FI119437B - Ei-toksinen, ei-toksigeeninen, ei-patogeeninen Fusarium-ekspressiojärjestelmä ja siinä käytettäviä promoottereita ja terminaattoreita - Google Patents

Description

f 1 1 9437

Ei-toksinen, ei-toksigeeninen, ei-patogeeninen Fusarium-ekspressiojärjestelmä ja siinä käytettäviä promoottoreita ja terminaattoreita - Icke-toxiskt, icke-toxigeniskt, icke-pa-togeniskt Fusarium-expressionssystem och promotorer och ter-5 minatorer för användning däri 1. Keksinnön ala

Keksintö koskee isäntäsoluja, jotka ovat käyttökelpoisia yh-10 distelmä-DNA-proteiinien tuotannossa. Erityisesti, keksintö koskee ei-toksisia, ei-toksigeenisiä ja ei-patogeenisiä Fusarium-sieni-isäntäsoluja, joita voidaan käyttää yhdistel-mä-DNA-proteiinien, erityisesti entsyymien korkeatasoisessa ekspressiossa. Edelleen keksintö koskee promoottori- ja ter-15 minaattorisekvenssejä, joita voidaan käyttää sellaisessa järjestelmässä.

2. Keksinnön tausta

Yhdistelmä-DNA-isäntäsolujen käyttö heterologisten proteii-20 nien ekspressiossa on viime vuosina yksinkertaistanut huo-. mattavasti kaupallisesti arvokkaiden proteiinien suurten • φ ***. määrien tuotantoa, joita kaupallisesti arvokkaita proteiine- * · · • ** ja on muuten saatavissa vain puhdistamalla luontaisista läh- • · · *· · teistään. Nykyisin on olemassa vaihteleva valikoima ekspres- • · · : 25 siojärjestelmiä, joista voidaan valita minkä hyvänsä määrä- Φ tyn proteiinin tuotantoon, mukaan lukien prokaryoottisia ja : eukaryoottisia isäntiä. Usein sopivan ekspressiojärjestelmän valinta ei riipu vain isäntäsolun kyvystä tuottaa aktiivi-ϊ\. sessa tilassa olevan proteiinin riittäviä saantoja, vaan se 30 voi suuressa määrin riippua myös proteiinin aiotusta lopul- * · · 119437 2 sellaisissa prosesseissa, ovat Neurospora orassa, Acremonium chrysogenum, Tolypocladium geodes, Mucor circinelloides ja Trichoderma reesei, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ja Aspergillus oryzae.

5 Määrättyjä Fusarium-suvun lajeja on käytetty mallijärjestel-minä kasvipatogeenisuuden ja geenisäätelyn tutkimiseen, kuten Fusarium oxysporum'ia (Diolez et ai., 1993, Gene 131:61-67; Langin et ai., 1990, Curr. Genet 17:313-319; Malardier 10 et ai., 1989, Gene 78:147-156 ja Kistler ja Benny, 1988,

Curr. Genet. 13:145-149), Fusarium solani'a (Crowhurst et ai., 1992, Curr. Genet. 21:463-469), ja Fusarium culmorum'ia (Curragh et ai., 1992, Mycol. Res. 97:313-317). Nämä Fusa-rium-lajit eivät olisi kaupallisesti sopivia heterologisten 15 proteiinien tuotantoon johtuen niiden ei-toivottavista ominaispiirteistä kuten että ne ovat kasvipatogeenejä tai koska ne tuottavat ei-turvalliset tasot mykotoksiinia. Dickman ja Leslie (1992, Mol. Gen. Genet. 235:458-462) kuvaavat Gibbe-rella zeae'n transformoinnin plasmidin, joka sisältää Neuro-20 spora crassa'n nit-2:n. Dickman'in ja Leslie'n kuvaama Gib- • ·, berella zeae-kanta on kasvipatogeeni ja tuottaa tsearaleno- • · nia, estrogeenistä mykotoksiinia. Sanchez-Fernandez et ai.

• · · * * (1991, Mol. Gen. Genet. 225:231-233) kuvaa niaD-mutaation • · · *· · sisältävän Gibberella fujikoroi'n transformoinnin plasmidil- • * * ί.: · 25 la, joka sisältää Aspergillus niger'in niaD-geenin.

« • * · • · * * · · ··» ϊ.ί · Eräs ihanteellinen ekspressiojärjestelmä on sellainen, joka on oleellisen vapaa proteaasin ja mykotoksiinin tuotannosta, myös oleellisen vapaata muiden endogeenisesti tehtyjen eri-3 0 tettyjen proteiinien suurista määristä, ja joka kykenee kor-[· > keampiin ekspressiotasoihin kuin tunnetut isäntäsolut. Nyt * i < *· 'ϊ keksintö now aikaansaa uusia Fusarium-ekspressiojärjestel- ««· miä, jotka täyttävät nämä vaatimukset.

• · • * * m m · »·· · ,·. ; 35 3. Keksinnön yhteenveto • ··

Keksintö aikaansaa ei-toksisen, ei-toksigeenisen ja ei-pato-geenisen yhdistelmä-DNA-Fusarium-isäntäsolun, joka käsittää 119437 3 promoottoriin toimintakykyisesti liittyneenä nukleiinihappo-sekvenssin, joka koodittaa heterologista proteiinia. Tässä määriteltynä "ei-toksinen" tarkoittaa, että isäntäsolu ei vaikuta kuten myrkky kasveihin tai eläimiin. Esimerkiksi, 5 Fusarium-isäntäsolua pidettäisiin ei-toksisena, jos, noin 14 päivää sen jälkeen kun noin 5 hiirtä on injisoitu annoksella noin 20 ml (laimennettu 1:1) 3 päivää vanhaa Fusarium-kasva-tusväliainetta/kg kehonpaino/hiiri, yksikään hiiristä ei kuolisi Fusarium-käsittelyn seurauksena. Tässä määriteltynä 10 "ei-toksigeeninen" tarkoittaa, että isäntäsolut ovat oleellisen vapaita mykotoksiinista määritettynä analyyttisillä vakiomenetelmillä kuten HPLC-analyysillä. Esimerkiksi, Fusa-rium-määrä, jota on kasvatettu 2 x 9-cm:isillä petrimaljoilla, jotka sisältävät kiinteää ravintoväliainetta, voidaan 15 uuttaa orgaanisilla liuottimilla, ja 0,5 % uutteesta voidaan injisoida HPLC:hen analyysiä varten. Tunnettujen mykotoksii-nien puuttuminen osoitetaan havaittavien HPLC-huippujen puuttumisella asemissa, jotka tunnetaan mykotoksiinistandar-deille. Tässä määriteltynä "ei-patogeeninen" tarkoittaa, 20 että isäntäsolut eivät aiheuta merkittävää sairautta terveissä kasveissa tai terveissä eläimissä. Esimerkiksi, Fusa-*···] rium-lajilla, joka on patogeeninen kasveille, voidaan nähdä **.*·ί sienen hyökkäystä kasvin puuaineen kimppuun ja seurauksena * * ·.* : sairaustila, jolle ovat tunnusomaisia tyypilliset lakastu-

Ip· · 25 misoireet. Tässä määriteltynä "heterologinen proteiini" on : :*: proteiini, joka ei ole isäntäsolulle luontainen, tai luon- • · · .*·*; täinen proteiini, johon on tehty modifikaatioita luontaisen sekvenssin muuttamiseksi, tai luontainen proteiini, jonka ekspressio on kvantitatiivisesti muuttunut luontaisen prote- • »» *... 3 0 iinin ekspressioon vaaditun luontaisen säätelysekvenssin, • * * • · · *, kuten promoottorin, ribosominkiinnittymiskohdan, tai vastaa- • · V*i vien käsittelyn seurauksena, tai isäntäsolun muun yhdistel- t" : mä-DNA-tekniikoilla tapahtuvan käsittelyn seurauksena. Nuk- • · · . leiinihapposekvenssi on toimintakykyisesti liittynyt sopi- • · * I 35 vaan promoottorisekvenssiin, joka pystyy ohjaamaan nukle-• · · 1 * iinihapposekvenssin transkriptiota valitussa isäntäsolussa.

119437 4

Keksintö koskee myös menetelmää yhdistelmä-DNA-proteiinien tuottamiseksi, jossa menetelmässä kasvatetaan yhtä edellä mainituista lajeista olevaa isäntäsolua, joka sisältää nuk-leiinihapposekvenssin, joka koodittaa heterologista proteii-5 nia, oloissa, jotka vaikuttavat proteiinin ekspressioon, ja otetaan proteiini talteen viljelmästä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa proteiini on sieniproteiini, edullisimmin sienientsyymi. Keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä tuotetaan ainakin noin 0,5 g heterologista proteiinia/1 10 isäntäsolua.

Keksinnön mukainen isäntäsolu erittää odottamattomasti vain alhaiset määrät proteaasia määritettynä kaseiinikirkastus-määrityksellä, joka kuvataan kappaleessa 6.1, alla; erityi-15 sesti havaitaan vain pienet hydrolyysivyöhykkeet, tai ei lainkaan. Keksinnön mukaiset isäntäsolut ja menetelmät ovat odottamattomasti tehokkaampia määrättyjen sienientsyymien yhdistelmä-DNA-tuotannossa kuin mikään muu tunnettu sienilaji, kuten Aspergillus niger, Aspergillus oryzae tai Fusarium 2 0 oxysporum.

• ♦ • · *]*. Lisäksi keksintö koskee promoottorisekvenssiä, joka on joh- • ·· I * dettu geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in tryp- * · ♦ * .* siinimäistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on oleel- • · · ί·· · 25 lisesti sama promoottoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvens- sillä. Promoottorin sekvenssi esitetään in SEQ ID NO:5:ssä.

I»· • · · • « · •

Lisäksi keksintö koskee terminaattorisekvenssiä, joka on johdettu geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in 30 trypsiinimäistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on .* . oleellisesti sama terminaattoriaktiivisuus kuin mainitulla « · «

*· 1 sekvenssillä. Terminaattorin sekvenssi esitetään SEQ ID

• · * ^ | ♦ ···* NO: 6 : ssa.

• * t · · • · * • » · · ·*·.· 35 4. Piirrosten lyhyt kuvaus • *

Kuviossa 1 esitetään SDS-geeli eritetyistä proteiineista Fusarium graminearum'issa (linja 1); Aspergillus niger'issä 119437 5 (linja 2) ja Aspergillus oryzae'ssa (linja 3). Linjassa 4 esitetään molekyylimassamerkit.

Kuviossa 2 esitetään proteaasimäärityksen tulokset seuraa-5 villa näytteillä: Aspergillus oryzae (kaivo 1); Aspergillus niger (kaivo 2); Fusarium graminearum (kaivo 3); kaivojen tyhjät kontrollit (kaivot 4 - 6).

Kuviossa 3 esitetään plasmidin pJRoyö konstruointi.

10

Kuviossa 4 esitetään SDS-PAGE-analyysi trypsiinityyppisen proteaasin (SP387) erityksestä F. graminearum 20334:n trans-formantissa. Linja 1: molekyylimassamerkit; linja 2: tyhjä: linja 3: puhdistetun trypsintyyppisen proteaasiproteiinin 15 standardi; linja 4: tyhjä; linja 5: F. graminearum-kanta 20334 transformoimaton; linja 6: tyhjä; linja 7: F. graminearum-kanta 20334, joka on transformoitu plasmidilla pJRoy6; linja 8: tyhjä; linja 9: molekyylimassamerkit.

