JP4563585B2 - ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 - Google Patents
ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4563585B2 JP4563585B2 JP2000574691A JP2000574691A JP4563585B2 JP 4563585 B2 JP4563585 B2 JP 4563585B2 JP 2000574691 A JP2000574691 A JP 2000574691A JP 2000574691 A JP2000574691 A JP 2000574691A JP 4563585 B2 JP4563585 B2 JP 4563585B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- nucleic acid
- acid sequence
- seq
- host cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- QJVJRCDUNXFIBU-UHFFFAOYSA-N C=NC1C=CC1 Chemical compound C=NC1C=CC1 QJVJRCDUNXFIBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 CC(N)=C*** Chemical compound CC(N)=C*** 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
- C12R2001/685—Aspergillus niger
Description
【０００１】
発明の背景：
発明の分野：
本発明は、転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列、及び前記ポリペプチドに関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞にも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０００２】
関連文献の記載：
異種タンパク質の発現における組換え宿主細胞の使用は、最近、それらの天然源からの精製によってのみ得られる多量の市販のタンパク質の生成を単純化した。最近、ユーバクテリア及び真核生物宿主を包含する、いずれかの所定のタンパク質の生成のために選択される発現システムの種々の選択が存在する。適切な発現システムの選択はしばしば、活性状態でのタンパク質の適切な収量を生成する宿主細胞の能力に依存するのみならず、また、かなりの程度、タンパク質の意図される最終使用によっても支配され得る。
【０００３】
しばしば遭遇する１つの問題は、所定の宿主細胞により生成されるか又は培養培地に存在する、高いレベルのタンパク質分解酵素である。１つの提案は、特定のタンパク質分解化合物を生成する能力を奪われた宿主生物を提供することであった。例えば、WO90/00192号（Genecor, Inc.）は、酵素的活性のアスパラギン酸プロテイナーゼを分泌することができない糸状菌宿主を記載している。ヨーロッパ特許第574347号（Ciba Geigy AG）は、スブチリシン−型のセリンプロテアーゼを欠いているアスペルギラス宿主を記載している。WO98/12300号（Novo Nordisk A/S）はメタロプロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼを欠いている宿主を記載している。WO97/12045号（Genencor, Inc.）は、プロテアーゼ遺伝子の調節に関与するプロモーター配列の破壊をもたらす、プロテアーゼ欠失にされている酵母及び細菌宿主システムを記載している。
【０００４】
Mattern, I.E., など., (1992, Mol. Gen. Genet. 234: 332-336) は、明らかに、少なくとも２種のプロテアーゼ、すなわちアスペルギロペプシンA及びアスペルギロペプシンBの欠失のために、親株の細胞外プロテアーゼ活性のわずか１〜２％を有することが示された、アスペルギラス・ニガーの変異体株を記載する。プロテアーゼ欠失の表現型が両プロテアーゼをコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす調節突然変異に起因することが示唆された。
【０００５】
特異的プロモーター又はプロモーター組みでの真核転写の開始は、ポリペプチドであるが、しかしRNAポリメラーゼのそれ自体の部分ではない真核転写活性化因子を必要とする。多くの転写活性化因子は、ポリペプチドコード配列の転写の開始のために必要な機能的プロモーターを形成するためにプロモーター上の特定部位に結合する。しかしながら、転写活性化因子はまた、他のポリペプチドの存在下でのみ、開始複合体中に組み込まれ得る。転写活性化活性を有するポリペプチドが菌類において記載されており、そしてそのようなポリペプチドの一覧表は公開されている（Dhawale, S. S., and Lane, A.C. 1993, Nucleic Acid Research 21: 5537-5546）。
発明により提供される解決法：
プロテアーゼ生成の調節に関与する転写活性化因子の活性が変更されている、宿主細胞におけるポリペプチドの生成を高めるための改良された方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
発明の要約：
本発明の第１の観点は、
（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200mg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関する。
【０００７】
もう１つの観点においては、本発明はまた、核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、及び前記核酸配列によりコードされるポリペプチドにも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法に関する。
【０００８】
発明の特定の記載：
転写活性化因子をコードする核酸配列：
本発明の第１の観点は、
（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200mg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
から成る群から選択された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関する。
【０００９】
用語“転写活性化因子”とは、本明細書において使用される場合、それが連結されているポリペプチドコード配列の転写の開始のために必要な特異的プロモーター又はプロモーター組を活性化する能力を有するポリペプチドを言及する。
用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、他の核酸配列を実質的に有さない核酸配列、例えば、アガロース電気泳動により決定される場合、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の純度、最も好ましくは少なくとも約90％の純度の核酸配列を言及する。例えば、単離された核酸配列は、その核酸配列を、その天然の位置から、それが再生されるであろう異なった部位に再配置されるために遺伝子工学に使用される標準のクローニング方法により得られる。そのクローニングの方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、そのフラグメントのベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成起源のもの、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００１０】
好ましい態様においては、核酸配列は、活性ポリペプチドをコードする、配列番号１に示される核酸配列に対して、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の同一性の程度を有する。本発明のためには、２種の核酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギャップペナルティ及び10のギャップ長さペナルティーを有するClustal方法（Higgins, 1989, CABIOS 5:151-153）により決定される。
【００１１】
さらにより好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は、配列番号１に示されるような核酸配列を有する。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、前記ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらのポリペプチドは、その生来の源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構築された手段において異なる。例えば、比活性、結合特異性及び/又は親和性、又は同様のものにおいて異なる、ポリペプチドの変異体を、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて合成することは、興味あることである。類似配列が、配列番号１のポリペプチド部分として表される核酸配列、例えばその副配列に基づいて、及び/又は核酸配列によりコードされるポリペプチドのもう１つのアミノ酸を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、例えば、Fordなど., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107 を参照のこと。
【００１２】
もう1つの好ましい態様においては、本発明は、ポリペプチドの転写活性化活性を定性的に保持する、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の程度の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、“相同ポリペプチド”という。）をコードする単離された核酸配列に関する。
【００１３】
好ましい態様においては、相同ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。本発明のためには、２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギャップペナルティー及び10のギャップ長さのペナルティーを有するClustal 方法（Higgins, 1989, 前記）により決定される。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは、標準のサザンブロット方法によれば、核酸配列が、配列番号１に示される核酸配列のポリペプチドコード部分に対応するオリゴヌクレオチドブローブに対して、低い〜高い緊縮条件（すなわち、５×SSPE、0.3％のSDS, 200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25，35，又は50％のホルムアミド（それぞれ、低い、中位及び高い緊縮性）における42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下で、ハイブリダイズすることを示す。配列番号１と相同であるクローン又はDNAを同定するためには、ハイブリダイゼーション反応は、２×SSC、0.2％のDSDを用いて、好ましくは少なくとも50℃、より好ましくは少なくとも55℃、より好ましくは少なくとも60℃、より好ましくは65℃、さらにより好ましくは少なくとも70℃及び最も好ましくは少なくとも75℃で、それぞれ30分間、３度、洗浄される。
【００１５】
配列番号１の核酸配列又はその副配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はその部分配列、又は配列番号３のアミノ酸配列が、当業界において良く知られている方法に従って、いずれかの属又は種の相同遺伝子を同定し、そして単離し又はクローン化するためのオリゴヌクレオチドプローブを企画するために使用され得る。
【００１６】
特に、そのようなプローブは、対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。そのようなブローブは、完全な配列よりもかなり短いが、しかし少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、及びより好ましくは少なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。より長いプローブがまた使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（例えば、32P、3H, 35S, ビオチン又はアビジンによる）。例えば、32P-, 3H-又は35S-ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、X線フィルムの使用により検出され得る。
【００１７】
従って、そのような他の生物から調製されるゲノム、cDNA又はコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズし、そして転写活性化活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る。そのような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に移行され、そして固定され得る。次に、配列番号１に対して相同であるクローン又はDNAは、標準のサザンブロット方法に従って同定され得る。
【００１８】
対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める、複数の他の形の遺伝子のいずれかを示す。対立遺伝子変動は天然においては、突然変異を通して生じ、そして集団内での表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり（すなわち、コードされたポリペプチドにおける変化は存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００１９】
用語“ポリペプチドの対立遺伝子変異体”は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％の同一性を有し、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、（ｃ）配列番号１の核酸配列又はその相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズし、そして（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列から成る群から選択された核酸配列の対立遺伝子変異体である。
【００２０】
本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１とは異なる核酸配列も包含する。本発明はまた、配列番号１の副配列にも関し、ここで配列番号１の副配列は、配列番号１により包含される核酸配列であるが、但しその5’及び3’末端からの１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。好ましくは、配列番号１の副配列は、転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。より好ましい態様においては、配列番号１の副配列は、配列番号３に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列を少なくとも含む。
【００２１】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングに基づく方法を用いることによってもたらされ得る。（例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと）。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。核酸配列は、微生物、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
【００２２】
配列番号１の核酸配列、その相補鎖、又は配列番号１の対立遺伝子変異体及び副配列、又は転写活性化因子の対立遺伝子変異体及びフラグメントとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする核酸配列によりコードされる転写活性化因子は、いずれかの属の微生物から得られる。
好ましい態様においては、転写活性化因子は、菌類細胞から得られる。“菌類（Fungi）”とは、本明細書において使用される場合、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【００２３】
好ましい態様においては、菌類源は、糸状菌株である。“糸状菌”とは、真菌門（Eumycota）及び卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁により特徴付けられる。生長は菌糸の延長によってであり、炭素異化は絶対好気性である。糸状菌株は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neicakkunastux）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）。
【００２４】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列が、アスペルギラスの株、例えばA.アワモリ（A. awamori）又はA.ニジュランス（A. nidulans）から得られる。さらにより好ましくは、核酸配列、例えば配列番号１で示される核酸配列が、A.ニガー（A. niger）の株の単離物、すなわちDSM12298から得られる。
【００２５】
もう１つのより好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、フサリウムの株、例えばF.オキシスポラム（F. oxysporum）から得られる。好ましくは、前記株は、F. ベネナタム（F. venenatum）の株（Nirenberg sp. nov.）である。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、酵母株、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、シゾサッカロミセス（Schixosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）株から得られる。好ましくは、前記株は、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pichia）又はサッカロミセス（Saccharomyces）の株である。
【００２６】
前述の短いに関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。例えば、ポリペプチドは、Raper, k.D. and Fennel, D.I. (1965. The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore MD) により定義されるように、アスペルギラスの分類学的同等物である微生物から、それらが知られている種名称にかかわらず、得られる。アスペルギラスは、小柄又は鉢状態として種々に言及される、同時に形成される特殊化された細胞、及び分生子として言及される、無性生殖的に形成された胞子の１又は２つの層を担持する小嚢で終結する既知のテレオモルフ状態を有さない分生子柄から構成されるアスペルギラスにより特徴づけられる栄養胞子菌類である。アスペルギラスの既知のテレオモルフは、ユーロチウム（Eurotium）、ネオサルトリヤ（Neosartorya）及びエメリセラ（Emericella）を包含する。アスペルギラスの株及びそのテレオモルフは、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection (AtCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
【００２７】
さらに、そのような転写活性化因子は、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、核酸配列は、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。転写活性化因子をコードする核酸配列がプローブにより検出されると、配列は当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor, New York を参照のこと）。
【００２８】
もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、転写活性化活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする。
【００２９】
本発明はまた、菌類における転写活性化因子であるポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１に示される核酸配列又はその相補鎖、又は配列番号１の対立遺伝子変異体及び副配列と同じ条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブに、低い緊縮条件、より好ましくは中位の緊縮条件、及び最も好ましくは高い緊縮条件下で、上記の標準サザンブロット方法（例えば、Sambrook, など., 1989, 前記）を用いてハイブリダイズする、本発明の転写活性化因子をコードする単離された核酸配列にも関する。
【００３０】
もう１つのさらに好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれるDNA結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列である。
核酸構造体：
本発明のもう1つの観点は、適切な発現宿主における転写活性化因子の生成を指令する１以上の制御配列に操作可能的に連結される本発明の転写活性因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体に関する。好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれるポリペプチドをコードする。
【００３１】
発現は、ポリペプチドの生成に関与する次のいずれかの段階を包含することが理解されているが、但しそれらだけには限定されない：転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプチドをコードする核酸配列の操作が、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要である。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業者においてよく知られている。
【００３２】
“核酸構造体”は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される核酸のゼグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖の核酸分子として、本明細書において定義される。用語“核酸構造体”とは、その核酸構造体がコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カッセト”と類似語である。用語“コード配列”とは、本明細書において使用される場合、mRNAに転写され、そして本発明の転写活性化因子に翻訳される配列である。コード配列の境界は一般的に、mRNAの5’末端でのATG開始コドン、及びmRNAの3’末端での読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３３】
用語“制御配列”は、ポリペプチドの発現のために必要であるか又はそのために好都合であるすべての成分を含むよう本明細書においては定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものでも外来性のものでもあり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少、制御配列はプロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列コード領域と共に、制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーと共に提供され得る。用語“操作可能に連結される”とは、制御配列がポリペプチドの生成を方向づけるように、DNA配列のコード配列に対する位置で適切に配置される配置として、本明細書においては定義される。
【００３４】
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する、細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そして細胞に対して相同の又は非相同の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００３５】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に操作可能的に連結される。細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
【００３６】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００３７】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち糸状菌細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に操作可能的に連結される。細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が本発明において使用され得る。
糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００３８】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る。細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が本発明において使用され得る。
【００３９】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
制御配列はまた、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路中に振り向けることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含むことができる。他方では、コード配列の5’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列が通常、シグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、又はリゾムコル種からのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、糸状菌細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００４０】
