FI103053B - Geeni ja geenituote -laktaamiyhdisteiden tuottamista varten - Google Patents

Description

! 103053

GEENI JA GEENITUOTE β-LAKTAAMIYHDISTEIDEN TUOTTAMISTA VARTEN

Keksintö koskee erään avainentsyymin geeniä ja geenituotetta, joka entsyymi on rakenteensa ja moni-5 funktionaalisuutensa suhteen uusi ja katalysoi penisilliini G:n ja penisilliini V:n biosynteesin viimeistä vaihetta, puhdistetussa ja eristetyssä muodossa.

Jo vuonna 1953 Kato havaitsi (J. Antibiot. Ser. Tokyo 6, 130 - 136, 1953) edeltäjättömissä peni- 10 silliinikäymisissä penisilliiniytimen kertymistä. Tämän β-laktaamin eristivät myöhemmin Batchelor et ai. (Nature 183, 257 - 258, 1959) ja se identifioitiin 6-amino-penisillaanihapoksi (6-APA). 6-APA:a kertyy erityisesti edeltäjättömissä penisilliinikäymisissä. Erickson ja 15 Bennet (Appi. Microbiol. 13, 738 - 742, 1965) pitivät 6-APA:a sekundaarisena metaboliittina, jota saadaan isopenisilliini N:n entsymaattisen 7-deasyloinnin avulla edeltäjänä toimivan fenyyli- tai fenoksietikkahapon puuttuessa tai jota vastaavasti muodostuu lohkaistaessa 20 entsymaattisesti luonnollisia hydrofobisia penisilliinejä. Myöhemmin todettiin, että penisilliinin biosynteesin viimeinen vaihe käsitti isopenisilliini N:n L-a-amidoadipiinihapposivuketjun vaihtamisen fenyyli- tai fenoksietikkahappoon, jolloin sivuketjuhapot osallistu-25 van reaktioon asyylikoentsyymi A -yhdisteinä. Tätä asyylin siirtoa katalysoivan entsyymin identifioi Loder (Postepy Hig. Med. Dosw. 26, 493 - 500, 1972) P.

chrysogenumin raakauutteista ja sille annettiin nimitys penisilliinin asyylitransferaasi (PAT). Tätä entsyymiä 30 esiintyy kaikissa penisilliiniä muodostavissa sienissä ja se sijaitsee solun sisällä. Fawcettin et ai. työt (Biochem. J. 151, 741 - 746, 1975) vahvistavat todeksi isopenisilliini N:n transasyloitumisen penisilliini G:ksi P. chrysogenumin raakojen entsyymiuutteiden avul-35 la fenyyliasetyylikoentsyymi A:n läsnäollessa.

2 103053 PAT:n tärkeyden penisilliini G:n tai V:n biosynteesille vahvistavat havainnot, joita ovat tehneet Brunner et ai. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349,. 95 - 103, 1968), Spencer (Biochem. Biophys. Res. Conunun. 31, 170 -5 175, 1968), Gatenback ja Brunsberg (Acta Chem. Scand. 22, 1059, 1061, 1968), Spencer ja Maung (Biochem. J. 118, 29 -30, 1970), Meesschaert et ai. (J. Antibiotics 33, 722 -730, 1980), Kogekar et ai. (Indian J. of Biochem. and Biophys. 20, 208 - 212, 1983), Frederiksen et ai. (Biotechn. 10 Letters 6, 549 - 554, 1984), Abraham (julkaisussa Regu lation of Secondary Metabolite Formation, Kleinkauf et ai., toim., Proceedins of the 16th Workshop Conferences Hoechst, Gracht Castle, 12. - 16.5.1985, Voi. 16, Wein-heim, s. 115 - 132, 1986), Luengo et ai. (J. Antibiotics 15 39, 1565 - 1573 ja 1754 - 1759, 1986) sekä Alvarez et ai.

(Antimicrob. Agents and Chemotherapy 31, 1675 - 1682, 1987). Tiolista riippuvainen entsyymi kykenee myös katalysoimaan eri penisilliinien välistä asyylinvaihtoa ja sitä tavataan suuremmassa määrin penisilliinikannoilla, joiden 20 synteesikapasiteetti on suuri, kuin vähän tuottavilla kannoilla (Prues ja Johnson, J. Bact. 94, 1502 - 1508, 1967).

Tämä keksintö koskee tämän tärkeän biosynteesient-syymin geenin ja geenintuotteen eristämistä, karakterisointia ja sekvenssin selvitystä, mikä antaa olennaisia 25 edellytyksiä geeniteknologista työskentelyä varten, koskien sekä tiitterin suurentamista että hybridi- tai mutaa-tiosynteesiä tai uusien entsymaattisten β-laktaamin trans-formointitapojen paljastamista.

Proteiinin sekvenssointi on tunnettua Laursenin 30 mukaan, Methods Enzymology 25, 344 - 359 (1972). Samoin on nykyään alalla tunnettua paikallistaa proteiineja koodaa-vat geenit (Rothstein et ai., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Voi. XLV, 99 - 105, 1981) ja sek-venssoida ne (Maxam ja Gilbert, Methods Enzymology 65, 35 499 - 560, 1980). Saavutettu geenin kytkeminen vahvaan, 3 103053 mahdollisesti indusoituvaan promoottoriin on tunnettua Pribnowin mukaan. Biolog. Regulation and Development, Voi. 1, 231 - 277, Plenum Press nro 4 (Goldberger et ai., 1979).

5 Useita β-laktaamin biosynteesin entsyymejä on jo eristetty puhtaassa muodossa ja karakterisoitu rakenteen suhteen. Samoin on useiden näistä entsyymeistä koodaavat geenialueet sillä välin eristetty, sekvenssoitu, liitetty vastaaviin ilmentämisvektoreihin, jotka ovat sopivia 10 transformaatiota varten ja kloonattu (esim. lajilta Cephalosporium acremonium peräisin oleva isopenisilliini N -syntetaasi: Samson et ai., Nature 318, 191 - 194, 1985; Baldwin et ai., J. Antibiotics 40(5), 652 - 659, 1987; EP 200 425, Eli Lilly, 1985; lajilta Penicillium chrysogenum 15 peräisin oleva isopenisilliini N -syntetaasi: Carr et ai., Gene 48, 257 - 266, 1986; EP 225 128, Eli Lilly, 1985; lajilta Cephalosporium acremonium peräisin oleva ekspan-daasi: Samson et ai., Biotechn. 5, 1207 - 1214, 1987; sekä useita lajilta Streptomyces clavuligerus peräisin olevia 20 entsyymejä, jotka katalysoivat 0-laktaamin biosynteesiä: EP 233 715, Beecham, 1986). Ensimmäinen β-laktaamia tuottavan mikro-organismin transformaatio, joka on suoritettu sellaisilla ilmentämisvektoreilla, on samoin jo kuvattu (Skatrud et ai., Curr. Genet 12(5), 337 - 348, 1987).

25 PAT, joka katalysoi penisilliinin biosynteesin vii- • · < meistä vaihetta, nimittäin isopenisilliini N:n transasy-lointia eli sen lohkaisemista 6-APA:ksi ja sen asylointia penisilliiniksi, sen reaktiokaavan mukaisesti, joka on nähtävissä kuviossa 9, on jo aikaisemmin identifioitu (ks. 30 yllä) penisilliiniä tuottavilta sienikannoilta ja sen ka-. talyyttinen monifunktionaalisuus on kuvattu, mutta sen äärimmäisen pysymättömyyden vuoksi sitä ei ole tähän mennessä voitu eristää huomattavan puhtaana ja karakterisoida rakenteen suhteen. Tiolista riippuvainen PAT, joka on 35 erittäin pysymätön ja lievästi hapan ja jota muodostuu 4 103053 kasvavassa määrin lajin Penicillium chrysogenum penisilliiniä muodostavilla kannoilla 40 - 100 tunnin fer-mentaation aikana, katalysoi toisaalta koentsyymi A:n aktivoimien fermentatiivisten sivuketjujen (esim. hyd-5 rofobisten edeltäjäaineiden fenoksietikkahappo, fenyy-lietikkahappo, heksaanihappo, oktaanihappo jne. asyyli-koentsyymi A -yhdisteet), asyylin siirtoa luonnollisille penisilliineille (esim. isopenisilliini N, penisilliini V, penisilliini G, 6-APA jne.) ja toisaalta se kataly-10 soi luonnollisten penisilliinien kesken tapahtuvaa asyylin siirtoa, ts. sen asyylin siirron aikana, joka tapahtuu asyylientsyymikompleksin avulla, luonnolliset penisilliinit toimivat sekä asyylin luovuttajana että asyylin vastaanottajana, kun taas koentsyymi A:n akti-15 voimat hydrofobiset edeltäjäyhdisteet voivat osallistua entsymaattiseen reaktioon ainoastaan asyylin luovuttajana. Koska asyylin siirto tapahtuu vesiväliaineessa, vesi nukleofiilisena kilpailee myös asyylientsyymikompleksin kanssa, jolloin asyylin luovuttajat, jotka ovat 20 runsasenergisia, voivat yksinkertaisesti lohjeta hydro- lyyttisesti. Niinpä 6-APA:a, luonnollisten penisilliinien β-laktaamiydintä, esiintyy aina penisilliinifer-mentaatioiden kasvuliemessä.

PAT:n osoittaminen voi tapahtua käyttäen ta-25 vanomaisia analyysimenetelmiä, kuten esimerkiksi radio- aktiivisia, mikrobiologisia tai kromatografisia analyysimenetelmiä. Seuraavat kolme erilaista määritysmenetelmää valmistettiin esim. PAT:n, joka katalysoi entsymaattista reaktiota 30 6-APA + fenoksiasetyylikoentsyymi A -» penisilliini

V + koentsyymi A

6-APA-fenoksiasetyylikoentsyymi A -asyylitransferaasi-aktiivisuuden määrittämiseksi: a) Penisilliini V:n osoittaminen mikrobiologisen 35 agardiffuusiokokeen avulla käyttäen spesifisesti tuotteel le herkkiä koekantoja, esim. Micrococcus luteus ATCC 9341:n herkkyys penisilliinille bakteerivastaisena ainee- 5 103053 na on yli tuhatkertainen verrattuna sen herkkyyteen 6-APA:lie.

b) Käytettäessä 35S-penisilliini V:n 35S:llä merkittyä 6-APA:a (entsymaattisesti 35S-penisilliini G:stä) uu- 5 tettavan 35S-penisilliini V:n osoittaminen β-laskurissa.

c) Uutetun penisilliini V:n osoittaminen käyttäen HPLC:a.

Entsymaattinen transasylointireaktio suoritetaan mikrotiitterilevyillä käyttäen seuraavaa seosta: 10 6-APA (2,5 mg/ml reaktiopuskuriliuoksessa) 20 μΐ

PaCoA (noin 15-20 mg/ml kahteen kertaan tislatussa vedessä) 30 μΐ entsyymiä tai vastaavasti reaktiopuskuri-liuosta (0,1 M fosfaattipuskuri pH 7,8, joka 15 sisältää 1 mM DDT:a) 150 μΐ Välittömästi tai vastaavasti eri aikoina yhden tunnin pituisen stationaarisen inkuboinnin kuluessa otetaan kulloinkin 20 μΐ näytettä, se laimennetaan sitten samalla mikrotiitterilevyllä 1:5 50-%:isella etanolin vesiliuok-20 sella (« entsyymireaktion pysäyttäminen) tai vastaavasti 1:5 liuoksella, jossa on 5 U/ml penisillinaasia (= 8-lak-taamikontrolli) ja analysoidaan penisilliini V:n suhteen agardiffuusiotestissä koelevyillä, joihin on istutettu Micrococcus luteus ATCC 9341:tä tai vastaavasti laktaamil-\\ 25 le yliherkkää kantaa Pseudomonas aeruginosa BC 248 (istu tusmäärä 0,5 %, DIFC0:n antibioottiväliaine 1, 50 μΐ syvennystä kohden, inkubointi 15 tuntia 37 eC:ssa).

Otetaan eri aikoina näytteitä entsymaattinen trans-asylointi -valmisteesta (sama seos kuin yllä, kokonaisti-30 lavuus 2 ml), sitten uutetaan 1:1 di-isopropyylieetterillä ’ pH:ssa 2,0 (HCl), orgaaninen faasi haihdutetaan pois typen avulla, jäännös uudelleensuspendoidaan samaan tilavuuteen reaktiopuskuriliuosta ja siitä tutkitaan penisilliini V HPLC:n avulla (olosuhteet kuten PaCoA-pitoisuuden määri-35 tyksessä, mutta käyttäen eluenttia, jossa on 40 % metano- 6 103053 lia ja 60 % 0,01 M M TBAS:a 0,025 M fosfaattipuskuriliuok-sessa pH 7,0).

Retentioaikoja (min) fenoksietikkahappo 1,10 5 penisilliinihappo G (penicilloic acid G) 1,62 penisilliinihappo .V (penicilloic acid V) 1,92 penisilliini G 3,00 penisilliini V 4,92 3-desasetoksikefalosporiini V 2,46 10 kefalosporiini V 3,24

Monispesifisen PAT-entsyymin muut aktiivisuudet voidaan samoin määrittää HPLC:n avulla, jolloin käytetään pelkästään liuosta, jossa on 0,001 M TBAS:a 0,025 M fos-faattipuskuriliuoksessa pH 7,0, eluenttina polaarisia sub- 1.5 straatteja tai vastaavasti tuotteita varten. Retentioaikoja (min) isopenisilliini N 1,67 6-APA 4,00 DTT pelkistettynä 2,41 20 DTT haptettuna 4,60

Isopenisilliini N voidaan saada talteen edeltäjät-tömistä penisilliinifermentaatioista käyttäen adsorboivaa hartsia (DIAION HP 20) ja käänteisfaasikromatografiaa '(Nucleosil C 18, 10 pm).

:. 25 Entsyymivalmisteesta riippuen täytyy kiinnittää erityisesti huomiota sen indikaattorireaktion valintaan, jonka avulla monispesifisen biosynteesientsyymin varsinainen aktiivisuus on tarkoitus osoittaa. Ei esimerkiksi ole erityisen tarkoituksenmukaista käyttää 6-APA-fenoksiase-30 tyylikoentsyymi A -asyylitransferaasiaktiivisuutta PAT:n indikaattorireaktiona raa'assa uutteessa, koska tässä raa-assa entsyymivalmisteessä läsnä olevat häiritsevät aktii-' visuudet sekä nopeasti hydrolysoivat fenoksiasetyylikoent- syymi A:ta (= PaCoA) ja penisilliini V:tä, että myös asy-35 loivat 6-APA:a runsasenergisen sivuketjujohdannaisen 7 103053

PaCoA avulla penisilliini V:ksi, mitä esim. sellaiset tunnetut proteolyyttiset entsyymit kuin kymotrypsiini katalysoivat. Nämä häiritsevät aktiivisuudet erotetaan kuitenkin selvästi varsinaisesta, tiolista riippuvaisesta PATista.

5 Niillä on esim. erilainen eluoitumiskäyttäytyminen kroma-tografiassa, stabiiliusprofiili ja inhiboitumistavat. Nämä häiritsevät aktiivisuudet selittävät toisaalta aikaisemmin raaoista valmisteista löydetyn hyvin alhaisen spesifisen PAT-aktiivisuuden (noin 1-10 pU/mg proteiinia) sekä sa-10 moin sen paradoksilta vaikuttavan havainnon, että raa'an uutteen 6-APA-PaCoA-asyylitransferaasiaktiivisuus kohoaa suuresti kun entsyymin laimennus suurenee, maksimiaktiivi-suuteen saakka. PAT:n osoittamisessa on olennaisen tärkeä seikka pelkistävien yhdisteiden, kuten esimerkiksi ditio-15 treitolin tai β-merkaptoetanolin, läsnäolo, jotka yhdisteet aktivoivat tai vastaavasti stabiloivat erittäin herkästi hapettuvaa SH-entsyymiä.

PAT: n erittäin huono lämmönkestävyys vaikeuttaa samoin entsyymin puhdistamista huomattavasti. Esimerkiksi 20 juuri valmistettu entsyymivalmiste menettää koko tiolista riippuvaisen 6-APA-PaCoA-asyylitransferaasiaktiivisuuden yhden tunnin stationaarisen inkuboinnin 37 eC:ssa jälkeen, huolimatta erilaisten stabiloimisaineiden läsnäolosta (esim. 5 mM ditiotreitoli + 5 % sorbitoli + 0,1 mM fenyy-25 limetaanisulfonyylif luoridi). Sen vuoksi on sopivaa suorittaa kaikki puhdistamistyö jäähdytyslaboratoriossa 4 eC:ssa suojaten hapettumiselta. Raa'at esipuhdistetut entsyymiliuokset voidaan jäädyttää (-196 °C, -20 eC) useiden viikkojen ajaksi stabiloimisaineiden läsnä ollessa 30 ilman mitään merkittävää aktiivisuuden häviötä, jolloin kuitenkin useat jäädytyksenvaihtovaiheet välittömästi in-aktivoivat PAT-aktiivisuuden. Ammoniumsulfaattisaostumat ovat samoin enemmän tai vähemmän stabiileja muutaman päivän tai viikon ajan 4 °C:ssa mainitun stabiloimisaineseok-35 sen läsnä ollessa.

m • * β 103053

Nuoresta, penisilliinipositiivisesta penisilliini-huovastosta saadaan keksinnössä käytetyn PAT:n puhdistus-menetelmän avulla, huovaston hajottamisen, nukleiinihappojen saostamisen, proteiinin saostamisen, hydrofobiseen 5 vuorovaikutukseen perustuvan ja affiniteettikromatografian jälkeen, suhteellisen stabiileja, vähintään 50 % aktiivisia entsyymivalmisteita, jollaisia tarvitaan entsyymiki-neettistä tai proteiinikemiallista karakterisointia varten. Suhteellisen säilytyskelpoinen proteiinisaostuma voi-10 daan aikaansaada käyttäen tavanomaisia puhdistusmenetelmiä, esim. hajottamalla solut käyttäen korkeapainehomoge-noijaa tai lasikuulamyllyä tai suorittamalla nukleiinihappojen saostaminen käyttäen setyylitrimetyyliammoniumbromi-dia, streptomysiinisulfaattia tai protamiinisulfaattia. 15 Proteiinien saostukseen sopii mm. ammoniumsulfaatti, jolloin 50 % kyllästäminen riittää seostamaan kaiken todettavissa olevan PAT-aktiivisuuden. Lähtien ammoniumsulfaatti-saostumasta sidotaan tiolista riippuvainen PAT fenyylise-faroosi CI 4 B:hen hydrofobisen vuorovaikutuksen avulla ja 20 sen jälkeen kun on poistettu yli 90 % painolastina olevasta proteiinista, tuote eluoidaan käyttäen stabiloimisai-neiden vesiliuosta, jonka ioninvahvuus on alhainen, konsentroidaan käyttäen ultrasuodatuskalvoa, jonka rajamole-> kyylipaino on 10 kD ja puhdistetaan lisäksi mieluimmin 25 af f inieettikromatografian avulla tai vuorotellen geelisuo- datusvaiheen avulla (Ultrogel ACA 54), anioninvaihtokroma-tografian avulla (DEAE-sefaroosi FF) tai adsorptiokromato-grafian avulla (hydroksyyliapatiitti), jotta saataisiin vähintään 50 % aktiivinen entsyymivalmiste, mikä vastaa 30 väkevöitymiskerrointa noin 1 000 ammoniumsulfaattisaostu-man perusteella.

Affiniteettimatriisina voidaan käyttää tavallisia makrohuokoisia kantaja-aineita, kuten esimerkiksi sefaroo-sia, selluloosaa, polymeerimateriaaleja, stabiloitua sili-35 kageeliä, alumiinioksidia jne. Sopivia affiniteettiligan- 9 103053 deja, jotka sidotaan kantaja-aineeseen C2_l0-välikkeen avulla tai ilman välikettä kovalenttisesti tai hydrofobisen tai ionogeenisen vuorovaikutuksen avulla, ovat ensisijaisesti asyyli- tai amino-S-laktaamiyhdisteet. Näiden ligan-5 dien sitominen välikkeeseen tai matriisiin täytyy suorittaa siten, että ligandissa oleva sitoutumiskohta jää puhdistettavan entsyymin lähestyttävissä olevaksi. Tämän keksinnön mukaisesti osoittavat erityisen voimakasta puhdistavaa vaikutusta etenkin affiniteettimatriisit, joissa on 10 terminaalinen amino -välikkeitä, kuten esimerkiksi AH-se-faroosi 4 B tai HMD-Ultrogel ACA 34, joihin on sidottu N-etoksikarbonyyli-2-etoksi-l,2-dihydrokinoliinin (EEDQ) avulla sellaisia ligandeja kuin esimerkiksi luonnollisia penisilliinejä, mieluimmin 6-APA:a, penisilliini V:tä tai 15 penisilliini G:tä tai analogisia stabiileja 3-desasetoksi-kefalosporiiniyhdisteitä, kuten esimerkiksi 7-amino-3-des-asetoksikefalosporaanihappoa (7-ADCA) tai 7-fenoksiaseta-mido- tai 7-fenyyliasetamido-3-desasetoksikefalosporaani-happoa (3-desasetoksikefalosporiini V tai G). Amino-B-lak-20 taamiaffiniteettimatriisit voidaan siten valmistaa vastaavista fenyyliasetamido-B-laktaamimatriiseista ilman kallista suojaryhmäteknologiaa käyttäen E. colin liukenevaa -penisilliini G -asylaasia.