20 Kuviossa 5 esitetään pJRoy20:n restriktiokartta.

• · * • · I*’. Kuviossa 6 esitetään pDM151:n restriktiokartta.

I M • · • ·

» « I

** t* Kuviossa 7 esitetään pDM155:n restriktiokartta.

• * · • * * rt ^ * 25 • · « _ M.* Kuvioissa 8A ja 8B esitetään Carezyme®:n ekspressiotaso Fu- * «· *.· ' sarium graminearum' issa kun DSM 1514 : ää f ermentoidaan Fusa rium graminearum'issa 20 - 160 tuntia. Kuviossa 8A esitetään ·*·,, Carezyme®-määrityksen tulokset. Kuviossa 8B esitetään SDS- .*!*· 3 0 PAGE-analyysi Carezyme®:n tuotannosta mainitussa Fusarium * .·, graminearum'issa. Linja 1: molekyylimassamerkit; linja 2: 20 * · * *·^* tuntia; linja 3: 50 tuntia; linja 4: 70 tuntia; linja 5: 90 • * ···* tuntia; linja 6: 120 tuntia; linja 7: 140 tuntia; linja 8: • 160 tuntia.

• ·· · : 35 • M • *

Kuvioissa 9A ja 9B esitetään Lipolase®:n ekspressiotaso kun DSM 155-10:tä fermentoidaan Fusarium graminearum'issa 20 - 119437 6 160 tuntia. Kuviossa 9A esitetään Lipolase®-määrityksen tulokset. Kuviossa 9B esitetään SDS-PAGE-analyysi Lipolase®-tuotannosta mainitussa Fusarium graminearum'issa. Linja 1: molekyylimassamerkit; linja 2: 20 tuntia; linja 3: 50 tun- 5 tia; linja 4: 60 tuntia; linja 5: 90 tuntia; linja 6: 120 tuntia; linja 7: 140 tuntia; linja 8: 160 tuntia.

Kuviossa 10 esitetään pCaHj4l8:n restriktiokartta.

10 Kuviossa 11 esitetään pDM148:n restriktiokartta.

Kuviossa 12 esitetään pDM149:n restriktiokartta.

Kuviossa 13 esitetään pMHan37:n restriktiokartta.

15

Kuviossa 14 esitetään pDM154:n restriktiokartta.

5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Fusarium'eille on tunnusomaista myseeli, jota on viljelmässä 20 runsaasti ja puuvillamaisena, ja jolla on usein jonkin ver- . ran vaaleanpunaista, purppuranpunaista tai keltaista sävyä • · *’*. kiinteällä väliaineella. Konidioforit ovat vaihtelevasti • · ♦ *· ** kapeita ja yksinkertaisia, tai paksuja, lyhyitä, epäsäännöl- • · · *· · lisesti haarautuneita, tai niissä on kiehkura talluksia ί 25 (phialides), yksinään tai ryhmittyneinä rikkoutuviksi koni- « *.·/ dioforien massoiksi (sporodochia). Konidioita on pääasialli- ί sesti kahta tyyppiä, jotka usein pysyvät pieninä kosteina tähkinä: makrokonidiot useampisoluisia, hieman käyristyneitä tai taipuneita terävissä kärjissä, tyypillisesti kanootin- * 30 muotoisia ja mikrokonidiota, jotka ovat yksisoluisia, munan- t · · [· ^ muotoisia tai suorakaiteenmuotoisia, syntyneet yksittäin tai • · *. *ί ketjuiksi. Jotkin konidiot ovat välituotteita, 2- tai 3- • · · *...· soluisia, suorakaiteenmuotoisia tai hieman käyriä.

* • · • * * ♦ · * .·, ; 3 5 Eräässä erityisessä suoritusmuodossa keksinnön mukaiset t · · isäntäsolut ovat Fusarium graminearum-kannasta, jolle ovat tunnusomaisia seuraavat ominaispiirteet. Konidiot: Mikro- 119437 7 konidiot puuttuvat. Makrokonidiot ovat selväpiirteisen vä-liseinällisiä, paksuseinäisiä, suoria/kohtuullisen sirppi-mäisiä, epäsäännöllisen käyristyneitä lähes suoralla vatsa-pinnalla ja tasaisen kaarevalla selkäpinnalla. Tyvisolu on 5 selväpiirteisen jalanmuotoinen. Kärkisolu on kartionmuotöinen tai ahtautunut kuten suukappale. Konidioforit: haaroit-tumattomia ja haaroittuneita monotalluksia. Klamydoitiöt: ovat yleensä hyvin hitaita muodostumaan viljelmässä: mikäli niitä esiintyy, niitä muodostuu useimmiten makrokonidioissa, 10 mutta niitä voi muodostua myös myseelissä. Kolonian morfologia: PDA:11a kasvu on nopeaa tiiviillä ilmamyseelillä, joka voi lähes täyttää putken ja on usein väriltään keltaista/-kullanruskeaa reunojen ollessa valkoisia/karmiininpunaisia. Punaruskeat/oranssinväriset rikkoutuvat konidioforien mas-15 sat, mikäli niitä on läsnä, ovat hajallaan kasvavia, esiintyen usein vain kun viljelmät ovat yli 30 päivää vanhoja. Alapinta on tavallisesti karmiininpunaista. Tämä sieni tuottaa "Discolor"-osaston kaikista lajeista eniten sylinteri-mäisiä (selkä- ja vatsapinnat samansuuntaiset) makrokoni-20 dioita.

• · ^

Eräässä erityisimmässä suoritusmuodossa Fusarilon graminea- • · *.'·· rum on Fusarium graminearum Schwabe IMI 145425, joka on :*· ί talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen the American • · : 25 Type Culture Collection tulonumerolla ATCC 20334 (US-patent- ·*· · , tijulkaisu 4,041,189), samoin kuin johdannaisia ja mutantte- • · · ja, jotka ovat samalla lailla ei-toksisia, ei-toksigeenisiä ja ei-patogeenisiä, esimerkiksi niitä, jotka esitetään US-patenttijulkaisussa 4,041,189.

: ·..

30 ·· * • · · *·] Ymmärretään, että koko selityksessä ja patenttivaatimuksissa paitsi että käsitteen "Fusamim graminearum" käyttö viittaa !***· tämän lajin organismeihin, se viittaa myös niihin lajeihin, ··· . jotka on aikaisemmin nimitetty tai nimitetään nykyisin muik- • · · • · · *** * 35 si lajeiksi vaihtoehtoisissa luokittelukaavioissa, mutta Φ · *· joilla on samat edellä määritellyt morfologiset - ja kasva- tusominaispiirteet, ja voivat olla F. graminearum'in kanssa 119437 8 samanmerkityksissä. Näitä ovat mm., mutta näihin rajoittumatta, Fusarium roseum, F. roseum var. graminearum, Gibbe-rella zeae, tai Gibberella roseum, Gibberella roseum f. sp. cerealis.

5

Ammattimies ymmärtää myös, että tässä kuvatun tässä kuvatun isäntälajin menestyksekäs transformointi ei rajoitu erityisesti esimerkkeinä esitettyjen vektorien, promoottorien ja valintamarkkerien käyttöön. Yleisesti puhuen, ne tekniikat, 10 jotka ovat käyttökelpoisia F. oxysporum'in, F. solani'n ja F. culmorum'in transformoinnissa, ovat käyttökelpoisia myös keksinnön mukaisilla isäntäsoluilla. Esimerkiksi, vaikka amdS-valintamarkkeri on edullinen, muita käyttökelpoisia valintamarkkereita ovat mm. argB (A. nidulans tai A. niger), 15 trpc (A. niger tai A. nidulans), pyrG (A. niger, A. oryzae tai A. nidulans), niaD (A. nidulans, A. niger, tai F. oxysporum) , ja hygB (E. coli)-markkereita. Promoottori voi olla mikä hyvänsä DNA-sekvenssi, jolla on voimakasta transkrip-tioaktiivisuutta näissä lajeissa, ja se voi olla peräisin 20 geeneistä, jotka koodattavat sekä solunulkoisia että solun- •·. sisäisiä proteiineja, kuten amylaaseja, glukoamylaaseja, * m Γ*. proteaaseja, lipaaseja, sellulaaseja ja glykolyyttisiä ent- • · ", * syymejä. Esimerkkejä sellaisista promoottoreista ovat, mutta • · · *· näihin rajoittumatta, mm. A. nidulans'in amdS-promoottori · · ϊ·ϊ ' 25 tai glykolyyttisten entsyymien geeneistä olevat promootto- rit, esimerkiksi TPI, ADH, GAPDH, ja PGK. Promoottori voi • t* *.· · myös olla homologinen promoottori, ts. käytetylle isännälle luonnollisen geenin promoottori. Promoottorisekvenssi voi myös olla varustettu linkkereillä spesifisten restriktiokoh-3 0 tien lisäämiseksi, jotka helpottavat promoottorisekvenssin .* , liittämistä valitun geenin tai valitun signaalipeptidin tai * « · ** ’* esialueen kanssa.

t*« t : * · · • ·*; Promoottorisekvenssi voi olla johdettu geenistä, joka koo- * * · .*.J 35 dittaa Fusarium oxysporum trypsiinityyppistä proteaasia tai • * sen fragmenttia, jolla on oleellisesti sama promoottoriak-tiivisuus kuin mainitulla sekvenssillä. Promoottorin sek- 119437 9 venssi esitetään SEQ ID N0:5:ssä. Edelleen keksintö koskee nukleiinihapposekvenssejä, jotka hybridisoituvat SEQ ID N0:5:ssä esitetyn promoottorisekvenssin kanssa seuraavissa olosuhteissa: esiliotetaan 5X SSC:ssä ja esihybridisoidaan 1 5 tunnin ajan noin 40 °C:ssa liuoksessa, jossa on 20 % forma-midia, 5X Denhardt'in liuosta, 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,8, ja 50 μg denaturoitua ultraäänikäsiteltyä vasikan ka-teenkorvan DNA:ta, minkä jälkeen seuraa 18 tunnin ajan noin 40 °C:ssa hybridisointi samassa liuoksessa, jota on täyden-10 netty 100 μΜ ATP:llä, minkä jälkeen pestään 0,4X SSC:ssä lämpötilassa noin 45 °C, tai jotka ovat ainakin noin 90-%:isesti homologisia ja edullisesti noin 95-%:isesti homologisia SEQ ID NO:5:lie, mutta joilla on oleellisesti sama promoottoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvenssillä. Eräässä 15 toisessa suoritusmuodossa promoottori voi olla sekvenssi, joka käsittää suuren joukon sitoutumiskohtia AreA:lle, typ-pirajoituksen aikana ekspressöityjen geenien posiitiivinen säätelijä; näitä kohtia kutsutaan nit-2-kohdiksi Neurospora orassa'ssa (Fu ja Marzlus, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei.