糸状菌細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス−オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はヒューミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００４１】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ酸末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般的に、不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子から得られる（WO95/33836号）。
【００４２】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
発現ベクター：
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制御部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換が可能にされ得る。他方では、ポリペプチドをコードする核酸配列は、前記配列又はその配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コード配列はベクターに位置し、その結果、そのコード配列は発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列と操作可能的に連結される。
【００４３】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そしてポリペプチドをコードする核酸配列の発現を引き起こすことができるいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが挿入される糸状菌細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは線状又は閉環プラスミドであり得る。ベクターは自己複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外実在物として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確保するためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。ベクターシステムは、糸状菌細胞のゲノム中に導入される完全なDNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。
【００４４】
ベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、及び同様のものを提供する遺伝子である。糸状菌細胞への使用のための選択マーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びに他の種からの同等物を包含する群から選択され得る。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。
【００４５】
ベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに関係なく細胞におけるベクターの自己複製を可能にする要素を含む。
宿主細胞：
本発明のもう１つの観点は、本発明の核酸構造体又は発現ベクターを含んで成る宿主細胞に関する。
【００４６】
本発明の方法における宿主細胞の選択は、興味あるポリペプチドをコードする核酸配列の源に、かなりの程度、依存するであろう。
糸状菌細胞中への発現ベクター又は核酸構造体の導入は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体既知の態様での細胞壁の差異性から成る方法を包含することができる。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National of sciences USA 81: 1470-1474に記載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene 78; 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。
【００４７】
“導入”とは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクターを糸状菌細胞中に導入することを意味し、その結果、前記ベクターは染色体組み込み体として、又は自己複製染色体ベクターとして維持される。組み込みは一般的に、核酸配列が細胞中に安定して維持される場合、好都合であると思われる。染色体中へのベクターの組み込みは、相同組換え、非相同組換え又はトランスポジションにより起こる。
【００４８】
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、ベクターは、糸状菌細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置でのゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。それらの核酸配列は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得る。
【００４９】
自律複製のためには、ベクターはさらに、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を含むことができる。
組換え発現ベクターを構成するために本明細書に記載される要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、 Sambrook,など., を参照のこと）。
【００５０】
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒューミコラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム又はトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
より好ましい態様においては、糸状菌細胞はアスペルギラス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はアクレモニウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はフサリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はムコル細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はミセリオプソラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はネウロスポラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はペニシリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はチエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリポクラジウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリコダーマ細胞である。
【００５１】
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジャポニカ（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium toruloseam）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）又はフサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸状菌親細胞は、フサリウム・ベネナタム（Nirenberg sp. nov.）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ムコル・ミエヘイ（Mucor meihei）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィリア（Myceliopthora thermophilum）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロスポラ・クラサ（Neurospona crassa）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium Purpurogenum）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、トリコダーマ細胞は、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【００５２】
転写活性化活性を有するポリペプチド：
本発明のもう１つの観点は，
（ａ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）その相補的鎖，又は（iii）転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列番号１の副配列に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列にコードされるポリペプチド、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ)の対立遺伝子変異体；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント、ここで前記フラグメントは転写活性化活性を有し；及び
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又はその対立遺伝子変異体から成る群から選択された、単離されたポリペプチドに関する。
【００５３】
転写活性化因子は、本明細書に記載されるような技法を用いて単離され得る。本明細書において定義されるように、“単離された”ポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に有さない、例えばSDS−PAGEにより測定される場合、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の純度、さらにより好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度及びさらに最も好ましくは約95％の純度であるポリペプチドである。
【００５４】
本発明はまた、転写活性化活性を有する配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約55％、好ましくは少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％., 最も好ましくは少なくとも約95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドにも関する。
【００５５】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、配列番号２のアミノ酸配列、又は転写活性化活性を保持するそのフラグメントを含んで成る。最も好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号２のアミン酸配列を有する。配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシ末端から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号２のフラグメントは、配列番号３に示されるポリペプチド配列を少なくとも含む。
【００５６】
相同ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失、及び/又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２又は３のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なることができる。好ましくは、アミノ酸変更は、マイナーな性質のもの、すなわちタンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ−末端−、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
【００５７】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、非活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill（1979, The Proteins, Academic Press, New York）により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly並びにそれらの逆。
【００５８】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、アスペルギラス・ニガー株、より好ましくはアスペルギラス・ニガーAB4.1（van Haringsveldt, W.,など., 1987, Mol. Gen. Genet. 206: 71-75）、及び最も好ましくはDSM12298としてDSMに寄託されているアスペルギラス・ニガー13PAP2，又はその変異体株（配列番号２又は３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する）から得られる。
【００５９】
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれる核酸配列にコードされるポリペプチドである。
本発明はさらに、（ａ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体又は発現ベクターを有する宿主細胞を、ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明の転写活性化因子を生成するための方法に関する。
変更された転写活性化活性を有する宿主細胞：
本発明のもう１つの観点は、ポリペプチドの生成のために有用な親菌類細胞の変異体である宿主細胞に関し、個々で前記親細胞はプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成り、その転写が本発明の転写活性化因子により活性化され、そして変異体細胞は、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりも低く転写活性化因子及びプロテアーゼを生成する。
【００６０】
突然変異体細胞は、当業界において良く知られている方法を用いて、例えば転写活性化因子をコードする遺伝子の１又は複数のヌクレオチド挿入又は欠失により構成され得る。
好ましい態様においては、変異体細胞は、細胞に存在し、そして転写活性化因子の発現のために必要な核酸配列の修飾又は不活性化により得られる。
【００６１】
さらに好ましい態様においては、核酸配列は、（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択される。
【００６２】
もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞における転写活性化因子の低められた発現は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制御配列の修飾又は不活性化により得られる。用語“制御配列”は、“核酸構造体”のセクションにおいて定義されている。より好ましい態様においては、変異体細胞における制御配列は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわち核酸配列の発現に影響を及ぼすのに十分である部分である。可能性ある修飾のための他の配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６３】
遺伝子の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にゆだね、そして遺伝子の発現が低められるか又は排除されている変異体細胞についてスクリーンすることによって行われ得る。特異的であるか又はランダムであり得る突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることによって行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ得る。
【００６４】
本発明のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外（UV）線、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。
そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発される親細胞を、適切な条件下でインキュベートし、そして低められた又は遺伝子の発現を示すか又は発現を示さない変異体細胞について選択することによって行われる。
【００６５】
遺伝子の修飾又は不活性化はまた、遺伝子における１又は複数のヌクレオチド、又はその転写又は翻訳のために必要とされる調節要素の挿入、置換又は除去により達成され得る。たとえば、ヌクレオチドが、停止コドンの導入、開始コドンの除去又は読み取り枠の変更をもたらすために、挿入され又は除去され得る。そのような修飾又は不活性化は、当業界において知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成突然変異誘発により達成され得る。原則的に、修飾はインビボで、すなわち修飾される遺伝子を発現する細胞に対して直接的に行われ得るが、好ましくは、修飾は下記に例示されるように、インビトロで行われ得る。
【００６６】
選択の糸状菌細胞により上記遺伝子を不活性化するか又はその発現を低下させる便利な手段の例は、遺伝子置換又は遺伝子破壊の技法に基づかれている。たとえば、遺伝子破壊方法においては、興味ある内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸配列が、欠陥遺伝子を生成するために、親細胞中に形質転換される欠陥核酸配列の生成のためにインビトロで突然変異誘発される。相同組換えにより、欠陥核酸配列により、内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントが置換される。所望には、欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントはまた、核酸配列が修飾されているか又は破壊されている形質転換体の選択のために使用され得るマーカーをコードする。
【００６７】
他方では、遺伝子の修飾又は不活性化は、遺伝子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を用いて、確立されているアンチセンス技法により行われ得る。より特定には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞において転写され得、そして細胞において生成されるmRNAに対してハイブリダイズすることができる、遺伝子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、低められるか又は排除され得る。相補的アンチセンスヌクレオチド配列のmRNAへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量が低められるか、又は排除される。
【００６８】
配列番号１の核酸配列に対して相補的な核酸配列は、いずれかの微生物源から得られる。好ましい源は、菌類源、例えば上記のような酵母及び糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Mucor）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい酵母源は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）及びヤロウィア（Yarrowia）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらに、核酸配列は、糸状菌細胞に対して生来のものであり得る。
【００６９】
もう１つの好ましい態様においては、親細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する遺伝子を含む。
もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞は、上記方法のいずれかにより修飾されているか又は不活性化されている核酸を有し、そして同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも低く、プロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。変異体細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約75％、及びさらにより好ましくは少なくとも約95%低く、プロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。
【００７０】
さらにより好ましい態様においては、変異体細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも実質的に検出できない量のプロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。
プロテアーゼは、既知方法を用いてアッセイされ得る。そのような方法においては、48時間の培養培地のアリコートが3H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンと共にpH4.0でインキュベートされ、そしてTCA−可溶性画分における放射能が測定される（van Noort, J.M., など., 1991. Anal. Biochem 198:385-390）。他の方法は、例えばA.ニガーのアスパラギン酸プロテイナーゼA（Takahashi, K., 1991, Meth. In Enzymol. 248: 146-155）、エンドペプチダーゼ（Morihara, k., 1995. Meth. In Enzymol. 248: 242-253）、カルボキシペプチダーゼ（Reminton, J., and Breddam, X., 1994. Meth. In Enzymol. 244: 231-248）、ジペプチジルペプチダーゼ（Ikehara, Y., など., 244: 125-227）及びアミノペプチダーゼ（Little, G., など., 1976. Meth. In Engymol. 45: 495-503）を同定するために記載されている。
【００７１】
もう1つの好ましい態様においては、変異体細胞は、興味あるポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。
本発明のもう1つの観点は、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞に関し、ここで前記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、本発明の転写活性化因子をより多く生成し；そして（ｂ）その転写が前記転写活性化因子により活性化されるポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成る。
【００７２】
好ましい態様においては、宿主細胞は、（ｉ）転写活性化因子をコードする核酸配列、（ii）転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体、又は（iii）“発現ベクター”のセクションにおいて定義されたような発現ベクターの１又は複数のコピーを、親細胞中に導入することによって、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりも転写活性化因子をより生成する。
【００７３】
本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体はまた、ポリペプチドの発現を方向づけるために好都合である１又は複数の因子、例えば転写活性化因子（例えば、トランス−作用因子）、シャペローン（chaperone）及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の糸状菌細胞において機能的であるいずれかの因子が本発明において使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と必ずしも一列に並んで存在する必要はない。
【００７４】
活性化因子は、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudla など., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai and Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297）。活性化因子をコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエヘム活性化因子タンパク質（hap1）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトース代謝タンパク質４（gal4）、アスペルギラス・ニジュランスアンモニア調節タンパク質（areA）及びアスペルギラス・オリザエα−アミラーゼ活性因子 (amyR) をコードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Verdier, 1990, 前記、及びMackenzie など., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307を参照のこと）。
【００７５】
シャペローンは、もう１つのポリペプチドの適切な折りたたみを助けるタンパク質である (Hartl など., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron など., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder など., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook, 1992, Nature 355: 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson など., 1994, Bio/Technology 1: 381-384; Jacobs など., 1993, Molecular Microbiology 8: 957-966)。シャペローンをコードする核酸配列は、アスペルギラス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はサッカロミセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロミセス・セレビシアエBiP/GRP78, 及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Gething and Sambrook, 1992, 前記、及びHartl など., 1994, 前掲を参照のこと。
【００７６】