Entsyymin tuottamiseen tarvittavia mikro-organisme-·'· 25 ja viljellään tavallisissa penisilliinin muodostukseen käytetyissä elatusaineissa. Sopivia elatusaineiden aineosia ovat kaikki substraatit, joita yleisesti käytetään sienten viljelyssä. Näiden ravinteiden lisäksi voidaan käyttää lisäaineita, jotka edistävät mikro-organismien 30 kasvua ja lisäävät PAT-aktiivisuutta, sopivana yhdistelmänä. Lisäaineita ovat esimerkiksi magnesiumsulfaatti,nat-riumkloridi, kalsiumkarbonaatti, fosfaatit ja samankaltaiset epäorgaaniset suolat sekä kasvuaineet, vitamiinit ja hivenalkuaineet. Lisäämällä erilaisia induktoreita, mie-35 luimmin fenoksi- tai fenyylietikkahappoa ja niiden johdan- * l0 103053 naisia tai analogeja, voidaan huomattavasti suurentaa saavutettavaa entsyymitiitteriä.

Viljely tapahtuu pääasiallisesti veden.alla aerobisissa olosuhteissa lämpötilassa, joka on väliltä 15 - 5 35 °C ja pH:ssa, joka on väliltä 4-8. Aika, joka tarvi taan kasvuliemen maksimaalisen entsyymiaktiivisuuden saavuttamiseen, riippuu käytetystä mikro-organismityypistä ja optimaalinen viljelyaika arvioidaan sen vuoksi mieluimmin erikseen kullekin yksittäiselle kannalle. Yleensä viljelyn 10 kesto vaihtelee mieluimmin käytetystä kahdestä päivästä viiteen päivään. Transasylointiin voidaan käyttää kasvu-lientä tai siitä valmistettua aktiivista sekundaarista valmistetta. Esimerkkejä sellaisista aktiivisista sekundaarisista valmisteita ovat muuntamattomat tai läpäisevik-15 si tehdyt solut, jotka on otettu talteen kasvuliemestä ja pesty; soluttomat uutteet, jotka on saatu huovaston fysikaalisen, kemiallisen tai entsymaattisen käsittelyn avulla (esimerkiksi soluhomogenaatit, jotka on saatu hajottamalla huovasto tai suorittamalla sille ultraäänikäsittely ja 20 solulysaatit, jotka on muodostettu käsittelemällä pinta-aktiivisilla aineilla tai entsyymeillä); haluttua entsyymiä sisältävät osittain tai kokonaan puhdistetut valmisteet, jotka on saatu puhdistamalla soluttomat uutteet käyttäen avuksi tavanomaisia entsyymien puhdistusmenetelmin 25 miä, esimerkiksi käyttämällä liuoksesta irti suolausta, fraktioivaa saostamista, dialyysiä, geelisuodatusta, ioninvaihto-, adsorptio- ja affiniteettikromatografiaa; stabiloidut PAT-valmisteet, jotka on saatu siten, että entsyymi tai muuntamattomat tai läpäiseviksi tehdyt solut on 30 immobilisoitu joko fysikaalisesti tai kemiallisesti suuren molekyylipainon omaaviin kantaja-aineisiin, jotka ovat veteen liukenemattomia, käyttäen adsorptiota, kovalenttis-ten sidosten muodostusta, ristikytkentää, sisäänsulkemista tai kapselointia.

« • · u 103053

Yllä tulokseksi saatujen entsyymikonsentraattien entsymaattinen tai fysikaaliskemiallinen karakterisointi voi tapahtua käyttäen sellaisia klassisia menetelmiä kuin kromatografia, elektroforeesi, substraattispesifisyyttä 5 koskeva tutkimus, N-terminaalinen sekvenssointi, aktiivisuuden ja stabiiliuden pH- ja lämpötilaprofiilin määrittäminen, aktivoitumista, inhiboitumista ja stabilisoitumista koskevat tutkimukset jne.

On olemassa muutamia menetelmiä geenien eristämi-10 seksi. Yleinen katsaus on esitetty Watsonin et ai. (Re-kombinierte DNA - Eine Einfiihrung, Heidelberg, 1983) ja Winnackerin (Gene und Klone - Eine Einfiihrung in die Gen-technologie, Weinheim, 1984) kirjoissa. Pat-geenin (PAT-entsyymin geeni) tapauksessa vaikuttaa erittäin mielek-15 käältä käyttää synteettisiä DNA-koettimia, koska tarpeelliset aminohapposekvenssit ovat olemassa. Geneettiseen koodiin perustuva DNA-sekvenssi voidaan johtaa PAT:n poly-peptidi l:n aminohapposekvenssistä ja vastaavat oligonuk-leotidit voidaan syntetisoida kemiallisesti. Kuviossa 5 on 20 esitetty PAT:n polypeptidi l:n aminohappojäännösten 2-22 järjestys. Koska muutamilla aminohapoilla on 2, 3, 4 tai 6 kodonia, saadaan tulokseksi aminohapposekvenssin alla annetun kaltainen nukleotidisekvenssi. Osa, joka vastaa aminohappo jäännöksiä 16 - 21, olisi esimerkiksi erityisen .* 25 sopiva, koska tässä tapauksessa on ainoastaan 16 erilaista geenisekvenssiä mahdollisia. Nämä 16 oligonukleotidia, jotka ovat RNA:lle komplementaarisia, voidaan syntetisoida neljänä seoksena, joissa kussakin on neljää oligonukleotidia (oligonukleotidiseokset 1, 2, 3 ja 4 kuviossa 5). Gee-30 nin varmempi identifiointi ei näiden oligonukleotidien avulla luultavasti ole mahdollista, koska Penicillium chrysogeniumin genomissa esiintyy muita DNA-sekvenssejä, jotka ovat hyvin samankaltaisia kuin nämä DNA-sekvenssit. Näiden erilaisten DNA-sekvenssien erottaminen toisistaan 12 103053 voi olla hyvin hankalaa. On sen vuoksi suositeltavaa, että merkkisekvenssinä on käytettävissä lisäoligonukleotidi.

Strategiaa geenien eristämiseksi DNA-koettimia käyttäen on tarkastellut Lathe (J. Mol. Biol. 183, 1-12, 5 1985). Esimerkiksi, jos omataan tietoja tiettyjen kodonien tai tiettyjen dinukleotidijaksojen esiintymistiheydestä, voidaan syntetisoida pitempi DNA-sekvenssi. Penicillium chrysogenumia varten ei sellaisia tietoja ole käytettävissä. Tästä huolimatta voidaan pitemmän oligonukleotidin 10 saamiseksi koettimena käytettäväksi käyttää saatavilla olevia oligonukleotideja sekvenssointialukkeena: käänteis-kopioijaentsyymi voi syntetisoida määrätylle RNA: lie komplementaarisen DNA-säikeen, mutta ainoastaan, jos läsnä on sopiva alukemolekyyli (= primer). Kuvatussa tapauksessa 15 voidaan oligonukleotidiseoksia 1-4 käyttää alukkeena. On siten mahdollista sekvenssoida ainoastaan pat-mRNA, vaikka valmisteessa on läsnä lukuisia muita mRNArita. Tämä sek-venssointireaktio suoritetaan emässpesifisten ketjunkat-kaisureagenssien (dideoksinukleosiditrifosfaatteja) läsnä 20 ollessa. Tuotetaan siten useita pidennettyjä oligonukleotideja, joiden geelielektroforeesianalyysin avulla on mahdollista määrittää pat-mRNA:lie komplementaarisen DNA:n emässarja. Tämän menetelmän etuna on, että saatu sekvenssi-informaatio mahdollistaa uusien oligonukleotidien suo-.« 25 ran synteesin. Lisäksi on hyvin tärkeää, että tämän sek venssin täytyy olla yhdenmukainen sen sekvenssin kanssa, joka on johdettu aminohapposekvenssistä ja se varmistaa siten, että pat-spesifinen sekvenssi todella on olemassa.

Geenin varsinainen eristäminen voidaan sitten suo-30 rittaa geenipankista. Geenipankki on kokoelma rekombinant-ti-DNA-vektoreita, jotka kukin sisältävät pienen osan Penicillium chrysogenumin DNA:sta (X-EMBL3-geenipankin tapauksessa tämä on noin 0,05 % rekombinanttimolekyyliä kohden). Plakkihybridisaation avulla voidaan eristää ,ν-kloo-35 ne ja ja nämä hybridisoituvat radioaktiivisuudella merkityn • 13 103053 DNA-koettimen kanssa. Näiden kloonien DNA:n avulla voidaan valmistaa fysikaalinen kartta. Sellainen restriktiokartta osoittaa restriktioendonukleaasien leikkauskohtien järjestyksen, mistä voi olla apua aseman määrityksessä. DNA-hyb-5 ridisaatiotekniikoita käyttäen on mahdollista määrittää, minkä DNA:n osa-alueen kanssa DNA-koettimet hybridisoituvat. Vastaavat osafragmentit liitetään plasmidi- tai bak-teriofaagivektorimolekyyleihin ja karakterisoidaan lisäksi molekyyligeneettisten menetelmien avulla. DNA-kappaleen 10 kloonaaminen vektoriin M13mpl9 mahdollistaa sitten DNA-sekvenssin määrittämisen, jolloin pat-spesifistä DNA-koe-tinta voidaan käyttää alukkeena. DNA:n lisäsekvenssoinnin avulla voidaan varmistaa geenin koodaava osa ja siitä johdettu PAT:n aminohapposekvenssi. Jo määritetyistä amino-15 happo-osasekvensseistä voidaan saada tarvittavat tiedot.

DNA-sekvenssi-informaation perusteella voidaan Pe-nicillium chrysogenumin pat-geeni liittää ilmentämisvekto-riin, joka sallii PAT:n hyvän ilmentymisen tunnettuihin ilmentämisorganisrneihin (Reznikoff ja Gold, Maximizing 20 Gene Expression, Boston, 1986). Jotta tehtäisiin mahdolliseksi juuri sellainen kokoonpano, jossa ATG tulee tarkalleen E. coli -aloituskodonin asemaan, voidaan lisätä Ncol:n leikkauskohta kohdennetun mutageneesin avulla. Tätä ennen täytyy kuitenkin eristää täydellinen cDNA-klooni .: 25 vastaavasta geenipankista. Esimerkissä 19 (ks. myös kuvio 7) kuvataan plasmidin pBC2001 kokoonpanemisen yksityiskohdat. Tämän aikaansaamiseksi suoritetaan kaikkein ensimmäiseksi pat-cDNA-kloonista saadun DNA-fragmentin kloonaaminen ml3mpl9:ään. Siten on käytettävissä yksisäikeinen DNA, 30 jota käytetään kohdennettuun mutageneesiin Ncol:n leikkauskohdan lisäämiseksi; lisäksi HindIII:n leikkauskohdan, joka tarvitaan kloonaamista varten. Plasmidi pBC200l muodostuu, kun Ncol - Hindlll-fragmentti liitetään vektoriin pKK233-2. Se sisältää tehokkaita signaaleja E. colissa 35 ilmentämistä varten (ptrc, rrnBTlT2) ja ampisilliiniresis- 9 14 103053 tenssigeenin (bla) E. colin selektio-indeksinä. Pat-gee-nin DNA voidaan liittää vektoreihin, joiden avulla voidaan transformoida Penicillium chrysogenum tai muita β-laktaamia tuottavia mikro-organismeja. Koska transforman-5 tit usein sisältävät siirretyn DNA:n useina kopioina (esim. Kolar et ai.}, on geenin voimakkaampi ilmentyminen mahdollista, mikä voi johtaa lisääntyneeseen penisilliinin muodostukseen. Esimerkissä 20 kuvataan plasmidin pBC2002 kokoonpaneminen, jota plasmidia voidaan käyttää 10 Penicillium chrysogenumin transformointiin. pBC2002 (ks. myös kuvio 8) sisältää Penicillium chrysogenumin täydellisen pat-geenin 4,8 kiloemäksen Sall-restriktiofragmen-tissa, joka on liitetty muunnettuun vektoriin pHS103. Fleomysiiniresistenssigeeni (ble) mahdollistaa Penicilli-15 um chrysogenumissa selektion; ampisilliiniresistenssigee-ni (bla) mahdollistaa E. colissa selektion.

Lisäksi on DNA:n manipulointi mahdollista. Promoot-torikappaleiden vaihto voi samoin parantaa kopioitumista Penicillium chrysogenumissa. ATG:iden kohdennettu mutage-20 neesi voi lisätä translaatiota Penicillium chrysogenumissa. Erityisten aminohappojäännösten vaihtaminen kohdennetun tai fragmenttispesifisen - kohdentamattoman, mutta geenispesifisen - mutageneesin avulla tekee mahdolliseksi eristää erityisiä mutantteja, jotka muuttavat entsyymin 25 stabiiliuden tai sen aktiivisuuden tai spesifisyyden.

Sattumanvaraisesti tai ei sattumanvaraisesti valittujen mikro-organismien seulonta, jossa tutkitaan sellaisten organismien DNA:n spesifistä hybridisoitumista radioaktiivisen pat-DNA:n kanssa - on myös eristetyn DNA-kappa-30 leen ilmeinen käyttömahdollisuus. Sellaisen seulonnan tuloksena voi olla kantoja, jotka aikaisemmin tuottivat tuntemattomia β-laktaameja tai kantoja, jotka sisältävät PAT:a muistuttavia entsyymejä, mutta joilla on muita ominaisuuksia.

is 103053 Tämän keksinnön DNA eristettiin Penicillium chryso-genumilta. Menetelmä on kuvattu esimerkeissä 10 - 13 ja sitä valaisevat kuviot 4, 5 ja 6. Lähtien PAT:n polypepti-di l:n aminohapposekvenssistä (kuvio 5), syntetisoitiin 5 neljä oligonukleotidia (kuvio 5: oligonukleotidiseokset 1-4, kuvio 6C), joita käytetään sekvenssointialukkeena (esimerkiksi 11). Siten määritetyn sekvenssin ensimmäiset 29 emästä (kuvio 6D) ovat yhdenmukaisia oletetun pat-mRNA-sekvenssin kanssa (kuvio 6B). Tämän informaation tuloksena 10 syntetisoitiin 30-meeri (kuvio 6E), jota käytettiin radioaktiivisena koettimena λ-kloonin eristämiseksi Penicillium chrysogenum -geenipankista (esimerkit 12 ja 13). M13-vek-toreihin subkloonaamisen jälkeen DNA sekvenssoitiin (kuvio 6F). Tämän sekvenssin ensimmäiset 77 emästä ovat yhdenmu-15 kaisia mRNA:lle komplementaarisen sekvenssin emästen 35 -111 kanssa (kuvio 6D). Näiden yksittäisten sekvenssien väliset yhteydet osoittavat, että on todellakin eristetty pat-geeni.

PAT:n molekyylipaino on noin 38 000 D. Keskimääräi-20 nen aminohapon molekyylipainon 110 D perusteella voidaan arvioida geenin koodaavan osan kooksi 1 100 emäsparia. Koska rihmasienten geenit sisältävät tavallisesti ainoastaan harvoja ja silloinkin pieniä, introneja (Ballance, Yeast 2, 229, 1986), voidaan olettaa, että täydellinen .: 25 geeni sijaitsee kuvatussa molekyylissä ja että säätely- alueet ovat samoin läsnä täydellisessä muodossa.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä rajoittamatta sitä. Esimerkeissä lyhennykset ml, 1, mg, g, rpm, DS, WV% ja U tarkoittavat millilitroja, litroja, milli-30 grammoja, grammoja, kierroksia minuutissa, kuiva-ainetta, paino/tilavuus-% ja kansainvälistä entsyymiyksikköä (1 kansainvälinen entsyymiyksikkö * 1 pmooli substraat-tia/min). Paino-osat suhtautuvat tilavuusosiin kuten g ml:aan, lämpötila on annettu Celsius-astfeina. Tuotteiden 35 karakterisointi suoritettiin käyttäen seuraavia tekniikoi- 16 103053 ta: suurteho-ohutkerroskromatografiaa (HPTLC), korkeapa!-nenestekromatografiaa (HPLC), ultraviolettispektrofotomet-riaa (UV), infrapunaspektrometriaa (IR) ja ydlnmagneettis-ta resonanssia (NMR). Esimerkeissä lueteltujen kantojen 5 nimiin lisätyt numerot vastaavat niiden viljelmäkokoelmien rekisteröityjen kantojen symboleja, joihin kantoja on jätetty sellaisina, esim. ATCC:n (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA).

Fenoksiasetyylikoentsyymi A:n (PaCoA) tuottaminen 10 ja analyysi:

Periaate: Koentsyymi A + fenoksietikkahappoklori-di -» PaCöA

901 mg CoA:ta liuotetaan jään avulla jäähdyttäen 15 ml:aan kahteen kertaan tislattua vettä ja pH säädetään 15 7,0:ksi natriumhydroksidin avulla (2,56 ml 1 N NaOH ja 1,60 ml 0,5 N NaOH). Sen jälkeen lisätään annoksina, voimakkaasti sekoittaen, kokonaismäärä 235 mg fenoksietik-kahappokloridia ja pH-arvo pidetään 7,0:ssa (1,8 ml 1 N NaOH). Sen jälkeen kun on sekoitettu yhden tunnin ajan 20 jäähdyttäen jään avulla, liuosta uutetaan kolme kertaa, kulloinkin 40 ml:11a dietyylieetteriä, pH:ssa 2,0 (6 tai 1 N HC1), sitten neutraloidaan vesifaasi NaOH:n avulla, jäljellä oleva eetteri poistetaan huoneenlämpötilassa kiertohaihduttimessa, seosta kaasutetaan lyhyen aikaa ty-· 25 peliä, se laimennetaan sitten 1:50 kahteen kertaan tis latulla vedellä, lisätään ampulleihin 500 pl:n annoksina ja jäädytetään nesteytetyssä typessä. Analyysi suoritetaan käyttäen HPLC:a, jolloin standardina käytetään fenyyliase-tyylikoentsyymi A:ta (PeCoA).

30 HPLC-systeemi: HP 1090 Liquid Chromatogram (Hewlett

Packard)

Pylväs: Hypersil ODS 5 pm, C 18, 150 x 200 mm

Integraattori: Model 3392 (Hewlett Packard)/ATT 3

Virtausnopeus: 0,5 ml/min 35 Osoittaminen: 230 nm 17 ΊΓ7ηρ7

Eluentti: 35 % metanolia, 65 % 0,01 M tetrabutyyli-ammoniumsulfaattia (TBAS), 0,025 M fosfaattipuskuriliuok-sessa pH 7,0

Arviointi: 5 Näyte retentioaika pinta-ala korkeus (min) 400 pg/ml PeCoA 9,41 8 466 900 210 692 200 pg/ml PeCoA 9,68 4 105 400 107 689 100 pg/ml PeCoA 9,88 2 092 100 54 990 10 PaCoA-kantaliuos 1:200 10,53 1 966 600 47 737

PaCoA-kantaliuos 1:50 10,68 7 850 700 172 983

PaCoA-kantaliuos 1:40 10,47 10 389 000 222 475

Pinta-alan integrointi -» 19,2 mg PaCoA/ml 15 Korkeuden arviointi -» 16,8 mg PaCoA/ml

Keskiarvo -» 18,0 mg PaCoA/ml

Esimerkki 1

Entsymaattisesti aktiivisen biomassan valmistaminen

20 Ampullin, jossa oli Penicillium chrysogenum P2/ATCC

48271:n lyofilisoituja itiöitä, sisältö suspendoidaan 8 ml:aan elatusainetta A (koostumus litraa kohden: 15 g laktoosia, 0,11 g typpeä maissinliotusnesteestä (Cornsteep Liquor), 5 g Witte-peptonia, 4 g NaCl, 0,5 g MgS04 ♦ 7H20, ·· 25 0,6 g KH2P04, 5 mg FeCl3 · 6H20, 2 mg CuS04 · 5H20, saatettu na kokonaistilavuudeksi 1 000 ml tislatulla vedellä, pH 4,85, sterilisointi: 20 minuuttia 120 °C:ssa). 2 litran erlenmeyerpulloon, jossa on 225 ml ohraa, istutetaan 2 ml tätä itiösuspensiota. Ennen pulloon sijoittamista ohraa 30 pestään vedellä, kunnes pesuvesi on kirkasta, se jätetään turpoamaan elatusaineeseen A 20 - 30 minuutin ajaksi, suodatetaan seulan avulla ja kuivataan noin yhden tunnin ajan suodatuspaperilla ja sitä lisätään sen jälkeen 225 ml:ksi 2 litran erlenmeyerpulloon, steriloidaan sitten kolme ker-35 taa 100 °C:ssa noin yhden tunnin ajan yhden päivän välein 18 103053 ja ennen istuttamista kuivataan kahden päivän ajan 40 -45 eC:ssa. Itiöiden istuttamisen jälkeen erlenmeyerpulloa ravistetaan vähän aikaa ja inkuboidaan sitten .noin kahdeksan päivän ajan 24 ± 1 eC:ssa ja 60 ± 10 %:n suhteellises-5 sa kosteudessa.

