JPH0638763A - セファロスポリンｃ生合成に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由
来であり、セファロスポリンＣ生合成に関与する遺伝子
を単離し、アクレモニウム・クリソゲナムの改良にこれ
を利用することを目的とする。 【構成】 セファロスポリンＣ生合成に関与する遺伝子
群を含有するＤＮＡ断片であり、少なくとも配列表に示
されるアミノ酸配列をコードする新規な遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム・クリ
ソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生合成に関与
する遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床上重要なセファロスポリン系抗生物
質の出発原料であるセファロスポリンＣは、糸状菌であ
るアクレモニウム・クリソゲナムを用いた発酵法により
製造されている。従来、該菌のセファロスポリンＣ生産
能力を向上させるために用いられてきた技術は、突然変
異生成、それに続く高生産株のランダムスクリーニング
であった。しかし、近年、該菌を宿主とする形質転換系
の開発〔例えば、Queener ら、Microbiology 1985. Ame
rican Society for Microbiology, (1985) 468-47 2 〕
およびセファロスポリンＣ生合成酵素遺伝子のクローニ
ングが相次いで行われ、優良菌株の育種に遺伝子工学的
アプローチを施す道が開けてきた〔例えば、Skatrud
ら、BIO/TECHNOLOGY (1989)7、477〕。セファロスポリン
Ｃは、アクレモニウム・クリソゲナムにおいて、３種の
アミノ酸を出発原料として、５種類の酵素による６ステ
ップの反応を経て生合成されることが知られている。
〔例えば、Martinら、Trends in Biotechnology (1985)
3: 39-44 参照〕。現在までに、これら生合成酵素のう
ち４種の酵素をコードする遺伝子がそれぞれアクレモニ
ウム・クリソゲナムよりクローニングされ、〔例えば、
Samon ら、Nature (1985)318,191 、Samsonら、BIO/TEC
HNOLOGY (1987) 5,1207、Gutierres ら、Journalof Bac
teriolo gy (1991) 173,2354-2365 、EP0450758 〕分子
育種に応用されつつある。しかしながら、第３番目のス
テップ、すなわち、イソペニシリンＮからペニシリンＮ
への異性化反応を触媒する酵素であるイソペニシリンＮ
エピメラーゼをコードする遺伝子（以後IPNE遺伝子と略
す）は未だ単離同定されていない。また、アクレモニウ
ム・クリソゲナムには、セファロスポリンＣ生合成に間
接的に関与する遺伝子（例えば、セファロスポリンＣ生
合成遺伝子群の発現制御に係わるタンパク質、あるいは
合成中間体の膜透過に係わるタンパクをコードする遺伝
子）が複数存在することが予想され、上記生合成酵素遺
伝子と同様に、これらの遺伝子もセファロスポリンＣ生
産菌の分子育種に有益な手段を提供すると考えられる。
しかしながら、IPNE遺伝子と同様これら遺伝子の解析は
全く行われていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アクレモニ
ウム・クリソゲナム由来であり、セファロスポリンＣ生
合成に関与する遺伝子を単離し、アクレモニウム・クリ
ソゲナムの改良に、これを利用することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】抗生物質の生合成に関与
する遺伝子群は、一般にクラスターを形成しているとい
う知見〔例えば、Martinら、Annu. Rev. Microbiol.(19
89) 43,173-206〕に基づいて、本発明者らは、既知のセ
ファロスポリンＣ生合成酵素遺伝子近傍のＤＮＡ断片を
単離し、遺伝子破壊法を利用することによって、該断片
上に存在する遺伝子の機能を解析した。その結果、イソ
ペニシリンＮ合成酵素遺伝子の近傍に位置し、図３に示
す制限酵素地図を有するＤＮＡ断片上に、セファロスポ
リンＣ生合成に関与する遺伝子が少なくとも２個存在し
ていることを見いだし、本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、

【０００５】(1) アクレモニウム・クリソゲナム由来で
あり、セファロスポリンＣ生合成に関与する遺伝子を含
むＤＮＡ断片。 (2) イソペニシリンＮ合成酵素遺伝子の近傍に位置し、
図３に示す制限酵素地図により規定される(1)記載のＤ
ＮＡ断片。 (3) 配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含む(1),(2) 記載のＤ
ＮＡ断片。 (4) 配列表（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含む(1),(2),(3) 記載
のＤＮＡ断片。 (5) 図３におけるPstI-EcoRV間の塩基配列が配列表
（配列番号３）で示される(1),(2),(3) または(4) 記載
のＤＮＡ断片に関する。

【０００６】また、本研究の過程で、本発明ＤＮＡ断片
の一部をプローブとして使用することにより、配列表
（配列番号１）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
および配列表（配列番号２）に記載した配列からなるタ
ンパク質を、それぞれコードする２種の cDNA が得られ
た。各々代表的なクローンに由来する塩基配列を配列表
（配列番号１および２）に示した。これらcDNA化合物も
アクレモニウム・クリソゲナム内で機能するプロモ−タ
−断片（例えば、特開平4 ー58891）と連結させることに
より、本発明ＤＮＡ断片と同様、アクレモニウム・クリ
ソゲナムの改良に利用できると考えられる。したがっ
て、図３に示す制限酵素地図により規定されるＤＮＡ断
片から転写されるＲＮＡ（セファロスポリンＣ生合成に
関与するタンパクをコードする m-RNA ）に由来する c
DNA 化合物群も本発明に包含される。本発明に係るＤＮ
Ａ断片は、大略下記の工程によって造成することができ
る。

【０００７】(1) アクレモニウム・クリソゲナムから染
色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素（例えば,MboI
等）で部分分解する。 (2)(1)で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込
み、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡライ
ブラリーを構築する。 (3)(2)で得られたライブラリーの中から、合成ＤＮＡプ
ローブを用いたハイブリダイゼーションにより、イソペ
ニシリンＮ合成酵素遺伝子の少なくとも一部を含むクロ
ーンを単離する。 (4) 該クローンより組換えＤＮＡを抽出し、制限酵素解
析、サザンハイブリダイゼーション等を行ってイソペニ
シリンＮ合成酵素遺伝子の存在位置を確認した後、その
下流域（ACVS遺伝子の反対側）を適当なプラスミドベク
ター（例えば、pUC18 ) にサブクローニングする。 (5)(4)でサブクローン化されたＤＮＡ断片上で、ＲＮＡ
に転写される領域（機能的遺伝子）を同定する。 (6) 相同組換え現象を利用した遺伝子破壊法により、
(5) で同定した領域内に変異を有するアクレモニウム・
クリソゲナム株を取得する。 (7) 上記(6) で得た変異株のセファロスポリンＣ生産能
を調べ、親株のそれと比較することにより、本遺伝子が
セファロスポリンＣ生合成に関与していることを確認す
る。

【０００８】上記の工程中でＤＮＡ，組換え体宿主とし
ての大腸菌等の取扱いに必要な一般的な操作は、当業者
間で通常行われているものであり、例えば、Maniatisら
の実験操作書 ( T.Maniatis et al., Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry 1982, 1989 ) に従えば容易に実施できる。使用する
酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることができ、
特に断わらない限り、製品で指定されている使用条件に
従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。
上記(1) において、ＤＮＡ抽出源としては、アクレモニ
ウム・クリソゲナムATCC11550 、アクレモニウム・クリ
ソゲナムIS-5等の菌株が使用できる。なお、アクレモニ
ウム・クリソゲナムIS-5株は、平成２年２月５日付けで
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第11232 号の寄託番号で寄託されている。

【０００９】また、該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例え
ば、Johnstone ら〔Johnstone et al.,EMBO Journal(19
85)4 1307-1311〕の方法、もしくは、Minuthら［Minuth
et al. , Current Genetics(1982)5: 227-231］の方法
に準じて行うことができる。上記(2) におけるベクター
としては、例えば、EMBL3,EMBL4 （STRATAGENE社）等の
ラムダファージベクターもしくは、pHC79 （Bethesda R
esearch Laboratories＜BRL ＞社）, pBSFPKM6（後述）
等のコスミドベクターを使用することができる。上記
(3) で使用するプローブは、既に明かとなっている A.c
hrysogenum由来のIPNS遺伝子の配列に基づいて設計し、
市販の合成機を用いて容易に合成することができる。上
記(5) における転写領域は、例えば、(4) で得たプラス
ミドから適当な制限酵素断片を調製し、該断片を放射能
ラベルしたものをプローブとして、アクレモニウム・ク
リソゲナムから抽出したＲＮＡとのノーザンハイブリダ
イゼーションを行うことによっておおまかに推定するこ
とができる。あるいは、アクレモニウム・クリソゲナム
に由来するラベル化 cDNA をプローブとして、(4) で得
たプラスミドの制限酵素分解物とのサザンハイブリダイ
ゼーションを行うことによっても推定できる。また、該
制限酵素断片をプローブとしてアクレモニウム・クリソ
ゲナム由来の cDNA クローンを単離し、その構造を決定
することによって、さらに細かく転写領域ならびにタン
パク質コード領域等を限定することも可能である。な
お、アクレモニウム・クリソゲナムからのＲＮＡの抽出
は、例えば、EP-0450758記載の方法に準じて行うことが
できる。また、cDNAライブラリーの構築、ノーザンハイ
ブリダイゼーション等の操作も、例えば、上記マニアテ
ィスらの実験操作書に準じて行うことができる。上記
(6) における遺伝子破壊は、例えば Hoskinsらの方法
〔Jo Ann Hoskinsら、Curr Genet(1990)18:523-530〕に
準じて行うことができる。なお、本発明者らは、まずセ
ファロスポリン生合成遺伝子の一つであるデアセチルセ
ファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の
破壊実験を試み、後述の参考例に示すとおり、該菌にお
いても、特定の遺伝子の破壊株は比較的容易に取得でき
ることを見いだした。なお、遺伝子破壊用プラスミドを
構築する際必要となる選択マーカー遺伝子としては、例
えば特開平４ー５８８９１に記載されている、アクレモ
ニウム・クリソゲナム内で作用するプロモーターに連結
されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺
伝子、あるいはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
遺伝子等を使用することができる。また、破壊用プラス
ミドによるアクレモニウム・クリソゲナムの形質転換も
公知の方法に準じて行うことができる〔例えば、Queene
r ら、Microbiology 1985.American Societyfor Microb
iology(1985) 468-472 〕。上記(7) におけるセファロ
スポリンＣ濃度は、例えば、Martinezらが記載した方法
〔E yme Microb. Technol.(1985)7,389-393 〕に準じて
測定することができる。

