JP2002535990A - 真菌細胞においてポリペプチドを生産する方法 - Google Patents
真菌細胞においてポリペプチドを生産する方法Info
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- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
Abstract
(57)【要約】
本発明はポリペプチドを生産する方法であって：（ａ）親真菌細胞の突然変異体を培養し、ここで当該突然変異細胞はｐａｃＣ pHシグナル変換経路の１もしくは複数の遺伝子の修飾を含んで成る第一核酸配列と、前記ポリペプチドをコードする第二核酸配列と含んで成り；そして（ｂ）当該ポリペプチドを培養培地から単離する；ことを含んで成る方法に関する。
Description
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明はプロテアーゼ欠陥細胞においてポリペプチドを生産するための方法に
関連する。
関連する。
【０００２】 関連技術の説明 多くの微生物は幅広いpH域で増殖することができる。この能力は細胞内プロセ
スを極端なpHから守るのに有効なpH恒常性メカニズムと、pH恒常性の境界をまた
いで有効な活性が適切な周囲pHにてのみ発揮されることを保障する手段を要する
。
スを極端なpHから守るのに有効なpH恒常性メカニズムと、pH恒常性の境界をまた
いで有効な活性が適切な周囲pHにてのみ発揮されることを保障する手段を要する
。
【０００３】 ｐａｃＣ遺伝子はｐａｃＣと命名されたタンパク質をコードする。ｐａｃＣは
配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質であり、それは遺伝子であってその産物がア
ルカリpHにて優先的に合成されるような遺伝子の発現を活性化し、また酸性増殖
条件に適する遺伝子産物の合成を抑制する。Tilburnら、1995, EMBO Journal 14
: 779-790 は、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）内のｐａｃＣが、アルカリ周囲pHに応答して、ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ
，Ｆ，Ｈ及びＩ遺伝子の産物により媒介されるシグナルの存在下でアルカリ性発
現産物の転写を活性化することを提唱している。ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及び
Ｉ遺伝子はｐａｃＣpHシグナル変換経路として知られている。従って、アルカリ
性周囲pHでは、アルカリ性遺伝子の発現が高まり、同時に酸性遺伝子の発現は減
退する。酸性条件下では、ｐａｃＣは非機能状態にあり、そしてそのレベルは減
退し、酸性発現遺伝子産物の抑制及びｐａｃＣ自体を含むアルカリ性発現遺伝子
の活性化の消失に結びつく。
配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質であり、それは遺伝子であってその産物がア
ルカリpHにて優先的に合成されるような遺伝子の発現を活性化し、また酸性増殖
条件に適する遺伝子産物の合成を抑制する。Tilburnら、1995, EMBO Journal 14
: 779-790 は、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）内のｐａｃＣが、アルカリ周囲pHに応答して、ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ
，Ｆ，Ｈ及びＩ遺伝子の産物により媒介されるシグナルの存在下でアルカリ性発
現産物の転写を活性化することを提唱している。ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及び
Ｉ遺伝子はｐａｃＣpHシグナル変換経路として知られている。従って、アルカリ
性周囲pHでは、アルカリ性遺伝子の発現が高まり、同時に酸性遺伝子の発現は減
退する。酸性条件下では、ｐａｃＣは非機能状態にあり、そしてそのレベルは減
退し、酸性発現遺伝子産物の抑制及びｐａｃＣ自体を含むアルカリ性発現遺伝子
の活性化の消失に結びつく。
【０００４】 ｐａｃＣ遺伝子又はｐａｃＣpHシグナル変換経路の遺伝子のいくつかの変異は
、実際の周囲pHとは異なるpHでの増殖効果を模倣できる（Caddickら1986, Molec
ular General Genetics 203: 346-353; Shahら1991, FEMS Microbiological Let
ters 77: 209-212; Espesoら1993, EMBO Journal 12: 3947-3956; Arstら1994,
Molecular General Genetics 245: 787-790)。ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及びＩ
の６つの遺伝子の任意のいくつかの突然変異は酸性pHでの増殖効果を模倣し、そ
の結果、例えば酸性ホスファターゼのレベルの高揚及びアルカリ性ホスファター
ゼのレベルの低下が得られる。対照的に、ｐａｃＣ遺伝子におけるいくつかの突
然変異はアルカリpHでの増殖効果を模倣し、その結果、アルカリ性ホスファター
ゼのレベルの高揚及び酸性ホスファターゼのレベルの低下が得られる。このよう
なアルカリ性条件下での増殖を模倣するｐａｃＣ遺伝子の突然変異はその活性を
調節する酸性Ｃ末端セグメントを除去する。酸性Ｃ末端ドメインが除かれると、
ｐａｃＣは活性となり、そしてアルカリ性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現
を活性化し、且つ酸性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現を抑制する。ｐａｃ
Ｃ遺伝子のかかる突然変異はシグナル変換経路の必要性を取り除き、アルカリ性
発現遺伝子の構成及び酸性発現遺伝子の超抑制に結びつく。
、実際の周囲pHとは異なるpHでの増殖効果を模倣できる（Caddickら1986, Molec
ular General Genetics 203: 346-353; Shahら1991, FEMS Microbiological Let
ters 77: 209-212; Espesoら1993, EMBO Journal 12: 3947-3956; Arstら1994,
Molecular General Genetics 245: 787-790)。ｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及びＩ
の６つの遺伝子の任意のいくつかの突然変異は酸性pHでの増殖効果を模倣し、そ
の結果、例えば酸性ホスファターゼのレベルの高揚及びアルカリ性ホスファター
ゼのレベルの低下が得られる。対照的に、ｐａｃＣ遺伝子におけるいくつかの突
然変異はアルカリpHでの増殖効果を模倣し、その結果、アルカリ性ホスファター
ゼのレベルの高揚及び酸性ホスファターゼのレベルの低下が得られる。このよう
なアルカリ性条件下での増殖を模倣するｐａｃＣ遺伝子の突然変異はその活性を
調節する酸性Ｃ末端セグメントを除去する。酸性Ｃ末端ドメインが除かれると、
ｐａｃＣは活性となり、そしてアルカリ性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現
を活性化し、且つ酸性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現を抑制する。ｐａｃ
Ｃ遺伝子のかかる突然変異はシグナル変換経路の必要性を取り除き、アルカリ性
発現遺伝子の構成及び酸性発現遺伝子の超抑制に結びつく。
【０００５】 ｐａｃＣ遺伝子はアスペルギルス・ニドゥランス（Tilburnら1995, supra）、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（Maccabeら1996, Molecular Ge
neral Genetics 250: 367-374）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergill
us parasiticus）（Pinero and Keller, 1997, Phytopathology 87: S78)及びペ
ニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）（Suarezら1996, Molec
ular Microbiology 20: 529-540)からクローニングされている。
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（Maccabeら1996, Molecular Ge
neral Genetics 250: 367-374）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergill
us parasiticus）（Pinero and Keller, 1997, Phytopathology 87: S78)及びペ
ニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）（Suarezら1996, Molec
ular Microbiology 20: 529-540)からクローニングされている。
【０００６】 ｐａｃＣpHシグナル変換経路における遺伝子には、アスペルギルス・ニドゥラ
ンスｐａｌＡ（Negrete-Urtasunら1997, Journal of Bacteriology 179: 1832-1
835）；アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＢ遺伝子（Denisonら1995, Journa
l of Biological Chemistry 270: 28519-28522）；アスペルギルス・ニドゥラン
スｐａｌＦ遺伝子（Maccheroniら1997, Gene 194: 163-167)；及びアスペルギル
ス・ニドゥランスｐａｌＩ遺伝子（Arstら1994, 前掲）が開示されている。
ンスｐａｌＡ（Negrete-Urtasunら1997, Journal of Bacteriology 179: 1832-1
835）；アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＢ遺伝子（Denisonら1995, Journa
l of Biological Chemistry 270: 28519-28522）；アスペルギルス・ニドゥラン
スｐａｌＦ遺伝子（Maccheroniら1997, Gene 194: 163-167)；及びアスペルギル
ス・ニドゥランスｐａｌＩ遺伝子（Arstら1994, 前掲）が開示されている。
【０００７】 ｐａｃＣpHシグナル変換突然変異体はCaddickら1986, Molecular General Gen
etics 203: 346:352, 及びArstら1994, Molecular General Genetics 245: 787-
790 により発表されている。
etics 203: 346:352, 及びArstら1994, Molecular General Genetics 245: 787-
790 により発表されている。
【０００８】 注目のタンパク質の産生にとって有害なタンパク質分解活性を抑制又は消失で
きること、特に組換細胞において全体的なタンパク質分解活性を担う各々の遺伝
子を中断又は欠失させることなくそれができることは、現状当業界にはない極め
て魅力的な代替案を供するであろう。
きること、特に組換細胞において全体的なタンパク質分解活性を担う各々の遺伝
子を中断又は欠失させることなくそれができることは、現状当業界にはない極め
て魅力的な代替案を供するであろう。
【０００９】 本発明の課題は真菌細胞においてポリペプチドを生産するための改良された方
法の提供にある。
法の提供にある。
【００１０】 発明の概要 本発明はポリペプチドを生産するための方法に関連し、この方法は（ａ）親真
菌細胞の突然変異体を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、こ
こで当該突然変異細胞はｐａｃＣpHシグナル変換経路の遺伝子の少なくとも一つ
又はその相同体の改変を含んで成る第一核酸配列と、当該ポリペプチドをコード
する第二核酸配列とを含んでなり；そして（ｂ）当該ポリペプチドを当該培養培
地から単離する、ことを含んで成る。
菌細胞の突然変異体を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、こ
こで当該突然変異細胞はｐａｃＣpHシグナル変換経路の遺伝子の少なくとも一つ
又はその相同体の改変を含んで成る第一核酸配列と、当該ポリペプチドをコード
する第二核酸配列とを含んでなり；そして（ｂ）当該ポリペプチドを当該培養培
地から単離する、ことを含んで成る。
【００１１】 発明の詳細な説明 本発明はポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）親真菌細胞の突
然変異体を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、ここで当該突
然変異真菌細胞は当該親細胞とは、ｐａｃＣpHシグナル変換経路の１又は複数の
遺伝子又はその相同体が修飾、例えば中断又は欠失されている関係にあり；そし
て（ｂ）当該ポリペプチドを当該突然変異細胞の培養培地から単離する；ことを
含んで成る。
然変異体を当該ポリペプチドの産生が誘導される条件下で培養し、ここで当該突
然変異真菌細胞は当該親細胞とは、ｐａｃＣpHシグナル変換経路の１又は複数の
遺伝子又はその相同体が修飾、例えば中断又は欠失されている関係にあり；そし
て（ｂ）当該ポリペプチドを当該突然変異細胞の培養培地から単離する；ことを
含んで成る。
【００１２】 「ｐａｃＣpHシグナル変換経路」とは本明細書では微生物の生育環境の周囲pH
を認識し、そしてｐａｌＡ，ｐａｌＢ，ｐａｌＣ，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及びｐａ
ｌＩ等の遺伝子によりコードされる細胞性タンパク質の群を通じてｐａｃＣの活
性転写因子へのタンパク質分解プロセシングを促進する経路と定義する。活性化
ｐａｃＣはアルカリ性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現をオンにし、そして
酸性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現をオフにする。ｐａｌＡ，ｐａｌＢ，
ｐａｌＣ，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及びｐａｌＩ遺伝子の相同体が本発明の方法に包
括されるものと理解されるであろう。
を認識し、そしてｐａｌＡ，ｐａｌＢ，ｐａｌＣ，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及びｐａ
ｌＩ等の遺伝子によりコードされる細胞性タンパク質の群を通じてｐａｃＣの活
性転写因子へのタンパク質分解プロセシングを促進する経路と定義する。活性化
ｐａｃＣはアルカリ性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現をオンにし、そして
酸性条件下での増殖に必要な遺伝子の発現をオフにする。ｐａｌＡ，ｐａｌＢ，
ｐａｌＣ，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及びｐａｌＩ遺伝子の相同体が本発明の方法に包
括されるものと理解されるであろう。
【００１３】 本発明の方法において、ｐａｃＣpHシグナル変換経路に関与する真菌細胞の任
意の遺伝子、例えば限定することなく、糸状菌のｐａｌＡ，ｐａｌＢ，ｐａｌＣ
，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及び／又はｐａｌＩ遺伝子、又は酵母の類似の相同体、例
えばＲｉｍ９ｐ（Denisonら、1998, Molecular Microbiology 30: 259-264)が修
飾されていてよい。好適な態様において、この遺伝子はｐａｌＡ遺伝子である。
別の好適な態様において、この遺伝子はｐａｌＢ遺伝子である。より好適な態様
において、この遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列を有するアスペルギ
ルス・オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｐａｌＡ遺伝子である。別のより好適な態様
において、この遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列を有するアスペルギ
ルス・オリザｐａｌＢ遺伝子である。
意の遺伝子、例えば限定することなく、糸状菌のｐａｌＡ，ｐａｌＢ，ｐａｌＣ
，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及び／又はｐａｌＩ遺伝子、又は酵母の類似の相同体、例
えばＲｉｍ９ｐ（Denisonら、1998, Molecular Microbiology 30: 259-264)が修
飾されていてよい。好適な態様において、この遺伝子はｐａｌＡ遺伝子である。
別の好適な態様において、この遺伝子はｐａｌＢ遺伝子である。より好適な態様
において、この遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列を有するアスペルギ
ルス・オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｐａｌＡ遺伝子である。別のより好適な態様
において、この遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列を有するアスペルギ
ルス・オリザｐａｌＢ遺伝子である。
【００１４】 以下に示す通り、真菌細胞のｐａｃＣpHシグナル変換経路における１又は複数
の遺伝子の修飾は細胞により産生されるタンパク質分解活性の値を下げる。１又
は複数のプロテアーゼがタンパク質分解活性を担うことができうる。この欠陥は
アルカリ性条件下での特異的なプロテアーゼ遺伝子の発現の低下に由来し、なぜ
ならｐａｃＣはｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及びＩ遺伝子によりコードされる遺伝
子産物の群により媒介されるシグナルの不在下によりアルカリ性発現遺伝子の転
写を活性化できないからである。
の遺伝子の修飾は細胞により産生されるタンパク質分解活性の値を下げる。１又
は複数のプロテアーゼがタンパク質分解活性を担うことができうる。この欠陥は
アルカリ性条件下での特異的なプロテアーゼ遺伝子の発現の低下に由来し、なぜ
ならｐａｃＣはｐａｌＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｈ及びＩ遺伝子によりコードされる遺伝
子産物の群により媒介されるシグナルの不在下によりアルカリ性発現遺伝子の転
写を活性化できないからである。
【００１５】 ｐａｃＣpHシグナル変換経路突然変異細胞は当業界周知の方法を利用して１又
は複数の上記の遺伝子の発現を抑制又は消失させることにより構築できうる。例
えば、この遺伝子はコード領域又は活性にとって必須なその一部、又はコード領
域の発現にとって必要な調節機能を改変させることにより修飾又は不活性化され
うる。かかる調節又はコントロール配列の例はプロモーター配列又はその機能性
部分、即ち、核酸配列の発現を及ぼすのに十分な部分でありうる。考えられる修
飾のためのその他のコントロール配列には、限定することなく、リーダー、ポリ
アデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター及び転
写アクチベーターが挙げられる。
は複数の上記の遺伝子の発現を抑制又は消失させることにより構築できうる。例
えば、この遺伝子はコード領域又は活性にとって必須なその一部、又はコード領
域の発現にとって必要な調節機能を改変させることにより修飾又は不活性化され
うる。かかる調節又はコントロール配列の例はプロモーター配列又はその機能性
部分、即ち、核酸配列の発現を及ぼすのに十分な部分でありうる。考えられる修
飾のためのその他のコントロール配列には、限定することなく、リーダー、ポリ
アデニル化配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター及び転
写アクチベーターが挙げられる。
【００１６】 この遺伝子の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にかけ、そして親細
胞の標準の増殖pHとは異なるpHで増殖できる突然変異細胞を選別し、続いてその
突然変異細胞、対、親細胞のタンパク質分解活性を測定することにより行ってよ
い。突然変異誘発（それは特異的なものでもランダムなものでもよい）は、例え
ば適当な物理又は化学突然変異誘発剤の利用により、適当なオリゴヌクレオチド
の利用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ構築突然変異誘発にかけることにより行
うことができうる。更に、突然変異誘発はこのような突然変異誘発剤の任意の組
合せの利用により実施してよい。
胞の標準の増殖pHとは異なるpHで増殖できる突然変異細胞を選別し、続いてその
突然変異細胞、対、親細胞のタンパク質分解活性を測定することにより行ってよ
い。突然変異誘発（それは特異的なものでもランダムなものでもよい）は、例え
ば適当な物理又は化学突然変異誘発剤の利用により、適当なオリゴヌクレオチド
の利用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ構築突然変異誘発にかけることにより行
うことができうる。更に、突然変異誘発はこのような突然変異誘発剤の任意の組
合せの利用により実施してよい。
【００１７】 本目的のために適当な物理又は化学突然変異誘発剤の例には紫外（ＵＶ）線、
ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート
（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる
。
ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート
（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる
。
【００１８】 このような薬剤等を使用した場合、突然変異誘発は典型的には親細胞を選定の
突然変異誘発剤の存在下で適当な条件下において突然変異誘発にかけ、そしてｐ
ａｃＣpHシグナル変換経路の遺伝子の発現の抑制又は消失を示す突然変異細胞の
スクリーニングを行うことにより実施する。
突然変異誘発剤の存在下で適当な条件下において突然変異誘発にかけ、そしてｐ
ａｃＣpHシグナル変換経路の遺伝子の発現の抑制又は消失を示す突然変異細胞の
スクリーニングを行うことにより実施する。
【００１９】 ｐａｃＣpHシグナルにおける１又は複数の遺伝子の修飾又は不活性化は当該遺
伝子又はその転写もしくは翻訳に必要な調節要素内での１又は複数個のヌクレオ
チドの導入、置換又は除去により達成されうる。例えば、停止コドンの導入、開
始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの変化をもたらすようにヌ
クレオチドを挿入又は除去してよい。かかる修飾又は不活性化は当業界公知の方
法に従う部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ構築突然変異誘発により達成されう
る。原理的にはこの修飾はｉｎ ｖｉｖｏで、即ち、修飾すべき遺伝子を発現す
る細胞に対して直接行ってよいが、この修飾は下記に説明する通りｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで実施するのが好ましい。
伝子又はその転写もしくは翻訳に必要な調節要素内での１又は複数個のヌクレオ
チドの導入、置換又は除去により達成されうる。例えば、停止コドンの導入、開
始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの変化をもたらすようにヌ
クレオチドを挿入又は除去してよい。かかる修飾又は不活性化は当業界公知の方
法に従う部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ構築突然変異誘発により達成されう
る。原理的にはこの修飾はｉｎ ｖｉｖｏで、即ち、修飾すべき遺伝子を発現す
る細胞に対して直接行ってよいが、この修飾は下記に説明する通りｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで実施するのが好ましい。
【００２０】 ｐａｃＣpHシグナル変換経路を不活性化する簡単な方法の例は遺伝子置換、遺
伝子欠失又は遺伝子中断の技術を基礎とする。遺伝子中断方法では、注目の内因
性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然
変異誘発にかけて欠陥核酸配列を作り出し、次いでそれを親細胞の中に形質転換
させて欠陥遺伝子を作り出す。相同組換によると、欠陥核酸配列を内因性遺伝子
又は遺伝子フラグメントと置き換える。欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントが、
核酸配列の修飾又は破壊された形質転換体の選択に利用されうるマーカーをもコ
ードするのが所望されうる。
伝子欠失又は遺伝子中断の技術を基礎とする。遺伝子中断方法では、注目の内因
性遺伝子又は遺伝子フラグメントに対応する核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで突然
変異誘発にかけて欠陥核酸配列を作り出し、次いでそれを親細胞の中に形質転換
させて欠陥遺伝子を作り出す。相同組換によると、欠陥核酸配列を内因性遺伝子
又は遺伝子フラグメントと置き換える。欠陥遺伝子又は遺伝子フラグメントが、
核酸配列の修飾又は破壊された形質転換体の選択に利用されうるマーカーをもコ
ードするのが所望されうる。
【００２１】 他方、ｐａｃＣpHシグナル変換経路内の１又は複数の遺伝子の修飾又は不活性
化は、当該遺伝子の核酸配列に対して相補性のヌクレオチド配列を利用する確立
されたアンチセンス技術により実施してよい。より詳しくは、この遺伝子の発現
は、細胞の中で転写され、そして細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズ
することのできる当該遺伝子の核酸配列に対して相補性のヌクレオチド配列の導
入によって抑制又は消失されうる。かくして、相補性アンチセンスヌクレオチド
配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、翻訳されるタンパク質の量
は抑制又は消失する。
化は、当該遺伝子の核酸配列に対して相補性のヌクレオチド配列を利用する確立
されたアンチセンス技術により実施してよい。より詳しくは、この遺伝子の発現
は、細胞の中で転写され、そして細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズ
することのできる当該遺伝子の核酸配列に対して相補性のヌクレオチド配列の導
入によって抑制又は消失されうる。かくして、相補性アンチセンスヌクレオチド
配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、翻訳されるタンパク質の量
は抑制又は消失する。
【００２２】 真菌細胞内のｐａｃＣpHシグナル変換経路に関与する遺伝子の核酸配列に対し
て相補性又は相同性の核酸配列はかかる遺伝子を含む微生物起源から獲得できう
る。アスペルギルス・オリザのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列に対して相補
性又は相同性の核酸配列を有するｐａｌＡ遺伝子の好適な起源はアスペルギルス
・ニドゥランスである。アスペルギルス・オリザのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核
酸配列に対して相補性又は相同性の核酸配列を有するｐａｌＢ遺伝子の好適な起
源はアスペルギルス・ニドゥランスである。
て相補性又は相同性の核酸配列はかかる遺伝子を含む微生物起源から獲得できう
る。アスペルギルス・オリザのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の核酸配列に対して相補
性又は相同性の核酸配列を有するｐａｌＡ遺伝子の好適な起源はアスペルギルス
・ニドゥランスである。アスペルギルス・オリザのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核
酸配列に対して相補性又は相同性の核酸配列を有するｐａｌＢ遺伝子の好適な起
源はアスペルギルス・ニドゥランスである。
【００２３】 選定の真菌細胞の対応の遺伝子の核酸配列に対して相補性又は相同性でありう
るｐａｃＣpHシグナル変換経路におけるその他の遺伝子の好適な糸状菌起源には
、限定することなく、アスペルギルス・ニドゥランス由来のｐａｌＦ遺伝子（Ｍ
ａｃｃｈｅｒｏｎｉら、１９９７，前掲）及びアスペルギルス・ニドゥランス由
来のｐａｌＩ遺伝子（Ａｒｓｔら、１９９４，前掲）が挙げられる。更に、この
核酸配列はその真菌細胞にとって天然のものであってよい。
るｐａｃＣpHシグナル変換経路におけるその他の遺伝子の好適な糸状菌起源には
、限定することなく、アスペルギルス・ニドゥランス由来のｐａｌＦ遺伝子（Ｍ
ａｃｃｈｅｒｏｎｉら、１９９７，前掲）及びアスペルギルス・ニドゥランス由
来のｐａｌＩ遺伝子（Ａｒｓｔら、１９９４，前掲）が挙げられる。更に、この
核酸配列はその真菌細胞にとって天然のものであってよい。
【００２４】 選定の真菌細胞の対応の遺伝子の核酸配列に対して相補性でありうるｐａｃＣ
pHシグナル変換経路における遺伝子の相同体の好適な酵母起源には、限定するこ
となく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）（Ｒｉｍ９ｐ；Ｄｅｎｉｓｏｎら、１９９８、前掲）が挙げら
れる。
pHシグナル変換経路における遺伝子の相同体の好適な酵母起源には、限定するこ