Tämän stationaarisen inkuboinnin jälkeen sienten itiöt uudelleensuspendoidaan 3-5 minuutin aikana käyttäen 140 kierrosta minuutissa 250 ml:aan liuosta, jossa on 0,9 % NaCl + 0,1 % Tween 80, pystysekoituskoneessa. Sen 10 jälkeen kun on vielä lisätty 250 ml 0,9 % NaCl-liuosta (ilman Tween 80:tä), itiösuspensio dekantoidaan steriilis-ti 1 litran kylvökanisteriin. Viiteenkymmeneen 2 litran erlenmeyerpulloon, joissa kussakin on 200 ml elatusainetta B (koostumus litraa kohden: 9 g kaliumfenoksiasetaattia, 15 150 g laktoosimonohydraattia, 2,25 g typpeä "Pharmamedia"- valmisteena, 10,5 g (NH4)2S04, 4 g Na2S04, 0,5 g KH2P04, 10 ml eläinöljyä (laardiöljyä), 25 g CaC03, saatettuna kokonaistilavuudeksi 1 000 ml tislatulla vedellä; pH 6,5, sterilisointi: 20 minuuttia 120 ®C:ssa), istutetaan kuhun-20 kin 8 ml tätä istutusmateriaalia, jota voidaan säilyttää 4 ®C:ssa noin yhden kuukauden ajan ja sitten sekoitetaan kolmen päivän ajan 25 ± 1 °C:ssa käyttäen 260 kierrosta minuutissa. Tämän sekoitusinkubaation jälkeen kootaan talteen 1 820 g entsymaattisesti aktiivista biomassaa. Peni-•I 25 silliinitiitteri on 1,9 g penisilliini V:tä litraa kohden massaa.

Esimerkki 2

Entsymaattisesti aktiivisen raa'an entsyymivalmisteen tuottaminen 30 1 786 g kosteaa huovastoa (= 220 g kuiva-ainetta), joka on saatu esimerkissä 1, uudelleensuspendoidaan 3,5 litraan 0,1 M fosfaattipuskuriliuosta, pH 7,5, joka sisältää 5 mM ditiotreitolia (DTT), 0,1 % Triton X 100:a ja 0,1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF) ja homoge-35 noidaan yhtäjaksoisesti, jäähdyttäen 2/3 °C:seen, lasikuu- 19 103053 lamyllyssä (600 ml:n teräksinen jauhatusastia, jossa on 510 ml 500 - 750 μπκη lasihelmiä, kiertonopeus 2 000 kierrosta minuutissa, kitka-aukon leveys 0,1 mm, virtausnopeus 30 1/tunti, liike eteenpäin 2-3*, paluuliike 5“, suola-5 vesijäähdytys, jolloin liike eteenpäin -20/8“ ja paluuliike -5/-1°). Homogenaattia sentrifugoidaan sen jälkeen 30 minuutin ajan nopeudella 15 000 kierrosta minuutissa 4 eC:ssa, supernatantti sekoitetaan 0 eC:ssa 0,5 paino/ti-lavuus-% setyylitrimetyyliammoniumbromidin (CTAB) kanssa 10 ja sekoitetaan 30 minuutin ajan. Saostunut nukleiinihappo erotetaan sentrifugoimalla (10 min, 15 000 kierrosta minuutissa, 4 °C), supernatantti kyllästetään 50 paino/tila-vuus-%:ksi lisäämällä kiinteää ammoniumsulfaattia ja pidetään 4 eC:ssa yön ajan proteiinien saostumisen saattami- 15 seksi täydelliseksi. Saostuma sentrifugoidaan sitten, pestään kylmällä kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella ja sen jälkeen kun on lisätty 5 paino/tilavuus-% sorbitolia, 5 mM DTT:a, 2 mM EDTA:a ja 0,1 mM PMSF:a, säilytetään 4 °C:ssa seuraavaan kromatografiavaiheeseen asti. Hajotta- 20 minen tai vastaavasti kaksi saostamisvaihetta tapahtuvat käyttäen proteiinin määritystä (Bradford) tai vastaavasti aktiivisuuden määritystä (6-APA-PaCoA-asyylitransferaasi-aktiivisuuden mikrobiologinen osoittaminen käyttäen lak-taamille yliherkkää kantaa Pseudomonas aeruginosa BC 248).

25 Saadut arvot on lueteltu taulukossa 1.

Esimerkki 3

Entsyymivalmisteessa AS-saostuma olevan transasy-lointiaktiivisuuden tai penisilliini V:n lohkaisu-aktiivisuuden mikrobiologinen osoittaminen lisäten 30 tai lisäämättä inhibiittoreita

Esimerkissä 2 kuvatulla tavalla tuotetusta raa'asta entsyymi valmisteesta määritetään seuraavasti mikrobiologisessa agardiffuusiotestissä 6-APA:n tai vastaavasti isope-nisilliini N:n transasylointi PaCoArn avulla ja kaliumpe- « 20 103053 nisilliini V:n lohkaiseminen lisäten tai lisäämättä inhibiittoria:

Koeorganismi: Micrococcus luteus ATCC.9341/BC 85, 0,5 % istutus 5 Koe-elatusaine: Antibioottielatusaine 1 (DIFCO), 110 ml

Koelevy: Nunc 243’ x 243 x 18 mm Näyte: 50 μΐ syvennystä kohden (halkaisija 6 mm)

Inkubointi: 37 eC, 15 tuntia 10 Entsyymi: As-saostuma (tuotettu kuten on kuvattu

esimerkissä 2): 1 ml sentrifugoitu (20 000 kierrosta mi-nuutissa/10 min), supernatantti heitetty pois, pelletti uudelleensuspendoitu 20 ml:aan liuosta RP + Z

RP + Z: 0,1 M fosfaattipuskuriliuos pH 7,5 + 1 mM 15 DTT + 10 mM MgCl2 A. Transasylointi/asylointi Mikrotiitterilevyillä oleva valmiste:

Substraatti 6-APA tai isopenisilliini N

(2,5 mg/ml) 10 μΐ 20 PaCoA (n. 15 mg/ml) 15 μΐ

Entsyymi tai vastaavasti RP + Z inhibiittorin kanssa tai ilman sitä 75 μΐ

Inhibiittori: a) ilman inhibiittoria (= kontrolli) b) 2 mM jodiasetamidi

. 25 c) 2 mM PMSF

• · Välittömästi ja vastaavasti .7, 30 ja 60 minuutin inkubaatioajan jälkeen otetaan valmisteista 20 μ1:η näyt-v teitä, ne laimennetaan 1:5 50-%:isella etanolilla (entsyy-mireaktio pysähtyy) ja niistä analysoidaan penisilliinipi-30 toisuus agardiffuusiotestissä.

103053 21

Isopenisilliini N:n ( 28 ja 36) transasy-lolnti PaCoArn avulla (HH 0 mm) i3°peni-| Z Z 7t 51X lj N t r 30. gp. , 7- JQ- go·__t V 30* 80' nro 29 22,5 2S,S 20.0 21.0 21,1 *0.0 10,1 l«,7 22,7 24,7 25,7 20,7 ^ nro 36 27,0 *0,1 30.0 30.7 25.2 *5.0 *1,0 *1,1 *0,1 *7,* *7,7 10,7

s????nN“ h U07"0 v h MO/nO

__SO 25 11,5 *,0 1,5 1,0 0,5 0,*5__ nro 28 *0 10,5 11,« *5,1 24,0 *1,7 17,0 5,7 _ nro 36__*4,5 l*,l 10,0___ 10 6-APA:n asylointi PaCoA:n avulla entsyymilaimennok sesta riippuen _1J___1^10__1J0__1:100 f 7’ 10· oo- , · r 10' 00- · 7· 30' 00' · 7· 30’ 00' 10,1 *4,4 *4,1 15,7 10,0 25,4 20,5 25,4 10,0 *4,* 30,7 30,7 14,5 21,3 20,7 27,0

i5 1:500 1:1000 Penisill. V h uq/nO

0 7' 30’ 80' » 7' 30· 00' 2,0 1,5 1,0 0,5 0,15_ 14,0 17,0 *0,0 *2,0 0 0,0 10,5 11,1 25,1 *4,0 11,7 17,0 0,7 _ B. Penisilliini V:n lohkaiseminen 20 Mikrotiitterilevyillä oleva valmiste

Kaliumpenisilliini V 100 pg/ml 10 pl 0,1 M fosfaattipuskuriliuos pH 7,5 15 μΐ

Entsyymi tai vastaavasti RP + Z (+ inhibiittori) 75 μΐ 25 a) ilman inhibiittoria (= kontrolli) b) + 2 mM jodiasetamidi c) + 2 mM etyylimaleiini-imidi

d) + 2 mM PMSF

e) RP + Z

v « 22 103053

Kaliumpenisilliini V:n lohkaiseminen (HH 0 mm) erilaisten inhibiittorien läsnä ollessa I »I el 41 t V 30· 30' · Γ 30· «0· · 7’ 30’ *0’ % V 30· JO- 5 2s,r n,* o o isj 33,1 o o «,o n,o o o 33,3 o o o ,1 R Perusill.h Mirri transasyl. vert. vuoksi • V 30’ JO' 3,0 1,3 ‘ '1,0 9,3 0,35 3-APA ♦ P»CoA -* * V 30' 30' 23,8 35,a 23,3 33.4 27,3 23,7 23,3 IS,3 11,3 PenisiU. V <7,0 73,7 7«,» 23.»

Esimerkki 4 10 PAT:n aktivointi, inhibointi, stabilointi ja pH- profiili

Esimerkissä 2 kuvatulla tavalla tuotettu PAT-ammo-niumsulfaattisaostuma laimennetaan 1:10 0,1 M reaktiopus-kuriliuoksella, erilaisten aktivaattoreiden tai inhibiit-15 toreiden tai stabiloimisaineiden läsnä ollessa ja tutkitaan 6-APA-PaCoA-asyylitransferaasiaktiivisuus välittömästi tai sen jälkeen kun on inkuboitu yhden päivän ajan 4 eC:ssa tai -20 "C:ssa, mikrobiologisessa testimallissa. Tuloksista on yhteenveto taulukossa 2.

20 Esimerkki 5 PAT:n lämmönkestävyys

Esimerkissä 2 kuvatulla tavalla tuotettu PAT-ammo-niumsulfaattisaostuma laimennetaan 1:20 0,1 M fosfaatti-puskuriliuoksella pH 7,5, joka sisältää 1 tai 10 mM DTT:a, 25 sitten sentrifugoidaan tehokkaasti, supernatantille suoritetaan stationaarinen inkubointi -196_eC:ssa, -20 *C:ssa, +4 "C:ssa, +20 "C:ssa ja +37 *C:ssa ja siitä tutkitaan 6-APA-PaCoA-asyylitransferaasiaktiiVisuus välittömästi tai vastaavasti 1, 4, 26 ja 120 tunnin jälkeen mikrobiologi-30 sessa testimallissa. Tulokset on luetteloitu taulukossa 3.

. . ' 23 103053

Esimerkki 6 PÄT:n puhdistaminen hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvan kromatografian avulla käyttäen fenyyli-sefaroosi Cl-4B:tä (HIC-virtaus) ja affiniteetti-5 kromatografian avulla käyttäen 6-APA-AH-sefaroosi 4 B:tä (affiniteettivirtaus) 240 g esimerkissä 2 kuvatulla tavalla saatua ammo-niumsulfaattisaostumaa liuotetaan 2 000 ml:aan 50 mM fos-faattipuskuriliuosta pH 7,5, joka sisältää 1 M (NH4)2S04 ja 10 1 mM DTT:a ja lisätään laboratorion jäähdytyshuoneessa +4. *C:ssa BP 113 -pylvääseen, jossa on 200 ml tasapainotettua fenyylisepharose Cl-4B:tä. Pylvästä pestään sen jälkeen käyttäen virtausnopeutta 50 ml/min, 3 perusti-lavuudella 50 mM fosfaattipuskuriliuosta pH 7,5, joka si-15 sältää 1 M (NH4 )2S04 ja 1 mM DTT:a, sitten poistetaan painolastina oleva proteiini käyttäen vielä kaksi perustila-vuutta 50 mM fosfaattipuskuriliuosta pH 7,5, joka sisältää 1 mM DTT:a, sitten eluoidaan PAT-entsyymi käyttäen kolme perustilavuutta deionoitua vettä (E-H20), joka sisältää 20 1 mMDTT:a, aktiiviset fraktiot konsentroidaan kymmeneso- satilavuudeksi Pellicon-kasettisysteemissä käyttäen poly-sulfoniultrasuodatuskalvoa, jonka rajamolekyylipaino on 10 kD, stabiloidaan käyttäen 1 paino/tilavuus-%~sorbitolia, 5 mM DTT:a, 2 mM EDTA:a ja 0,1 mM PMSF:a ja jäähdyte-25 tään -20 ’Crseen seuraavaan kromatografiavaiheeseen asti. Yksittäisten fraktioiden, jotka käsittävät yhden perusti-^lavuuden, mikrobiologisesti määritetty 6-APA-PaCoA-asyyli-transferaasiaktiivisuus ja kokonaisproteiinipitoisuus on esitetty seuraavassa taulukossa:

N

,. 103053 24

Mikrobiol. määritetcy PAT-ak- Kokonaisproteii-tiiv. (ππ HH 0 käyttäen Pseud ni/Bradford Näyte aeruginora 3C 248) (ingj välittö- 30""" _ _masti__Penaasi__ panos 19 24 g 5483 ------

Pt 150/1 17 18 0 230

Pt 150/2 18 15 0 102

Pt 150/3 14 . - IS 0 98

Pt 150/4 0 00 2750

Pt 150/5 000 390

Pt 150/8 hiukan 15 0 52 .- Pt 150/7 18 31 0 389 10 Pt 150/8 0 0 _0__14 HIC-fraktion aktiivinen sisältö sulatetaan varovaisesti seuraavana päivänä ja lisätään K 26/40 Pharmacia-pylvääseen, jossa on 50 ml affiniteettimatriisia 6-APA-AH-15 sepharose 4 B, joka on aikaansaatu kytkemällä penisilliini G:tä AH-sepharose 4 B:hen (Pharmacia) EEDQ:n avulla LKB-ohjeen "Practical guide for use in affinity chromatography and related techniques", Reactifs IBF-Societe Chimique Pointet-Girard, Ranska 1933, sivu 133, mukaan ja lohkaise-20 maila sen jälkeen fenyylietikkahappo E. colin liukoisen penisilliini G -amidaasin avulla. Pylvästä eluoidaan sitten 4 eC:ssa käyttäen virtausnopeutta 3 ml/min, seuraavil-la liuoksilla: AL 278/1: 12 perustilavuutta 50 mM fosfaattipusku-25 riliuosta pH 7,5 + 1 mM DTT + 0,1 M NaCl

AL 278/2: Kolme perustilavuutta samaa puskuriliuospa + 1 mM DTT + 0,1 M NaCl + 1 mM 6-APA

\ AL 278/3: Kuusi perustilavuutta samaa puskuriliuosta + 1 mM DTT + 1 M NaCl + 1 mM 6-APA 30 PAT-aktiivisuus, joka eluoitu fraktiossa 278/2 spe sifisen eluentin 6-APA avulla, konsentroidaan kymmenesosa-tilavuudeksi Minitan-kasettisysteemissä käyttäen polysul-foniultrasuodatuskalvoa, jonka rajamolekyylipaino on 10 kD, sekoitetaan jälleen stabiloivan seoksen, jossa on 35 1 painotilavuus-% sorbitolia, 5 mM DTT:a, 2 mM EDTAra ja « 103053 0,1 mM PMSF:a, kanssa ja syväjäädytetään erinä. Tämän ent-syymivalmisteen, joka on HPLC-määrityksen mukaan vähintään 50-%:isesti puhdas, substraattispesifisyys on esitetty taulukossa 4.

5 Esimerkki 7

Affiniteettikromatografian avulla aikaansaadaan PAT-entsyymivalmisteen kromatofokusointi käyttäen tuotetta Mono P/Pharmacia (kromatofokusointi AL 310) 10 1 ml: n erä PAT-entsyymi valmistetta, joka on puhdis tettu esimerkissä 6 kuvatulla tavalla affiniteettikromatografian avulla ja konsentroitu, sulatetaan varovaisesti ja sille suoritetaan sitten puskurin vaihto liuokseen 25 mM bis tris/HCl -puskuriliuos pH 6,3 käyttäen tasapainotettua 15 PD 10 Sephadex G 25 -valmista pylvästä, se lisätään sitten 4 ml:n FPLC Mono P -valmiiseen pylvääseen, joka on tasapainotettu samalla puskuriliuoksella, minkä jälkeen eluoi-daan välittömästi käyttäen virtausnopeutta 60 ml/tunti, 100 ml:11a 1:10-laimennettua polypuskuriliuosta 74, jonka 20 pH on säädetty 4,0:ksi, sitten fraktioidaan huipuittain ja fraktioille suoritetaan analyysi, joko alkuperäisessä muodossa tai konsentroituna kymmenkertaisesti Centricon 10:n avulla käyttäen RPC:a (käänteisfaasikromatografia), SDS-gradientti-polyakryyliamidigeelielektroforeesia, immobi-25 liiniin perustuvaa isoelektristä fokusointia ja geelisuo-datusta.

i

Kuviossa 1 on esitetty Mono P:tä käyttäen saatu PAT-entsyymin eluutioprofiili. Monifunktionaalinen entsyymi hajaantuu vähintään kolmeksi isoelektriseksi muo-30 doksi (PAT 310/3, PAT 310/4 ja PAT 310/5). Nämä erilaisen varauksen omaavat entsyymivariantit voivat edustaa joko todellisia isoentsyymejä tai saman entsyymin erilaisia hapetus-pelkistysmuotoja.

Kuten voidaan nähdä kuviosta 2, hajoaa tiolista 35 riippuvainen Penicillium chrysogeniumin PAT RPC:n denatu- 103053 26 roivissa olosuhteissa (pylväs = Biorad Hi Pore RP 304, 250 x 4,6 mm; HPLC-parametrit: 0,5 ml/min, 45 baaria, 280 nm, 40°, injektiotilavuus 25 μΐ; lineaarinen gradient-ti väliltä eluentti A; 35-%:isen asetonitriilin vesi-5 liuos, jossa on 0,01 % trifluorietikkahappoa ja eluentti B: 80-%:isen asetonitriilin vesiliuos, jossa on 0,01 % trifluorietikkahappoa, 30 min) yhdeksi polypeptidi lrksi ja iso- tai hapetus-pelkistysvariantista riippuen, yhdeksi tai kahdeksi vaihtelevasti hydrofobiseksi variantiksi 2a 10 ja 2b.