【００１０】以下、実施例により本発明を詳述するが、
本発明は、該実施例によって限定されるものではない。
なお、実施例、参考例に記載の略称ないし略号は、以下
のとおりのものである。

【００１１】マニアテイスの実験書：(T.Maniatis et a
l.,Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor Laboratory 1982 ) Ｎ−３シード培地：コーンスティープリカー４０ｇ／ビ
ート２０ｇ／酢酸アンモニウム２ｇ／スイトース４０ｇ
を水１リットルに溶解したもの。

【００１２】メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０
ｇ／コーンスティープリカー１０ｇ／酢酸アンモニウム
５ｇ／硫酸アンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭
酸カルシウム１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイ
ト４１．５を水１リットルに含むもの。

【００１３】ＣＭ培地：ショ糖２０ｇ／リン酸二水素カ
リウム０．５ｇ／リン酸水素二カリウム０．５ｇ／塩化
カリウム０．５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５
ｇ／硫酸鉄(II)（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム
３ｇ／イーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０ｇを
水１リットルに溶解したもの。 ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。

【００１４】ＧＡＧ培地：グリセロール４０ｇ／アスパ
ラギン４ｇ／塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム
０．１ｇ／微量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）
４ｇ／硫酸鉄(II)（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン
（４水塩）０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／
無水硫酸銅０．０４ｇを水１リットルに溶解したもの〕
２５ミリリットル／０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
７．０）３０ミリリットルを水１リットルに含有する培
地。

【００１５】Ｐ−バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム／
０．０１Ｍ塩化マグネシウム／０．０２５Ｍ塩化カルシ
ウム ＰＥＧ溶液：２５％ポリエチレングリコール（〜４００
０）／０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）／０．０５Ｍ塩
化カルシウム／０．６Ｍ塩化カリウム。 ６×ＳＳＣ：０．９Ｍ塩化ナトリウム／９０ｍＭクエン
酸ナトリウム。 ２０×ＳＥＴ：３Ｍ塩化ナトリウム／０．４Ｍトリス
（ｐＨ７，８）／２０ｍＭＥＤＴＡ。

【００１６】２０×ＳＳＰＥ：塩化ナトリウム２１０ｇ
／リン酸二水素ナトリウム（２水塩）３１．２ｇ／０．
５Ｍ ＥＤＴＡ ４０ミリリットルを水１リットルに溶
解したもの。 ５０×デンハルツ：フィコール５ｇ／ポリビニルピロリ
ドン５ｇ／牛血清アルブミン５ｇを水０、５リットルに
溶解したもの。

【００１７】（参考例１） デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＤＣＰＣ−ＡＴＦ）遺伝子の破壊 a. pDATF1 の構築； 図１に示される工程に従って、ア
クレモニウム・クリソゲナムのＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子
を破壊するためのプラスミド pDATF1 を構築した。

【００１８】以下に各工程を説明する。先ず、pATF1 を
Spe1 で切断しＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子を含む 3,7 Kb
の断片を分離精製した。該断片と Xba1 で切断し、アル
カリフォスファターゼ処理を施した pUC18（宝酒造販）
とを T4 リガーゼで連結することにより pSATF1 を得
た。次いで、 pSATF1 の Eco 47III（この制限酵素認識
部位はpSATF1上のＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子内部に一箇所
だけ存在する）部位に、Xba1 リンカーを挿入すること
により pSATF1Xを得た。一方、 pACTHY83 を Spe1,Xba1
で切断し、3,2Kb のハイグロマイシンＢホスホトランス
フェラーゼ発現単位断片（アクレモニウム・クリソゲナ
ム由来アクチン遺伝子のプロモ−タ−およびタ−ミネ−
タ−、細菌由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子がアクレモニウム・クリソゲナム内での
発現に好適な配置で結合した断片）を分離精製した。次
いで、該断片と Xba1 で切断し、アルカリフォスファタ
ーゼ処理を施した上記 pSATF1Xを T4 リガーゼで連結す
ることにより pDATF1 を得た。なお、本参考例で使用し
た pATF1は、アクレモニウム・クリソゲナム由来ＤＣＰ
Ｃ−ＡＴＦ遺伝子ならびにデアセトキシセファロスポリ
ンＣ合成酵素／デアセチルセファロスポリンＣ合成酵素
（アクレモニウム・クリソゲナムの場合、単一のポリペ
プチドが両酵素活性を有していることが明かとなってい
る）遺伝子を含む 7Kbの BamHI断片が pUC18に挿入され
たプラスミドであり、その造成法は、EP0450758 に記載
されている。また、pACTHY83は上述のとおりハイグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼ発現単位を有するア
クレモニウム・クリソゲナム形質転換用ベクターであ
り、その造成法は、EP0450758 に記載されている。

【００１９】b.pDATF1によるアクレモニウム・クリソゲ
ナムの形質転換；pDATF1を Sac1 で線上化した後、アク
レモニウム・クリソゲナム IS-5 株由来のプロトプラス
トに導入し、ハイグロマイシンＢに耐性となった形質転
換体を取得した。以下にその詳細を説明する。

【００２０】ＣＭ固形培地上で３０℃５日間生育させた
アクレモニウム・クリソゲナムＩＳ−５の菌糸体をＣＭ
培地５０ミリリットルに接種し、回転式振とう機（２５
０ｒ．ｐ．ｍ）上、３０℃で３日間培養した。さらに、
該菌液１ミリリットルを５０ミリリットルのＧＡＧ培地
に接種して、３０℃で２０時間培養した。得られた培養
液５０ミリリットルを３５００ｒ．ｐ．ｍで１０分間遠
心し、菌糸体を沈澱させた後、０．９％のＮａＣリット
ル溶液で洗浄し、０．０１Ｍジチオスレイト−ルを含ん
だマクイルベイン緩衝液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ
リン酸ナトリウム、 pH７，３）２０ミリリットルに懸濁
し、３０℃で１時間、おだやかに振とうした。次いで菌
糸体を３２００ｒ．ｐ．ｍ、１０分間の遠心で沈澱さ
せ、Ｐ−バッファ−で洗浄した後、ノボザイム（Ｎｏｖ
ｏ社）を１０ｍｇ／ミリリットルの濃度で含有するＰ−
バッファ−１０ミリリットルに懸濁し、３０℃で１時間
おだやかに振とうした。該反応液を８００ｒ．ｐ．ｍで
３０秒間遠心して得た上清を、濾紙（ＴＯＹＯＦＩＬＴ
ＥＲ ＰＡＰＥＲ ５Ａ）を用いて濾過することによ
り、菌糸体とプロトプラストを分離した。

【００２１】次いで、該濾液を３０００ｒ．ｐ．ｍで５
分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−バッ
ファ−で１回洗浄し、プロトプラストが３×１０⁸ 個／
ミリリットルの濃度となるようにＰ−バッファ−に懸濁
した。かくして得られたプロトプラスト懸濁液０，１ミ
リリットルに、Sac1切断により線上化した pDATF1 10μ
g を含む溶液１０μリットルを加えた後、０，０５ｍリ
ットルのＰＥＧ溶液を加え、かるく混合した。該混合液
を氷上に２５分間静置した後、同上のＰＥＧ溶液を１ミ
リリットル加えて、室温でさらに３０分間静置した。か
くして得られた形質転換プロトプラスト懸濁液を０，２
ミリリットルずつプロトプラスト再生培地〔文献（イソ
ガイら: Agric.Biol.Chem.１９８７、５１、２３２１−
２３２９）に記載されているＢＲＭ培地〕を２５ミリリ
ットル含有するプレ−ト上に広げ１５℃で２０時間培養
した。

【００２２】次いで、該プレ−トに４，５ｍｇのハイグ
ロマイシンＢを含み、５０℃に保温した同上のＢＲＭ培
地５ミリリットルを重層した後、２８℃で１４日間培養
した。その結果、ハイグロマイシンＢに耐性となった形
質転換体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す）が二百数十
株出現した。

【００２３】c.破壊株の選択；ＤＣＰＣ−ＡＴＦはセフ
ァロスポリンＣ生合成経路の最終ステップ、すなわち、
デアセチルセファロスポリンＣをセファロスポリンＣに
変換する反応を触媒する酵素である。したがって、この
遺伝子が破壊された株はセファロスポリンＣ生成能を消
失するはずである。上記（２）で得たＨＹＢ形質転換体
より１２株をランダムに選択し、その各々をＮ３シード
培地５０ミリリットルに接種し、２５℃で３日間振とう
培養した（２２０ｒ．ｐ．ｍ）。得られた培養液１ミリ
リットルをメイン培地３０ミリリットルを含む５００ミ
リリットルのフラスコに移植し、２５℃で４日間振とう
培養した。かくして得られた培養液を遠心分離して得た
上清を１０倍希釈した後、高速液体クロマトグラフィー
に供し、セファロスポリンＣの検出を行った。高速液体
クロマトグラフィーのカラムは、ＺＯＲＢＡＸーＢＰＮ
Ｈ２カラム（デュポン社製）を用い、移動相としては４
％酢酸、４％メタノール、８％アセトニトリルからなる
溶液を用いて、流速は２ミリリットル／分、検出波長は
２４５ｎｍで行った。その結果、調べた１２株中２株の
形質転換体（DAT2及び DAT8 と命名）がセファロスポリ
ンＣ生成能を失っていることが明かとなった。そして、
これら２株はＤＣＰＣ−ＡＴＦの基質であるデアセチル
セファロスポリンＣを親株より多く蓄積した。また、予
想どおり DAT2,DAT3の細胞破砕液中にＤＣＰＣ−ＡＴＦ
活性は全く検出されなかった。

