IHz i CDCt3

Massespektrum (m/e) 587, 485, 470, 450 15 144658

Tabellen fortsat.

Opløselighed Uopløseligt i petroleumsether, hexan og vand. Lidt opløseligt i benzen og ether. Opløseligt i chloroform, ethylacetat, acetone, ethanol, methanol, pyridin, tetrahydrofuran og dimethylsulfoxid

Farvereaktioner Dragendorff: Positiv

Beilstein: Positiv

Den biologiske aktivitet af P-4 er som følger: A) Antimikrobiel aktivitet:

Med trypticase-sojaagar (BBL) som prøvemedium undersøgtes de inhibitoriske koncentrationer overfor de nedennævnte mikroorganismer ved papirskivemetoden. Filtrerpapirskiver (Toyo Seisakusho, tynd type, 8 mm i diameter), som hver var imprægneret med 0,02 ml af en 300 pg/ml opløsning af P-4, placeredes på agarplader, der hver især var inokuleret en af de nedennævnte mikroorganismer. P-4 havde ingen aktivitet mod de følgende bakterier:

Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens og Mycobacterium avium.

På den anden side inkuberedes væksten af en svamp, Talaro-myces avellaneus, af P-4 på en agarplade bestående af 3,5 g dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g monokaliumdihydrogen-phosphat, 5 g gærekstrakt (Difco), 10 g glucose, 15 g agar og 1000 ml destilleret vand, pH 7,0. Den minimale inhibitoriske koncentration var 1,0 til 1,5 pg/ml for P-4. Endvidere dyrkedes Tetrahymena pyriformis W på et prøvemedium [sammensat af 20 g proteose-pepton (Difco), 1 g gærekstrakt, 2 g glucose, 1000 ml destilleret vand og 10 ml 1 M phosphat-puffer, pH 7,0] ved 28°C i 44 til 48 timer, og den vækst-inhibitoriske aktivitet af P-4 mod denne protozo bestemtes ved seriefortyndingsmetoden. Vækstinhibition optrådte ved 0,5 pg/ml for C-15003 P-4.

16 144858 P-4 havde aktivitet mod de følgende mikroorganismer:

Fusieladium levieri, Helminthosporium sigmoidium var. irregulare, Pyricularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia sclerotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rubrum, Ehodotorula rubra og Cryptococcus neoformans.

B) Antitumoraktivitet:

De terapeutiske virkninger af P-4 (indgivet intraperitonealt i 9 på hinanden følgende dage) på P388-leukæni hos mus (l x 10^ celler/dyr, mus, intraperitonealt transplanteret) undersøgtes. P-4 havde en antitumoraktivitet så høj som l80fo levetidsforøgelse ved en dosisstørrelse på 0,00625 mg/kg/ dag.

C) Toksicitet: I en foreløbig akut-toksicitetstest med mus som forsøgsdyr med intraperitoneale injektioner af P-4 viste dette antibiotikum en ID^Q-værdi på over 0,313 mg/kg.

Som førnævnt har P-4 stærk inhibitorisk aktivitet mod fungi og protozoer og er derfor værdifuldt som antifungalt eller antiprotozoisk middel. Da P-4 viser en levetidsforøgende virkning på tumorbærende pattedyr (f.eks. mus), forventes det også, at forbindelsen vil være anvendelig som antitumorlægemiddel.

P-4 kan som antifungalt og antiprotozoisk middel med fordel anvendes til en vurdering af den bakterielle økologi i jorden, i aktivt slam, i dyrs legemsvæske eller lignende, således når værdifulde bakterier skal isoleres fra jordprøver, eller når virkningerne af bakterier skal vurderes uafhængigt af virkningerne af fungi og protozoer i forbindelse med funktionen og analysen af et aktivt slamanlæg anvendt til behandling af spildevand, kan det foreliggende antibiotikum udnyttes til opnåelse af en selektiv vækst af den bakterielle flora uden at tillade vækst af de ledsagende fungi og protozoer i prøven. I et typisk tilfælde sættes prøven til et flydende eller fast medium, og der tilsættes 0,1 ml af en 10 til 100 pg/ml opløsning af P-4 i l$'s methanol-vand. pr. ml af mediet, som derefter inkuberes.

