ES2340390T3 - Enzimas hibridas. - Google Patents
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Abstract
Proceso para la producción de jarabe, comprendiendo someter almidón granulado a una enzima híbrida en medio acuoso, donde la enzima híbrida comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos.
Description
Enzimas híbridas.
Esta aplicación contiene un Listado de
Secuencias en forma legible para el ordenador.
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a un híbrido entre al menos un módulo de unión a
carbohidratos ("CBM") y al menos el módulo catalítico (CM) de
una glucoamilasa. La invención también se refiere al uso de la
enzima híbrida en un proceso de almidón en el cual se degrada
almidón granulado en azúcares, p. ej., un jarabe, o el cual se puede
usar como nutriente para levaduras en la producción de un producto
de fermentación, tal como especialmente etanol.
Se ha descrito un gran número de procesos para
convertir almidón en hidrolizados de almidón, tales como maltosa,
glucosa o jarabes especializados, ya sea para usarse como
edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como
fructosa. La glucosa también puede fermentarse a etanol u otros
productos de fermentación.
El almidón es un polímero de alto peso molecular
que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste
en aproximadamente un 80% de amilopectina y un 20% de amilosa. La
amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual las cadenas
lineales de residuos de
alfa-1,4-D-glucosa
se unen por enlaces
alfa-1,6-glucosídicos.
La amilosa es un polisacárido lineal formado por
unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por
enlaces alfa-1,4-glucosídicos. En el
caso de convertir almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el
almidón se despolimeriza. El proceso de despolimerización
convencional consiste en una etapa de gelatinización y dos etapas de
proceso consecutivas, llámense un proceso de licuefacción y un
proceso de sacarificación.
El almidón granulado consiste en gránulos
microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura
ambiente. Cuando una suspensión de almidón acuosa se calienta, los
gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las
moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de
"gelatinización" se da un dramático incremento en la
viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es del 30-40%
en un proceso industrial típico, el almidón tiene que adelgazarse o
"licuarse" para que se pueda manejar. Esta reducción en la
viscosidad se obtiene actualmente en gran parte por la degradación
enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena
larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más pequeñas
(maltrodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso
de licuefacción se lleva a cabo típicamente a aproximadamente
105-110ºC durante aproximadamente 5 a 10 minutos
seguido por aproximadamente 1-2 horas a una
temperatura de aproximadamente 95ºC. La temperatura se baja después
a 60ºC, se agregan una gluco-amilasa o una
beta-amilasa y opcionalmente una enzima de
desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el
proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 a 72
horas.
Los procesos de conversión de almidón
convencionales consumen mucha energía debido a los diferentes
requerimientos en términos de temperatura durante las diferentes
etapas. Es entonces deseable poder seleccionar y/o diseñar enzimas
usadas en el proceso de tal forma que el proceso total pueda
llevarse a cabo sin tener que gelatinizar el almidón.
La invención proporciona en un primer aspecto
una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un
módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia
de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos. El módulo
catalítico puede ser preferentemente de origen fúngico, bacteriano o
vegetal.
En otros aspectos la invención proporciona una
secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer
aspecto, un constructo de ADN comprendiendo la secuencia de ADN que
codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de
expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima
híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un
vector; dicha célula huésped siendo capaz de expresar la secuencia
de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.
En un aspecto final la invención proporciona
procesos para producir jarabe o un producto de fermentación a partir
de almidón granulado comprendiendo someter el almidón crudo a una
alfa-amilasa y a una enzima híbrida teniendo
actividad glucoamilasa de la invención en un medio acuoso. Si se
desea un producto de fermentación el proceso incluye la presencia de
un organismo de fermentación.
La figura 1 compara el rendimiento de etanol por
gramo de DS de dos híbridos glucomilasa-SBM (Módulo
de Unión a Almidón) (TEAN-1 y
TEAN-3) que comprenden el dominio catalítico de
T. emersonii y el SBM de A. niger con la glucoamilasa
de Talaromyces emersonii de tipo silvestre.
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El término "almidón granulado" se entiende
como almidón crudo no cocido, es decir, almidón que no se ha
sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como
pequeños gránulos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en
almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de
gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos
pueden absorber una pequeña cantidad de líquido. Hasta 50ºC a 70ºC
el hinchamiento es reversible, dependiendo el grado de
reversibilidad del almidón particular. Con temperaturas más altas
comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización.
El término "temperatura de gelatinización
inicial" se entiende como la temperatura mínima a la que comienza
la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua se
empieza a gelatinizar entre 50ºC y 75ºC; la temperatura exacta de
gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar
fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de
gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, la
variedad particular de la especie vegetal así como con las
condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la
temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la
temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en un 5% de los
gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y
Lii. C., Starch/Stärke, Vol. 44 (12) págs. 461-466
(1992).
El término "hidrolizado de almidón soluble"
se entiende como los productos solubles del proceso de la invención
y pueden comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como
glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla
de éstas. Preferiblemente al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98% o al menos el 99% de los sólidos secos del almidón
granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.
El término "homología" de polipéptidos se
entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican
una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La
homología puede determinarse adecuadamente mediante programas
informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en
el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin
Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B.
y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453. Se usan los ajustes siguientes para
comparar las secuencias de aminoácidos: penalización de creación GAP
de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.
El término "homología" de polipéptidos se
entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican
una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La
homología puede determinarse adecuadamente mediante programas
informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en
el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin
Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S. B.
y Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453. Se usan los siguientes escenarios para la
comparación de secuencias de aminoácidos: penalización de creación
GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.
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Los números de clasificación de enzimas (números
EC) referidos en la presente descripción con las reivindicaciones
están de acuerdo con las Recomendaciones (1992) del Comité de
Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular
Biology, Academic Press Inc., 1992.
Las enzimas híbridas mencionadas en la presente
incluyen especies que comprenden una secuencia de aminoácidos de una
glucoamilasa (EC 3.2.1.3) enlazada (es decir, unida covalentemente)
a una secuencia de aminoácidos que comprende un módulo de unión a
carbohidratos (CBM). El término "módulo de unión a carbohidratos
(CBM)" también puede referirse como un "dominio de unión a
carbohidratos (CBD)".
Las enzimas híbridas que contienen CBM, así como
las descripciones detalladas de la preparación y purificación de las
mismas, se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, WO 90/00609,
WO 94/24158 y WO 95/16782, así como Greenwood et al.,
Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) págs.
1295-1305]. Por ejemplo, se pueden preparar al
transformar en una célula huésped una construcción de ADN que
comprenda al menos un fragmento de ADN que codifique el módulo de
unión a carbohidratos ligado, con o sin un enlazador, a una
secuencia de ADN que codifique la glucoamilasa de interés, con o sin
su propio módulo de unión a carbohidratos nativo, y cultivando la
célula huésped transformada para expresar el gen fusionado. El
producto recombinante resultante (enzima híbrida), comúnmente
referida en la técnica como una "proteína de fusión", puede
describirse por la siguiente fórmula general:
A-CBM-MR-X
En la fórmula anterior, A-CBM es
la región N-terminal o C-terminal de
una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos el módulo de
unión a carbohidratos (CBM) per se. MR es la región media (el
enlazador), y X es la secuencia de residuos aminoácido de un
polipéptido codificado por una secuencia de ADN que codifica la
enzima (u otra proteína) a la cual se va a enlazar el CBM.