プロセッシングプロテアーゼは、生化学的に活性な成熟ポリペプチドを生成するためにプロペプチドを分解するプロテアーゼである（Enderlin and Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller など., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius など., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius など., 1983, Cell 32: 839-852; 米国特許第5,702,934号）。プロセッシングプレテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセス・セレビシアエKex2, ヤロウェア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）ニ塩基性プロセッシングエンドプロテアーゼ（xpr6）及びフサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）メタロプロテアーゼ（p45遺伝子）をコードする遺伝子から得られる。
【００７７】
より好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は、親細胞のその対応するプロモーターよりも強いプロモーター又はその機能的部分に操作可能的に連結される。さらにより好ましい態様においては、プロモーター又はその機能的部分は、細胞外プロテアーゼ、例えばアスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエ中性メタロプロテアーゼ、アスペルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテアーゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ又はフサリウム・ベネナタムトリプシンをコードする遺伝子の発現を仲介する。
【００７８】
本発明はまた、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞にも関し、ここで前記変異体は、
ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及び
ｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連結される誘導プロモーター、及び（ii）前記ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に結合された、それに前記転写活性化因子が結合することができるところのプロモーター配列（ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る）を含んで成る。
【００７９】
上記（ａ）における転写活性化因子の不活性形は、前記のいずれかの方法に従って、細胞に存在し、そして生来の転写活性化因子の発現のために必要な核酸配列の不活性化又は修飾により得られる。好ましい態様においては、不活性化又は修飾は、１又は複数のヌクレオチド挿入、欠失又は置換、特異的又はランダム突然変異誘発又は遺伝子中断、及び転写活性化因子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を用いてのアンチセンス技法を包含する（但し、それらだけには限定されない）方法により得られる。もう１つの好ましい態様においては、生来の転写活性化因子の不活性形は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制御配列の不活性化又は修飾により得られる。
【００８０】
もう１つの好ましい態様においては、生来の転写活性化因子をコードする核酸配列は、配列番号１に示される配列を有する。もう1つの好ましい態様においては、転写活性化因子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る。
上記（ｂ）における誘発性プロモーター配列は、プロモーターの転写開始活性が発酵条件に従って誘発され得るいずれかのプロモーター配列又はその機能的部分であり得る。好ましくは、誘発は炭素又は窒素代謝物により仲介される。好ましい態様においては、プロモーターは、アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdSプロモーター、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーのniaD7プロモーター、アスペルギラス種のniiAプロモーター、アスペルギラス種のアルカリホスファターゼプロモーター、アスペルギラス種の酸性ホスファターゼプロモーター、又はアスペルギラス・ニガーのalcAプロモーターである。
【００８１】
もう1つの好ましい態様においては、宿主細胞はさらに、プロモーター配列を含んで成り、ここで前記プロモーターは転写活性化因子により活性化され、そしてポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に連結される。
本発明の転写活性化因子により活性化されるプロモーター配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、NA2−tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びそれらの変異体、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する（但し、それらだけには限定されない）群から選択されたいずれかのプロモーター、又はその機能的部分であり得る。糸状菌細胞に使用するための特に好ましいプロモーターは、プロテアーゼ遺伝子、例えばフサリウム・オキシスポラムメリプシン−様プロテアーゼ遺伝子（米国特許第4,288,627号）、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）、アスペルギラス・ニガーpacA遺伝子、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・オリザエ中性メタロプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテアーゼ遺伝子、又はフサリウム・ベネナタムトリプシン遺伝子からのプロモーター、又はその機能的部分である。
【００８２】
もう１つの好ましい態様においては、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子を発現する宿主細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも１又は複数の生来のプロテアーゼを少なく生成する。プロテアーゼは、上記方法のいずれかを用いてアッセイされ得る。より好ましい態様においては、48時間培養培地からのアリコートが3H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンと共にpH4.0でインキュベートされ、そしてTCA−可溶性画分における放射能が測定される（van Noort, J.M., など., 前掲）。
【００８３】
本明細書に記載される核酸構造体は、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞を得るために、“宿主細胞”のセクションに記載のような方法のいずれかに従って、親菌類細胞中に導入され得る。好ましい態様においては、核酸構造体は細胞の染色体中に組み込まれる。もう1つの好ましい態様においては、核酸構造体は、自己複製染色体外ベクターとして維持される。
【００８４】
本発明の方法が、変異体菌類細胞を得るために特定の順序に制限されないことは理解されるであろう。第２核酸配列の修飾は、ポリペプチドの生成のために細胞の構成におけるいずれかの段階で親細胞中に導入され得る。
ポリペプチドの生成：
本発明のもう１つの観点は、（ａ）ポリペプチドをコードする遺伝子を有する宿主細胞を、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養し：そして（ｂ）前記宿主細胞の栄養培地からポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明の宿主細胞におけるポリペプチドを生成するための方法に関する。
【００８５】
１つの態様においては、その転写が本発明の転写活性化因子により活性化されるプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る親菌類細胞の変異体である宿主細胞に関し、そして前記変異体細胞は、同じ条件下で培養される場合、親細胞によりも転写活性化因子及びプロテアーゼを低く生成する。
もう１つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、本発明の転写活性化因子をより生成し；そして（ｂ）ポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成り、その転写は本発明の転写活性化因子により活性化される。
【００８６】
もう1つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前記変異体は、ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及びｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連結される誘導プロモーター、及び（ii）前記転写活性化因子が前記ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に結合することができるプロモーター配列（ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る）を含んで成る。
【００８７】
本発明の宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて、興味あるポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする適切な培地において、及び条件下で行われる実験用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固相発酵を包含する）により培養される。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行われる（例えば、Bennett, J.W. and LaSure, L., eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。適切な培地は、市販されており、又は公開された組成物（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）を用いて調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
【００８８】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により単離され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿により、栄養培地から単離され得る。次に単離されたポリペプチドはさらに、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、溶解度差による分別（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 を参照のこと）。
【００８９】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、酵素生成物の形成、酵素基質の消出又はSDS−PAGEの使用を包含することができる。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。多くの酵素についての酵素活性を決定するための方法は、当業界において知られている。
【００９０】
本発明の方法においては、宿主細胞は、同じ条件下で培養される場合、対応する親細胞よりも、少なくとも約20％多く、好ましくは少なくとも約50％多く、より好ましくは少なくとも約100％多く、さらにより好ましくは少なくとも約200％多く、そして最も好ましくは少なくとも約300％多く、ポリペプチドを生成する。
【００９１】
ポリペプチドは、変異体糸状菌細胞に対して天然のものでも、又は異種のものでも、いずれのポリペプチドでもあり得る。用語“異種ポリペプチド”とは、細胞により生成されないポリペプチドとして、本明細書において定義される。用語“ポリペプチド”は、特定の長さのコードされた生成物の言及を意味せず、そして従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの生成に関与する、核酸配列に対して外来性の１又は複数の制御配列を含んで成る核酸配列によりコードされる、細胞に対して生来のポリペプチドである組換えポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチド又はその変異体であり得る。ポリペプチドはまた、１又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種である、少なくととも２つの異なったポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含むハイブリッドポリペプチドでもあり得る。ポリペプチドはさらに、上記ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子及び構築されたバリエーションを包含する。
【００９２】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、抗体又はその部分、抗原、血餠因子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその部分、調節タンパク質、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である。
より好ましい態様においては、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。
【００９３】
さらにより好ましい態様においては、酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００９４】
もう１つのさらにより好ましい態様においては、ポリペプチドは、ヒトインスリン又はその類似体、ヒト成長ホルモン、エリトロポエチン又はインスリノトロピンである。
異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核、真核又は他の源から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書においては使用される場合、ポリペプチドがその源により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろう。
【００９５】
本発明の方法においては、変異体糸状菌細胞はまた、その細胞に対して天然のあるポリペプチドの組換え生成のためにも使用され得る。天然ポリペプチドは、ポリペプチドの発現を増強するために、シグナル配列の使用により、興味ある生来のポリペプチドの細胞外への輸送を促進するために、及び細胞により通常生成されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を高めるために、異なったプロモーターの制御下でポリペプチドをコードする遺伝子を置換することによって、組換え的に生成され得る。本発明はまた、細胞に対して生来であるポリペプチドのそのような組換え生成を、そのような発現が、細胞に対して天然ではない遺伝子要素の使用、又は糸状菌細胞に通常存在しない状態で機能するよう操作されている生来の要素の使用を包含する程度まで、用語“異種ポリペプチド”の範囲内に包含する。異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York を参照のこと。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、前記フラグメントのベクターへの挿入、及び核酸配列の複数のコピー又はクローンが置換されるであろう変異体菌類細胞への前記組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００９６】
本発明の方法においては、異種ポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている融合された又はハイブリッドポリペプチドも包含することができる。融合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、他のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードする配列を、それらが整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう、連結することを包含する。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２種の異なったポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んで成り、ここで１又は複数のポリペプチドは、変異体菌類細胞に対して異種であり得る。興味ある異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。発現は、ポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を包含することが理解されるであろう。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプチドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要である。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業界において良く知られている。
【００９７】
本発明は次の例によりさらに記載されるが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００９８】
実施例
実施例：
材料：
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品であった。
株：
AB4.1：株ATCC9029のcspA pyrG1誘導体であるアスペルギラス・ニガーの株（van Hartingsveldt, W., など., 1987. Mol. Gen. Genet. 206: 71-75; Bos, C.J., など., Curr. Genet. 14: 437-443）。
【００９９】
AB1.13: AB4.1のUV突然変異誘発に由来するアスペルギラス・ニガーのプロテアーゼ欠失株（Mattern, I.E., など., 1992. Mol. Gen. Genet. 234: 332-336）。
13PAP2：A.ニガーのpepAプロモーター（Jarai G. and Buxton F. 1994. Curr. Genet. 26: 238-244）の制御下で、A. ニジュランスamdS遺伝子（Corrick, R. A., など., 1987. Gene 53: 63-71）の複数コピーを含むAB1.13誘導体。この株は、プロテアーゼ欠失表現型を有し、そして単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上で増殖することができない。株13PAP2は、DSM No.12298としてDSMに寄託されている。
【０１００】
4PAP6：A.ニガーのpepA プロモーターの制御下でA. ニジュランスandS 遺伝子の複数コピーを含むAB4.1誘導体。前記株は、プロテアーゼ欠失表現型を有さず、そして単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上で増殖することができる。
N402：ATCC No.64974としてATCC (Manassas VA, USA) に寄託されているアスペルギラス・ニガーの株。
【０１０１】
MC1046：ATCC No.35467としてATCCに寄託されているE.コリの株。
プラスミド：
pPAP: 下記実施例１に記載され、そして図１に示されるようにして構成される。
PAopyrGcosArp1: 下記実施例１に記載され、そして図２に示されるようにして構成される。
【０１０２】
pEES1: 下記実施例１に記載され、そして図３に示されるようにして構成される。
p3SR2: C.M. Corrick, A.P. Twomey, and M. J. Hynes (1987. Gene 53: 63-71) により記載されるように、A. ニジュランスamdS 遺伝子を含む。
pABPYRG*−Not：Verdoes, J.C., など. (1994. Gene 145: 179-187) により記載されるように、不活性化されたpyrG遺伝子を含む。
【０１０３】
pHelp1：Gems, D., など. (1991. Gene 98: 61-67) により記載されるように、選択マーカーとしてのA. オリザエからのpyrG遺伝子、及びE.コリベクターpIC20R中にクローン化された、A.ニガーにおいて自己複製できるAMA１配列を含む。
pAnscos1：Osiewacz, H.D. (1994, Curr. Genet. 26: 87-90) により記載されるように、２個のcos部位を含む。
【０１０４】
pAO4−２：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 159-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。
pAO4−13：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 159-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。
pUC19：Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messig, J. (1985. Gene 33: 103-119) により記載の通りである。
例１：A. ニガーからのprtT転写活性化因子のクローニング：
prtTを、13PAP2, すなわちpepA プロテアーゼ遺伝子プロモーターにより調節されるamdS遺伝子を発現することができず、そしてプロテアーゼ欠失表現型（prt-）を有するA.ニガー変異体株からクローン化した。
A.ニガー13PAP2レポーター株の構成：
プラスミドpPA1を、次の３種のフラグメントの連結により構成した：
１）EcoR1及びKpnIにより消化されたE.コリベクターpBlueScript II SK (Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA);
２）PCRにより増幅された、開始コドン〜内部BamHI部位までの約130bpのamdS コード配列に連結されるpepA遺伝子の1.2kbプロモーター領域を含む1.4kbのEcoRI/Bam HI制限フラグメント；及び
３）A.ニジュランスamdS遺伝子のほとんどを含むp3SR2からの2.1kbのBam HI/KpnI フラグメント。
【０１０５】
フラグメント２を次の２段階で構成した。第１段階においては、下記“コスミドライブラリーの構成”のセクションに記載のようにして、プロトプラストから調製されたA.ニガーN402からのゲノムDNAを、鋳型として使用し、そして下記に示される２種のオリゴヌクレオチド、すなわちpepApr 及びpepA/amdSをプライマーとして使用した：
pepApr：CGG AAT TCG CAT GCT GGA GGT GCT TCT AA
pepA/amdS：TTC CCA GGA TTG AGG CAT TTT GAC CAC GAG AAT
次に、この反応から得られる1200bpのPCR生成物を、下記に示されるオリゴヌクレオチドMBL1213及び鋳型としてのプラスミドp3SR2と共に、第２PCR反応においてプライマーとして使用した：
MBL1213：TAA CTT CCA CCG AGG TC
続いて、下記の３種のフラグメントの連結により得られる生成物を、E.コリDH5α中にトランスフェクトした。
【０１０６】
最終構成方法においては、pPA1をNotIにより消化し、pABPYRG*−Notからの3.8kbのNotIフラグメントに連結し、図１に示されるプラスミドpPAPをもたらした。pPAPを用いて、A.ニガーAB1.13を形質転換し、そして複数コピーでpyrG遺伝子座中に組み込まれたpPAPを有する形質転換体を単離した。pyrG遺伝子により補充されたこの形質転換体の、自発的５フッ素酸（FOA）耐性で、ウリジン−要求性変異体を、13PAP2と命名した。
pAopyrGcosArp1の構成：
プラスミドpAopyrGcosArp1を、次の３種のフラグメントのE.コリDH5α中への連結及び続くトランスフェクションにより構成した：
１）Acc65I及びBamHIにより切断されたE.コリベクターpHelp1；
２）２つのcos部位を含むpAnscos1からの3.0kbのBamHI/HindIIIフラグメント；及び
３）A.オリザエpyrG遺伝子を含むpAO4-2からの3.2kbのAcc65I/HindIIIフラグメント。
【０１０７】
得られるプラスミドpAopyrGcosArp1は、アスペルギラスにおいて自己複製し、そしてウリジンを欠いている培地上での増殖により選択され得る。PAopyrGcosArp1は図２に示される。
コスミドライブラリーの構成：
アスペルギラス・ニガーのコスミドライブラリーを、“SuperCas1コスミドベクターキット”（Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA）を用いて、その供給者の説明書に従って構成した。
【０１０８】
A.ニガーN402からのゲノムDNAを、標準の方法により製造されたプロトプラストから調製した。
単離の後、プロトプラストを、Beckman GS-6Rにおいて2000rpmでの10分間の遠心分離によりペレット；次のそのペレットを、22.5mMのトリス−イソナフタレンスルホン酸、275mMのパラ−アミノサリチル酸、0.2Mのトリス−HCl（pH8.5）、0.25MのNaCl及び50mMのEDTAを含む緩衝液に懸濁し、すぐに１体積のフェノール/クロロホルム（１：１）を添加した。注意して混合し、そして3000rpmでの20分間の遠心分離した後、水性相をデカントし、そしてDNAを標準の方法を用いて沈殿せしめた。
【０１０９】
ゲノムDNAのサイズを、４℃で30ボルトで20時間、運転される0.3％のアガロースゲル上での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染色されたゲルは、回収されたDNAが50〜100kb以上のサイズの範囲であることを示した。DNAを、MboIを用いて一部消化した。その消化されたDNAのサイズは、上記と同じタイプのゲル分析により決定される場合、30〜50kbであった。QIAGEN（Venlo, The Netherlands）からのキットを用いて、製造業者の説明書に従って精製されたpAopyrGcosArp1ベクターを、BamHIにより消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製した。連結及びパッケージングを、標準の方法に従って行った。
【０１１０】