となく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）（Ｒｉｍ９ｐ；Ｄｅｎｉｓｏｎら、１９９８、前掲）が挙げら
れる。
【００２５】 好適な態様において、この突然変異真菌細胞は更にｐａｃＣ遺伝子のコピーを
２以上含んで成る。ｐａｃＣ遺伝子の２以上のコピーはｐａｌ突然変異表現型の
遺伝子外（ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ）抑制を妨げる。遺伝子外サプレッサーはｐａ
ｃＣの切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）であることが示され、それは構成的に
活性なｐａｃＣに結びつく。
２以上含んで成る。ｐａｃＣ遺伝子の２以上のコピーはｐａｌ突然変異表現型の
遺伝子外（ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ）抑制を妨げる。遺伝子外サプレッサーはｐａ
ｃＣの切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）であることが示され、それは構成的に
活性なｐａｃＣに結びつく。
【００２６】 ｐａｃＣ遺伝子は真菌細胞にとって天然でも異種のものであってもよい。糸状
菌由来のｐａｃＣ遺伝子の好適な起源には、限定することなく、アスペルギルス
・ニドゥランス（Ｔｉｌｂｕｒｎら、１９９５、前掲）、アスペルギルス・ニガ
ー（Ｍａｃｃａｂｅら、１９９６、前掲）、アスペルギルス・パラシチカス（Ｐ
ｉｎｅｒｏ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ、１９９７、前掲）及びペニシリウム・クリ
ソゲヌム（Ｓｕａｒｅｚら、１９９６、前掲）が挙げられる。酵母由来のｐａｃ
Ｃ遺伝子相同体の好適な起源には、限定することなく、ヤロウィア・リポリチカ
（Yarrowia lipolytica）（Lambertら、1997, Molecular and Cellular Biology
17: 3966-3976）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Su and Mitchell, 1993,
Nucleic Acids Research 21: 3789-3797)が挙げられる。
菌由来のｐａｃＣ遺伝子の好適な起源には、限定することなく、アスペルギルス
・ニドゥランス（Ｔｉｌｂｕｒｎら、１９９５、前掲）、アスペルギルス・ニガ
ー（Ｍａｃｃａｂｅら、１９９６、前掲）、アスペルギルス・パラシチカス（Ｐ
ｉｎｅｒｏ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ、１９９７、前掲）及びペニシリウム・クリ
ソゲヌム（Ｓｕａｒｅｚら、１９９６、前掲）が挙げられる。酵母由来のｐａｃ
Ｃ遺伝子相同体の好適な起源には、限定することなく、ヤロウィア・リポリチカ
（Yarrowia lipolytica）（Lambertら、1997, Molecular and Cellular Biology
17: 3966-3976）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Su and Mitchell, 1993,
Nucleic Acids Research 21: 3789-3797)が挙げられる。
【００２７】 本発明の方法において、ｐａｃＣpHシグナル変換経路の修飾は１又は複数のプ
ロテアーゼの産生を抑制又は消失させる。
ロテアーゼの産生を抑制又は消失させる。
【００２８】 「１又は複数のプロテアーゼ」とは本明細書では１又は複数種のエキソペプチ
ダーゼ及び／又はエンドペプチダーゼと定義する。エキソペプチダーゼは基質の
アミノ又はカルボキシ末端付近のペプチド結合を切断し、一方エンドペプチダー
ゼは基質の末端から遠方のペプチド結合を切断する（Rao, 1998, Microbiology
and Molecular Biology Reviews 62: 597-635）。エキソペプチダーゼはアミノ
ペプチダーゼでもカルボキシペプチダーゼでもよい。エキソペプチダーゼ又はエ
ンドペプチダーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸
プロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼであってよい(Raoら、1998、前掲；
North, 1982, Microbiology Reviews 46: 308-340; Otto and Schirmeister, 19
97, Chemical Reviews 97: 133-171）。 好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはセリンプロテアーゼで
ある。別の好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはメタロプロテ
アーゼである。別の好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはアス
パラギン酸プロテアーゼである。別の好適な態様において、この１又は複数のプ
ロテアーゼはシステインプロテアーゼである。別の好適な態様において、この１
又は複数のプロテアーゼはアミノペプチダーゼである。別の好適な態様において
、この１又は複数のプロテアーゼはカルボキシペプチダーゼである。別の好適な
態様において、この１又は複数のプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプ
ロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アミノペ
プチダーゼ及び／又はカルボキシペプチダーゼである。
ダーゼ及び／又はエンドペプチダーゼと定義する。エキソペプチダーゼは基質の
アミノ又はカルボキシ末端付近のペプチド結合を切断し、一方エンドペプチダー
ゼは基質の末端から遠方のペプチド結合を切断する（Rao, 1998, Microbiology
and Molecular Biology Reviews 62: 597-635）。エキソペプチダーゼはアミノ
ペプチダーゼでもカルボキシペプチダーゼでもよい。エキソペプチダーゼ又はエ
ンドペプチダーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸
プロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼであってよい(Raoら、1998、前掲；
North, 1982, Microbiology Reviews 46: 308-340; Otto and Schirmeister, 19
97, Chemical Reviews 97: 133-171）。 好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはセリンプロテアーゼで
ある。別の好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはメタロプロテ
アーゼである。別の好適な態様において、この１又は複数のプロテアーゼはアス
パラギン酸プロテアーゼである。別の好適な態様において、この１又は複数のプ
ロテアーゼはシステインプロテアーゼである。別の好適な態様において、この１
又は複数のプロテアーゼはアミノペプチダーゼである。別の好適な態様において
、この１又は複数のプロテアーゼはカルボキシペプチダーゼである。別の好適な
態様において、この１又は複数のプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、メタロプ
ロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アミノペ
プチダーゼ及び／又はカルボキシペプチダーゼである。
【００２９】 このプロテアーゼの活性は当業界周知の任意の方法を利用して決定してよい。
タンパク質分解活性の種類の特定は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ
、アスパラギン酸プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼに特異的な当業界周
知のプロテアーゼインヒビターを利用して決定することもできうる。例えば、No
rth, 1982、前掲；Otto and Schirmeister, 1997、前掲；及びRao ら、1998、前
掲を参照されたい。
タンパク質分解活性の種類の特定は、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ
、アスパラギン酸プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼに特異的な当業界周
知のプロテアーゼインヒビターを利用して決定することもできうる。例えば、No
rth, 1982、前掲；Otto and Schirmeister, 1997、前掲；及びRao ら、1998、前
掲を参照されたい。
【００３０】 本発明の方法において、この突然変異真菌細胞は好ましくは同一の条件下で培
養した対応の親真菌細胞と比較してこの１又は複数のプロテアーゼを少なくとも
約２５％少ない量で、より好ましくは少なくとも約５０％少ない量で、更により
好ましくは少なくとも約７５％少ない量で、そして最も好ましくは少なくとも約
９５％少ない量で産生する。最も好適な態様において、この突然変異細胞は同一
条件下で培養した対応の親真菌細胞と比較して、検出不能なプロテアーゼしか産
生しない。この親及び突然変異細胞は注目のポリペプチドの産生を誘導する条件
下での、又は１又は複数のプロテアーゼの産生を誘導する条件下でのこの１又は
複数のプロテアーゼの産生について比較することができうる。
養した対応の親真菌細胞と比較してこの１又は複数のプロテアーゼを少なくとも
約２５％少ない量で、より好ましくは少なくとも約５０％少ない量で、更により
好ましくは少なくとも約７５％少ない量で、そして最も好ましくは少なくとも約
９５％少ない量で産生する。最も好適な態様において、この突然変異細胞は同一
条件下で培養した対応の親真菌細胞と比較して、検出不能なプロテアーゼしか産
生しない。この親及び突然変異細胞は注目のポリペプチドの産生を誘導する条件
下での、又は１又は複数のプロテアーゼの産生を誘導する条件下でのこの１又は
複数のプロテアーゼの産生について比較することができうる。
【００３１】 本発明の方法において、このポリペプチドは注目の突然変異真菌細胞にとって
天然でも異種でもよい任意のポリペプチドであってよい。
天然でも異種でもよい任意のポリペプチドであってよい。
【００３２】 「ポリペプチド」とは本明細書ではコード産物の特定の長さに関連して言及し
ていなく、それ故ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が包含される。「異
種ポリペプチド」とは本明細書では真菌細胞にとって天然でないポリペプチド、
天然配列を改変することで修飾の施された天然ポリペプチド、又は組換ＤＮＡ技
術によるその真菌細胞の操作の結果として発現が定量的に改変された天然ポリペ
プチドと定義する。例えば、天然ポリペプチドは、例えば当該ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を別のプロモーターのコントロール下に配置して当該ポリペプチ
ドの発現を高める、シグナル配列の利用を介して注目の天然ポリペプチドの細胞
外への輸送を促進する、及び当該細胞により通常産生されるポリペプチドをコー
ドする遺伝子のコピー数を高めることにより組換的に産生されうる。この突然変
異真菌細胞は当該ポリペプチドをコードする核酸配列のコピーを１又は複数含み
うる。
ていなく、それ故ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が包含される。「異
種ポリペプチド」とは本明細書では真菌細胞にとって天然でないポリペプチド、
天然配列を改変することで修飾の施された天然ポリペプチド、又は組換ＤＮＡ技
術によるその真菌細胞の操作の結果として発現が定量的に改変された天然ポリペ
プチドと定義する。例えば、天然ポリペプチドは、例えば当該ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を別のプロモーターのコントロール下に配置して当該ポリペプチ
ドの発現を高める、シグナル配列の利用を介して注目の天然ポリペプチドの細胞
外への輸送を促進する、及び当該細胞により通常産生されるポリペプチドをコー
ドする遺伝子のコピー数を高めることにより組換的に産生されうる。この突然変
異真菌細胞は当該ポリペプチドをコードする核酸配列のコピーを１又は複数含み
うる。
【００３３】 好ましくは、このポリペプチドはホルモンもしくはその変異体、酵素、レセプ
ターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はリポーターである。より好
適な態様において、このポリペプチドはオキシドリダクターゼ、トランスフェラ
ーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。更により好
適な態様において、このポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カル
ボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ
、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリ
ボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシ
ダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ
、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェ
ノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタ
ミナーゼ又はキシラナーゼである。
ターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はリポーターである。より好
適な態様において、このポリペプチドはオキシドリダクターゼ、トランスフェラ
ーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。更により好
適な態様において、このポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カル
ボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ
、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリ
ボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラク
トシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシ
ダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ
、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェ
ノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタ
ミナーゼ又はキシラナーゼである。
【００３４】 真菌細胞において発現されうる注目のポリペプチドをコードする核酸配列は任
意の原核、真核細胞又はその他の起源から獲得できうる。本発明の目的のため、
一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得」とは、そのポリペプチドが
その起源により産生される、又はその起源に由来する遺伝子の挿入された細胞に
より産生されることを意味するであろう。
意の原核、真核細胞又はその他の起源から獲得できうる。本発明の目的のため、
一定の起源との関係で本明細書で用いる「から獲得」とは、そのポリペプチドが
その起源により産生される、又はその起源に由来する遺伝子の挿入された細胞に
より産生されることを意味するであろう。
【００３５】 注目のポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローニングするのに利
用する技術は当業界において公知であり、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤ
ＮＡからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。かかるゲノムＤＮＡからの
核酸配列のクローニングは例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用
することにより行うことができうる。例えば、Innis ら、1990, PCR Protocols
: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York参照のこと
。このクローニング手順は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成
る所望の核酸フラグメントを切除及び単離し、このフラグメントをベクター分子
に挿入し、そしてこの組換ベクターを突然変異細胞の中に組込み、そこでこの核
酸配列の多数のコピー又はクローンを複製させることを包含しうる。この核酸配
列はゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組合せ
であってよい。
用する技術は当業界において公知であり、そしてゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤ
ＮＡからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。かかるゲノムＤＮＡからの
核酸配列のクローニングは例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用
することにより行うことができうる。例えば、Innis ら、1990, PCR Protocols
: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York参照のこと
。このクローニング手順は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成
る所望の核酸フラグメントを切除及び単離し、このフラグメントをベクター分子
に挿入し、そしてこの組換ベクターを突然変異細胞の中に組込み、そこでこの核
酸配列の多数のコピー又はクローンを複製させることを包含しうる。この核酸配
列はゲノム、ｃＤＮＡ，ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組合せ
であってよい。
【００３６】 本発明の方法において、このポリペプチドは融合又はハイブリドポリペプチド
を含んでもよく、それにおいては別のポリペプチドがこのポリペプチド又はその
フラグメントのＮ末端又はＣ末端に融合している。融合ポリペプチドは一のポリ
ペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を別のポリペプチドをコードす
る核酸配列（又はその一部）に融合させることによって作られる。融合ポリペプ
チドを作るための技術は当業界において公知であり、そして例えば複数のポリペ
プチドをコードする複数のコード配列をライゲーションし、それらがイン・フレ
ームとなり、その融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネー
ターのコントロール下となるようにすることを含む。このハイブリドポリペプチ
ドは少なくとも２種類のポリペプチドから獲得した部分又は完全ポリペプチド配
列の組合せを含んで成ってよく、それにおいて１又は複数のポリペプチドはその
突然変異真菌細胞にとって異種のものであってよい。
を含んでもよく、それにおいては別のポリペプチドがこのポリペプチド又はその
フラグメントのＮ末端又はＣ末端に融合している。融合ポリペプチドは一のポリ
ペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を別のポリペプチドをコードす
る核酸配列（又はその一部）に融合させることによって作られる。融合ポリペプ
チドを作るための技術は当業界において公知であり、そして例えば複数のポリペ
プチドをコードする複数のコード配列をライゲーションし、それらがイン・フレ
ームとなり、その融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネー
ターのコントロール下となるようにすることを含む。このハイブリドポリペプチ
ドは少なくとも２種類のポリペプチドから獲得した部分又は完全ポリペプチド配
列の組合せを含んで成ってよく、それにおいて１又は複数のポリペプチドはその
突然変異真菌細胞にとって異種のものであってよい。
【００３７】 注目のポリペプチドをコードする単離された核酸配列は当該ポリペプチドの発
現が供されるよう様々な方法で操作してよい。発現とは、ポリペプチドの生産に
関与する任意の段階、例えば限定することなく、転写、後転写修飾、翻訳、後翻
訳修飾、及び分泌を含むものと理解されるであろう。核酸配列をベクターへの挿
入前に操作することは発現ベクターに依存して所望される又は必要でありうる。
クローニング方法を利用して核酸配列を修飾する技術は当業界において周知であ
る。
現が供されるよう様々な方法で操作してよい。発現とは、ポリペプチドの生産に
関与する任意の段階、例えば限定することなく、転写、後転写修飾、翻訳、後翻
訳修飾、及び分泌を含むものと理解されるであろう。核酸配列をベクターへの挿
入前に操作することは発現ベクターに依存して所望される又は必要でありうる。
クローニング方法を利用して核酸配列を修飾する技術は当業界において周知であ
る。
【００３８】 「核酸構築体」とは本明細書では核酸分子と定義され、一本鎖でも二本鎖でも
よく、天然遺伝子から単離されたものであるか、又は天然にはない状態で組合さ
れて並んだ核酸のセグメントを含むように修飾されたものでよい。核酸構築体は
、その核酸構築体が本発明のコード配列の発現に必要なコントロール配列を全て
含むとき、発現カセットと同義である。「コード配列」とは本明細書ではそのタ
ンパク質生成物のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列と定義する。コード配列
の境界は一般にｍＲＮＡの５′末端にあるオープンリーディングフレームのすぐ
上流に配置されたＡＴＧ開始コドン（真核系）と、ｍＲＮＡの３′末端あるオー
プンリーディングフレームのすぐ下流に配置された転写ターミネーター配列とに
より決定される。コード配列には、限定することなく、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組
換核酸配列が挙げられうる。
よく、天然遺伝子から単離されたものであるか、又は天然にはない状態で組合さ
れて並んだ核酸のセグメントを含むように修飾されたものでよい。核酸構築体は
、その核酸構築体が本発明のコード配列の発現に必要なコントロール配列を全て
含むとき、発現カセットと同義である。「コード配列」とは本明細書ではそのタ
ンパク質生成物のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列と定義する。コード配列
の境界は一般にｍＲＮＡの５′末端にあるオープンリーディングフレームのすぐ
上流に配置されたＡＴＧ開始コドン（真核系）と、ｍＲＮＡの３′末端あるオー
プンリーディングフレームのすぐ下流に配置された転写ターミネーター配列とに
より決定される。コード配列には、限定することなく、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組
換核酸配列が挙げられうる。
【００３９】 「コントロール配列」とは、本明細書では注目のポリペプチドの発現に必要又
は有利な全ての成分を含むように定義する。各コントロール配列は当該ポリペプ
チドをコードする核酸配列にとって天然又は外来のものであってよい。かかるコ
ントロール配列には、限定することなく、リーダー、ポリアデニル化配列、プロ
ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターが挙げられ
る。最低でも、コントロール配列はプロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグ
ナルを含む。コントロール配列には、そのコントロール配列とポリペプチドをコ
ードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特異的な制限部位
を導入する目的でリンカーが施されていてよい。「作用可能式に連結」とは本明
細書ではコントロール配列がＤＮＡ配列のコード配列との関係で適切な位置に配
置され、従ってコントロール配列がポリペプチドの発現を指令できるようになっ
ている形態と定義される。
は有利な全ての成分を含むように定義する。各コントロール配列は当該ポリペプ
チドをコードする核酸配列にとって天然又は外来のものであってよい。かかるコ
ントロール配列には、限定することなく、リーダー、ポリアデニル化配列、プロ
ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターが挙げられ
る。最低でも、コントロール配列はプロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグ
ナルを含む。コントロール配列には、そのコントロール配列とポリペプチドをコ
ードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特異的な制限部位
を導入する目的でリンカーが施されていてよい。「作用可能式に連結」とは本明
細書ではコントロール配列がＤＮＡ配列のコード配列との関係で適切な位置に配
置され、従ってコントロール配列がポリペプチドの発現を指令できるようになっ
ている形態と定義される。
【００４０】 コントロール配列は適当なプロモーター配列、即ちその核酸配列の発現のため
に真菌細胞により認識される核酸配列であってよい。プロモーター配列はポリペ
プチドの発現を媒介する転写コントロール配列を含む。このプロモーターは選定
の真菌細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、例えば突然変異、
切頭型及びハイブリドプロモーターであってよく、そしてこの真菌細胞に対して
同種又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得
できうる。
に真菌細胞により認識される核酸配列であってよい。プロモーター配列はポリペ
プチドの発現を媒介する転写コントロール配列を含む。このプロモーターは選定
の真菌細胞内で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、例えば突然変異、
切頭型及びハイブリドプロモーターであってよく、そしてこの真菌細胞に対して
同種又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得
できうる。
【００４１】 糸状菌細胞内で核酸構築体の転写を指令するのに適当なプロモーターの例には
、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍ
ｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
酸安息アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ又はＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏ
ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅア
ルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン
酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ
、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６
／００７８７）、ＮＡ２−ｔｐｉ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性ア
ルファ−アミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオース三リ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリド）をコー
ドする遺伝子から獲得したプロモーター、並びにそれらの突然変異、切頭型及び
ハイブリドプロモーターである。
、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍ
ｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
酸安息アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ又はＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏ
ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅア
ルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン
酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ
、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６
／００７８７）、ＮＡ２−ｔｐｉ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性ア
ルファ−アミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオース三リ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリド）をコー