20 U.S.A. 87:5331-5335). Promoottorisekvenssiä voidaan modifioida lisäämällä tai korvaamalla sellaisia AreA-kohtia.

• · % • · • · · :/.· Terminaattorit ja polyadenylointisekvenssit voivat myös olla **· : peräisin samoista lähteistä kuin promoottorit. Eräässä eri- • * . **· 25 tyisessä suoritusmuodossa terminaattorisekvenssi voi olla »·· · , peräisin geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in ·»·. trypsiinityyppistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on S · · oleellisesti sama terminaattoriaktiivisuus kuin mainitulla

sekvenssillä. Terminaattorin sekvenssi esitetään SEQ ID

•#>* 30 NO:6:ssa. Edelleen keksintö käsittää nukleiinihapposekvens- *·* * sit, jotka hybridisoituvat SEQ ID NO:6:ssa esitettyyn ter- ·*·.: minaattorisekvenssiin seuraavissa olosuhteissa: esiliuote- • · ,***· taan 5X SSC:ssä ja esihybridisoidaan 1 tunnin ajan noin 40 • * * *. °C:ssa liuoksessa, jossa on 20 % formamidia, 5X Denhardt's « · · *·* * 35 liuosta, 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,8, ja 50 μg denatu- • · · *· *! roitua ultraäänikäsiteltyä vasikan kateenkorvan DNA:ta, minkä jälkeen hybridisoidaan 18 tunnin ajan noin 40 °C:ssa 119437 10 samassa liuoksessa, jota on täydennetty 100 μΜ ATP:llä, minkä jälkeen pestään 0,4X SSC:ssä lämpötilassa noin 45 °C, tai joilla on ainakin noin 90-%:inen homologia ja edullisesti noin 95-%:inen homologia SEQ ID NO:5:lie, mutta joilla on 5 oleellisesti sama terminaattoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvenssillä.

Konstruktiin voidaan insertoida myös enhancer-sekvenssejä.

10 Jotta vältettäisiin tarve rikkoa solu ekspressöidyn tuotteen saamiseksi, ja jotta minimoitaisiin ekspressöidyn tuotteen mahdollisen hajoamisen määrä solun sisällä, on edullista, että tuote erittyy solun ulkopuolelle. Tätä varten kiinnostuksen kohteena oleva geeni liitetään eräässä edullisessa 15 suoritusmuodossa esialueeseen, kuten signaaliin tai johto-peptidiin, joka voi ohjata ekspressöidyn tuotteen solun eri-tysreittiin. Esialue voi olla peräisin minkä hyvänsä organismin minkä hyvänsä eritetyn proteiinin geeneistä, tai se voi olla luontainen esialue. Sellaisen esialueen käyttökel-20 poisia käytettävissä olevia lähteitä ovat glukoamylaasi- tai • ·, amylaasigeeni Aspergillus-lajista, amylaasigeeni Bacillus- • · !**. lajista, lipaasi- tai proteinaasigeeni Rhizomucor miehei'- * t* l ) stä, α-faktorin geeni Saccharomyces cerevisiae'sta, tai • « * • p* vasikan prokymosiinigeeni. Esialue voi olla johdettu A.

• · * *·· : 25 oryzae'n TAKA-amylaasin, A. niger'in neutraalin a-amylaasin, \.V A. niger'in happostabiilin α-amylaasin, B. licheniformis'in

• M

*.· t α-amylaasin, Bacillus NCIB 11837:stä olevan maltogeenisen amylaasin, B. stearothermophilus'in α-amylaasin tai B. licheniformis subtilisin'in geenistä. Eräs tehokas signaa-·*·*· 30 lisekvenssi on A. oryzae'n TAKA-amylaasin signaali, Rhizomu- ,* , cor miehei'n asparagiinihappoproteinaasin signaali ja Rhizo- « · « *·/ mucor miehei'n lipaasin signaali. Eräänä vaihtoehtona, voi- | · ···’ daan käyttää myös ekspressöitävälle geenille luontaista esi- ; aluetta, esimerkiksi, SEQ ID N0:4:ssä aminohappojen -24 ja • · · · .*. : 35 -5 olevaa.

* · · • · 119437 11

Halutun tuotteen geeni liitettynä toimintakykyisesti promoottori- ja terminaattorisekvensseihin voidaan sisällyttää vektoriin, joka sisältää valintamarkkerin, tai se voidaan sijoittaa erilliseen vektoriin tai plasmidiin, joka pystyy 5 integroitumaan isäntäkannan genomiin. Vaihtoehtoisesti, käytetyt vektorit voivat pystyä replikoitumaan isäntäsolussa lineaarisina tai rengasmaisina ekstrakromosomaalisina elementteinä. Näitä vektorityyppejä ovat esimerkiksi plasmidit ja minikromosomit. Vektorijärjestelmä voi olla yksi ainoa 10 vektori tai plasmidi, tai kaksi tai useampia vektoreita tai plasmideja, jotka yhdessä sisältävät kokonais-DNA:n, jonka on integroiduttava genomiin. Vektorit tai plasmidit voivat olla lineaarisia tai suljettuja rengasmaisia molekyylejä.

15 Isäntäsolu voidaan transformoida heterologista proteiinia koodittavalla nukleiinihapolla käyttämällä alalla tunnettuja menettelytapoja, kuten transformointia ja elektroporaatiota (katso esimerkiksi julkaisua: Fincham, 1989, Microbial Rev. 53:148-170).

20

Keksinnön mukaista yhdistelmä-DNA-isäntäsolua voidaan kas- vattaa alalla tunnettuja menettelytapoja käyttämällä. Lyhy- esti, isäntäsoluja kasvatetaan standardikasvatusväliaineel- .** · la, kuten sellaisilla, jotka sisältävät yhdistelmän epäor- · , 2 5 gaanisia suoloja, vitamiineja, sopivaa orgaanista hiililäh- . dettä, kuten glukoosia tai tärkkelystä, mitä hyvänsä erilai- ’.V,t sista kompleksisista ravinnelähteistä (hiivauute, hydroly- 1 · « ’ soitu kaseiini, soijajauho ja vastaavat). Yksi esimerkki on FP-l-väliaine (5 % soijajauhoa, 5 % glukoosia, 2 % ·'*’* 30 K2HP04: ää, 0,2 % CaCl2:ta, 0,2 % MgS04 7H20: ta ja 0,1 % plu- # * · * *.* * ronihappoa (BASF) ) . Fermentomti suoritetaan pH-arvossa noin ·*·,· 4,5 - 8,0, ja lämpötilassa noin 20 - 37 °C noin 2-7 päivän • i ,’**· ajan.

♦ ·· • ·

♦ · J

'·' * 3 5 Keksinnön mukaista isäntäsolulajia voidaan käyttää ekspres-*· · söimään mitä hyvänsä kiinnostuksen kohteena olevaa proka-ryoottista tai eukaryoottista heterologista proteiinia, ja 119437 12 edullisesti sitä käytetään ekspressöimään eukaryoottisia proteiineja. Erityisen kiinnostavaa näille lajeille on niiden käyttö heterologisten proteiinien, erityisesti sienient-syymien ekspressiossa. Uusia ekspressiojärjestelmiä voidaan 5 käyttää ekspressöimään entsyymejä kuten katalaasi, lakkaasi, fenolioksidaasi, oksidaasi, oksidoreduktaasit, sellulaasi, ksylanaasi, peroksidaasi, lipaasi, hydrolaasi, esteraasi, kutinaasi, proteaasi ja muut proteolyyttiset entsyymit, ami-nopeptidaasi, karboksipeptidaasi, fytaasi, lyaasi, pektinaa-10 si ja muut pektinolyyttiset entsyymit, amylaasi, glukoamy-laasi, α-galaktosidaasi, β-galaktosidaasi, a-glukosidaasi, β-glukosidaasi, mannosidaasi, isomeraasi, invertaasi, trans-ferääsi, ribonukleaasi, kitinääsi, mutanaasi ja deoksiribo-nukleaasi.

15

Eräässä erityisessä suoritusmuodossa, entsyymi on alkalinen proteaasi, esimerkiksi, Fusarium oxysporum pre-pro-trypsii-nigeeni. Eräässä erityisimmässä suoritusmuodossa genomisek-venssi esitetään SEQ ID NO:3:ssa ja proteiinisekvenssi esi-20 tetään SEQ ID N0:4:ssä.

* f *···* Eräässä toisessa erityisessä suoritusmuodossa entsyymi on t · *,*ϊ alkalinen endoglukanaasi, joka on immunologisesti reaktiivi- • · V : nen vasta-aineen kanssa, joka on kohotettu hyvin puhdistet- ;s· · 25 tua ~43 kD endoglukanaasia vastaan, joka on peräisin Humico- 15*; la insolens, DSM 1800:sta, tai joka on johdannainen ~43 kD:n j*j*: endoglukanaasista, jolla on sellulaasiaktiivisuutta (katso WO 91/17243). Endoglukanaasia, jota kutsutaan tämän jälkeen

*·, nimellä "Carezyme®", voi koodittaa geeni, joka esitetään SEQ

* «· 30 ID NO: 7 : llä, ja sillä voi olla proteiinisekvenssi, joka esi- « · * *, tetään SEQ ID N0:8:ssa. Entsyymi voi myös olla Carezyme®-va- · V'j riantti.

·*· i : • 4 * • Yhä edelleen eräässä toisessa erityisessä suoritusmuodossa

I I J

” * 35 entsyymi on 1,3-spesifinen lipaasi, jota kutsutaan tämän • *♦ * * jälkeen nimellä Lipolase®. Entsyymiä voi koodittaa DNA-sek- venssi, joka esitetään SEQ ID NO:9:ssä, ja sillä voi olla 119437 13 aminohapposekvenssi, joka esitetään SEQ ID NO: 10:ssä. Entsyymi voi myös olla Lipolase®-variantti, esimerkiksi D96L, E210K, E210L (katso W0 92/05249). Ammattimiehet ymmärtävät, ettei käsite "sienientsyymit" sisällä ainoataan luontaisia 5 sienientsyymejä, vaan myös ne sienientsyymit, joita on modifioitu aminohapposubstituutioilla, -deleetioilla, -addi-tioilla, tai muilla modifikaatioilla, jotka voidaan tehdä aktiivisuuden, lämpöstabiilisuuden, pH-sietokyvyn ja vastaavien ominaisuuksien parantamiseksi. Keksinnön mukaista isän-10 täsolulajia voidaan myös käyttää ekspressöimään farmaseuttisesti kiinnostavia heterologisia proteiineja, kuten hormoneja, kasvutekijöitä, reseptoreita, ja vastaavia.

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla ei-rajoittavilla 15 esimerkeillä.

6. Esimerkit 6.1. Fusarium graminearum 20334 erittää vain alhaisen tason proteiinia 20 Fusarium graminearum-kannan 20334, A. oryzae'n ja A. ni-.. ger'in konidioitiösuspensioita siirrostetaan 25 ml:aan YPD- ’···* väliainetta (1 % hiivauutetta (Difco) , 2 % baktopeptonia *» *· (Difco), 2 % glukoosia) 125-ml: isessa ravistelupullossa, ja ! inkuboidaan 5 päivän ajan 30 °C:ssa pyöritysnopeudella 300 t ;,| j 25 r/min. Viljelmistä olevat supernatanttiliemet kerätään sent-rifugoimalla. Yhteensä 10 μΐ kutakin näytettä sekoitetaan 10 »T: μ1:η kanssa 0,1 M ditiotreitolia (Sigma) ja 10 μ1:η kanssa lisäyspuskuria (40 mM Tris-emästä, 6 % natriumdodekyylisul-”.)>t faattia, 2,5 mM EDTA:ta, 15 % glyserolia, 2 mg/ml bromikre- .···* 30 solipurppuranpunaista) . Näytteitä keitetään 5 min ajan, ja * Φ Ψ ajetaan 4- - l2-%:isella polyakryyliamidigeelillä (Novex).

«,** · ’S Proteiinit havainnollistetaan värjäämällä Coomassie-sinisel- lä. Tulokset (kuvio 1) osoittavat, että Fusarium graminea- * : rum-kanta 20334 tuottaa hyvin vähän erittynyttä proteiinia.