ライブラリーの滴定の後、単一の連結物及びパッケージングからのパッケージング混合物のすべてを、宿主細胞MC1046中にトランスフェクトし、そして50μg/mlのアンピシリンLBプレート上にプレートした。約40,000のコロニーを得た。10のコロニーからのコスミド調製物は、それらがすべて、予測されるサイズの挿入体を有したことを示した。次に、40,000のコロニーを、LB培地にソーキングし、そしてプレートから剥離し、次に貯蔵のために−80℃で15％グリセロールにアリコートした。これは、A.ニガーゲノムの約40倍の増幅を示す。
prtTクローンの選択：
コスミドDNAをライブラリーから調製し、そしてP.J. Punt and C.A.M.J.J. Van Den Hondel (1992. Methods Enzymol. 216: 447-457) に記載される形質転換方法に従って、13PAP２中に導入した。pyrG マーカーを選択するための反復された努力は、4,000〜30,000の形質転換体の回収をもたらした。pyrGマーカーについての二重選択、及び単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上での増殖は、５回の異なった実験から合計65の一次形質転換体をもたらした。
【０１１１】
個々の一次形質転換を、プロテアーゼ活性、単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上での増殖、及びそれらの２つの特徴の不安定性についてスクリーンンした。アセトアミドを含む培地上での増殖によりスクリーンされたアセトアミダーゼ+表現型は、pepAプロモーターがamdSコード配列に連結されるレポーターカセットにおけるpepAプロモーターの活性化に起因するアセトアミダーゼ活性の表示である。プロテアーゼ+表現型を、単一の窒素源として透析された脱脂乳を含む最少培地プレートを用いてスクリーンした（Mattern, I.E.,など., 1992. Mol. Gen. Genet. 234: 332-336）。それらのプレート上で、野生型AB4.1株は、透明な光輪を製造し、そしてAB1.13変異体は非常に小さな後輪を製造する。この差異は、pepA 欠失株がまた、それらのプレート上で大きな光輪を生成することができるので、pepAの活性にはよらない。従って、脱脂乳プレート上での大きな光輪は、他の細胞外プロテアーゼの活性化を示す。
【０１１２】
不安定性ウリジン含有培地上で、希釈された胞子ストックを増殖することによって試験した。単一の胞子由来のコロニーを、それらのプレートから採取し、そしてプロテアーゼ活性及びアセトアミド上での増殖について試験した。スクリーニング結果は、70％以上のコロニーにおいて、両特徴が失われたことを示した。従って、それらの２種の表現型は共に失われたか、又は保持されており、このことは、pepAプロモーター及び他のプロテアーゼプロモーターの活性化が調和して調節され、そしてpyrGマーカーの存在に連結されることを示唆する。この表現型を担当する遺伝子は、prtTとして命名された。次に、12種のアセトアミダーゼ+、プロテアーゼ+形質転換体を単離した。
prtT遺伝子の単離：
13PAP2のアセトアミダーゼ+、プロテアーゼ+形質転換体からprtT遺伝子を開放するために、DNAを、前記のようにして最少培地において増殖された菌糸体から調製した。このDNAを、コンピテントE.コリDH5ａ細胞を形質転換する試みに使用した。数百のアンピシリン−耐性コロニーを得た。DNA分析は、それらがすべて、pHelp1プラスミドに起因する配列を含んだことを示した。E.コリコロニーから単離されたコスミドDNAを用いて、13PAP2を再形質転換した。２種のDNAサンプルは、アセトアミド含有培地上での増殖及び高められたプロテアーゼ活性の両者を示す形質転換体を生ぜしめた。次に、コスミドの１つのACR１からのDNAを、いくつかの制限酵素により消化した。次に、その得られるフラグメント及びpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2株を同時形質転換した。ACR１のEcoRI，PstI, BamHI及びKpnI制限は、アセトアミド上で増殖でき、そして高いプロテアーゼ活性を有する形質転換体を付与し、ところがSalI及びHindIII消化物は、そうではなかった。EcoRI消化は最も単純なパターンを付与するので、別のEcoRIフラグメントをゲル単離し、そしてpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した。わずか１つのフラグメント、すなわち15kbのEcoRIフラグメントが、アセトアミド含有培地上で増殖できる形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、コスミドからprtTをサブクローン化するために、pBlueScript II SKにおいてサブクローン化した。このクローンの挿入体はまだかなり大きいので、別のPstIバンドをゲル単離し、そしてその個々及びpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した。わずか１つのバンド、すなわち2.5kbのPstIフラグメントは、アセトアミド含有培地上で増殖する形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、pBlueScriptII SKにおいてサブクローン化した。４種のサブクローン、すなわちClE0.7, ClE1.8, NcE1.1及びNcE1.4を、制限地図に基づいてこのプラスミドから構成した。さらに、2.5kbのPst1フラグメントを含む6.5kbのSstI/EcoRIフラグメントをサブクローン化し、pEES1（図３に示される）をもたらした。
【０１１３】
AB4.1からのゲノムDNAのサザンブロット分析は、prtTのわずか1つのコピーの存在を示した。
実施例２：prtT遺伝子の配列決定及びその配列の分析：
すべての配列反応は、dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kits又はBigDye（商標）Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer Corporation, Branchburg, NJ, USAからの)を用いて調製された。反応は、ABI PRISM（商標）377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corporation) 上で、製造業者の説明書に従って行われる。
【０１１４】
prtT遺伝子を、ゲノムクローンClE0.7, ClE1.8, NcE1.1, NcE1.4及びpEES1から配列決定した。使用される配列特異的プライマーは下記に列挙される：
122958：CGA TCG ATG ACT GCC TGT
122956：AGA GAC ACA TAG TGC CTT
122959：GCT TAT AGT CGA TAG CGC
122960：CCT CTC TCC AGC GAT GGT
122962：ATG GAA TAC ATA CTG CTT
122961：ATG AAA CCC ACT GTA GCT
122963：TGC TCG ATA AGC GGG TCC
122964：AAT CTT ATG GAC CCG CTT
124289：CCC CGG GAA ACA AGA ACA GG
124290：GTT GGC GGA CCT TGA CTA TG
125112：ACA GCT ACA GTG GGT TTC ATC T
125111：AGT CAA CGG GGG AAG TCT C
128330：CTA GCA GCG TAT CGG TCA GC
130887：CTT GGA AAA GAA ACG ATA G
130888：AAC GTA CGC TTT CCT CCT T
134135：GGG TCC GTC CAG TCC GTT CTT
−48逆方向：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA
−40普遍性：GTT TTC CCA GTC ACG AC
遺伝子の変異体対立遺伝子を、次のプライマーを用いて、変異体株AB1.13から単離されたゲノムDNAのPCR増幅により得た：
PstI：TC ATC CCT GGT GTT ACT GC
PstII: C ATG GAT TGG CTG GCC G
prtT遺伝子の完全なDNA配列は、配列番号１に示される。変異体対立遺伝子のPCRフラグメントの配列は、配列番号４に示される。
【０１１５】
コンピューターソフトウェアNetgene 2 (S. M. Hebsgaard, P. G. Korning, N. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, S. Brunak (1996. Nucleic Acids Research 24: 3439-3452)) を用いてのDNA配列（配列番号１）の分析は、５個のエキソンの存在を示した（配列番号１の注釈を参照のこと）。
prtT cDNAの分析：
mRNAを、プロテアーゼ生成のために好ましい条件下で増殖されたA.ニガーの培養物から、市販のポリ (A)+RNA単離されたキット（Pharmacia, uppsala SE）を用いて、全RNA（上記例１に記載されるDNA単離方法に従って単離された）から精製した（J.P.T.W. Van Den Hombergh, など., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 605-613）。二本鎖cDNAを、標準の方法を用いて調製し、そして次のプライマーとのPCR反応のために使用した：
オリゴ−dTプライマー：T20N
Prt270n：TACTCTCCAGATTGCCTG
Prt1420r：TGAGATACCACTCAGCAG
Prt1350n：TGCACTTCTCTGTCTCTG
Prt2365r：GACTTCTGGCATCAGTTG
Prt2320n：CTCATGGATGGCATGATC
プライマーPrt270n及びPrt1420rとのPCR反応は、約1.0kbのフラグメントを生成した。このフラグメントを、pGEM-Tベクター（Promega Corp., Madison WI, USA）中にクローン化し、そしてその得られるプラスミドの挿入体を、プライマーに122958, 122960, −40普遍性及び−48逆方向を用いて配列決定した。その結果は、遺伝子のこの部分における２個のイントロンの存在を確かめた。
【０１１６】
プライマーPrt1350n及びPrt2365rとの第２のPCR反応は、約0.9kbのフラグメントを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクター中にクローン化し、そして得られるプラスミドにおける挿入体を、プライマー124289, 124290, -40普遍性及び-48逆方向を用いて配列決定した。その結果は、遺伝子のこの部分における単一のイントロンの存在を確かめた。
【０１１７】
オリゴ−dTプライマー及びPrt2320nとのもう1つのPCR反応は、約350bpのフラグメントを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクターにおいてクローン化した。プライマー−40普通性及び−48逆方向を用いての挿入体の配列決定は、そのフラグメントがprtTの3’部分を含み、そしてもう1つのイントロンの存在を確かめたことを示した。
【０１１８】
翻訳されたprtT遺伝子の推定されるタンパク質配列は、配列番号２に示される。翻訳された変異体対立遺伝子prt13の推定されるタンパク質配列は、配列番号５に示される。配列番号２及び５の比較は、それらの２種の間の唯一の差異が、翻訳されたprtT遺伝子におけるロイシン残基が翻訳されたprt13遺伝子におけるプロリンにより置換される位置112に存在することを示す。
【０１１９】
推定されるPrtTタンパク質配列の分析は、Zinc(II)2Cys6二核クラスターDNA結合モチーフ（配列番号２、残基47−81）の存在を示す。このモチーフは、GAL4クラスの菌類転写活性化因子を定義する（Reece, M.J., and Ptashne, M. 1993, Science 261: 909-911）。prtT遺伝子におけるこのモチーフの存在は、prtTが転写活性化因子であることを示す。
実施例３：野生型A.ニガー株におけるprtT遺伝子の破壊：
prtT遺伝子の上流及び下流の配列がA.オリザエpyrG遺伝子により分離されているプラスミドを構成した。プラスミドpEES1を、MunI及びNheIにより消化し、prtTのコード配列のほとんどを含む2.1kbのフラグメントを除去した。A.オリザエpyrG遺伝子を含むpAO4-13からの2.3kbのEcoRI/NheIフラグメントを、pEES1のMunI及びNheI部位にクローン化した。図４に示されるプラスミドをpDprtと命名した。次に、その構造体を用いて、A.ニガー株AB4.1を形質転換し、ウリジン原栄養性形質転換体を、脱脂乳含有プレート上でのプロテアーゼ活性について分析した。それらのうち５個はそれらのプレート上でハローを生成せず、このことは、プロテアーゼ活性が非常に低かったことを示唆する。破壊されたprtT遺伝子を有する株及び変異体AB1.13株の比較は、プロテアーゼ活性又は表現型においていずれの差異も示さなかった。
実施例４：prtTの過剰発現：
A.ニガーgpd遺伝子のプロモーターに融合されるprtTのコード領域及び3’側非コード配列を含むプラスミドpGPprt（図５）を構成した。gpd遺伝子は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、すなわち一次代謝に関係する構成的に発現された酵素をコードする。使用されるプロモーターは、コード領域の上流のフラグメントであった。プラスミド及びpyrG選択プラスミドpAO4-13を用いて、同時形質転換により、A.ニガーAB4.1を性質転換した。サザンブロット分析により決定される場合、高められたprtT転写を有する形質転換体を、高められたプロテアーゼ発現について分析した。
生物学的材料の寄託：
次の生物学的材料を、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 braunschweig, germanyに、ブダペスト条件に基づいて寄託し、そして次に受託番号が付与された：
受託物 受託番号 受託日
エスシェリシア・コリpEES DSM12294 1998-07-14
アスペルギラス・ニガー13PAP2 DSM12298 1998-07-14
菌株は、培養物が、本特許出願の審査中、入手できることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を提供する。寄託物は、本出願の対象物が出願される国々の外国特許法により必要とされる場合、利用できる。しかしながら、寄託物の有用性は、政府指令により許される特許権を損いながら本発明を実施する許可を構成しないことは理解されるべきである。
【０１２０】
本明細書において記載され、そして請求された発明は、本明細書に開示される特定の態様により制限されず、それらの態様は、本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様は、本発明の範囲内にあるものと意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に本発明の種々の修飾は当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた、本発明の範囲内に存在する。
【０１２１】
種々の文献が本明細書において引用されており、それらの開示はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドpPAPの制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図２】 図２は、プラスミドpAopyrGcosArp1の制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図３】 図３は、プラスミドpEES1の制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図４】 図４は、プラスミドpDprtの制限地図を示し、その構成は実施例３に記載される。
【図５】 図５は、プラスミドpGPprtの制限地図を示し、その構成は実施例4に記載される。
【配列表】
発明の背景：
発明の分野：
本発明は、転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列、及び前記ポリペプチドに関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞にも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０００２】
関連文献の記載：
異種タンパク質の発現における組換え宿主細胞の使用は、最近、それらの天然源からの精製によってのみ得られる多量の市販のタンパク質の生成を単純化した。最近、ユーバクテリア及び真核生物宿主を包含する、いずれかの所定のタンパク質の生成のために選択される発現システムの種々の選択が存在する。適切な発現システムの選択はしばしば、活性状態でのタンパク質の適切な収量を生成する宿主細胞の能力に依存するのみならず、また、かなりの程度、タンパク質の意図される最終使用によっても支配され得る。
【０００３】
しばしば遭遇する１つの問題は、所定の宿主細胞により生成されるか又は培養培地に存在する、高いレベルのタンパク質分解酵素である。１つの提案は、特定のタンパク質分解化合物を生成する能力を奪われた宿主生物を提供することであった。例えば、WO90/00192号（Genecor, Inc.）は、酵素的活性のアスパラギン酸プロテイナーゼを分泌することができない糸状菌宿主を記載している。ヨーロッパ特許第574347号（Ciba Geigy AG）は、スブチリシン−型のセリンプロテアーゼを欠いているアスペルギラス宿主を記載している。WO98/12300号（Novo Nordisk A/S）はメタロプロテアーゼ及びアルカリプロテアーゼを欠いている宿主を記載している。WO97/12045号（Genencor, Inc.）は、プロテアーゼ遺伝子の調節に関与するプロモーター配列の破壊をもたらす、プロテアーゼ欠失にされている酵母及び細菌宿主システムを記載している。
【０００４】
Mattern, I.E., など., (1992, Mol. Gen. Genet. 234: 332-336) は、明らかに、少なくとも２種のプロテアーゼ、すなわちアスペルギロペプシンA及びアスペルギロペプシンBの欠失のために、親株の細胞外プロテアーゼ活性のわずか１〜２％を有することが示された、アスペルギラス・ニガーの変異体株を記載する。プロテアーゼ欠失の表現型が両プロテアーゼをコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす調節突然変異に起因することが示唆された。
【０００５】
特異的プロモーター又はプロモーター組みでの真核転写の開始は、ポリペプチドであるが、しかしRNAポリメラーゼのそれ自体の部分ではない真核転写活性化因子を必要とする。多くの転写活性化因子は、ポリペプチドコード配列の転写の開始のために必要な機能的プロモーターを形成するためにプロモーター上の特定部位に結合する。しかしながら、転写活性化因子はまた、他のポリペプチドの存在下でのみ、開始複合体中に組み込まれ得る。転写活性化活性を有するポリペプチドが菌類において記載されており、そしてそのようなポリペプチドの一覧表は公開されている（Dhawale, S. S., and Lane, A.C. 1993, Nucleic Acid Research 21: 5537-5546）。
発明により提供される解決法：
プロテアーゼ生成の調節に関与する転写活性化因子の活性が変更されている、宿主細胞におけるポリペプチドの生成を高めるための改良された方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
発明の要約：
本発明の第１の観点は、
（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200mg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関する。
【０００７】
もう１つの観点においては、本発明はまた、核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、及び前記核酸配列によりコードされるポリペプチドにも関する。本発明はさらに、転写活性化因子の生成又は機能が変更されている、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞、及び前記ポリペプチドを生成するための方法に関する。
【０００８】
発明の特定の記載：
転写活性化因子をコードする核酸配列：
本発明の第１の観点は、
（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補鎖に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200mg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
から成る群から選択された転写活性化因子をコードする単離された核酸配列に関する。
【０００９】
用語“転写活性化因子”とは、本明細書において使用される場合、それが連結されているポリペプチドコード配列の転写の開始のために必要な特異的プロモーター又はプロモーター組を活性化する能力を有するポリペプチドを言及する。
用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、他の核酸配列を実質的に有さない核酸配列、例えば、アガロース電気泳動により決定される場合、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは少なくとも約60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも約80％の純度、最も好ましくは少なくとも約90％の純度の核酸配列を言及する。例えば、単離された核酸配列は、その核酸配列を、その天然の位置から、それが再生されるであろう異なった部位に再配置されるために遺伝子工学に使用される標準のクローニング方法により得られる。そのクローニングの方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、そのフラグメントのベクター分子中への挿入、及び核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中への前記組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成起源のもの、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００１０】
好ましい態様においては、核酸配列は、活性ポリペプチドをコードする、配列番号１に示される核酸配列に対して、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の同一性の程度を有する。本発明のためには、２種の核酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギャップペナルティ及び10のギャップ長さペナルティーを有するClustal方法（Higgins, 1989, CABIOS 5:151-153）により決定される。
【００１１】
さらにより好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は、配列番号１に示されるような核酸配列を有する。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、前記ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらのポリペプチドは、その生来の源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構築された手段において異なる。例えば、比活性、結合特異性及び/又は親和性、又は同様のものにおいて異なる、ポリペプチドの変異体を、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて合成することは、興味あることである。類似配列が、配列番号１のポリペプチド部分として表される核酸配列、例えばその副配列に基づいて、及び/又は核酸配列によりコードされるポリペプチドのもう１つのアミノ酸を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的な記載のためには、例えば、Fordなど., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107 を参照のこと。
【００１２】
もう1つの好ましい態様においては、本発明は、ポリペプチドの転写活性化活性を定性的に保持する、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の程度の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、“相同ポリペプチド”という。）をコードする単離された核酸配列に関する。
【００１３】
好ましい態様においては、相同ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくは１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。本発明のためには、２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、同一性表、10のギャップペナルティー及び10のギャップ長さのペナルティーを有するClustal 方法（Higgins, 1989, 前記）により決定される。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは、標準のサザンブロット方法によれば、核酸配列が、配列番号１に示される核酸配列のポリペプチドコード部分に対応するオリゴヌクレオチドブローブに対して、低い〜高い緊縮条件（すなわち、５×SSPE、0.3％のSDS, 200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25，35，又は50％のホルムアミド（それぞれ、低い、中位及び高い緊縮性）における42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）下で、ハイブリダイズすることを示す。配列番号１と相同であるクローン又はDNAを同定するためには、ハイブリダイゼーション反応は、２×SSC、0.2％のDSDを用いて、好ましくは少なくとも50℃、より好ましくは少なくとも55℃、より好ましくは少なくとも60℃、より好ましくは65℃、さらにより好ましくは少なくとも70℃及び最も好ましくは少なくとも75℃で、それぞれ30分間、３度、洗浄される。
【００１５】
配列番号１の核酸配列又はその副配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はその部分配列、又は配列番号３のアミノ酸配列が、当業界において良く知られている方法に従って、いずれかの属又は種の相同遺伝子を同定し、そして単離し又はクローン化するためのオリゴヌクレオチドプローブを企画するために使用され得る。
【００１６】
特に、そのようなプローブは、対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。そのようなブローブは、完全な配列よりもかなり短いが、しかし少なくとも15個、好ましくは少なくとも25個、及びより好ましくは少なくとも40個の長さのヌクレオチドであるべきである。より長いプローブがまた使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（例えば、32P、3H, 35S, ビオチン又はアビジンによる）。例えば、32P-, 3H-又は35S-ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、X線フィルムの使用により検出され得る。