ドする遺伝子から獲得したプロモーター、並びにそれらの突然変異、切頭型及び
ハイブリドプロモーターである。
【００４２】 酵母細胞において、有用なプロモーターはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ遺伝子（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）及びＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子から獲得される。酵母細胞のためのその他の有用なプロモーターはＲｏ
ｍａｎｏｓら、１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により発表されてい
る。
ｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ遺伝子（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）及びＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ遺伝子から獲得される。酵母細胞のためのその他の有用なプロモーターはＲｏ
ｍａｎｏｓら、１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により発表されてい
る。
【００４３】 コントロール配列は真菌細胞により認識されて転写を終結する配列である適当
な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列はポリペプチド
をコードする核酸配列の３′末端を作用可能式に連結されている。選定の真菌細
胞において機能的な任意のターミネーターが本発明において利用されうる。
な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列はポリペプチド
をコードする核酸配列の３′末端を作用可能式に連結されている。選定の真菌細
胞において機能的な任意のターミネーターが本発明において利用されうる。
【００４４】 糸状菌細胞の好適なターミネーターはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ
、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシンターゼ、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ及びＦｕｓａｒｉ
ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から獲
得される。
ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ
、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシンターゼ、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ及びＦｕｓａｒｉ
ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から獲
得される。
【００４５】 酵母細胞に好適なターミネーターはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチ
トクロームＣ（ＣＹＣ１）又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から
獲得される。酵母細胞に有用なその他のターミネーターはＲｏｍａｎｏｓら、１
９９２、前掲に記載されている。
ｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチ
トクロームＣ（ＣＹＣ１）又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子から
獲得される。酵母細胞に有用なその他のターミネーターはＲｏｍａｎｏｓら、１
９９２、前掲に記載されている。
【００４６】 コントロール配列は真菌細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域
である適当なリーダー配列であってもよい。リーダー配列はポリペプチドをコー
ドする核酸配列の５′末端に作用可能式に連結される。選定の真菌細胞において
機能的な任意のリーダー配列が本発明において利用されうる。
である適当なリーダー配列であってもよい。リーダー配列はポリペプチドをコー
ドする核酸配列の５′末端に作用可能式に連結される。選定の真菌細胞において
機能的な任意のリーダー配列が本発明において利用されうる。
【００４７】 糸状菌細胞の好適なリーダーはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡ
ＫＡアミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン
酸イソメラーゼをコードする遺伝子から獲得される。
ＫＡアミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン
酸イソメラーゼをコードする遺伝子から獲得される。
【００４８】 酵母細胞のために適当なリーダーはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）をコードする遺伝子から獲得される。
ｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）をコードする遺伝子から獲得される。
【００４９】 コントロール配列はポリアデニル化配列であってもよく、それは核酸配列の３
′末端に作用可能式に連結され、且つ転写されると、真菌細胞によりポリアデノ
シン残基を転写ｍＲＮＡに付加するように認識される配列である。選定の真菌細
胞において機能的な任意のポリアデニル化配列が本発明において利用されうる。
′末端に作用可能式に連結され、且つ転写されると、真菌細胞によりポリアデノ
シン残基を転写ｍＲＮＡに付加するように認識される配列である。選定の真菌細
胞において機能的な任意のポリアデニル化配列が本発明において利用されうる。
【００５０】 糸状菌細胞にとって好適なポリアデニル化配列はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏ
ｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコ
アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシン
ターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ及び
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼをコードする遺
伝子から獲得される。
ｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコ
アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニレートシン
ターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ及び
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼをコードする遺
伝子から獲得される。
【００５１】 酵母細胞にとって有用なポリアデニル化配列はGuo and Sherman, 1995, Molec
ular Cellular Biology, 15: 5983-5990に記載されている。
ular Cellular Biology, 15: 5983-5990に記載されている。
【００５２】 コントロール配列はポリペプチドのアミノ末端に連結されており、且つコード
ポリペプチドを細胞分泌経路へと誘導するアミノ酸配列をコードするシグナルペ
プチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５′末端は、分泌さ
れるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳解読枠内で天然に
連結されたシグナルペプチドコード領域をもとから含んでいることがある。他方
、コード配列の５′末端はそのコード配列にとって外来のものであるシグナルペ
プチドコード領域を含んでよい。この外来シグナルペプチドコード領域はそのコ
ード配列がシグナルペプチドコード領域をそもそも含んでない場合に必要とされ
うる。他方、この外来シグナルペプチドコード領域はポリペプチドの分泌を高め
るため、天然シグナルペプチドコード領域を単に置換してよい。しかしながら、
発現ポリペプチドを選定の真菌細胞の分泌経路へと誘導する任意のシグナルペプ
チドコード領域が本発明において利用されうる。
ポリペプチドを細胞分泌経路へと誘導するアミノ酸配列をコードするシグナルペ
プチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５′末端は、分泌さ
れるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳解読枠内で天然に
連結されたシグナルペプチドコード領域をもとから含んでいることがある。他方
、コード配列の５′末端はそのコード配列にとって外来のものであるシグナルペ
プチドコード領域を含んでよい。この外来シグナルペプチドコード領域はそのコ
ード配列がシグナルペプチドコード領域をそもそも含んでない場合に必要とされ
うる。他方、この外来シグナルペプチドコード領域はポリペプチドの分泌を高め
るため、天然シグナルペプチドコード領域を単に置換してよい。しかしながら、
発現ポリペプチドを選定の真菌細胞の分泌経路へと誘導する任意のシグナルペプ
チドコード領域が本発明において利用されうる。
【００５３】 糸状菌細胞にとって有効なシグナルペプチドコード領域はＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒ
ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃ
ｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ又はＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏ
ｓａリパーゼをコードする遺伝子から獲得したシグナルペプチドコード領域であ
る。
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒ
ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃ
ｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ又はＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏ
ｓａリパーゼをコードする遺伝子から獲得したシグナルペプチドコード領域であ
る。
【００５４】 酵母細胞にとって有用なシグナルペプチドはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子から獲得される。その他の有用なシグナル
ペプチドコード領域はＲｏｍａｎｏｓら、１９９２、前掲に記載されている。
ｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子から獲得される。その他の有用なシグナル
ペプチドコード領域はＲｏｍａｎｏｓら、１９９２、前掲に記載されている。
【００５５】 コントロール配列はポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコー
ドするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドはプロ酵
素又はプロポリペプチド（又は時折りチモゲン）として知られる。プロポリペプ
チドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒
又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドへと変換されうる。このプロペプ
チドコード領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ
−因子遺伝子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナ
ーゼ遺伝子又はＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラッカ
ーゼ遺伝子（ＷＯ９５／３３８３６）から獲得できうる。
ドするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドはプロ酵
素又はプロポリペプチド（又は時折りチモゲン）として知られる。プロポリペプ
チドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒
又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドへと変換されうる。このプロペプ
チドコード領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ
−因子遺伝子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナ
ーゼ遺伝子又はＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラッカ
ーゼ遺伝子（ＷＯ９５／３３８３６）から獲得できうる。
【００５６】 シグナルペプチド及びプロペプチド領域の双方がポリペプチドのアミノ末端に
存在している場合、このプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に配
置され、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に配
置されている。
存在している場合、このプロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に配
置され、そしてシグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に配
置されている。
【００５７】 真菌細胞の増殖との関係でポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を
付加することも所望されうる。調節系の例は、化学又は物理刺激に対応して、例
えば調節化合物の存在下で遺伝子の発現をオンにしたりオフにするものである。
原核細胞系における調節系にはｌａｃ，ｔａｃ及びｔｒｐオペレーター系が含ま
れるであろう。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を利用してよい。糸状菌で
は、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅグルコアミラーゼプロモーターが調節配列として利用されうる。調節配列の
その他の例は遺伝子増幅を可能にするものである。真核系では、これらにはメト
トレキセートの存在下で増幅するジヒドロフォレートリダクターゼ遺伝子、及び
重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。このような場合
、ポリペプチドをコードする核酸配列は調節配列に作用可能式に連結されている
。
付加することも所望されうる。調節系の例は、化学又は物理刺激に対応して、例
えば調節化合物の存在下で遺伝子の発現をオンにしたりオフにするものである。
原核細胞系における調節系にはｌａｃ，ｔａｃ及びｔｒｐオペレーター系が含ま
れるであろう。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を利用してよい。糸状菌で
は、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅグルコアミラーゼプロモーターが調節配列として利用されうる。調節配列の
その他の例は遺伝子増幅を可能にするものである。真核系では、これらにはメト
トレキセートの存在下で増幅するジヒドロフォレートリダクターゼ遺伝子、及び
重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。このような場合
、ポリペプチドをコードする核酸配列は調節配列に作用可能式に連結されている
。
【００５８】 本発明の方法において、注目のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現
を改変する核酸構築体が利用されうる。この構築体は内因性遺伝子の発現を改変
するのに必要な最少数の成分を含みうる。一の態様において、この核酸構築体は
（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン及び（ｄ）スプ
ライスドナー部位を含むのが好ましい。核酸構築体の細胞への導入により、この
構築体は相同組換を介して細胞ゲノムの中に内因性遺伝子部位において挿入され
る。ターゲッティング配列は要素（ａ）〜（ｄ）を内因性遺伝子の中に、要素（
ｂ）〜（ｄ）がその内因性遺伝子に作用可能式に連結されるように組込まれるこ
とを指令する。別の態様において、この核酸構築体は（ａ）ターゲッティング配
列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イ
ントロン及び（ｆ）スプライスアクセプター部位を含み、ここでこのターゲッテ
ィング配列は要素（ａ）〜（ｆ）を、要素（ｂ）〜（ｆ）が内因性遺伝子に作用
可能式に組込まれることを指令する。ところで、これらの構築体は追加の成分、
例えば選択マーカーを含んでよい。
を改変する核酸構築体が利用されうる。この構築体は内因性遺伝子の発現を改変
するのに必要な最少数の成分を含みうる。一の態様において、この核酸構築体は
（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン及び（ｄ）スプ
ライスドナー部位を含むのが好ましい。核酸構築体の細胞への導入により、この
構築体は相同組換を介して細胞ゲノムの中に内因性遺伝子部位において挿入され
る。ターゲッティング配列は要素（ａ）〜（ｄ）を内因性遺伝子の中に、要素（
ｂ）〜（ｄ）がその内因性遺伝子に作用可能式に連結されるように組込まれるこ
とを指令する。別の態様において、この核酸構築体は（ａ）ターゲッティング配
列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イ
ントロン及び（ｆ）スプライスアクセプター部位を含み、ここでこのターゲッテ
ィング配列は要素（ａ）〜（ｆ）を、要素（ｂ）〜（ｆ）が内因性遺伝子に作用
可能式に組込まれることを指令する。ところで、これらの構築体は追加の成分、
例えば選択マーカーを含んでよい。
【００５９】 双方の態様において、これらの成分の導入は内因性遺伝子の発現が改変した新
しい転写ユニットをもたらす。本質的には、この新しい転写ユニットはターゲッ
ティング構築体及び内因性遺伝子により導入された配列の融合産物である。内因
性遺伝子の改変した一の態様では、遺伝子は活性化されている。この態様では、
遺伝子が対応の親細胞内よりも顕著に高いレベルで発現されるよう、調節配列の
挿入を介して親細胞の内因性遺伝子に通常一体化した調節領域を置換、中断又は
破壊するように相同組換が利用される。この活性化遺伝子は当業界周知の方法（
例えば、米国特許第５，６４１，６７０号）を利用し、この構築体の中への増幅
可能な選択マーカーの合体により更に増幅されうる。内因性遺伝子が改変された
別の態様では、遺伝子の発現は抑制されている。
しい転写ユニットをもたらす。本質的には、この新しい転写ユニットはターゲッ
ティング構築体及び内因性遺伝子により導入された配列の融合産物である。内因
性遺伝子の改変した一の態様では、遺伝子は活性化されている。この態様では、
遺伝子が対応の親細胞内よりも顕著に高いレベルで発現されるよう、調節配列の
挿入を介して親細胞の内因性遺伝子に通常一体化した調節領域を置換、中断又は
破壊するように相同組換が利用される。この活性化遺伝子は当業界周知の方法（
例えば、米国特許第５，６４１，６７０号）を利用し、この構築体の中への増幅
可能な選択マーカーの合体により更に増幅されうる。内因性遺伝子が改変された
別の態様では、遺伝子の発現は抑制されている。
【００６０】 ターゲッティング配列は内因性遺伝子の中、その遺伝子のすぐ隣、上流遺伝子
の中、又は内因性遺伝子の上流且つ遠方にあってよい。１又は複数のターゲッテ
ィング配列が利用されうる。例えば、環状のプラスミド又はＤＮＡフラグメント
は好ましくは単独のターゲッティング配列を使用し、線形のプラスミド又はＤＮ
Ａフラグメントは２つのターゲッティング配列を使用する。
の中、又は内因性遺伝子の上流且つ遠方にあってよい。１又は複数のターゲッテ
ィング配列が利用されうる。例えば、環状のプラスミド又はＤＮＡフラグメント
は好ましくは単独のターゲッティング配列を使用し、線形のプラスミド又はＤＮ
Ａフラグメントは２つのターゲッティング配列を使用する。
【００６１】 この構築体の調節配列は１又は複数のプロモーター、エンハンサー、スカフォ
ルドアタッチメント領域又はマトリックスアタッチメント部位、ネガティブ調節
要素、転写結合部位又はこれらの配列の組合せを含んで成ってよい。
ルドアタッチメント領域又はマトリックスアタッチメント部位、ネガティブ調節
要素、転写結合部位又はこれらの配列の組合せを含んで成ってよい。
【００６２】 この構築体は更に内因性遺伝子の１又は複数のエキソンを含む。エキソンとは
ＲＮＡへコピーされて成熟ｍＲＮＡ分子の中に存在しエキソン配列が内因性遺伝
子のコード領域とｉｎ−ｆｒａｍｅとなったＤＮＡ配列と定義する。エキソンは
任意的に、１又は複数のアミノ酸をコードする及び／又はアミノ酸を部分的にコ
ードするＤＮＡを含みうる。他方、エキソンは５′非コード領域に対応するＤＮ
Ａを含む。１又は複数の内因性エキソンが１又は複数のアミノ酸及び／又はアミ
ノ酸の一部をコードする場合、リーディングフレームは内因性遺伝子のコード領
域とイン・フレームであり、従って第二のエキソンに由来するｍＲＮＡの部分の
適当なリーディングフレームはそのままとなっている。
ＲＮＡへコピーされて成熟ｍＲＮＡ分子の中に存在しエキソン配列が内因性遺伝
子のコード領域とｉｎ−ｆｒａｍｅとなったＤＮＡ配列と定義する。エキソンは
任意的に、１又は複数のアミノ酸をコードする及び／又はアミノ酸を部分的にコ
ードするＤＮＡを含みうる。他方、エキソンは５′非コード領域に対応するＤＮ
Ａを含む。１又は複数の内因性エキソンが１又は複数のアミノ酸及び／又はアミ
ノ酸の一部をコードする場合、リーディングフレームは内因性遺伝子のコード領
域とイン・フレームであり、従って第二のエキソンに由来するｍＲＮＡの部分の
適当なリーディングフレームはそのままとなっている。
【００６３】 この構築体のスプライスドナー部位は一のエキソンから別のエキソンへのスプ
ライシングを指令する。典型的には、第一エキソンは第二エキソンの５′側にあ
り、そしてその３′側にある第一エキソンと重なり合って隣接するスプライスド
ナー部位は第二エキソンの５′側において第二エキソンと隣接するスプライスア
クセプター部位を認識する。スプライスアクセプター部位は、スプライスドナー
部位と同様、一のエキソンから別のエキソンへのスプライシングを指令する配列
である。スプライスドナー部位と一緒に作用して、スプライシング装置はスプラ
イスアクセプター部位を利用してイントロンを除去する。
ライシングを指令する。典型的には、第一エキソンは第二エキソンの５′側にあ
り、そしてその３′側にある第一エキソンと重なり合って隣接するスプライスド
ナー部位は第二エキソンの５′側において第二エキソンと隣接するスプライスア
クセプター部位を認識する。スプライスアクセプター部位は、スプライスドナー
部位と同様、一のエキソンから別のエキソンへのスプライシングを指令する配列
である。スプライスドナー部位と一緒に作用して、スプライシング装置はスプラ
イスアクセプター部位を利用してイントロンを除去する。
【００６４】 本発明の別の観点において、突然変異真菌細胞は注目のポリペプチドの産生、
回収及び／又は増幅に有害でありうるタンパク質をコードする１又は複数の第三
核酸配列の修飾を更に含みうる。この修飾は１又は複数の第三核酸配列の発現を
抑制又は消失させ、同一の条件下で培養したときにこの第三の核酸配列の修飾を
有しない突然変異細胞よりも多くのポリペプチドを産生しうる修飾された第三核
酸配列を有する突然変異細胞をもたらす。この第三核酸配列は任意のタンパク質
又は酵素をコードしうる。例えば、この酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ
、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ
ナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオ
キシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グ
ルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタ
ナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポ
リフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランス
グルタミナーゼ又はキシラナーゼであってよい。
回収及び／又は増幅に有害でありうるタンパク質をコードする１又は複数の第三
核酸配列の修飾を更に含みうる。この修飾は１又は複数の第三核酸配列の発現を
抑制又は消失させ、同一の条件下で培養したときにこの第三の核酸配列の修飾を
有しない突然変異細胞よりも多くのポリペプチドを産生しうる修飾された第三核
酸配列を有する突然変異細胞をもたらす。この第三核酸配列は任意のタンパク質
又は酵素をコードしうる。例えば、この酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ
、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチ
ナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオ
キシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−
ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グ
ルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタ
ナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポ
リフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランス
グルタミナーゼ又はキシラナーゼであってよい。
【００６５】 上記の様々な核酸及びコントロール配列を一緒に結合させ、１又は複数の好都
合な制限部位をその部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換
が行われるよう含みうる組換発現ベクターを作り上げることができうる。他方、
ポリペプチドをコードする核酸配列は、当該配列又はそれを含んで成る核酸構築
体を発現のために適当なベクターの中に挿入することにより発現されうる。発現
ベクターの作製において、コード配列が発現、そして可能としては分泌のために
適当なコントロール配列と作用可能式に連結されるようにそのコード配列をベク
ターの中に配置する。
合な制限部位をその部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換
が行われるよう含みうる組換発現ベクターを作り上げることができうる。他方、
ポリペプチドをコードする核酸配列は、当該配列又はそれを含んで成る核酸構築
体を発現のために適当なベクターの中に挿入することにより発現されうる。発現
ベクターの作製において、コード配列が発現、そして可能としては分泌のために
適当なコントロール配列と作用可能式に連結されるようにそのコード配列をベク
ターの中に配置する。
【００６６】 この組換発現ベクターは、組換ＤＮＡ手順に簡便にかけ、ポリペプチドをコー
ドする核酸配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えばプラスミ
ド又はウィルス）であってよい。ベクターの選定は一般にベクターとそれ導入す
る真菌細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは線形又は閉環プラスミド
であってよい。このベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外質に存在し、
その複製が染色体の複製と独立したベクター、例えばプラスミド、染色体外要素
、ミニクロモソーム又は人工染色体であってよい。このベクターは自己複製を確
実にする任意の手段を含んでよい。他方、このベクターは真菌細胞に導入される
とゲノムに組込まれ、その組込まれた染色体と一緒に複製するものであってよい
。このベクター系は単独のベクターもしくはプラスミド、又は真菌細胞のゲノム
の中に導入すべき全ＤＮＡを一緒になって含む２以上のベクターもしくはプラス
ミド、又はトランスポゾンであってよい。
ドする核酸配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えばプラスミ
ド又はウィルス）であってよい。ベクターの選定は一般にベクターとそれ導入す
る真菌細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは線形又は閉環プラスミド
であってよい。このベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外質に存在し、
その複製が染色体の複製と独立したベクター、例えばプラスミド、染色体外要素
、ミニクロモソーム又は人工染色体であってよい。このベクターは自己複製を確