Ή · : 35 * tf 6.2. Fusarium graminearum 20334 erittää vain alhaisen tason proteaaseja 119437 14

Yhteensä 40 μΐ kasvatusliemiä Fusarium graminearum-kannasta 20334, A. oryzae'sta, ja A. niger'ista (katso lukua 6.1., yllä) pipetoidaan kutakin kaivoihin, jotka on leikattu ka-seiiniagarlevylle (2 % rasvatonta kuivamaitoa (Lucerne), 50 5 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 % hienoa agaria (Ditco)). Levyjä inkuboidaan 37 °C:ssa 5 tunnin ajan, ja havaitaan proteiini-hydrolyysivyöhykkeet. Tulokset (kuvio 2) osoittavat, että Fusarium graminearum-kannan 20334 kasvatusliemi sisältää hyvin vähän proteolyyttistä aktiivisuutta.

10 6.3. Fusarium oxysporum'in genomisen prepro-trypsiinigeenin kloonaus F. oxysporum'in genomi-DNA:sta valmistetaan genomi-DNA-kir-jasto lambda-fagiin käyttämällä menetelmiä, kuten sellaisia, 15 jotka kuvataan käsikirjassa: Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Yhteensä 50 μg genomi-DNA:ta sulatetaan 1 min ajan 37 °C:ssa tilavuudessa 200 μΐ, joka sisältää 10 mM Tris-puskuria (pH = 7,5), 50 mM NaCl:ää, 7 mM MgCl2:ta, 7 mM 2-merkaptoetanolia 20 ja 4 yksikköä restriktioentsyymiä Sau3A. Osaksi sulatettu DNA, jonka molekyylikoko on 10 - 20 kiloemästä, eristetään agaroosigeelielektroforeesilla, minkä jälkeen seuraa elekt-roeluointi dialyysimembraaniin ja konsentrointi käyttämällä *·· .*.J Elutip-D-kolonnia (Schleicher and Schuell) . 1 μg lambda- .·. ; 25 ulokkeita fagista EMBL4, joka on katkaistu BamHl-restriktio- • · entsyymillä ja käsitelty fosfataasilla (Clonetech) , liite- • · * ***.* tään 300 - 400 μg:n kanssa Sau3A:lla katkaistua genomi-DNA:- • · · ta tilavuudessa 25 μΐ standardiolosuhteissa (katso käsikir- * · Λ *·* ’ jaa Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory 30 Manual, Cold Spring Harbor, NY). Lamda-fagit valmistetaan • · : *·· tästä liitosseoksesta käyttämällä kaupallisesti saatavaa • · · · reagenssipakkausta (Gigapack Gold II, Stratagene) valmista- .·! : jän ohjeita noudattamalla.

• ·· • · * * * • · • · "* 35 Noin 15 000 yhdistelmä-DNA-lamba-fagin siirrostaminen le- • · : vyille ja suodatinnostojen (Hybond N+-suodattimille, • · :/·· Amersham) tuottaminen suoritetaan käyttämällä standardi- 119437 15 menetelmiä (Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Suodattimet käsitellään hybridisointia varten ei-radioaktiivista nukleiinihappojen havaitsemiseen tarkoitetulla Genius-reagenssi-5 pakkauksella (Boehringer Mannheim) käyttämällä standardi-menetelmiä (Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Koettimena käytetty DNA on 0,75 kiloemäksen digoksigeniini(DIG)-leimattu PCR-fragmentti F. oxysporum'in trypsiinityyppisen proteaasin 10 (kutsutaan tämän jälkeen nimellä SP387) geenin koko koodi-alueesta, joka on läsnä plasmidissa pSX233, joka on talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen NRRL tulonumerolla NRRL B-21241. PCR-reaktion alukkeet ovat 5'-tgcggatccATGGT-CAAGTTCGCITCCGTC ("eteenpäin"-aluke, SEQ ID NO:l) ja 5'-15 gacctcgagTTAAGCATAGGTGTCAATGAA ("taaksepäin"-aluke, SEQ ID NO:2). Molemmissa alukkeissa, pikkukirjaimet edustavat link-kerisekvenssejä ja isot kirjaimet vastaavat SP387-geenin koodialuetta. PCR:n muodostamiseksi, 25 ng 907 emäsparin BamHl/Xbal-DNA-fragmenttia, joka sisältää SP387-geenin plas-20 midista pSX233, sekoitetaan 68 pmoolin kanssa kumpaakin "eteenpäin11- ja "taaksepäin"-alukkeesta.

• ·. DNA-fragmentin ja alukkeiden seoksen tilavuus säädetään 80 • · Γ*. ^l:ksi IX Taq-puskuri/lX DIG-leimaus-seoksella/5 yksikköä • · · I t 25 Taq:tä (Boehringer Mannheim). Reaktio-olosuhteet ovat 95 °C, • * *

** .· 3 min, sitten 35 sykliä, jotka käsittävät [95 °C 30 s, 50 °C

* * : 1 min, 72 °C 1 min] . PCR:llä F. oxysporum'in trypsiinityyp-

\i.: pisestä proteaasista johdettu DNA-sekvenssi esitetään SEQ ID

* * · V : NO:3:ssa. Fagitäplät seulotaan DIG-leimatulla koettimella 30 käyttäen Genius-reagenssipakkauksen (Boehringer Mannheim) modifikaatiota (Engler ja Blum, 1993, Anal. Biochem. 210: « 235-244). Positiiviset kloonit eristetään ja puhdistetaan # .* . toisella levyillesiirrostus- ja hybridisointikierroksella.

* · ·

Valmistetaan yhdistelmä-DNA-lamda-fageja, jotka sisältävät « · *···* 35 F. oxysporum'in trypsiinityyppisen proteaasin geenin, ja • fagista eristetään DNA käyttämällä Quiagen-lamda-midi-val- * * · · .'•J mistusreagenssipakkausta (Quiagen) .

• · 119437 16 6.4. Ekspressioplasmidin pJRoy6 konstruointi Käytetään restriktiokartoitus-, "Southern blotting"- ja hybridisointitekniikkoja (Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) tun- 5 nistamaan 5,5 kiloemäksen Pstl-restriktioentsyymifragmentin yhdestä yhdistelmä-DNA-fagista, joka sisältää F. oxysporum'-in trypsiinityyppistä proteaasia koodittavan geenin ja reunustavat DNA-sekvenssit. Tämä 5,5 kiloemäksen Pstl-fragmentti alikloonataan Pstl-sulatettuun pUC118:aan, ja plasmidille 10 annetaan nimi pJRoy4 (katso kuviota 3). Plasmidi pJRoy4 sulatetaan EcoRl-restriktioentsyymillä, ja eristetään 3,5 kiloemäksen EcoRl-fragmentti, joka sisältää SP387-geenin ja pUC118-polylinkkerin 43 emäsparin EcoRl/Pstl-alueen, ja alikloonataan pToC90-vektoriin plasmidin pJRoy6 luomiseksi 15 (kuvio 3).

6.5. SP387-ekspressiokasetin konstruointi Konstruoidaan ekspressiokasetti (pJRoy20), joka sisältää SP387-promoottorin ja -terminaattorin liitettynä BamHl-koh- 20 dalla pUC118:aan. Eräs E. coli-kanta, joka sisältää pJRoy2Q:n, on talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen NRRL. Promoottorifragmentti luodaan sulattamalla SP387-vek- • ·. torin pJRoy6 EcoRl:llä (joka katkaisee kohdassa -1200) ja

Ncol:llä (joka katkaisee translaation aloituskohdassa, katso « · · I 25 kuviota 5). Terminaattorisekvenssi (emäsparit 2056 - 3107 * · · • .1 kuviossa 5) luodaan PCR-monistuksella käyttämällä seuraavia • 1 1 ··· · oligonukleotideja: • · · • · 1 • · 1

a.: : ETEENPÄIN

30 5'gcacaccatggtcgctggatccATACCTTGTTGGAAGCGTCG3' (SEQ ID NO: 11) * · 1 * · 1 • » ·

TAAKSEPÄIN

• 1 · 5 ' atcggagcatgcggtaccgtttaaacgaattcAGGTAAACAAGATATAATTTTCTG3 ' * · *·;·’ 35 (SEQ ID NO:12) • · • · · * · ( * · · ·

* » I

« ·· • · 119437 17

Isot kirjaimet ovat komplementaarisia SP387-terminaattori-DNA:lle, kun taas pienet kirjaimet ovat häntiä, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostetut restriktiokoh-dat.

5

Kun on sulatettu Ncol:llä ja Sphl:llä, eristetään tulokseksi saatu monistustuote, joka sisältää terminaattorin, jota reunustavat Ncol- ja BamHl-kohdat 5'-päässä, ja reunustavat EcoRl-, Pmel-, Kpm- ja Sphl-kohdat 3'-päässä. Suoritetaan 10 3-tieliitos promoottorifragmentin, terminaattorifragmentin ja Kpnl/Sphl-katkaistun pUC118:n välillä, jolloin muodostuu pJRoy20 (katso kuviota 5).

6.6. Carezyme®-konstruktit 15 Käytetään EcoRV-kohtaa SP387-promoottorin kohdassa -15, ja Ncol-kohtaa, joka on läsnä kohdassa +243 Carezyme®-koodialu-eella, jolloin muodostuu täsmällinen fuusio SP387-promootto-rin ja Carezyme®-geenin välille. PCR-fragmentti, joka sisältää alueen -18 - -1 SP387-promoottorista, ja jota seuraa 20 suoraan alue -1 - +294 Carezyme®-geenistä, luodaan Carezy-me®-vektorista pCaHj418 (katso kuviota 10) käyttämällä seu-raavia alukkeita: • *

’;·1. ETEENPÄIN

• · ·

25 EcoRV

• » **·" i 5 ' ctcttggatatctatctcttcaccATGCGTTCCTCCCCCCTCCT3 ' * : (seq id N0:i3) * · · * * · • · · taaksepäin * 30 5'CAATAGAGGTGGCAGCAAAA3' (SEQ ID NO:14) • * • · • *i .··.·. Pienet kirjaimet eteenpäin-alukkeessa ovat SP387-promootto- • rin emäsparit -24 - -1, kun taas isot kirjaimet ovat Carezy- • · · *· " me®:n emäsparit 1 - 20.

• · « l...: 35 : Käytetään PCR-olosuhteita: 95 °C, 5 min, sen jälkeen seuraa • · · · .•.j 30 sykliä, jotka käsittävät [95 °C, 30 s, 50 °C, 1 min, 72 • · 119437 18 °C, 1 min]. Tulokseksi saatu 0,32 kiloemäksen fragmentti kloonataan vektoriin pCRII käyttämällä yhtiön Invitrogen TA-kloonausreagenssipakkausta, jolloin saadaan tulokseksi pDM148 (katso kuviota li). 0,26 kiloemäksen EcoRV/NcoI-frag-5 mentti eristetään pDM148:sta ja liitetään pCaHj418:sta olevaan 0,69 kiloemäksen Ncol/Bglll-fragmenttiin, ja kloonataan EcoRV/BamHI-sulatettuun pJRoy20:een pDM149:n luomiseksi (katso kuviota 12). 3,2 kiloemäksen EcoRI-Carezyme®-ekspres-siokasetti (SP387 promoottori/Carezyme®/SP387-terminaattori) 10 eristetään pDM149:stä ja kloonataan pToC90:n EcoRI-kohtaan pDM151:n luomiseksi (katso kuviota 6). Ekspressiokonstrukti pDMISI sisältää sekä ekspressiokasetin että amdS-valittavan markkerin. Yksi E. coli-kanta, joka sisältää pDMISI:n, on talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen NRRL.