【００１７】
従って、そのような他の生物から調製されるゲノム、cDNA又はコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、上記プローブとハイブリダイズし、そして転写活性化活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る。そのような他の生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAは、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に移行され、そして固定され得る。次に、配列番号１に対して相同であるクローン又はDNAは、標準のサザンブロット方法に従って同定され得る。
【００１８】
対立遺伝子変異体は、同じ染色体遺伝子座を占める、複数の他の形の遺伝子のいずれかを示す。対立遺伝子変動は天然においては、突然変異を通して生じ、そして集団内での表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり（すなわち、コードされたポリペプチドにおける変化は存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００１９】
用語“ポリペプチドの対立遺伝子変異体”は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％の同一性を有し、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、（ｃ）配列番号１の核酸配列又はその相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズし、そして（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列から成る群から選択された核酸配列の対立遺伝子変異体である。
【００２０】
本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１とは異なる核酸配列も包含する。本発明はまた、配列番号１の副配列にも関し、ここで配列番号１の副配列は、配列番号１により包含される核酸配列であるが、但しその5’及び3’末端からの１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。好ましくは、配列番号１の副配列は、転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。より好ましい態様においては、配列番号１の副配列は、配列番号３に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列を少なくとも含む。
【００２１】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングに基づく方法を用いることによってもたらされ得る。（例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと）。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。核酸配列は、微生物、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、核酸配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
【００２２】
配列番号１の核酸配列、その相補鎖、又は配列番号１の対立遺伝子変異体及び副配列、又は転写活性化因子の対立遺伝子変異体及びフラグメントとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする核酸配列によりコードされる転写活性化因子は、いずれかの属の微生物から得られる。
好ましい態様においては、転写活性化因子は、菌類細胞から得られる。“菌類（Fungi）”とは、本明細書において使用される場合、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【００２３】
好ましい態様においては、菌類源は、糸状菌株である。“糸状菌”とは、真菌門（Eumycota）及び卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌糸体壁により特徴付けられる。生長は菌糸の延長によってであり、炭素異化は絶対好気性である。糸状菌株は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス（Neicakkunastux）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスクス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）。
【００２４】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列が、アスペルギラスの株、例えばA.アワモリ（A. awamori）又はA.ニジュランス（A. nidulans）から得られる。さらにより好ましくは、核酸配列、例えば配列番号１で示される核酸配列が、A.ニガー（A. niger）の株の単離物、すなわちDSM12298から得られる。
【００２５】
もう１つのより好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、フサリウムの株、例えばF.オキシスポラム（F. oxysporum）から得られる。好ましくは、前記株は、F. ベネナタム（F. venenatum）の株（Nirenberg sp. nov.）である。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列は、酵母株、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、シゾサッカロミセス（Schixosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）株から得られる。好ましくは、前記株は、ハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pichia）又はサッカロミセス（Saccharomyces）の株である。
【００２６】
前述の短いに関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。例えば、ポリペプチドは、Raper, k.D. and Fennel, D.I. (1965. The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore MD) により定義されるように、アスペルギラスの分類学的同等物である微生物から、それらが知られている種名称にかかわらず、得られる。アスペルギラスは、小柄又は鉢状態として種々に言及される、同時に形成される特殊化された細胞、及び分生子として言及される、無性生殖的に形成された胞子の１又は２つの層を担持する小嚢で終結する既知のテレオモルフ状態を有さない分生子柄から構成されるアスペルギラスにより特徴づけられる栄養胞子菌類である。アスペルギラスの既知のテレオモルフは、ユーロチウム（Eurotium）、ネオサルトリヤ（Neosartorya）及びエメリセラ（Emericella）を包含する。アスペルギラスの株及びそのテレオモルフは、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection (AtCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
【００２７】
さらに、そのような転写活性化因子は、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、核酸配列は、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。転写活性化因子をコードする核酸配列がプローブにより検出されると、配列は当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor, New York を参照のこと）。
【００２８】
もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、転写活性化活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
もう１つの好ましい態様においては、単離された核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする。
【００２９】
本発明はまた、菌類における転写活性化因子であるポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１に示される核酸配列又はその相補鎖、又は配列番号１の対立遺伝子変異体及び副配列と同じ条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブに、低い緊縮条件、より好ましくは中位の緊縮条件、及び最も好ましくは高い緊縮条件下で、上記の標準サザンブロット方法（例えば、Sambrook, など., 1989, 前記）を用いてハイブリダイズする、本発明の転写活性化因子をコードする単離された核酸配列にも関する。
【００３０】
もう１つのさらに好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれるDNA結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列である。
核酸構造体：
本発明のもう1つの観点は、適切な発現宿主における転写活性化因子の生成を指令する１以上の制御配列に操作可能的に連結される本発明の転写活性因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体に関する。好ましい態様においては、核酸配列は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれるポリペプチドをコードする。
【００３１】
発現は、ポリペプチドの生成に関与する次のいずれかの段階を包含することが理解されているが、但しそれらだけには限定されない：転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプチドをコードする核酸配列の操作が、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要である。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業者においてよく知られている。
【００３２】
“核酸構造体”は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される核酸のゼグメントを含むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖の核酸分子として、本明細書において定義される。用語“核酸構造体”とは、その核酸構造体がコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カッセト”と類似語である。用語“コード配列”とは、本明細書において使用される場合、mRNAに転写され、そして本発明の転写活性化因子に翻訳される配列である。コード配列の境界は一般的に、mRNAの5’末端でのATG開始コドン、及びmRNAの3’末端での読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００３３】
用語“制御配列”は、ポリペプチドの発現のために必要であるか又はそのために好都合であるすべての成分を含むよう本明細書においては定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものでも外来性のものでもあり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少、制御配列はプロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列コード領域と共に、制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーと共に提供され得る。用語“操作可能に連結される”とは、制御配列がポリペプチドの生成を方向づけるように、DNA配列のコード配列に対する位置で適切に配置される配置として、本明細書においては定義される。
【００３４】
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する、細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そして細胞に対して相同の又は非相同の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【００３５】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に操作可能的に連結される。細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
【００３６】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００３７】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち糸状菌細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に操作可能的に連結される。細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が本発明において使用され得る。
糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ及びアスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００３８】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に操作可能的に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして糸状菌細胞により認識される配列でもあり得る。細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が本発明において使用され得る。
【００３９】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
制御配列はまた、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路中に振り向けることができるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含むことができる。他方では、コード配列の5’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列が通常、シグナルペプチドコード領域を含まない場合に必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス種からのグルコアミラーゼ又はアミラーゼ遺伝子、又はリゾムコル種からのリパーゼ又はプロテイナーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、糸状菌細胞の分泌経路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００４０】
糸状菌細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス−オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はヒューミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００４１】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ酸末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般的に、不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、又はミセリオプソラ・サーモフィララッカーゼ遺伝子から得られる（WO95/33836号）。
【００４２】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
発現ベクター：
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制御部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得、そのような部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換が可能にされ得る。他方では、ポリペプチドをコードする核酸配列は、前記配列又はその配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、コード配列はベクターに位置し、その結果、そのコード配列は発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列と操作可能的に連結される。
【００４３】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そしてポリペプチドをコードする核酸配列の発現を引き起こすことができるいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが挿入される糸状菌細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは線状又は閉環プラスミドであり得る。ベクターは自己複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外実在物として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確保するためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。ベクターシステムは、糸状菌細胞のゲノム中に導入される完全なDNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドであり得る。
【００４４】
ベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、及び同様のものを提供する遺伝子である。糸状菌細胞への使用のための選択マーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）及びtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、並びに他の種からの同等物を包含する群から選択され得る。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子、及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。
【００４５】
ベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに関係なく細胞におけるベクターの自己複製を可能にする要素を含む。
宿主細胞：
本発明のもう１つの観点は、本発明の核酸構造体又は発現ベクターを含んで成る宿主細胞に関する。
【００４６】
本発明の方法における宿主細胞の選択は、興味あるポリペプチドをコードする核酸配列の源に、かなりの程度、依存するであろう。
糸状菌細胞中への発現ベクター又は核酸構造体の導入は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体既知の態様での細胞壁の差異性から成る方法を包含することができる。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National of sciences USA 81: 1470-1474に記載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene 78; 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。
【００４７】
“導入”とは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクターを糸状菌細胞中に導入することを意味し、その結果、前記ベクターは染色体組み込み体として、又は自己複製染色体ベクターとして維持される。組み込みは一般的に、核酸配列が細胞中に安定して維持される場合、好都合であると思われる。染色体中へのベクターの組み込みは、相同組換え、非相同組換え又はトランスポジションにより起こる。
【００４８】
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、ベクターは、糸状菌細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置でのゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。それらの核酸配列は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得、そしてさらに、非コード又はコード配列であり得る。
【００４９】
自律複製のためには、ベクターはさらに、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする複製の起点を含むことができる。
組換え発現ベクターを構成するために本明細書に記載される要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、 Sambrook,など., を参照のこと）。
【００５０】
好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒューミコラ、ムコル、ミセリオプソラ、ネウロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム又はトリコダーマの種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
より好ましい態様においては、糸状菌細胞はアスペルギラス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はアクレモニウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はフサリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はヒューミコラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はムコル細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はミセリオプソラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はネウロスポラ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はペニシリウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はチエラビア細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリポクラジウム細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、糸状菌細胞はトリコダーマ細胞である。
【００５１】
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジャポニカ（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium toruloseam）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）又はフサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸状菌親細胞は、フサリウム・ベネナタム（Nirenberg sp. nov.）細胞である。さらに最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ムコル・ミエヘイ（Mucor meihei）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ミセリオプソラ・サーモフィリア（Myceliopthora thermophilum）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ネウロスポラ・クラサ（Neurospona crassa）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium Purpurogenum）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、トリコダーマ細胞は、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。
【００５２】
転写活性化活性を有するポリペプチド：
本発明のもう１つの観点は，
（ａ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ii）その相補的鎖，又は（iii）転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列番号１の副配列に、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列にコードされるポリペプチド、ここで前記低い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び25％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける50℃での30間により定義され；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ)の対立遺伝子変異体；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメント、ここで前記フラグメントは転写活性化活性を有し；及び
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又はその対立遺伝子変異体から成る群から選択された、単離されたポリペプチドに関する。
【００５３】
転写活性化因子は、本明細書に記載されるような技法を用いて単離され得る。本明細書において定義されるように、“単離された”ポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に有さない、例えばSDS−PAGEにより測定される場合、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の純度、さらにより好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度及びさらに最も好ましくは約95％の純度であるポリペプチドである。
【００５４】
本発明はまた、転写活性化活性を有する配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約55％、好ましくは少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％., 最も好ましくは少なくとも約95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドにも関する。