実にする任意の手段を含んでよい。他方、このベクターは真菌細胞に導入される
とゲノムに組込まれ、その組込まれた染色体と一緒に複製するものであってよい
。このベクター系は単独のベクターもしくはプラスミド、又は真菌細胞のゲノム
の中に導入すべき全ＤＮＡを一緒になって含む２以上のベクターもしくはプラス
ミド、又はトランスポゾンであってよい。
【００６７】 ベクターは好ましくは形質転換細胞の選別をし易くする１又は複数の選択マー
カーを含む。選択マーカーは遺伝子であって、その生成物が殺生物剤、又はウィ
ルス耐性、重金属耐性、従属栄養性から自己栄養性への変化、等を担う遺伝子で
ある。酵母細胞のために適当なマーカーはＡＤＥ２，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹ
Ｓ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。糸状菌細胞における利用に適当
な選択マーカーには、限定することなく、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒ
ｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリ
シンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランス
フェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートリダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オルチジン−
５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）
及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、並びにそれらの均等物が挙げら
れる。糸状菌細胞において利用するのに好適なのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ及びｐｙ
ｒＧ遺伝子、並びにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの
ｂａｒ遺伝子である。
カーを含む。選択マーカーは遺伝子であって、その生成物が殺生物剤、又はウィ
ルス耐性、重金属耐性、従属栄養性から自己栄養性への変化、等を担う遺伝子で
ある。酵母細胞のために適当なマーカーはＡＤＥ２，ＨＩＳ３，ＬＥＵ２，ＬＹ
Ｓ２，ＭＥＴ３，ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。糸状菌細胞における利用に適当
な選択マーカーには、限定することなく、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒ
ｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリ
シンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランス
フェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートリダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オルチジン−
５′−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）
及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、並びにそれらの均等物が挙げら
れる。糸状菌細胞において利用するのに好適なのはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｄｕｌａｎｓ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ及びｐｙ
ｒＧ遺伝子、並びにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの
ｂａｒ遺伝子である。
【００６８】 これらのベクターは好ましくは、ベクターの細胞ゲノムへの安定的な組込み又
はゲノムとは独立したゲノムの細胞内での自己複製を可能にする要素を含む。
はゲノムとは独立したゲノムの細胞内での自己複製を可能にする要素を含む。
【００６９】 「導入」とは、注目のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るベクタ
ーを細胞の中に導入し、そのベクターが染色体一体化物として又は自己複製染色
体外ベクターとして維持されるようにすることを意味する。組込みは一般には核
酸配列が細胞の中で安定に維持されがちであるため、有利と考えられている。ベ
クターの染色体への組込みは相同組換、非相同組換、又はトランスポゾンによる
。
ーを細胞の中に導入し、そのベクターが染色体一体化物として又は自己複製染色
体外ベクターとして維持されるようにすることを意味する。組込みは一般には核
酸配列が細胞の中で安定に維持されがちであるため、有利と考えられている。ベ
クターの染色体への組込みは相同組換、非相同組換、又はトランスポゾンによる
。
【００７０】 発現ベクターの真菌細胞への導入は周知の方法に従うプロトプラスト形成、プ
ロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生から成る工程を包含しうる。アスペ
ルギルス細胞の形質転換に適当な手順はＥＰ２３８０２３及びＹｅｌｔｏｎら、
1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474
に記載されている。フサリウム種を形質転換させるのに適当な方法はＭａｌａｒ
ｄｉｅｒら、１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６及びＷＯ９６／００７
８７に記載されている。酵母はBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Si
mon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Metho
ds in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press, Inc., New York;
Itoら1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnenら1978, Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences USA 75: 1920に記載の手順を利用し
て形質転換してよい。
ロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生から成る工程を包含しうる。アスペ
ルギルス細胞の形質転換に適当な手順はＥＰ２３８０２３及びＹｅｌｔｏｎら、
1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474
に記載されている。フサリウム種を形質転換させるのに適当な方法はＭａｌａｒ
ｄｉｅｒら、１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６及びＷＯ９６／００７
８７に記載されている。酵母はBecker and Guarente, In Abelson, J.N. and Si
mon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Metho
ds in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press, Inc., New York;
Itoら1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnenら1978, Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences USA 75: 1920に記載の手順を利用し
て形質転換してよい。
【００７１】 細胞のゲノムへの組込みのため、このベクターは当該ポリペプチドをコードす
る核酸配列又は当該ベクターの相同性もしくは非相同性組換によるゲノムへの安
定的な組込みのための任意のその他の要素を頼りとしうる。他方、このベクター
は細胞のゲノムへの相同性組換による組込みを指令するための追加の核酸配列を
含みうる。この追加の核酸配列はベクターが染色体内の正確な位置においてゲノ
ムの中に組込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの傾向を高めるた
め、この組込み要素は相同性組換の確率を高めるよう対応の標的配列と高度に相
同性な十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜
１，５００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべき
ことが好ましい。組込み要素は細胞のゲノム内の標的配列と相同性な任意の配列
であってよい。更に、この組込み要素は非コード又はコード核酸配列であってよ
い。他方、このベクターは非相同性組換により細胞のゲノムの中に組込まれてよ
い。
る核酸配列又は当該ベクターの相同性もしくは非相同性組換によるゲノムへの安
定的な組込みのための任意のその他の要素を頼りとしうる。他方、このベクター
は細胞のゲノムへの相同性組換による組込みを指令するための追加の核酸配列を
含みうる。この追加の核酸配列はベクターが染色体内の正確な位置においてゲノ
ムの中に組込まれることを可能にする。正確な位置での組込みの傾向を高めるた
め、この組込み要素は相同性組換の確率を高めるよう対応の標的配列と高度に相
同性な十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜
１，５００塩基対、そして最も好ましくは８００〜１，５００塩基対を含むべき
ことが好ましい。組込み要素は細胞のゲノム内の標的配列と相同性な任意の配列
であってよい。更に、この組込み要素は非コード又はコード核酸配列であってよ
い。他方、このベクターは非相同性組換により細胞のゲノムの中に組込まれてよ
い。
【００７２】 自己複製の場合、このベクターは更に注目の細胞が自己複製できるようにする
複製起点を含んで成ってよい。酵母細胞において利用するための複製起点の例は
２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１，ＡＲＳ４，ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及
びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。複製起点は真菌細胞内で温度感受性で
機能するようにする突然変異を有するものであってよい（例えば、Ehrlich, 197
8, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433)。
複製起点を含んで成ってよい。酵母細胞において利用するための複製起点の例は
２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１，ＡＲＳ４，ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及
びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。複製起点は真菌細胞内で温度感受性で
機能するようにする突然変異を有するものであってよい（例えば、Ehrlich, 197
8, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433)。
【００７３】 本発明の方法は突然変異真菌細胞を獲得するための特定の順序に限定されるも
のではないであろう。ｐａｃＣpHシグナル変換経路に関与する遺伝子の修飾はポ
リペプチドの生産のための細胞の構築における任意の段階において親細胞に導入
してよい。この真菌突然変異細胞のｐａｃＣpHシグナル変換経路内の遺伝子は、
ポリペプチドをコードする遺伝子の導入の前に本発明の方法を利用して既に修飾
されていることが好ましい。
のではないであろう。ｐａｃＣpHシグナル変換経路に関与する遺伝子の修飾はポ
リペプチドの生産のための細胞の構築における任意の段階において親細胞に導入
してよい。この真菌突然変異細胞のｐａｃＣpHシグナル変換経路内の遺伝子は、
ポリペプチドをコードする遺伝子の導入の前に本発明の方法を利用して既に修飾
されていることが好ましい。
【００７４】 組換発現ベクターを構築するために本明細書に記載の要素をライゲーションす
るのに利用する手順は当業者に周知である（例えば、J. Sambrook, Ef. Fritsch
, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版
、Cold Spring Harbor, New York）。
るのに利用する手順は当業者に周知である（例えば、J. Sambrook, Ef. Fritsch
, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版
、Cold Spring Harbor, New York）。
【００７５】 本発明の方法において、真菌細胞は野生型細胞又はその突然変異体であってよ
い。
い。
【００７６】 本明細書において用いている「真菌」とは、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ
）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉ
ｏｍｙｃａｔａ）及び接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の門（Hawksworthら、
In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 第８版、1995, CAB Int
ernational, University Press, Cambridge, UKにより定義）、並びに卵菌類（
Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲、第１７１頁記
載）及び全てのｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５
、前掲）が含まれる。
）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉ
ｏｍｙｃａｔａ）及び接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の門（Hawksworthら、
In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 第８版、1995, CAB Int
ernational, University Press, Cambridge, UKにより定義）、並びに卵菌類（
Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲、第１７１頁記
載）及び全てのｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５
、前掲）が含まれる。
【００７７】 より好適な態様において、真菌細胞は酵母細胞である。本明細書で用いる「酵
母」には、ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ酵母（エンドミケス目）、ｂａｓｉ
ｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ酵母及び不完全菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来変わりうるため、本発明の目的
の場合、酵母はBiology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S
.M. 及びDavenport, R.R. 編、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.9,
1980）の記載の通りに定義されるべきである。
母」には、ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ酵母（エンドミケス目）、ｂａｓｉ
ｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ酵母及び不完全菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来変わりうるため、本発明の目的
の場合、酵母はBiology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S
.M. 及びDavenport, R.R. 編、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.9,
1980）の記載の通りに定義されるべきである。
【００７８】 より好適な態様において、酵母細胞はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌ
ラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ
）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤ
ロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
ラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ
）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤ
ロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００７９】 最も好適な態様において、酵母細胞はサッカロマイセス・カールスベルゲニス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマ
イセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、
サッカロマイセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔ
ａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ダグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビフォルミ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も
好適な態様において、酵母細胞はクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において、酵
母細胞はヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
細胞である。
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマ
イセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、
サッカロマイセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔ
ａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ダグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビフォルミ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も
好適な態様において、酵母細胞はクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好適な態様において、酵
母細胞はヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
細胞である。
【００８０】 別の好適な態様において、真菌細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」にはＥｕ
ｍｙｃｏｔａ及びＯｏｍｙｃｏｔａ（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲
により定義）の亜門の全ての糸状菌形態が含まれる。糸状菌はキチン、セルロー
ス、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複雑な多糖類から成る菌糸体壁
を特徴とする。植物性増殖は分節伸長によるものであり、そして炭素異化は絶対
的に好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエの如き酵母による
植物性増殖は単細胞葉状体の出芽により、そして炭素異化は発酵性でありうる。
ｍｙｃｏｔａ及びＯｏｍｙｃｏｔａ（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、１９９５、前掲
により定義）の亜門の全ての糸状菌形態が含まれる。糸状菌はキチン、セルロー
ス、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複雑な多糖類から成る菌糸体壁
を特徴とする。植物性増殖は分節伸長によるものであり、そして炭素異化は絶対
的に好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエの如き酵母による
植物性増殖は単細胞葉状体の出芽により、そして炭素異化は発酵性でありうる。
【００８１】 より好適な態様において、糸状菌細胞はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕ
ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、
フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）、ジッベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒュミコウ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）
、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、マイセ
リオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈ
ｅｃｉｕｍ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニュ
ーロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙ
ｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス
（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シ
エラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉ
ｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。
ｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕ
ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、
フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）、ジッベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒュミコウ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）
、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、マイセ
リオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈ
ｅｃｉｕｍ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニュ
ーロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙ
ｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏ
ｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス
（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シ
エラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉ
ｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である。
【００８２】 最も好適な態様において、糸状菌細胞はアスペルギルス・アキュレアタス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞である。 別の最も好適な態様において、糸状菌細胞はフサリウム・バクトリジオイデス
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・クルックウ
ェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｃｅｒｅａｌｉｓと同義）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉ
ｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐ
ｏｒｕｍ）、フサリウム・ネガンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フ
サリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリ
ウム・レチキュラトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサ
リウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムビキ
ヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウ
ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロスム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）又はフサリウム・ベネナトウ
ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である。
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞である。 別の最も好適な態様において、糸状菌細胞はフサリウム・バクトリジオイデス
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・クルックウ
ェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｃｅｒｅａｌｉｓと同義）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉ
ｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐ
ｏｒｕｍ）、フサリウム・ネガンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フ
サリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリ
ウム・レチキュラトウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサ
リウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムビキ
ヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウ
ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕ
ｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロスム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）又はフサリウム・ベネナトウ
ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である。
【００８３】 フサリウム・ベネナトウム細胞は最も好ましくはフサリウム・ベネナトウムＡ
３／５（当初Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ＡＴＣＣ２０３３４
として寄託され、最近Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Bi
ology 23: 62-80 及びO'Donnellら1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-
67によりフサリウム・ベネナトウムとして再分類されている）、並びに現在知ら
れている種名とは関係なくフサリウム・ベネナトウムの分類学的同等物である。
別の好適な態様において、フサリウム・ベネナトウム細胞はＷＯ９７／２６３３
０に開示の通り、フサリウム・ベネナトウムＡ３／５又はフサリウム・ベネナト
ウムＡＴＣＣ２０３３４の形態学的突然変異体である。
３／５（当初Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ＡＴＣＣ２０３３４