La porción A puede estar ya sea ausente (de tal
manera que A-CBM sea un CBM per se, es decir,
no comprenda residuos aminoácidos que no sean aquellos que
constituyen el CBM) o puede ser una secuencia de uno o más residuos
de aminoácido (que funcione como una extensión terminal del CBM
per se). El enlazador (MR) puede estar ausente, o ser un
enlace, o un grupo de enlace corto que comprenda de alrededor de 2 a
aproximadamente 100 átomos de carbono, en particular de 2 a 40
átomos de carbono. Sin embargo, el MR es preferentemente una
secuencia de aproximadamente 2 a alrededor de 100 residuos de
aminoácido, más preferiblemente de alrededor de 2 a 40 residuos de
aminoácido, así como de 2 a 15 residuos de aminoácido.
La fracción X puede constituir o bien el
N-terminal o la región C-terminal de
la enzima híbrida global.
Por tanto será aparente a partir de lo anterior
que el CBM en una enzima híbrida del tipo en cuestión puede
colocarse C-terminalmente,
N-terminalmente o internamente en la enzima
híbrida.
En la forma de realización donde un CBM es
interno en el CBM puede enlazarse por medio de dos enlazadores.
Debe entenderse que la enzima híbrida de la
invención puede tener más de un CBM, tal como dos o tres CBMs. La
forma de realización donde se añade más de un CBM está cubierta: p.
ej., construcciones en serie de dos o más CBDs N- o
C-terminalmente, una construcción con un CBM
N-terminal + un C- terminal.
Ejemplos de híbridos contemplados según la
invención en consecuencia también incluyen un híbrido de las
siguientes fórmulas generales:
A-CBM1-MR1-X-MR2-CBM2-B
A-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2-X
A-CBM1-MR1-CBM2-X-MR3-CBM3-C
El CBM1 y CBM2 pueden ser diferentes o los
mismos. B y C pueden estar o bien ausentes (de manera que, p. ej.,
B-CBM2 sea un CBM2 per se, es decir, no
comprenda residuos de aminoácidos que no sean los que constituyen el
CBM2) o puede (como A) ser una secuencia de uno o más residuos de
aminoácido (que funcione como extensiones terminales del CBM2 per
se). Los enlazadores pueden estar ausentes o presentes.
Una secuencia enlazadora puede ser cualquier
secuencia enlazadora adecuada. En formas de realización preferidas
la(s) secuencia(s) enlazadora(s) se
deriva(n) de la glucoamilasa Athelia rolfsil, la
glucoamilasa de A. niger, la glucoamilasa de Talaromyces
emersonii, o la alfa-amilasa de A.
kawachii. Ejemplos específicos de tales secuencias enlazadoras
incluyen:
- -
- enlazador AMG de A. niger.
- TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA (SEC ID nº: 20),
- -
- enlazador de alfa-amilasa de A. kawachii:
- TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS (SEC ID nº: 21),
- -
- enlazador AMG de Athelia rolfsii:
- STGATSPGGSSGS (SEC ID nº: 27),
PEPTPEPT (SEC ID nº:
22)
El enlazador también puede ser fragmentos de los
enlaces anteriores.
En otra forma de realización preferida las
enzimas híbridas tienen una secuencia enlazadora que difiere de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 20, SEC ID nº:
21, SEC ID nº: 27, o SEC ID nº: 22 en no más de 10 posiciones, no
más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones,
no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4
posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o
incluso no más de 1 posición.
Un módulo de unión a carbohidratos (CBM) es una
secuencia de aminoácidos polipéptidos que se une preferentemente a
un poli- u oligosacárido (carbohidrato), frecuentemente, pero no
necesariamente de forma exclusiva, a una forma insoluble en agua
(incluyendo cristalina) de los mismos.
Los CBMs derivados a partir de enzimas de
degradación de almidón comúnmente se conocen como módulos de unión a
almidón o CBMs (CBMs que pueden ocurrir en determinadas enzimas
amilolíticas, tal como en determinadas glucoamilasas, o en enzimas
tales como ciclodextrina glucanotransferasas, o en
alfa-amilasas). Asimismo, otras subclases de CBMs
abrazarían, p. ej., módulos de enlace de celulosa (CBMs de enzimas
celulolíticas), módulos de unión de quitina (CBMs que típicamente
ocurren en quitinasas), módulos de unión de xilano (CBMs que
típicamente ocurren en xilanasas), módulos de unión de manano (CBMs
que típicamente ocurren en mananasas). Los SBMs se conocen
frecuentemente como SBDs (Dominios de Unión a Almidón).
Los CBMs pueden encontrarse como partes
integrales de polipéptidos grandes o proteínas que consisten en dos
o más regiones de secuencias de aminoácidos polipéptidos,
especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas) las cuales
típicamente comprenden un módulo catalítico conteniendo el sitio
activo para la hidrólisis de sustrato y un módulo unión a
carbohidratos (CBM) para unirse al sustrato de carbohidrato en
cuestión. Tales enzimas pueden comprender más de un módulo
catalítico y, p. ej., uno, dos o tres CBMs, y opcionalmente
comprender una o más regiones de secuencias de aminoácidos
polipéptidos que enlacen el/los CBM(s) con el/los
módulo(s) catalítico(s), una región de éste último
tipo normalmente siendo conocida como un "enlazador". Ejemplos
de enzimas hidrolíticas comprendiendo un CBM, algunas de las cuales
se han mencionado ya arriba, son celulasas,
alfa-amilasas, xilanasas, Mananasas,
arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. También se han
encontrado CBMs en algas, p. ej., en el alga roja Porphyra
purpurea en forma de una proteína de unión a polisacáridos no
hidrolítica.
En proteínas/polipéptidos en los cuales ocurren
los CBMs (p. ej. enzimas, típicamente enzimas hidrolíticas), un CBM
puede localizarse en el N o C terminal o en una posición
interna.
Esa parte de un polipéptido o proteína (p. ej.,
enzima hidrolítica) que constituye un CBM per se típicamente
consiste en más de aproximadamente 30 y menos que aproximadamente
250 residuos de aminoácidos.
El "Módulo de Unión a Carbohidratos de la
Familia 20" o un módulo CBM-20 está en el
contexto de esta invención definido como una secuencia de
aproximadamente 100 aminoácidos que tiene al menos 45% de homología
al módulo de unión a carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en
la figura 1 por Joergensen et al (1997) en Biotechnol. Lett.
19:1027-1031. El CBM comprende los por lo menos 102
aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del
aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de las Familias de
Glicósido Hidrolasa aplicada en esta descripción sigue el concepto
de Coutinho, P.M. Henrissat;, B. (1999) servidor CAZy
Carbohidrate-Active en la URL:
afmb.cnrs-mrs.fr/\simcazy/CAZY/index.html
alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The
modular structure of cellulases and other
carbohidrate-active enzymes: an integrated database
approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose
Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S.
Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Ca., Tokio, págs.
15-23 y Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001;
Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and
functional modules, Current Opinión in Structural Biology
11:593-600.
Ejemplos de enzimas que comprenden un CBM
adecuado para el uso en el contexto de la invención son
alfa-amilasas, alfa-amilasas
maltogénicas, celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas,
acetilesterasas y quitinasas. Otros CBMs de interés en relación a la
presente invención incluyen CBMs que se derivan de glucoamilasas (EC
3.2.1.3) o de CGTasas (EC 2.4.1.19).
Los CBMs que se derivan de fuentes fúngicas,
bacterianas o vegetales generalmente serán adecuados para el uso en
el contexto de la invención. Se prefieren los CBMs de Aspergillus
sp., Athelia sp., Talaromyces sp, Bacillus
sp., Klebsiella sp., o Rhizopus sp. Se prefieren
los CBMs de origen fúngico. A este respecto, técnicas adecuadas para
aislar los genes pertinentes se conocen bien en la técnica.
Se prefieren para la invención los CBMs de la
Familia de Módulo de Unión a Carbohidratos 20. Una "Familia de
Módulo de Unión a Carbohidratos 20" o un módulo
CBM-20 está definido en el contexto de esta
invención como una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos
teniendo al menos un 45% de homología con el Módulo de Unión a
carbohidratos (CBM) del polipéptido descrito en la figura 1 por
Joergensen et al (1997) en Biotechnol. Lett.
19:1027-1031. El CBM comprende los últimos 102
aminoácidos del polipéptido, es decir, la subsecuencia del
aminoácido 582 al aminoácido 683. La numeración de CBMs aplicada en
esta descripción sigue el concepto de Coutinho & Henrissat 1999
(Coutinho, P.M. & Henrissat, B. The modular structure of
cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an
integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and
Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiia, K. Haiashi, K.
Sakka, Y. Kobaiashi, S. Karita y T. Kimura Eds., Uni Publishers Co.,
Tokyo, págs. 15-23 o de forma alternativa: Coutinho,
P.M. & Henrissat, B. (1999) servidor de Enzimas Activas de
Carbohidrato en la URL:
afmb.cnrs-mrs.fr/\simcazy/CAZY/index.html).
Los CBMs de la Familia 20 del Módulo de Unión a
Carbohidratos adecuados para la invención pueden derivarse de
glucoamilasas de Aspergillus awamori (SWISSPROT Q12537),
Aspergillus kawachii (SWISSPROT P23176), Aspergillus
niger (SWISSPROT P04064)1 Aspergillus oryzae
(SWISSPROT P36914)1 de alfa-amilasas de
Aspergillus kawachii (EMBL:#AB008370) Aspergillus
nidulans (NCBL AAF17100.1) de beta-amilasas de
Bacillus cereus (SWISSPROT P36924) o de CGTasas de
Bacillus circulans (SWISSPROT P43379). Se prefiere un CBM de
la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii
(EMBL:#AB008370) así como CBMs que tienen al menos el 50%, 60%,
70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos el 99% de homología
con el CBM de la alfa-amilasa de Aspergillus
kawachii (EMBL:#AB008370), es decir un CBM que tiene al menos el
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos el 99% de
homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Se
prefieren también para la invención los CBMs de la Familia 20 del
Módulo de Unión a Carbohidratos que tienen las secuencias de
aminoácidos mostradas en la SEC ID NO: 3 (CBM de Bacillus
flavorthermus), SEC ID NO: 4 (CBM de Bacillus sp.) y SEC
ID NO: 5 (CBM de Alcaliphillic Bacillus). Los CBMs que más se
prefieren incluyen los CBMs de la glucoamilasa de Horrnoconis
sp. tal como de Homoconis resinae (Sin. Hongo Creosote o
Amorphotheca resinae) tales como el CBM de
SWISSPROT:Q03045 (SEC ID NO: 6), de Lentinuta sp., tal
como de Lentinula edodes (hongo shiitake) tal como el CBM de
SPTREMBL:Q9P4C5 (SEC ID NO: 7), de Neurospora sp. tal
como de Neurospora crassa tal como el 5 CBM de
SWISSPROT:P148Q4 (SEC ID NO: 8), de Talaromyces sp.,
tal como de Talaromyces byssochlamydioides tal como el CBM de
NN005220 (SEC ID NO: 9), de Geosmithia sp., tal como de
Geosmithia cylindrospora, tal como el CBM de NN48286 (SEC ID
NO: 10), de Eupenicillium sp. tal como de Eupenicillium
ludwigii tal como el CBM de NN005968 (SEC ID NO: 12), de
Aspergillus sp., tal como de Aspergillus japonicus tal
como el CBM de NN001136 (SEC ID NO: 13), de Penicillum sp.,
tal de Penicillum cf. miczynskii, tal como el CBM de
NN48691 (SEC ID NO: 14), de Mz1 Penicillium sp., tal como el
CBM de NN48690 (SEC ID NO: 15), de Thysanophora sp., tal como
el CBM de NN48711 (SEC ID NO: 16), y de Humicola sp., tal
como de Humicola grisea var. Thermoidea tal como el CBM de
SPTREMBLQ12623 (SEC ID NO: 17). Los CBMs que más se prefieren
incluyen el CBM de glucoamilasa de Aspergillus sp., tal como
de Aspergillus Niger, tal como la SEC ID NO: 18, y Athelia
sp., tal como de Athelia rolfsii, tal como la SEC ID NO:
19. Se prefiere también para la invención cualquier CBD que tenga al
menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso por lo menos el
99% de homología con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de
CBD mencionadas arriba. La glucoamilasa de Aspergillus sp.
así como de Aspergillus Niger, así como la SEC ID nº: 18, y
Athelia. sp. tal como de Athelia rolfsii, tal como la
SEC ID nº: 19. También se prefiere para la invención cualquier CBD
teniendo al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso al
menos el 99% de homología con cualquiera de las secuencias de
aminoácidos de CBD anteriormente mencionadas.
Otros CBMs adecuados de la Familia 20 del Módulo
de Unión a Carbohidratos pueden encontrarse en el servidor de
Enzimas Activas en Carbohidratos en la URL:
afmb.enrs-mrs.fr/-cazy/CAZY/index.html).
Otro CBM puede encontrarse en una glucoamilasa
de Mucor circinelloides, Rhizopus oryzae, Arxula
adeninivorans.
Una vez que una secuencia de nucleótidos
codificando la región de unión a sustrato (unión a carbohidratos) se
ha identificado, ya sea como ADNc o ADN cromosómico, puede
manipularse después de una variedad de formas para fusionarla a una
secuencia de ADN que codifique la enzima de interés. El fragmento de
ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la unión a
carbohidratos y el ADN que codifica la enzima de interés se ligan
después con o sin un enlazador. El ADN ligado resultante puede
manipularse después de una variedad de formas para lograr la
expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Las glucoamilasas que son adecuadas como la base
para los híbridos CBM/glucoamilasa de la presente invención
incluyen, por ejemplo, glucoamilasas derivadas de un organismo
fúngico, bacteriano o vegetal. Las glucoamilasas que se prefieren
son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que
consiste en glucoamilasas de Aspergillus, en particular las
glucoamilasas G1 o G2 de A. niger (Boel et al. (1984),
EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102) mostradas en la SEC ID
nº: 24), o variantes de las mismas, tal como se describe en WO
92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); las
glucoamilasas de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae
(Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o
variantes o fragmentos de las mismas. Otras glucoamilasas incluyen
glucoamilasas de Athelia rolfsii (patente de EEUU nº.