【００５５】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、配列番号２のアミノ酸配列、又は転写活性化活性を保持するそのフラグメントを含んで成る。最も好ましい態様においては、ポリペプチドは配列番号２のアミン酸配列を有する。配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシ末端から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。好ましくは、配列番号２のフラグメントは、配列番号３に示されるポリペプチド配列を少なくとも含む。
【００５６】
相同ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入又は欠失、及び/又は異なったアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸残基の置換により、配列番号２又は３のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なることができる。好ましくは、アミノ酸変更は、マイナーな性質のもの、すなわちタンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ−末端−、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
【００５７】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、非活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill（1979, The Proteins, Academic Press, New York）により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly並びにそれらの逆。
【００５８】
より好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、アスペルギラス・ニガー株、より好ましくはアスペルギラス・ニガーAB4.1（van Haringsveldt, W.,など., 1987, Mol. Gen. Genet. 206: 71-75）、及び最も好ましくはDSM12298としてDSMに寄託されているアスペルギラス・ニガー13PAP2，又はその変異体株（配列番号２又は３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する）から得られる。
【００５９】
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子は、E.コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれる核酸配列にコードされるポリペプチドである。
本発明はさらに、（ａ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体又は発現ベクターを有する宿主細胞を、ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明の転写活性化因子を生成するための方法に関する。
変更された転写活性化活性を有する宿主細胞：
本発明のもう１つの観点は、ポリペプチドの生成のために有用な親菌類細胞の変異体である宿主細胞に関し、個々で前記親細胞はプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成り、その転写が本発明の転写活性化因子により活性化され、そして変異体細胞は、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりも低く転写活性化因子及びプロテアーゼを生成する。
【００６０】
突然変異体細胞は、当業界において良く知られている方法を用いて、例えば転写活性化因子をコードする遺伝子の１又は複数のヌクレオチド挿入又は欠失により構成され得る。
好ましい態様においては、変異体細胞は、細胞に存在し、そして転写活性化因子の発現のために必要な核酸配列の修飾又は不活性化により得られる。
【００６１】
さらに好ましい態様においては、核酸配列は、（ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも70％同一性を有する核酸配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする核酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、又は（ii）その相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の対立遺伝子変異体；（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は転写活性化活性を有するポリペプチドフラグメントをコードし；及び（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の副配列、ここで前記副配列は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；から成る群から選択される。
【００６２】
もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞における転写活性化因子の低められた発現は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制御配列の修飾又は不活性化により得られる。用語“制御配列”は、“核酸構造体”のセクションにおいて定義されている。より好ましい態様においては、変異体細胞における制御配列は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわち核酸配列の発現に影響を及ぼすのに十分である部分である。可能性ある修飾のための他の配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６３】
遺伝子の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にゆだね、そして遺伝子の発現が低められるか又は排除されている変異体細胞についてスクリーンすることによって行われ得る。特異的であるか又はランダムであり得る突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることによって行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ得る。
【００６４】
本発明のための適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外（UV）線、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。
そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発される親細胞を、適切な条件下でインキュベートし、そして低められた又は遺伝子の発現を示すか又は発現を示さない変異体細胞について選択することによって行われる。
【００６５】
遺伝子の修飾又は不活性化はまた、遺伝子における１又は複数のヌクレオチド、又はその転写又は翻訳のために必要とされる調節要素の挿入、置換又は除去により達成され得る。たとえば、ヌクレオチドが、停止コドンの導入、開始コドンの除去又は読み取り枠の変更をもたらすために、挿入され又は除去され得る。そのような修飾又は不活性化は、当業界において知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成突然変異誘発により達成され得る。原則的に、修飾はインビボで、すなわち修飾される遺伝子を発現する細胞に対して直接的に行われ得るが、好ましくは、修飾は下記に例示されるように、インビトロで行われ得る。
【００６６】
選択の糸状菌細胞により上記遺伝子を不活性化するか又はその発現を低下させる便利な手段の例は、遺伝子置換又は遺伝子破壊の技法に基づかれている。たとえば、遺伝子破壊方法においては、興味ある内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸配列が、欠陥遺伝子を生成するために、親細胞中に形質転換される欠陥核酸配列の生成のためにインビトロで突然変異誘発される。相同組換えにより、欠陥核酸配列により、内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントが置換される。所望には、欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントはまた、核酸配列が修飾されているか又は破壊されている形質転換体の選択のために使用され得るマーカーをコードする。
【００６７】
他方では、遺伝子の修飾又は不活性化は、遺伝子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を用いて、確立されているアンチセンス技法により行われ得る。より特定には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞において転写され得、そして細胞において生成されるmRNAに対してハイブリダイズすることができる、遺伝子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、低められるか又は排除され得る。相補的アンチセンスヌクレオチド配列のmRNAへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量が低められるか、又は排除される。
【００６８】
配列番号１の核酸配列に対して相補的な核酸配列は、いずれかの微生物源から得られる。好ましい源は、菌類源、例えば上記のような酵母及び糸状菌である。好ましい糸状菌源は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ムコル（Mucor）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）及びトリコダーマ（Trichoderma）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい酵母源は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）及びヤロウィア（Yarrowia）の種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらに、核酸配列は、糸状菌細胞に対して生来のものであり得る。
【００６９】
もう１つの好ましい態様においては、親細胞は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する遺伝子を含む。
もう１つの好ましい態様においては、変異体細胞は、上記方法のいずれかにより修飾されているか又は不活性化されている核酸を有し、そして同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも低く、プロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。変異体細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約75％、及びさらにより好ましくは少なくとも約95%低く、プロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。
【００７０】
さらにより好ましい態様においては、変異体細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも実質的に検出できない量のプロテアーゼ又はその組み合わせを生成する。
プロテアーゼは、既知方法を用いてアッセイされ得る。そのような方法においては、48時間の培養培地のアリコートが3H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンと共にpH4.0でインキュベートされ、そしてTCA−可溶性画分における放射能が測定される（van Noort, J.M., など., 1991. Anal. Biochem 198:385-390）。他の方法は、例えばA.ニガーのアスパラギン酸プロテイナーゼA（Takahashi, K., 1991, Meth. In Enzymol. 248: 146-155）、エンドペプチダーゼ（Morihara, k., 1995. Meth. In Enzymol. 248: 242-253）、カルボキシペプチダーゼ（Reminton, J., and Breddam, X., 1994. Meth. In Enzymol. 244: 231-248）、ジペプチジルペプチダーゼ（Ikehara, Y., など., 244: 125-227）及びアミノペプチダーゼ（Little, G., など., 1976. Meth. In Engymol. 45: 495-503）を同定するために記載されている。
【００７１】
もう1つの好ましい態様においては、変異体細胞は、興味あるポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。
本発明のもう1つの観点は、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞に関し、ここで前記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、本発明の転写活性化因子をより多く生成し；そして（ｂ）その転写が前記転写活性化因子により活性化されるポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成る。
【００７２】
好ましい態様においては、宿主細胞は、（ｉ）転写活性化因子をコードする核酸配列、（ii）転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体、又は（iii）“発現ベクター”のセクションにおいて定義されたような発現ベクターの１又は複数のコピーを、親細胞中に導入することによって、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりも転写活性化因子をより生成する。
【００７３】
本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体はまた、ポリペプチドの発現を方向づけるために好都合である１又は複数の因子、例えば転写活性化因子（例えば、トランス−作用因子）、シャペローン（chaperone）及びプロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る。選択の糸状菌細胞において機能的であるいずれかの因子が本発明において使用され得る。１又は複数のそれらの因子をコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と必ずしも一列に並んで存在する必要はない。
【００７４】
活性化因子は、ポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudla など., 1990, EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai and Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297）。活性化因子をコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエヘム活性化因子タンパク質（hap1）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトース代謝タンパク質４（gal4）、アスペルギラス・ニジュランスアンモニア調節タンパク質（areA）及びアスペルギラス・オリザエα−アミラーゼ活性因子 (amyR) をコードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Verdier, 1990, 前記、及びMackenzie など., 1993, Journal of General Microbiology 139: 2295-2307を参照のこと）。
【００７５】
シャペローンは、もう１つのポリペプチドの適切な折りたたみを助けるタンパク質である (Hartl など., 1994, TIBS 19: 20-25; Bergeron など., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder など., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething and Sambrook, 1992, Nature 355: 33-45; Puig and Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; Wang and Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson など., 1994, Bio/Technology 1: 381-384; Jacobs など., 1993, Molecular Microbiology 8: 957-966)。シャペローンをコードする核酸配列は、アスペルギラス・オリザエタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はサッカロミセス・セレビシアエカルネキシン、サッカロミセス・セレビシアエBiP/GRP78, 及びサッカロミセス・セレビシアエHsp70をコードする遺伝子から得られる。さらなる例のためには、Gething and Sambrook, 1992, 前記、及びHartl など., 1994, 前掲を参照のこと。
【００７６】
プロセッシングプロテアーゼは、生化学的に活性な成熟ポリペプチドを生成するためにプロペプチドを分解するプロテアーゼである（Enderlin and Ogrydziak, 1994, Yeast 10: 67-79; Fuller など., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius など., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius など., 1983, Cell 32: 839-852; 米国特許第5,702,934号）。プロセッシングプレテアーゼをコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシアエジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセス・セレビシアエKex2, ヤロウェア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）ニ塩基性プロセッシングエンドプロテアーゼ（xpr6）及びフサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）メタロプロテアーゼ（p45遺伝子）をコードする遺伝子から得られる。
【００７７】
より好ましい態様においては、転写活性化因子をコードする核酸配列は、親細胞のその対応するプロモーターよりも強いプロモーター又はその機能的部分に操作可能的に連結される。さらにより好ましい態様においては、プロモーター又はその機能的部分は、細胞外プロテアーゼ、例えばアスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエ中性メタロプロテアーゼ、アスペルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテアーゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ又はフサリウム・ベネナタムトリプシンをコードする遺伝子の発現を仲介する。
【００７８】
本発明はまた、親菌類細胞の変異体である、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞にも関し、ここで前記変異体は、
ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及び
ｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連結される誘導プロモーター、及び（ii）前記ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に結合された、それに前記転写活性化因子が結合することができるところのプロモーター配列（ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る）を含んで成る。
【００７９】
上記（ａ）における転写活性化因子の不活性形は、前記のいずれかの方法に従って、細胞に存在し、そして生来の転写活性化因子の発現のために必要な核酸配列の不活性化又は修飾により得られる。好ましい態様においては、不活性化又は修飾は、１又は複数のヌクレオチド挿入、欠失又は置換、特異的又はランダム突然変異誘発又は遺伝子中断、及び転写活性化因子の核酸配列に対して相補的なヌクレオチド配列を用いてのアンチセンス技法を包含する（但し、それらだけには限定されない）方法により得られる。もう１つの好ましい態様においては、生来の転写活性化因子の不活性形は、転写活性化因子の発現のために必要とされる制御配列の不活性化又は修飾により得られる。
【００８０】
もう１つの好ましい態様においては、生来の転写活性化因子をコードする核酸配列は、配列番号１に示される配列を有する。もう1つの好ましい態様においては、転写活性化因子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んで成る。
上記（ｂ）における誘発性プロモーター配列は、プロモーターの転写開始活性が発酵条件に従って誘発され得るいずれかのプロモーター配列又はその機能的部分であり得る。好ましくは、誘発は炭素又は窒素代謝物により仲介される。好ましい態様においては、プロモーターは、アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdSプロモーター、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーのniaD7プロモーター、アスペルギラス種のniiAプロモーター、アスペルギラス種のアルカリホスファターゼプロモーター、アスペルギラス種の酸性ホスファターゼプロモーター、又はアスペルギラス・ニガーのalcAプロモーターである。
【００８１】
もう1つの好ましい態様においては、宿主細胞はさらに、プロモーター配列を含んで成り、ここで前記プロモーターは転写活性化因子により活性化され、そしてポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に連結される。
本発明の転写活性化因子により活性化されるプロモーター配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、NA2−tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びそれらの変異体、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する（但し、それらだけには限定されない）群から選択されたいずれかのプロモーター、又はその機能的部分であり得る。糸状菌細胞に使用するための特に好ましいプロモーターは、プロテアーゼ遺伝子、例えばフサリウム・オキシスポラムメリプシン−様プロテアーゼ遺伝子（米国特許第4,288,627号）、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）、アスペルギラス・ニガーpacA遺伝子、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・オリザエ中性メタロプロテアーゼ遺伝子、アスペルギラス・ニガーアスペルギロペプシンプロテアーゼ遺伝子、又はフサリウム・ベネナタムトリプシン遺伝子からのプロモーター、又はその機能的部分である。
【００８２】
もう１つの好ましい態様においては、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つのコピーを有する。
もう１つの好ましい態様においては、本発明の転写活性化因子を発現する宿主細胞は、同一の条件下で培養される場合、親細胞よりも１又は複数の生来のプロテアーゼを少なく生成する。プロテアーゼは、上記方法のいずれかを用いてアッセイされ得る。より好ましい態様においては、48時間培養培地からのアリコートが3H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンと共にpH4.0でインキュベートされ、そしてTCA−可溶性画分における放射能が測定される（van Noort, J.M., など., 前掲）。
【００８３】
本明細書に記載される核酸構造体は、ポリペプチドの生成のために有用な宿主細胞を得るために、“宿主細胞”のセクションに記載のような方法のいずれかに従って、親菌類細胞中に導入され得る。好ましい態様においては、核酸構造体は細胞の染色体中に組み込まれる。もう1つの好ましい態様においては、核酸構造体は、自己複製染色体外ベクターとして維持される。
【００８４】
本発明の方法が、変異体菌類細胞を得るために特定の順序に制限されないことは理解されるであろう。第２核酸配列の修飾は、ポリペプチドの生成のために細胞の構成におけるいずれかの段階で親細胞中に導入され得る。
ポリペプチドの生成：
本発明のもう１つの観点は、（ａ）ポリペプチドをコードする遺伝子を有する宿主細胞を、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養し：そして（ｂ）前記宿主細胞の栄養培地からポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明の宿主細胞におけるポリペプチドを生成するための方法に関する。
【００８５】
１つの態様においては、その転写が本発明の転写活性化因子により活性化されるプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列を含んで成る親菌類細胞の変異体である宿主細胞に関し、そして前記変異体細胞は、同じ条件下で培養される場合、親細胞によりも転写活性化因子及びプロテアーゼを低く生成する。
もう１つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前記変異体は、（ａ）同じ条件下で培養される場合、親細胞に比較して、本発明の転写活性化因子をより生成し；そして（ｂ）ポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成り、その転写は本発明の転写活性化因子により活性化される。
【００８６】
もう1つの態様においては、宿主細胞は親菌類細胞の変異体であり、ここで前記変異体は、ａ）本発明の転写活性化因子又はその調節配列の修飾又は活性化、及びｂ）（ｉ）本発明の転写活性化因子をコードする核酸配列に操作可能的に連結される誘導プロモーター、及び（ii）前記転写活性化因子が前記ポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能的に結合することができるプロモーター配列（ここで、（ｉ）及び（ii）は同時に又は順番に導入され得る）を含んで成る。
【００８７】