として寄託され、最近Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Bi
ology 23: 62-80 及びO'Donnellら1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-
67によりフサリウム・ベネナトウムとして再分類されている）、並びに現在知ら
れている種名とは関係なくフサリウム・ベネナトウムの分類学的同等物である。
別の好適な態様において、フサリウム・ベネナトウム細胞はＷＯ９７／２６３３
０に開示の通り、フサリウム・ベネナトウムＡ３／５又はフサリウム・ベネナト
ウムＡＴＣＣ２０３３４の形態学的突然変異体である。
【００８４】 別の最も好適な態様において、糸状菌細胞はジッベレラ・プリカリス（Ｇｉｂ
ｂｅｒｅｌｌａ ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ジッベレラ・ゼア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌａ ｚｅａｅ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌ
ｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ
）、ムコーム・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフソラ・サ
ーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、マイ
ロセシウム・ロリジン（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｉｎ）、ニューロ
スポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）又はペニシリウム・
パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）細胞で
ある。 別の最も好適な態様において、糸状菌細胞はトリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラチアト
ウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデ
ルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・
ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
ｂｅｒｅｌｌａ ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ジッベレラ・ゼア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌａ ｚｅａｅ）、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌ
ｅｎｓ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ
）、ムコーム・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフソラ・サ
ーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、マイ
ロセシウム・ロリジン（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｒｉｄｉｎ）、ニューロ
スポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）又はペニシリウム・
パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）細胞で
ある。 別の最も好適な態様において、糸状菌細胞はトリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔ
ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラチアト
ウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデ
ルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・
ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【００８５】 本発明の方法において、突然変異真菌細胞は注目のポリペプチドの生産のため
に適当な栄養培地の中で、当業界公知の方法を利用して培養する。例えば、細胞
を振盪フラスコ培養、小スケール又は大スケール発酵（連続式、バッチ式、供給
バッチ式、又は固状発酵等）により、適当な培地中、且つポリペプチドの発現及
び／又は単離が可能な条件下で実験又は工業用発酵槽の中で実施することにより
培養することができる。培養は炭素及び窒素源並びに無機塩を含んで成る適当な
栄養培地の中で、当業界公知の手順を利用して実施する。適当な培地は商業的供
給者から入手するものであるか、又は公開された処方に従って調製されたもので
あってよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎのカタログ）。分泌したポリペプチドは培地から直接回収できうる
。
に適当な栄養培地の中で、当業界公知の方法を利用して培養する。例えば、細胞
を振盪フラスコ培養、小スケール又は大スケール発酵（連続式、バッチ式、供給
バッチ式、又は固状発酵等）により、適当な培地中、且つポリペプチドの発現及
び／又は単離が可能な条件下で実験又は工業用発酵槽の中で実施することにより
培養することができる。培養は炭素及び窒素源並びに無機塩を含んで成る適当な
栄養培地の中で、当業界公知の手順を利用して実施する。適当な培地は商業的供
給者から入手するものであるか、又は公開された処方に従って調製されたもので
あってよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎのカタログ）。分泌したポリペプチドは培地から直接回収できうる
。
【００８６】 ポリペプチドはそれに特異的な当業界に公知の方法を利用して検出できうる。
これらの検出方法には、特異的抗体の利用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失
、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられうる。例えば、酵素アッセイはポリペプチド
の活性の測定のために利用されうる。酵素活性を測定するための手順は多くの酵
素について当業界において公知である。
これらの検出方法には、特異的抗体の利用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失
、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられうる。例えば、酵素アッセイはポリペプチド
の活性の測定のために利用されうる。酵素活性を測定するための手順は多くの酵
素について当業界において公知である。
【００８７】 得られるポリペプチドは当業界公知の方法により単離できうる。例えば、ポリ
ペプチドは栄養培地から慣用の手順、例えば限定することなく、遠心分離、濾過
、抽出、スプレー乾燥、エバポレーション又は沈殿により単離できうる。この単
離されたポリペプチドは次に当業界公知の様々な手順、例えば限定することなく
、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマト
フォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（調製等電点電気泳動）、示
差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出により更に精製されうる
（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden、編、VCH Pub
lishers, New York, 1989 を参照のこと）。
ペプチドは栄養培地から慣用の手順、例えば限定することなく、遠心分離、濾過
、抽出、スプレー乾燥、エバポレーション又は沈殿により単離できうる。この単
離されたポリペプチドは次に当業界公知の様々な手順、例えば限定することなく
、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマト
フォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（調製等電点電気泳動）、示
差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出により更に精製されうる
（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden、編、VCH Pub
lishers, New York, 1989 を参照のこと）。
【００８８】 本発明を以下の限定でない実施例により更に説明する。 実施例 材料 バッファー及び基質として使用した化学品は少なくとも試薬級の商品とした。
【００８９】 培地及び溶液 ＰＤＡプレートは３９ｇ／ＬのPotato Dextrose Agar (Difco）を含み、そし
てｐｙｒＧ栄養要求体のために１０mMのウリジンを付加した。
てｐｙｒＧ栄養要求体のために１０mMのウリジンを付加した。
【００９０】 ＭＹ２５培地はpH６．５で１リットル当り２５ｇのマルトース、２．０ｇのＭ
ｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの酵
母エキス、２．０ｇのＫ2 ＳＯ4 、２．０ｇの尿素及び０．５mlの微量金属溶液
から成る。ＭＹ２５振盪フラスコ培地はマイクロタイター増殖実験で使用するた
め、ガラス蒸留水で１：１００又は１：１０００に希釈した（ＭＹ２５／１００
又はＭＹ２５／１０００）。培養物は３４℃で増殖させた。
ｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、２．０ｇのクエン酸、１０ｇの酵
母エキス、２．０ｇのＫ2 ＳＯ4 、２．０ｇの尿素及び０．５mlの微量金属溶液
から成る。ＭＹ２５振盪フラスコ培地はマイクロタイター増殖実験で使用するた
め、ガラス蒸留水で１：１００又は１：１０００に希釈した（ＭＹ２５／１００
又はＭＹ２５／１０００）。培養物は３４℃で増殖させた。
【００９１】 ２×ＭＹ塩pH６．５溶液は１リットル当り４ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４ｇ
のＫ2 ＳＯ4 、２０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、４ｇのクエン酸、１mlの微量金属及び２
mlのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏから成る（１００ｇ／Ｌストック溶液）。
のＫ2 ＳＯ4 、２０ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、４ｇのクエン酸、１mlの微量金属及び２
mlのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏから成る（１００ｇ／Ｌストック溶液）。
【００９２】 最少培地形質転換プレートは１リットル当り６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇの
ＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量金属溶液、１ｇのグルコース、
５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３４２．３ｇのスクロース及び２０ｇのＮｏ
ｂｌｅアガーから成る（pH６．５）。最少培地トランスファープレート（pH６．
５）は１リットル当り６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫ
Ｈ2 ＰＯ4 、１mlの微量元素、１０ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ及び２０ｇのＮｏｂｌｅアガーから成る。
ＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ2 ＰＯ4 、１mlの微量金属溶液、１ｇのグルコース、
５００mgのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３４２．３ｇのスクロース及び２０ｇのＮｏ
ｂｌｅアガーから成る（pH６．５）。最少培地トランスファープレート（pH６．
５）は１リットル当り６ｇのＮａＮＯ3 、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫ
Ｈ2 ＰＯ4 、１mlの微量元素、１０ｇのグルコース、５００mgのＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ及び２０ｇのＮｏｂｌｅアガーから成る。
【００９３】 微量金属溶液（１０００×）は１リットル当り２２ｇのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
、１１ｇのＨ3 ＢＯ3 、５ｇのＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、５ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ 2 Ｏ、１．６ｇのＣｏＣｌ2 ・５Ｈ2 Ｏ、１．６ｇの（ＮＨ4 ）6 ＭＯ7 Ｏ24及
び５０ｇのＮａ4 ＥＤＴＡから成る。
、１１ｇのＨ3 ＢＯ3 、５ｇのＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、５ｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ 2 Ｏ、１．６ｇのＣｏＣｌ2 ・５Ｈ2 Ｏ、１．６ｇの（ＮＨ4 ）6 ＭＯ7 Ｏ24及
び５０ｇのＮａ4 ＥＤＴＡから成る。
【００９４】 ＣＯＶＥプレートは１リットル当り３４３．３ｇのスクロース、２０mlのＣＯ
ＶＥ塩溶液、１０mlの１Ｍのアセトアミド、１０mlの３ＭのＣｓＣｌ及び２５ｇ
のＮｏｂｅｌアガーから成る。ＣＯＶＥ塩（５０×）溶液は２６ｇのＫＣｌ、２
６ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、７６ｇのＫＨ2 ＰＯ4 及び５０mlのＣＯＶＥ微量
金属溶液から成る。ＣＯＶＥ微量金属溶液は（１リットル当り）、０．０４ｇの
ＮａＢ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．０４ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．７０ｇの
ＦｅＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８０ｇのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ及び１０ｇのＺｎ
ＳＯ4 から成る。
ＶＥ塩溶液、１０mlの１Ｍのアセトアミド、１０mlの３ＭのＣｓＣｌ及び２５ｇ
のＮｏｂｅｌアガーから成る。ＣＯＶＥ塩（５０×）溶液は２６ｇのＫＣｌ、２
６ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、７６ｇのＫＨ2 ＰＯ4 及び５０mlのＣＯＶＥ微量
金属溶液から成る。ＣＯＶＥ微量金属溶液は（１リットル当り）、０．０４ｇの
ＮａＢ4 Ｏ7 ・１０Ｈ2 Ｏ、０．０４ｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．７０ｇの
ＦｅＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、０．８０ｇのＮａ2 ＭｏＯ2 ・２Ｈ2 Ｏ及び１０ｇのＺｎ
ＳＯ4 から成る。
【００９５】 ＮＺＹプレートは１リットル当り５ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮＺアミン及び１５ｇのＢａｃｔｏアガーから
成る。
Ｏ、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮＺアミン及び１５ｇのＢａｃｔｏアガーから
成る。
【００９６】 ＹＥＧ培地は１リットル当り５ｇの酵母エキス及び２０ｇのデキストロースか
ら成る。
ら成る。
【００９７】 ＳＴＣは１．２Ｍのソルビトール−１０mMのＣａＣｌ2 −１０mMのＴｒｉｓ
pH７．５から成る。
pH７．５から成る。
【００９８】 ＳＭバッファーは１リットル当り５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ、５０mlの１Ｍのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び５mlの２％のゼラチンか
ら成る。
Ｈ2 Ｏ、５０mlの１Ｍのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び５mlの２％のゼラチンか
ら成る。
【００９９】 実施例１：ｐＤＳＹ８２によるアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０の形質転
換 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０はＷＯ９８／１１２０３に記載の通り
にして構築した。 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０のプロトプラストを下記のプロトコー
ルに従って調製した。アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０を１００mlの１％
の酵母エキス−２％のペプトン−１％のグルコースの中で３２℃で１６〜１８時
間、１５０rpm で振盪させながら増殖させた。その菌糸体を０．４５mmのフィル
ターを介し、フィルター上に約１０ml残るまで濾過することにより回収し、２５
mlの１．０〜１．２ＭのＭｇＳＯ4 −１０mMのリン酸ナトリウムpH６．５で洗浄
し、前述の通りに濾過し、再び１０ml残るまで洗い、次いで１０mlの５mg／mlの
ＮＯＶＯＺＹＭ ２３４TM（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）、１．２
ＭのＭｇＳＯ4 −１０mMのリン酸ナトリウムpH６．５（０．４５mm濾過）の中で
、１２５mlのエーレンマイヤーフラスコ内で再懸濁させた。その懸濁物を３７℃
で約１時間５０rpm で静かに撹拌しながらインキュベーションしてプロトプラス
トを作製した。１０mlの容量のプロトプラスト／菌糸体調製品を３０mlのＣｏｒ
ｅｘ遠沈管に入れ、５mlの０．６Ｍのソルビトール−１０mMのトリス−ＨＣｌ
pH７．５をかぶせ、そしてスインギングバケットローターで３６００×ｇで１５
分遠心分離してプロトプラストを回収した。このプロトプラストをバッファー界
面からパスツールピペットを用いて回収した。このプロトプラストを５容量のＳ
ＴＣで洗い、遠心分離し、そして前述の通りに再洗浄して遠心分離にかけた。こ
のプロトプラストをＳＴＣの中に２×１０7 プロトプラスト／mlの最終濃度とな
るように再懸濁した。
換 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０はＷＯ９８／１１２０３に記載の通り
にして構築した。 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０のプロトプラストを下記のプロトコー
ルに従って調製した。アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０を１００mlの１％
の酵母エキス−２％のペプトン−１％のグルコースの中で３２℃で１６〜１８時
間、１５０rpm で振盪させながら増殖させた。その菌糸体を０．４５mmのフィル
ターを介し、フィルター上に約１０ml残るまで濾過することにより回収し、２５
mlの１．０〜１．２ＭのＭｇＳＯ4 −１０mMのリン酸ナトリウムpH６．５で洗浄
し、前述の通りに濾過し、再び１０ml残るまで洗い、次いで１０mlの５mg／mlの
ＮＯＶＯＺＹＭ ２３４TM（Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark）、１．２
ＭのＭｇＳＯ4 −１０mMのリン酸ナトリウムpH６．５（０．４５mm濾過）の中で
、１２５mlのエーレンマイヤーフラスコ内で再懸濁させた。その懸濁物を３７℃
で約１時間５０rpm で静かに撹拌しながらインキュベーションしてプロトプラス
トを作製した。１０mlの容量のプロトプラスト／菌糸体調製品を３０mlのＣｏｒ
ｅｘ遠沈管に入れ、５mlの０．６Ｍのソルビトール−１０mMのトリス−ＨＣｌ
pH７．５をかぶせ、そしてスインギングバケットローターで３６００×ｇで１５
分遠心分離してプロトプラストを回収した。このプロトプラストをバッファー界
面からパスツールピペットを用いて回収した。このプロトプラストを５容量のＳ
ＴＣで洗い、遠心分離し、そして前述の通りに再洗浄して遠心分離にかけた。こ
のプロトプラストをＳＴＣの中に２×１０7 プロトプラスト／mlの最終濃度とな
るように再懸濁した。
【０１００】 １５ＵのＢａｍＨＩで線形にしたｐＤＳＹ８２（ＷＯ９８／１１２０３）の５
〜１５μｌのアリコートを１４mlのＦａｌｃｏｎポリプロピレンチューブ内の０
．１mlのプロトプラストに２×１０7 プロトプラスト／mlの濃度で添加し、次い
で２５０μｌの６０％のＰＥＧ４０００−１０mMのＣａＣｌ2 −１０mMのトリス
−ＨＣｌ、pH７を加え、静かに混合し、そして３７℃で３０分インキュベーショ
ンした。この懸濁物を１２mlの溶融上層アガー（１×ＣＯＶＥ塩、１％のＮＺア
ミン、０．８Ｍのスクロース、０．６％のＮｏｂｌｅアガー）又は３mlのＳＴＣ
と混合し、そしてその懸濁物を最少培地プレートに注いだ。このプレートを３７
℃で３〜５日インキュベーションした。
〜１５μｌのアリコートを１４mlのＦａｌｃｏｎポリプロピレンチューブ内の０
．１mlのプロトプラストに２×１０7 プロトプラスト／mlの濃度で添加し、次い
で２５０μｌの６０％のＰＥＧ４０００−１０mMのＣａＣｌ2 −１０mMのトリス
−ＨＣｌ、pH７を加え、静かに混合し、そして３７℃で３０分インキュベーショ
ンした。この懸濁物を１２mlの溶融上層アガー（１×ＣＯＶＥ塩、１％のＮＺア
ミン、０．８Ｍのスクロース、０．６％のＮｏｂｌｅアガー）又は３mlのＳＴＣ
と混合し、そしてその懸濁物を最少培地プレートに注いだ。このプレートを３７
℃で３〜５日インキュベーションした。
【０１０１】 ＢａｍＨＩ ＲＥＭＩ ｐＤＳＹ８２形質転換体の形質転換率はＤＮＡ １μ
ｇ当り約８０〜１１０形質転換体の範囲であった。アスペルギルス・オリザＨｏ
ｗＢ４３０の約２７，０００のＤＮＡ標識形質転換体のＢａｍＨＩ ＲＥＭＩラ
イブラリーが得られた。
ｇ当り約８０〜１１０形質転換体の範囲であった。アスペルギルス・オリザＨｏ
ｗＢ４３０の約２７，０００のＤＮＡ標識形質転換体のＢａｍＨＩ ＲＥＭＩラ
イブラリーが得られた。
【０１０２】 このアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０標識突然変異ライブラリープール
は、ＢａｍＨＩで消化し、その後ＢａｍＨＩの存在下で形質転換したｐＤＳＹ８
２に関して、「ｂ」と表示する。このライブラリーを約１０００形質転換体のグ
ループにプールし、そして１０％のグリセロールの中で−８０℃で保存した。
は、ＢａｍＨＩで消化し、その後ＢａｍＨＩの存在下で形質転換したｐＤＳＹ８
２に関して、「ｂ」と表示する。このライブラリーを約１０００形質転換体のグ
ループにプールし、そして１０％のグリセロールの中で−８０℃で保存した。
【０１０３】 実施例２：リパーゼ発現スクリーニング 実施例１記載のアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０標識突然変異ライブラ
リー「ｂ」プールをリパーゼ発現についてアッセイした。
リー「ｂ」プールをリパーゼ発現についてアッセイした。
【０１０４】 ９６穴プレートスクリーニングの場合、ＭＹ２５培地を等容量の滅菌水及び２
×ＭＹ塩pH６．５溶液から成る希釈液を用いて１０００倍希釈した。２４穴プレ
ート法の場合、ＭＹ２５培地を等容量の滅菌水及び２×ＭＹ塩pH６．５溶液から
成る希釈液を用いて１００倍希釈した。
×ＭＹ塩pH６．５溶液から成る希釈液を用いて１０００倍希釈した。２４穴プレ
ート法の場合、ＭＹ２５培地を等容量の滅菌水及び２×ＭＹ塩pH６．５溶液から
成る希釈液を用いて１００倍希釈した。
【０１０５】 第一９６穴プレートスクリーニングは個々のプール由来の胞子をＭＹ２５／１
０００に希釈し、５０mlの培地をウェルに分注したときにウェル当り平均して１
胞子が接種されるようにすることを包含する。接種後、この９６穴プレートを７
日間、３４℃で静置条件下で培養した。次いで培養物を下記の通りにしてリパー
ゼ活性についてアッセイした。注目の突然変異体をＭＹ２５／１００を含む２４
穴プレートに直接接種し、そして３４℃で７日間増殖させた。次いで培養物を下
記の通りにしてリパーゼ活性についてアッセイした。注目の突然変異体をＣＯＶ
Ｅプレートにまいて胞子を生成させ、ＰＤＡプレート上にまいて孤立コロニーを
生成させ、次いで各単離体由来の４つの孤立コロニーを上記の２４穴プレート法
で試験した。
０００に希釈し、５０mlの培地をウェルに分注したときにウェル当り平均して１
胞子が接種されるようにすることを包含する。接種後、この９６穴プレートを７
日間、３４℃で静置条件下で培養した。次いで培養物を下記の通りにしてリパー
ゼ活性についてアッセイした。注目の突然変異体をＭＹ２５／１００を含む２４
穴プレートに直接接種し、そして３４℃で７日間増殖させた。次いで培養物を下
記の通りにしてリパーゼ活性についてアッセイした。注目の突然変異体をＣＯＶ
Ｅプレートにまいて胞子を生成させ、ＰＤＡプレート上にまいて孤立コロニーを
生成させ、次いで各単離体由来の４つの孤立コロニーを上記の２４穴プレート法
で試験した。
【０１０６】 リパーゼアッセイ基質はｐ−ニトロフェニルブチレートストック基質（２１ml
のｐ−ニトロフェニルブチレート／ml ＤＭＳＯ）を使用直前にＭＣバッファー
（４mMのＣａＣｌ2 −１００mMのＭＯＰＳ pH７．５）に希釈することによって
調製した。標準リパーゼ（LIPOLASETM，Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark
）を０．０２％のアルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）ディタージェン
ト含有ＭＣバッファー４０LU／mlを含むように調製した。この標準品を使用する
まで４℃で保存した。標準リパーゼを使用直前にＭＣバッファーで１／４０に希
釈した。ブロスサンプルを０．０２％のＡＯＳディタージェントを含むＭＣバッ
ファーに希釈し、そして２０μｌのアリコートを９６穴プレートのウェルに分注
し、次いで２００μｌの希釈基質を分注した。プレートリーダーを用い、４０５
nmでの吸収を、約１分間の間隔で２回の測定値の差として記録した。リパーゼ単
位／ml（LU／ml）はこのリパーゼ標準品に対して計算した。
のｐ−ニトロフェニルブチレート／ml ＤＭＳＯ）を使用直前にＭＣバッファー
（４mMのＣａＣｌ2 −１００mMのＭＯＰＳ pH７．５）に希釈することによって
調製した。標準リパーゼ（LIPOLASETM，Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark
）を０．０２％のアルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）ディタージェン
ト含有ＭＣバッファー４０LU／mlを含むように調製した。この標準品を使用する
まで４℃で保存した。標準リパーゼを使用直前にＭＣバッファーで１／４０に希
釈した。ブロスサンプルを０．０２％のＡＯＳディタージェントを含むＭＣバッ
ファーに希釈し、そして２０μｌのアリコートを９６穴プレートのウェルに分注
し、次いで２００μｌの希釈基質を分注した。プレートリーダーを用い、４０５
nmでの吸収を、約１分間の間隔で２回の測定値の差として記録した。リパーゼ単
位／ml（LU／ml）はこのリパーゼ標準品に対して計算した。
【０１０７】 ９６穴スクリーニング、それに続く２４穴スクリーニングの結果は、アスペル
ギルス・オリザＨｏｗＢ４０コントロール株よりも高レベルでリパーゼを産生す
る更なる評価のためのアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３と命名したＤＮ
Ａ標識突然変異体を特定した。
ギルス・オリザＨｏｗＢ４０コントロール株よりも高レベルでリパーゼを産生す
る更なる評価のためのアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３と命名したＤＮ
Ａ標識突然変異体を特定した。
【０１０８】 実施例３：アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３の振盪フラスコ評価 実施例２に記載のアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３を次にＣＯＶＥプ
レート上にまき、振盪フラスコ評価のための胞子を作った。
レート上にまき、振盪フラスコ評価のための胞子を作った。
【０１０９】 振盪フラスコ評価は３００〜５００mlの胞子懸濁物（０．０２％のＴｗｅｅｎ
−８０＋ＣＯＶＥプレート由来の胞子）を２５mlのＭＹ２５培地、pH６．５の中
に、１２５mlの振盪フラスコ内で接種することにより実施した。この振盪フラス
コを３４℃で３日、２００rpm でインキュベーションした。サンプルを２日及び
３日目に採取し、そして実施例２に記載の通りにしてリパーゼ活性を測定した。
−８０＋ＣＯＶＥプレート由来の胞子）を２５mlのＭＹ２５培地、pH６．５の中
に、１２５mlの振盪フラスコ内で接種することにより実施した。この振盪フラス
コを３４℃で３日、２００rpm でインキュベーションした。サンプルを２日及び
３日目に採取し、そして実施例２に記載の通りにしてリパーゼ活性を測定した。