15 6.7. Lipolase®-konstruktit

EcoRV-kohtaa SP387-promoottorin kohdassa -15, ja Sacl-kohtaa Lipolase®-koodausalueen kohdassa +6 käytetään luomaan täsmällisen fuusion SP387-promoottorin ja Lipolase®-geenin vä-20 lille. Konstruoidaan sovitin, joka sisältää viimeiset 15 emäsparia SP387-promoottorista, joita seuraavat ensimmäiset 6 emäsparia Lipolase®-koodausalueesta, ja esitetään alla.

• · « • ·

EcoRV Sacl • · · Ί 25 atctatctcttcaccATGAGGAGCT (SEQ ID NO:15) • · · 1 .· tagatagagaagtggTACTCC (SEQ ID NO: 16) • · t » · « * » * · » *”·* 0,9 kiloemäksen SacI/BamHI-fragmentti Lipolase®-cDNA-geenis- !.: * tä eristetään A. oryzae-ekspressiokonstruktista pMHan37 30 (katso kuviota 13). EcoRV/SacI-sovitin ja SacI/BamHI-Lipo- lase®-fragmentti liitetään ja kloonataan EcoRV/BamHI-sula- tettuun pJRoy20:een plasmidin pDM154 luomiseksi (katso ku- /. viota 14). 3,2 kiloemäksen KpnI-Lipolase®-ekspressiokasetti *./ (SP387-promoottori/Lipolase®/SP387-terminaattori) eristetään « · ’·;·* 35 pDM154:stä, ja kloonataan pToC90:n Kpnl-kohtaan plasmidin jt:‘: pDM155 luomiseksi (katso kuviota 7) . Ekspressiokonstrukti :*·,· pDM155 sisältää sekä Lipolase®-ekspressiokasetin että amdS- • · 119437 19 valittavan markkerin. Eräs E. coli-kanta, joka sisältää pDM151:n, on talletettu kansainväliseen talletuslaitokseen NRRL.

5 6.8. F. graminearum'in transformointi

Fusarium graminearum-kannan ATCC 20334 viljelmiä kasvatetaan 3 viikon ajan 25 °C:ssa 100 x 15 mm petrilevyllä, joilla on Vogel'in väliainetta (Vogel, 1964, Am. Nature 98:435446) plus 1,5 % glukoosia ja 1,5 % agaria. Konidioita (noin 10 108/levy) siirretään 10 ml:aan steriiliä vettä käyttämällä siirtosilmukkaa, ja puhdistetaan suodattamalla 4 juustokan-gaskerroksen läpi ja lopuksi yhden miracloth-kerroksen läpi. Konidiosuspensioita konsentroidaan sentrifugoimalla. 50 ml YPG:tä (1 % hiivauutetta (Difco) 2 % baktopeptonia (Difco), 15 2 % glukoosia) siirrostetaan 10® konidiolla, ja inkuboidaan 14 tunnin ajan 20 °C:ssa, 150 r/min. Tulokseksi saadut hyy-fit siepataan steriilille 0,4-μπ\ suodattimelie, ja pestään peräkkäin steriilillä tislatulla vedellä ja 1,0 M MgS04:llä. Hyyfit suspendoidaan uudelleen 10 ml:aan Novozym® 234 (Novo 20 Nordisk)-liuokseen (2 - 10 mg/ml 1,0 M MgS04:ssä), ja sulatetaan 15 - 30 min ajan 34 °C:ssa sekoittaen nopeudella 80 r/min. Sulamaton hyyfimateriaali poistetaan tulokseksi saa-dusta protoplastisuspensiosta suodattamalla peräkkäin 4

«•I

·*·,· juustovaatekerroksen läpi ja "miracloth"-vaatteen läpi. 20 • · .·. : 25 ml 1 M sorbitolia ajetaan juustovaatteen ja "miracloth"- 4 ,4 vaatteen läpi, ja yhdistetään protoplastiliuoksen kanssa.

• · * "V Kun sekoitettu, protoplastit (noin 5 x 10®) pelletöidään • · "* sentrifugoimalla, ja pestään peräkkäin suspendoimalla uudel- | · * *** leen ja sentrifugoimalla 20 ml:ssa 1 M sorbitolia ja 20 30 ml:ssa STC:tä (0,8 m sorbitolia, 50 mM Tris-HCl:tä, pH = * » • ** 8,0, 50 mM CaCl2) . Pestyt protoplastit suspendoidaan uudel-

«•I

V * leen 4 osaan STC:tä ja 1 osaan SPTC:tä (0,8 M sorbitolia, 40 .*.J % polyetyleeniglykoli 4000 :tta (BDH) , 50 mM Tris-HCl pH = ···, 8,0, 50 mM CaCl2) konsentraatiossa 1 - 2 x 108/ml. 100 μΐ • i *·* 35 protoplastisuspensiota lisätään 5 jug:aan pJRoy6:tta ja 5 • · ♦ ί.ί : μΐ-.aan hepariinia (5 mg/ml STC:sä) polypropyleeniputkissa • · *.*·· (17 x 100 mm) , ja inkuboidaan 30 min ajan jäissä. Protoplas- 119437 20 tisuspensioon sekoitetaan varovasti 1 ml SPTCitä, ja inku-bointia jatketaan 20 min ajan huoneenlämpötilassa. Proto-plastit siirrostetaan levyille selektiiviselle väliaineelle, joka koostuu Cove'n suolasta (Cove, D.J., 1966, Biochem.

5 Biophys. Acta 113:51-56) plus 10 mM asetamidista, 15 mM CsCl2:sta, 2,5 % hienosta agarista (Difco) ja 1,0 M sakkaroosista käyttäen päällystettä samasta väliaineesta, jossa on 0,6 M sakkaroosia ja 1,0 % alhaisessa lämpötilassa sulavaa agaroosia (Sigma). Levyjä inkuboidaan 25 °C:ssa, ja 10 transformantteja ilmaantuu 6-21 päivässä.

6.9. Trypsiinityyppisen proteaasin ekspressio Fusarium gra-minearum'issa

Transformantteja siirretään levyille, joilla on COVE2-väli-15 ainetta (samaa kuin edellä oleva COVE-väliaine, mutta ilman cesiumkloridia ja korvaten 1,0 M sakkaroosin konsentraatiol-la 30 g/1), ja kasvatetaan 3 päivää tai pitempään 25 °C:ssa. 25-ml:isia eriä FP-l-väliainetta (5 % soijajauhoa, 5 % glukoosia, 2 % K2HP04: ää, 0,2 % CaCl2:ta, 0,2 % MgS04 · 7H20: ta ja 20 0,1 % pluronihappoa (BASF)) 150-ml:isissä pulloissa siirros tetaan noin 1-cm:isillä agarpaloilla COVE2-levyviljelmistä, ja inkuboidaan 6 päivän ajan 30 °C:ssa sekoittaen (150 r/min). Supernatanttilieminäytteet otetaan talteen sentrifu- *···* goinnin jälkeen, ja alistetaan seuraavalla tavalla SDS-PAGE- • · \**i 25 analyysille. 30 μΐ kutakin kasvatuslientä sekoitetaan 10 · V ί μ1:η kanssa SDS-PAGE-näytepuskuria (1 ml 0,5 M Tris pH = j.j · 6,8, 0,8 ml glyserolia, 1,6 ml 10-%:ista SDS:ää, 0,4 ml 0,8 : M ditiotreitolia, 0,2 ml l-%:ista bromifenolisinistä) , 2 μΐ »·· 2-%:ista PMSF:ää (Sigma) isopropanolissa, ja 2 μ1:η kanssa 30 glyserolia. Näytteet lisätään 4 minuutiksi kiehuvaan vesi- ··, hauteeseen, ja 40 μΐ kutakin ajetaan 10- - 27-%:isella poly- • · · akryyliamidigeelillä (Novex). Geelit värjätään ja värinpois- t » i tokäsitellään Coomassievärillä standardimenetelmiä käyttä- • 4 mällä. Trypsiinityyppisen proteaasin ekspressiotason on • · · S.,,! 35 määritetty olevan a 0,5 g/1.

• » • · · • · f 444 4 4 4 4 4 4 4 44 4 4 119437 21 6.10. Entsyymimääritykset 6.10.1. Carezyme®

Puskuri: Natriumfosfaatti (50 mM, pH 7,0)

Substraatti: AZCL-HE-selluloosaa (Megazyme) tasolla 2 mg/ml 5 puskuria

Entsyymistandardi: 100 mg Carezyme®-standardia (10070 ECU/g) liuotetaan 1 ml:aan puskuria, ja säilytetään -20 °C:ssa.

Tämä kantaliuos laimennetaan 1:100 puskuriin välittömästi 10 ennen entsyymimäärityksissä käyttöä. Määritysalue on 0,5 -5,0 ECU/ml. Käytetään muuntokerrointa 650000 ECU/g Carezyme®:ää.

Substraattiliuosta (990 μΐ) lisätään 24-kaivoisen mikrotiit-15 terilevyn näytekaivoihin. Substraattiin lisätään 10 μΐ Care-zyme®-näytettä (laimennettu puskuriin tuottamaan aktiivisuuden välillä 0,5 ja 10 ECU/ml). Reaktioita inkuboidaan 30 min ajan 45 °C:ssa siirtäen supernatantin 96-kaivoiselle mikro-tiitterilevylle, ja mitataan absorbanssi 650 nmrllä.

20 6.10.2. Lipolase®

Määrityspuskuri: 0,1 M MOPS, pH 7,5, joka sisältää 4 mM

*; CaCl2:ta ··· • ♦ ♦ · · • ·· • · ί 25 Substraatti: 10 ml p-nitrofenyylibutyraattia (pNB) . 1 ml: ssa DMSO: ta; * · » *’V Lisää 4 ml puskuria substraattiin DMSO:ssa 3 S · ::: 1Kantaliuoskonsentraatio = 11,5 mM 20-%:isessa DMSO:ssa : : : ♦ 30 Entsyymistandardi: Lipolase®:ää (23100 LU/g) liuotetaan ta- ί '1 solia 1000 LU/ml 50-%:iseen glyseroliin, ja säilytetään -20 ·· · * · · „ - V · °C:ssa.

: Tämä kantaliuos laimennetaan 1:100 puskuriin välittömästi • ···, ennen määritystä. Määritysalue on 0,125 - 3,0 LU/ml.

* « »·· 35 • ♦ • · · * · · 2 · · « · 119437 22 100 μΐ pNB-kantaliuosta lisätään 100 μΙ-.ΆΆη sopivasti laimennettua entsyyminäytettä. Aktiivisuus (mOD/min) mitataan 405 nm:llä 5 min ajan 25 °C:ssa.

5 6.10.3. SP387-määritys L-BAPNA-substraatti valmistetaan laimentamalla 0,2 M L-BAP-NA:n (Sigma B3133) kantaliuosta dimetyylisulfoksidissa (säilytetään pakastettuna) tasolle 0,004 M puskurissa (0,01 M dimetyyliglutaarihappoa (Sigma), 0,2 M boorihappoa ja 0,002 10 M kalsiumkloridia, säädetty NaOH:lla pH-arvoon 6,5) juuri ennen käyttöä. 1 μΐ viljelmää sentrifugoitiin (145 000 x g, 10 min). 100-μΐ erä laimennettua kasvatuslientä lisätään 100 μΐ:aan substraattia 96-kaivoisella mikrotiitterilevyllä. Absorption muutos 405 nm:llä määritetään 30 sekunnin välein 15 5 min ajan 25 °C:ssa ELISA-lukijaa käyttämällä. Tulokset lasketaan suhteessa puhdistettuun SP387-standardiin.