SDS-gradientti-polyakryyliamidigeelielektroforee-sissa (ks. kuvio 3a, olosuhteet Laemmlin mukaan, Nature 227, 680 - 685, 1970; gradienttigeelissä kuitenkin 8 - 20 % T), PAT-entsyymi hajoaa kahdeksi kooltaan eroavaksi 15 polypeptidiksi, joiden molekyylipainot ovat noin 30 ja 8 kD. Käyttäen RPCra ja sen jälkeen SDS-gradientti-PAGE:a voidaan osoittaa, että RPCissa ensin eluoituva polypeptidi 1 on identtinen noin 30 kilodaltonin suuruisen komponentin kanssa ja kaksi tiukemmin pysyvää, hydrofobista polypepti-20 diä 2a ja 2b ovat identtisiä 8 kD:n suuruisen komponentin kanssa. Sellainen moniulottuvainen analyysi voi lisäksi osoittaa, että pienillä polypeptideillä 2a ja 2b on SDS-gradientti-PAGE: ssa sama liikkuvuus kun taas emäksisen iso- tai hapetus-pelkistysvariantin suurempi, noin 30 kD:n 25 polypeptidi 1 liikkuu nopeammin kuin happamamman muodon vastaava polypeptidi 1.

Amfoliiniin perustuvassa isoelektrisessä fokusoinnissa (IEF) (ks. kuvio 3b, metodinen suoritus LKB Application Note 1804:n mukaan), aktiivinen affiniteettiyhteis-30 liuos tuo esille kolme tiiviisti yhdessä olevaa vyöhykettä, joiden isoelektrinen piste on 5,1.

Immobiliiniin perustuvan hyvin liuottavan IEF: n (ks. kuvio 3c, metodinen suoritus LKB Application Note 1819:n mukaan) kapealla pH-alueella olivat kromatofokusoi- 27 103053 maila erotettujen PAT-varianttien pl-arvot 5,15, 5,06 ja 5,32.

Määritettäessä molekyylipaino geelisuodatuksen avulla käyttäen Pharmacian Superose 12:ta (eluentti: 0,1 M 5 fosfaattipuskuriliuos, pH 7,5, joka sisältää 1 mM DTT:a, 0,4 ml/min), määritetään.molekyylipainoksi 36,5 kD ja vastaavasti käytettäessä LKB:n TKS-G20G0 SW:tä (sama eluentti ja 0,5 ml/min) määritetään molekyylipainoksi 38 kD, mikä korreloi hyvin kahden denaturoitumispolypeptidin 1 ja 2 10 summan kanssa.

Esimerkki 8

Polypeptidien 1 ja 2a samoin kuin 2 b N-terminaali- nen sekvenssointi

Uusi annos (2 mg proteiinia) PAT-entsyymivalmistet-15 ta, joka on puhdistettu affiniteettikromatografian avulla kuten on kuvattu esimerkissä 6, erotellaan kaksi kertaa RPC:n avulla varovaisen sulattamisen jälkeen (sama pylväs ja olosuhteet kuin on annettu esimerkissä 7, mutta loivemmin kohoava gradientti: min/% B:tä « 0/0, 8/0, 20/12, 20 25/12, 30/100, 33/100, 36/0, 40/0); lyofilisoidaan frak tiot, joissa on polypeptidejä 1 tai vastaavasti 2a tai 2b ja suoritetaan N-terminaalinen sekvenssointi käyttäen pro-teiinisekvenaattoria.

N-terminaalinen aminohapposekvenssi: ’· 25 30 kD:n yksikkö/polypeptidi 1: osasekvenssi 1 1 5 10 15 20 _-Thr-Thr-Ala-Tyr-Cys-GIn-Lau-Pro-Asn—Gly-Ala-Lau-Gln—Gly-Glo-Asn-Trp-Asp-^be— 25 30 35 37

Pha-Ser-Ala-Thr-tys-Glu-Asn-teu-Ke-Arg-_-_-_-_-Gin-_-Gly- 30 8 kD:n yksikkö I/polypeptidi 2a: osasekvenssi 6 1 5 10 15 20

Met—Leu—ΗΪ3—lie—Leu—Cys-GIn—Gly—Thr-Pro—Phe—Glu—Ile—Gly—Tyr-GIu—His-Gly-Ser-Ala— 25 30 34

Ala-tys-Ala-Val-iie-Aia-Arg-Ser-ile-Asp-rhe-Ala-Val-Asp- 103053 28 8 kD:n yksikkö II/polypeptidi 2b: osasekvenssi 6 15 10 15 20

Met-teu-His-lle-teu-Cys-Gln-GIy-Thr-Pro-Phe-^u-He-Gly-Tyr-Glu-Hia-Gly-Ser-Ala- 25 30 35 40

Ala—Lys—_-Val-ile-Ala-Arg- -iia-Aso-Phe—Ala-Val-Aap—Leu— - -Gly— -Thr- 5

Samoin kuin myöskään SDS-gradientti-PAGE:ssa eivät pienet polypeptidit 2a ja 2b, joilla on toisistaan eroava retentio RPC:ssa, eroa toisistaan sekvenssoidussa molekyy-linosassa.

10 Esimerkki 9

Polypeptidien 1 ja 2 proteolyyttisten peptidifrag- menttien sekvenssointi

Lyofilisoitua fraktiota, jossa on polypeptidiä 1 tai vastaavasti 2 ja joka on tuotettu esimerkissä 8 kuva-15 tulla tavalla, pilkotaan entsymaattisesti J.M. Wilkinsonin mukaan (Practical Protein-Chemistry - A Handbook, toimittanut A. Darbre, 1986) trypsiinin tai vastaavasti lysyyli-endopeptidaasin avulla, yksittäisiä peptidifragmentteja eristetään RPC:n avulla ja sekvenssoidaan käyttäen pro-20 teiinisekvenaattoria. Saadaan mm. seuraavat aminohappo- . osasekvenssit: AS-osasekvenssi 2 (typsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 1 5 10 13 25 Gly-Ala-Thr-Leu-Phe-Asn-Ile-Ile-Tyr-Asp-His-Ala-Arg- AS-osasekvenssi 3 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 15 10 n Pro-Thr-Asn-Pro-Asp-Glu-Met-Phe-Val-Met-Arg 30 AS-osasekvenssi 4 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 15 10

Glu-Leu-Asp-Pro-Leu-Pro-Asp-Ser-Trp-Asn-Arg AS-osasekvenssi 5 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n 35 peptidifragmentti): 103053 29 1 5 10 12

Met-Glu-Phe-Leu-_-Asp-Gly-Phe-Asp-Gly-Thr-Lys AS-osasekvenssi 7 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 5 1 5 10 14

Ile-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Ser-Pro-Ser-Gln-Ala-Tyr-Asp-Arg AS-osasekvenssi 8 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 15 10 10 Val-Gly-Phe-Asn-Ser-Ala-Gly-Val-Ala-Val-Asn-Tyr-Asn-Ala 15 20 25

Leu-His-Leu-Gln-Gly-Leu-Arg-Pro-Thr-Gly-Val-Pro-Ser-His 30 32

Ile-Ala-Leu-Arg 15 AS-osasekvenssi 9 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5 8

Thr-Glu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Lys i AS-osasekvenssi 10 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 20 2:n peptidifragmentti): ' ' 1 5

Tyr-Tyr-_-Glu-Ile-Arg AS-osasekvenssi 11 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 25 1

Trp-Pro-Lys AS-osasekvenssi 12 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 15 10 30 Ser-Ile-Asp-Phe-Ala-Val-Asp-Leu-Ile-Arg AS-osasekvenssi 13 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5 10

Asp-Val-Ser-Glu-Ile-Val-Met-Leu-Asn-Thr-Arg 30 103053 AS-osasekvenssi 14 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5 8

Gln-Val-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg 5 AS-osasekvenssi 15 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5

Cys-Gln-Gly-Thr-Pro-Phe-Glu AS-osasekvenssi 16 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu 10 polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 .5 10

Tyr-Tyr-Glu-Glu-Ile-Arg-Gly-Ile-Ala-Lys AS-osasekvenssi 17 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 15 1 5 10 15

Gln-Val-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Val-Ile-Glu-Glu-Arg-_-Pro Lys AS-osasekvenssi 18 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 20 1 5 10

Gly-Ala-Glu-Arg-Asp-Val-Ser-Glu-Ile-Val-Met-Leu-Asn-Thr 15 .

Arg AS-osasekvenssi 19 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 25 2:n peptidifragmentti): 1 5

Ala-Val-Ile-Ala-Arg v AS-osasekvenssi 20 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 30 1 5

Lys-Thr-Asp-Glu-Glu-Leu-Lys AS-osasekvenssi 21 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 4 35 Gly-Ile-Ala-Lys « 31 103053 AS -osasekvenssi 22 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5

Val-Ile-Glu-Glu-Arg 5 AS -osasekvenssi 23 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 1 5 10

Asn-Thr-_-Thr-Glu-Phe-Ala-Tyr-Gly-Leu-Lys AS-osasekvenssi 24 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 10 2:n peptidifragmentti): 1. 3

Ala-Ala-Arg

Esimerkki 10 poly (A) *RNA:n eristäminen Peni ci Ilium chrysogenumin 15 huovastosta

Penidillium chrysogenum P2/ATCC 48271: n itiösuspen-siota inkuboidaan sekoituskoneessa käyttäen 250 kierrosta minuutissa noin 70 tunnin ajan 25 eC:ssa viidessä erlen-meyerpullossa (kukin 1 000 ml), joista kukin sisältää 20 100 ml CDS-elatusainetta (1 litra CDS-elatusainetta varten sekoitetaan autoklaavikäsittelyn mukaisesti: 900 ml liuosta A: 3 g NaNOj , 0,5 g MgS04 · 7H20, 0,5 g KC1, 0,1 g FeS04 2H20, 5 g hiivauutetta, 10 g kaseiinipeptonia, 20 g sakkaroosia, pH 5,8 ja 100 ml liuosta B: 250 mM K2HP04/-, 25 KH2P04, pH 5,8). 12 erlenmeyerpulloon (kukin 1 000 ml), joista kukin sisältää 300 ml CDLP-elatusainetta (koostumus kuten CDS-elatusaineella, mutta 20 g:n sakkaroosia asemesta 150 g laktoosia/1 ja 50 ml 10 % fenoksietikkahappoa [liuotettuna veteen, pH 7,5 säädetty K0H:n avulla]), istu-30 tetaan kuhunkin 30 ml esiviljelmää ja inkuboidaan sekoi-^ tuskoneessa käyttäen 250 kierrosta minuutissa 40 tunnin ajan 25 "C:ssa. Huovasto suodatetaan käyttäen Biichner-sup-piloa, pestään vähän TE:llä (10 mM tris/HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) ja jauhennetaan nesteytetyssä typessä hienoksi jau-35 heeksi. Tämä jauhe suspendoidaan lyysipuskuriliuokseen • 32 103053 (5 M guanidiinimonotiosyanaatti, 10 mM EDTA, 50 mM tris/-HC1, pH 7,5, 8 % B-merkaptoetanolia) (3 ml lyysipuskuri-liuosta grammaa kohden kosteaa huovastomassaa) ja sekoitetaan yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kokonais-RNA:n 5 eristäminen tapahtuu erään kuvatun menetelmän mukaan (Cathala et ai., DNA 2, 329 - 335, 1983). 60 g:sta kosteaa huovastomassaa on mahdollista eristää noin 18 g raa-ka-RNA:ta. Tämä saostetaan etanolin avulla ja säilytetään -70 "C:ssa. Poly(A)*RNA:n väkevöinti tapahtuu oligo(dT)-10 selluloosa-affiniteettikromatografian avulla, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982. Tätä tarkoitusta varten raaka-RNA sentrifugoidaan, kuivataan ja liuotetaan veteen. Kromato-grafian jälkeen fraktiot, jotka sisältävät poly(A)* 15 RNA:n, saostetaan jälleen etanolin avulla ja säilytetään -70 “C:ssa. Poly(A)*RNA:n vahingotttumattomuus testataan geelielektroforeesin avulla glyoksaalin läsnäollessa (Maniatis et ai.) ja konsentraatio määritetään UV-absorp-tion avulla.

20 Esimerkki 11 ' PAT-entsyymiä koodaavan RNA:n osittainen sekvens-sointi

Johdetaan genettisen koodin perusteella DNA-sek- \ venssi PAT:n polypeptidi l:n aminohapposekvenssistä (esi-• 25 merkki 8) (kuvio 5). 17 emäsparin sarja, joka sallii pie nimmän mahdollisen lukumäärän erilaisia sekvenssejä, valitaan oligonukleotidiseosten synteesiä varten. Syntetisoidaan neljä seosta, joissa on neljä erilaista oligonukleo-tidia, jotka ovat komplementaarisia tarkoitetulle säikeel-30 le ja siten myös RNA:lie (oligonukleotidiseokset 1, 2, 3 ja 4 kuviossa 5). Nämä oligonukleotidit fosforyloidaan t entsymaattisesti ja merkitään siten radioaktiivisesti (Maniatis et ai.). 150 ng oligonukleotideja inkuboidaan 16 yksikön kanssa polynukleotidikinaasia 30 minuutin ajan 35 37 aC:ssa, 12 μ1:η reaktiovalmisteessa (50 mM tris/HCl, 33 103053 pH 9,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTE, 5 % glyserolia) 250 pCi:n kanssa ATP:a (Amersham PB 10218). 10 pg poly(A)*RNA:ta (esimerkki 10), joka on liuoksessa, jossa on 250 mM KC1, 10 mM tris/HCl, pH 8,3, sekoitetaan 2 μ1:η kanssa 5 3zP:llä merkittyjen oligonukleotidien seosta 0,5 ml:n reak-tioastiassa. Seosta kuumennetaan kahden minuutin ajan 75 °C:seen ja lämmitetään sitten 45 minuutin ajan 50 °C:ssa. Neljään Eppedorf-astiaan lisätään kuhunkin 3,3 μΐ reak-tiopuskuriliuosta (24 mM tris/HCl, pH 8,3, 16 mM MgCl2), 10 8 mM DTE, 0,4 mM dATP:a, 0,8 mM dGTP:a, 0,4 mM dCTP:a, 0,4 mM dTTP:a, kuusi yksikköä käänteiskopioijaentsyymiä ja lisäksi kussakin on 1 μΐ 1 mM dATP:a tai 1 μΐ 1 mM dGTP:a tai 1 μΐ 1 mM dCTPra tai 1 μΐ 1 mM dTTP:a. Sen jälkeen kun on lisätty 2 μΐ poly (A) +RNA-oligonukleotidiseosta, 15 Eppendorf-astian sisältöä sentrifugoidaan lyhyen aikaa ja kuumennetaan 45 minuutin ajan 50 °C:ssa. Reaktio päätetään lisäämällä 2 μΐ pysäytyspuskuriliuosta (99 % formamidia, 0,3 % bromifenolisinistä, 0,3 % ksyleenisyanolia) ja keittämällä kolmen minuutin ajan. 4 μΐ kutakin näytettä lisä-20 tään 8-%:iseen polyakryyliamidi/ureageeliin ja avataan 2,5 tunnin ajan käyttäen 40 W (Sequi Gen, Biorad). Sen jälkeen geeli pannaan 20 minuutin ajaksi liuokseen, jossa on 5 % metanolia, 5 % etikkahappoa ja kuivataan yhden tunnin ajan 80 eC:ssa. Jäähtynyt geeli kääritään taloudessa käytettä-• 25 vään folioon. Röntgenfilmin (Kodak XOmat AR) annetaan olla alttiina 20 tunnin ajan. Sekvenssi, joka voidaan lukea tästä röntgenfilmistä, on jäljennettynä: 10 20 30 40 50 60 5;-CCATTTCCAAGTrCACAATACCCACTGCTCCA<X:CATCACCCCCTCCCTTCACCCCCTAT 70 80 90 -100 110 30 GCAAATTCCGTGCGGGTATTAACCATGACAATCTCGGACACATCGCGTTCA-3'

Asemat 1-29 ovat komplementaarisia DNA-sek-venssille, joka on johdettu PAT:n polypeptidi l:n aminohapposekvenssistä (kuvio 5, 6D). Syntetisoidaan oligonuk- m 34 1 0 3 0 5 3 leotidi, joka käsittää tämän sekvenssin ensimmäiset 30 nukleotidia.

Esimerkki 12

Penicillium chrysogenumin genomigeenipankin kokoon-5 paneminen

Eristetään DNA Penicillium chrysogenum -viljelmän huovastosta (esimerkki 10), joka on pesty CDS-elatusai-neessa. Huovasto jauhennetaan nesteytetyssä typessä, lisätään sitten liuokseen, jossa on 1 % sarkosyyliä, 0,1 M 10 EDTA, pH 8, 100 pg proteinaasi K:ta/ml (1 g huovas-

toä/25 ml) ja ravistetaan 48 tunnin ajan 37 eC:ssa. Seosta uutetaan kolme kertaa fenolilla ja sen jälkeen kun on lisätty 0,1 tilavuusosaa 3 M natriumasetaattia pH 5,2, saos-tetaan etanolilla. Sen jälkeen suoritetaan CsCl-EtBr-sent-15 rifugointi (Maniatis et ai.) ja isoamyylialkoholilla uuttamisen ja TE:tä vastaan dialysoinnin jälkeen määritetään konsentraatio UV-absorption avulla. Lisäksi tutkitaan DNA agaroosigeelielektroforeesin avulla. 300 pg Penicillium chrysogenum -DNA:ta pilkotaan käyttäen 5 U Sau3A:ta (BRL) 20 60 minuutin ajan 37 °C:ssa liuoksessa, jossa on 10 mM

tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTE, 50 mM NaCl. Pilk-koutumisaste tutkitaan agaroosigeeliä käyttäen. On toivottavaa, että suuri osa DNArsta on kooltaan 10 ja 20 kilo-emäksen väliltä. DNA lisätään sitten kahteen NaCl-gra-• 1 25 dienttiin (tuotettu jäädyttämällä ja sitten sulattamalla kaksi Beckmann-SW28.1.-ultrasentrifugointiputkea, joissa on 20 % NaCl TE:ssä [10 mM tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA]) ja sentrifugoidaan 16 tunnin ajan nopeudella 14 000 kierrosta minuutissa ultrasentrifugissa roottorissa SW 28.1. 30 Putken sisältö fraktioidaan. Fraktiot, joiden DNA on suurempi kuin 10 kiloemästä, yhdistetään ja dialysoidaan TE:tä vastaan. Sen jälkeen kun DNA on konsentroitu (500 pg/ml), se puhdistetaan 7i.-EMBL3-DNA:n kanssa (Frischhauf et ai., J. Mol. Biol. 170, 827 - 832, 1983), 35 jota on pilkottu BamHlrllä ja EcoRl:llä. Sen jälkeen kun • * 35 10ό05ν> on lisätty 0,5 U T4-DNA-ligaasia, annetaan sitten ligaa-tion tapahtua yön ajan 16 °C:ssa liuoksessa, jossa on 30 mM tris/HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTE, 2,5 mM ATP (DNA-konsentraatio 200 pg/ml, vektorin ja Penicillium 5 chrysogenum -DNA:n moolisuhde 1:1). Ligaatioseos pakataan in vitro proteiiniuutteiden avulla ("pakkausseoksia", Maniatis et ai.). Tulokseksi saadut λ-lysaatit titrataan käyttäen indikaattorikantaa NM539 (Frischhauf et ai.). Saadaan 106 pfu (plakin muodostava yksikkö).