【０１１０】 その結果を以下の表１に示し、ここではコントロールとしてのアスペルギルス
・オリザＨｏｗＢ４３０のリパーゼ収率は１．０と標準化してある。
・オリザＨｏｗＢ４３０のリパーゼ収率は１．０と標準化してある。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】 表１に示す通り、アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３は振盪フラスコ内
で増殖させるとコントロール株アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０とより約
２．２倍多くのリパーゼを産生した。
で増殖させるとコントロール株アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０とより約
２．２倍多くのリパーゼを産生した。
【０１１３】 実施例４：アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３からのプラスミドＤＮＡ及
び隣接ＤＮＡのつり出し ｐＤＳＹ８２ ＤＮＡ及びゲノム隣接遺伝子座をアスペルギルス・オリザＤＥ
ＢＹ１０．３から単離した。 ゲノムＤＮＡを下記の手順に従ってアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３
から単離した。各突然変異体の胞子ストックを１５０mlのＹＥＧ培地に接種し、
そして３７℃、２５０rpm で一夜増殖させた。その菌糸体を各培養物からMiracl
oth (Calbiochem, La Jolla, CA)を介して濾過し、そして１０mMのトリス−０．
１mMのＥＤＴＡ、pH８（ＴＥ）で２回すすいだ。その菌糸体調製品を次に液体窒
素で急速凍結し、そして乳鉢で微粉末へと粉砕した。この粉末菌糸体調製品を各
々５０mlのチューブに移し、そして２０mlの溶解バッファーを加えた。各調製品
にＲＮａｓｅを２０μｇ／mlの最終濃度となるように加え、そしてその調製品を
３７℃で３０分インキュベーションした。プロテアーゼＫを各調製品に、０．１
mg／mlの最終濃度となるように加え、そしてその調製品を５０℃で１時間インキ
ュベーションした。次いでその調製品を１５，０００×ｇで２０分遠心分離し、
不溶性物質をペレット状にした。各上清液をＱｉａｇｅｎ ＭＡＸＩカラム（Qi
agen, Chatsworth, CA）に載せた。このカラムは製造者により用意されたＱＢＴ
で平衡化してある。次いでそのカラムを製造者により用意されたＱＣ ３０mlで
洗浄した。ＤＮＡを各カラムから製造者により用意されたＱＦ １５mlで溶出さ
せ、次いで０．７容量のイソプロパノールによる沈殿化及び１５，０００×ｇで
２０分の遠心分離により回収した。これらのペレットを最終的に５mlの７０％の
エタノールで洗い、風乾し、そして２００μｌのＴＥに溶解した。
び隣接ＤＮＡのつり出し ｐＤＳＹ８２ ＤＮＡ及びゲノム隣接遺伝子座をアスペルギルス・オリザＤＥ
ＢＹ１０．３から単離した。 ゲノムＤＮＡを下記の手順に従ってアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３
から単離した。各突然変異体の胞子ストックを１５０mlのＹＥＧ培地に接種し、
そして３７℃、２５０rpm で一夜増殖させた。その菌糸体を各培養物からMiracl
oth (Calbiochem, La Jolla, CA)を介して濾過し、そして１０mMのトリス−０．
１mMのＥＤＴＡ、pH８（ＴＥ）で２回すすいだ。その菌糸体調製品を次に液体窒
素で急速凍結し、そして乳鉢で微粉末へと粉砕した。この粉末菌糸体調製品を各
々５０mlのチューブに移し、そして２０mlの溶解バッファーを加えた。各調製品
にＲＮａｓｅを２０μｇ／mlの最終濃度となるように加え、そしてその調製品を
３７℃で３０分インキュベーションした。プロテアーゼＫを各調製品に、０．１
mg／mlの最終濃度となるように加え、そしてその調製品を５０℃で１時間インキ
ュベーションした。次いでその調製品を１５，０００×ｇで２０分遠心分離し、
不溶性物質をペレット状にした。各上清液をＱｉａｇｅｎ ＭＡＸＩカラム（Qi
agen, Chatsworth, CA）に載せた。このカラムは製造者により用意されたＱＢＴ
で平衡化してある。次いでそのカラムを製造者により用意されたＱＣ ３０mlで
洗浄した。ＤＮＡを各カラムから製造者により用意されたＱＦ １５mlで溶出さ
せ、次いで０．７容量のイソプロパノールによる沈殿化及び１５，０００×ｇで
２０分の遠心分離により回収した。これらのペレットを最終的に５mlの７０％の
エタノールで洗い、風乾し、そして２００μｌのＴＥに溶解した。
【０１１４】 アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３ゲノムＤＮＡ調製品由来の２μｇの
アリコートをＢｇｌII，ＨｐａＩ，ＮａｒＩ，ＮｄｅＩ，ＳｐｈＩ及びＳｔｕＩ
で別々に消化した。制限エンドヌクレアーゼはｐＤＳＹ８２を切らず、このこと
は一体化したプラスミドと隣接ゲノムＤＮＡとの単離を可能にする。この消化し
たＤＮＡを次にＴ４ ＤＮＡリガーゼによる２０μｌの反応でライゲーションさ
せた。
アリコートをＢｇｌII，ＨｐａＩ，ＮａｒＩ，ＮｄｅＩ，ＳｐｈＩ及びＳｔｕＩ
で別々に消化した。制限エンドヌクレアーゼはｐＤＳＹ８２を切らず、このこと
は一体化したプラスミドと隣接ゲノムＤＮＡとの単離を可能にする。この消化し
たＤＮＡを次にＴ４ ＤＮＡリガーゼによる２０μｌの反応でライゲーションさ
せた。
【０１１５】 このライゲーションさせたＤＮＡ調製品を各々Ｅ．コリＨＢ１０１に形質転換
した。この形質転換体は、その形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、イン
サートを制限消化させてそれが、ｐＤＳＹ８２に由来するかを確認し、そしてそ
のインサートをApplied Biosystems Model 373A 自動ＤＮＡシーケンサー（Appl
ied Biosystems, Inc., Foster City, CA)により双方のストランドについて、プ
ライマー歩行技術により、色素−ターミネーター化学（Giesecke ら、1992, Jou
rnal of Virol. Methods 38 : 47-60)を用い、Ｍ１３リバース（−４８）及びＭ
１３フォワード（−２０）プライマー（New England Biolabs, Beverly, MA）並
びにｐＤＳＹ８２に特異的なプライマーを利用して配列決定することにより、ス
クリーニングした。
した。この形質転換体は、その形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、イン
サートを制限消化させてそれが、ｐＤＳＹ８２に由来するかを確認し、そしてそ
のインサートをApplied Biosystems Model 373A 自動ＤＮＡシーケンサー（Appl
ied Biosystems, Inc., Foster City, CA)により双方のストランドについて、プ
ライマー歩行技術により、色素−ターミネーター化学（Giesecke ら、1992, Jou
rnal of Virol. Methods 38 : 47-60)を用い、Ｍ１３リバース（−４８）及びＭ
１３フォワード（−２０）プライマー（New England Biolabs, Beverly, MA）並
びにｐＤＳＹ８２に特異的なプライマーを利用して配列決定することにより、ス
クリーニングした。
【０１１６】 形質転換体Ｅ．コリＨＢ１０１−ｐＤＳＹ１０９はアスペルギルス・オリザＤ
ＥＢＹ１０．３由来のＳｐｈＩつり出し遺伝子座を含んだ。
ＥＢＹ１０．３由来のＳｐｈＩつり出し遺伝子座を含んだ。
【０１１７】 実施例５：アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３つり出し遺伝子座ｐＤＳＹ
１０９の特性決定 アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３つり出し遺伝子座ｐＤＳＹ１０９の
組込み現象の両側の３．４及び２．２kb領域をApplied Biosystems Model 373A
自動ＤＮＡシーケンサーにより、両ストランドについて、プライマー歩行技術を
用い、色素−ターミネーター化学により、Ｍ１３リバース（−４８）及びＭ１３
フォワード（−２０）プライマー並びに配列決定するＤＮＡに固有のプライマー
を利用して配列決定した。その核酸配列は、組込み現象がｐａｌＢ遺伝子のオー
プンリーディングフレーム内で起きることを示した。ｐａｌＢ遺伝子は周囲pHを
発信するｐａｃＣ pHシグナル変換経路に関与するシステインプロテアーゼをコ
ードする。
１０９の特性決定 アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３つり出し遺伝子座ｐＤＳＹ１０９の
組込み現象の両側の３．４及び２．２kb領域をApplied Biosystems Model 373A
自動ＤＮＡシーケンサーにより、両ストランドについて、プライマー歩行技術を
用い、色素−ターミネーター化学により、Ｍ１３リバース（−４８）及びＭ１３
フォワード（−２０）プライマー並びに配列決定するＤＮＡに固有のプライマー
を利用して配列決定した。その核酸配列は、組込み現象がｐａｌＢ遺伝子のオー
プンリーディングフレーム内で起きることを示した。ｐａｌＢ遺伝子は周囲pHを
発信するｐａｃＣ pHシグナル変換経路に関与するシステインプロテアーゼをコ
ードする。
【０１１８】 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０のゲノムＤＮＡを実施例４記載のプロ
トコールを利用して単離した。アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０のゲノム
ライブラリーはまずアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡをＴｓ
ｐ５０９Ｉで部分消化することにより構築した。４単位のＴｓｐ５０９を用い、
製造者により推奨されている条件を利用して３．５μｇのアスペルギルス・オリ
ザＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡを消化した。反応は６５℃で実施し、そしてサン
プルは５分間隔（０から５０分）で採取した。その反応体を氷の上に載せ、そし
てＥＤＴＡを１０mMとなるまで添加することにより停止させた。その消化物を１
％のアガロースゲル上に臭化エチジウムと一緒に泳動させ、そして３kb〜９kbの
ＤＮＡを含むゲノムの領域を切り出した。次いでそのＤＮＡをＢｅｔａ−Ａｇａ
ｒａｓｅ Ｉを用い、その製造者により用意されているプロトコール（New Engl
and Biolabs, Beverly, MA）を用いてそのゲルスライスから精製した。サイズ選
別したＤＮＡを次にラムダＺｉｐＬｏｘ ＥｃｏＲＩアームに、その製造者の指
示に従って１６℃で一夜かけてライゲーションした（Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD）。そのライゲーション反応体をGigapack Gold III Packagi
ng Kit (Stratagene, La Jolla, CA）を利用し、その製造者のプロトコールに従
ってパッケージング及び力価検定した。全部で８×１０6 の組換プラークが得ら
れ、そしてそのライブラリーを製造者により用意されたプロトコールを利用して
増幅させた。
トコールを利用して単離した。アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０のゲノム
ライブラリーはまずアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡをＴｓ
ｐ５０９Ｉで部分消化することにより構築した。４単位のＴｓｐ５０９を用い、
製造者により推奨されている条件を利用して３．５μｇのアスペルギルス・オリ
ザＨｏｗＢ４３０ゲノムＤＮＡを消化した。反応は６５℃で実施し、そしてサン
プルは５分間隔（０から５０分）で採取した。その反応体を氷の上に載せ、そし
てＥＤＴＡを１０mMとなるまで添加することにより停止させた。その消化物を１
％のアガロースゲル上に臭化エチジウムと一緒に泳動させ、そして３kb〜９kbの
ＤＮＡを含むゲノムの領域を切り出した。次いでそのＤＮＡをＢｅｔａ−Ａｇａ
ｒａｓｅ Ｉを用い、その製造者により用意されているプロトコール（New Engl
and Biolabs, Beverly, MA）を用いてそのゲルスライスから精製した。サイズ選
別したＤＮＡを次にラムダＺｉｐＬｏｘ ＥｃｏＲＩアームに、その製造者の指
示に従って１６℃で一夜かけてライゲーションした（Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD）。そのライゲーション反応体をGigapack Gold III Packagi
ng Kit (Stratagene, La Jolla, CA）を利用し、その製造者のプロトコールに従
ってパッケージング及び力価検定した。全部で８×１０6 の組換プラークが得ら
れ、そしてそのライブラリーを製造者により用意されたプロトコールを利用して
増幅させた。
【０１１９】 このゲノムライブラリーをスクリーニングしてｐａｌＢのゲノムクローンを得
た。このゲノムライブラリーの適当な希釈をＬａｍｂｄａ ＺｉｐＬｏｘアーム
により用意されたプロトコールに記載の通りにして行い、１５０mmのペトリ皿当
り７０００のプラークを得た。このプラークをＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルター（
Amersham, Cleveland, OH)に、標準のプロトコール（Sambrookら、1989、前掲）
を利用してリフティングさせた。このフィルターをＵＶ架橋を利用して固定し、
そしてＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂの中で４２℃でプレハイブリダイズさせた。そ
のフィルターをＤＩＧラベルした０．２５kbのｐａｌＢプローブとハイブリダイ
ズさせた。このプローブをApplied Biosystems Model 394 DNA/RNAシンセサイザ
ーにより、その製造者の仕様書に従って合成し、そしてGenius Kit (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN)を用いてジオキシゲニンでラベルした；
た。このゲノムライブラリーの適当な希釈をＬａｍｂｄａ ＺｉｐＬｏｘアーム
により用意されたプロトコールに記載の通りにして行い、１５０mmのペトリ皿当
り７０００のプラークを得た。このプラークをＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルター（
Amersham, Cleveland, OH)に、標準のプロトコール（Sambrookら、1989、前掲）
を利用してリフティングさせた。このフィルターをＵＶ架橋を利用して固定し、
そしてＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂの中で４２℃でプレハイブリダイズさせた。そ
のフィルターをＤＩＧラベルした０．２５kbのｐａｌＢプローブとハイブリダイ
ズさせた。このプローブをApplied Biosystems Model 394 DNA/RNAシンセサイザ
ーにより、その製造者の仕様書に従って合成し、そしてGenius Kit (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN)を用いてジオキシゲニンでラベルした；
【化１】
【０１２０】 増幅反応体（１００μｌ）を鋳型として約０．２μｇのｐＤＳＹ１０９を用い
て調製した。各反応体は以下の成分を含む：０．２μｇのプラスミドＤＮＡ、４
８．４pmolのフォワードプライマー、４８．４pmolのリバースプライマー、１mM
づつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバ
ッファー及び２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg
, NJ）、この反応体をEricomp Twin Block System Easy Cycler で、９５℃で５
分のサイクル１回、次いで各々９５℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で２分
のサイクル３０回にプログラミングしてインキュベーションした。
て調製した。各反応体は以下の成分を含む：０．２μｇのプラスミドＤＮＡ、４
８．４pmolのフォワードプライマー、４８．４pmolのリバースプライマー、１mM
づつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバ
ッファー及び２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp., Branchburg
, NJ）、この反応体をEricomp Twin Block System Easy Cycler で、９５℃で５
分のサイクル１回、次いで各々９５℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で２分
のサイクル３０回にプログラミングしてインキュベーションした。
【０１２１】 このフィルターをＧｅｎｉｕｓキットで用意されているプロトコールを利用し
て洗浄し、そして後ハイブリダイゼーション処理した。いくつかの陽性プラーク
が同定され、そして標準プロトコールを利用して均質となるまで精製した（Samb
rookら、1989、前掲）。
て洗浄し、そして後ハイブリダイゼーション処理した。いくつかの陽性プラーク
が同定され、そして標準プロトコールを利用して均質となるまで精製した（Samb
rookら、1989、前掲）。
【０１２２】 実施例１記載の方法に従ってｐａｌＢクローンの一つについてヌクレオチド配
列を決定した。そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び推定アミ
ノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を図１に示す。ｐａｌＢ遺伝子は８５４個
のアミノ酸のポリペプチドをコードする４７００bpのオープンリーディングフレ
ームをコードする。このオープンリーディングフレームには３個のイントロンが
介在している。
列を決定した。そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び推定アミ
ノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を図１に示す。ｐａｌＢ遺伝子は８５４個
のアミノ酸のポリペプチドをコードする４７００bpのオープンリーディングフレ
ームをコードする。このオープンリーディングフレームには３個のイントロンが
介在している。
【０１２３】 ＰａｌＢアミノ酸配列の対比アラインメントをＣｌｕｓｔａｌ法（Higgins, 1
989, CABIOS 5 : 151-153)を利用し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥTM ＭＥＧＡＬＩＧＮ TM ソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて、アイデンティティー
テーブル及び下記の多重アラインメントパラメーターに設定して行った：１０の
ギャップペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティー。対合アラインメント
パラメーターはＫｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５
及びダイアゴナルス＝５とした。
989, CABIOS 5 : 151-153)を利用し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥTM ＭＥＧＡＬＩＧＮ TM ソフトウェア（DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用いて、アイデンティティー
テーブル及び下記の多重アラインメントパラメーターに設定して行った：１０の
ギャップペナルティー及び１０のギャップ長ペナルティー。対合アラインメント
パラメーターはＫｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５
及びダイアゴナルス＝５とした。
【０１２４】 この対比アラインメントはアスペルギルス・オリザＰａｌＢタンパク質（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）がアスペルギルス・ニドゥランスＰａｌＢタンパク質（De
nison ら、1995、前掲）と６６．４％の同一性を共有することを示した。
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）がアスペルギルス・ニドゥランスＰａｌＢタンパク質（De
nison ら、1995、前掲）と６６．４％の同一性を共有することを示した。
【０１２５】 ＢｇｌIIで消化したアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３及びアスペルギ
ルス・オリザＨｏｗＢ１０１ゲノムＤＮＡのサザンブロットを上記の通りに調製
した。このブロットをＤＩＧでラベル化した０．２５ＫのｐａｌＢプローブをプ
ロービングし、つり出した隣接ＤＮＡがアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．
３内で中断された遺伝子であるかを確認した。
ルス・オリザＨｏｗＢ１０１ゲノムＤＮＡのサザンブロットを上記の通りに調製
した。このブロットをＤＩＧでラベル化した０．２５ＫのｐａｌＢプローブをプ
ロービングし、つり出した隣接ＤＮＡがアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．
３内で中断された遺伝子であるかを確認した。
【０１２６】 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ１０１由来の〜７．５kbのＢｇｌIIバンドは
このプローブにハイブリダイズし、一方アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．
３由来の１２kbのバンドがこのプローブにハイブリダイズした。
このプローブにハイブリダイズし、一方アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．
３由来の１２kbのバンドがこのプローブにハイブリダイズした。
【０１２７】 アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３内の組込み現象は非機能性ＰａｌＢ
タンパク質に結びつくと予想されるため、アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０
．３をpH８．０及びpH６．５で増殖について試験した。アスペルギルス・ニドゥ
ランスｐａｌＢマイナス株はpH８．０では増殖できず、pH６．５で増殖できる。
アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ３４０及びアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１
０．３を１０mMのウリジンの添加された最少培地内で増殖させた。予想通り、ア
スペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３はpH８．０では増殖できなかった。
タンパク質に結びつくと予想されるため、アスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０
．３をpH８．０及びpH６．５で増殖について試験した。アスペルギルス・ニドゥ
ランスｐａｌＢマイナス株はpH８．０では増殖できず、pH６．５で増殖できる。
アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ３４０及びアスペルギルス・オリザＤＥＢＹ１
０．３を１０mMのウリジンの添加された最少培地内で増殖させた。予想通り、ア
スペルギルス・オリザＤＥＢＹ１０．３はpH８．０では増殖できなかった。
【０１２８】 実施例６：ｐＭＴ１９３６の構築 ｐＭＴ１９３６をApplied Biosystems Model 394 DNA/RNAシンセサイザーによ
りその製造者の仕様書に従って合成した下記のプライマーを用いてｐａｌＢの中
断カセットを含むように構築した：
りその製造者の仕様書に従って合成した下記のプライマーを用いてｐａｌＢの中
断カセットを含むように構築した：
【化２】
【０１２９】 アスペルギルス・オリザｐａｌＢ５′隣接配列及びｐａｌＢ生成物のＮ末端部
をコードする配列を実施例４に記載のプロトコールに従って調製したアスペルギ
ルス・オリザＡ１５６０（Christensen ら、1988, Bio/Technology 6 : 1419-14
22）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。約０．０５μｇのゲノムＤＮＡ及び
５pmole づつの２つのプライマー１００７５４及び１００７５５を使用した。増
幅はポリメラーゼＰｗｏにより、その製造者の記載の通りにして実施した（Boeh
ringer Mannheim, Indianapolis, IN)。増幅は４０サイクル進行させた。反応生
成物の一部をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ
で消化し、そして約１．０５kbのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
単離した。
をコードする配列を実施例４に記載のプロトコールに従って調製したアスペルギ
ルス・オリザＡ１５６０（Christensen ら、1988, Bio/Technology 6 : 1419-14
22）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。約０．０５μｇのゲノムＤＮＡ及び
５pmole づつの２つのプライマー１００７５４及び１００７５５を使用した。増
幅はポリメラーゼＰｗｏにより、その製造者の記載の通りにして実施した（Boeh
ringer Mannheim, Indianapolis, IN)。増幅は４０サイクル進行させた。反応生
成物の一部をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ
で消化し、そして約１．０５kbのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により
単離した。
【０１３０】 アスペルギルス・オリザｐａｌＢ３′隣接配列及びｐａｌＢ遺伝子生成物のＣ
末端部をコードする配列は上記の通りにして得たが、但し増幅にはプライマー１
００７５２及び１００７５３を使用し、そしてＰＣＲ生成物はゲル電気泳動の前
にＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、約１．５kbのフラグメントを回収した。
末端部をコードする配列は上記の通りにして得たが、但し増幅にはプライマー１
００７５２及び１００７５３を使用し、そしてＰＣＲ生成物はゲル電気泳動の前
にＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、約１．５kbのフラグメントを回収した。
【０１３１】 上記の２つの消化、且つ精製したＰＣＲフラグメントを３部ライゲーションで
、ベクターｐＪａＬ４００由来の精製された２．７kbのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメント（図２）とライゲーションさせ、ｐＭＴ１９３５を作った（図３）。
ｐＭＴ１９３５のｐａｌＢ５′及び３′隣接物を、ＰＣＲプライマー１００７５
４及び１００７５３を介して導入したＢｓｓＨII，ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩにより
分離させた。
、ベクターｐＪａＬ４００由来の精製された２．７kbのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメント（図２）とライゲーションさせ、ｐＭＴ１９３５を作った（図３）。
ｐＭＴ１９３５のｐａｌＢ５′及び３′隣接物を、ＰＣＲプライマー１００７５
４及び１００７５３を介して導入したＢｓｓＨII，ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩにより
分離させた。
【０１３２】 反復隣接ｐｙｒＧ遺伝子を含むｐＪａＬ３９４の３．５kbのＨｉｎｄIII フラ
グメント（図４）をＨｉｎｄIII 切断してから脱リン酸した精製ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ II ＳＫ（−）にクローニングした。両方向のインサートを有するプ
ラスミドが得られた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカーのＳｐｅＩ部位がｐ
ｙｒＧ遺伝子の下流にあり、且つＸｈｏＩ部位がｐｙｒＧ遺伝子の上流にある一
のプラスミドｐＭＴ１９３１（図５）を選択した。ｐｙｒＧ遺伝子を３．５kbの
ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、そしてＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ消
化して精製したｐＭＴ１９３５に挿入して、中断プラスミドｐＭＴ１９３６を作
り上げた（図６）。
グメント（図４）をＨｉｎｄIII 切断してから脱リン酸した精製ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ II ＳＫ（−）にクローニングした。両方向のインサートを有するプ
ラスミドが得られた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカーのＳｐｅＩ部位がｐ
ｙｒＧ遺伝子の下流にあり、且つＸｈｏＩ部位がｐｙｒＧ遺伝子の上流にある一