4.727.046) mostradas en la SEC ID nº: 26, glucoamilasas de
Talaromyces, en particular, derivadas de Talaromyces
emersonii (WO 99/28448) mostradas en la SEC ID nº: 25),
Talaromyces leycettanus (patente de EEUU nº. RE. 32.153),
Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente
de EEUU nº. 4.587.215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas
incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular
C. thermoamylolyticum (EP 135.138), y C.
thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). La glucoamilasa puede estar
con o sin su CBM nativo, pero comprende al menos el módulo
catalítico (CM). Las glucoamilasas preferidas son de origen fúngico
o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas
de Aspergillus, en particular las glucoamilasas G1 o G2 de
A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p.
1097-1102) mostradas en la SEC ID nº: 24), o
variantes de las mismas, tal como se describen en WO 92/00381, WO
00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); las glucoamilasas
de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol.
Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o variantes o
fragmentos de las mismas. Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasa
de Athelia rolfsii (patente de EEUU nº. 4.727.046) mostrada
en la SEC ID nº: 26, glucoamilasas de Talaromyces, en
particular, derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448)
mostrada en la SEC ID nº: 25), de Talaromyces leycettanus
(patente de EEUU nº. RE. 32.153), Talaromyces duponti,
Talaromyces thermophilus (patente de EEUU nº. 4.587.215).
Glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del
género Clostridium, en particular C.
thermoamylolyticum (EP 135.138), y C.
thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). La glucoamilasa puede estar
con o sin su CBM nativo, pero comprende al menos el módulo
catalítico (CM).
Una glucoamilasa preferida es la glucoamilasa de
A. niger descrita en la SEC ID nº: 24, o una glucoamilasa
con más del 50%, tal como el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
o 99% de homología (identidad) con la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID nº: 24.
Debe entenderse que la glucoamilasa (módulo
catalítico) puede ser en una forma de realización un fragmento
activo que tenga actividad glucoamilasa.
Otra glucoamilasa preferida es la glucoamilasa
de Athelia rolfsii mostrada en la SEC ID nº: 26, o una
glucoamilasa con más del 50%, tal como el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98% o 99% de homología (identidad) con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 26.
Una tercera glucoamilasa preferida es la
glucoamilasa de Talaromyces emersonii mostrada en la SEC ID
nº: 25, o una glucoamilasa con más del 50%, tal como el 60%, 70%,
80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología (identidad) con la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 25.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto la invención se refiere a una
enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un
módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia
de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos. En una forma
de realización preferida el módulo catalítico es de origen fúngico.
En una forma de realización más preferida el módulo catalítico se
deriva de una cepa de Talaromyces, preferiblemente
Talaromyces emersonii, una cepa de Aspergillus,
preferiblemente Aspergillus niger o una cepa de
Athelia, preferiblemente Athelia rolfsii.
En una forma de realización preferida la enzima
híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene
actividad de glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii y
un módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o
Athelia rolfsii. El híbrido puede incluir en una forma de
realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de
Aspergillus Niger, Athelia rolfsii, A. kawachii
o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el
módulo de unión a carbohidratos.
En una forma de realización preferida la enzima
híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene
actividad glucoamilasa derivada de Aspergillus niger y un
módulo de unión a carbohidratos de Athelia rolfsii o
Talaromyces emersonii. El híbrido puede incluir en una forma
de realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de
Aspergillus niger, Athelia rolfsii, A. kawachii
o Talaromyces emersonii entre el módulo catalítico y el
módulo de unión a carbohidratos.
En otra forma de realización preferida la enzima
híbrida de la invención comprende un módulo catalítico que tiene
actividad glucoamilasa derivada de Athelia rolfsii y un
módulo de unión a carbohidratos de Aspergillus niger o
Talaromyces emersonii. El híbrido puede incluir en una forma
de realización una secuencia enlazadora, preferiblemente de
Aspergillus niger, Athelia rolfsii o Talaromyces
emersonii entre el módulo catalítico y el módulo de unión a
carbohidratos.
Las Aspergillus niger, Athelia
rolfsii o Talaromyces emersonii que se prefieren son las
mostradas en las SEC ID Nos: 24, 25, y 26, respectivamente.
Preferiblemente la enzima híbrida comprende una
secuencia de CBM que tiene al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,
97% o incluso al menos un 99% de homología con cualquiera de las
secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID nº: 3, SEC ID nº:
4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 7, SEC ID nº: 8, SEC ID
nº: 9, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13,
SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 17, SEC ID
nº: 18, oSECIDn0: 19.
De forma incluso más preferida la enzima híbrida
comprende una secuencia de CBM con una secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID nº: 28. En otra forma de realización preferida
la secuencia de CBM tiene una secuencia de aminoácidos que difiere
de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID nº: 28, o cualquiera de las otras secuencias
de CBM, en no más de 10 posiciones de aminoácido, no más de 9
posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más
de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no
más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o incluso no más de 1
posición. En una forma de realización más preferida la enzima
híbrida comprende un CBM derivado de una glucoamilasa de Athelia
rolfsii, tal como el AMG de Athelia rolfsii AHU 9627
descrita en la patente de EEUU nº. 4.727.026 o el CBM de
Aspergillus niger.
\newpage
Los híbridos específicos contemplados según la
invención incluyen los siguientes:
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión recombinantes que pueden comprender una
secuencia de ADN codificando la enzima híbrida, un promotor, una
secuencia de péptidos de señal, y señales de detección
transcripcional y traduccional. Los diferentes ADN y secuencias de
control anteriormente descritas pueden unirse para producir un
vector de expresión recombinante que pueda incluir uno o más sitios
de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución
de la secuencia de ADN codificando el polipéptido en sitios de este
tipo. De forma alternativa, la secuencia de ADN de la presente
invención puede expresarse al insertar la secuencia de ADN o un
constructo de ADN comprendiendo la secuencia en un vector apropiado
para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de
codificación se localiza en el vector de modo que la secuencia de
codificación se enlaza operativamente con las secuencias de control
apropiadas para la expresión, y posiblemente la secreción.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus), que pueda someterse
convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y pueda
provocar la expresión de la secuencia de ADN. La elección del vector
típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula
huésped en la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden
ser plásmidos circulares, lineales o cerrados. El vector puede ser
un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe
como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea
independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un
elemento extracromosómico, un minicromosoma, un cósmido o un
cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para
asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede
ser uno que, al introducirse en la célula huésped, se integra en el
genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en los
cuales se ha integrado. El sistema de vector puede ser un solo
vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contengan
juntos el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula
huésped, o un transposón.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de la presente invención
preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionares, los
cuales permiten una selección fácil de células transformadas. Un
marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona
resistencia a biocidas o vírica, resistencia a metales pesados,
prototrofia a auxótrofos, y similares.