10 Esimerkki 13 PAT-spesifisen oligonukleotidin kanssa hybridisoi-tuvien λ-kloonien eristäminen A-EMBL3:ssa olevan Penicillium chrysogenum -geenipankin (esimerkki 12) 40 000 rekombinanttifaagia, kannan 15 NM538 (Frischhauf et ai.) kanssa, lisätään 90 mm:n TB-le- vyille, joissa on 0,7 % agaroosia (TB-elatusaine sisältää 10 g bactotryptonia ja 5 g NaCl litraa kohden, pH on säädetty 7,5:ksi NaOH:lla). Näistä levyistä tehdään kaksi jäljennöstä nailonsuodattimelle (Amersham Hybond N -suoda-20 tin). Sen jälkeen kun DNA on UV-kiinnitetty, näitä suodattimia käytetään hybridisaatioon. Esimerkissä 11 kuvattu 30-meeri, jonka senvenssi on komplementaarinen DNA-sek-venssille, joka on saatu PAT:n polypeptidi l:n aminohappo-sekvenssistä, merkitään radioaktiivisesti (T4-polynukleo-- 25 tidikinaasireaktio kuten esimerkissä 11). Hybridisaatiota suoritetaan noin 20 tunnin ajan 37 °C:ssa 6 x SSPE:ssä (1 x SSPE on 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2P0<, 1 mM EDTA, pH 7,4), jossa on 30 % formamidia, 5 x Denhard, 0,1 % SDS, 100 pg/ml sillin sperman DNA:ta, 0,1 mM ATP:a, 3 ng/ml 30 3zP:llä merkittyä oligonukleotidia. Suodattimia pestään sitten kolme kertaa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 2 x SCC:ssä (1 x SCC on 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsitraat-ti, pH 7,0), jossa on 0,1 % SDS:a ja sitten kolme kertaa 20 minuutin ajan 56 ®C:ssa 1 x SCC:ssä, jossa on 0,1 % SDS 35 ja kuivaamisen jälkeen ne autoradiografoidaan. Alkuperä!- • · 35 103053 sen levyn agaroosikerroksessa olevat alueet, jotka vastaavat röntgenfilmillä olevia positiivisia hybridisaatiosig-naaleja, otetaan irti steriilillä Pasteur-pipetillä ja uudelleensuspendoidaan SM-puskuriliuokseen (5,8 g NaCl, 5 2 g MgS04 · 7H20 ja 50 ml 1 M tris/HCl, pH 7,5). Sopiva laimennos indikaattorik.antana olevan NM 538: n kanssa sijoitetaan taas TB-levyille. Näiden levyjen faagit siirretään nailonsuodattimelle ja hybridisoidaan kuten yllä. Vastaavat rekombinantti-T.-faagit eristetään plakeista, 10 jotka antavat positiivisia signaaleja toisen kerran. Näiden faagien puhdistettua DNA:ta käytetään restriktioana-lyysiin ja "southern"-hybridisaatioon. Lisäksi suoritetaan subkloonausta plasmideissa (pUC 12, Messing, Methods Enzymol. 101, 20, 1983) ja M13-vektoreissa (M13mpl8, 15 M13mpl9, Norrander et ai., Gene 26, 101, 1983). Sekvens-soimalla eräs M13mpl9-subklooni, jossa on oligonukleotidi, saadaan seuraava sekvenssi: 10 20 30 40 50 5' -CATCACCCCCTCCCrrCACCCCCTATCCAAArrCCCTCCCCCTATT.4ACC 80 70 80 90 100 2 0 ATCACAATCTCccACACAiccccTrcACcccccrrrccAATACCtccrrr 110 120 130 140 150 TTCCCCCCTCATCCCTCACCATTCGTCCACAAAATGTACGAAAGACCCAA 100 170 180 190 200 CTCCCACTCACCCCCAATCtCCTCGTACTATrTGCCCCATCrrTCCTCCATC-3'

V

25 DNA-sekvenssin nukleotidit 35 - 111, jotka varmis tettiin käyttäen RNA:ta (esimerkki 11), ovat yhdenmukaisia tämän DNA-sekvenssin nukleotidien 1-77 kanssa (kuvio 6F).

Esimerkki 14 30 PAT-geenin DNA-sekvenssi

Kuviossa 4 tämän DNA-sekvenssin asema on merkitty kahdella vaakasuoralla viivalla (A), jolloin 1 vastaa ensimmäistä nukleotidia ja 1972 viimeistä.

37 103053 10 20 30 4O 50 80 70

CTTCATGTCCCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCAGATTCGTCCCTACCGCAATATAAATCTCAGCATGCA

80 90 100 110 120 130 140

GTTCCCCCTGCATCArCATCCCCACCACCCCCTrTCTCATCTCCCTCACCCACCTCTCAGTrcrrTACCC

150 ISO 170 180 190 200 210

b ATCTTCCGACCCCCACCAGAAATCCTTCACATCCTCTCTCAAGGCACTCCCTTTGAAGTAAGTGCTCCAC

220 230 24**. 250 280 270 280

TCAATACCACA lTLiTICCTTCTCAATCTTCCGAGTTCTGACCTCATCCACATCGGCTACGAACATCGCT

290 300 310 320 330 340 350

CTGCTGCCAAACCCCTCATACCCAGAAGCATTGACTTCGCCGTCGATCTCATCCGACCGAAAACCAAGAA

10 380 370 380 390 400 410 420

GACGGACCAAGAGCTTAAACACGTACTCTCGCAACTGGCGCCCGTGATCGACGAAAGATCCCCCAAATAC

430 440 450 480 470 480 490

TACCAGCAGATTCCCCCTCACTCCCACTTCGCTCTTTCCTACATTTTCTGCACCAATCCTGACCCATCAC

500 510 520 530 540 550 560

15 CCCCCAAAAACCACGTATTGCAAAGCGCCCTCAACCCGATCTCTCCGACATTGTCATGCTTAATACCCCC

570 580 590 800 810 820 830

ACCCAATTTGCATACGCGCTCAAGGCACCCCGTCATGGCrCCACCACTGCCTATTGTCAACTTCCAAATG

840 850 880 870 880 890 700

GACCCCTCCAGCGCCAAAACTGCGATCTACGTTAAGAGATTTrACCTCCTCATTTTATTCCATCCAATTT

20 710 720 730 740 750 780 770

CCGCCCACTAATTTGGTTGTTCAAGTTCTTTTCTCCCACCAAAGACAACCTCATCCCCTTAACGATCCGT

780 790 800 810 820 830 840

CACCCCCGACTrCCCACCATCAAATTCATAACCCAGCCTGGAATCATCCGCAACCTTCCATTTAACACTG

850 880 870 880 890 900 910

25 CGCGCCTCGCCGTCAATTACAACCCCCrrCACCTTCAAGCTCTrCCACCCACCGCACTrCCTTCGCATAT

920 930 940 950 980 970 980

TGCCCTCCCCATACCCCTCCAAACCACTTCTCCTTCCCAGGCCTATGACCCGATCGTGGAGCAACCCGCA

990 1000 1010 1020 ' 1030 1040 1050

ATCGCCCCCACCGCTTTTATCATGGTOGCCAATGGCCACCACCCATTTGGTTTCGAATTCTCCCCCACCA

30 1080 1070 1080 1090 1100 1110 1120

CCATCCCAAACCACGTGCTCGACGCGAATGGTAGCATCCTGCACACCAACCACTCCTTGCTTCAGCACCG

1130 1140 1150 1180 1170 1180 1190

CAAAAATGAGAAAGAGCTCCATCCCTTACCGCACTCATGGAATCGCCACCAGCGTATGCAGTTCCTCCTC

38 103053 1200 1210 1220 1230 1240 1250 12β0

CACGGGTTCGACGCCACCAAACAGCCATTrGCCCAGCTCTGGGCCGACGAAGACAATTATCCCTTTAGCA

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 tctgccccgcttacgaggagcgcaacaccagagccgccactctgttcaatatcatctacgaccatgcccg 5 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 tagacacgcaaccctgccccttcgccggccgaccaaccctgatgagatgtttctcatccggtttgacgag 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470

GACCACCAGAGCTCTGCCCTCAACGCCAGGCTTTCAAGGCTCrrCATGACCACCCAATGCATCTnTGTA

1480 1490 1500 1510 ' 1520 1530 1540

TCTACCTTCAACCCACTCCGTCTTCACTTCTTCGCCCGCACTGCCTACCGTTTOTACCATCTCACTCATA

10 1550 1560 1570 1580 1590 1800 1610

TAAATGTCTAGCCCCTACCTACACTATACCTAAGGCAGACAACCCTAGACTGATTAACCTACCCCCCTAT

1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 actaccccgatctctacatacaacatttagtacagattagcatgcctaactaatttaacttcagcattct 15 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750

CCCCTTCATATTGATTnCATCCATTATACACTCTTAATCCnTCCCCCTACAAGCCCNATATATACGAC

1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820

CATAGGGTGTGGAGAACAGGGCTTCCCCTCTOCTrCGCCGTACTTAAGCTATATATTCTACACGCCCAAT

1830 1840 1850 I860 1870 1880 1890

ACTCAATGTCCCCTTAGCACCTAACCCCCACTCTACCGTAAGTGCCGGTGATATACCTGAGAACTCTTAA

20 1900 1910 1920 1930 1940 1950 I960

GACTGAAGACAGCATATCACGCGTTACCCTGCACCGTACCTACTACCTTCAATATCACTCTTTCAGCATG

1970

CACAGGGTCGAC

25 Esimerkki 15 PAT-geenin DNA-sekvenssi Tässä DNA-sekvenssissä oleva koodaava alue osoitettiin vertaamalla kokeellisesti määritettyjä aminohappo-osasekvenssejä tämän DNA-sekvenssin koodauskapasiteettiin. 30 Siten on osoitettu, että tässä geenissä on läsnä kolme intronia. Ne identifioitiin lisäksi intron-ekstron-konsen-sussekvenssin avulla (Rambosek ja Leach, Critical Reviews in Biotechnology 6, 357 - 393, 1987), 39 103053

10 20 30 40 50 60 TO

GTTGATGTCCCATCACTCTCATGCTATGCTCCCAGATTGGTGGCTACGCCAATATAAATCTCACCATGCA

80 90 100 110 120 130 140 gttccgcctccatcatcatccccaggaccccgtttgtcatctccgtcacccacgtctcagttgtttaccc 5 150 160 1T0 180 190 200 210 atcttcccacccgcagcagaaatccttcacatcctctgtcaagccactccctttgaagtaactgctccac

MetLeuHialleLeuCisGlnGlyThrProPheClu 220 230 240 250 260 270 280 tcaataccacattttttccttctgaatcttcccagttctcacctgatccagatcccctaccaacatcgct

IleGlyTyrGluHiaClyS

10 290 300 310 320 330 340 350 ctgctgccaaacccgtcatagccacaaccattgacttccccgtcgatctcatccgacggaaaaccaacaa erAlaAlaLysAlaVallleAlaArgSerlleAapPheAlaValAepLeuIleArgClyLysThrLysLy 360 370 380 390 400 410 420 gacgcacgaagagcttaaacaggtactctcccaactgggccgcgtgatcgacgaaacatggcccaaatac sthrAspGluGluLeuLysGlnValLeuSerGlnLeuGlyArgVallleGluGluArgTrpProLysTyr 15 430 440 450 460 470 480 490

TACGAGGACATTCGCGGTCAGTGCCACTTCCCTCTTTCCTACATTTTCTCCACCAATGCTCACCGATGAC TyrGluGluIleArgG

500 510 520 ^ 530 540 550 560 cccccaaaaaccacctattccaaacggcgctgaaccccatctctccgagattgtcatccttaatacccgc lylleAlaLysGlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAanThrArg 20 570 580 590 600 610 620 630

acgcaatttccataccccctcaacccagcccgtgatcgctgcaccactgcctattctcaacitccaaatg ThrGluPheAlaTyrGlyLeul.ysAlaAlaArgA5pGlyCysThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAsnG

640 650 660 670 680 690 700 GACCCCTCCACCCCCAAAACTCCCATCTACCTTAACACAl ITl'ACCTCCTCAriT lATTCCATCCAATTr lyAlaLeuGlnGlyGlnAanTrpAap • 25 ” 710 720 730 740 750 760 770

GC CC C GACTAATTTGGITGTTCAAGTTCTTTTCTGCCACCAAAGAGAACCTGATCCGGTTAACCATCCGT

PhePheSerAlaThrLysCluAanLeuIleArgLeuThrlleArg 780 T90 800 810 820 830 840 CACCCCGGACTTCCCACCATCAAATTCATAACCCAGGCTCCAATCATCGGCAACCTTGGATITAACAGTG ClnAlaClyLeuProThrlleLysPhelleThrGluAlaClyllelleGlyLysValClyPheAsnSerA 30 850 860 870 380 890 900 910 CCGGCCTCGCCCTCAATTACAACGCCCTTCACCTTCAACCTCTTCGACCCACCGCAGTTCCTTCCCATAT laClyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuClnClyLeuArgProThrGlyValProSerHisll 920 930 940 950 960 970 980 tgccctccccatagcgctccaaagcacttctccttcccaggcctatcaccgcatcctgcagcaaggcgca eAlaLeuArglleAlaLeuGluSerThrSerProSerGlnAlaTyrAspArglleValGluClnClyGly 35 40 103053 990 1000 1010 1020 1030 1040 10S0

ATCCCCCCCAGCCCTTTTATCATOCTCGCCAATCCCCACCACCCATTTGCrrrTCCAArrCTCCCCCACCA MetAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAsnClyHiaGluAlaPheGlyLeuQluPheSerProThrS

ΙΟβΟ 1070 1080 1090 1100 1110 1120 5 ccatcccaaagcaggtgctccacgcgaatgctagcatcgtccacaccaaccactgcttgcttcagcacgg erlleArgLysGlnValLeuAspAlaAsnGlyArgMetValHijThrAsnHiaCysLeuLeuClnHisGl 1130 1140 1150 . 1160 1170 1180 1190 caaaaatgagaaagagctcgatcccttaccgcactcatcgaatcgccaccagcgtatgcacttcctcctc yLyaAsnGluLysGluLeuAspProLeuProAspSerTrpAanArgHiaGlnArgMetCluPheLeuLeu 1Q 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1290 GACGGCTTCGACGGCACCAAACAGGCATTTGCCCAGCTCTGGCCCGACCAAGACAATTATCCCTTTACCA AspGlyPheAspGlyThrLysGlnAlaPheAlaGlnLeuTrpAlaAapGluAapAanTyrProPheSerl 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 TCTCCCCCGCTrACCACCAGCCCAAGAGCACAGCCGCGACrCTCTTCAATATCATCTACCACCATCCCCG leCysArgAlaTyrCluGluClyLysSerArgGlyAlaThrLeuPheAanllelleTyrAapHiaAlaAr 15 1340 1350 1360 1370 1330 1390 1400 tacacacgcaaccgtccggcttggccggcccaccaaccctgatgacatctttgtcatccgctttcaccag gArgGluAlathrValArgLeuGlyArgProThrAsnProA3pGluMetPheValMetArgPheA3pGlu 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 cagcaccacacgtctcccctcaacgccacgctttgaaggctcttcatcaccagccaatgcatcttttgta

GluAspCluArgSerAlaLeuAsnAlaArgLeu*·· 20 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 tgtagcttcaacccactccgtcttcacttcttcccccgcactgcctaccctttctaccatctgactcata 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 taaatgtctaccccctacctacactatacctaacccacagaagcctacactgattaacgtacgcccctat 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680

25 ACTACCCCCATCTCTACATAGAACATTrAGTAGAGATTACGATCCCTAACTAATTTAACTTCAGCATTGT

1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 ccccttcatattcattttcatccattatacactcttaatcctttccccctagaagcccnatatataccac 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1320

CATACCGTCTGGACAACAGGCCTTCCCCTCTGCTTCGCCCTACTTAACCTATATATTCTACACCCCCAAT

30 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890

ACTCAATGTGCCCTTAGCACCTAAGCCCCACTCTACCCTAACTCCCCGTGATATAGCTCACAACTCTTAA

1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960

CACTGAACACAGGATATCACGCGTTACCCTGCACCGTACCTACTACCTTCAATATCACTCTTTCAGGATG

1970

CACAGCG7CGAC

35 « 4i 103053

Esimerkki 16 DNA-sekvenssistä johdettu PAT:n aminohapposekvenssi Tämän polypeptidin molekyylipaino on 40 000 D. Jos se katkaistaan aminohappojäännöksien 102 ja 103 välistä, 5 saadaan kaksi polypeptidiä: Yksi 11 500 daltonin polypep-tidi, jossa on polypeptidi 2:n N-terminaalinen aminohappo-sekvenssi; kaikki peptidifragmentit voidaan löytää jälleen tästä aminohapposekvenssistä AS-osasekvenssit 9 - 24). tämä on siten "PAT:n 8 kD:n komponentti".

10 Yksi 28 500 daltonin polypeptidi, jossa on polypep tidi l:n N-terminaalinen aminohapposekvenssi; kaikki peptidifragmentit voidaan löytää jälleen tästä aminohapposekvenssistä AS-osasekvenssit 2, 3, 4, 5, 7, 8). Tämä on siten "PAT:n 30 kD:n komponentti".

15 10 , 20 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheCluIleClyTyrGluHiaGlySerAla 30 40

AlaLysAlaVallleAlaArgSerlleAspPheAlaValAapLeuIleArgGlyLysThr 50 60 20 LysLysThrAspGluGluLeuLysGlnValLeuSerGlnLeuGlyArgVallleCluGlu 70 80

ArgTrpProLysTyrTyrCluCluIleArgGlylleAlaLyaGlyAlaGluAxgAapVal 90 100

SerGluIleValMetLeuAsnThrArgThrCluPheAlaTyrGlyLeuCyaAlaAlaArg 25 no 120

AapClyCysThrThrAlaTyrCysGlnLeuProAanGlyAlaLeuClnClyClnAanTrp 130 140

AspPhePheSerAlaThrLysCluAsnLeuIleArgLeuThrlleArgGInAlaGlyLeu 150 160

ProThrlleLysPhellsThrCloAlaGlytlellaClyLyaValGlyPheAsnSerAla 30 170 180

GlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnClyLeuArgProThrClyValPro 190 200

SerHisIleAlaLeuArglleAlaLeuCluSerThrSerProSarClnAlaTyrAapArg 210 220 35 IleValCluGlnGlyClyMetAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAanGlyHijClu 230 240

AlaPheClyLeuGluPheSerProThrSerlleArgLysClnVaILeuAspAlaAsnCly 42 1 0 3 0 5 3 250 290

ArgMetValHiaThrAanHijCyaLeuLeuGlnHijClyLyaAjnGluLyaCluLeuAap 270 230

ProLeuProAspSerTrpAanArgHisClnArgMetCluPheleuLeuAspClyPheAjp 5 290 300

GlyThrLysGlnAlaPheAlaClnLeuTrpAlaAapCluAapAanTyrProPheSerlie 310 320

CyaAriAlaTyrCluCluClyLyaSerArgGlyAlaThrLeuPheAanllelleTyrAap 330 340 10 HisAlaArgArgGluAlaThrValArgLeuGlyArgProThrAanProAapCluMetPhe '350'

ValMetArgPheAapCluGluAapGluArgSerAlaLeuAanAlaArgLeu \

Esimerkki 17 15 DNA:sta johdetun PAT:n aminohapposekvenssin vertaaminen kokeellisesti määritettyihin aminohapposekvensseihin 30 kD:n yksikkö/polypeptidi 1 (N-terminaalinen aminohapposekvenssi ) 2 ThcThrAlaTyrCysGlnLeuPcoAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAnsTrpAspPhePhe 20 104 ThrThrAlaTyrCysGlnLeuPcoAsnGlyAlaLeuGlnGlyGlnAsnTcpAspPhePhe 22 SecAlaThrLysGluAsnLeuIleArg 30 124 SecAlaThrLysGluAsnLeuIleAcg 132 AS-osasekvenssi 2 (trypsiinin avulla saatu polypep-25 tidi l:n peptidifragmentti): 1 GlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAspHlsAlaArg 13 311 GlyAlaThrLeuPheAsnllelleTyrAspHisAlaArg 323 AS -osasekvenssi 3 (trypsiinin avulla saatu polypep-30 tidi l:n peptidifragmentti): 1 ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 11 333 ProThrAsnProAspGluMetPheValMetArg 343 AS -osasekvenssi 4 (trypsiinin avulla saatu polypep-35 tidi l:n peptidifragmentti): e e 43 103053 1 GluLeuAspProLeuProAspSerTrpAsnAcg 11 258 GluLeuAspProLeuProAapSerTrpAsnArg 268 AS-osasekvenssi 5 (trypsiinin avulla saatu polypep-5 tidi l:n peptidifragmentti): * 1 MetGluPheLeu—-AspGlyPheAspGlyThcLys 12 272 MetGluPheLeuLeuAspGlyPheAspGlyThcLys 283 AS-osasekvenssi 7 (trypsiinin avulla saatu polypep-10 tidi l:n peptidifragmentti): 1 IleAlaLeuGluSerThrSecProSerGlnAlaTyrAspArg 14 187 IleAlaLeuGluSerThcSecPcoSecGlnAlaTycAspArg 200 AS-osasekvenssi 8 (trypsiinin avulla saatu polypep-15 tidi l:n peptidifragmentti): 1 ValGlyPheAsnSerAlaGlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeu 155 ValGlyPheAsnSecAlaGlyValAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnGlyLeu 21 ArgProThrGlyValProSerHisIleAlaLeuArg 32 175 ArgProThrGlyValPco5erHisIleAlat.euAeg 186 20 8 kD:n yksikkö I/polypeptidi 2a 1 MetLeuHlslleLeuCysGlnGlyThrProPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThcPcoPheGluIleGlyTyrGluHisGlySerAla

AlaLysAlaVallleAlaArgSerlleAspPheAlaValAsp 34

AlaLysAlaVallleAlaArgSarlleAspPheAlaValAsp 34 - 25 8 kD:n yksikkö II/polypeptidi 2b l MetLeuHlsIleLeyCysGlnGlyThcPcoPheGlutleGlyTycGluHlsGlySe rAla 1 MetLeuHisIleLeuCysGlnGlyThrProPheGlutleGlyTycGluHlsGlySerAla

AlaLysAlaValHeAlaArgSerIleAspPheAlaValAspLeuIleAtgGlyl.ysThr 4 0 Ai a Ly s VallieAlaArg_HeAspPheAlaValAspLeu_Gly The 40 AS-osasekvenssi 9 (trypsiinin avulla saatu polypep-tidi 2:n peptidifragmentti): 1 ThrGluPheAlaTytGlyC.euL.ys 8 35 90 ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97 • 9 m 44 103053 AS-osasekvenssi 10 (trypsiinin avulla saatu poly-peptidi 2:n peptidifragmentti): 1 TyrTyrAnyGluIleArg 6 65 TyrTycGluGluIleArg 70 5 AS -osasekvenssi 11 (trypsiinin avulla saatu poly-peptidi 2:n peptidifragmentti): 1 TrpProLys 3 62 TcpPtoLys 64 10 AS -osasekvenssi 12 (trypsiinin avulla saatu poly-peptidi 2:n peptidifragmentti): 1 SecIleAspPheAlaValAspLeuIleArg" 10 29 SerlleAspPheAlaValAspLeuIleArg 37 15 AS -osasekvenssi 13 (trypsiinin avulla saatu poly-peptidi 2:n peptidifragmentti): l AspValSerGluIleValMetLeuAsnTheArg 11 79 AspValSerGluIleValNetLeuAsnThcAcg 89 20 AS -osasekvenssi 14 (trypsiinin avulla saatu poly-peptidi 2:n peptidifragmentti): 1 GlnValLeuSerGlnLeuGlyAtg β 49 GlnValLeuSerGlnLeuGlyArg 56 25 • « .