本発明の宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて、興味あるポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする適切な培地において、及び条件下で行われる実験用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固相発酵を包含する）により培養される。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行われる（例えば、Bennett, J.W. and LaSure, L., eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。適切な培地は、市販されており、又は公開された組成物（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）を用いて調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収される。
【００８８】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により単離され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿により、栄養培地から単離され得る。次に単離されたポリペプチドはさらに、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、溶解度差による分別（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 を参照のこと）。
【００８９】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、酵素生成物の形成、酵素基質の消出又はSDS−PAGEの使用を包含することができる。例えば、酵素アッセイは、ポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。多くの酵素についての酵素活性を決定するための方法は、当業界において知られている。
【００９０】
本発明の方法においては、宿主細胞は、同じ条件下で培養される場合、対応する親細胞よりも、少なくとも約20％多く、好ましくは少なくとも約50％多く、より好ましくは少なくとも約100％多く、さらにより好ましくは少なくとも約200％多く、そして最も好ましくは少なくとも約300％多く、ポリペプチドを生成する。
【００９１】
ポリペプチドは、変異体糸状菌細胞に対して天然のものでも、又は異種のものでも、いずれのポリペプチドでもあり得る。用語“異種ポリペプチド”とは、細胞により生成されないポリペプチドとして、本明細書において定義される。用語“ポリペプチド”は、特定の長さのコードされた生成物の言及を意味せず、そして従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの生成に関与する、核酸配列に対して外来性の１又は複数の制御配列を含んで成る核酸配列によりコードされる、細胞に対して生来のポリペプチドである組換えポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、野生型ポリペプチド又はその変異体であり得る。ポリペプチドはまた、１又は複数のポリペプチドが細胞に対して異種である、少なくととも２つの異なったポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含むハイブリッドポリペプチドでもあり得る。ポリペプチドはさらに、上記ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子及び構築されたバリエーションを包含する。
【００９２】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、抗体又はその部分、抗原、血餠因子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその部分、調節タンパク質、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である。
より好ましい態様においては、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。
【００９３】
さらにより好ましい態様においては、酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００９４】
もう１つのさらにより好ましい態様においては、ポリペプチドは、ヒトインスリン又はその類似体、ヒト成長ホルモン、エリトロポエチン又はインスリノトロピンである。
異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、いずれかの原核、真核又は他の源から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書においては使用される場合、ポリペプチドがその源により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろう。
【００９５】
本発明の方法においては、変異体糸状菌細胞はまた、その細胞に対して天然のあるポリペプチドの組換え生成のためにも使用され得る。天然ポリペプチドは、ポリペプチドの発現を増強するために、シグナル配列の使用により、興味ある生来のポリペプチドの細胞外への輸送を促進するために、及び細胞により通常生成されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を高めるために、異なったプロモーターの制御下でポリペプチドをコードする遺伝子を置換することによって、組換え的に生成され得る。本発明はまた、細胞に対して生来であるポリペプチドのそのような組換え生成を、そのような発現が、細胞に対して天然ではない遺伝子要素の使用、又は糸状菌細胞に通常存在しない状態で機能するよう操作されている生来の要素の使用を包含する程度まで、用語“異種ポリペプチド”の範囲内に包含する。異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York を参照のこと。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及び単離、前記フラグメントのベクターへの挿入、及び核酸配列の複数のコピー又はクローンが置換されるであろう変異体菌類細胞への前記組換えベクターの組み込みを包含する。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００９６】
本発明の方法においては、異種ポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている融合された又はハイブリッドポリペプチドも包含することができる。融合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、他のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）に融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードする配列を、それらが整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう、連結することを包含する。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２種の異なったポリペプチドから得られる部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んで成り、ここで１又は複数のポリペプチドは、変異体菌類細胞に対して異種であり得る。興味ある異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。発現は、ポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を包含することが理解されるであろう。ベクター中へのその挿入の前、ポリペプチドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要である。クローニング方法を用いての核酸配列の修飾技法は、当業界において良く知られている。
【００９７】
本発明は次の例によりさらに記載されるが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００９８】
実施例
実施例：
材料：
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品であった。
株：
AB4.1：株ATCC9029のcspA pyrG1誘導体であるアスペルギラス・ニガーの株（van Hartingsveldt, W., など., 1987. Mol. Gen. Genet. 206: 71-75; Bos, C.J., など., Curr. Genet. 14: 437-443）。
【００９９】
AB1.13: AB4.1のUV突然変異誘発に由来するアスペルギラス・ニガーのプロテアーゼ欠失株（Mattern, I.E., など., 1992. Mol. Gen. Genet. 234: 332-336）。
13PAP2：A.ニガーのpepAプロモーター（Jarai G. and Buxton F. 1994. Curr. Genet. 26: 238-244）の制御下で、A. ニジュランスamdS遺伝子（Corrick, R. A., など., 1987. Gene 53: 63-71）の複数コピーを含むAB1.13誘導体。この株は、プロテアーゼ欠失表現型を有し、そして単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上で増殖することができない。株13PAP2は、DSM No.12298としてDSMに寄託されている。
【０１００】
4PAP6：A.ニガーのpepA プロモーターの制御下でA. ニジュランスandS 遺伝子の複数コピーを含むAB4.1誘導体。前記株は、プロテアーゼ欠失表現型を有さず、そして単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上で増殖することができる。
N402：ATCC No.64974としてATCC (Manassas VA, USA) に寄託されているアスペルギラス・ニガーの株。
【０１０１】
MC1046：ATCC No.35467としてATCCに寄託されているE.コリの株。
プラスミド：
pPAP: 下記実施例１に記載され、そして図１に示されるようにして構成される。
PAopyrGcosArp1: 下記実施例１に記載され、そして図２に示されるようにして構成される。
【０１０２】
pEES1: 下記実施例１に記載され、そして図３に示されるようにして構成される。
p3SR2: C.M. Corrick, A.P. Twomey, and M. J. Hynes (1987. Gene 53: 63-71) により記載されるように、A. ニジュランスamdS 遺伝子を含む。
pABPYRG*−Not：Verdoes, J.C., など. (1994. Gene 145: 179-187) により記載されるように、不活性化されたpyrG遺伝子を含む。
【０１０３】
pHelp1：Gems, D., など. (1991. Gene 98: 61-67) により記載されるように、選択マーカーとしてのA. オリザエからのpyrG遺伝子、及びE.コリベクターpIC20R中にクローン化された、A.ニガーにおいて自己複製できるAMA１配列を含む。
pAnscos1：Osiewacz, H.D. (1994, Curr. Genet. 26: 87-90) により記載されるように、２個のcos部位を含む。
【０１０４】
pAO4−２：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 159-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。
pAO4−13：De Ruiter-Jacobs, Y.M.J.T., など. (1989. Curr. Genet. 16: 159-163) により記載されるように、A. オリザエpyrG 遺伝子を含む。
pUC19：Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messig, J. (1985. Gene 33: 103-119) により記載の通りである。
例１：A. ニガーからのprtT転写活性化因子のクローニング：
prtTを、13PAP2, すなわちpepA プロテアーゼ遺伝子プロモーターにより調節されるamdS遺伝子を発現することができず、そしてプロテアーゼ欠失表現型（prt-）を有するA.ニガー変異体株からクローン化した。
A.ニガー13PAP2レポーター株の構成：
プラスミドpPA1を、次の３種のフラグメントの連結により構成した：
１）EcoR1及びKpnIにより消化されたE.コリベクターpBlueScript II SK (Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA);
２）PCRにより増幅された、開始コドン〜内部BamHI部位までの約130bpのamdS コード配列に連結されるpepA遺伝子の1.2kbプロモーター領域を含む1.4kbのEcoRI/Bam HI制限フラグメント；及び
３）A.ニジュランスamdS遺伝子のほとんどを含むp3SR2からの2.1kbのBam HI/KpnI フラグメント。
【０１０５】
フラグメント２を次の２段階で構成した。第１段階においては、下記“コスミドライブラリーの構成”のセクションに記載のようにして、プロトプラストから調製されたA.ニガーN402からのゲノムDNAを、鋳型として使用し、そして下記に示される２種のオリゴヌクレオチド、すなわちpepApr 及びpepA/amdSをプライマーとして使用した：
pepApr：CGG AAT TCG CAT GCT GGA GGT GCT TCT AA
pepA/amdS：TTC CCA GGA TTG AGG CAT TTT GAC CAC GAG AAT
次に、この反応から得られる1200bpのPCR生成物を、下記に示されるオリゴヌクレオチドMBL1213及び鋳型としてのプラスミドp3SR2と共に、第２PCR反応においてプライマーとして使用した：
MBL1213：TAA CTT CCA CCG AGG TC
続いて、下記の３種のフラグメントの連結により得られる生成物を、E.コリDH5α中にトランスフェクトした。
【０１０６】
最終構成方法においては、pPA1をNotIにより消化し、pABPYRG*−Notからの3.8kbのNotIフラグメントに連結し、図１に示されるプラスミドpPAPをもたらした。pPAPを用いて、A.ニガーAB1.13を形質転換し、そして複数コピーでpyrG遺伝子座中に組み込まれたpPAPを有する形質転換体を単離した。pyrG遺伝子により補充されたこの形質転換体の、自発的５フッ素酸（FOA）耐性で、ウリジン−要求性変異体を、13PAP2と命名した。
pAopyrGcosArp1の構成：
プラスミドpAopyrGcosArp1を、次の３種のフラグメントのE.コリDH5α中への連結及び続くトランスフェクションにより構成した：
１）Acc65I及びBamHIにより切断されたE.コリベクターpHelp1；
２）２つのcos部位を含むpAnscos1からの3.0kbのBamHI/HindIIIフラグメント；及び
３）A.オリザエpyrG遺伝子を含むpAO4-2からの3.2kbのAcc65I/HindIIIフラグメント。
【０１０７】
得られるプラスミドpAopyrGcosArp1は、アスペルギラスにおいて自己複製し、そしてウリジンを欠いている培地上での増殖により選択され得る。PAopyrGcosArp1は図２に示される。
コスミドライブラリーの構成：
アスペルギラス・ニガーのコスミドライブラリーを、“SuperCas1コスミドベクターキット”（Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA, USA）を用いて、その供給者の説明書に従って構成した。
【０１０８】
A.ニガーN402からのゲノムDNAを、標準の方法により製造されたプロトプラストから調製した。
単離の後、プロトプラストを、Beckman GS-6Rにおいて2000rpmでの10分間の遠心分離によりペレット；次のそのペレットを、22.5mMのトリス−イソナフタレンスルホン酸、275mMのパラ−アミノサリチル酸、0.2Mのトリス−HCl（pH8.5）、0.25MのNaCl及び50mMのEDTAを含む緩衝液に懸濁し、すぐに１体積のフェノール/クロロホルム（１：１）を添加した。注意して混合し、そして3000rpmでの20分間の遠心分離した後、水性相をデカントし、そしてDNAを標準の方法を用いて沈殿せしめた。
【０１０９】
ゲノムDNAのサイズを、４℃で30ボルトで20時間、運転される0.3％のアガロースゲル上での電気泳動により分析した。臭化エチジウムにより染色されたゲルは、回収されたDNAが50〜100kb以上のサイズの範囲であることを示した。DNAを、MboIを用いて一部消化した。その消化されたDNAのサイズは、上記と同じタイプのゲル分析により決定される場合、30〜50kbであった。QIAGEN（Venlo, The Netherlands）からのキットを用いて、製造業者の説明書に従って精製されたpAopyrGcosArp1ベクターを、BamHIにより消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製した。連結及びパッケージングを、標準の方法に従って行った。
【０１１０】
ライブラリーの滴定の後、単一の連結物及びパッケージングからのパッケージング混合物のすべてを、宿主細胞MC1046中にトランスフェクトし、そして50μg/mlのアンピシリンLBプレート上にプレートした。約40,000のコロニーを得た。10のコロニーからのコスミド調製物は、それらがすべて、予測されるサイズの挿入体を有したことを示した。次に、40,000のコロニーを、LB培地にソーキングし、そしてプレートから剥離し、次に貯蔵のために−80℃で15％グリセロールにアリコートした。これは、A.ニガーゲノムの約40倍の増幅を示す。
prtTクローンの選択：
コスミドDNAをライブラリーから調製し、そしてP.J. Punt and C.A.M.J.J. Van Den Hondel (1992. Methods Enzymol. 216: 447-457) に記載される形質転換方法に従って、13PAP２中に導入した。pyrG マーカーを選択するための反復された努力は、4,000〜30,000の形質転換体の回収をもたらした。pyrGマーカーについての二重選択、及び単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上での増殖は、５回の異なった実験から合計65の一次形質転換体をもたらした。
【０１１１】
個々の一次形質転換を、プロテアーゼ活性、単一の窒素源としてアセトアミドを含む培地上での増殖、及びそれらの２つの特徴の不安定性についてスクリーンンした。アセトアミドを含む培地上での増殖によりスクリーンされたアセトアミダーゼ+表現型は、pepAプロモーターがamdSコード配列に連結されるレポーターカセットにおけるpepAプロモーターの活性化に起因するアセトアミダーゼ活性の表示である。プロテアーゼ+表現型を、単一の窒素源として透析された脱脂乳を含む最少培地プレートを用いてスクリーンした（Mattern, I.E.,など., 1992. Mol. Gen. Genet. 234: 332-336）。それらのプレート上で、野生型AB4.1株は、透明な光輪を製造し、そしてAB1.13変異体は非常に小さな後輪を製造する。この差異は、pepA 欠失株がまた、それらのプレート上で大きな光輪を生成することができるので、pepAの活性にはよらない。従って、脱脂乳プレート上での大きな光輪は、他の細胞外プロテアーゼの活性化を示す。
【０１１２】
不安定性ウリジン含有培地上で、希釈された胞子ストックを増殖することによって試験した。単一の胞子由来のコロニーを、それらのプレートから採取し、そしてプロテアーゼ活性及びアセトアミド上での増殖について試験した。スクリーニング結果は、70％以上のコロニーにおいて、両特徴が失われたことを示した。従って、それらの２種の表現型は共に失われたか、又は保持されており、このことは、pepAプロモーター及び他のプロテアーゼプロモーターの活性化が調和して調節され、そしてpyrGマーカーの存在に連結されることを示唆する。この表現型を担当する遺伝子は、prtTとして命名された。次に、12種のアセトアミダーゼ+、プロテアーゼ+形質転換体を単離した。
prtT遺伝子の単離：
13PAP2のアセトアミダーゼ+、プロテアーゼ+形質転換体からprtT遺伝子を開放するために、DNAを、前記のようにして最少培地において増殖された菌糸体から調製した。このDNAを、コンピテントE.コリDH5ａ細胞を形質転換する試みに使用した。数百のアンピシリン−耐性コロニーを得た。DNA分析は、それらがすべて、pHelp1プラスミドに起因する配列を含んだことを示した。E.コリコロニーから単離されたコスミドDNAを用いて、13PAP2を再形質転換した。２種のDNAサンプルは、アセトアミド含有培地上での増殖及び高められたプロテアーゼ活性の両者を示す形質転換体を生ぜしめた。次に、コスミドの１つのACR１からのDNAを、いくつかの制限酵素により消化した。次に、その得られるフラグメント及びpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2株を同時形質転換した。ACR１のEcoRI，PstI, BamHI及びKpnI制限は、アセトアミド上で増殖でき、そして高いプロテアーゼ活性を有する形質転換体を付与し、ところがSalI及びHindIII消化物は、そうではなかった。EcoRI消化は最も単純なパターンを付与するので、別のEcoRIフラグメントをゲル単離し、そしてpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した。わずか１つのフラグメント、すなわち15kbのEcoRIフラグメントが、アセトアミド含有培地上で増殖できる形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、コスミドからprtTをサブクローン化するために、pBlueScript II SKにおいてサブクローン化した。このクローンの挿入体はまだかなり大きいので、別のPstIバンドをゲル単離し、そしてその個々及びpAopyrGcosArp1を用いて、13PAP2を同時形質転換した。わずか１つのバンド、すなわち2.5kbのPstIフラグメントは、アセトアミド含有培地上で増殖する形質転換体を生ぜしめた。このフラグメントを、pBlueScriptII SKにおいてサブクローン化した。４種のサブクローン、すなわちClE0.7, ClE1.8, NcE1.1及びNcE1.4を、制限地図に基づいてこのプラスミドから構成した。さらに、2.5kbのPst1フラグメントを含む6.5kbのSstI/EcoRIフラグメントをサブクローン化し、pEES1（図３に示される）をもたらした。
【０１１３】
AB4.1からのゲノムDNAのサザンブロット分析は、prtTのわずか1つのコピーの存在を示した。
実施例２：prtT遺伝子の配列決定及びその配列の分析：
すべての配列反応は、dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kits又はBigDye（商標）Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer Corporation, Branchburg, NJ, USAからの)を用いて調製された。反応は、ABI PRISM（商標）377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Corporation) 上で、製造業者の説明書に従って行われる。
【０１１４】
prtT遺伝子を、ゲノムクローンClE0.7, ClE1.8, NcE1.1, NcE1.4及びpEES1から配列決定した。使用される配列特異的プライマーは下記に列挙される：
122958：CGA TCG ATG ACT GCC TGT
122956：AGA GAC ACA TAG TGC CTT
122959：GCT TAT AGT CGA TAG CGC
122960：CCT CTC TCC AGC GAT GGT
122962：ATG GAA TAC ATA CTG CTT
122961：ATG AAA CCC ACT GTA GCT
122963：TGC TCG ATA AGC GGG TCC
122964：AAT CTT ATG GAC CCG CTT
124289：CCC CGG GAA ACA AGA ACA GG
124290：GTT GGC GGA CCT TGA CTA TG
125112：ACA GCT ACA GTG GGT TTC ATC T
125111：AGT CAA CGG GGG AAG TCT C
128330：CTA GCA GCG TAT CGG TCA GC
130887：CTT GGA AAA GAA ACG ATA G
130888：AAC GTA CGC TTT CCT CCT T
134135：GGG TCC GTC CAG TCC GTT CTT
−48逆方向：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA
−40普遍性：GTT TTC CCA GTC ACG AC
遺伝子の変異体対立遺伝子を、次のプライマーを用いて、変異体株AB1.13から単離されたゲノムDNAのPCR増幅により得た：
PstI：TC ATC CCT GGT GTT ACT GC
PstII: C ATG GAT TGG CTG GCC G
prtT遺伝子の完全なDNA配列は、配列番号１に示される。変異体対立遺伝子のPCRフラグメントの配列は、配列番号４に示される。
【０１１５】
コンピューターソフトウェアNetgene 2 (S. M. Hebsgaard, P. G. Korning, N. Tolstrup, J. Engelbrecht, P. Rouze, S. Brunak (1996. Nucleic Acids Research 24: 3439-3452)) を用いてのDNA配列（配列番号１）の分析は、５個のエキソンの存在を示した（配列番号１の注釈を参照のこと）。
prtT cDNAの分析：
mRNAを、プロテアーゼ生成のために好ましい条件下で増殖されたA.ニガーの培養物から、市販のポリ (A)+RNA単離されたキット（Pharmacia, uppsala SE）を用いて、全RNA（上記例１に記載されるDNA単離方法に従って単離された）から精製した（J.P.T.W. Van Den Hombergh, など., 1997, Eur. J. Biochem. 247: 605-613）。二本鎖cDNAを、標準の方法を用いて調製し、そして次のプライマーとのPCR反応のために使用した：
オリゴ−dTプライマー：T20N
Prt270n：TACTCTCCAGATTGCCTG
Prt1420r：TGAGATACCACTCAGCAG
Prt1350n：TGCACTTCTCTGTCTCTG
Prt2365r：GACTTCTGGCATCAGTTG
Prt2320n：CTCATGGATGGCATGATC
プライマーPrt270n及びPrt1420rとのPCR反応は、約1.0kbのフラグメントを生成した。このフラグメントを、pGEM-Tベクター（Promega Corp., Madison WI, USA）中にクローン化し、そしてその得られるプラスミドの挿入体を、プライマーに122958, 122960, −40普遍性及び−48逆方向を用いて配列決定した。その結果は、遺伝子のこの部分における２個のイントロンの存在を確かめた。
【０１１６】