6.11. Carezyme®:n ekspressio

Puhdistetaan 23 pDM151-transformanttia, kasvatetaan raviste-20 lupulloissa soija/glukoosi-väliaineella, ja määritetään 9 päivän kuluttua Carezyme®-aktiivisuuden suhteen (Taulukko 1 - katso alla). 4 transformanttia ekspressöi Carezyme®:ää ta-solia noin 50 - 100 mg/1. Transformanttia pDM151-4 kasvate- • · « .1.$ taan pienimittakaavaisissa fermenttoreissa käyttäen olosuh- • · : 25 teitä, jotka on kehitetty SP387:n tuotannolle (katso kappa- 1 1 letta 6.9) . Noin 6,0 g/1 Carezyme®:ää ilmenee 7 päivän ku- * · · "V luttua (kuvio 8A) . Carezyme® käsittää yli 90 % eritetyistä

J 1 J

proteiineista 7 päivän pohjalta (kuvio 8A). Carezyme® käsit- 2 1 ! ** ‘ tää yli 90 % eritetyistä proteiineista SDS-geelielektrofo- 30 reesin pohjalta (kuvio 8B).

• φ « 1 • · · * ·· · • · 1 • · 1 * • · • · « r 1 1 • 1 * 1 1 i : 35 « · * · · • · I ·1· ·

ft » « I

• 1« « · 119437 23

Taulukko I

Transformantti # ECU/ml mg/1 5 pDM 151.3 - 4 58,2 90 pDM 151.3 - 5 0 0 pDM 151.3 - 6 0 0 pDM 151.3 - 10 0 0 pDM 151.3 - 11 2,46 4 10 pDM 151.3- 12 0 0 pDM 151.3 - 13 12,2 19 pDM 151.3 - 14 47,3 73 pDM 151.3 - 15 22,7 35 pDM 151.3 - 16 0 0 15 pDM 151.3 - 17 0 0 pDM 151.3 - 18 0 0 pDM 151.3 - 19 0 0 pDM 151.3 - 21 0 0 pDM 151.3 - 22 43,7 67 20 pDM 151.3 - 23 1,25 2 pDM 151.3 - 24 17,8 27 pDM 151.3 - 25 38 58 • 1. pDM 151.3 - 26 0 0 pDM 151.3 - 27 10,5 16 : 1, 25 pDM 151.3 - 28 49,3 76 ♦ 1 · ** .1’ pDM 151.3 - 29 19,8 30 pDM 151.3 - 30 22,7 35 »i· • 2 *.1 1 6.12. Lipolase®:n ekspressio 30 Puhdistetaan 15 pDM155-transformanttia, kasvatetaan raviste- · • lupulloissa soija/glukoosi-väliaineessa, ja määritetään 9 päivää myöhemmin Lipolase®-aktiivisuuden suhteen (taulukko 2 . - katso seuraavaa sivua) .

• · · • · · • » ··· * : ·;· 35 « · • · · » · · «·· ♦ · • · · • «· 2 • » 119437 24

Taulukko II

Transformantti # LU/ml mg/ml pDM 155 - 1 669 167 5 pDM 155 - 2 45,2 11 pDM 155 - 3 180 45 pDM 155 - 4 0 0 pDM 155 - 5 55,4 14 pDM 155 - 6 116 29 10 pDM 155 - 7 704 176 pDM 155 - 8 214 54 pDM 155 - 9 17,1 4 pDM 155 - 10 712 178 pDM 155 - 11 511 128 15 pDM 155 - 12 0 0 pDM 155 - 13 0 0 pDM 155 - 14 0 0 pDM 155 - 15 153 38 pDM 155 - 16 0 0 20 pDM 155 - 17 0 0 pDM 155 - 18 0 0 pDM 155 - 19 129 32 pDM 155 - 20 378 95 * · ,*]*! pDM 155 - 21 216 54 : *. 25 » · * * · ^ * ,* 4 transformanttia ekspressöi Lipolase®:ää tasolla noin 100 - • » » *··#5 200 mg/1 (pNB-määrityksen perusteella) . Transformanttia 114 ·Σ·* pDM155-10 kasvatetaan pienimittakaavaisissa fermenttoreissa • i· i käyttämällä olosuhteita, jotka kehitettiin SP387-tuotannolle 30 (katso lukua 6.9). Noin 2,0 g/1 Lipolase:a ilmenee 7 päivän { *.. lukuttua (kuvio 8A) . Lipolase® käsittää yli 90 % eritetyistä ΓΓ: proteiineista SDS-geelielektroforeesin pohjalta (kuvio 8B).

« · > · « • »« *.,* 7 . Mikro-organismien talletus

| J

*;·' 35 Seuraavat biologiset materiaalit on talletettu kansainväli- : seen talletuslaitokseen the Agricultural Research Service *« · ^ **·.: Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research 4 « 119437 25

Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Kanta Tulonumero Talletuspäivämäärä 5 E. coli, joka NRRL B-21285 20. kesäkuuta 1994 sisältää pJRoy6:n E. coli, joka NRRLB-21418 10. maaliskuuta 1995 sisältää 10 E.coli, joka NRRLB-21419 10. maaliskuuta 1995 sisältää pDM151:n E. coli, joka NRRLB-21420 10. maaliskuuta 1995 sisältää pDM155:n 15 Kannat on talletettu olosuhteissa, jotka varmistavat, että viljelmän saanti on mahdollinen tämän patenttihakemuksen ollessa ratkaisematta laitoksen the Comissioner of Patents and Trademarks määrittämälle henkilölle sääntöjen 37 C.F.R §1.14 ja 35 U.S.C. §122 ja kansainvälisen Budapestin sopi-20 muksen ehtojen mukaisesti. Tallenne edustaa kunkin talletetun kannan biologisesti puhdasta viljelmää. Tallenne on saatavissa vieraiden patenttilakien sitä vaatiessa maissa, / \ joissa kohdepatenttihakemuksen vastineet, tai sen jälkeläi- «·» ,·. : siä jätetään. Olisi kuitenkin ymmärrettävä, että tallenteen

« M

• · 25 saatavuus ei muodosta lisenssiä kohteena olevan keksinnön • < * .* toteuttamiseksi hallituksen myöntämät patenttioikeudet osit-

» t I

*",* tain kumoten.

*» · • « « · · • ·« • * · ·* * Tässä kuvatut erityiset suoritusmuodot eivät rajoita tässä 30 kuvattua ja vaadittua keksintöä, koska nämä suoritusmuodot Βψ • *·· on tarkoitettu keksinnön useiden näkökantojen kuvauksiksi.

:T: Kaikki samanarvoiset suoritusmuodot on tarkoitettu tämän • / · keksinnön suoja-alaan kuuluviksi. Itse asiassa edellä ole- • · 4 l..‘ vasta kuvauksesta ilmenee ammattimiehille tässä esitettyjen I : ”* 35 ja kuvattujen lisäksi keksinnön erilaisia modifikaatioita.

« * ;,· : Sellaiset modifikaatiot on myös tarkoitettu oheisten patentti*.: tivaatimuksen suoja-alaan kuuluviksi.

119437 26 Tässä viitataan eri viitteisiin, joiden sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitteeksi.

f · 9 9 9 9 · 9 *» 9 « « < • «* * · 9 9 V * t • · • ·

V

*.9 9 9 9% • 99 9 m 9 9 9 9 9 9 9* • «* *· * 9 9 9 99 9 9 9 9 9 » 999 9 9 9 9*9 » ♦

« I

ϊ 9 9 % 9 9 9 · *9% i : «»· 9 9 9 9 9· 9 9 9 «f* · 9 9 9%9 • 99 9 9 119437 27

SEKVENSSILUETTELO

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: Novo Nordisk Biotech, Inc.

(B) KATU: 1445 Drew Avenue, Ste. 105 (C) KAUPUNKI: Davis (D) OSAVALTIO: California

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 95616-4880 (G) PUHELIN: (916) 757-8100 (H) TELEFAX: (916) 758-0317 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: EI-TOKSINEN, EI-TOKSIGEENINEN, EI-PATOGEENINEN FUSARIUM-EKSPRESSIOJÄRJESTELMÄ JA SIINÄ KÄYTETTÄVIÄ PROMOOTTOREITA JA TERMINAATTOREITÄ (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 16 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Novo Nordisk of North America, Inc.

(B) KATU: 405 Lexington Avenue, 64th Floor (C) KAUPUNKI: New York (D) OSAVALTIO: New York

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 10174-6401 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: disketti (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patent In Release #1.0, Version #1.30 • a • (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: S#*.· (A) HAKEMUSNUMERO: määrättävä *,5 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 15. kesäkuuta 1995 V: (O luokitus: ♦ « · · {,V (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: • J,.· (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/269,449 ,V. (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 30. kesäkuuta 1994 • « · (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 08/404,678 : (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 15. maaliskuuta 1995 >4· V *' (viii) ASIAMIEHEN TIEDOT: ..·] · (A) NIMI: Agris Dr., Cheryl H.

*/·! (B) REKISTERINUMERO: 34,086

,·". (C) VIITE/LUETTELONUMERO 4216.204-WO

··» i |\ (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: *;·* J (A) PUHELIN: 212-867-0123 :*·.ϊ (B) TELEFAX: 212-878-9655 • 4 119437 28 (2) SEKVENSSIN ID NO:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:1: TGCGGATCCA TGGTCAAGTT CGCTTCCGTC 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: GACCTCGAGT TAAGCATAGG TGTCAATGAA 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 998 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: • · ATCATCAACC ACTCTTCACT CTTCAACTCT CCTCTCTTGG ATATCTATCT CTTCACCATG 60 • · "*. GTCAAGTTCG CTTCCGTCGT TGCACTTGTT GCTCCCCTGG CTGCTGCcGC TCCTCAGGAG 120 • · · • · · *. ATCCCCAACA TTGTTGGTGG CACTTCTGCC AGCGCTGGCG ACTTTCcCTT CATCGTGAGC 180 • t · • · ATTAGCCGCA ACGGTGGCCC CTGGTGTGGA GGTTCTCTCC TCAACGCCAA CACCGTCTTG 240 • · · • * * ACTGCTGCCC ACTGCGTTTC CGGATACGCT CAGAGCGGTT TCCAGATTCG TGCTGGCAGT 300 • * « • · · CTGTCTCGCA CTTCTGGTGG TATTACCTCC TCGCTTTCCT CCGTCAGAGT TCACCCTAGC 360 * · · • * * • TACAGCGGAA ACAACAACGA TCTTGCTATT CTGAAGCTCT CTACTTCCAT CCCCTCCGGC 420 .. GGAAACATCG GCTATGCTCG CCTGGCTGCT TCCGGCTCTG ACCCTGTCGC TGGATCTTCT 480 • · GCCACTGTTG CTGGCTGGGG CGCTACCTCT GAGGGCGGCA GCTCTACTCC CGTCAACCTT 540 Φ · * *\ CTGAAGGTTA CTGTCCCTAT CGTCTCTCGT GCTACCTGCC GAGCTCAGTA CGGCACCTCC 600 • « :/·; GCCATCACCA ACCAGATGTT CTGTGCTGGT GTTTCTTCCG GTGGCAAGGA CTCTTGCCAG 660 * · · : : GGTGACAGCG GCGGCCCCAT CGTCGACAGC TCCAACACTC TTATCGGTGC TGTCTCTTGG 720 • · · I .*. GGTAACGGAT GTGCCCGACC CAACTACTCT GGTGTCTATG CCAGCGTTGG TGCTCTCCGC 780 • · * • * · · : TCTTTCATTG ACACCTATGC TTAAATACCT TGTTGGAAGC GTCGAGATGT TCCTTGAATA 840 • · · • · TTCTCTAGCT TGAGTCTTGG ATACGAAACC TGTTTGAGAA ATAGGTTTCA ACGAGTTAAG 900 AAGATATGAG TTGATTTCAG TTGGATCTTA GTCCTGGTTG CTCGTAATAG AGCAATCTAG 960 1 1 9437 29 ATAGCCCAAA TTGAATATGA AATTTGATGA AAATATTC 998 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 248 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Proteiini (B) ASEMA: 1..224 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) ASEMA: -24..0 (D) LISÄTIEDOT: /tuote» "MUU" /huomautus= "Leima=pre-propeptidi" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4:

Met Vai Lys Phe Ala Ser Vai Vai Ala Leu Vai Ala Pro Leu Ala Ala -20 -15 -10

Ala Ala Pro Gin Glu Ile Pro Asn Ile Vai Gly Gly Thr Ser Ala Ser -5 15

Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Vai Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro 10 15 20

Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Vai Leu Thr Ala Ala 25 30 35 40 « *···' His Cys Vai Ser Gly Tyr Ala Gin Ser Gly Phe Gin Ile Arg Ala Gly .*. : 45 50 55 • M • * .·. : Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Vai *. : 60 65 70 • * « : Arg Vai His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu . .·. 75 80 85 • · · * · * #·;·, Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg ·.·’ : 90 95 100

Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Vai Ala Gly Ser Ser Ala Thr Vai 105 110 115 120 • · · · *... Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Vai Asn : ί : 125 130 135 » .·. : Leu Leu Lys Vai Thr Vai Pro Ile Vai Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala

*. *: 140 145 ISO

• · ·

Gin Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gin Met Phe Cys Ala Gly Vai • 155 160 165 • · • · * ··· · Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile ί 170 175 180 • t* • ·

Vai Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Vai Ser Trp Gly Asn Gly 185 190 195 200 119437 30

Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Vai Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu 205 210 215

Arg Ser Phe lie Asp Thr Tyr Ala 220 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1206 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: GAATTCTTAC AAACCTTCAA CAGTGGAGAC TTCCGACACG ACATATCGAT CCTTTGAAGA 60 TACGGTGAGC GTCAGATCAT GAATTTCATA CATCCTCACG TCCTTCCTCT TTCAAACTAT 120 GCAAAGTCCT TCTAGTACCT CCCAAAACTT GATTTACGCG CTCTCCAATC AAAAGTACCT 180 TCCAAAAGTG ATCTACCTCA GCTCTAGATC AGGGCACCTA TTCGCAAAGA TCTACAAGCT 240 GAACTAGTAA GCATAGCGGG AGAATATCCC ACATCATTCG AGAAGGCCTT CGTATTAGAC 300 CTAGTGGGAT CGACAGAAAA GATAAGACGG AGATAGATGC TATGTTTGGA AGGTAGGGGA 360 TGGAATAGGA TGCAACAGGT ATTGGCATAA GCGATGCAAT AGGTGCATCT AGAAACTAGG 420 TGACAGACTG GCCACAGAGG TGTATCCTAT GCAGGTCGAT GCGTGCGTTA TCGCAGGGCT 480 GCTATTGCGT GGTGGTGGCT ACAAAAGTTC TATGTGGTTT CCAGTTTCAG AATATTGGGC 540 CATTGTGATT GATGGCGCAT GACCGAATTA TAGCAGTGAA CCCCGCCCAG AGTAGTAGTG 600 CAGATGCGCT TTGATGCTTG GCGATTCCTC GGGCTAAATA ACTCCGGTTG GTCTGTAGAA 660 « '···' TGCTGACGCG ATGATCCTTC GGCATTAATC GTAGATCTTG GGGGGGGATA AGCCGATCAA 720 • · * *· " AGACACACTG TAGATCAGCT CTTCGATGAC TCTTACCAGC TTTATAATAA CATTCATCTT 780 • φ • · · ’· Ϊ GAACGTCTTT TTCGTCCAGT GTTTACCTTT CGTCCTATTT ATCCGTCATA TCCACAGTGT 840 : TATTGGCGAT agagttatcg ACTTTCCTCA TCGGGATACT GGCCCCTGCT GCCAAGGGCC 900 TTATATGCCG ATCACTTTCA CGGGAGCATG ATAAGGTTAA TGCTTCTTCT GAATGCCGAA 960 • ·· * CTAGACTACG GAACAACGGA GCTTAGTACC AGAAAGGCAG GTACGCCTAT TCGCAAACTC 1020 CGAAGATACA ACCAAGCAAG CTTATCGCGG GATAGTAACC AGAGAGGCAG GTAAGAAGAC 1080 • · • *·· ACAACAACAT CCATAGCTAT GTAGATTCTC GAATATAAAA GGACCAAGAT GGACTATTCG 1140 *· * v‘ · AAGTAGTCTA TCATCAACCA CTCTTCACTC TTCAACTCTC CTCTCTTGGA TATCTATCTC 1200 Ϊ TTCACC 1206 • · • · Ϊ***: (2) SEKVENSSIN ID NO: 6 TIEDOT: ··· j ;*; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *" I (A) PITUUS: 1188 emäsparia :.*·· (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 119437 31 (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 6: TAAATACCTT GTTCGAAGCG TCGAGATGTT CCTTGAATAT TCTCTAGCTT GAGTCTTGGA 60 TACGAAACCT GTTTGAGAAA TAGGTTTCAA CGAGTTAAGA AGATATGAGT TGATTTCAGT 120 TGGATCTTAG TCCTCGTTGC TCGTAATAGA GCAATCTAGA TAGCCCAAAT TGAATATGAA 180 ATTTGATGGA AATATTCATT TCGATAGAAG CAACGTGAAA TGTCTAGCAG GACGAAAAGT 240 AGATCAAGGC TGTTATGTTC CCCGACCAAC CTACCTTGAT GTCAGTCTGC GAGTCGTGTG 300 CAGTGACCCA GAATGATGGA TTGACTTGGA CATTTTCTGT CTATGAAGTA TTATGAACAT 360 GAATATCGTT TCCTCATTAT CTATGTTGGC AGCCTAAAGT TTTACCATAT AGCTAGCAAT 420 CAGTCAAGTA TCTGCGTATG AAGGGTTGTT AAGCCAGGAC GGTATCAGCG TTGAATATTT 480 AAAGAATGAT ATGAGATAAT CAACATTGAC ATGATAAAAG AAAAGGGGAA ACAAATTGTG 540 CATATAGTAA AGACTTCAGG TCGACCCCTC AATAGACATA TGCGAACCGA AAACCAACAG 600 GATACAATTT ATAGATAAGT ATAACTACAG TTATCTGTCT GCCGAACAAA TACTCTTTTG 660 TGAAACAAAT GAAGAGTACA TAAGCTACAG TTCCTCAGTA GGAACATCCT TTACAATAAC 720 TCCCTTGACT TCCTTCAGCT TCTCAATAGC CTCCAAAGTC ATCGGTCTGC CATCAAGGCA 780 CGTCAGCTCT GGTGTAGCAT ACAGCAGTGC CATACTTACG GAGGATAGGA AGTGGGAGGA 840 ATCGTTCGTG TCTGCCTCCA AAAATCGACA CCAGTGTCCT TTTTGACGAT ACTGATATGG 900 TGGTAAGCTT GGGAGTCTAT TGTTGACGTT GCATCACTTA CTTAAGCACG GTTTCATTCC 960 TCTGCTGATA GTCCTCCAAC TTCTCGAAGT CGTAAACGAT GGCCTATAGT ATCTTATTGA 1020 GAAATATGTC TTCTCAGAAA ATTATATCTT GTTTACCTTT CGGTCCGCCA TGGCTGCTAA 1080 AACTGCTGGG AAATTCAAAA GCGCAGCACA AGCAGCAAGA GTGATGGGCA CAACGTGATA 1140 • · *...’ TGTTGATAAA AGCATCAGTA TCGATAAGTT CCACTCAGAA ACCTGCAG 1188 • · • · · (2) SEKVENSSIN ID NO: 7 TIEDOT: * · • · · • « // (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :.! : (A) PITUUS: 1060 emäsparia . (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen : ·* : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * (ix) OMINAISPIIRRE:

. (A) NIMI/SELITYS : CDS

(B) ASEMA: 10..924 * · · »ti (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS : mat_peptidi /./ (B) ASEMA: 73..924 • » ··· (ix) OMINAISPIIRRE: :.· (A) nimi/SELITYS: sig_peptidi : (B) ASEMA: 10..72 • ·· • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: GGATCCAAG ATG CGT TCC TCC CCC CTC CTC CCG TCC GCC OTT GTG GCC 48

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala 119437 32 -21 -20 -15 -10 GCC CTG CCG GTG TTG GCC CTT GCC GCT GAT GGC AGG TCC ACC CGC TAC 96

Ala Leu Pro Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr -5 15 TGG GAC TGC TGC AAG CCT TCG TGC GGC TGG GCC AAG AAG GCT CCC GTG 144

Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val 10 15 20 AAC CAG CCT GTC TTT TCC TGC AAC GCC AAC TTC CAG CGT ATC ACG GAC 192

Asn Gin Pro Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg lie Thr Asp 25 30 35 40 TTC GAC GCC AAG TCC GGC TGC GAG CCG GGC GGT GTC GCC TAC TCG TGC 240

Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys 45 SO 55 GCC GAC CAG ACC CCA TGG GCT GTG AAC GAC GAC TTC GCG CTC GGT TTT 288

Ala Asp Gin Thr Pro Trp Ala val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe 60 65 70 GCT GCC ACC TCT ATT GCC GGC AGC AAT GAG GCG GGC TGG TGC TGC GCC 336

Ala Ala Thr Ser lie Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala 75 80 85 TGC TAC GAG CTC ACC TTC ACA TCC GGT CCT GTT GCT GGC AAG AAG ATG 384

Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met 90 95 100 GTC GTC CAG TCC ACC AGC ACT GGC GGT GAT CTT GGC AGC AAC CAC TTC 432

Val Val Gin Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe 105 110 115 120 GAT CTC AAC ATC CCC GGC GGC GGC GTC GGC ATC TTC GAC GGA TGC ACT 480

Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Val Gly lie Phe Asp Gly Cys Thr 125 130 135 119437 33 ACC ACC TGC GTC GCT GGC AGC ACT TGC ACG AAG ATT AAT GAC TGG TAC 912

Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys lie Asn Asp Trp Tyr 265 270 275 280 CAT CAG TGC CTG TAGACGCAGG GCAGCTTGAG GGCCTTACTG GTGGCCGCAA 964

His Gin Cys Leu CGAAATGACA CTCCCAATCA CTGTATTAGT TCTTGTACAT AATTTCGTCA TCCCTCCAGG 1024 GATTGTCACA TAAATGCAAT GAGGAACAAT GAGTAC 1060 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 305 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 8:

Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Vai Vai Ala Ala Leu Pro -21 -20 -15 -10

Vai Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys -5 15 10

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Vai Asn Gin Pro 15 20 25

Vai Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gin Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala 30 35 40

Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Vai Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gin 45 50 55

Thr Pro Trp Ala Vai Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr .* *· 60 65 70 75 ··· ·*· · Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu ’· '· 80 85 90 • · • · « *· · Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Vai Ala Gly Lys Lys Met Vai Vai Gin . 95 100 105 • « * ··· ♦ , ,·, Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn M.* 110 115 120 ·»· V * Ile Pro Gly Gly Gly Vai Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gin Phe 125 130 135 j·, Gly Gly Leu Pro Gly Gin Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu J ·· 140 145 150 155 ··· ·,♦ · Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe • 160 165 170 • ♦ • · *· *· Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gin Vai j*". 175 180 185 **« , *. Gin Cys Pro Ala Glu Leu Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp Ϊ : : 190 195 200 * · f · }**.' Asp Gly Asn Phe Pro Ala Vai Gin Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser * * 205 210 215

Pro Vai Asn Gin Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 220 225 230 235 34 1194 11

Ser Ser Pro Pro Vai Gin Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu 240 245 250

Arg Trp Ala Gin Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys 255 260 265

Vai Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gin Cys 270 275 280

Leu (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 876 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 9: ATGAGGAGCT CCCTTGTGCT GTTCTTTGTC TCTGCGTGGA CGGCCTTGGC CAGTCCTATT 60 CGTCGAGAGG TCTCGCAGGA TCTGTTTAAC CAGTTCAATC TCTTTGCACA GTATTCTGCA 120 GCCGCATACT GCGGAAAAAA CAATGATGCC CCAGCTGGTA CAAACATTAC GTGCACGGGA 180 AATGCCTGCC CCGAGGTAGA GAAGGCGGAT GCAACGTTTC TCTACTCGTT TGAAGACTCT 240 GGAGTGGGCG ATGTCACCGG CTTCCTTGCT CTCGACAACA CGAACAAATT GATCGTCCTC 300 TCTTTCCGTG GCTCTCGTTC CATAGAGAAC TGGATCGGGA ATCTTAACTT CGACTTGAAA 360 GAAATAAATG ACATTTGCTC CGGCTGCAGG GGACATGACG GCTTCACTTC GTCCTGGAGG 420 TCTGTAGCCG ATACGTTAAG GCAGAAGGTG GAGGATGCTG TGAGGGAGCA TCCCGACTAT 480 • CGCGTGGTGT TTACCGGACA TAGCTTGGGT GGTGCATTGG CAACTGTTGC CGGAGCAGAC 540

• »I

,*. ί CTGCGTGGAA ATGGGTATGA TATCGACGTG TTTTCATATG GCGCCCCCCG AGTCGGAAAC 600 f · Φ • · I AGGGCTTTTG CAGAATTCCT GACCGTACAG ACCGGCGGAA CACTCTACCG CATTACCCAC 660 • · • * , ACCAATGATA TTGTCCCTAG ACTCCCGCCG CGCGAATTCG GTTACAGCCA TTCTAGCCCA 720 • · · * · » · p t\ GAGTACTGGA TCAAATCTGG AACCCTTGTC CCCGTCACCC GAAACGATAT CGTGAAGATA 780 i i · *·· GAAGGCATCG ATGCCACCGG CGGCAATAAC CAGCCTAACA TTCCGGATAT CCCTGCGCAC 840 CTATGGTACT TCGGGTTAAT TGGGACATGT CTTTAG 876 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: V · · :T: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 291 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo I./ (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen *../ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 10: ; Met Arg Ser Ser Leu Vai Leu Phe Phe Vai Ser Ala Trp Thr Ala Leu *, ·· 1 5 10 15

Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Vai Ser Gin Asp Leu Phe Asn Gin Phe 20 25 30 119437 35

Asn Leu Phe Ala Gin Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn 35 40 45

Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn He Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro 50 55 60

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser 65 70 75 80

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys 85 90 95

Leu He Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser He Glu Asn Trp He 100 105 110

Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu He Asn Asp He Cys Ser Gly 115 120 125

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp 130 135 140

Thr Leu Arg Gin Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr 145 150 155 160

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val 165 170 175

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp He Asp Val Phe Ser 180 165 190

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr 195 200 205

Val Gin Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg He Thr His Thr Asn Asp He 210 215 220

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro 225 230 235 240 • 9 *Jt,· Glu Tyr Trp He Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp t . 245 250 255 * * * • * * • . lie Val Lys lie Glu Gly He Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gin Pro i * : 260 265 270 e * «{I Asn lie Pro Asp He Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu lie Gly *",* 275 280 285 » J · ’** Thr Cys Leu * : : 290 • (2) SEKVENSSIN ID NO :11 TIEDOT: · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS : yksi juosteinen *,/ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen *·* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:11: J ·*· GCACACCATG GTCGCTGGAT CCATACCTTG TTGGAAGCGT CG 42 V*: (2) SEKVENSSIN ID NO: 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 56 emäsparia 119437 36 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: ATCGGAGCAT GCGGTACCGT TTAAACGAAT TCAGGTAAAC AAGATATAAT TTTCTG 56 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 44 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:13: CTCTTGGATA TCTATCTCTT CACCATGCGT TCCTCCCCCC TCCT 44 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14: CAATAGAGGT GGCAGCAAAA 2 0 (2) SEKVENSSIN ID NO:15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 25 emäsparia t\j (B) TYYPPI: nukleiinihappo ' 1 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen i/ ; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen Ϊ.: i (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 15: . ATCTATCTCT TCACCATGAG GAGCT 25 J t f ·1 t 'V: (2) SEKVENSSIN ID NO:16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ;1,jt (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ί1ϊ\1 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i · • » ·

4 M

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 16: *.,/ TAGATAGAGA AGTGGTACTC C 21 i f « · · * t · *·· · f 0 « • m r

Claims (30)

37 1 1 9437 Patent t ivaa t imuks et

1. Ei-toksinen, ei-toksigeeninen, ei-patogeeninen yhdistel-mä-DNA-Fusarium-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa heterolo- 5 gista proteiinia toimintakykyisesti promoottoriin liittyneenä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnet -t u siitä, että Fusarium on Fusarium graminearum. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että Fusarium graminearum’illa on ATCC 20334:n tunnistusominaispiirteet.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että heterologinen proteiini on sieniproteiini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että heterologinen proteiini on eritettyä pro- 20 teiinia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnet- ... t u siitä, että heterologinen proteiini on sieni entsyymiä. • · • · · • · » · · *· 25

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnet- » t • * « *· " t u siitä, että sienientsyymi on katalaasia, lakkaasia, fe- • · : nolioksidaasia, oksidaasia, oksidoreduktaasia, sellulaasia, ί,ί.ί ksylanaasia, peroksidaasia, lipaasia, hydrolaasia, esteraa- :Y: siä, kutinaasia, proteolyyttistä entsyymiä, aminopeptidaa- 30 siä, karboksipeptidaasia, fytaasia, lyaasia, pektinolyyttis-tä entsyymiä, amylaasia, glukoamylaasia, a-galaktosidaasia, t · .···, β-galaktosidaasia, α-glukosidaasia, β-glukosidaasia, manno- • · sidaasia, isomeraasia, invertaasia, transferaasia, ribonuk- * · • · · : leaasia, kitinaasia tai deoksiribonukleaasia. • · · : : 35 ··· .:.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnet - **·· t u siitä, että sienientsyymi on proteaasi. • · 38 1 1 9 4 3 7

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnet-t u siitä, että sienientsyymi on alkalinen proteaasi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että alkalinen proteaasi on Fusarium oxy-sporum'in trypsiinityyppinen proteaasi.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, t u n- 10. e t t u siitä, että Fusarium oxysporum’in trypsiinityyp-pisellä proteaasilla on SEQ ID NO:4:ssä esitetty aminohapposekvenssi .

12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, t u n - 15. e t t u siitä, että sienientsyymi on endoglukanaasi tai sen variantti.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että endoglukanaasilla on SEQ ID NO:8:ssa 20 esitetty aminohapposekvenssi.

14. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, t u n - ... n e t t u siitä, että sienientsyymi on 1,3-lipaasi tai sen * m variantti. • · · *· " 25 • · *. *ί

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen isäntäsolu, t u n - • · ·.: : n e t t u siitä, että 1,3-lipaasilla on SEQ ID NO:10:ssä esitetty aminohapposekvenssi. ♦ · · * · · • « ·

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, t u n - .*.·. n e t t u siitä, että heterologinen proteiini on hormoni, • · · ,···, kasvutekijä tai reseptori.

• · • · · • · : 17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, t u n - *·· 35. e t t u siitä, että promoottori on sienipromoottori. ·φ· ···· • · 39 1 1 9437

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että promoottori on A. nidulans amdS:stä oleva promoottori. 5

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu sienipromoottori on johdettu geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in trypsiini-tyyppistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on oleelli- 10 sesti sama promoottoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvenssillä.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu promoottorisekvenssi esite- 15 tään SEQ ID N0:5:ssä.

21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää myös valittavissa olevan markkerin. 20

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että markkeri on argB, trpC, pyrG, amdS, ... niaD tai hygB. • · • · ·*· • · • · · *· " 25

23. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isäntäsolu, t u n - · · *.**: n e t t u siitä, että se käsittää myös terminaattorin. • · • · · • · *· · ί

: : 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen isäntäsolu, t u n - n e t t u siitä, että mainittu terminaattori on johdettu 30 geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in trypsiini-tyyppistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on oleelli- * φ « .···. sesti sama terminaattoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvens- **:** sillä. • · • * · • · · ··« · • · ·

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen isäntäsolu, t u n -n e t t u siitä, että mainittu terminaat tori sekvenssi esi-tetään SEQ id NO:6:ssa. · 40 119437

26. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan ei-tok-sista, ei-toksigeenistä, ei-patogeenistä yhdistelmä-DNA-Fusarium-isäntäsolua, joka käsittää mainittua proteiinia koo- 5 dittavan nukleiinihapposekvenssin liittyneenä toimintaky-kyisesti promoottoriin, ja eristetään mainittu proteiini.

27. Promoottorisekvenssi, tunnettu siitä, että se on johdettu geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in tryp- 10 siinityyppistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on oleellisesti sama promoottoriaktiivisuus kuin mainitulla sekvenssillä, jolloin mainitulla promoottorilla on SEQ ID NO:5:ssä esitetty sekvenssi.

28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen promoottorisekvenssi, tunnettu siitä, että promoottorisekvenssillä on SEQ ID No:5:ssä esitetty DNA-sekvenssi.

29. Terminaattorisekvenssi, tunnettu siitä, että se 20 on johdettu geenistä, joka koodittaa Fusarium oxysporum'in trypsiinityyppistä proteaasia tai sen fragmenttia, jolla on oleellisesti sama terminaattoriaktiivisuus kuin mainitulla • M sekvenssillä, jolloin mainitulla terminaattorilla on SEQ id • · ϊ,1·· NO:6:ssa esitetty sekvenssi. 25 • · • 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen terminaattorisekvenssi, M» 1 . tunnettu siitä, että terminaattorisekvenssillä on SEQ • M ID NO: 6 : ssa esitetty DNA-sekvenssi.

• · · . . 30 • · · • · · • · ·«· • ♦ • · • · 1 * • · • 1 · • · · « · ··» • ♦ • t • » · ««· ···· • · 119437 41