AS-osasekvenssi 15 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 6 CysGlnGlyThcPcoPheGlu 12 1 CysGlnGlyThrProPheGlu 7 30 AS-osasekvenssi 16 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 65 TyrTyrGluGluIleArgGlylleAlaLys 74 1 TyrTyrGluGluXleArgGlylleAlaLys 10 » < 45 103053 AS -osasekvenssi 17 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 49 GlnValLeuSecGlnLeuGlyArgVallleGluGluAcgTrpProLye 64 1 GlnValLeuSecGlnLeuGlyAcgVallleGluGluArg ProLys 16 5 AS -osasekvenssi 18 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 75 GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThcArg 89 1 GlyAlaGluArgAspValSerGluIleValMetLeuAsnThcArg 15 10 AS -osasekvenssi 19 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 23 AlaVallleAlaArg 27 1 AlaVallleAlaArg 5 15 AS-osasekvenssi 20 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 42 LysThrAspGluGluLeuLys 48 1 LvS AspGluGluLcuLys 7 20 AS-osasekvenssi 21 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 71 GlylleAlaLys 74 1 GlyTlAlaLys 4 : 25 AS-osasekvenssi 22 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti):

57 VallleGluGluArg SI

1 VallleGluGluArg 5 30 *. AS-osasekvenssi 23 (lysyyliendopeptidaasin avulla saatu polypeptidi 2:n peptidifragmentti): 87 AsnThrArgThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 97 1 AsnThr ThrGluPheAlaTyrGlyLeuLys 11 35 w < 46 1 0 3 0 5 3

Yhteenveto AS-osasekvenssi asema DNArsta johde tussa AH-sekvenssissä N-terminaalinen AH-sekvenssi, 30 kD:n yksik-5 kö/polypeptidi 1 104 - 113 N-terminaalinen AH-sekvenssi, 8 kD:n yksik-kö/polypeptidi 2a 1-34 N-terminaalinen AH-sekvenssi, 8 kD:n yksik-kö/polypeptidi 2b 1-40 10 AS-osasekvenssi 2 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 311 - 323 AS -osasekvenssi 3 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 333 - 343 AS-osasekvenssi 4 (trypsiinin avulla saatu 15 polypeptidi l:n peptidifragmentti): 258 - 268 AS -osasekvenssi 5 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 272 - 283 AS-osasekvenssi 7 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 187 - 200 20 AS -osasekvenssi 8 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi l:n peptidifragmentti): 155 - 186 AS-osasekvenssi 9 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 90 - 97 AS -osasekvenssi 10 (trypsiinin avulla saatu 25 polypeptidi 2:n fragmentti): 65 - 70 AS -osasekvenssi 11 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 62 - 64 AS -osasekvenssi 12 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 28-37 30 AS-osasekvenssi 13 (trypsiinin avulla saatu ^ polypeptidi 2:n fragmentti): 79 - 89 AS-osasekvenssi 14 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 49-56 AS-osasekvenssi 15 (lysyyliendopeptidaasin 35 avulla polypeptidi 2:sta): 6-12 47 103053 AS-osasekvenssi 16 (lysyyliendopeptidaasin avulla polypeptidi 2:sta): 65 - 74 AS-osasekvenssi 17 (lysyyliendopeptidaasin avulla polypeptidi 2:sta): 49 - 64 5 AS-osasekvenssi 18 (lysyyliendopeptidaasin avulla polypeptidi 2:sta): 75 - 89 AS-osasekvenssi 19 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 23 - 27 AS-osasekvenssi 20 (trypsiinin avulla saatu 10 polypeptidi 2:n fragmentti): 42 - 48 AS-osasekvenssi 21 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 71 - 74 AS-osasekvenssi 22 (trypsiinin avulla saatu polypeptidi 2:n fragmentti): 57 - 61 15 AS-osasekvenssi 23 (lysyyliendopeptidaasin avulla polypeptidi 2:sta): 87 - 97

Esimerkki 18

Sellaisen DNA-fragmentin osasekvenssi, joka sijaitsee isopenisilliini N -syntetaasin geenin (ips) ja 20 PAT:n geenin välissä Tämä sekvenssi alkaa jaksolla "GGATCC", restriktio-entsyymin BamHl tunnistussekvenssillä, joka sijaitsee ips-geenissä. On esitetty tämän geenin viimeiset 34 (C-termi-naalista) kodonia; ne on identifioitu vertaamalla julkais-25 tuun DNA-sekvenssiin (Carr et ai., Gene 48, 257 - 266, 1986). Välialueen jälkeen seuraa pat-DNA-sekvenssin asema 1 kohdalla 1442. Tämä DNA:n osasekvenssi on merkitty kuviossa 4 (B).

Tämä DNA:n osasekvenssi on tärkeä, koska se todis-30 taa ips- ja pat-geenin välisen ahtaan kytkennän ja koska kaikki olennaiset säätelyelementit pat-geenin transkriptiota ja translaatiota varten sijaitsevat tässä fragmentissa.

103053 48 10 20 30 40 50

CCATCCTACCAACCAACACCCCAAGACCCATCACCCCCCAATCTCCTACG AspProSerLysGluAspGlyLysThrAapGlaArgProIleSerTyrC

60 70 80 90 100 gccactatctgcagaacggattacttagtctaatcaacaacaaccgccag g lyAspTyrLeaGlnAanGlyLeuValSerLeuIleAsnLysAanGlyGln 110 120 130 140 150 acatcaaagggcccatccatcgcaccgccatccaaatcccggactctcac

ThrEnd 850

NNNNNNNNNNNNNNNMNN 1250 bp NNNNNKNNNNVHNNHNNNNN

10 1410 1420 1430 1440 1450

CAACACTACCCGCATCCAGCAGGCATACTCCACGTGCCCCAGTTCATCTC

1460 1470 1480 1490 1500 ccatcagtgtcatgctatggtcccagattggtggctacggccaatataaa 1510 1520 1530 1540 1550

15 TCTCAGCATCCACTTCCCCCTCCATCATCATCCCCACCACCCCCCCAGCA

1560 1570 1580 1590 GAAATGCTTCACATCCTCTCTCAAGGCACTCCCTTTCAAGTA MetLeuHisrleUeuCysGlnClyThrProPheClu 20 Esimerkki 19

Plasmidin pBC2001 kokoonpaneminen ja pat-geenin ilmentäminen E. colissa a) Penicillium chrysogenumin cDNA-geenipankin kokoonpaneminen 25 5 pg poly( A)*-RNA: ta, jonka eristäminen ja puhdista minen on kuvattu esimerkissä 10, annetaan reagoida käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä oligo-dT-alukkeen kanssa neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnä ollessa komplementaarisen yksisäikeisen DNA:n muodostamiseksi. Siitä 30 muodostetaan kaksisäikeinen molekyyli käyttäen entsyymiä RNaseH ja DNA-polymeraasia (Gubler ja Hoffman, Gene 25, 263, 1983). Sen jälkeen kun on lisätty sopivat EcoRl-adap-terit, mitä tarkoitusta varten käytetään entsyymejä poly-nukleotidikinaasi ja T4-DNA-ligaasi, saadaan lineaarinen, 35 kaksisäikeinen cDNA, joka voidaan sijoittaa kloonausvekto- • 49 103053 reihin. Näitä reaktioita varten on edullista käyttää kaupallista cDNA-synteesivälineistöä (Pharmacia). Se sisältää tärkeimmät entsyymit ja adapterioligonukleotidin. Reaktio suoritetaan valmistajan ohjeiden mukaan. Siten syntetisoi-5 tu kaksisäikeinen cDNA, jossa on EcoRl-päät, kloonataan vektoriin gtlO (Huynh et ai., DNA cloning, Glover, D.M. toim., Oxford, 1, 49, 1985). 80 μΐ cDNA-valmistetta sekoitetaan 16 pl:n kanssa gtlO-DNA:ta (8 μg), jota on aikaisemmin pilkottu EcoRl:llä ja käsitelty alkalisella fosfa-10 taasilla (Maniatis et ai.). Sen jälkeen kun on lisätty 3 μΐ 3 M natriumasetaattia (pH 5,2) ja 250 μΐ etanolia, seoksen annetaan saostua 20 tunnin ajan -20 “C:ssa ja se liuotetaan sen jälkeen 60 pl:aan 10 mM tris-HCl:a (pH 7,5), jossa on 1 mM EDTA:a. Ligaatiota suoritetaan 15 12 eC:ssa 20 tunnin ajan 66 mM tris-HCl:ssa (pH 7,5), jos sa on 1 mM spermidiiniä, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitolia, 0,2 mg/ml BSA:a (naudan seerumin albumiinia), 0,5 mM ATP:a, lisäämällä 6 U T4-DNA-ligaasia. Ligaatioseos pakataan in vitro proteiiniuutteiden avulla ("pakkausseos") ja 20 sijoitetaan viljelylevyille E. coli -kannan C600hfl kanssa (Huynh et ai.). Tarpeelliset menetelmät on kuvattu (Maniatis et ai.). Sellaisessa testissä voidaan saada enemmän kuin 5 x 105 plakkia.

b) pat-spesifisten cDNA-kloonien eristäminen ja 25 subkloonaus M13mpl9:ssä

Suoritetaan plakkihybridisaatio, kuten on kuvattu simerkissä 13, käyttäen noin 40 000 Penicillium chrysoge-num -cDNA-geenipankin plakkia. Indikaattorikantana käytetään E. coli -kantaa C600hfl (Huynh et ai.). Sen jälkeen 30 kun on osittain pilkottu EcoRl:llä, rekombinantti-gtlO- faagien DNA yhdistetään ligaation avulla EcoRl:llä pilkotun Ml3mpl9-RF (replikatiivinen muoto) -DNA:n kanssa ja transfiksoidaan. Identifioidaan rekombinantti-Ml3mpl9-RF-DNA:n yksittäisiä klooneja ja varmistetaan oikeiksi rest- 35 riktiokartoituksen avulla.

103053 c) Rekombinantti-Ml3mpl9-kloonin DNA in kohdennettu mutageneesi Ncol:n leikkauskohdan lisäämiseksi.

Syntetisoidaan 41-meeri-oligonukleotidi, jolla on seuraava sekvenssi 5 5'-TCCGACCCGCAGCAGCCATGGTTCACATCCTCTGTCAAGGC-3' DNA-sekvenssi on muuttunut pat-cDNA:n DNA-sekvens-siin verrattuna siten, että on saatu Ncol:n leikkauskohta, 10 johon kuuluu N-terminaalista metioniinijäännöstä vastaava ATG. Oikealle on 20, vasemmalle 15 nukleotidia, jotka ovat identtisiä pat-cDNA-sekvenssin kanssa. 5 pmoolia fosfory-loitua oligonukleotidia ja 0,5 pmoolia yksisäikeistä M13mpl9-DNA:ta sekoitetaan ja kuumennetaan 10 piissä 20 mM 15 tris-HCl:a (pH 7,5), jossa on 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, viiden minuutin ajan 65 °C:ssa ja 20 minuutin ajan 42 "Cissa. Suoritetaan käsittely Klenow-polymeraasilla, T4-DNA-ligaa-silla ja Sl-nukleaasilla Eghtedarzadehin ja Henikoffin mukaan (Nucl. Acids Res. 14, 5115, 1986): 10 μΐ liuosta, 20 jossa on kaksi yksikköä Klenow-polymeraasia ja kolme yksikköä T4-DNA-ligaasia 20 mM tris-Cl:ssa (pH 7,5), jossa on 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia, 0,8 mM kutakin neljästä dNTPista, 1 mM ATPia, pidetään tunnin ajan 42 "Cissa. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTAia (lopullinen konsen-25 traatio 25 mM) ja kuumennetaan 10 minuutin ajan 70 "Cissa. Sen jälkeen kun on saostettu etanolilla, pelletti liuotetaan 10 pliaan tris-HClia (pH 8), jossa on 1 mM EDTAia. Sen jälkeen kun on lisätty 15 pl 30 mM kaliumasetaattia (pH 4,6), jossa on 0,25 M NaCl, 1 mM ZnCl2, 5 % glyserolia, 30 seitsemän yksikköä Sl-nukleaasia, inkuboidaan 20 minuutin .· ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kun on transfektoitu sopiva E. coli -kanta (esim. JM101; Yanisch-Perron et ai., Gene 33, 103, 1985) reaktiovalmisteen avulla ja eristetty RF-DNA, voidaan muuttuneet DNAit identifioida pilkkomalla 35 Ncolillä.

* 51 103053 d) Ncol -Hindlll-fragmentin, jossa on pat-cDNA, kloonaaminen plasmidiin pKK233-2.

Rekombinantti-M13-kloonin RF-DNA:ta, j.oka sisältää pat-cDNA:n, jossa on lisätty Ncolrn leikkauskohta, pilko-5 taan Ncol:lläja HindIII:lla. Plasmidia pKK233-2 (Amann ja Brosius, Gene 40, 183, 1985) pilkotaan samoin Ncol:llä ja Hindlllrlla. Kahden DNA:n ligaatio tapahtuu 20 tunnin aikana 14 eC:ssa liuoksessa, jossa on 66 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM spermidiiniä, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitolia, 10 0,2 mg/ml BSA:a, 0,5 mM ATP:a, lisäten 2 U T4-DNA-ligaa- sia. Sopivan e. coli -kannan (esim. JM88; Yanisch-Perron et ai., Gene 33, 103, 1985) transformaation jälkeen eristetään yksittäisiä plasmidia-DNA:itä ja ne karakterisoidaan restriktiokartoituksen avulla. Plasmidille, joka si-15 sältää Ncol -HindiII-restriktiofragmentin, jossa on pat-cDNA, plasmidissa pKK233-2, on annettu nimitys pBC2001.

e) pat-geenin ilmentäminen E. colissa E. coli RB791 (Amann ja Brosius, Gene 40, 183, 1985) transformoidaan pBC2001:llä. 50 ml:aan LB-elatusai-20 netta (litraa kohden: 10 g bactotryptonia, 8 g NaCl, 5 g hiivauutetta; pH 7,5 säädetään NaOH:n avulla) istutetaan kannan RB791 (pBC2001) yksittäinen kolonni ja sekoitetaan käyttäen 200 kierrosta minuutissa 37 eC:ssa, kunnes on saavutettu optinen tiheys 0,5 (mitattuna aallonpituudella 25 600 nm). Lisätään 5 ml 0,1 M IPTG:a (isopropyyli-B-D-tio- galaktosidi). Sen jälkeen sekoitetaan käyttäen 200 kierrosta minuutissa kolmen tunnin ajan 37 *C:ssa. Sitten solut sentrifugoidaan (10 minuuttia, 5 000 kierrosta minuutissa, 20 *C, Beckmann JA20) ja niitä käsitellään edelleen 30 E. colissa ilmentyneen proteiinin identifioimiseksi. Tämä identifiointi voidaan suorittaa E. colin kokonaisproteii-nin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla, "Western-Blot"-menetelmän avulla käyttäen PAT:lie spesifisiä vasta-aineita tai entsymaattisen osoittamisen avulla.

« 52 103053

Esimerkki 20 pat-geenin transformointi PeniciIlium chrysogenu- mille a) Plasmidin pBC2002 kokoonpaneminen 5 Plasmidi pHS103 (Kolar et ai., Gene 62, 127, 1988)

pilkotaan täydellisesti EcoRl:llä ja sille suoritetaan jälleen ligaatio EcoRlrllä ja Sällillä pilkotun M13mpl9-RF-DNA:n läsnä ollessa (66 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM

spermidiiniä, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitolia, 0,2 mg/ml 10 BSA:a, 0,5 mM ATP:a, lisäten 2 U T4-DNA-ligaasia 14 "Czssa, 20 tunnin ajan). Transformaation jälkeen on käytettävissä plasmidi, joka sopii Sali-fragmenttien kloonausta varten. Tätä plasmidia pilkotaan Sällillä, aivan samoin kuin rekombinanttiplasmidia, jossa on täydellisen 15 pat-geenin sisältävä 4,8 kiloemäksen Sali-fragmentti (ks. esimerkki 13). Ligaation ja transformaation jälkeen voidaan identifioida plasmidi, jonka muodostaa muunnettu pHS103 ja pat-geenin sisältävä 4,8 kiloemäksen Sali-fragmentti; tälle plasmidille on annettu nimitys pBC2002.

20 b) Penicillium chrysogenum -protoplastien eristämi nen ja transformaatio 2 ml Penicillium chrysogenum P2/ATCC:n tiheää itiö-suspensiota lisätään 200 ml:aan Penicillium chrysogenumil-le tarkoitettua steriiliä vähimmäiselatusainetta, joka on 25 yhden litran erlenmeyerpullossa [litraa kohden: 3 g NaN03, 0,5 g MgS04 · 7H20, 0,5 g KC1, 10 mg FeS04 · 7H20, 20 g sakkaroosia, 13 g KH2P04 ja 1 ml hivenalkuaineseosta (100 ml varten: 0,1 g FeS04 · 7H20, 0,9 g ZnS04 · 7H20 , 0 , 04 g CuS04 · 5H20, 0,01 g MnSo4 · H20, 0,01 g H3B03, 0,01 g 30 Na2HP04 · 2H20)] ja sekoitetaan käyttäen 250 kierrosta mi-nuutissa 20 tunnin ajan 25 "C:ssa. Protoplastien eristäminen ja puhdistaminen tapahtuu Yeltonin et ai. mukaan (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, 1470, 1984). Huovasto sentrifugoidaan erilleen ja pestään kaksi kertaa 0,9 M 35 NaCl:ssa ja uudelleensuspendoidaan 20 ml:aan 0,9 M NaCl:a, 0 53 103053 jossa on 5 mg/ml novotsyymi 234:3. Inkuboidaan 30 eC:ssa 1,5 tunnin ajan. Reaktiovalmiste sentrifugoidaan (Beckman-jäähdytyssentrifugi JS 7,5, 1 500 kierrosta, minuutissa, 20 eC, 5 min). Protoplastipelletti pestään kaksi kertaa 5 0,9 M NaCl:lla ja sitten kerran 1 M sorbitoli -liuoksessa, jossa on 50 mM CaCl2. Protoplastit uudelleensuspendoidaan 0,2 ml:aan 0,1 M sorbitoli -liuosta, jossa on 50 mM CaCl2 (noin 0,5 - 5 x 108 protoplastia/ml).

Transformaatiota varten käytetään 5 pg pBC2002:ta, 10 joka on 10 mM tris-HCl:ssa (pH 7,5), jossa on 1 mM EDTA:a ja se lisätään protoplastisuspensioon. Lisätään 12,5 μΐ liuosta, jossa on 25 % polyetyleeniglykolia (BDH), 10 mM tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2 (steriilisuodatettuna). Inkuboidaan 20 minuutin ajan jäissä. Lisätään 0,5 ml liuosta, 15 jossa on 12,5 μΐ 25 % polyetyleeniglykolia (BDH), 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM CaCl2 (steriilisuodatettuna); seosta inkuboidaan viiden minuutin ajan 20 eC:ssa. Sen jälkeen kun on lisätty 1 ml liuosta, jossa on 0,9 M NaCl, 50 mM CaCl2, sekoitetaan perusteellisesti ja seos lisätään 20 3 ml:aan vähimmäiselatusainetta, jossa on 0,5 % agaria ja 20 pg fleomysiiniä/ml (48 *C). Transformaatiovalmisteet sijoitetaan levyviljelmiksi vähimmäiselatusainelevyille (yllä kuvatun mukainen vähimmäiselatusaine, jossa on 1,6 % agaria ja 20 pg fleomysiiniä/ml).

·.·. 25 Eri kolonioista eristetty DNA voidaan karakterisoi da "Southern"-hybridisaation avulla käyttäen radioaktiivisesta merkittyä pat-DNA:ta. Transformanteista todetaan sellaiset, jotka sisältävät useita kopioita pat-geeniä useamman integroitumistapahtuman johdosta. Sellaisia kan-30 to ja tutkitaan myöhemmin koefermentaatioiden avulla li- sääntyneen penisilliininmuodostuksen suhteen.

« 54 103053 C c .*2 ° ° o o o o ° qj “on -a —«nc -—------ _j 2 “ c e 3 a n

5 “ ji r- M

<0 H o 3 “ . · U ><-lO-r<*n ^ o O ^ aj ^ „ -e ^ m _ ™ o KT\-- •r-j <0 * W ^ Z « S Ϊ ° ° o . o o o s- .fg co CO -Π ^ u w* - 11 ' ----"- - -----—----- ^ u-i 4 u) ^ m .40 o o a o o a a <a

«-10 9* 5 C

e r. *s - ja CM u -0 - u

00 »» >\ (3 -H

-» <r a o» a * n :iq ·· μ v » ^ s f* ^ s « s o’3 ^ < ·«§«--: s I 3« 5· ^ ~ m ° ° I pT ° ° e" > :n u 2 «" a δ s I - « s s § $-T7T ss s C 7*S £3 · ° ° ° ° ° « a O ^

4) -° 49 n S'* 3 1 X

OO c * e c α H

O g = 2 a.-------« 5 - " ΐι§ b „ “ - = -v » ·. g, ° £ i;2 s st atss3’3 U 2 Ϊ-«<··Η _____ U - <1 § 1|B« . 1 ! ! !· 1 i! m ;3 ~ -h 3 »o ’ - N uS i d * s -o 5 ^^___iJ-S ^ 3 -- as - U 3d 4 u h c S -7 <m *. 'V. - o « oj c a T w» «λ “> n H hi ί CM '2 £ M .3

_ S •d g I

(u ·» -T73 2 1 3 C u Ifl 60 U 3 t.

g 2ί" s K « 3 SSSa«S

M *· g ΐ 5 S 3 st a a s 5 2 ,-2 m~ ~ " ~ N " " ^ s t _r-----ί ” C n 3 o 8°·»« 5 H 5 Λ *3 5 i? ^ Λ 2 wt: ji <J O H'-' " « HQ «g

Cu us w “ --- u pd u

— I o O 41 O

® M 3 n*-4 a -2 22 o O O o o * 0+ "

tn O» r- * ? O

jp o u >*ί « > *-i a « · · * 3 «« «I ·Η -Hr-* u ä ----1—I--a-S“33- , , 2 ,-¾. 9 η ί i a - a; -S - i 2 2^° •h 2 «1 « ^ 3 S3 n h m I u u^na« C I ’»eSSo ^U “ Ο Ο «I <UH 3 ; . C-J «I u Λ 5 MH ? .ng I»» u-oM- 2 ; to «β> u. u, 5 3 ; ί > η,Χηm m . 3d. ns h 5 . te,—( ,-2 h /1/1-^: * c — 30 « a ‘mm -» u H -tSj!» u2« U ««M a 3 V -r-> ΙΛ Π5 -"Ϊ

TiT: mwji u -~ ά * Ά j i u : Sh 3 mu -a ^ 3 n f-1 --1 ΰ? ►>“· 3o u Mo^"2i5.. C U in sagfc·’-' 'H > °·“ . . I 2 d oo 3“ »3 3 Λ Ή ion

-»to J >, " e-2” 30r-a3 M * “ 3 U1 « u u „ ^ -H

o 3 i- E 3 c 5 . 1 « ~ ° u 3 -H-Hugxa . (-< wi u (n λ o. fL n c r( ό -, u h u I I c <» >n e—“ “ 3 NK ’•S ,nl « Η.. ' ' «ΙΟ η -H -M > n S a H OJ um ui » a O f „ fl-l . U ο,οΐη “ n MM ^i "m tn MM « M u« :nO Sui-mo 3-hm S. h 27 ·* UI MM n U >.»l <, l .. -M ui OH · <· ί M s M 3 Su ai I M uul Jl D.OO + ^ _I p 3 nfl 0H * E o *! I rl 41 4 M Q,a >· l—i u 6*C 3 * I (/j Tj m M «4 OH< ^ ^ a u o oa!xo§i «ai t * u » «3 vi -c imcqio ^ i: ^ § « o Ia PauH z: 5zi * omm » aoac^* 2 2 OO 60ΓΛ ° ' X " ; 3g'äJ5S^S S “ oS Γμβ^ a 1¾ i Sss2 ^h|29:» jr? *i3 m isoili

-M S “· 32Sii m c 8 2 ^5 5-3^-3 :22-3 E5h om-S

', 3 0UHII o 4 h n “I ηο3 ACM M (S

* ¢0(¾ «Λ ' c H •’-J [__ I___I_ . 103053 55

•H

* <0 •h öm οοοοσοαασα o o o o o o ooooooooo rt o e u c · rt e O O, S 0 xj o u) . n m ei m 3 O , e r> ->λ I rs. r> rt «o ~ I ~ „~xa . « is ιο . e r> , , oi H I «-» o tn n f3 ·- rtrtrtrt 2 rt rt rt ' rt rt 1 n *| >rj (N O M Π

Zj Π3 ^ *H

-h (q Tj :2 " g

ja u c s ^ 5 S

rt « 3 ιΛ "i >Λ tM r» o vrt ___ ιοβ_ in „ rt U-rH = 'ϊΐΐ'1 's 'S -S I 0^0 I - -2 I I I ^ «o» S «3··« rt — T-rt^n^ rt

G .5 ST -V JS

.. m ™ 3 -s g - 3 ΙΛ----

S " »00 ,H

04 .§ > o ^ «

Sh 5 33 2 S oooooooooo oooooo ooooooooo “ '"1 tn M sr <u mm · (0 rt O.

5 U O -H σι G CG C CC C CCC C

buj ° w rt rt rt rt _ rt rt rt -. rt rt rt rt ,n 2 m <t CU · Jrf (OJ! ®J<i .* Λί ™ .... Ji Λ! j2 _ S* -HJ + -HU 2 I 3 rt 3 3 I 3 .* 3 3 3 I _~2 OI 3 3 3 I £2 3 1 » — .3--2 O H *° -rl -H -rl -rl i H -H -H Ξ ~ -H -H -H ~ -H -

H u> « H «* JS JZ Si JZ SZ JZ JS JS JZ JS JS

u £ u S'« 2 c uiuCijica) c « · ij ·πΐ ^ I <U ^ (O (TJ 3^

w yj u <c U I O -O OIOOOO OlOOOl ^ O O I O 3 I l O

•H -H „ .° 3 J® 3 H

^ s ^ s Ä ° «β - 3- g---- u < s

p to % O +-H

«Η I S U rt OOOOOOOOOO OOOOOO OOOOOOOOO

So ό 2 8 2 'o c CU <u rt -H % £ O- c 3 I h Λ m^-oos-ors^toto ηοΝοιβ 3 te <si tn tn oj n IA a :«Ö ^ *V JS W)NOJNNIO<OW10<0 n n (M Ui o» 3 ΠΝτ0^9»00Ν -ri S ° n *-nriNr-»-fONnn rt π n *- ·^ rt rt n n n pi

:« - :θ Τ’ — , -C

H rt *J .2 ° 3 rtl M 4J M ^ S- W -H Λ X ® rt h ° Ä -3 m n t 0 ortOO to «o to — to , σι_

3 ϋ? 3 j«i s «- ci"tsTto'eTa o"to-to"tn" to"3 r-Λrt-sr~° r-tVrYj'0 e «o o o cT

~™ -HB *-CJts|>- CN>-<M<SI rt (M rt ·— rt rt rt — — 3 , a r-4 Π} m.________ . ~ ' u

Cvi (Λ IL

oo rt V5 r-i 2

• Ή Q

» « C_? 4J ““

Ha c H H H H H H 3 CS CQQQQQQ 3

' 23ΣΣΣ5 S

w v E E £ £ E E o 3 3 g *---- 7 ^ 3 rt3 .5 UJO. UIOOOOO -H 3 g O· § 5 5 ,H H o H o'« «n 3 rt Ϊ3 u u Jc h mm as vT u rt h ^*c c -h αααααα hi

3 rt O r JM rt — H G -H 1 H

, . u e *-* > — a x * Ή rt C H H

• g JS H U ie * * o T -V T 3 -HHHC3

OH 3 U OQO ·Η H *H C H JJ

33 m 5<tt LII ε >,^^.Η.ΗΗ .2 Ξ O < I 3 >sOH«JT3rt 4)-1 5 POO = IXX i_) II.2 So ^c__o- rt rt rt η η·ηο«)Ε·η ΠΓ s>h Eo55 rtrtu ο

u-H U CC ZZZ -° Ss-H u H U JJ

.2.1 c :m °xcc . . ^ -h:« a ui c h « o

r- 1» Ή CJ _i ·— m ^ I — J3 4J *H tQ >s U5 VJ

S3 o to uj rV- * . . * o n nO Ö c «,. n« oc ^n-a -H :tal— L* qUU t— I I ,2, Cl, Q_ Qt_ H- J- :fl(/)U-. -ou_itJj“3j3 —1 “'foeaSQH QH h ai xx tfl <o 2 — n hi ιοί " s 3Qi;;2“s^£i llllss o rt IcccSJJ0000 XZZZHH 55ΣΣΣ5ΣΪ

’ % Ά rtlllllll'ifT S2S5S2 S6EE££EEE

3 Θ ^2°°n^-^u>u> e wnnncmnnm ^ o'o'o"’0^0*0 1-( 4.4-4.4.4.4.4.4-

rt _ —__- —" ~J

H u------1-*--- “ 103053 co I I I ~~

rr V ^ . I

., a * oooooooo

U ¢0 r—I a CO 4J

o -h-j- to c O urn C Ή

tsl CON « O

1 V. °* ossonKsa w

— OU 2 nnflffinn -H

j® -IU ° I—I

C “< m Λ τ'0 00 f* r. to tn ή «ηΝ,-.ΝβΝ . ________ 4j S Sl ti l/TujVf^ tffieVT U w S J= Π) .

« 3 _„_ c U)

w < w -S -H

S ° g ♦ g S » U «3 Cc oooooooo « T3

eT CU u " <u .5· M

° i o a C c c -2 -H

2<Ju c0 c0 c0 ^ ^ r*. ^ a> M

+ CU O , ^ CM ^'VVf «” V

2 ? S S .3cf-.3 §«««-- ^ 2 vo ·η X x .c x r- E * Γ» 3 “ ε

3 >>« -Η ^ g X

** 4J-1-1U 0000000^1 C (χ <u _ X UTS. X n

Sz_ :t0 -H iH

——~ :co X ~^GT C i-H

ex « ή ή

♦ to Ή M

51 Sc oooooooo £ 3 •h <υ t-ι to to 4J -H o. W ι-l u, 3 to 00 C Ή OL, monin O.

•co ο ω . VVVAVtT* G μ ^.VoV o S ή*ό g rtf vrtoneo D ο ή :θ 03 nnnnfMonn (Χ'Ό -w U *H 3 C C ^

4-» X> W*-s (3 »H CO CO

•h o -h m J*j ε u* ψ r-ί i-1 > oo *H MlrteOjOOe W μ :co *h 4J J"«•T**-**γ7·η n"Vso' o* i 1

> Ή *H U OJ W N N <M_£ NNN 3> CO

s ajcqj= "v* ω ;___i co D-.

ε td 3 ffi 4-1

w S

o

CO »H

w

A-» -HO

Oi 4J

V 4J O

A-* CO

-Ξ CO

3 + CO Ή r-| o « 3 ^ >-t C 0] ° -H H /\ ^2 31

• 4-> « iH

’ G 3 G tfl «0 !j 0 3 0 « o o e m v; o tfl *} ,_ g aj

s ^ ^ 2J^ ^ ? S

x £22 £2< ^ u <0 .. to ‘2 U. < X to to cm *J .2 ΛΧ </) tO C | 1-1 to

^ H · -H

5 cwwjgusa s S. 2 1 g /gE/g/S ^ £ -5 T—I ^ U5 I—i C/3

3 U -H O

<0 C :fl H

H I->-, 1 l ω co o 57 103053 t » □ 'Ji o ο ο o o ooooo 3 rt n <u 2

^ S

3 ai G

υ . α Λ • co S O ^ o a o $ £ o o o £ 3 ° -3 rt u T? u ^

O

O

o .H joooo ^ o q α a J"4 ij *"* S 5 _ s ~____ % „T* ‘0iS ooooo ooooo 10 <0 VJ 01 2

>. Ή >> C

>· -H :cu ® > w „

:(U cO , G

*-* a. -o. a o^-o^o o 5· o ™ q co a n n· en — — » rt fi i u

Oi :c0 2C 3 g s I -S i g n o»'-' t o q 3 o < n — q q ή o m " 3 3 il Ή c * U -e -fi aj -. -h --—---— - •ο μ

3 M

3 :« * £ » 0 b m ooooo ooooo > c n g u ;H -S 5 c s μ o 3 Λ 5 - vj

v ·μ n . cc) C

ccl · m O OOOC4A! O Y OJ fs u I 'f.h n *· en n m 3 rt n cm μί O- •rt * > ^ 3 1 (0 Ή Ί- -H c_,

CU -H -G Z

CU *-> Jj- ^ μ 34 <0

<U CU -H Yf^CMOo^'CT-r-Q

vt -H « Γ-3»-^“ίΜ^^«-^ -Γ en vi ®2 "rt 5 C C -3 -G >rl CU -— -H - — -1- - '— - — o μ o 00 VJ r-l 3 H >s * 'rt

•rt « b m OOOOO OOOOO H

ϊη <U SS 2 μ ^ to ° 2 V.

10 C C e CU CU « Φ i o il . 01

o* · I O oecom'rOen^rvrcM

3 öin γηηηη γηΛηη * h

, CM S CU H

I ' $ 5 Ξ 0. £ pv ^ n ‘ -r-t -<r 3 r- fM n -e - m n a oi

* < - g — — CM «M - - <M O

PV ai -H 2 ^ < "v jz jo c e _ 1 :cu -------3 -rt

•μ vi vi CU

Θ ·· ^ tj U

3 e «n * « Ϊ S "°°o« OOOOO OOIOI e 00 HO g £ 0 non ai 5 "

10 P. μ S

, ΓΗ u HH ^ .2, .. 2 >_ 2ίί b o o im en cm o >n , cm , • -β Π τηηηητη n' o e * 2 o ·· O Oi O 1-1 rt» Ή Ή Εν •rt Σ< Ή «ΥΜΝΟ Ύ· en I CO ) SQ.

•rt μ *—*—*— ^- CM CM·- »- 5 •H il „ u μ o< -h m a, c----- _ ai 0 cu pv μ ίο I en I >-· «· H3<y _ rz „ r tn » cn nj ^ ^ ·η ϋ ä ^ <0 n 4J __irt Q 4J _ -.40? O 3 β J ^ y IM ίί ® ^ CM ^ ....

34 34 O Λ Ä '“H 10 01 e ·η e >> 3 vv vi >. μ r*H .1 . m. —. 1 , — « — 3 . — tn ^

CU h 2 r- · > μ H

H l~ e *“ C :« c^ h__w 00 103053 58 c 4)

CO

•H

> 3 ---------------- D. , ' '

Cu __ 1 iH

•H 3 60

v-l CN > S

U ^ I 03 ^Tvl

00 -H

(0 r·. SC Soo •U CN >,·· f'' cn >iU cn •h —3 cn>J :co

ι-l < AJO* Cr-H

o ca x ^o e> *-* ίο o O' O' ΟΟιΛΟΌιηΝΌ

u Ή m ΑΑ-~· -CT CO O' CN -T MCMnsHO

c5 5 5 22 ^

3 <0 c Μ ·Η C

u ^ *H ·Η WiH

Φ u-i ;> :cg«H

*H *h :co <y

U3 C W*H E-U

•HO) CU W O

T3 Q CL*tf CO M

-Π Ή W CO Hft 3 ?> - . ----------

Cu *H

Ή > > > c u > ™ Ή C c e ® τΙτΙΉτΙ Ιί·Η·Η·ΗΉΉ

^ J* CGCC^-H-H-tHCC

0¾ -ΗΉτ-ι-ΗΟΙ-Ι-ιμ-Η-Η “ ·Ητ-Ι—l-HAJ o o o-h-hc<<<

c-h <u HriHH ti aafl.HHfcnM

"" oj μ ΗΗΗΗ»[»υ)»ΗΗ<<<< M -¾ 2 ή ί-η ή -h co o o o ή i i i i

Tl Tl 5 BMilBlJdHHCIlMOOOO

•*0 ·™ C-1 -H-r-(-Hi-l<l)eOC8nJ-H-H

M·1-! CCCC'C'A-l'A-lVUCC

0J ΟΦΟΙΙΙ utigjuig o-c 0,0.0,0,0.^:14:^^01 dj _ _ ___ !C0 *H * U U-4 ~ “2 < ·· W «H CL.

rj g5 c > o <

O -H I

2J ti ’H Ή i-l *H *H

® S μ -i c c ή ^ “ *0 rH ·Η »H >«» _, P c <o <s <c *< *< P Jj OOOOOO OOOOC0^HMU4

P OUCJUUO OOOO-H^rHCD

H*H Ή CO Φ (0 il CO cOcOfOQiC'HHu <,u ή cl cl ci« Ph Cl ^^OH^mncoc

^ ti >* CL 1-4 -H

5^ S .>1 OCCÖQ

0^ QJ Ή V) 0) 3) V | e 3 ΰ *_ M ^_ • 3 C Λ------- ---- C -H <0 Z 2 D) μ μ ο 00 >μ μ ·Η -Η -Η * μ e e -μ ο >

cn -0 ο ·η -η C

>>W ι-ΙΉΉ ^ α η η < -nee -£>» ί) Η Η <: <: ϋ < U ι-ί ·Η u w ta «π ·η α. ρ* g οο·ηιη -.τ’ Λί ϋ) μ < < < <o.-tr-ioooo E Ρ <5 Ή *Η I I | I W H H N M CN Ν

5*Η -HCCvOsCrN. r^O^-rlSSXÄSC

’HW ,-ι α> a «-tcnco ^ >, g e- <ϋ *η -h ^α. >> o c y-»ce *Η w ϋ) Λ ΓΛ CU Oi 4) ϋ τ! 05 —I »—» fed α. α.

,. C -Li ' "" ' c <U 43 O. (Ο

U

·. 4J

-O O 3 .M w

3 C

r—< ··

3 H

CO < H Cl, 59 103053

Kuviot esittävät seuraavaa:

Kuvio 1: Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271:stä peräisin olevan tiolista riippuvaisen PAT:n puhdistaminen.

Affiniteettikromatografian avulla tuotetun PAT-ent-5 syymivalmisteen Ai 278/2 kromatofokusointi käyttäen Mono P:tä * AL 310

Pylväs: Pharmacia Mono P

Perustilavuus: 4 ml

Eluenttipuskuri: A: 25 mM bis TRIS -puskuri pH 6,3; 10 HC1; B: 10 ml polypuskuria 74/100 ml pH 4,0; HC1 Näyte: Affiniteettinäyte AL 278/2 Näytteen tilavuus: 1 ml:n puskuri vaihdetaan puskuriin a, ja tätä syötetään 2 ml

Paperin syöttö: 30 cm/tunti 15 Virtaus: 60 ml/tunti

Optinen tiheys: 0,1; 280 nm; HR-10-kyvetti

Fraktiot: Katso merkintää

Kuvio 2: P. chrysogenum P2/ATCC 48271:n tiolista riippuvaisen PAT:n puhdistaminen.

20 Aktiivisen valmisteen AL 278/2 (affiniteettikroma tografian jälkeisen) Mono P:tä käyttäen suoritetusta kro-matofokusoinnista AL 310 saatujen fraktioiden 3-5 RPC (käänteisfaasikromatografia) (MN Nucleosil 300-5/C4).

Kuvio 3: Penicillium chrysogenum P2/ATCC 48271:n 25 tiolista riippuvaisen PAT:n elektroforeettinen karakterisointi

Af finiteettikromatografian avulla tuotetun PAT-ent-syymivalmisteen AL 278/2 Mono P:tä käyttäen suoritetun kromatofokusoinnin AL 310:n gradientti-SDS-polyakryyliami-30 digeelielektroforeesi ja isoelektrinen fokusointi käyttäen amofoliinia (pH 3,5 - 9,5) tai immobiliinia (pH 4,5 - . p .

6,5).

Kuvio 4: Penicillium chrysogenumin restriktiokart-ta, joka sisältää pat-geenin.

60 103053

Restriktiokartat ovat likimääräisiä jäljennöksiä DNA-molekyyleissä olevista restriktioleikkauskohdista. Esitetyt restriktioleikkauskohtien etäisyydet ovat verrannollisia todellisiin etäisyyksiin, mutta etäisyydet, joita 5 todella havaitaan, voivat erota näistä. Kaikkia restrik- tioleikkauskohtia ei ole annettu, lisää leikkauskohtia voi olla läsnä kautta koko molekyylin.

A 1 esimerkkien 14 ja 15 sekvenssi B » esimerkin 18 sekvenssi 10 Kuvio 5: Valitun oligonukleotidiseoksen järjestämi nen j a sekvenssi.

Kuvio 6: Kaavioesitys sekvenssoitujen alueiden (D, F, G), oligonukleotidien (C, E), PAT:n polypeptidi l:n ja siitä johdetun koodaavan DNA-säikeen (B) sekvenssin väli-15 sistä suhteista.

D - esimerkin 11 sekvenssi F 1 esimerkin 13 sekvenssi G 1 osa esimerkkien 14 ja 15 sekvenssistä

Kuvio 7: Plasmidin pBC2001 kokoonpaneminen.

20 Lähtien täydellisen pat-cDNA-kloonin DNA:sta (ylim mät rivit) kloonataan kaksi EcoRl-fragmenttia vektoriin M13mpl9. Lisätään Ncol:n leikkauskohta käyttäen oligonuk-leotidia. Ncol-Hindlll-fragmentti sijoitetaan sitten il-mentämisvektoriin pKK233-2.

• 25 EcoRl, HinduI, Ncol osoittavat vastaavien entsyy mien leikkauskohdat; mcs tarkoittaa M13mpl9:n multippelia kloonauskohtaa; p trc tarkoittaa pKK233-2:n trp-lac-fuu-siopromoottoria; rrnBTlT2 tarkoittaa pKK233-2:n transkription terminaatiosekvenssiä; bla tarkoittaa pKK233-2:n am-30 pisilliiniresistenssigeeniä.

Kuvio 8: Plasmidi pBC2002.

Tämän plasmidin kokoonpaneminen alkaa pHS103:sta (Kolar et ai.), joka sisältää Aspergillus nidulans -promoottorin p gdp (glyserolialdehydifosfaattidehydrogenaasi-35 geenin promoottori) ja fleomysiiniresistenssigeenin (ble) 6i 103053 fuusion. Ampisilliiniresistenssigeeni (bla) toimii selek-tiomerkkigeeninä E. colissa, pHSl03:een sijoitetaan 4,8 kiloemäksen Sali-fragmentti, jossa on Penicillium chryso-genumin pat-geeni. Sali, EcoRl ovat vastaavien restriktio-5 entsyymien leikkauskohdat.

Kuvio 9: Reaktiokaava, jonka mukaan penisilliini-asyylitransferääsi (PAT) katalysoi isopenisilliini N: n transasylointia tai vastaavasti sen lohkaisemista 6-APA:ksi sekä tämän asylointia penisilliiniksi.

- · ^ • r 1 ·

Claims (19)

62 103053

1. DNA-sekvenssi puhdistetussa ja eristetyssä muodossa, joka koodaa penisilliiniasyylitransferääsi (PAT)-entsyymiä, jolla on seuraava aminohapposekvens-5 si: 10 20 MetLeuHialleLeuCyaClnClyThrProPheCluIleGlyTyrCluHiaGlySerAla 30 40 AlaLyaAlaVallleAlaArgSerlleA.apPheAlaValAapLeuIleArgClyLyaThr 50 00

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavan sekvenssin: 5 10 20 30 40 50 60 70 cttcatgtcccatcagtgtcatcctatggtcccacattgctggctaccgcaatataaatctcaccatcca 80 90 100 110 120 130 140 CTTCCCCCTCCATCATCATCCCCACCACCCCCTrrCTCATCTCCCTCACCCACCtCTCAGTTGTTTACCC 150 130 170 180 190 200 210 ATCTTCCGACCCGCAGCAGAAATGCTTCACATCCTCTGTCAAGCCACTCCCTTrCAAGTAAGTGCTGCAC 10 220 230 240 250 230 270 280 TCAATACCACATTTTTTCCTTCTCAATCTTCCCACTrCTCACCTGATCCACATCGCCTACCAACATCCCT 290 300 310 320 330 340 350 ctgctcccaaacccctcatagccagaaccattgacttcgccgtccatctcatcccagccaaaaccaagaa 15 330 370 380 390 400 410 420 CACCCACCAACACCTTAAACACCTACTCTCCCAACTCCCCCCCCTGATCGACGAAACATCCCCCAAATAC 430 440 450 430 470 480 490 TACGACCACATTCGCGGTCACTGCCACTTCGGTC Π rCCTACArrTTCTCCACCAATCCTGACCCATCAC 500 510 520 530 540 550 530 CCCCCAAAAACCAGCTATrCCAAACCCCCCrGAACCCCATCTCTCCCACArrCTCATCCTTAATACCCCC 20 570 580 590 000 310 320 330 ACCCAATTTGCATACCCCCTCAAGGCACCCCCTGATGGCTGCACCACTCICCTATTGTCAACTTCCAAATG 340 350 330 370 380 390 700 cacccctccagggccaaaactgggatgtacgttaagagattttacctcctcattttattccatcgaattt 710 720 730 740 750 730 770 780 790 800 810 820' 830 840 CACCCCCCACTTCCCACCATCAAAITCATAACCCACCCTGCAATCATCCGCAACGTrCCATTTAACAGTG 850 830 870 880 890 900 910 cgggggtcgccctcaattacaacccccttcaccttcaacgtcttccacccaccccagttccttcgcatat 30 920 930 940 950 930 970 980 TCCCCTCCCCAtACCCCrCCAAACCACTTCTCCTTCCCACGCCTATCACCCCATCCrrCGACCAACCCCCA ’ 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ATCCCCCCCAGCCCnnATCATGCTGGCCAATGGGCACGACGCATTTGCTrrCCAATTCTCCCCCACCA 1030 1070 1080 1090 1100 IHO 1120

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää sekvenssit, jotka ovat tarpeen Penicillium chrysogenumin PAT-gee-nin transkriptiota ja translaatiota varten.

3. CCATCCCAAACCAGCTCCTCGACCCCAATCCTACCATCCTCCACACCAACCACTGCTTGCTTCACCACCG 1130 1140 1150 HflO 1170 1180 1190 CAAAAATCACAAACACCTCCATCCCTTACCCCACTCATCCAATCCCCACCAGCCTATGCAGTTCCTCCTC 64 103053 1200 1210 1220 1230 1240 1230 1280 CACGCGTTCGACGCCACCAAACACCCATTTCCCCACCTCTGCCCCCACCAACACAATTATCCCTTTAGCA 1270 1230 1290 1300 1310 1320 1330 ^ tctgccgcgcttacgagcacggcaacagcacaggcgccactctcttcaatatcatctaccaccatccccg 1340 1350 1380 1370 1380 1390 1400 TAGAGAGGCAACGGTGCCGCTTGCCCGGCCGACCAACCCTGATGAGATGTTTGTCATCCCGTTTCACCAG 1410 1420 1430 1440 1450 1480 1470 CAGCACGaGAGGTCTCCCCTCAACCCCACGCTTTCAAGCCTCTTCATCACCAGCCAATCCATCTTTTCTA 10 1430 1490 1500 1510 1520 1530 1540 TGTAGCTTCAACCGACTCCGTCTTCACTTCTTCGCCCGCACTGCCTACCGTTTCTACCATCTGACTCATA 1550 1580 1570 1580 1590 1800 1810 taaatctctagcccctacctacactatacctaagggacacaaccgtagactcattaacgtacgcgcctat 1320 1930 1640 1650 1660 1670 1830 15 agtaccccgatctctacatacaacatttactacagattaccatccctaactaatttaacttgaccattgt · 1890 1700 1710 1720 1730 1740 1750 CCCCTTCATATTGATTTTCATCCATTATACACTCTTAATCCTTTCCCGGTACAAGCCGHATATATACCAC 1780 1770 1780 1790 1800 1310 1820 catagcctctgcagaacaccgcttcccctctgcttccccctacttaacctatatattctacacccccaat 20 1830 1840 1850 I860 1870 1880 1890 actcaatctccccttaccacctaacccccactctaccctaactgcccctcatatacgtcacaactcttaa 1900 1910 1920 1930 1940 1950_ 1980 gactcaagacaccatatcacgccttaccctgcaccctacctactaccttcaatatcactctttcaggatg 1970 2. cacaggctccac

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssit, jotka ovat tarpeen . Penicillium chrysogenumin PAT-geenin transkriptiota ja translaatiota varten ovat isopenisilliini N-syntetaasi-geenin ja Penicillium chrysogenumin PAT-geenin välillä 35 olevat sekvenssit. „ 103053

5 CAAAAATCAGAAACACCTCGATCCCTTACCGCACrCATCGAATCCCCACCACCCTATGGACTrCCTCCTC 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1280 CACCCCTTCCACCCCACCAAACACCCArrTCCCCACCTCTCCCCCCACCAACACAArTATCCCTrrACCA 1270 1230 1290 1300 1310 1320 1330 tctcccccgcttaccaccaccgcaacaccacacgccccactctcttcaatatcatctaccaccatccccg 10 1340 1350 1380 1370 1330 1390 1400 TACACACCCAACCGTCCCCCTrCCCCCGCCGACCAACCCTCATGACATCTTTCTCATCCCGTrTGACCAG 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 CACCACCACAGGTCTGCCCTCAACGCCAGGCTrTCAACCCrCTTCATCACCAGCCAATCCATC ΓΤITGTA 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 15 tCTAGCTTCAACCGACTCCGTCTTCACTTCTrCGCCCGCACTGCCTACCGTTTGTACCATCTCACTCATA 1550 1580 1570 1530 1590 1800 1810 taaatctctagcccctacctacactatacctaacccacacaaccctagactcattaacgtaccgccctat 1820 1830 1840 1850 1880 1870 1880 ACTACCCCCATCTCTAGATAGAACArrrACTACAGATTAGGATGCCTAACrAATTTAACTTCACCATTCrr 20 1890 1700 1710 1720 1730 1740 1750 CCCGTTCATATTCATTTTCATCCATTATACACTCTTAATCCi 111'CCCCGTACAACCCCMATATATACCAC 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 CATACCGTCTGGAGAACACCGCTTCCCGTCTCCTTCGCCCTACTTAACCTATATATTCTACACCGCCAAT 1830 1840 1850 1880 1870 1830 1390 25 actcaatctccccttaccacctaagccccactctagggtaactgccggtgatatacctcagaactcttaa 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1980 gactgaagacagcatatcacgcgttaccctgcaccctacctactaccttcaatatcactctttcacgatg 1970 CACACGGTCGAC 30

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen DNA-sekvenssin koodaama proteiini puhdistetussa ja eristetyssä muodossa.

6. Vektori, tunnettu siitä, että se si-5 sältää penisilliiniasyylitransferaasia (PAT) koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin penisilliiniasyylitransferaa-silla on seuraava sekvenssi: 10 20 MetLeuHialleLeuCysClnClyThrProPheCluIleClyTyrCluHiaGlySerAla 10 30 *0 AlaLysAlaVallleAlaArgSerlleAspPheAlaVa'lAapLeuIleArgClyLysThr 50 60 LysLysThrAspGluGluLeuLysGlnValLeuSerClnLeuGlyArgVallleCluClu TO ao ArgTrpProLysTyrTyrCluCluIleArgClylleAlaLyaGlyAlaCluArgAapVal 15 90 100 SerCluIleValMetLeuAanThrArgThrCluPheAlaTyrClyteuLyaAlaAlaArg 110 120 AapClyCysThrThrAlaTyrCyaClni.euProAanClyAlaLeuClnClyClnAanTrp 130 140

20 A3pPhePheSerAlaThrLy3GluA3nLeuIleArgLeuThrIleArgClnAlaGlyC.eu 150 100 ProThrlleLysPheneThrCluAlaClyllelleGlyLyaValClyPheAsriSerAla 170 180 ClyValAlaValAanTyrAanAlaLeuHisLeuClnGlyLeuArgProThrClyValPro 25 190 200 SerHisIleAlaLeuArglleAlaLeuCluSerThrSerProSerClnAlaTyrAapArg 210 220 IleValCluGlnGlyClyMatAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAanClyHiaClu 230 240 AlaPheClyLeuCluPheSerProThrSerCleArgLysClnValLeaAspAlaAsnCly 250 260 , ArgMetValH i3ThrA3nHl3Cy3LeuLauClnHi3Clyty3A3nCluLy3GluL.euA3p 270 280 ProLeuProAapSerTrpAanArgHisGlnArgMetGluPheLeuLeuAapGlyPheAap 290 300 ^ ClyThrLysClnAlaPheAlaClnLeuTrpAlaAapCluAapAanTyrProPheSerlle 310 320 CyaArgAlaTyrCluCluGlytyaSerArgGlyAlaThrLeuPheAanllelleTyrAsp 66 1 0 3 0 5 3 330 340 HisAlaAryArjGluAiaThrValAriLeuClyAxgProThrAanProAjpCluMetPhe 350 ValMetArsPheAapCluCluAapCluATiSerAlaLeuAjaAlaAryLeu 5

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tunnettu siitä, että penisilliiniasyylitrans-feraasia (PAT) koodaava DNA-sekvenssi sisältää seuraa-van sekvenssin: 10 20 30 40 50 80 70 GTTGATGTCCCATCAGTGTCATGCTATGGTCCCACAITCGTCCCTACCGCAATATAAATCTCACCATCCA 80 90 100 110 120 130 140 GTTCCGCCTGCATGATCATCCCCAGCACGCCGTTTGTCATCTCCCTCAGCCAGCTCTCACTTGT ΓΙ'ACCC 150 180 170 180 190 200 210

15 ATCTrCCCACCCCCACCACAAATCCrTCACATCCTCTCTCAACCCACTCCCmCAACTAAGTCCrCCAC 220 230 240 250 280 270 280 TGAATACCACAI 11II1 CCTrCTCAATCTTCCCAGTTCTGACCTGATCCACATCGGCTACGAACATGGCT 290 300 310 320 330 340 350 CTCCTCCCAAACCCCTCATACCCACAACCATTCACTrCGCCGTCGATCTCATGCGAGGGAAAACCAAGAA 20 380 370 380 390 400 410 420 GACGCACCAACACCTTAAACAGGTACTCTCGCAACTGCGCpCCGTGATCGAGGAAACATGGCCCAAATAC 430 440 450 480 470 480 490 TACCACCACATTCCCCCTCACTCCCACTrCCGTCTTTCCTACATTTTCTGCACCAATGCTGACCCATCAC 500 510 520 530 540 550 580 2. cccccaaaaaccacctattgcaaacccccctcaacccgatgtctccgacattgtcatccttaatacccgc 570 580 590 800 810 820 830 ACCCAATTTGCATACGCGCTCAACCCACCCCCTGATGCCTGCACCACTCCCTATTGTCAACTTCCAAATC 640 850 880 870 880 890 700 CACCCCTCCAGGGCCAAAACTCCGATGTACGTTAAGACATTTTACCTCCTCATTTTArTCCATCGAATTT 30 710 720 730 740 750 780 770 CCGCCCACTAATTTGCTTGTTCAAGTTCTTTTCTGCCACCAAAGAGAACCTCATCCCCTTAACCATCCCT ; 730 790 800 810 820' 830 840 CACCCCCCACTTCCCACCATCAAATTCATAACCGAGGCTGGAATCAICGGGAAGGTTCCATTTAACACTG 850 880 870 880 390 900 910 CCCCCGTCCCCGTCAATrACAACCCCCTrCACCTTCAAGGTCTrCCACCCACCGGAGTTCCTTCGCATAT 35 920 930 940 950 980 970 980 TCCCCTCCCCATAGCGCTCCAAAGCACTTCTCCTTCCCACCCCTATGACCCGATCGTGGAGCAAGCCGCA 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 atcgcccccagcccttttatcatggtggccaatgcccaccacgcatttgctttcgaaitctcccccacca 67 103053 ΙΟβΟ 1070 1080 ιοβο ΙΙΟΟ ΠΙΟ 1120 GCATCCGAAAGCACCTCCTCCACGCGAATGGTACCATCCTGCACACCAACCACTGCTTCCTICACCACGC 1130 1140 1150 1100 1170 1130 1190

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi geenejä, jotka ovat tarpeen Penicillium chrysogenumin PAT-geenin 35 transkriptiota ja translaatiota varten. „ 105053

9. Jonkin patenttivaatimuksista 6-8 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää geenejä, jotka mahdollistavat plasmidin selektion β-laktaamia tuottavissa mikro-organismeissa.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 6-9 mukai nen vektori, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää isopenisilliini N-syntetaasia koodaavan geenin.

10 LysLysThrAspGIuGluLeuLysGlnValLeuSerClnteuCIyArgVallleGluGlu 70 80 ArgTrpProLysTyrTyrCluCluIleArsClylleAlaLyaGlyAlaGluArgAapVal 90 100 SerGluIleValMetLeuAanThrArgThrCluPheAlaTyrGlyt.euI.yaAlaAlaAri 15 110 120 AapGlyCysThrThrAlatyrCysClnLeuProAanGlyAlaLeuGlnGlyClnAanXrp 130 140 AapPhePheSerAlaThrLyaCluAanLeuIleAriLeuThrlleArgClnAlaClyLeu 150 100 ProThrlleLysPhelleThrCluAlaGlyllelleClyLysValClyPheAanSerAla 20 170 130 ClyVaiAlaValAsnTyrAsnAlaLeuHisLeuGlnClyLeuArgPro*hrGlyValPro 190 200 SerHisIleAlaLeuArglleAlaLeuGluSerThrSerProSerClnAlaTyrAapAri 210 220 IleValCluGlnGlyClyMetAlaAlaSerAlaPhelleMetValGlyAanClyHiaClu 230 240 AlaPheGlyLeuCluPheSerProthrSerneArjLyaClnValLeuAspAlaAanCly 250 200 ArgMetValHiaThrAanHiaCyateuteuGlnHiaClyLyaAanGluLysCluLeuAap 30 270 230 ProUeuProAapSerTrpAanArgHlaCloArgMetCluPheLeuLeuAapClyPheAap 290 300 GlyThrLysGlnAlaPheAlaClnLeuTrpAlaAapCluAapAanTyrProPheSerlle 310 320 2^ CyaArg’AlaTyrGluGluClyLysSerArgClyAlaThrLeuPheA.snllelleTyrAap 330 340 HlsAlaArgArsGluAlathrValArgLeuGlyAriProThrAanProAapCluMetPhe 350 ValMetArgPheA3pCluCluA3pCluArySerAlaL.eaAanAlaArjLeu 63 1 0 3 0 5 3

11. Menetelmä penisilliiniasyylitransferaasin (PAT) tuottamiseksi, tunnettu siitä, että trans-5 10 formoidaan isäntä jonkin patenttivaatimuksista 6-10 mukaisella vektorilla ja eristetään ilmennetty PAT. g

! '12. Solu, joka sisältää jonkin patenttivaati- , muksista 6-10 mukaisen vektorin.

13. Menetelmä penisilliinin tuoton parantami-15 seksi, tunnettu siitä, että penisilliiniä tuottava solu transformoidaan jonkin patenttivaatimuksista 6 - 10 mukaisella vektorilla ja penisilliini eristetään. 69 1 0 3 0 5 3