プライマーPrt1350n及びPrt2365rとの第２のPCR反応は、約0.9kbのフラグメントを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクター中にクローン化し、そして得られるプラスミドにおける挿入体を、プライマー124289, 124290, -40普遍性及び-48逆方向を用いて配列決定した。その結果は、遺伝子のこの部分における単一のイントロンの存在を確かめた。
【０１１７】
オリゴ−dTプライマー及びPrt2320nとのもう1つのPCR反応は、約350bpのフラグメントを生成した。このフラグメントをまた、pGEM−Tベクターにおいてクローン化した。プライマー−40普通性及び−48逆方向を用いての挿入体の配列決定は、そのフラグメントがprtTの3’部分を含み、そしてもう1つのイントロンの存在を確かめたことを示した。
【０１１８】
翻訳されたprtT遺伝子の推定されるタンパク質配列は、配列番号２に示される。翻訳された変異体対立遺伝子prt13の推定されるタンパク質配列は、配列番号５に示される。配列番号２及び５の比較は、それらの２種の間の唯一の差異が、翻訳されたprtT遺伝子におけるロイシン残基が翻訳されたprt13遺伝子におけるプロリンにより置換される位置112に存在することを示す。
【０１１９】
推定されるPrtTタンパク質配列の分析は、Zinc(II)2Cys6二核クラスターDNA結合モチーフ（配列番号２、残基47−81）の存在を示す。このモチーフは、GAL4クラスの菌類転写活性化因子を定義する（Reece, M.J., and Ptashne, M. 1993, Science 261: 909-911）。prtT遺伝子におけるこのモチーフの存在は、prtTが転写活性化因子であることを示す。
実施例３：野生型A.ニガー株におけるprtT遺伝子の破壊：
prtT遺伝子の上流及び下流の配列がA.オリザエpyrG遺伝子により分離されているプラスミドを構成した。プラスミドpEES1を、MunI及びNheIにより消化し、prtTのコード配列のほとんどを含む2.1kbのフラグメントを除去した。A.オリザエpyrG遺伝子を含むpAO4-13からの2.3kbのEcoRI/NheIフラグメントを、pEES1のMunI及びNheI部位にクローン化した。図４に示されるプラスミドをpDprtと命名した。次に、その構造体を用いて、A.ニガー株AB4.1を形質転換し、ウリジン原栄養性形質転換体を、脱脂乳含有プレート上でのプロテアーゼ活性について分析した。それらのうち５個はそれらのプレート上でハローを生成せず、このことは、プロテアーゼ活性が非常に低かったことを示唆する。破壊されたprtT遺伝子を有する株及び変異体AB1.13株の比較は、プロテアーゼ活性又は表現型においていずれの差異も示さなかった。
実施例４：prtTの過剰発現：
A.ニガーgpd遺伝子のプロモーターに融合されるprtTのコード領域及び3’側非コード配列を含むプラスミドpGPprt（図５）を構成した。gpd遺伝子は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、すなわち一次代謝に関係する構成的に発現された酵素をコードする。使用されるプロモーターは、コード領域の上流のフラグメントであった。プラスミド及びpyrG選択プラスミドpAO4-13を用いて、同時形質転換により、A.ニガーAB4.1を性質転換した。サザンブロット分析により決定される場合、高められたprtT転写を有する形質転換体を、高められたプロテアーゼ発現について分析した。
生物学的材料の寄託：
次の生物学的材料を、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 braunschweig, germanyに、ブダペスト条件に基づいて寄託し、そして次に受託番号が付与された：
受託物 受託番号 受託日
エスシェリシア・コリpEES DSM12294 1998-07-14
アスペルギラス・ニガー13PAP2 DSM12298 1998-07-14
菌株は、培養物が、本特許出願の審査中、入手できることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された菌株の実質的に純粋な培養物を提供する。寄託物は、本出願の対象物が出願される国々の外国特許法により必要とされる場合、利用できる。しかしながら、寄託物の有用性は、政府指令により許される特許権を損いながら本発明を実施する許可を構成しないことは理解されるべきである。
【０１２０】
本明細書において記載され、そして請求された発明は、本明細書に開示される特定の態様により制限されず、それらの態様は、本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様は、本発明の範囲内にあるものと意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に本発明の種々の修飾は当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた、本発明の範囲内に存在する。
【０１２１】
種々の文献が本明細書において引用されており、それらの開示はすべて、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドpPAPの制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図２】 図２は、プラスミドpAopyrGcosArp1の制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図３】 図３は、プラスミドpEES1の制限地図を示し、その構成は実施例１に記載される。
【図４】 図４は、プラスミドpDprtの制限地図を示し、その構成は実施例３に記載される。
【図５】 図５は、プラスミドpGPprtの制限地図を示し、その構成は実施例4に記載される。
【配列表】
Claims (26)
- （ａ）配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸からなるポリペプチドをコードする核酸；及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸、又は（ii）その相補鎖と、高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸、ここで前記高い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200mg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び５０％のホルムアミドにおける42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDSにおける７０℃での30分間の洗浄により定義される；
から成る群から選択される、プロテアーゼプロモーターに対する転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。 - 配列番号１の核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸。
- 転写活性化活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はそのフラグメントをコードする、請求項１又は２に記載の核酸。
- 配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
- エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）DSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれる転写活性化活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
- 好適な発現宿主におけるポリペプチドの生成を指令する１以上の制御配列に操作可能的に連結される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸構造体。
- 請求項６に記載の核酸構造体、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む発現ベクター。
- 請求項６に記載の核酸構造体又は請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- （ａ）（ｉ）配列番号１の核酸、（ii）その相補鎖に、高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド、ここで前記高い緊縮条件は５×SSPE、0.3％のSDS、200μg/mlの剪断され、そして変性されたサケ精子DNA及び５０％のホルムアミド中42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションにより定義され、そして洗浄条件は２×SSC、0.2％のSDS中７０℃での30分間により定義され、ここで、該ポリペプチドは転写活性化活性を保持する；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは転写活性化活性を保持する；及び
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ここで、該ポリペプチドは転写活性化活性を保持する、
から成る群から選択される単離されたポリペプチド。 - 配列番号２のアミノ酸配列又は転写活性化活性を保持するそのフラグメントからなる、請求項９に記載のポリペプチド。
- エスシェリシア・コリDSM12294に含まれるプラスミドpEESに含まれる核酸によりコードされる、請求項９又は１０に記載のポリペプチド。
- 配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
- 請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）請求項８に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成を誘導する条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収する、
を含む方法。 - ポリペプチドの生成のために有用な菌類宿主細胞であって、前記細胞が、
ａ）プロテアーゼをコードする１以上のDNA配列を含む親菌類細胞の突然変異体であり、該DNA配列の転写が請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸によりコードされた転写活性化因子により活性化され、ここで該突然変異体は、該親菌類細胞内に存在し、かつ、該転写活性化因子の発現のために必要な核酸の修飾又は不活性化により得られ、かつ、該修飾又は不活性化は、部位特異的突然変異誘発、PCR生成突然変異誘発、ヌクレオチド挿入及び/又は置換、又は遺伝子中断又は置換技術、又はそれらの組み合わせにより行われる；そして
ｂ）同じ条件下で培養されるとき、上記親細胞よりも少ない上記転写活性化因子及びプロテアーゼを生成し、そして
前記菌類宿主細胞はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger）の菌株である、
ことを特徴とする宿主細胞。 - 前記転写活性化因子の低下した生成が、ポリペプチドの発現のために必要とされる制御配列の修飾又は不活性により得られる、請求項１４に記載の宿主細胞。
- 前記制御配列がプロモーター配列又はその機能的部分である、請求項１５に記載の宿主細胞。
- 前記修飾されるか又は不活性化される核酸が請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、前記ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１のコピーを含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、同一の条件下で培養されるとき、親細胞よりも、天然のプロテアーゼ又は天然プロテアーゼの組み合わせ物を少量生成する、請求項１４に記載の宿主細胞。
- 前記プロテアーゼの活性がpH4での3H−ラベルされたクジラ精子ミオグロビンの分解によりアッセイされる、請求項１４に記載の宿主細胞。
- ポリペプチドの製造方法であって：
（ａ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子を宿す、請求項１４に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成のために好適な栄養培地中で培養し；そして
（ｂ）前記突然変異体細胞の栄養培地から前記ポリペプチドを回収する
を含む方法。 - 前記ポリペプチドが前記親細胞にとって天然である、請求項２１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが前記親細胞に対して異種である、請求項２１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体又はその部分、抗原、血液凝固因子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその部分、調節タンパク質、構造タンパク質、リポーター、又は輸送タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
- 前記酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである、請求項２４に記載の方法。
- 前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである、請求項２５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK199801258 | 1998-10-05 | ||
| DKPA199801258 | 1998-10-05 | ||
| PCT/DK1999/000524 WO2000020596A1 (en) | 1998-10-05 | 1999-10-05 | Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002526112A JP2002526112A (ja) | 2002-08-20 |
| JP4563585B2 true JP4563585B2 (ja) | 2010-10-13 |
Family
ID=8102827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000574691A Expired - Fee Related JP4563585B2 (ja) | 1998-10-05 | 1999-10-05 | ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1117798B1 (ja) |
| JP (1) | JP4563585B2 (ja) |
| CN (1) | CN1329667B (ja) |
| AT (1) | ATE349528T1 (ja) |
| AU (1) | AU5850999A (ja) |
| DE (1) | DE69934596T2 (ja) |
| DK (1) | DK1117798T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000020596A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003526374A (ja) * | 2000-03-14 | 2003-09-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7229784B2 (en) | 2000-09-19 | 2007-06-12 | Microbia, Inc. | Modulation of secondary metabolite production by zinc binuclear cluster proteins |
| CN101629204A (zh) | 2003-03-31 | 2010-01-20 | 诺维信股份有限公司 | 在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法 |
| EP1799827A2 (en) * | 2004-10-12 | 2007-06-27 | DSMIP Assets B.V. | Fungal transcriptional activators useful in methods for producing a polypeptide |
| DK1954812T3 (da) | 2005-11-29 | 2013-02-18 | Dsm Ip Assets Bv | DNA-bindingssted for en transskriptionsaktivator, der er anvendelig ved genekspression |
| US20100062491A1 (en) * | 2007-01-05 | 2010-03-11 | Novozymes A/S | Overexpression of the Chaperone BIP in a Heterokaryon |
| WO2009058661A1 (en) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Use and production of citrate-stable neutral metalloproteases |
| CN101182352B (zh) * | 2007-11-21 | 2010-06-09 | 中国科学院微生物研究所 | 一种转录激活因子及其编码基因与应用 |
| CN102597241B (zh) | 2009-07-22 | 2015-09-02 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于生产感兴趣的化合物的经改进的宿主细胞 |
| DK2875119T3 (en) | 2012-07-19 | 2018-04-03 | Dsm Ip Assets Bv | AGSE-DEFICIENT TRIALS |
| KR20160035587A (ko) | 2013-07-10 | 2016-03-31 | 노파르티스 아게 | 복수개의 프로테아제 결핍 사상형 진균 세포들 및 그의 이용방법 |
| US10513724B2 (en) | 2014-07-21 | 2019-12-24 | Glykos Finland Oy | Production of glycoproteins with mammalian-like N-glycans in filamentous fungi |
| WO2016110453A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Dsm Ip Assets B.V. | A crispr-cas system for a filamentous fungal host cell |
| FR3046180B1 (fr) * | 2015-12-28 | 2018-09-21 | IFP Energies Nouvelles | Souches mutantes de trichoderma reesei |
| CN110431224A (zh) | 2017-03-13 | 2019-11-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 锌双核簇转录调控因子缺陷型菌株 |
| BR112020025589A2 (pt) | 2018-06-19 | 2021-03-23 | Dsm Ip Assets B.V. | variantes de enzima lipolítica |
| US20230212634A1 (en) | 2020-01-14 | 2023-07-06 | The Protein Brewery B.V. | Expression of Ovalbumin and its Natural Variants |
| WO2023222614A1 (en) | 2022-05-16 | 2023-11-23 | Dsm Ip Assets B.V. | Lipolytic enzyme variants |
| WO2023242273A1 (en) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Newmilkbuzz B.V. | Expression of milk caseins in filamentous fungi |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5179003A (en) * | 1988-01-05 | 1993-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the production of proteins or protein-containing gene products |
| JPH10501414A (ja) * | 1994-06-17 | 1998-02-10 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | ａｒｅＡ遺伝子が修飾された真菌及びアスペルギルス オリザエからのａｒｅＡ遺伝子 |
| WO1997012045A1 (en) * | 1995-09-27 | 1997-04-03 | Chiron Corporation | Method of making a protease deficient host |
| JP4263241B2 (ja) * | 1996-03-27 | 2009-05-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | アルカリプロテアーゼを欠失した糸状真菌 |
-
1999
- 1999-10-05 AT AT99945966T patent/ATE349528T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-10-05 EP EP99945966A patent/EP1117798B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-05 EP EP06126806A patent/EP1783223A1/en not_active Withdrawn
- 1999-10-05 AU AU58509/99A patent/AU5850999A/en not_active Abandoned
- 1999-10-05 CN CN99814016.3A patent/CN1329667B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-05 DK DK99945966T patent/DK1117798T3/da active
- 1999-10-05 WO PCT/DK1999/000524 patent/WO2000020596A1/en active IP Right Grant
- 1999-10-05 JP JP2000574691A patent/JP4563585B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-05 DE DE69934596T patent/DE69934596T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003526374A (ja) * | 2000-03-14 | 2003-09-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5850999A (en) | 2000-04-26 |
| CN1329667A (zh) | 2002-01-02 |
| DK1117798T3 (da) | 2007-04-10 |
| EP1117798A1 (en) | 2001-07-25 |
| DE69934596D1 (de) | 2007-02-08 |
| DE69934596T2 (de) | 2007-10-04 |
| CN1329667B (zh) | 2014-05-28 |
| EP1117798B1 (en) | 2006-12-27 |
| ATE349528T1 (de) | 2007-01-15 |
| EP1783223A1 (en) | 2007-05-09 |
| WO2000020596A1 (en) | 2000-04-13 |
| JP2002526112A (ja) | 2002-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1266011B1 (en) | Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides | |
| JP4563585B2 (ja) | ポリペプチドの生成方法において有用な菌類転写活性化因子 | |
| JP4620253B2 (ja) | 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター | |
| JP4783359B2 (ja) | 真菌細胞において遺伝子を発現させるための真菌プロモーター | |
| US8426164B2 (en) | Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides | |
| US7172887B2 (en) | Methods for producing citric acid using host cells deficient in oxaloacetate hydrolase | |
| JP2010517587A (ja) | 関心のある化合物を生産するための組み換え宿主細胞 | |
| JP2008531031A (ja) | 真菌細胞中で遺伝子を発現させるためのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）プロモーター | |
| JP2011101651A (ja) | オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠陥真菌宿主細胞 | |
| JP2002515252A (ja) | 糸状菌変異体細胞においてポリペプチドを生産するための方法 | |
| JP2002535990A (ja) | 真菌細胞においてポリペプチドを生産する方法 | |
| JP4860820B2 (ja) | シクロヘキサデプシペプチド欠損細胞におけるポリペプチドの産生方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060920 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090714 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091001 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100305 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100312 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100607 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100629 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100729 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130806 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |