KR0163660B1 - 방선균류인 마이크로모노스포라 속 sa-246 균주를 이용한 항균-항암활성을 갖는 saph 유도체의 제조방법 - Google Patents

방선균류인 마이크로모노스포라 속 sa-246 균주를 이용한 항균-항암활성을 갖는 saph 유도체의 제조방법

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Abstract

본 발명은 방선균류의 일종인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속 균주가 생산하는 항균-항암활성물질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 그람양성세균에 대한 생육저하작용과 인체 암세포주에 세포독성을 갖는 퀴논계열의 다음 구조식(Ⅰ)의 신규 SAPH 유도체 및 토양에서 분리한 방선균류의 일종인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속의 균주(기탁번호:ICCTC 8729P)로부터의 신규의 SAPH 유도체의 제조방법 및 이를 함유하는 의약조성물에 관한 것이다.

Description

방선균류(Actinomycetes)인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속 SA-246 균주를 이용한 항균-항암활성을 갖는 SAPH 유도체의 제조방법
제1도는 SAPH 화합물의 수소핵자기공명(1H-NMR) 스펙트럼.
제2도는 SAPH 화합물의 탄소핵자기공명(13C-NMR) 스펙트럼.
본 발명은 방선균류의 일종인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속 균주를 이용한 항균-항암활성물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 그람양성세균에 대한 생육저해작용과 몇몇 인체 암세포주에 세포독성을 갖는 퀴논계열의 신규의 SAPH 유도체 및 토양에서 분리한 방선균류의 일종인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속의 균주로부터 신규 화합물인 SAPH 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
현대의학이 해결하지 못하고 있는 난제인 암정복을 위하여 수많은 노력을 기울여 왔지만 아직도 암은 인간의 사망원인 중의 수위를 접하고 있으며, 이로 인해 약효가 뛰어나고 독성이 적은 새로운 항암제의 개발이 시급한 실정이다. 지금까지 보고된 항암물질은 1,500여개 이상으로, 현재 임상적으로 사용되고 있는 항암제는 작용기작과 화학구조에 따라 알킬화제, 항암성 항생물질, 대가길항제, 스테로이드 호르몬, 유사분열억제제 등으로 나뉘어지고 있다. 제2차 세계대전 후 본격적인 항암제 개발연구가 시작된 이래 항암제 스크리닝 기술은 많은 발전을 해왔으며 실제로 실험실내의 간편한 조작에 의해 탐색된 항암활성물질이 생체내에서도 동일한 활성을 보임으로서 미생물 배양액이나 천연물로부터 간단하게 항암물질을 스크리닝하는 단계에 이르렀다. 미생물은 다양한 생리대사 기작을 지님으로써 많은 종류의 생리활성물질을 생산하고 실제로 생물공업제품의 대부분이 미생물로부터 개발되었다. 이런 관점에서 볼 때 미생물은 아직도 생리활성물질 탐색에 있어서 중요한 대상이며 특히 자연에서의 분리가 어려운 희귀미생물은 대사물질의 다양성 때문에 유용한 생리활성물질의 개발가능성을 매우 높게한다.
이러한 취지하에 노력한 결과 본 발명자들은 저영양성 희귀미생물을 분리하고 이들이 생산하는 생리활성물질을 탐색한 결과, 저영양성 미생물 선택배지에서 분리된 방선균으로부터 새로운 퀴논(quinone)계열의 화합물 SAPH 유도체를 분리정제하여 화학구조를 밝히고, 이 화합물이 그람 양성세균 및 암세포주에 대한 세포독성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 항암활성 및 항세균활성을 보이는 퀴논(quinone)계열의 다음 구조식(Ⅰ)로 표시되는 신규의 SAPH 유도체, 이들의 광학이성체 및 약학적으로 허용가능한 이들의 산, 염기부가염을 제공하는 것이다.
상기식에서, R은 저급알킬이다.