Ejemplos de marcadores seleccionares para su uso
en una célula huésped de hongo filamentoso pueden seleccionarse del
grupo incluyendo, pero no limitándose a, amdS (acetamidasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina
acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD
(nitrato-reductasa), pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa),
sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), y
marcadores de resistencia a glufosinato, así como equivalentes de
otras especies. Se prefiere para su uso en una célula de
Aspergillus los marcadores el amdS y pyrG de Aspergillus
nidulans o Aspergillus oryzae y el marcador bar de
Streptomyces higroscopicus. Además, la selección puede
realizarse mediante cotransformación, p. ej., como se describe en WO
91/17243, donde el marcador seleccionable está sobre un vector
separado.
Los vectores de la presente invención contienen
preferiblemente un(os) elemento(s) que permite la
integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o
la replicación autónoma del vector en la célula independiente del
genoma de la célula.
Los vectores de la presente invención pueden
integrarse en el genoma de la célula huésped cuando se introducen en
una célula huésped. Para la integración, el vector puede basarse en
la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés o
cualquier otro elemento del vector para la integración estable del
vector en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa.
De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ADN
adicionales para dirigir la integración mediante recombinación
homologa en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ADN
adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la
célula huésped en una(s) ubicación(es) preci-
sa(s) en el/los cromosoma(s). Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener preferiblemente un número suficiente de ADN, tal como de 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible de 800 a 1.500 pares de bases, los cuales sean altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para intensificar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia homologa a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ADN de codificación o no codificación. En cambio, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homologa. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia homologa a una secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped, y, además, puede ser secuencias de codificación o no codificación.
sa(s) en el/los cromosoma(s). Para incrementar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deberían contener preferiblemente un número suficiente de ADN, tal como de 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible de 800 a 1.500 pares de bases, los cuales sean altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para intensificar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia homologa a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ADN de codificación o no codificación. En cambio, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homologa. Estas secuencias de ADN pueden ser cualquier secuencia homologa a una secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped, y, además, puede ser secuencias de codificación o no codificación.
Para la replicación autónoma, el vector puede
comprender además un origen de replicación que permite que el vector
se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El
episoma que replica al vector plásmido AMA1 descrito en WO 00/24883
puede utilizarse.
Más de una copia de una secuencia de ADN
codificando un polipéptido de interés puede insertarse en la célula
huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ADN. La
amplificación estable de la secuencia de ADN puede obtenerse al
integrar al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma
de la célula huésped usando métodos bien conocidos en la técnica y
seleccionando los transformantes.
Los procedimientos usados para enlazar los
elementos anteriormente descritos para construir los vectores de
expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un
experto en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al, 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbor, Nueva York).
La célula huésped puede ser de origen fúngico,
tal como originaria de un hongo filamentoso o de levadura, o de
origen bacteriano, tal como originario de Bacillus.
La célula huésped de la invención, ya sea
comprendiendo un constructo de ADN o un vector de expresión
comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida, se
usa ventajosamente como una célula huésped en la producción
recombinante de la enzima híbrida. La célula puede transformarse con
un vector de expresión. De forma alternativa, la célula puede
transformarse con el constructo de ADN de la invención codificando
la enzima híbrida, convenientemente al integrar el constructo de ADN
(en una o más copias) en el cromosoma huésped. La integración del
constructo de ADN en el cromosoma huésped puede realizarse según
métodos convencionales, p. ej., mediante recombinación homologa o
heteróloga.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped es un hongo filamentoso representado por los grupos
siguientes de Ascomycota, e incluyen, p. ej., Neurospora,
Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium
(=Aspergillus). En una forma de realización más preferida, el
hongo filamentoso incluye todas las formas filamentosas de la
subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por
Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The
Fungi, 8ª edición, 1995, CAE internacional, University Press,
Cambridge, Reino Unido. Los hongos filamentosos se caracterizan por
un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano,
quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento
vegetativo es mediante alargamiento hifal y catabolismo de carbono
es estrictamente aeróbico.
En una forma de realización aún más preferida,
la célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una especies
de, pero no limitada a una célula seleccionada del grupo que
consiste en una cepa perteneciente a una especie de
Aspergillus, preferiblemente Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus
kawachii, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de
Fusarium oxisporium, Fusarium graminearum (en el
estado perfecto llamada Gribberella zeae, previamente
Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y
Gibberella roseum f. sp. cerealis), o Fusarium
sulphureum (en el estado perfecto llamada Gibberella
puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides,
Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium,
Fusarium roseum, y Fusarium roseum var.
graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de
Fusarium crookwellense), o Fusarium venenatum.
En una forma de realización más preferida, la
célula huésped de hongo filamentoso es una célula de una cepa
perteneciente a una especie de Aspergillus, preferiblemente
Aspergillus oryzae, o Aspergillus niger.
La célula huésped puede ser una célula huésped
de hongo filamentoso de tipo salvaje o una variante, un mutante o
una célula huésped de hongo filamentoso modificada genéticamente. En
una forma de realización preferida de la invención la célula huésped
es una proteasa deficitaria o una cepa menos de proteasa. También se
contemplan específicamente cepas de Aspergillus, tales como
cepas de Aspergillus niger, modificadas genéticamente para
romper o reducir la expresión de glucoamilasa,
alfa-amilasa estable de ácido,
alpha-1,6 transglucosidasa, y actividades
proteasa.
En otra forma de realización preferida, la
célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura"
como se utiliza en este caso incluye levadura ascosporógena
(Endomicetales), levadura basidiosporógena, y levadura perteneciente
a los Fungi Imperfecti (Blastomicetes). Desde la
clasificación de una levadura puede cambiar en el futuro, para los
objetivos de esta invención, la levadura deberá definirse como se
describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A.,
Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol.
Symposium Series No. 9, 1980).
En una forma de realización aún más preferida,
la célula huésped de levadura es una célula Candida,
Hansenula, Kluyveromices, Pichia,
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o
Yarrowia.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped de levadura es una célula Saccharomyces
carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii,
Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o
Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped de levadura es una célula de
Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped de levadura es una célula del
Yarrowia lipolytica.
Las células micóticas pueden transformarse por
un proceso que incluye la formación de protoplasto, la
transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared
celular de una manera conocida per se. Los procedimientos
adecuados para la transformación de células huésped de
Aspergillus se describen en EP 238 023 y Yelton et
al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
81: 1470-1474. Los métodos adecuados para
transformar especies de Fusarium se describen por Malardier
et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO
96/00787.
La levadura puede transformarse usando los
procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y
Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs
182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et
al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et
al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
75: 1920.