【００２４】d.サザン法によるＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子
破壊の確認；上記 DAT2,DAT8株およびその親株である I
S-5 株からリーダー、ブローダの方法〔U.Raeder & P.B
roda,Letters in Applied Microbiology (1985) 1,17-2
0〕に従ってＤＮＡを抽出し、SpeIもしくは BamHIでの
切断、また StuI と XhoI による二重切断を行った。つ
いで、これら切断ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した
後、サザン法によりナイロンフィルター（ハイボンド
Ｎ）に転写し、放射能ラベルした pCCS1の EcoRI断片
（ＤＣＰＣ−ＡＴＦの全コード領域を含む 1,25kb の c
DNA 断片）とのサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。その結果、DAT8株では染色体のＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺
伝子と pDATF1 上の破壊されたＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子
とが２重交叉により、期待どおり置換されていることが
示された。すなわち、DAT2,DAT8 株ではSpeIによる切断
で6,9Kb,BamHI で5,5Kb と3,2Kb,StuI+XhoI による切断
では5,9Kbの断片がそれぞれ該プローブとハイブリダイ
ズし、親株で観察された位置（SpeI-3,7Kb, StuI+XhoI-
2,7Kb,BamHI-7Kb ）にハイブリダイゼーションシグナル
は全く認められなかった（図２）。以上の結果、アクレ
モニウム・クリソゲナムにおいても特定遺伝子の破壊が
比較的容易に達成できることが判明した。

【実施例】

【００２５】（実施例１） IPNS遺伝子を含むコスミドクローンの単離 a.遺伝子ライブラリーの作製；アクレモニウム・クリソ
ゲナム IS-5 株（微工研菌寄第11232 号）の全ＤＮＡを
特願平２ー１６６５６６に記載した方法で抽出した。こ
のＤＮＡ約100 μg をMboIで部分消化した後、10〜40%
のショ糖密度勾配遠心法による分画操作を行って、30〜
40KbのＤＮＡ断片15μg を得た。該断片 3μg と BamHI
で切断し、アルカリホスファターゼ処理を施したコスミ
ドベクターpBSF PKM6 1μg とを T4 リガーゼで連結し
た後、パッケイジングエクストラクト（STRATAGENE社）
を用いてλファージ粒子内に封入した。かくして得た組
換えコスミド懸濁液を適当に希釈し、E.coli HB101(ATC
C33694) に感染させ、アンピシリン(100μg/ミリリット
ル) を含むＬブロス寒天培地上に出現するコロニー数を
計測した。その結果、この懸濁液は、２×10⁵ 個の組換
えコスミド粒子を含むことが判明した。このファージ液
をアクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリー
として保存した。なお、ここで使用したベクター pBSFP
KM6 は pBSFPKM５（該コスミドベクターの造成法は特願
平２ー２１９０３２に記載されている）をSfiIで切断
し、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ（Klenow）断片と４種
のデオキシヌクレオチド３リン酸を用いて平滑化した部
位に、BamHI リンカー（宝酒造：5'CCGGATCCGG3') を常
法によって挿入することにより作製した。

【００２６】b.プローブの調製；S.M.Samsonらの報告
〔Nature. 318,191(1985) 〕をもとに次の列を有するＤ
ＮＡオリゴマー：５’ＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＣＣ
ＧＡＡＴＡＧＧ３’を自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステム社のＤＮＡシンセサイザー・モデル３８
０−Ａ）を用いて、常法どおり合成した。次いで、該Ｄ
ＮＡオリゴマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチド・キ
ナーゼと〔γー32 Ｐ〕ＡＴＰを用いて放射能ラベルし
た。これをＩＰＳプローブと称し、ハイブリダイゼーシ
ョン実験に供した。

【００２７】c.ハイブリダイゼーションによるスクリー
ニング；a.で得たライブラリーの一部を E.coli HB101
に感染させ、アンピシリン（シグマ社）100 μg/ミリリ
ットルを含むＬ−ブロス寒天培地上に約１００００個の
コロニーとして生育させた後、これらをワットマン５４
１濾紙へ移した。ついで、0,5N NaOH/ 1,5M NaClで処理
して溶菌及びＤＮＡ変性を行い、0,5M Tris-HCl(pH7.0)
/ 1,5M NaCl により中和した後、上記ＩＰＳプローブと
ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーショ
ンは、6 ×SET,0,5 ％ノニデットP-40( シグマ社) 、0,
1mg/ミリリットル変性サケ精子ＤＮＡおよび終濃度 1×
10⁵ cpm/ ミリリットルでＩＰＳプローブを含有する溶
液を用いて、６０℃で１、５時間行った。この後 6×SS
C 溶液を用いて室温で２回、つづいて６０℃で１回濾紙
を洗浄した。次いで、この濾紙を乾燥させ、オートラジ
オグラフィーに供した。その結果、８個のハイブリダイ
ゼーション陽性のコロニーが見いだされた。そこで陽性
コロニーから６個をとりあげ、液体培養した後、常法に
よりコスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを Bam
HIで切断し、アガロースゲル電気泳動にかけた後、上記
ＩＰＳプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション
を行ったところ、すべてのクローンが有する3,2 KbのBa
mHI 断片が該プローブとハイブリダイズしていた。そこ
で、 COS1 と命名したクローン由来の該断片を PUC18
（宝酒造販）の BamHI部位に常法に従ってサブクローニ
ングし、該断片の制限酵素地図を作製した。これを既に
明かとなっているアクレモニウム・クリソゲナム由来の
IPNS遺伝子のそれと比較したところ、両者はよく一致し
ていた。さらに、この断片上NcoIからXhoIまでの塩基配
列は、 Samson らが報告したIPNS遺伝子のＮ末端コード
域の配列と完全に一致していた。以上の結果より、COS1
のインサート中にIPNS遺伝子が含まれていることが確認
された。また COS1 の HindII I,BamHI,SalIによる切断
パターンをGutierresら〔Journal of Bacteriology(199
1),173,2354-2365〕によって報告されたアクレモニウ
ム・クリソゲナムの ACVS,IPNS遺伝子クラスター領域の
制限酵素地図と比較することにより、COS1のインサート
はIPNS遺伝子の下流、少なくとも20Kb以上に渡る領域を
カバーしていることが示唆された。

【００２８】d.IPNS遺伝子の下流領域のサブクローニン
グと制限酵素地図の作製；c で得たCOS 1 をSal1で切断
したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、サザンの方
法により、ゲルからナイロンフィルターにＤＮＡを転写
した。該フィルターと32P で放射能ラベルしたpIPS1 の
約1Kb の Pst1-BamHI 断片（IPNS遺伝子のＣ末端コード
域から下流へ向かう約1Kb の断片）とのハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、約7,3Kb のSalI断片がハイブ
リダイズした。そこで、該断片をpUC18 のSalI部位にサ
ブクローニングし、挿入方向を異にする２種のプラスミ
ドpIPD1 、pIPD1'を得た。そして、これら２種のプラス
ミドを制限酵素解析に供し、該SalI断片の部分制限酵素
地図を作製した。次ぎに、COS1をEcoRI で切断し、上記
と同様にフィルターに転写した。ついで該フィルターと
³²P で放射能ラベルしたpIPD1 の約0,9KbpのKpnI断片
（KpnI部位とベクターのマルチクローニングサイトの
KpnI部位での切断で生ずる断片）とのサザンハイブリダ
イゼーションを行ったところ、約3,9Kb のEcoRI 断片が
ハイブリダイズした。そこで、この断片をpUC18のEcoRI
部位にサブクローニングし、プラスミドpIPD2を得た。
次いで、このプラスミドを用いて該断片の制限酵素地図
を作製し、上記SalI断片の地図とオーバーラップさせる
ことにより図３に示すとおり、IPNS遺伝子の下流約10Kb
に及ぶ領域の部分制限酵素地図を完成させた。なお、こ
の地図の下段には、上記３種のサブクローンプラスミド
pIPS1,pIPD1またはpIPD1',pIPD2中に含まれるインサー
トの領域を示した。

【００２９】（実施例２） 転写領域の同定 上記pIPD1 から数種の制限酵素断片を調製し、それをプ
ローブとしてアクレモニウム・クリソゲナムＲＮＡとの
ノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、
上記IPNS遺伝子の下流約10Kbに及ぶＤＮＡ断片上から、
少なくとも２種の未同定ＲＮＡが転写されていること、
すなわち、該断片上に２種の遺伝子が存在していること
が明かとなった。以下、実験の詳細を記述する。

【００３０】a.アクレモニウム・クリソゲナムのポリＡ
⁺ ＲＮＡ抽出；ＣＭ固形培地上３０℃、３日間生育させ
たアクレモニウム・クリソゲナムIS-5の菌糸体をＮ３シ
ード培地５０ミリリットルに接種し、２５℃で３日間培
養した。得られた培養液１ミリリットルをメイン培地３
０ミリリットルを含む５００ミリリットルのフラスコに
移植し、２５℃で３日間培養した。該菌液１０ミリリッ
トルから吸引濾過により集めた菌糸体を液体窒素中で凍
結させ、乳鉢と乳棒を用いてすりつぶした。かくして得
られた菌破砕粉末から TOTAL RNA ISOLATION KIT（イン
ビトロジェン社）を用いて、その添付プロトコールに従
って全ＲＮＡ800 μg を抽出した。次いで、この全ＲＮ
Ａからマニアティスの実験書に従って、オリゴ（ｄＴ）
セルロースクロマトグラフィー操作を行うことによりポ
リＡ⁺ ＲＮＡ 27 μg を得た。

【００３１】b.プローブの調製；上記pIPS1 の約0,4Kb
のXhoI-SacI 断片、約0,4KbpのClaI-BamHI断片ならびに
pIPD1 の約2,2Kb のPst1断片と、上記実施例１d)で得た
約0,9Kb の断片を32Ｐでラベルして、それぞれプローブ
Ａ、Ｂ，Ｃ，Ｄと称しハイブリダイゼーションに供し
た。なお、使用したプローブの染色体上における位置は
図３に示してある。