본 발명의 다른 목적은 방선균류인 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속의 SA-246 균주의 배양여액으로부터 항균활성 및 항암활성을 나타내는 상기 일반식(Ⅰ)의 SAPH 유도체를 분리함을 특징으로 하는 항암 및 항세균물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 일반식(Ⅰ)의 유도체의 사용방법 및 이들의 의약조성물을 제공하는 것이다. 이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 나타낸 방선균 SA-246 균주는 저영양성 선택배지를 사용하여 토양에서 분리하여 사용하였다. 분리 균주의 생물활성은 1차로 항균활성을 조사하고 2차로 정제된 활성물질을 사용하여 인체 암세포주에 대한 세포독성을 조사하였다. SA-246 균주로부터 SAPH 화합물을 얻기 위한 분리정제는 그람 양성세균인 사로시나 루치아에 대한 생육억제를 지표로 삼아 실시하였으며 이하 본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 기술하면 다음과 같다.
[실시예 1]
[방선균 SA-246 균주의 분리 배양]
본 발명에 사용한 균주 SA-246은 저영양성 미생물 분리용 배지를 사용하여 토양으로부터 분리하였다. 즉 통상의 육즙배지를 100배로 희석한 희석육즙 배지(육즙 0.03g, 펩톤 0.05g, 한전 15g/l, pH 7.0)를 사용하였으며 멸균한 증류수에 토양시료를 10-5으로 희석한 후 상기 조성의 분리용배지상에 0.5밀리리터씩 도말하여 30℃에서 10-20일간 배양하여 분리하였다. 선발된 SA-246 균주의 항생물질 생산용 배지로는 지에스배지(가용성스타치 5g, 글루코스 5g, 아스파틱엑시드 0.5g, 인산포스페이트 0.5g, 마그네슘설페이트 0.5g, 패러스설페이트 0.01g/l, pH 7.3)를 이용하였으며 이 배지에 SA-246 균주를 접종한 후 5일간 정치배양하여 전배양 하였다. 본 배양은 1리터용 삼각플라스크에 생산용배지 250밀리리터를 분주하여 전배양액 10밀리리터를 접종한 후 분당 회전속도 160으로 27℃에서 7일간 배양하였다.
[실시예 2]
[분리주 SA-246 균주의 동정]
SA-246 균주의 분류동정은 인터네셔널 스트렙토마이세스 프로젝트(ISP)의 분류기준 및 동정방법에 준하여 행하였다. SA-246 균주의 배양적 특성을 조사한 결과는 다음 표 1과 같다. 즉 이스트-말트 익스트렉트 한천배지 및 오트밀 한천배지에서는 생육이 양호하였으나 그 외의 배지에서는 생육이 매우 미약하거나 또는 전혀 생육하지 못하였다. 공시된 모든 배지에서 기균사는 형성되지 않았고 기저균사는 연갈색 또는 연노랑색을 띄었으며 이소트-말트 익스트렉트 한천배지에서는 연갈색의 수용성 색소를 생성하였다. 포자(다음표 2)는 짧은 스포로포아(sporophore)위에 단포자를 형성하였으며 세포벽 구성 아미노산 성분으로 메소형의 디아미노피멜릭엑시드를 함유하고 있었다. 또한 전분 및 탈지유를 가수분해하고 젤라틴 액화능을 지녔으며 13종의 탄소원을 대상으로 당 이용성을 조사한 결과 D-만니톨, L-만노스, 슈크로스 등은 잘 이용하였으나 그 외의 탄소원은 이용하지 못하였다. 이상의 분류학적 특성을 토대로 ISP 분류기준 및 기타 방선균 분류기준과 비교 검토한 결과 본 균주는 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속에 속하는 것으로 동정하였으며 따라서 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.) SA-246으로 명명하였고, 1996년 3월 11일자로 특허절차상 미생물 기탁의 국제적승인을 받은 국제기탁기관인 생명공학연구소(KCTC)에 기탁번호 KCTC8729P로 기탁하였다.
[실시예 3]
[SAPH 화합물의 분리정제]