Las técnicas usadas para aislar o clonar una
secuencia de ADN codificando un polipéptido de interés se conocen en
la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, la preparación
a partir de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de
las secuencias de ADN de la presente invención a partir de este ADN
genómico se pueden llevar a cabo, p. ej., usando la bien conocida
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el tamiz de anticuerpos
de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados
con características estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis
et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application,
Academic Press, Nueva York. Pueden utilizarse otros procedimientos
de amplificación de DNA tales como la reacción en cadena de la
ligasa (LCR), transcripción activada y ligada (LAT) y amplificación
a base de secuencias de ADN (NASBA).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a una secuencia de ADN aislada comprendiendo una secuencia de
ADN que codifica una enzima híbrida comprendiendo una secuencia de
aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa
y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a
carbohidratos, donde el módulo catalítico.
El término "secuencia de ADN aislada" como
se utiliza en la presente se refiere a una secuencia de ADN, la cual
está esencialmente libre de otras secuencias de ADN, p. ej., al
menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos
aproximadamente un 40% pura, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 60% pura, incluso más preferiblemente al menos
aproximadamente un 80% pura, y de la forma más preferible al menos
aproximadamente un 90% pura como se ha determinado por
electroforesis de agarosa.
Por ejemplo, una secuencia de ADN aislada puede
obtenerse por procedimientos de clonación estándar usados en
ingeniería genética para recolocar la secuencia de ADN de su
ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los
procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el
aislamiento de un fragmento de ADN deseado que comprenda la
secuencia de ADN que codifique el polipéptido de interés, la
inserción del fragmento en una molécula del vector, y la
incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se
replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ADN. Una
secuencia de ADN aislada puede manipularse de una variedad de
maneras para proporcionar la expresión del polipéptido de interés.
La manipulación de la secuencia de ADN antes de su inserción en un
vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de
expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ADN utilizando
métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere, entre otras
cosas, a un constructo de ADN comprendiendo una secuencia de ADN
codificando una enzima híbrida comprendiendo una secuencia de
aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa
y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a
carbohidratos. En una forma de realización el módulo catalítico es
de origen fúngico. "Constructo de ADN" se define aquí como una
molécula de ADN, ya sea mono o bicatenaria, que se aísla de un gen
de origen natural o que se ha modificado para contener segmentos de
ADN, que se combina y yuxtapone de tal manera, que de otro modo no
existiría en la naturaleza. El término constructo de ADN es sinónimo
del término casete de expresión cuando el constructo de ADN contiene
todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una
secuencia de codificación de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Un híbrido de la invención puede producirse
usando cualquier método, por ejemplo, comprendiendo (a) cultivar una
célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del
híbrido; y (b) recuperar el híbrido.
En los métodos de producción de la presente
invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado
para la producción del híbrido usando métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en
matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala
(incluyendo fermentaciones continuas, intermitentes o en estado
sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en
un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión y/o
el aislamiento del híbrido. El cultivo se desarrolla en un medio
nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y
sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica.
Medios adecuados están disponibles a través de proveedores
comerciales o pueden prepararse según composiciones publicadas (p.
ej., en catálogos de la Colección Americana de Tipos de Cultivo). Si
el híbrido se segrega en el medio nutritivo, éste puede recuperarse
directamente del medio. Si el híbrido no se segrega, éste puede
recuperarse de los Usados de células.
El híbrido puede detectarse usando métodos
conocidos en la técnica que sean específicos para el híbrido. Estos
métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos
específicos, la formación de un producto enzimático, o la
desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo
enzimático puede utilizarse para determinar la actividad del híbrido
como se describe en este caso.
El híbrido resultante puede recuperarse mediante
métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el híbrido puede
recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos
convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugado,
filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o
precipitación.
El híbrido de la presente invención puede
purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la
técnica incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (p. ej.,
intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y
exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej.,
isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej.,
precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o
extracción (véase, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and
Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
La enzima híbrida del primer aspecto de la
invención puede utilizarse en un proceso para producir jarabe o un
producto de fermentación, tal como especialmente etanol, en el que
el almidón granulado se trata en un medio acuoso con una enzima
híbrida de la invención que tiene actividad glucoamilasa. La enzima
híbrida que tiene actividad glucoamilasa puede añadirse en una forma
de realización en una cantidad de 0,02-20 AGU/g de
DS, preferiblemente 0,1-10 AGU/g de DS, tal como
aproximadamente 0,1, 0,3, 0,5, 1 o 2 AGU/g de DS, tal como entre
0,1-0,5 AGU/g de DS. El almidón granulado puede
someterse además a una alfa-amilasa, preferiblemente
una descrita a continuación.
La alfa-amilasa, según la
invención, puede tener cualquier origen. Se prefieren son
alfa-amilasas de origen fúngico o bacteriano. La
alfa-amilasa puede ser una
alfa-amilasa de Bacillus, tal como, derivada
de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens,
B. stearothermophilus, y B. subtilis. Otras
alfa-amilasas incluyen alfa-amilasas
derivadas de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512,
NCIB 12513 ó DSM 9375, todas las cuales se describen en detalle en
WO 995/26397, y la alfa-amilasa descrita por
Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research
Communications, 151 (1988), págs. 25-31. Otras
variantes de alfa-amilasa e híbridos se describen en
WO 96/23874, WO 97/41213, y WO 99/19467.
Otra alfa-amilasa incluye las
alfa-amilasas derivadas de una cepa de
Aspergillus, tales como alfa-amilasas de
Aspergillus oryzae y Aspergillus niger. En una forma
de realización preferida la alfa-amilasa es una
alfa-amilasa ácida. En una forma de realización más
preferida la alfa-amilasa ácida es una
alfa-amilasa ácida fúngica o una
alfa-amilasa ácida bacteriana. Más preferiblemente,
la alfa-amilasa ácida es una
alfa-amilasa ácida fúngica derivada del género
Aspergillus. Una amilasa fúngica ácida comercialmente
disponible es SP288 (disponible a través de Novozymes A/S,
Dinamarca). En una forma de realización preferida, la
alfa-amilasa es una alfa-amilasa
ácida. El término "alfa-amilasa ácida"
significa una alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) la cual
añadida en una cantidad eficaz tiene actividad a un pH en el rango
de 3.0 a 7.0, preferiblemente de 3.5 a 6.0, o más preferiblemente de
4.0-5.0. Una alfa-amilasa fúngica
ácida preferida es una alfa-amilasa de tipo
Fungamyl. En la presente descripción, el término
"alfa-amilasa de tipo Fungamyl" indica
una alfa-amilasa que muestra una alta homología, es
decir más del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% o incluso el 100% de homología (identidad) con la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 10 en WO
96/23874.
Preferiblemente la alfa-amilasa
es una alfa-amilasa ácida, preferiblemente del
género Aspergillus, preferiblemente de la especie
Aspergillus Niger. En una forma de realización preferida la
alfa-amilasa ácida fúngica es una de A. niger
descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swissprot/TeEMBL
con el número de registro primario P56271. También se contemplan
variantes de dicha amilasa ácida fúngica que tienen al menos el 70%
de identidad, tal como al menos el 80% o incluso al menos el 90% de
identidad, tal como al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos el
99% de identidad con la misma.
La amilasa también puede ser una
alfa-amilasa maltogénica. Una
"alfa-amilasa maltogénica" (glucano
1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C.