【００３２】c.ノーザンハイブリダイゼーション；a.で
得たポリＡ⁺ ＲＮＡ2 μg をマニアティスの実験書に記
載された方法に従ってグリオキザールにより変性し、1,
1 ％アガロースゲル中で電気泳動したのち、アマーシャ
ム社の添付プロトコールに従ってナイロンフィルター
（ハイボンドー Ｎ＋、アマーシャム社）にアルカリ転写
した。かくして得たフィルターをb)で調製した４種のプ
ローブとそれぞれハイブリダイゼーションさせた。ハイ
ブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳ
ＰＥ，５×デンハルツ、０．１％ＳＤＳ，100 μg/ミリ
リットルの変性サケ精子ＤＮＡ，および終濃度 2×10⁵
cpm/ミリリットルでプローブＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄをそれぞれ
含有する溶液中にて４２℃で１５時間行った。ついで、
これらのフィルターを０．１％のＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃ中、室温で２回づつ洗浄し、さらに、０. １％のＳＤ
Ｓを含む０．２×ＳＳＣ溶液中５５℃で３０分間したの
ち、オートラジオグラフィーを行った。その結果、プロ
ーブＡでは約１、３Ｋｂ（IPNSmRNA ）、プローブＣで
は約１、４Ｋｂ，そして、プローブＤでは約２、１Ｋｂ
のハイブダイゼーションバンドが検出された。これに対
してブローブＢとハイブリダイズするバンドは全く検出
されなかった。以上の結果、アクレモニウム・クリソゲ
ナムのIPNS遺伝子から下流約10KbまでのＤＮＡ断片上に
は、少なくとも２種の遺伝子が存在していることが明か
となった。以後、IPNS遺伝子側に位置し１、４Ｋｂの転
写産物を与える遺伝子をγ遺伝子、そして、IPNS遺伝子
から遠い方に位置し２．１Ｋｂの転写産物を与える遺伝
子をα遺伝子と称する。

【００３３】（実施例３） α遺伝子の解析 a.α-cDNA のクローニングとその構造解析；ベクタープ
ライマー（pcDV1 Oligo(d -Tailed Plasmid Primer: フ
ァルマシア社）、リンカー（pL1 Oligo(dG)-Tailed Lin
ker:ファルマシア社）を使用し、上記ポリＡ⁺ ＲＮＡ 4
μg から岡山・バーグ法〔Mol.Cell.Biol.,2 161(198
2)〕に従って、cDNAを組み込んだ組換えプラスミドを作
製した。該プラスミドを一部使用して大腸菌 MC1061(AT
CC53338)を形質転換し、アンピシリン100 μg を含有す
るＬ−ブロス寒天培地上（プレート30枚）に約30000 個
のコロニーを生育させた。次いで、該コロニーをハイボ
ンドＮ（アマーシャム社）に、アマーシャム社の添付プ
ロトコールに従って転写し、ＤＮＡを固定した。かくし
て得たフィルターを実施例２(C) で得たブローブＤとハ
イブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション
およびフィルターの洗浄は、実施例２c と同様に行っ
た。その結果、４個のハイブリダイゼーション陽性コロ
ニーが見いだされた。そこで、これらを取り上げ、液体
培養したのちプラスミドＤＮＡを調製した。そして、そ
れぞれをpAL1,pAL2,pAL3,pAL4 と命名した。これらプラ
スミドをBam HIで切断し、アガロースゲル電気泳動によ
り解析したところ、pAL3が最も長いcDNAインサートを含
有することが判明した。さらに、このサイズ（２、１Ｋ
ｂ）はノーザン法により検出されたα-mRNA のそれとよ
く一致していた。そこで、pAL3が有するcDNAインサート
の全塩基配列を、サンガーらの方法〔Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA 74 5463(1977) 〕に基づき決定した。塩基配列決
定の具体的実験手技は、タカラのシークエンシングキッ
ト（宝酒造販）を用いて、その添付プロトコールに従っ
て行った。かくして決定された 2113bp のＤＮＡ塩基配
列を配列表（配列番号１）に示す。本ＤＮＡ配列には、
116 番目に始まるＡＴＧから 2044 番で終わるＴＡＧま
で、６４２個のアミノ酸をコードしうるオープンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）が存在していた。該ＯＲＦか
ら翻訳したアミノ酸配列を配列表（配列番号１）の塩基
配列の下段に示した。

【００３４】b.α遺伝子の構造解析；上記 a．で明かと
なったα-cDNA断片の塩基配列と実施例１で得たIPNS遺
伝子下流域の地図とを照合したところ、α遺伝子はプロ
ーブＤを含む、図３中のPstI-EcoRV間、３、３Ｋｂ
の断片内に含有されていると推定された。そこで、この
断片の全塩基配列をa と同様の実験手技を用いて決定し
た。なお、決定した塩基配列は配列表（配列番号３：２
２２６番ー５５３７番）に示した。予想どおりこの配列
中には、上記cDNA配列から予想されたＯＲＦが完全に含
まれていた。また、このＯＲＦは５２ｂｐ、６３、６
７、５３ｂｐから成る４個のイントロンにより分断され
ていることが明かとなった。

【００３５】c.α遺伝子の破壊；図４に示される工程に
従って、アクレモニウム・クリソゲナムのα遺伝子を破
壊するためのプラスミドpDAL1 を構築した。以下に各工
程を説明する。先ずα遺伝子全体を含有する約6Kb の断
片（図３のPstI-EcoRIまでの領域）を所持するプラ
スミドpALNC1を以下のごとく作製した。pIPD1 をPstIで
切断したのち約5,6Kb の断片を分離精製し、該断片をＴ
４リガーゼで自己閉環させることによりpALN1 を得た。
次いで、該プラスミドをEcoRI で切断し、アルカリホス
ファタたのち約4,9Kb の断片を分離精製した。該断片と
pIPD2 の約3,9KbのE coRI断片（実施例１,d）とを、Ｔ
４リガーゼで連結することによりpALNC1を得た。次に、
このプラスミドからα遺伝子のコード域の約７割を含む
1,8Kb のEcoRV 断片を欠失させ、そこにマーカー遺伝子
を挿入することによりpDAL1 を作製した。すなわち、pA
LNC1をEcoRV で切断したのち約 6,9Kbの断片を分離精製
し、アルカリホスファターゼ処理を施した。一方、pACT
HY83をSnaBI と SmaI で二重切断し、ハイグロマイシン
Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子発現単位を含有する
約3,5Kb の断片を分離精製した。次いで、この両者をＴ
４リガーゼを用いて連結させることによりpDAL1 を得
た。DraI-SmaI で２重切断した上記pDAL1(10μg)を用い
て、参考例１、b の方法に従ってアクレモニウム・クリ
ソゲナムIS-5株の形質転換を行ったところ、二百数十株
のＨＹＢ形質転換体が得られた。この中からランダムに
３０株を選択し、参考例１b)と同様に培養して、セファ
ロスポリンＣ生産性を調べて見た。その結果、DAL19,DA
L30 と命名した２株のセファロスポリンＣ生産性は親株
であるIS-5株の２０分の１以下にまで低下していること
が判明した。また、サルモネラを用いたバイオアッセイ
〔Ott ら、The Journal ofAntibiotics,(1982)35,637-6
38〕を試みたところ、該培養液中にはセファロスポリン
Ｃ前駆体の一種であるイソペニシリンＮが多量に蓄積し
ていることも明かとなった。これら２株およびIS-5株か
ら参考例１、c と同様の方法に従って、染色体ＤＮＡを
抽出し、EcoRI もしくはSalIで切断した。ついで、この
切断ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動したのち、ナイロ
ンフィルターに転写し、放射能ラベルしたpIPD1 の約1,
8Kb のEcoRV 断片もしくはpALNC1の約1,8Kb のEcoRV 断
片とのサザンハイブリダイゼーションを行った。その結
果、DAL19 およびDAL30 株では染色体上のα遺伝子とpD
AL1 上の破壊された遺伝子とが期待どおり置換している
ことが判明した。すなわち、DAL19,DAL30 株では、pIPD
1 由来のプローブを用いた場合、EcoRI による切断で4,
1Kb の位置にハイブリダイゼーションシグナルが検出さ
れ、親株で観察された位置（3,3Kb ）にシグナルは全く
認められなかった。また、pALNC1由来のプローブを用い
た場合、親株ではSacIによる切断で6,3Kb の位置にハイ
ブリダイゼーションシグナルが明確に認められたが、DA
L19 およびDAL30 株では如何なる位置にもシグナルは検
出されなかった（図５）。以上の結果、本発明ＤＮＡ断
片上に存在するα遺伝子は、セファロスポリンＣ生合成
に関与する新規なタンパクをコードしているということ
が明かとなった。

【００３６】（実施例４） γ遺伝子の解析 a.γー cDNAのクローニングとその構造解析；実施例３、
a.で作製したcDNAライブラリー（約30000 コロニー）
を、実施例２(C) で得たプローブＣによるハイブリダイ
ゼーションにてスクリーニングしたところ、３個の陽性
コロニーが見いだされた。実施例３、a.と同様に、これ
らのコロニーよりプラスミドを調製、解析した結果、pG
AN2 と命名したプラスミドが最長のcDNAインサートを含
有していることが明かとなった。さらに、このインサー
トのサイズ（約１．４Ｋｂ）は、ノーザン解析により検
出されたγ-mRNA のそれとよく一致していた。そこで、
pGAN2が保有するcDNAインサートの全塩基配列を実施例
４と同様の実験手技を用いて決定した。かくして得られ
た１４６２bpの塩基配列を配列表（配列番号２）に示
す。本ＤＮＡ配列には、５２番目に始まるＡＴＧから１
２０３番で終わるＴＡＧまで、３８３個のアミノ酸をコ
ードしうるＯＲＦが存在していた。該ＯＲＦより翻訳し
たアミノ酸配列を配列表（配列番号２）の塩基配列の下
段に示した。