17 144658 P-4 kan også anvendes som antimikrobielt middel til behandling af plantesygdomme forårsaget af de mikroorganismer, der er nævnt i det ovenstående. I den typiske anvendelse bruges P-4 i form af en 1%'s methanolisk vandig opløsning indeholdende 0,5 yg/ml til 5 yg/ml af antibiotikumet. P-4 kan f.eks. anvendes til at kontrollere bladpest, helmintho-sporium-bladpletsyge og skedevisnen hos risplanter.

De følgende eksempler skal belyse opfindelsen nærmere; dele er vægtdele, såfremt andet ikke er angivet, forholdet mellem dele og volumendele svarer til forholdet mellem g og ml, og % er baseret på vægt/volumen, med mindre andet er angivet.

Eksempel 1.

A.

40 volumendele podningskulturmedium (1,0% glucose, 2,0% bactotrypton og 1,2% bacto-gærekstrakt, pH 7,0) hældeg i en 200 volumendeles Erlenmeyer-kolbe.

Efter sterilisation inokuleredes Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) i mediet. Det inokulerede medium inkuberedes ved 28°C i en roterende rystemaskine (200 omdr./min.), hvorved der opnåedes en podningskultur. Cellerne i kulturen vaskedes tre gange med steriliseret, destilleret vand, og de vaskede celler genopslæmmedes i steriliseret, destilleret vand med samme volumen som det oprindelige medium.

En volumendel af den ovenstående blanding inokuleredes i 40 volumendele hovedkulturmedium bestående af 3% opløselig stivelse, 0,2% ammoniumchlorid, 0,05% magnesiumsulfat, 1,09% kaliumdihydrogenphosphat, 2,09% dikaliumhydrogenphos-phat, 0,001% ferrosulfat og 0,3% L-leucin, og dyrkningen udførtes ved 28°C i 8 dage i en roterende rystemaskine (200 omdr./min.).

Den totale produktionsmængde af C-15003 var 12 yg/ml, og andelen af P-4 heri var 80% (vægt/vægt).

*Ll 18 144658 500 volumendele af den under A opnåede podningskultur in-okuleredes i en 2000 volumendeles Sakaguchi-kolbe og dyrkedes ved 28°C i 48 timer i en frem- og tilbagegående rystemaskine (110 slag/min.), hvilket gav et inokulum. In- 3 okulumet overførtes til 100 x 10 volumendele af et medium bestående af 2,0% glucose, 3,0% opløselig stivelse, 1,0% majsstøbevand, 1,0% sojabønnemel, 0,5% polypepton, 0,3% na-triumchlorid, 0,5% calciumcarbonat (vægt/vol.), pH 7,0, i 3 en 200 x 10 volumendeles rustfri stålfermentor.

Dyrkningen gennemførtes ved 28°C i 48 timer under gennem- luftning (100 1/min.) og omrøring (200 omdr./min.). Dyrk- 3 3 ningsmediet (10 x 10 volumendele) overførtes til 100 x 10 volumendele af et fermentationsmedium (5% dextrin, 3% majsstøbevand, .0,1% pepton, 0,5% L-leucin og 0,5% calcium- 3 carbonat (vægt/vol.), pH 7,0) i en 200 x 10 volumendeles rustfri stålfermentor.

Fermentationen udførtes ved 28°C i 4 dage under gennemluft- 3 ning (100 x 10 volumendele/min.) og omrøring (150 omdr./ min.).

Den totale produktion af C-15003 var 12 yg/ml, og andelen af P-4 i C-15003 var ca. 85% (vægt/vægt).

Cj_

Til 95 x 10 volumendele af det under B opnåede dyrkningsmedium sattes 50 x 10"5 volumendele acetone. Blandingen om-rørtes i 30 minutter. Til den resulterende blanding sattes 3 2 x 10 dele "Hyflo Super-Cel", og blandingen omrørtes godt. Blandingen filtreredes gennem et trykfilter, hvorved der 3 opnåedes 135 x 10 volumendele filtrat. Til filtratet sat- 3 3 tes 50 x 10 volumendele vand og 90 x 10 volumendele ethyl-acetat, og blandingen omrørtes og ekstraheredes to gange.

19 144658

De opnåede ethylacetatlag samledes og vaskedes to gange med 3 vand, hver gang med 80 x 10 volumendele. Til det opnåede 3 ethylacetatlag sattes 1 x 10 dele vandfrit natriumsulfat, og blandingen tørredes og koncentreredes til 200 volumendele. Til koncentratet sattes petroleumsether, og det fremkomne bundfald udvandtes ved filtrering, hvilket gav 35 dele af råproduktet.

Til det således opnåede råprodukt sattes 50 volumendele ethylacetat, og blandingen omrørtes.

De uopløselige bestanddele fjernedes ved filtrering, og til filtratet satte 10 dele silicagel (0,05 til 0,2 mm). Efter omrøring af blandingen fjernedes ethylacetatet ved destillation under reduceret tryk. Remanensen anbragtes øverst i en silicagelsøjle (500 volumendele). Antibiotikaerne eluere-des trinvis med 500 volumendele n-hexan, 500 volumendele af en blanding af n-hexan og ethylacetat (3:1), 2000 volumendele af en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1) og 2000 volumendele vandmættet ethylacetat, og eluatet opsamledes i fraktioner på hver 50 volumendele.

En volumendel af hver fraktion koncentreredes til tørhed, og 0,1 volumendel ethylacetat sattes til koncentratet, hvorved der opnåedes en blanding. Blandingen anbragtes i en plet 2,5 cm fra den nederste kant af en silicagelglasplade (60 F254' 0,25 mm, 20 x 20) og elueredes ca. 17 cm med vandmættet ethylacetat. Efter eluering gennemførtes påvisning med ultraviolet lys (2357 Å). De aktive fraktioner med Rf 0,42 opsamledes og koncentreredes under reduceret tryk til ca. 2 volumendele. Til dette koncentrat sattes 20 volumendele petroleumsether, hvorved der opnåedes 1,08 dele rå krystaller. De rå krystaller opløstes i 20 volumendele varmt ethylacetat. Efter afkøling udvandtes 0,92 dele P-4. Renhedsgraden af de opnåede P-4 krystaller var 94% (vægt/vægt), og deres smeltepunkt var 178-180°C.

144658 20

Dj_ I 400 volumendele 50%'s methanol opløstes 20 dele af det under C opnåede råprodukt. 1000 volumendele "Diaion HP-10" anbragtes i en søjle (2,5 cm i diameter) sammen med 3000 volumendele 50%'s methanol-vand. Den ovenfor fremstillede prøveopløsning sendtes gennem søjlen og vaskedes med 1000 volumendele 60%'s methanol, og der udførtes kontinuerlig gradienteluering under anvendelse af 7500 volumendele 60%'s methanol-vand og 7500 volumendele 95%'s methanol-vand.

Eluatet opsamledes i 75 volumendeles fraktioner, og hver fraktion underkastedes silicageltyndtlagskromatografi som beskrevet under C.

De aktive fraktioner nr. 182 til 190 opsamledes og koncentreredes. Til koncentratet sattes 500 volumendele vand og 1000 volumendele éthylacetat.

Blandingen omrystedes i en skilletragt, og det vandige lag fraskiltes, og efter to ganges vaskning med 300 volumendele vand tørredes ethylacetatlaget over vandfrit natriumsulfat, koncentreredes og henstilledes.

De resulterende krystaller af P-4 opsamledes ved filtrering og tørredes (0,950 dele P-4).

Renhedsgraden af de opnåede P-4 krystaller var 92% (vægt/ vægt), og deres smeltepunkt var 177-179°C.

Eksempel 2.

På samme måde som i eksempel 1 anvendtes methylesteren af leucin, N-methylamidet af leucin, α-keto-isocapronsyre eller hydrochloridet af leucin i stedet for L-leucin, hvorved der opnåedes lignende resultater, dvs. specifik produktion af det omhandlede P-4.