3,2,1,133) es capaz de hidrolizar amilos y amilopectina a maltosa en
la configuración alfa. Una alfa-amilasa maltogénica
de la cepa NCIB 11837 de Bacillus stearothermophilus está
disponible a nivel comercial a través de Novozymes A/S bajo el
nombre comercial NOVAMYL. Las alfa-amilasas
maltogénicas se describen en las patentes estadounidenses Nos.
4.598.048, 4.604.355 y 6.162.628.
Preferiblemente, la alfa-amilasa
maltogénica se usa en un proceso de hidrólisis de almidón crudo,
como se describe, p. ej., en WO 95/10627.
Cuando se usa la alfa-amilasa,
p. ej., como una enzima generadora de maltosa, se pueden añadir
alfa-amilasas fúngicas en una cantidad de
0,001-1,0 AFAU/g de DS, preferiblemente de
0,002-0,5 AFAU/g de DS, preferiblemente
0,02-0,1 AFAU/g de DS.
Las composiciones comerciales preferidas
comprendiendo alfa-amilasa incluyen MYCOLASE de DSM
(Gist Brocades), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X y SAN™
SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASE™
L-40,000, DEX-LO™, SPEYME FRED,
SPEZYME™ AA, y SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), y la
alfa-amilasa fúngica ácida vendida bajo el nombre
comercial SP288 (disponible a través de Novozymes A/S,
Dinamarca).
La alfa-amilasa puede añadirse
en cantidades como son bien conocidas en la técnica. Al medirse en
unidades AAU la actividad alfa-amilasa ácida está
presente preferiblemente en una cantidad de
5-50.0000 AAU/kg de DS, en una cantidad de
500-50.000 AAU/kg de DS, o más preferiblemente en
una cantidad de 100-10.000 AAU/kg de DS, tal como
500-1,000 AAU/kg de DS. Las
alfa-amilasas ácidas fúngicas se añaden
preferiblemente en una cantidad de 10-10.000 AFAU/kg
de DS, en una cantidad de 500-2.500 AFAU/kg de DS, o
más preferiblemente en una cantidad de 100-1.000
AFAU/kg de DS, tal como aproximadamente 500 AFAU/kg de DS.
El proceso de la invención comprende en una
forma de realización la hidrólisis de un compuesto acuoso de almidón
granulado, en particular la hidrólisis de almidón granulado en un
hidrolizado de almidón soluble a una temperatura inferior a la
temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón
granulado.
El compuesto acuoso de almidón granulado que se
va a someter a un proceso de la invención puede tener un
20-55% de sólidos secos de almidón granulado,
preferiblemente un 25-40% de sólidos secos de
almidón granulado, más preferiblemente un 30-35% de
sólidos secos de almidón granulado.
Después de someterse al proceso del aspecto
séptimo de la invención al menos un 85%, al menos un 86%, al menos
un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos
un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos
un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o
preferiblemente al menos un 99% de los sólidos secos del almidón
granulado se convierte en un hidrolizado de almidón soluble.
Según la invención el proceso se lleva a cabo a
una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial.
Preferiblemente la temperatura a la que se llevan a cabo los
procesos es de entre 30-60ºC, así como al menos
30ºC, al menos 31ºC, al menos 32ºC, al menos 33ºC, al menos 34ºC, al
menos 35ºC, al menos 36ºC, al menos 37ºC, al menos 38ºC, al menos
39ºC, al menos 40ºC, al menos 41ºC, al menos 42ºC, al menos 43ºC, al
menos 44ºC, al menos 45ºC, al menos 46ºC, al menos 47ºC, al menos
48ºC, al menos 49ºC, al menos 50ºC, al menos 51ºC, al menos 52ºC, al
menos 53ºC, al menos 54ºC, al menos 55ºC, al menos 56ºC, al menos
57ºC, al menos 58ºC, al menos 59ºC, o preferiblemente al menos
60ºC.
El pH al que se lleva a cabo el proceso del
aspecto séptimo de la invención puede estar en el rango de 3.0 a
7.0, preferiblemente de 3.5 a 6.0, o más preferiblemente de
4.0-5.0.
El almidón granulado a procesar en el proceso de
la invención puede obtenerse en particular a partir de tubérculos,
raíces, tallos, leguminosas, cereales o grano entero. Más
específicamente el almidón granulado puede obtenerse a partir de
granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca,
tapioca, sorgo, arroz, guisantes, moldura, plátano o patatas. Se
contemplan especialmente tanto los tipos cerosos como no cerosos de
maíz y cebada. El almidón granulado a procesar puede ser una calidad
de almidón altamente refinado, preferiblemente al menos un 90%, al
menos un 95%, al menos un 97% o al menos un 99,5% puro o éste puede
ser un material más crudo conteniendo almidón comprendiendo grano
molido entero incluyendo fracciones no amiláceas tales como residuos
de germen y fibras. La materia prima, tal como grano entero, se
muele para abrir la estructura y permitir un tratamiento adicional.
Se prefieren dos procesos de molienda según la invención: molienda
en húmedo y en seco. En la molienda en seco el grano entero se muele
y se usa. La molienda en húmedo ofrece una buena separación de
germen y harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica con
unas pocas excepciones en lugares donde el hidrolizado de almidón se
usa en la producción de jarabes. La molienda tanto en seco como en
húmedo se conoce bien en la técnica del tratamiento de almidón y se
contempla igualmente para el proceso de la invención.
En un aspecto final la invención se refiere al
uso de la enzima híbrida teniendo actividad glucoamilasa en un
proceso para la producción de un producto de fermentación,
especialmente etanol. El proceso comprende someter almidón granulado
en medio acuoso a una alfa-amilasa y una enzima
híbrida de la invención en presencia de un organismo de
fermentación. La alfa-amilasa puede ser cualquiera
de las alfa-amilasas, preferiblemente una mencionada
arriba. Se prefieren las alfa-amilasas fúngicas
ácidas, especialmente de origen de Aspergillus.
Un organismo de fermentación preferido es la
levadura. Preferiblemente el proceso comprende fermentar con
levadura llevado a cabo simultáneamente a la hidrólisis del
compuesto acuoso de almidón granulado con
alfa-amilasa y la enzima híbrida de la invención. La
fermentación se realiza simultáneamente con la hidrólisis la
temperatura entre 30ºC y 35ºC, y más preferiblemente entre 31ºC y
34ºC.
"Organismo de fermentación" se refiere a
cualquier microorganismo adecuado para el uso en un proceso de
fermentación deseado. Organismos de fermentación adecuados según la
invención son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares,
tales como glucosa y/o maltosa, directa o indirectamente en el
producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos de
fermentación incluyen organismos fúngicos, tales como levadura. La
levadura preferida incluye cepas de Sacchromyces spp., y en
particular, Sacchromyces cerevisiae. La levadura disponible
comercialmente incluye, p. ej., RED STAR®/Lesaffre Ethanol Red
(disponible a través de Red Star/Lesaffre, EEUU), FALI (disponible
de Fleischmann's Yeast, una división de Burns Philp Food Inc.,
EEUU), SUPERSTART (disponible de Alltech), GERT STRAND (disponible
de GERT STRAND AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DSM
Specialties).