SA-246 균주가 생산하는 활성물질은 실시예 1의 배양방법으로 배양한 균배양액으로부터 획득하였으며 그람 양성 세균인 사르시나 루치아에 대한 항균활성을 지표로 하여 수행한 분리정제방법은 다음과 같다. 즉 배양액을 원심분리하여 배양상징액만을 취한 후 이 상징액을 비교적 극성이 작은 유기용매인 에틸아세테이트로 3회 반복하여 추출하였다. 활성물질을 포함하는 붉은색의 추출물은 진공농축 후 소량의 클로로포름에 녹여 실리카겔이 충진되어 있는 컬럼에 로딩한 후 크로마토그라피를 수행하였다. 즉 용리제로 클로로포름과 메타놀을 90:1 비율로 혼합한 혼합용매로 분리하여 비활성 물질을 용출하고, 잔존하는 활성물질은 용리제로 클로로포름, 메타놀, 빙초산을 90:3:0.1 비율로 혼합한 혼합용매로 용출하였다. 활성분획은 농축 후 소량의 클로로포름에 녹여 클로로포름, 메타놀, 빙초산을 90:3:0.1 비율로 한 전개용매로 분취-TLC 크로마토그라피를 수행하였다. 활성분획은 클로로포름과 메타놀을 20:1 비율로 조성한 용매로 용출하고 농축한 후 소량의 아세토나이트릴에 녹여 60% 함수 아세토나이트릴을 용매로 하여 고압액체 크로마토그라피(Capcell pak C, 10×250mm)를 행하여 28분 대에서 신규화합물인 SAPH 유도체를 순수 분리하였다.
[실시예 4]
[SAPH 화합물의 항균활성]
SAPH 화합물의 항균활성 측정을 위하여 그람 양성 및 음성세균과 효모, 곰팡이 등의 검정균을 사용하였으며 정제된 활성물질을 디메틸설퍼옥사이드(DMSO)에 농도별로 희석한후 각각의 검정균용 배지와 혼합하여 한천배지 희석법으로 조사하였다. 그 결과 다음표 3과 같이 SAPH 화합물은 그람 양성세균에 대하여 15.6-250피피엠의 최소생육저해 농도를 보였으며 곰팡이와 효모류에는 조사된 농도범위내에서 항균활성을 보이지 않았다.
[실시예 5]
[SAPH 화합물의 세포독성]
순수하게 정체된 SAPH의 암세포주에 대한 세포독성 조사는 폐암세포주(A549), 난소암세포주(SK-OV-3), 피부암세포주(SK-MEL-2), 신경암세포주(XF498), 대장암세포주(HCT15)를 대상으로 실시하였으며 시료를 디메틸설퍼옥사이드(DMSO)에 농도별로 희석한 다음 암세포주에 처리한 후 생존세포의 단백질을 정량하여 이를 세포독성의 지표로 삼는 설포라다민-B 방법에 의하여 측정하였다. 그 결과 폐암세포주, 난소암세포주, 피부암세포주, 신경암세포주, 대장암세포주에 대한 ED50값이 0.47-0.56PPM으로 강한 세포독성을 나타내었다(표 4).
[실시예 6]
[SAPH 화합물의 물리화학적 특성]
실시예 4에서 얻어진 SAPH 화합물의 이화학적 특성은 다음과 같다.
1) 물질의 성상:붉은색의 무정형
2) 분자량:614
3) 분자식:CHO)
4) 질량분석치(M+H):615(m/z)
5) 융점:260℃ 이상에서 붕괴
6) 용해성
가용성:디메틸설퍼옥사이드, 클로로포름, 아세토니트릴, 에틸아세테이트
불용성:헥산, 메탄올, 물
7) 자외선흡수스펙트럼(UV max :228, 260, 528nm
8) 핵자기공명(NMR) 스펙트럼
중수소화된 클로로포름(CDCL)을 용매로 하고 테트라메틸실란(TMS)을 내부 표준 물질로 하여 측정한 수소핵자기공명( H-NMR) 스펙트럼, 탄소핵자기공명( C-NMR) 스펙트럼은 각각 제1 및 제2도와 같다.
9) 화학구조
본 발명은 상기의 특정 실시예들에 의해 상세히 설명되었지만, 특히 청구범위에 정의된 본 발명의 정의 및 범위를 벗어나지 않은 많은 변형 및 치환이 가능하다는 것은 당 분야의 숙련자들에게 자명하며, 그러한 변형 및 치환 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (5)

  1. 다음의 구조식(Ⅰ)으로 표시되는 퀴논계열의 SAPH 유도체, 이들의 광학이성체 및 약학적으로 허용가능한 이들의 산, 염기부가염.
    상기식에서, R은 저급알킬기이다.
  2. 제1항에 있어서, R이 메틸임을 특징으로 하는 SAPH 화합물.
  3. 항균 및 항암활성을 갖는 토양으로부터 분리된 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속 SA-246(KCTC 8729P).
  4. 방선균주 분리주 마이크로모노스포라(Micromonospora sp.)속 SA-246(KCTC 8729P)으로부터 상기 제1항의 구조식(Ⅰ)로 표시되는 SAPH 유도체를 분리함을 특징으로 하는 SAPH 유도체의 제조방법.
  5. SAPH 화합물 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체로 구성되는 항균 및 항암활성을 갖는 의약조성물.
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