のプラスミドｐＭＴ１９３１（図５）を選択した。ｐｙｒＧ遺伝子を３．５kbの
ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、そしてＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ消
化して精製したｐＭＴ１９３５に挿入して、中断プラスミドｐＭＴ１９３６を作
り上げた（図６）。
【０１３３】 ｐｙｒＧ選択可能ｐａｌＢ中断カセットはｐＭＴ１９３６から６．２kbのＮｏ
ｔＩフラグメントとして（ポリリンカー内でのＮｏｔＩ切断）又は５．５kbのＡ
ｓｅＩ−ＰｖｕＩフラグメント（実際のｐａｌＢ５′及び３′隣接配列内でのＡ
ｓｅＩ及びＰｖｕＩ切断）として単離できた。
ｔＩフラグメントとして（ポリリンカー内でのＮｏｔＩ切断）又は５．５kbのＡ
ｓｅＩ−ＰｖｕＩフラグメント（実際のｐａｌＢ５′及び３′隣接配列内でのＡ
ｓｅＩ及びＰｖｕＩ切断）として単離できた。
【０１３４】 実施例７：ｐＭＴ１９３６由来のＡｓｅＩ／ＰｖｕＩ ｐａｌＢ中断カセットに
よるアスペルギルス・オリザの形質転換 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０を実施例１記載と同一の形質転換手順
を利用し、ｐＭＴ１９３６から獲得した５．５kbのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメ
ントで形質転換した。この形質転換のための線形フラグメントはｐＭＴ１９３６
のＡｓｅＩ及びＰｖｕＩによる消化、並びにQIAquick Gel Extraction Kit (Qia
gen, Chatsworth, CA)を利用する１％のアガロースゲルでのその製造者に従うフ
ラグメントの分離により単離した。それらの形質転換体を最少培地プレート上で
pH６．５又はpH８．０での増殖について試験した。
よるアスペルギルス・オリザの形質転換 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０を実施例１記載と同一の形質転換手順
を利用し、ｐＭＴ１９３６から獲得した５．５kbのＡｓｅＩ／ＰｖｕＩフラグメ
ントで形質転換した。この形質転換のための線形フラグメントはｐＭＴ１９３６
のＡｓｅＩ及びＰｖｕＩによる消化、並びにQIAquick Gel Extraction Kit (Qia
gen, Chatsworth, CA)を利用する１％のアガロースゲルでのその製造者に従うフ
ラグメントの分離により単離した。それらの形質転換体を最少培地プレート上で
pH６．５又はpH８．０での増殖について試験した。
【０１３５】 この結果が示すには、試験した１２８の形質転換のうち１３がpH８．０での増
殖不能により示される通りｐａｌＢマイナス表現型を保有していた。この１３の
ｐａｌＢマイナス株及びpH８．０で増殖できる１３の形質転換体を胞子精製した
。
殖不能により示される通りｐａｌＢマイナス表現型を保有していた。この１３の
ｐａｌＢマイナス株及びpH８．０で増殖できる１３の形質転換体を胞子精製した
。
【０１３６】 アスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０マイナス突然変異体、アスペルギルス
・オリザｐａｌＢプラス株及びアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０由来のゲ
ノムＤＮＡのサザンブロットを実施し、ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩ形質転換性ＤＮＡフ
ラグメントがｐａｌＢ遺伝子座の中に完全な置換体として組込まれたかどうかを
検討した。ゲノムＤＮＡは実施例４に記載の手順に従い調製し、ＰｖｕＩで消化
し、そして０．８％のアガロースゲル上で電気泳動した。このＤＮＡをＨｙｂｏ
ｎｄ Ｎ+ フィルターに、０．４ＮのＮａＯＨ及び毛細管作用を利用して移した
。このブロットをＵＶ架橋してからＲａｐｉｄ Ｈｙｂ中での６５℃でのプレハ
イブリダイゼーションにかけた。次いでこのブロットをｐＭＴ１９３６由来の０
．９kbのＡｓｎＩ／ＳｐｅＩフラグメントでプロービングした。この０．９kbの
フラグメントを１％のアガロースゲルでの電気泳動後にアガロースゲルスライス
から、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラムを利用して単離した。このフラグメントを
Vistra ECF Randam Prime Labelingキットを用いてラベル化した。これらのブロ
ットをRapid Hyb (Amersham, Cleveland, OH）で６５℃でプレハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーションし、次いで２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ
で６５℃で５分２回洗浄し、次いで０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５
℃で１０分２回洗浄した。洗浄後、そのブロットをVistra ECF Signal Amplific
ation Kit (Amersham, Cleveland, OH）及びSTORM 860 Imaging System (Molecu
lar Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて検出処理した。
・オリザｐａｌＢプラス株及びアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０由来のゲ
ノムＤＮＡのサザンブロットを実施し、ＡｓｎＩ／ＰｖｕＩ形質転換性ＤＮＡフ
ラグメントがｐａｌＢ遺伝子座の中に完全な置換体として組込まれたかどうかを
検討した。ゲノムＤＮＡは実施例４に記載の手順に従い調製し、ＰｖｕＩで消化
し、そして０．８％のアガロースゲル上で電気泳動した。このＤＮＡをＨｙｂｏ
ｎｄ Ｎ+ フィルターに、０．４ＮのＮａＯＨ及び毛細管作用を利用して移した
。このブロットをＵＶ架橋してからＲａｐｉｄ Ｈｙｂ中での６５℃でのプレハ
イブリダイゼーションにかけた。次いでこのブロットをｐＭＴ１９３６由来の０
．９kbのＡｓｎＩ／ＳｐｅＩフラグメントでプロービングした。この０．９kbの
フラグメントを１％のアガロースゲルでの電気泳動後にアガロースゲルスライス
から、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラムを利用して単離した。このフラグメントを
Vistra ECF Randam Prime Labelingキットを用いてラベル化した。これらのブロ
ットをRapid Hyb (Amersham, Cleveland, OH）で６５℃でプレハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーションし、次いで２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ
で６５℃で５分２回洗浄し、次いで０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５
℃で１０分２回洗浄した。洗浄後、そのブロットをVistra ECF Signal Amplific
ation Kit (Amersham, Cleveland, OH）及びSTORM 860 Imaging System (Molecu
lar Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて検出処理した。
【０１３７】 このサザンブロットの結果は、このプローブがアスペルギルス・オリザＨｏｗ
Ｂ４３０由来の６kbのバンドにハイブリダイズすることを示した。完全な中断は
約８kbのＰｖｕＩバンドへのハイブリダイゼーションを予想させうる。このサザ
ンブロット結果はｐａｌＢマイナス株の一部が完全な中断を有し、その他は有さ
ないことを更に示した。
Ｂ４３０由来の６kbのバンドにハイブリダイズすることを示した。完全な中断は
約８kbのＰｖｕＩバンドへのハイブリダイゼーションを予想させうる。このサザ
ンブロット結果はｐａｌＢマイナス株の一部が完全な中断を有し、その他は有さ
ないことを更に示した。
【０１３８】 実施例８：アスペルギルス・オリザΔｐａｌＢ株の細胞外プロテアーゼ生産 実施例７に記載の３種のアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス及び３種類
のアスペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株を３４℃、pH７、１０００〜２００
０rpm で８日間、Ｎｕｔｒｉｏｓｅ、酵母エキス、（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、クエン酸、Ｋ2 ＳＯ4 、ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ及び微量金属か
ら成る培地を含む２リットル発酵槽の中で増殖させた。この細胞外培地のサンプ
ルを毎日採取し、そして６日目のサンプルを下記のＦＴＣ−カゼインアッセイを
利用して総細胞外プロテアーゼ活性についてアッセイした。
のアスペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株を３４℃、pH７、１０００〜２００
０rpm で８日間、Ｎｕｔｒｉｏｓｅ、酵母エキス、（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 、Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、クエン酸、Ｋ2 ＳＯ4 、ＣａＣｌ2 ・Ｈ2 Ｏ及び微量金属か
ら成る培地を含む２リットル発酵槽の中で増殖させた。この細胞外培地のサンプ
ルを毎日採取し、そして６日目のサンプルを下記のＦＴＣ−カゼインアッセイを
利用して総細胞外プロテアーゼ活性についてアッセイした。
【０１３９】 ＦＴＣ−カゼインアッセイは下記の通りに実施した。反応は０．１ＭのＭＯＰ
Ｓ pH７．０バッファーと１：１に混合した４０μｌのＦＴＣ−カゼイン（Twin
ing, 1984, Analytical Biochemistry 143 : 30-34）を０．１ＭのＭＯＰＳ pH
７．０バッファー中に適宜希釈した１０μｌの酵素溶液に添加することにより開
始させた。反応体を３７℃で２時間インキュベーションし、次いで１５０μｌの
５％のトリクロロ酢酸により反応をクエンチングした。このクエンチングした反
応体を５℃に２時間置き、次いで１０分間遠心分離した。２０μｌの上清液を２
mlの０．５ＭのボレートpH９．０を含む試験管に移し、そして混合した。この溶
液のサンプル２００μｌを次にブラック「Ｕ」底９６穴プレート（Dynatech, In
c., Chantiily, VA)に移した。このホウ酸バッファーをブランクとして装置のＯ
補正に用いた。蛍光はFluorolite 1000装置（Dynatech, Inc., Chantiily, VA）
を用い、１１７６に対照設定値及び４．１Ｖのランプ電圧としたチャンネル３を
利用して測定した。この装置のダイナミックレンジは０〜４０００蛍光単位であ
り、４００〜３５００単位で最良のウェル間再現性がある。
Ｓ pH７．０バッファーと１：１に混合した４０μｌのＦＴＣ−カゼイン（Twin
ing, 1984, Analytical Biochemistry 143 : 30-34）を０．１ＭのＭＯＰＳ pH
７．０バッファー中に適宜希釈した１０μｌの酵素溶液に添加することにより開
始させた。反応体を３７℃で２時間インキュベーションし、次いで１５０μｌの
５％のトリクロロ酢酸により反応をクエンチングした。このクエンチングした反
応体を５℃に２時間置き、次いで１０分間遠心分離した。２０μｌの上清液を２
mlの０．５ＭのボレートpH９．０を含む試験管に移し、そして混合した。この溶
液のサンプル２００μｌを次にブラック「Ｕ」底９６穴プレート（Dynatech, In
c., Chantiily, VA)に移した。このホウ酸バッファーをブランクとして装置のＯ
補正に用いた。蛍光はFluorolite 1000装置（Dynatech, Inc., Chantiily, VA）
を用い、１１７６に対照設定値及び４．１Ｖのランプ電圧としたチャンネル３を
利用して測定した。この装置のダイナミックレンジは０〜４０００蛍光単位であ
り、４００〜３５００単位で最良のウェル間再現性がある。
【０１４０】 表２に示す結果はアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス株がアスペルギル
ス・オリザｐａｌＢプラス株と比べ、平均して１０分の１の細胞外プロテアーゼ
しか産生しないことを示した。これらのアッセイをセリンプロテアーゼインヒビ
ターＰＭＳＦ又はメタロプロテアーゼインヒビター１，１０−フェナントロリン
のいずれかの存在下でも実施した。表示のインヒビターにより阻害された総プロ
テアーゼ活性のパーセントを表２に示す。アスペルギルス・オリザｐａｌＢプラ
ス及びｐａｌＢマイナスサンプルの阻害パターンは似かよっており、ｐａｌＢ欠
失がセリン及びメタロプロテアーゼの双方の産生に影響することを示唆する。
ス・オリザｐａｌＢプラス株と比べ、平均して１０分の１の細胞外プロテアーゼ
しか産生しないことを示した。これらのアッセイをセリンプロテアーゼインヒビ
ターＰＭＳＦ又はメタロプロテアーゼインヒビター１，１０−フェナントロリン
のいずれかの存在下でも実施した。表示のインヒビターにより阻害された総プロ
テアーゼ活性のパーセントを表２に示す。アスペルギルス・オリザｐａｌＢプラ
ス及びｐａｌＢマイナスサンプルの阻害パターンは似かよっており、ｐａｌＢ欠
失がセリン及びメタロプロテアーゼの双方の産生に影響することを示唆する。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】 ３種類の更なるアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス及び３種類の更なる
ｐａｌＢプラス株も２リットルの発酵槽の中で８日間、上記の通りに培養し、そ
して細胞外サンプルを毎日採取した。６日目のサンプルをインヒビターの存在下
及び不存下の双方で上記のＦＴＣ−カゼインアッセイを利用してアッセイした。
ｐａｌＢプラス株も２リットルの発酵槽の中で８日間、上記の通りに培養し、そ
して細胞外サンプルを毎日採取した。６日目のサンプルをインヒビターの存在下
及び不存下の双方で上記のＦＴＣ−カゼインアッセイを利用してアッセイした。
【０１４３】 下記の表３に示す結果は、アスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス株がアス
ペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株と比べて平均して１０分の１の総プロテア
ーゼ活性しか示さないことを示す。
ペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株と比べて平均して１０分の１の総プロテア
ーゼ活性しか示さないことを示す。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】 ２種類のアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス及び一種類のアスペルギル
ス・オリザｐａｌＢプラス株も２リットルの発酵槽の中で８日間上記の通りに増
殖させた。このアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス株はｐａｌＢ遺伝子の
完全な中断体である。細胞外サンプルを８日間にわたり毎日採取した。６日目の
サンプルをインヒビターの存在下及び不在下の双方で上記のＦＴＣ−カゼインア
ッセイを利用してアッセイした。その結果を以下の表４に示す。アスペルギルス
・オリザｐａｌＢマイナス株はアスペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株よりも
平均して２０分の１の細胞外プロテアーゼを産生した。
ス・オリザｐａｌＢプラス株も２リットルの発酵槽の中で８日間上記の通りに増
殖させた。このアスペルギルス・オリザｐａｌＢマイナス株はｐａｌＢ遺伝子の
完全な中断体である。細胞外サンプルを８日間にわたり毎日採取した。６日目の
サンプルをインヒビターの存在下及び不在下の双方で上記のＦＴＣ−カゼインア
ッセイを利用してアッセイした。その結果を以下の表４に示す。アスペルギルス
・オリザｐａｌＢマイナス株はアスペルギルス・オリザｐａｌＢプラス株よりも
平均して２０分の１の細胞外プロテアーゼを産生した。
【０１４６】
【表４】
【０１４７】 実施例９：アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＡ遺伝子のＰＣＲ増幅 アスペルギルス・ニドゥランス由来のｐａｌＡ遺伝子をＰＣＲを利用して実施
例４に記載の通りにして、下記のプライマーを用いてゲノムＤＮＡから増幅させ
た：
例４に記載の通りにして、下記のプライマーを用いてゲノムＤＮＡから増幅させ
た：
【化３】
【０１４８】 反応体は５０ngのアスペルギルス・ニドゥランスゲノムＤＮＡ、５０pmole づ
つのｐａｌＡ２５４０Ｒ及びｐａｌＡ１７２、Perkin Elmer PCRバッファー、１
mMのｄＮＴＰ及び０．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応はEric
omp Twin Block System Easy Cycler で反復し、それは９５℃で３分を１サイク
ル；９５℃で１分、５０℃で１分及び７２℃で１分を３０サイクル；そして７２
℃で５分を１サイクルとプログラムした。反応体のアリコートをアガロースゲル
で電気泳動し、そして約２．４kbの期待の生成物が得られた。この反応体の半分
を調製ゲルに泳動し、所望の生成物を含むゲルスライスを切り出し、そしてＤＮ
ＡをそのゲルからQiaquick Gel Extraction Kit を用いて単離した。
つのｐａｌＡ２５４０Ｒ及びｐａｌＡ１７２、Perkin Elmer PCRバッファー、１
mMのｄＮＴＰ及び０．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応はEric
omp Twin Block System Easy Cycler で反復し、それは９５℃で３分を１サイク
ル；９５℃で１分、５０℃で１分及び７２℃で１分を３０サイクル；そして７２
℃で５分を１サイクルとプログラムした。反応体のアリコートをアガロースゲル
で電気泳動し、そして約２．４kbの期待の生成物が得られた。この反応体の半分
を調製ゲルに泳動し、所望の生成物を含むゲルスライスを切り出し、そしてＤＮ
ＡをそのゲルからQiaquick Gel Extraction Kit を用いて単離した。
【０１４９】 ゲル単離ＰＣＲ生成物の１０分の１をPrime-It Kit (Stratagene, La Jolla,
CA）を用い、その製造者の仕様書に従って32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした。ｐａｌ
ＡプローブはTE Midi G-50カラム（５′から３′、Boulder, CO)でのラベリング
反応に従って精製した。
CA）を用い、その製造者の仕様書に従って32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした。ｐａｌ
ＡプローブはTE Midi G-50カラム（５′から３′、Boulder, CO)でのラベリング
反応に従って精製した。
【０１５０】 実施例１０：アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＡプローブによるアスペルギ
ルス・オリザゲノムＤＮＡのサザン分析 実施例４に記載の通りにして調製したアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄIII で消化し、そしてアガ
ロースゲルで電気泳動した。このＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルターに実施
例７記載の通りにしてアルカリ性条件下で移した。同一のブロットを３分の１づ
つ、低、中及び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションバッファーの中で
４２℃でプレハイブリダイゼーションした（５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ
、２００μｇ／mlの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、並びに低、中及び高及び超高スト
リンジェンシーそれぞれについて２５，３５又は５０％のホルムアミド中でのプ
レハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）。実施例１０記載のＰ 32 −ＣＴＰラベル化ｐａｌＡプローブを加え、そしてそれらのブロットを４２℃
で一夜ハイブリダイズさせた。それらのブロットを４２℃で５分、２×のＳＳＣ
、０．１のＳＤＳで２回洗浄し、そして０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで
１０分、２回洗浄した。中及び低ストリンジェンシーバッファー中でハイブリダ
イズする特定のバンドがブロット上に観察された。
ルス・オリザゲノムＤＮＡのサザン分析 実施例４に記載の通りにして調製したアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄIII で消化し、そしてアガ
ロースゲルで電気泳動した。このＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルターに実施
例７記載の通りにしてアルカリ性条件下で移した。同一のブロットを３分の１づ
つ、低、中及び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションバッファーの中で
４２℃でプレハイブリダイゼーションした（５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ
、２００μｇ／mlの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、並びに低、中及び高及び超高スト
リンジェンシーそれぞれについて２５，３５又は５０％のホルムアミド中でのプ
レハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション）。実施例１０記載のＰ 32 −ＣＴＰラベル化ｐａｌＡプローブを加え、そしてそれらのブロットを４２℃
で一夜ハイブリダイズさせた。それらのブロットを４２℃で５分、２×のＳＳＣ
、０．１のＳＤＳで２回洗浄し、そして０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで
１０分、２回洗浄した。中及び低ストリンジェンシーバッファー中でハイブリダ
イズする特定のバンドがブロット上に観察された。
【０１５１】 実施例１１：ｐａｌＡアスペルギルス・オリザゲノムクローンの単離 λＺｉｐＬｏｘ中のアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４２５ゲノムライブラリ
ーを製造者の仕様書に従って構築した。このライブラリーは６３０，０００のプ
ラーク形成単位を含み、７３％がインサートを含んだ。平均インサートサイズは
３．５kbであった。約７０００の組換ファージを大ＮＺＹプレート上のＥ．コリ
Ｙ１０９０（Life Technologies, Gaithersburg, MD)と共にまいた。これらのプ
ラークを標準のプロトコールを利用してＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルターにリフテ
ィングさせた。そのフィルターをＵＶ架橋し、そして実施例１０に記載の中スト
リンジェンシーハイブリダイゼーションバッファーの中で４２℃で１時間プレハ
イブリダイズさせた。32Ｐ−ラベル化アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＡプ
ローブを加え、そしてこのフィルターを４２℃で一夜ハイブリダイズさせた。そ
のフィルターを上記の通りに洗い、そしてＸ線フィルムに曝露させた。
ーを製造者の仕様書に従って構築した。このライブラリーは６３０，０００のプ
ラーク形成単位を含み、７３％がインサートを含んだ。平均インサートサイズは
３．５kbであった。約７０００の組換ファージを大ＮＺＹプレート上のＥ．コリ
Ｙ１０９０（Life Technologies, Gaithersburg, MD)と共にまいた。これらのプ
ラークを標準のプロトコールを利用してＨｙｂｏｎｄ Ｎ+ フィルターにリフテ
ィングさせた。そのフィルターをＵＶ架橋し、そして実施例１０に記載の中スト
リンジェンシーハイブリダイゼーションバッファーの中で４２℃で１時間プレハ
イブリダイズさせた。32Ｐ−ラベル化アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＡプ
ローブを加え、そしてこのフィルターを４２℃で一夜ハイブリダイズさせた。そ
のフィルターを上記の通りに洗い、そしてＸ線フィルムに曝露させた。
【０１５２】 ２つの陽性クローンが得られた。その陽性クローンを拾い、そして１mlのＳＭ
バッファーで溶出させた。この溶出液を１０4 希釈し、そして５０又は１００μ
ｌのアリコートを大ＮＺＹプレート上でＥ．コリＹ１０９０と共にまいた。この
プラークをリフティングし、そして上記の通りにフィルターを処理した。各プレ
ートから一つの精製陽性プラークが単離された。プラスミドＤＮＡをその陽性ク
ローンから、用意されたプロトコール（Life Technologies, Inc., Gaithersbur
g, MD)に従い、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂと共にまくことにより切り出した。
バッファーで溶出させた。この溶出液を１０4 希釈し、そして５０又は１００μ
ｌのアリコートを大ＮＺＹプレート上でＥ．コリＹ１０９０と共にまいた。この
プラークをリフティングし、そして上記の通りにフィルターを処理した。各プレ
ートから一つの精製陽性プラークが単離された。プラスミドＤＮＡをその陽性ク
ローンから、用意されたプロトコール（Life Technologies, Inc., Gaithersbur
g, MD)に従い、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂと共にまくことにより切り出した。
【０１５３】 実施例１２：ｐａｌＡアスペルギルス・オリザゲノムクローンの分析 プラスミドＤＮＡを実施例１１記載の２つの陽性クローン（ｐａｌＡ５Ａ及び
ｐａｌＡ６Ａ）から、Qiaquick Prep 8 キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を利
用して単離した。そのプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、それがインサート
を含むか確めた。ゲノムクローンの部分ヌクレオチド配列決定をApplied Biosys
tems Model 377 XL 自動ＤＮＡシーケンサーＭ１３を用い、フォワード及びリバ
ースプライマーを用いて実施した。この部分配列決定はこれらのクローンがアス
ペルギルス・オリザｐａｌＡホモログを含むことを証明した。最大のクローンｐ
ａｌＡ５Ａのヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ配列決定はApplied Biosyste
ms Model 377 XL 自動ＤＮＡシーケンサーで色素−ターミネーター化学により行
った。コンティグ配列をトランスポゾン挿入戦略を利用して作った（Primer Isl
and Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster Cit
y, CA)。ｐａｌＡ５Ａの２．９kbのインサートを５．３の平均冗長と配列決定さ
れた。
ｐａｌＡ６Ａ）から、Qiaquick Prep 8 キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を利
用して単離した。そのプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、それがインサート
を含むか確めた。ゲノムクローンの部分ヌクレオチド配列決定をApplied Biosys
tems Model 377 XL 自動ＤＮＡシーケンサーＭ１３を用い、フォワード及びリバ
ースプライマーを用いて実施した。この部分配列決定はこれらのクローンがアス
ペルギルス・オリザｐａｌＡホモログを含むことを証明した。最大のクローンｐ
ａｌＡ５Ａのヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ配列決定はApplied Biosyste
ms Model 377 XL 自動ＤＮＡシーケンサーで色素−ターミネーター化学により行
った。コンティグ配列をトランスポゾン挿入戦略を利用して作った（Primer Isl
and Transposition Kit, Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Inc., Foster Cit
y, CA)。ｐａｌＡ５Ａの２．９kbのインサートを５．３の平均冗長と配列決定さ
れた。
【０１５４】 ｐａｌＡ５Ａクローンのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）はｐａ
ｌＡの部分クローンが単離され、アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＢ遺伝子
（Negrete-Urtasun ら、1997、前掲）に対する相同性に基づきｐａｌＡの最後の
約２４５個のアミノ酸をコードするＤＮＡを欠いていた。部分ヌクレオチド配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
を図７に示す。ｐａｌＡ遺伝子は５４９個のアミノ酸のポリペプチドをコードす