【００３７】b.γ遺伝子の構造解析；上記 a．で明かと
なったγ-cDNA の塩基配列と実施例１で得たIPNS遺伝子
下流域の地図とを照合したところ、γ遺伝子は実施例２
において使用したプローブＣ、すなわち、図３中のPstI
-PstI 間、2,1Kb の断片内に含有されていると推定
された。そこで、この断片の全塩基配列を決定した。か
くして得られた配列を配列表（配列番号３：１番ー２２
３１番）に示した。予想どおりこの配列中に、上記cDNA
配列から予想されたＯＲＦが完全に含まれていた。ま
た、γ遺伝子は94bpからなる少なくとも１個のイントロ
ンを所有しており、上記α遺伝子とは逆方向に転写され
ることなどが明かとなった。

【００３８】c.γ遺伝子の破壊；第６図に示される工程
に従って、アクレモニウム・クリソゲナムのγ遺伝子を
破壊するためのプラスミドpDNS1 を構築した。先ずpIPD
1'をNcoIとStuIで切断した後、約 9Kbの断片を分離精製
し、該断片の両末端をＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片
と４種のデオキシヌクレオシド５’- ３リン酸を用いて
平滑化した。次いで、この断片と実施例３、c)で得た p
ACTHY83 由来の約 3,5KbのSnaBI-SmaI断片とを、Ｔ４リ
ガーゼを用いて連結させることによりpDNS1 を得た。Sm
aIで切断したpDNS1 （10μg ）を用いて、参考例１、b)
の方法に従ってアクレモニウム・クリソゲナムIS-5株の
形質転換を行ったところ、二百数十株のＨＹＢ形質転換
体が得られた。この中から１０株をランダムに選択し、
参考例１、b と同様に培養して、セファロスポリンＣ生
産性を調べてみた。その結果、DNS1,DNS5 と命名した２
株のセファロスポリンＣ生産性は、親株であるIS-5株の
１０分の１以下にまで低下していることが判明した。ま
た、驚くべきことに、これらの株も上記α破壊株と同様
に、多量のイソペニシリンＮを蓄積していることが明か
となった。これら２株およびIS-5株から参考例１、c と
同様の方法に従って、染色体ＤＮＡを抽出し、EcoRI も
しくは SalI で切断した。これらＤＮＡ切断物をアガロ
ースゲル電気泳動した後、ナイロンフィルターに転写
し、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブ
は、EcoRI 切断の場合はpIPD1 の約 0,35Kb のEcoRI 断
片、そして、SalI切断の場合はpIPD1 の約1,8Kb のEcoR
V 断片をそれぞれ放射能ラベルして使用した。その結
果、DNS1およびDNS5株では染色体上のNcoI-StuI 断
片がハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子発現単位と期待どおり置換していることが判明した。
すなわち、DNS1およびDNS5株では、EcoRI による切断で
4,9Kb 、SalIによる切断で3,9Kb の断片がそれぞれのプ
ローブとハイブリダイズし、親株で観察された位置（Ec
oRI:3,3Kb, SalI:7,3Kb）にハイブリダイゼーションシ
グナルは全く認められなかった（図７）。

【００３９】以上の結果、本発明ＤＮＡ断片上に存在す
るγ遺伝子は、先述のα遺伝子と同様に、セファロスポ
リンＣ生合成に関与する新規なタンパクをコードしてい
るということが明かとなった。さらに、これら遺伝子欠
損株において蓄積する中間代謝物の解析結果から、両遺
伝子はいずれもイソペニシリンＮエピメラーゼ活性発現
に関与していることも明かとなった。先述の参考例およ
び実施例において制限酵素消化により生ずるＤＮＡ断片
の分離は、すべて１％アガロースゲル電気泳動により行
い、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の単離精製は、ジ
ーンクリーン（GENE CLEAN,フナコシ社販）を用いて、
その添付プロトコールに従って行った。また特に断わら
ない限り、ＤＮＡ断片の放射能ラベル化は、マルチプラ
イムＤＮＡラベリングシステム（Maltiprime DNA label
ling system : Amersham）を用いて、それに付属するプ
ロトコールに従って行った。また、ＤＮＡ断片の結合反
応、該反応により生ずるプラスミドを用いた大腸菌の形
質転換、得られた形質転換体からのプラスミドの調製お
よびその解析等の基本操作は、すべてマニアテスの実験
書に記載された方法に準じて行った。

【００４０】

【発明の効果】実施例に開示したとおり、本発明のＤＮ
Ａ断片上には、アクレモニウム・クリソゲナムにおける
セファロスポリンＣ生合成に関与する新規遺伝子が少な
くとも２個存在している。したがって、該断片あるい
は、該遺伝子に対応するcDNA化合物を使用することによ
り、セファロスポリンＣ発酵能が向上したアクレモニウ
ム・クリソゲナム株の創製が期待できる。

【配列表】

【００４１】配列番号：１ 配列の長さ：2113 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲ ナム (Acremonium
chrysogenum) 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：116..2044 特徴を決定した方法：P 配列 ACTTACACCC TTCTCCGAGA CAGTCAAAGC CACCAGCACC AGCACCAATG TCTCGGAGGC 60 AAGGACATCG CTCGCAAAGA CACAAGCACA CACGGGAGCA TAACGGCAAT CCCCA ATG 118 Met 1 GCA CCC GGC GGC CTA CTA ACC CTC GCT GGC GCC GCT GCC GCC AGC ACC 166 Ala Pro Gly Gly Leu Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ser Thr 5 10 15 GCC GCC GCT GCC TAC CTC GAC GCC AAG CTT CAC CTC ACC AAG GAC CTC 214 Ala Ala Ala Ala Tyr Leu Asp Ala Lys Leu His Leu Thr Lys Asp Leu 20 25 30 AAC CAG CTC GCC CGC GCC GAA CGG GGG GCC CAG AAC TTC GCC AGA GCT 262 Asn Gln Leu Ala Arg Ala Glu Arg Gly Ala Gln Asn Phe Ala Arg Ala 35 40 45 GTT GAG CAG CGC AAG GCA TCT GGC TTC TTC CTC TTC GAG GCC GCC GCT 310 Val Glu Gln Arg Lys Ala Ser Gly Phe Phe Leu Phe Glu Ala Ala Ala 50 55 60 65 GCC CGC CTC GGC GAT GCA CCT TGC ATC TGG TCG CGC GGG CAC CCC GAG 358 Ala Arg Leu Gly Asp Ala Pro Cys Ile Trp Ser Arg Gly His Pro Glu 70 75 80 TAC TCG TGG ACG CAG ACG TAC CAA CGC GCA TGT CAG TAT GGC CAC TAC 406 Tyr Ser Trp Thr Gln Thr Tyr Gln Arg Ala Cys Gln Tyr Gly His Tyr 85 90 95 TTC CGC GAT CTG GGC GTG GTG GCC GGG CAG CAC GTC GGT GTT TAT CTG 454 Phe Arg Asp Leu Gly Val Val Ala Gly Gln His Val Gly Val Tyr Leu 100 105 110 TAC AAC TCG CCG GAG CTG ATG TTC ATC TGG ATG GGT CTA CTG TCT ATC 502 Tyr Asn Ser Pro Glu Leu Met Phe Ile Trp Met Gly Leu Leu Ser Ile 115 120 125 GGT GCT GCT CCT GCC CTC ATC AAT TAC AAT CTC GGC TCT GAT GCT CTG 550 Gly Ala Ala Pro Ala Leu Ile Asn Tyr Asn Leu Gly Ser Asp Ala Leu 130 135 140 145 GTT CAC TGT GTC CGC TTG TCG CGC TCG CGG TTT CTG ATA TAC GAT GAT 598 Val His Cys Val Arg Leu Ser Arg Ser Arg Phe Leu Ile Tyr Asp Asp 150 155 160 GCG TCC GAT TGT TCC TCT CGC ATT CAC GAA GTT GGT GAG CGG CTT CGG 646 Ala Ser Asp Cys Ser Ser Arg Ile His Glu Val Gly Glu Arg Leu Arg 165 170 175 GAT ATC AAT GTC GAG GCT ATC ATG CTC TCC GGC ACG CTG AAG GAA GAC 694 Asp Ile Asn Val Glu Ala Ile Met Leu Ser Gly Thr Leu Lys Glu Asp 180 185 190 ATT GCC CGG AAA GAA ACA CAC AGG GCA CCG GTA GAT TGC TTC GAG GAC 742 Ile Ala Arg Lys Glu Thr His Arg Ala Pro Val Asp Cys Phe Glu Asp 195 200 205 ACC AAG GTG CTG CTA CCG TTT GCT TTG ATG TAC ACT AGT GGT ACG ACT 790 Thr Lys Val Leu Leu Pro Phe Ala Leu Met Tyr Thr Ser Gly Thr Thr 210 215 220 225 GGC CTG CCA AAG GCC GCA CCC ATC ACA GTG GCC AGG AAC TAT CCC TCT 838 Gly Leu Pro Lys Ala Ala Pro Ile Thr Val Ala Arg Asn Tyr Pro Ser 230 235 240 GCT TCA CTG CTG CCA AAG ACA TTT GGG CAG AAA CCG GGC CCC AAC GGT 886 Ala Ser Leu Leu Pro Lys Thr Phe Gly Gln Lys Pro Gly Pro Asn Gly 245 250 255 GAC CGC ACC TAC TAC TGC ATC CCG CTC TAC CAC GGA ACG GGG GGC ATC 934 Asp Arg Thr Tyr Tyr Cys Ile Pro Leu Tyr His Gly Thr Gly Gly Ile 260 265 270 GCG GCC ATG AAC GAC TTG ATG AGC GGA ATA TCC ATT GCT CTT GCG CCC 982 Ala Ala Met Asn Asp Leu Met Ser Gly Ile Ser Ile Ala Leu Ala Pro 275 280 285 AAG TTC TCC TTG TCT CGC TTC TGG GAC GAT TGC ATA GAG AGC GGG TCA 1030 Lys Phe Ser Leu Ser Arg Phe Trp Asp Asp Cys Ile Glu Ser Gly Ser 290 295 300 305 ACA ATA TTT GTC TAT GTC GGG GAA CTT ATT CGG TAC CTA CTC TCT GCT 1078 Thr Ile Phe Val Tyr Val Gly Glu Leu Ile Arg Tyr Leu Leu Ser Ala 310 315 320 CCG GCC TCA CCA AAG GAC CGT CAG CAC CGC GTC CGT CTC GTC TGG GGG 1126 Pro Ala Ser Pro Lys Asp Arg Gln His Arg Val Arg Leu Val Trp Gly 325 330 335 AAC GGA CTC AGC CCG GAA CTC TGG ACC AAA TTC CAG GAC CGC TTC GGC 1174 Asn Gly Leu Ser Pro Glu Leu Trp Thr Lys Phe Gln Asp Arg Phe Gly 340 345 350 GTA TCG GAC ATC GGT GAA TTC TAC GCC AGC ACA GAA GGC GTC CTG ACA 1222 Val Ser Asp Ile Gly Glu Phe Tyr Ala Ser Thr Glu Gly Val Leu Thr 355 360 365 CTC TTA AAA CAC TAC CGC GGC GGT GGT TTC GGC CTC GGC GCC GTC GGC 1270 Leu Leu Lys His Tyr Arg Gly Gly Gly Phe Gly Leu Gly Ala Val Gly 370 375 380 385 CAC CAC GGT TGG CTC CTC CGC CGC AAG TTT CAC AAT GAC TAC GTA CCC 1318 His His Gly Trp Leu Leu Arg Arg Lys Phe His Asn Asp Tyr Val Pro 390 395 400 GTC AGG ATC GAC CCG GAG ACG GGT GAC ATC TGG CGG TCG CCG AAG ACG 1366 Val Arg Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asp Ile Trp Arg Ser Pro Lys Thr 405 410 415 GGC TTT GCC GAG CGA CTG CCG TAC GAG AGG GGC GGT GAG ATC CTG GCG 1414 Gly Phe Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Glu Arg Gly Gly Glu Ile Leu Ala 420 425 430 CGG CTC CCG TCA CGG TCA GCC TGG GCT GGG TAC TGG CAT GCT GAG GAG 1462 Arg Leu Pro Ser Arg Ser Ala Trp Ala Gly Tyr Trp His Ala Glu Glu 435 440 445 GCG ACG CAG AAG AAG CTG GTG GAG AAT GTG TTT GAG AAG GGG GAT CTG 1510 Ala Thr Gln Lys Lys Leu Val Glu Asn Val Phe Glu Lys Gly Asp Leu 450 455 460 465 TAC TTC CGG ACG GGT GAT GCT CTT CGA CGC GAT GCC GAC GGT CAC TGG 1558 Tyr Phe Arg Thr Gly Asp Ala Leu Arg Arg Asp Ala Asp Gly His Trp 470 475 480 TAC TTT CTC GAC CGA CTT GGC GAC ACA TAC CGC TGG AAA GGA GAA AAC 1606 Tyr Phe Leu Asp Arg Leu Gly Asp Thr Tyr Arg Trp Lys Gly Glu Asn 485 490 495 GTG TCC ACG ACC GAG GTA GGA CAA GTC CTG GGC TCA CAC GCA GAC ATT 1654 Val Ser Thr Thr Glu Val Gly Gln Val Leu Gly Ser His Ala Asp Ile 500 505 510 GCC GAG GCC AAT GTC TAC GGC GTC CAG GTC CCC AAC CAC GAC GGG CGA 1702 Ala Glu Ala Asn Val Tyr Gly Val Gln Val Pro Asn His Asp Gly Arg 515 520 525 GCC GGC TGC GCA GCC ATC GCA TTG AAG AAC GCG GCA ACC CCA GAC ACG 1750 Ala Gly Cys Ala Ala Ile Ala Leu Lys Asn Ala Ala Thr Pro Asp Thr 530 535 540 545 TTG GAC TGG TCA CGG CTG ACG TCG CTC CTG CGG TCA GAG TTG CCC TCC 1798 Leu Asp Trp Ser Arg Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ser Glu Leu Pro Ser 550 555 560 TAC GCC GTT CCT GTC TTC ATT AGG GTG CGG GAG ACG GTG GGA GGC ATG 1846 Tyr Ala Val Pro Val Phe Ile Arg Val Arg Glu Thr Val Gly Gly Met 565 570 575 AGC ACG GAT AAC CAT AAA CAC AAC AAG GTG CCA CTC CGC GAC GAG GGG 1894 Ser Thr Asp Asn His Lys His Asn Lys Val Pro Leu Arg Asp Glu Gly 580 585 590 GTC GAC CCG CGC TCC ATG GGC AGC AAG GTC CCT GGA GGT GAA AAG GAT 1942 Val Asp Pro Arg Ser Met Gly Ser Lys Val Pro Gly Gly Glu Lys Asp 595 600 605 CGC TTC TTC TGG CTG CCG GCC GGT GCG AGC AAG TAT GTT CCC TTT ACC 1990 Arg Phe Phe Trp Leu Pro Ala Gly Ala Ser Lys Tyr Val Pro Phe Thr 610 615 620 625 GAG CGG GAC TGG GAT CTA CTG TCC GGC CAG TCG GCG GCT CGG CCA AGA 2038 Glu Arg Asp Trp Asp Leu Leu Ser Gly Gln Ser Ala Ala Arg Pro Arg 630 635 640 CTC TAGTTGCTAT TAACGGGACC CATCGACGCG TGAAACGATG TAACATAGAA 2091 Leu AACAAATGTG GCTTGCAAAA CA 2113

【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：1462 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲ ナム(Acremonium
chrysogenum) 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置：52..1203 特徴を決定した方法：P 配列 CCGACATTAC ATGTTGTAGT CTTGACCATT CACGCGGTTA ATCCCACCTC G ATG GAC 57 Met Asp 1 CCC TCT CGC CCA CAT CCG CTA TCC GGC AAG CTT GTC GTA GAG CTC GCG 105 Pro Ser Arg Pro His Pro Leu Ser Gly Lys Leu Val Val Glu Leu Ala 5 10 15 GGG CTA GCC CCA GGC CCA TTC TGT GGC ATG CTC TTG GCA GAC TAT GGC 153 Gly Leu Ala Pro Gly Pro Phe Cys Gly Met Leu Leu Ala Asp Tyr Gly 20 25 30 GCC TCA GTA CTC CGC ATC GAC GGA CCG CGA TCC CCA AAG GGG GAC GTC 201 Ala Ser Val Leu Arg Ile Asp Gly Pro Arg Ser Pro Lys Gly Asp Val 35 40 45 50 CTG GCG AGG AAC AAG TCG TCC ATC TGC ATC GAC TTG AAG CAT CCG CCC 249 Leu Ala Arg Asn Lys Ser Ser Ile Cys Ile Asp Leu Lys His Pro Pro 55 60 65 TCA CGC AAG GTG CTC CTC TCC ATC CTG TCC CGC GCG GAC GTG CTC ATC 297 Ser Arg Lys Val Leu Leu Ser Ile Leu Ser Arg Ala Asp Val Leu Ile 70 75 80 GAC CCG TTC CGG CCC GGC GTC CTG GAG CGT CTG GGG CTC TCC CCC ACA 345 Asp Pro Phe Arg Pro Gly Val Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ser Pro Thr 85 90 95 GAG GTC CTT CTC AAG GCG AAT GCC CGC CTG GTG GTC GCC CGT CTC ACC 393 Glu Val Leu Leu Lys Ala Asn Ala Arg Leu Val Val Ala Arg Leu Thr 100 105 110 GGC TTC CGC CGA GAT GGC AAG TAC CAG GAC ATG GCA GGC CAT GAT ATC 441 Gly Phe Arg Arg Asp Gly Lys Tyr Gln Asp Met Ala Gly His Asp Ile 115 120 125 130 AAC TAC CTC GCC GTG TCT GGC GTC CTG GCT ATG CTT GGT AGG GCA GGC 489 Asn Tyr Leu Ala Val Ser Gly Val Leu Ala Met Leu Gly Arg Ala Gly 135 140 145 GAG AAT CCC TTC CCG CCG GCC AAC ATC CTC GGC GAC TTT GCC GGA GGG 537 Glu Asn Pro Phe Pro Pro Ala Asn Ile Leu Gly Asp Phe Ala Gly Gly 150 155 160 GGC GCC ATG TGC GTC GTG GGA ATT CTG CTG GCG CTC GTA TCG CGC GAT 585 Gly Ala Met Cys Val Val Gly Ile Leu Leu Ala Leu Val Ser Arg Asp 165 170 175 GCC ACG GGG CTT GGC CAG GTC GTC GAG GCC AAC ATG GTG GAC GGG TCT 633 Ala Thr Gly Leu Gly Gln Val Val Glu Ala Asn Met Val Asp Gly Ser 180 185 190 GCG TAC CTG GCC ACG ATG CCG CGC CTG GCG ACC AAG ACG CCC TTC TGG 681 Ala Tyr Leu Ala Thr Met Pro Arg Leu Ala Thr Lys Thr Pro Phe Trp 195 200 205 210 GGT TCC CCG CGG GGC GAG AAT GTC CTG GAC GGA GGG TGC CCC TGG TAT 729 Gly Ser Pro Arg Gly Glu Asn Val Leu Asp Gly Gly Cys Pro Trp Tyr 215 220 225 GCG ACA TAC CGG ACA AAG GAC CCC GGC GGG AAG TAC ATG GCC GTG GGA 777 Ala Thr Tyr Arg Thr Lys Asp Pro Gly Gly Lys Tyr Met Ala Val Gly 230 235 240 GCG CTG GAG CCT CAC TTC TAC GAG GTG CTG GTG CGA GGT CTG GGC CTG 825 Ala Leu Glu Pro His Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg Gly Leu Gly Leu 245 250 255 GAC AAG ACG GAC CTG CCT CCG CGG GAG GAT AGG GCC AAT TGG CCG AGA 873 Asp Lys Thr Asp Leu Pro Pro Arg Glu Asp Arg Ala Asn Trp Pro Arg 260 265 270 CTG AGG GCG CTA TTC GAG GCA AAA TTT GCG GAG AGG ACG CGC AGC GAG 921 Leu Arg Ala Leu Phe Glu Ala Lys Phe Ala Glu Arg Thr Arg Ser Glu 275 280 285 290 TGG GCG GAG GTC TTT GAC GGG ACG GAT GCC TGC GTC ACC CCG GTC CTG 969 Trp Ala Glu Val Phe Asp Gly Thr Asp Ala Cys Val Thr Pro Val Leu 295 300 305 GAG CAA GGT GAG CTG GAG AAG GCC GGC TTC GAA CAA CGG CTT CCC GTG 1017 Glu Gln Gly Glu Leu Glu Lys Ala Gly Phe Glu Gln Arg Leu Pro Val 310 315 320 AAT TTG GGG GCC ACG CCG GGA AAG CCT ATT CTT CCC GGA CAG GGT GAT 1065 Asn Leu Gly Ala Thr Pro Gly Lys Pro Ile Leu Pro Gly Gln Gly Asp 325 330 335 TGG ACG GGC GGG ACC CTT GCC AAG GGC CAT GGA GGA GAG GAG ATC CTG 1113 Trp Thr Gly Gly Thr Leu Ala Lys Gly His Gly Gly Glu Glu Ile Leu 340 345 350 CGC CGG TGG ATT GGG TGG GAA AGG GGG GTT GAC TAC CAC GTT GAG GAG 1161 Arg Arg Trp Ile Gly Trp Glu Arg Gly Val Asp Tyr His Val Glu Glu 355 360 365 370 AAT AGC GGA ATT CTC GTC GCT TGT TCG CGG GAA AAG TTG TAGGCAGGCA 1210 Asn Ser Gly Ile Leu Val Ala Cys Ser Arg Glu Lys Leu 375 380 GGCAGGCCAT GCTGGTACAT GCATGCAATG TTGGCCGCTT ATGTACGTAT GTGCATACAT 1270 AAACATTGAC AATAGTGGTG TCATGAAGGA GGAGGGGGGG GGTGGGTTTC GGCCCCTGAC 1330 GGTGGCTTGA TCGGGACATG GACGCCGCAT CGTCAGCGGA GTCAAGCCTC CCGACAGACC 1390 TGCCGACCCG ACATCCGAGT ATCTGTACGT AAGATTGCAT ACCAACAATG TACACCTACT 1450 TCCTACGGTT CC 1462

【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：5537 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アクレモニウム クリソゲ ナム(Acremonium
chrysogenum) 株名：IS5 配列の特徴 特徴を表す記号：intron 存在位置：1613..1520 3860..3911 4178..4240 435
7..4423 4839..4891 特徴を決定した方法：E 配列 CTGCAGTAAT TACGCCTTGT ATTATCTCAG TGCGACAGCA GCATGGTTGA GAGTCCCCAA 60 CGAGGATGAA GACGGTGAAA AGGGAGGTCG CATCCCAAGG CTGTGAATTC CAACACAGGC 120 AGCACGATTT TTCTTTTTTC ATTTCGCTCC ATGCAACCTC CAGAGAGAAA ATCCTGGAAC 180 CGTAGGAAGT AGGTGTACAT TGTTGGTATG CAATCTTACG TACAGATACT CGGATGTCGG 240 GTCGGCAGGT CTGTCGGGAG GCTTGACTCC GCTGACGATG CGGCGTCCAT GTCCCGATCA 300 AGCCACCGTC AGGGGCCGAA ACCCACCCCC CCCCTCCTCC TTCATGACAC CACTATTGTC 360 AATGTTTATG TATGCACATA CGTACATAAG CGGCCAACAT TGCATGCATG TACCAGCATG 420 GCCTGCCTGC CTGCCTACAA CTTTTCCCGC GAACAAGCGA CGAGAATTCC GCTATTCTCC 480 TCAACGTGGT AGTCAACCCC CCTTTCCCAC CCAATCCACC GGCGCAGGAT CTCCTCTCCT 540 CCATGGCCCT TGGCAAGGGT CCCGCCCGTC CAATCACCCT GTCCGGGAAG AATAGGCTTT 600 CCCGGCGTGG CCCCCAAATT CACGGGAAGC CGTTGTTCGA AGCCGGCCTT CTCCAGCTCA 660 CCTTGCTCCA GGACCGGGGT GACGCAGGCA TCCGTCCCGT CAAAGACCTC CGCCCACTCG 720 CTGCGCGTCC TCTCCGCAAA TTTTGCCTCG AATAGCGCCC TCAGTCTCGG CCAATTGGCC 780 CTATCCTCCC GCGGAGGCAG GTCCGTCTTG TCCAGGCCCA GACCTCGCAC CAGCACCTCG 840 TAGAAGTGAG GCTCCAGCGC TCCCACGGCC ATGTACTTCC CGCCGGGGTC CTTTGTCCGG 900 TATGTCGCAT ACCAGGGGCA CCCTCCGTCC AGGACATTCT CGCCCCGCGG GGAACCCCAG 960 AAGGGCGTCT TGGTCGCCAG GCGCGGCATC GTGGCCAGGT ACGCAGACCC GTCCACCATG 1020 TTGGCCTCGA CGACCTGGCC AAGCCCCGTG GCATCGCGCG ATACGAGCGC CAGCAGAATT 1080 CCCACGACGC ACATGGCGCC CCCTCCGGCA AAGTCGCCGA GGATGTTGGC CGGCGGGAAG 1140 GGATTCTCGC CTGCCCTACC AAGCATAGCC AGGACGCCAG ACACGGCGAG GTAGTTGATA 1200 TCATGGCCTG CCATGTCCTG GTACTTGCCA TCTCGGCGGA AGCCGGTGAG ACGGGCGACC 1260 ACCAGGCGGG CATTCGCCTT GAGAAGGACC TCTGTGGGGG AGAGCCCCAG ACGCTCCAGG 1320 ACGCCGGGCC GGAACGGGTC GATGAGCACG TCCGCGCGGG ACAGGATGGA GAGGAGCACC 1380 TTGCGTGAGG GCGGATGCTT CAAGTCGATG CAGATGGACG ACTTGTTCCT CGCCAGGACG 1440 TCCCCCTTTG GGGATCGCGG TCCGTCGATG CGGAGTACTG AGGCGCCATA GTCTGCCAAG 1500 AGCATGCCAC AGAATGGGCC TGGAGTGCGC GAGTTAGTGC GTGAGCGCAA GAAGCGGCTT 1560 CTATGCGTAG GCCTCTCGGC AGAGCAACAT GAAAGTGGCT ATGGATGACG GACCTGGGGC 1620 TAGCCCCGCG AGCTCTACGA CAAGCTTGCC GGATAGCGGA TGTGGGCGAG AGGGGTCCAT 1680 CGAGGTGGGA TTAACCGCGT GAATGGTCAA GACTACAACA TGTAATGTCG GCAGGTGGTC 1740 AGCGGAAATC CCACCATGCC ATTTGATGTT ATTGTAGTCC GTACTTGCAA TCTCGAAGCC 1800 TGCCTCGGCA TGGATGGTGC AGCGTGGTGA GGTGGCATTC GCGTAACTTC TACCCACGTG 1860 TACAGACGAC TCGGGTCCGA TACCGCGCAG CGACTATGAA AACATGGGTG GATATCAAAA 1920 GCGCATCGGG GACGTTGAAG ATTCTTGTCT CGGCATGTAC TCTGCTGTAG TATCAAGGGC 1980 GGAGCCTGTG CATCGAAGCT GAAAATCTAG CTGCACCAAG GACGGGGCGC ATGCCAGTGT 2040 CCAAGAATAG ACTCATCGTC TCCATCCTCC CATCATGAAT GAAACCTGCC CAGTTGGGCA 2100 AGCAGGTTGT TGCCAAGTAA TAACTTCAGA CATAATTCAT AGTCATCCAG AGCACAGACT 2160 ACGGATACAC GACCTCATTA TGGCATGGCA TGTATGCAGA CTGTGCGCCT AAATCAGGCA 2220 TCATTCTGCA GTACAAATGT TGCCTCCGAT GGTCCGTGTC TTGTATTACT TGGCGGAGCA 2280 TGTACTGTAA TATCACCCCC CTGTCATGTA CGGAGAAACG CAAGTATCAA TGTAATGTTC 2340 GTGCAAGGTG GGTGTACATT ATAGGCGCTC CTGTGGCAGC ACAGATGTAC ATGTACAACT 2400 TACATAGTCA CGGGTACTTG CTATATTAAG ACGCAGGGGG CCGGCCCGCT CGATCCAGTC 2460 AAGGCACAGC ATCTGATTCG ATCCAGACCA ATGCTTAGTA CATGTAACCT TAACCACTAG 2520 CTCTTAAGCT GTAAGCACTT CTGCCCGCGG AGCCGACCCG CCCTCACCCC CTGTCCGGCT 2580 GTTGTACCGT ACGAAGGGAT GAGTTGGCCA CGGTGTTTCC ACCACGTAGC CTATGCGTAC 2640 AGTATGCGCT GCTTGGCGTC GGTCTTGGGC AGTGAATATC ATCCCGTAGC CAAGAGTCAG 2700 CGTATTACTG TCCATGTTCT TTTACGTAAG GTACAATGTT TGTATGTAGT CGAGACTATA 2760 ACCTGGACAC GCATGGCCGC GGCCATATCC GACAGGAACA GTCCTTGAAT CTTCAGTGCC 2820 TGGTTCCACG GGCGCCGTAC AGTACCGTAC GGAGTCCGGA CGTACGGACA CCTCTTGTTA 2880 GTGCGGCCGC AACATCGCCG CCGATCTCCC TCCATCCATG TCCCTTGGCC CCCTCCCAAA 2940 AGGGCCCAAA CCCACAGACC CGCCACACCA TCAGGTCTCC CAAGCTTCTG GGTGCCGAGG 3000 CTAGCAGTCT TCAACAACTA TTCGTCAATA CTGGTTGTGT CCGTGTTTGG TCAACTTTTG 3060 GACTCCCGAT CGCACGATCA CTTACACCCT TCTCCGAGAC AGTCAAAGCC ACCAGCACCA 3120 GCACCAATGT CTCGGAGGCA AGGACATCGC TCGCAAAGAC ACAAGCACAC ACGGGAGCAT 3180 AACGGCAATC CCCAATGGCA CCCGGCGGCC TACTAACCCT CGCTGGCGCC GCTGCCGCCA 3240 GCACCGCCGC CGCTGCCTAC CTCGACGCCA AGCTTCACCT CACCAAGGAC CTCAACCAGC 3300 TCGCCCGCGC CGAACGGGGG GCCCAGAACT TCGCCAGAGC TGTTGAGCAG CGCAAGGCAT 3360 CTGGCTTCTT CCTCTTCGAG GCCGCCGCTG CCCGCCTCGG CGATGCACCT TGCATCTGGT 3420 CGCGCGGGCA CCCCGAGTAC TCGTGGACGC AGACGTACCA ACGCGCATGT CAGTATGGCC 3480 ACTACTTCCG CGATCTGGGC GTGGTGGCCG GGCAGCACGT CGGTGTTTAT CTGTACAACT 3540 CGCCGGAGCT GATGTTCATC TGGATGGGTC TACTGTCTAT CGGTGCTGCT CCTGCCCTCA 3600 TCAATTACAA TCTCGGCTCT GATGCTCTGG TTCACTGTGT CCGCTTGTCG CGCTCGCGGT 3660 TTCTGATATA CGATGATGCG TCCGATTGTT CCTCTCGCAT TCACGAAGTT GGTGAGCGGC 3720 TTCGGGATAT CAATGTCGAG GCTATCATGC TCTCCGGCAC GCTGAAGGAA GACATTGCCC 3780 GGAAAGAAAC ACACAGGGCA CCGGTAGATT GCTTCGAGGA CACCAAGGTG CTGCTACCGT 3840 TTGCTTTGAT GTACACTAGG TGAGTAAAGC CTCGGACTTC ACCCACCAGT TGCACATTCT 3900 CACGGCAAAA GTGGTACGAC TGGCCTGCCA AAGGCCGCAC CCATCACAGT GGCCAGGAAC 3960 TATCCCTCTG CTTCACTGCT GCCAAAGACA TTTGGGCAGA AACCGGGCCC CAACGGTGAC 4020 CGCACCTACT ACTGCATCCC GCTCTACCAC GGAACGGGGG GCATCGCGGC CATGAACGAC 4080 TTGATGAGCG GAATATCCAT TGCTCTTGCG CCCAAGTTCT CCTTGTCTCG CTTCTGGGAC 4140 GATTGCATAG AGAGCGGGTC AACAATATTT GTCTATGGTA AGCCACTACT CTCCCTTGGT 4200 ACCCTTCTTC GACTTGTTTG CCCTCCTGAC GAGTGTACAG TCGGGGAACT TATTCGGTAC 4260 CTACTCTCTG CTCCGGCCTC ACCAAAGGAC CGTCAGCACC GCGTCCGTCT CGTCTGGGGG 4320 AACGGACTCA GCCCGGAACT CTGGACCAAA TTCCAGGTAT GATCCCCCTT TACTTCGGTC 4380 CAGCCCCATC GAAACCATAG GATTGACACC AAGCGACAAA CAGGACCGCT TCGGCGTATC 4440 GGACATCGGT GAATTCTACG CCAGCACAGA AGGCGTCCTG ACACTCTTAA AACACTACCG 4500 CGGCGGTGGT TTCGGCCTCG GCGCCGTCGG CCACCACGGT TGGCTCCTCC GCCGCAAGTT 4560 TCACAATGAC TACGTACCCG TCAGGATCGA CCCGGAGACG GGTGACATCT GGCGGTCGCC 4620 GAAGACGGGC TTTGCCGAGC GACTGCCGTA CGAGAGGGGC GGTGAGATCC TGGCGCGGCT 4680 CCCGTCACGG TCAGCCTGGG CTGGGTACTG GCATGCTGAG GAGGCGACGC AGAAGAAGCT 4740 GGTGGAGAAT GTGTTTGAGA AGGGGGATCT GTACTTCCGG ACGGGTGATG CTCTTCGACG 4800 CGATGCCGAC GGTCACTGGT ACTTTCTCGA CCGACTTGGT ACGTTATCCC TGCTACAATC 4860 GCAGAGTGAC AATGCTAAAC GTGAATACCA GGCGACACAT ACCGCTGGAA AGGAGAAAAC 4920 GTGTCCACGA CCGAGGTAGG ACAAGTCCTG GGCTCACACG CAGACATTGC CGAGGCCAAT 4980 GTCTACGGCG TCCAGGTCCC CAACCACGAC GGGCGAGCCG GCTGCGCAGC CATCGCATTG 5040 AAGAACGCGG CAACCCCAGA CACGTTGGAC TGGTCACGGC TGACGTCGCT CCTGCGGTCA 5100 GAGTTGCCCT CCTACGCCGT TCCTGTCTTC ATTAGGGTGC GGGAGACGGT GGGAGGCATG 5160 AGCACGGATA ACCATAAACA CAACAAGGTG CCACTCCGCG ACGAGGGGGT CGACCCGCGC 5220 TCCATGGGCA GCAAGGTCCC TGGAGGTGAA AAGGATCGCT TCTTCTGGCT GCCGGCCGGT 5280 GCGAGCAAGT ATGTTCCCTT TACCGAGCGG GACTGGGATC TACTGTCCGG CCAGTCGGCG 5340 GCTCGGCCAA GACTCTAGTT GCTATTAACG GGACCCATCG ACGCGTGAAA CGATGTAACA 5400 TAGAAAACAA ATGTGGCTTG CAAAACACAT GTAATTCCGC ATAAAGCCTG AAGAGCGTAA 5460 ACACAACATA GAGGGCAGAT TCGGCCGAAC TCAACCGGCT ATGACTCCGT AACGCGCGGA 5520 ACAACCACTC AGATATC 5537

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例で使用したＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子破壊
用プラスミド pDATF1 の作製過程を示す。

【図２】IS-5株及びＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子破壊株の染
色体上におけるＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子並びにその隣接
領域の部分制限酵素地図を示す。ＤＣＰＣ−ＡＴＦｃＤ
ＮＡプローブとハイブリダイズする制限酵素断片の位置
とサイズをそれぞれ地図の下に示している。

【図３】本発明ＤＮＡ断片の部分制限酵素地図を示す。
重複する制限酵素認識部位に関しては、便宜上図中左か
ら右に通し番号を付した。

【図４】本実施例３で使用したα遺伝子破壊用プラスミ
ド pDAL1の作製過程を示す。

【図５】IS-5株およびα遺伝子破壊株の染色体上におけ
るα遺伝子ならびにその隣接領域の部分制限酵素地図を
示す。pIPD1 の1.8kb のEcoRV 断片プローブとハイブリ
ダイズするEcoRI 断片の位置とサイズならびにpALNC1の
1,8Kb のEcoRV 断片とハイブリダイズするSacI断片の位
置とサイズをそれぞれ地図の下に示している。

【図６】サザンハイブリダイゼーションの結果を示して
いる。

【図７】本実施例４で使用したγ遺伝子破壊用プラスミ
ド pDNS1の作製過程を示す。なお、図１、図４および図
７で使用した略称ないし略号は、以下のとおりのもので
ある。B:BamHI,S:SpeI,Bg:BglII,Xb:XbaI,E:Eco47III,S
-X:SpeI とXbaIの連結部位,P:Ps tI,S:SalI,RI:EcoRI,R
V:EcoRV,Sn:SnaBI,Sm:SmaI,D:DraI,St:StuI,N:NcoI,Sn-
RV:SnaBIとEcoRV の連結部位,Sm-RV:SmaI とEcoRV との
連結部位,St-Sm:StuI とSmaIの連結部位、 BAP: アルカ
リホスファターゼ,cefG:デアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼ（ＤＣＰＣ ＡＴＦ）遺伝
子，△cefG: ＤＣＰＣ−ＡＴＦ遺伝子の一部，α: 本発
明により得れた新規遺伝子α，△α: α遺伝子の一部,A
CTP:アクレモニウム・クリソゲナ由来アクチン遺伝子プ
ロモ−タ− ,ACTT: アクレモニウム・クリソゲナム由来
アクチン遺伝子タ−ミネ−タ−,HYB: ハイグロマイシン
Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子。

【図８】IS-5株およびγ遺伝子破壊株の染色体上におけ
るγ遺伝子ならびにその隣接領域の部分制限酵素地図を
示す。pIPD1 の1,8Kb のEcoRV 断片プローブとハイブリ
ダイズするSalI断片の位置とサイズならびにpIPD1 の0,
35KbのEcoRI 断片プローブとハイブリダイズするEcoRI
断片の位置とサイズをそれぞれ地図の下に示している。

【図９】サザンハイブリダイゼーションの結果を示して
いる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム・クリソゲナム由来であ
   り、セファロスポリンＣ生合成に関与する遺伝子を含む
   ＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 イソペニシリンＮ合成酵素遺伝子の近傍
   に位置し、図３に示す制限酵素地図により規定される請
   求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列表（配列番号１）に示すアミノ酸配
   列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項
   １または２記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 配列表（配列番号２）に示すアミノ酸配
   列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項
   １、２または３記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 図３におけるPstI-EcoRV間の塩基配
   列が配列表（配列番号３）で示される請求項１、２、３
   または４記載のＤＮＡ断片。