る２８５５bpのオープンリーディングフレームをコードする。このオープンリー
ディングフレームには４個のイントロンが介在し、それらの位置はアスペルギル
ス・ニドゥランス及びアスペルギルス・オリザクローン間で厳密に保存されてい
た。
ｌＡの部分クローンが単離され、アスペルギルス・ニドゥランスｐａｌＢ遺伝子
（Negrete-Urtasun ら、1997、前掲）に対する相同性に基づきｐａｌＡの最後の
約２４５個のアミノ酸をコードするＤＮＡを欠いていた。部分ヌクレオチド配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
を図７に示す。ｐａｌＡ遺伝子は５４９個のアミノ酸のポリペプチドをコードす
る２８５５bpのオープンリーディングフレームをコードする。このオープンリー
ディングフレームには４個のイントロンが介在し、それらの位置はアスペルギル
ス・ニドゥランス及びアスペルギルス・オリザクローン間で厳密に保存されてい
た。
【０１５５】 部分アスペルギルス・オリザＰａｌＡ推定アミノ酸配列とその他のＰａｌＡア
ミノ酸配列との対比アラインメントをClustal 法（Higgins, 1989, CABIOS 5 :
151-153)を利用し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥTM ＭＥＧＡＬＩＧＮTMソフトウェア（
DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用い、アイデンティティーテーブル及び下記の
多重アラインメントパラメーターで行った：１０のギャップペナルティー及び１
０のギャップ長ペナルティー。対合アラインメントパラメーターはＫｔｕｐｌｅ
＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナルス＝５とし
た。
ミノ酸配列との対比アラインメントをClustal 法（Higgins, 1989, CABIOS 5 :
151-153)を利用し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥTM ＭＥＧＡＬＩＧＮTMソフトウェア（
DNASTAR, Inc., Madison, WI）を用い、アイデンティティーテーブル及び下記の
多重アラインメントパラメーターで行った：１０のギャップペナルティー及び１
０のギャップ長ペナルティー。対合アラインメントパラメーターはＫｔｕｐｌｅ
＝１、ギャップペナルティー＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナルス＝５とし
た。
【０１５６】 対比アラインメントは部分アスペルギルス・オリザＰａｌＡタンパク質（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）がアスペルギルス・ニドゥランスＰａｌＡタンパク質（Ne
grete-Urtasun ら、1997、前掲）と８８％の同一性を共有することを示した。
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）がアスペルギルス・ニドゥランスＰａｌＡタンパク質（Ne
grete-Urtasun ら、1997、前掲）と８８％の同一性を共有することを示した。
【０１５７】 実施例１３：アスペルギルス・オリザ株におけるｐａｌＡの欠失 ６００pbのｐａｌＡオープンリーディングフレームがｐｙｒＧ遺伝子で置き換
えらえたプラスミドｐＢＭ８を構築した。
えらえたプラスミドｐＢＭ８を構築した。
【０１５８】 ２つの独立のｐａｌＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためにデザインした以下の
合成オリゴヌクレオチドプライマーをApplied Biosystems Model 394 DNA/RNAシ
ンセサイザーにより、製造者の仕様書に従って合成した。第一セットはＸｈｏＩ
部位を付加するためにデザインされた５′プライマー及びＨｉｎｄIII 部位を付
加するための３′プライマーを有する。
合成オリゴヌクレオチドプライマーをApplied Biosystems Model 394 DNA/RNAシ
ンセサイザーにより、製造者の仕様書に従って合成した。第一セットはＸｈｏＩ
部位を付加するためにデザインされた５′プライマー及びＨｉｎｄIII 部位を付
加するための３′プライマーを有する。
【化４】
【０１５９】 第二セットはＨｉｎｄIII 部位を付加するためにデザインされた５′プライマ
ー及びＮｏｔＩ部位を付加するための３′プライマーを有する。
ー及びＮｏｔＩ部位を付加するための３′プライマーを有する。
【化５】 太字はコード配列を表わす。
【０１６０】 ＰＣＲ反応体を５０ngのｐａｌＡ５Ａ ＤＮＡ鋳型、５０pmole づつのプライ
マー、並びに２mMのＭｇＳＯ4 入りの１×ＰＣＲバッファー（Boehringer Mannh
eim)、１mMのｄＮＴＰ及び２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehring
er Mannheim)を含む１００μｌの容量で用意した。反応はEricomp Twin Block S
ystem Easy Cycler で９５℃で５分のサイクルを１回、９５℃で１分、５５℃で
１分及び７２℃で１．５分のサイクルをそれぞれ３０回、並びに９５℃で１分、
５５℃で１分及び７２℃で３分のサイクルを１回にプログラミングしてサイクル
に委ねた。
マー、並びに２mMのＭｇＳＯ4 入りの１×ＰＣＲバッファー（Boehringer Mannh
eim)、１mMのｄＮＴＰ及び２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehring
er Mannheim)を含む１００μｌの容量で用意した。反応はEricomp Twin Block S
ystem Easy Cycler で９５℃で５分のサイクルを１回、９５℃で１分、５５℃で
１分及び７２℃で１．５分のサイクルをそれぞれ３０回、並びに９５℃で１分、
５５℃で１分及び７２℃で３分のサイクルを１回にプログラミングしてサイクル
に委ねた。
【０１６１】 容量１０μｌのＰＣＲ反応体を１．０％のアガロースゲルで１００ボルトで１
時間電気泳動した。プライマーセット１由来の〜１１００bp及びプライマーセッ
ト２由来の〜７３０bpの主要産物をゲルから切り出し、そしてQiaquick Gel Ext
ration Kitを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を次にプラスミドｐＣＲ２．
１−ＴＯＰＯ（Invitrogen, San Diego, CA)にクローニングし、そしてＴＯＰ
１０細胞（Invitrogen, San Diego, CA)にその製造者の仕様書に従って形質転換
した。
時間電気泳動した。プライマーセット１由来の〜１１００bp及びプライマーセッ
ト２由来の〜７３０bpの主要産物をゲルから切り出し、そしてQiaquick Gel Ext
ration Kitを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を次にプラスミドｐＣＲ２．
１−ＴＯＰＯ（Invitrogen, San Diego, CA)にクローニングし、そしてＴＯＰ
１０細胞（Invitrogen, San Diego, CA)にその製造者の仕様書に従って形質転換
した。
【０１６２】 ２つのクローンが得られ、１１００bpインサートについてはＥ．コリｐＰａｌ
Ａ１と、そして７３０bpインサートについてはＥ．コリｐＰａｌＡ２と命名した
。この２つのクローンをPerkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 Sequence
r XLを利用し、色素−ターミネーター化学並びにｌａｃフォワード及びｌａｃリ
バース配列決定プライマーを用いて配列決定した。
Ａ１と、そして７３０bpインサートについてはＥ．コリｐＰａｌＡ２と命名した
。この２つのクローンをPerkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 Sequence
r XLを利用し、色素−ターミネーター化学並びにｌａｃフォワード及びｌａｃリ
バース配列決定プライマーを用いて配列決定した。
【０１６３】 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ−をＨｉｎｄIII で消化し、そしてクレノウフ
ラグメントで処理して平滑末端を構築した。このＤＮＡを調製ゲルで電気泳動し
、そして切断プラスミドＤＮＡを含むバンドを切り出した。そのＤＮＡをQiaqui
ck Gel Extraction Kit を用いてゲルから単離した。次にそのプラスミドをライ
ゲーションしてＥ．コリＤＨ５αに形質転換させ、そしてプラスミドＤＮＡをい
くつかのコロニーから単離した。これらのクローンをＨｉｎｄIII による制限消
化によりＨｉｎｄIII の不在についてスクリーニングした。ＨｉｎｄIII 部位の
欠失したクローンをｐＢＭ１ａと命名した（図８）。ｐＢＭ１ａ由来のプラスミ
ドＤＮＡをQiaguick Prep 8 プロトコール（Qiagen, Chatsworth, CA）を利用し
て調製した。ｐＢＭ１ａを０．５μｌのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（μｌ当り１０Ｕ
づつ）で消化した。ｐＰａｌＡ１を０．５μｌのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（μｌ当
り１０Ｕづつ）で消化した。その消化したＤＮＡを１％のアガロースゲルで１時
間、１００ボルトで電気泳動した。ｐＰａｌＡ１の１１００bpのフラグメント、
ｐＰａｌＡ２の７３０bpのフラグメント及びｐＢＭ１ａの２．９kbのフラグメン
トをゲルから切り出し、そして２００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁し
た。３つのＤＮＡフラグメントを順に互いとライゲーションさせ、そしてＥ．コ
リＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させた。得られるプラスミドをｐＢＭ７
と命名した（図９）。
ラグメントで処理して平滑末端を構築した。このＤＮＡを調製ゲルで電気泳動し
、そして切断プラスミドＤＮＡを含むバンドを切り出した。そのＤＮＡをQiaqui
ck Gel Extraction Kit を用いてゲルから単離した。次にそのプラスミドをライ
ゲーションしてＥ．コリＤＨ５αに形質転換させ、そしてプラスミドＤＮＡをい
くつかのコロニーから単離した。これらのクローンをＨｉｎｄIII による制限消
化によりＨｉｎｄIII の不在についてスクリーニングした。ＨｉｎｄIII 部位の
欠失したクローンをｐＢＭ１ａと命名した（図８）。ｐＢＭ１ａ由来のプラスミ
ドＤＮＡをQiaguick Prep 8 プロトコール（Qiagen, Chatsworth, CA）を利用し
て調製した。ｐＢＭ１ａを０．５μｌのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（μｌ当り１０Ｕ
づつ）で消化した。ｐＰａｌＡ１を０．５μｌのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ（μｌ当
り１０Ｕづつ）で消化した。その消化したＤＮＡを１％のアガロースゲルで１時
間、１００ボルトで電気泳動した。ｐＰａｌＡ１の１１００bpのフラグメント、
ｐＰａｌＡ２の７３０bpのフラグメント及びｐＢＭ１ａの２．９kbのフラグメン
トをゲルから切り出し、そして２００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁し
た。３つのＤＮＡフラグメントを順に互いとライゲーションさせ、そしてＥ．コ
リＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させた。得られるプラスミドをｐＢＭ７
と命名した（図９）。
【０１６４】 プラスミドｐＪａｌ３９４由来のＤＮＡを１μｌのＨｉｎｄIII(μｌ当り１０
Ｕ）で消化した。この消化したＤＮＡを０．７％のアガロースゲルで１時間１０
０Ｖで電気泳動し、３５３９bpのバンドが得られた。この３５３９bpフラグメン
トをゲルから切り出し、そして２００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁し
た。
Ｕ）で消化した。この消化したＤＮＡを０．７％のアガロースゲルで１時間１０
０Ｖで電気泳動し、３５３９bpのバンドが得られた。この３５３９bpフラグメン
トをゲルから切り出し、そして２００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁し
た。
【０１６５】 プラスミドｐＢＭ７由来のプラスミドを１μｌのＨｉｎｄIII(μｌ当り１０Ｕ
）で消化した。ＨｉｎｄIII を６５℃で１０分かけて熱不活性化し、次いでシュ
リンプ・アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN
）を用い、その製造者の提案に従い脱リン酸化処理した。その消化したＤＮＡを
０．７％のアガロースゲルで１時間、１００ボルトで電気泳動し、３６３０bpの
バンドが得られた。その３６３０bpのフラグメントをゲルから切り出し、そして
３００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁した。その２つのＤＮＡフラグメ
ントをライゲーションし、そしてＥ．コリＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換
した。得られるクローンをｐＢＭ８と命名した（図１０）。
）で消化した。ＨｉｎｄIII を６５℃で１０分かけて熱不活性化し、次いでシュ
リンプ・アルカリ性ホスファターゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN
）を用い、その製造者の提案に従い脱リン酸化処理した。その消化したＤＮＡを
０．７％のアガロースゲルで１時間、１００ボルトで電気泳動し、３６３０bpの
バンドが得られた。その３６３０bpのフラグメントをゲルから切り出し、そして
３００μｌの１０mMのトリスpH７．５に再懸濁した。その２つのＤＮＡフラグメ
ントをライゲーションし、そしてＥ．コリＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換
した。得られるクローンをｐＢＭ８と命名した（図１０）。
【０１６６】 ｐＢＭ８の欠失フラグメントの単離のため、このプラスミドをＮｏｔＩ及びＸ
ｈｏＩで消化し、そしてその消化物を調製ゲルで電気泳動した。５．３kb欠失フ
ラグメントがQiaquick Gel Extraction Kit を用いてゲルから単離された。実施
例１に記載の通りにして調製したアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０プロト
プラストをこのフラグメントで形質転換し、最少培地プレートで選別にかけた。
全部で９３個の形質転換体が得られた。これらの形質転換体をpH８．０最少培地
プレート上でｐａｌマイナス表現型について試験した。この９３のうちの３つは
pH８．０で増殖不能であった。サザン分析はこの３つの株が完全な中断体である
ことを確証せしめた。
ｈｏＩで消化し、そしてその消化物を調製ゲルで電気泳動した。５．３kb欠失フ
ラグメントがQiaquick Gel Extraction Kit を用いてゲルから単離された。実施
例１に記載の通りにして調製したアスペルギルス・オリザＨｏｗＢ４３０プロト
プラストをこのフラグメントで形質転換し、最少培地プレートで選別にかけた。
全部で９３個の形質転換体が得られた。これらの形質転換体をpH８．０最少培地
プレート上でｐａｌマイナス表現型について試験した。この９３のうちの３つは
pH８．０で増殖不能であった。サザン分析はこの３つの株が完全な中断体である
ことを確証せしめた。
【０１６７】 実施例１４：アスペルギルス・オリザΔｐａｌＡ株の細胞外プロテアーゼの産生 実施例１３に記載の２種類のアスペルギルス・オリザｐａｌＡプラス及び２種
類のアスペルギルス・オリザｐａｌＡマイナス株を実施例８に記載の通りにして
２リットルの発酵槽の中で３４℃で８日間増殖させた。６日目のサンプルの総細
胞外プロテアーゼ活性を実施例８記載のＦＴＣ−カゼインアッセイを利用して決
定した。
類のアスペルギルス・オリザｐａｌＡマイナス株を実施例８に記載の通りにして
２リットルの発酵槽の中で３４℃で８日間増殖させた。６日目のサンプルの総細
胞外プロテアーゼ活性を実施例８記載のＦＴＣ−カゼインアッセイを利用して決
定した。
【０１６８】 以下の表５に示す結果は、アスペルギルス・オリザｐａｌＡマイナス株の細胞
外プロテアーゼレベルがアスペルギルス・オリザｐａｌＡプラス株により産生さ
れるレベルの約１０分の１であったことを示す。
外プロテアーゼレベルがアスペルギルス・オリザｐａｌＡプラス株により産生さ
れるレベルの約１０分の１であったことを示す。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】 微生物材料の寄託 下記の生物材料をブダペスト条約に従い、Agricultural Research Service Pa
tent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), Peori
a, Illinois に寄託し、下記の受託番号が付与されている： 寄託 受託番号 寄託日 E.コリ HB101 pDSY109 NRRL B-21623 1996年９月５日 E.コリ XL-1Blue pDSY174 NRRL B-30089 1999年１月28日
tent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), Peori
a, Illinois に寄託し、下記の受託番号が付与されている： 寄託 受託番号 寄託日 E.コリ HB101 pDSY109 NRRL B-21623 1996年９月５日 E.コリ XL-1Blue pDSY174 NRRL B-30089 1999年１月28日
【０１７１】 これらの株は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２のも
とで米国特許庁長官により認定された者に当該特許出願の係属中に容易に入手で
きることを保障する条件下で寄託してある。この寄託物は寄託株の実質的に純粋
な培養物である。
とで米国特許庁長官により認定された者に当該特許出願の係属中に容易に入手で
きることを保障する条件下で寄託してある。この寄託物は寄託株の実質的に純粋
な培養物である。
【配列表】
【図１】 アスペルギルス・オリザｐａｌＢ遺伝子のゲノム核酸配列及び推定アミノ酸配
列を示す（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２）。
列を示す（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及び２）。
【図２】 ｐＪａｌ４００の制限地図を示す。
【図３】 ｐＭＴ１９３５の制限地図を示す。
【図４】 ｐＪａｌ３９４の制限地図を示す。
【図５】 ｐＭＴ１９３１の制限地図を示す。
【図６】 ｐＭＴ１９３６の制限地図を示す。
【図７】 アスペルギルス・オリザｐａｌＡ遺伝子の部分ゲノム核酸配列及び推定アミノ
酸配列を示す（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４）。
酸配列を示す（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４）。
【図８】 ｐＢＭ１ａの制限地図を示す。
【図９】 ｐＢＭ７の制限地図を示す。
【図１０】 ｐＢＭ８の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/00 9/10 9/02 9/14 9/10 9/88 9/14 9/90 9/88 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/90 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA01 BA07 BA61 BA63 CA02 DA11 4B050 CC03 EE03 4B064 AG01 CA19 CC07 4B065 AA58X AA72X AB01 AC14 BC02 CA24 CA27 4H045 AA10 DA30 DA50 DA75 DA89 FA74
Claims (29)
- 【請求項１】 ポリペプチドを生産する方法であって： （ａ）親真菌細胞の突然変異体を培養し、ここで当該突然変異細胞はｐａｃＣ
pHシグナル変換経路の１もしくは複数の遺伝子の修飾を含んで成る第一核酸配列
と、前記ポリペプチドをコードする第二核酸配列と含んで成り；そして （ｂ）当該ポリペプチドを培養培地から単離する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記ｐａｃＣpHシグナル変換経路の１もしくは複数の遺伝子
がｐａｌＡ，ｐａｌＢ，ｐａｌＣ，ｐａｌＦ，ｐａｌＨ及びｐａｌＩ；並びにそ
れらの相同体から成る群から選ばれる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記遺伝子がｐａｌＡ遺伝子である、請求項１記載の方法。
- 【請求項４】 前記遺伝子がｐａｌＢ遺伝子である、請求項１記載の方法。
- 【請求項５】 前記遺伝子がｐａｌＣ遺伝子である、請求項１記載の方法。
- 【請求項６】 前記遺伝子がｐａｌＦ遺伝子である、請求項１記載の方法。
- 【請求項７】 前記遺伝子がｐａｌＩ遺伝子である、請求項１記載の方法。
- 【請求項８】 前記ポリペプチドが前記真菌細胞に対して天然又は異種のも
のである、請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 前記真菌細胞が糸状菌細胞又は酵母細胞である、請求項１記
載の方法。 - 【請求項１０】 前記糸状菌細胞がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕｒ
ｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フ
ィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
）、ジッベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒュミコウ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、
マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリ
オフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニュー
ロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃ
ｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍ
ｙｃｅｓ）、シゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シエ
ラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕ
ｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である、請求項１記載の
方法。 - 【請求項１１】 前記酵母細胞がカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ
（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）
、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤロ
ウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である、請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 前記突然変異体が１又は複数のプロテアーゼを、同一条件
で培養した親真菌細胞よりも少ない量で産生する、請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 前記１又は複数のプロテアーゼがエキソペプチダーゼ又は
エンドペプチダーゼである、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 前記１又は複数のプロテアーゼがエキソペプチダーゼ及び
エンドペプチダーゼである、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 前記エキソペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼがセリン
プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ又はシステイ
ンプロテアーゼである、請求項１３又は１４記載の方法。 - 【請求項１６】 前記突然変異細胞が同一条件下で培養した親細胞よりも少
なくとも約２５％少ない量で前記１又は複数のプロテアーゼを産生する、請求項
１２〜１５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１７】 前記突然変異細胞がプロテアーゼを産生しない、請求項１
２〜１６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 前記突然変異真菌細胞が前記第二核酸配列のコピーを少な
くとも２つ含んで成る、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１９】 前記ポリペプチドがホルモン、ホルモン変異体、酵素、レ
セプターもしくはその一部、抗体もしくはその一部、又はリポーターである、請
求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２０】 前記酵素がオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、
ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである、請求項１９記載の
方法。 - 【請求項２１】 前記酵素がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒド
ラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチ
ナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌク
レアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ
、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキ
シダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノール
オキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナー
ゼ又はキシラナーゼである、請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 前記突然変異細胞が更に１又は複数のｐａｃＣ遺伝子の２
以上のコピーを含んで成る、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２３】 前記突然変異細胞が更に１又は複数の第三核酸配列の１又
は複数の修飾を含んで成り、ここで当該修飾は当該１又は複数の第三核酸配列の
発現を抑制又は消失させるものである、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項２４】 前記第三核酸配列がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カ
ルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナー
ゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシ
リボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラ
クトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコ
シダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナー
ゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフ
ェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグル
タミナーゼ又はキシラナーゼから成る群から選ばれる酵素をコードする、請求項
２３記載の方法。 - 【請求項２５】 請求項１〜２４のいずれか１項記載の方法により生産され
たポリペプチド。 - 【請求項２６】 真菌細胞のプロテアーゼ欠陥突然変異体であって、ｐａｃ
ＣpHシグナル変換経路の１又は複数の遺伝子の修飾を含んで成る第一核酸配列と
ポリペプチドをコードする第二核酸配列とを含んで成り、ここで当該突然変異細
胞は当該１又は複数のプロテアーゼを同一条件下で培養したこの突然変異体の親
真菌細胞よりも少ない量で産生する、突然変異細胞。 - 【請求項２７】 前記ポリペプチドが前記突然変異細胞にとって天然又は異
種なものである、請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の核酸配列を含んで成る単離され
た核酸配列。 - 【請求項２９】 Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＮＲＲＬ Ｂ−３００８９の中
に含まれるプラスミドｐＤＳＹ１７４に含まれている、請求項２８記載の核酸配
列。
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