En un aspecto final la invención se refiere al
uso de una enzima híbrida de la invención para producir un producto
de fermentación, tal como especialmente etanol, o jarabe,
preferiblemente glucosa o maltosa. Un híbrido de la invención puede
utilizarse en un proceso de la invención.
La invención descrita y reivindicada aquí no
debe limitarse en alcance por las formas de realización específicas
aquí descritas, ya que estas formas de realización están diseñadas
como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. Cualquier
forma de realización equivalente está destinada a estar dentro del
campo de esta invención. De hecho, diferentes modificaciones de la
invención además de las mostradas y descritas aquí serán aparentes
para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior.
Modificaciones de este tipo también se destinan a estar dentro del
campo de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, la
presente descripción incluyendo las definiciones será de
utilidad.
Diferentes referencias y un listado de
secuencias se citan en la presente.
Levadura:
RED STAR®/Lesaffre Ethanol Red (disponible a
través de Red Star/Lesaffre, EEUU)
Cuando se usa según la presente invención la
actividad de cualquier alfa-amilasa estable en ácido
puede medirse en AFAU (Unidades de Alfa-amilasa
Fúngica Ácida), las cuales se determinan en relación a un estándar
enzimático. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada
5.260 mg de sustancia seca de almidón por hora bajo las condiciones
estándar mencionadas abajo.
La alfa-amilasa estable en
ácido, una endo-alfa-amilasa
(1,4-alfa-D-glucan-glucanohidrolasa,
E.C. 3,2,1,1) hidroliza enlaces
alfa-1,4-glucosídicos en las
regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y
oligosacáridos con longitudes de cadena diferentes. La intensidad de
color formado con yodo es directamente proporcional a la
concentración de almidón. La actividad amilasa se determina usando
colorimetría inversa como una reducción en la concentración de
almidón bajo las condiciones analíticas especificas.
Condiciones estándar/condiciones
de
reacción:
Un documento
EB-SM-0259.02/01 que describe este
método analítico con más detalle está disponible bajo pedido a
Novozymes A/S, Dinamarca.
La actividad glucoamilasa puede medirse en
Unidades AmiloGlucosidasa (AGU). La AGU se define como la cantidad
de enzima, la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo
las condiciones estándar de 37ºC, pH 4.3, sustrato: maltosa 23,2 mM,
tampón: 0,1 m de acetato, 5 minutos de tiempo de reacción.
Puede utilizarse un sistema autoanalizador. Se
añade mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de modo que
cualquier alfa-D-glucosa presente se
transforme en beta-D-glucosa. La
glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con
beta-D-glucosa en la reacción
mencionada arriba, formando NADH el cual se determina usando un
fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa
original.
Un documento
(EB-SM-0131.02/01) describiendo este
método analítico con más detalle está disponible bajo pedido a
través de Novozymes A/S, Dinamarca.
A menos que se indique lo contrario, las
manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando
métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook
et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold
Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et
al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John
Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., y Cutting, S. M. (eds.).
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Ejemplo
1
Los plásmidos expresando 18 híbridos de AMG
diferentes (Tabla 1) se construyeron entre los dominios catalíticos
(CD) y los dominios de unión de almidón (SBD) de glucoamilasa de
Aspergillus niger (AN), Talaromyces emersonii (TE), y
Althea rolfsii (AR). Los plásmidos se transformaron en
Saccharomyces cerevisiae para la expresión de proteínas
recombinantes, o los híbridos de glucoamilasa construidos
posteriormente se reclonaron en el vector de expresión de
Aspergillus niger para la expresión de las proteínas híbridas
en A. niger.
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DH10B de E. coli (mcrA
(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74
deaR recA1endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK, rpsL,
nupG), Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (MATa, his3D1, leu2;
trpl-289, ura3-52) y el vector
transportador pYES2 del plásmido de E. coli/levadura se
compraron de Invitrogen Inc. (San Diego, CA).
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Las manipulaciones de ADN se realizaron
esencialmente como se describe en Sambrook et Al., (1989)
Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª
Edición ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, y en Dan Burke, Dean Dawson, Tim Stearns (2000) Methods
in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory. Las endonucleasas de restricción y la
ligasa de ADN T4 eran de New England BioLabs. La Pwo ADN polimerasa
(Boehringen Mannheim) se usó esencialmente como se prescribe por el
proveedor. Para las reacciones de PCR SOE aprox. 100 ng de cada
fragmento deseado se purificaron en gel, mezclando y sometiendo a 25
ciclos de PCR sin añadir ningún cebador. Las reacciones se separaron
por electroforesis en gel de agarosa y las bandas de ADN que
migraban en los tamaños previstos se cortaron del gel, se
purificaron por columnas de giro y se usaron como molde en una nueva
reacción PCR usando los cebadores de flanqueo. El plásmido pSteD226
se construyó en dos etapas: primero la secuencia de codificación de
la glucoamilasa de Talaromyces emersonii (SEC ID Nº: 80) se
clonó como un fragmento HindIII-XbaI en pYES2 para
crear pSteD212. Posteriormente el fragmento
AgeI-HindIII de pSteD212 conteniendo el promotor
inducible por galactosa se sustituyó por un fragmento
AgeI-HindIII conteniendo el promotor TPI constitutivo
(Alben y Kawasaki (1982) Nucleotide sequence of the trióse phosphate
isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Appl.
Gen., 1:419-434) para crear pSteD226. El plásmido
pLac102 se construyó clonando la secuencia de codificación de la
forma G1 de la glucoamilasa de Aspergillus niger (SEC ID nº:
81) en el vector transportador pMT742 de levadura/E. coli
como un fragmento de EcoRI-HindIII. Para la
amplificación de CD y SBD's se emplearon los siguientes moldes de
ADN: el plásmido pLAc102 portando el ADNc codificando la forma G1 de
la glucoamilasa G1 de A. niger, el plásmido pSteD226 portando
el ADNc codificando la forma G1 de la glucoamilasa de T.
emersonii; el ADNc sintetizado de A. rolfsii conteniendo
la forma G1 de la glucoamilasa de A. rolfsii.
Los oligonucleótidos utilizados para amplificar
los productos de PCR de CD y SBD se catalogan en la Tabla 2 y la
Tabla 3 respectivamente. Los productos de PCR SOE se purificaron
mediante electroforesis en gel y columnas centrífugas Qiagen, se
digirieron con HindIII/XbaI y se ligaron en
HindIII/XbaI cortada y pSteD226 se purificó con gel.
Tras las reacciones nocturnas de ligación se sometieron a
electroforesis en DH10B y se pusieron sobre placas de agar LB
complementadas con 100 micro g/ml de ampicilina (Sigma). Los
transformantes se purificaron en la placa y los plásmidos se
extrajeron para la determinación de la secuencia. La integridad del
fragmento HindIII-XbaI clonado completo se verificó
mediante análisis de restricción y determinación de la secuencia de
ADN. Los plásmidos elegidos se transformaron después en levadura
competente InvScI y se colocaron sobre medios selectivos. Los
transformantes de levadura se purificaron hasta obtener colonias
individuales y las partes alícuotas se almacenaron a -80ºC en
glicerol al 15%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La PCR de SOE, como se describe en los
procedimientos experimentales, se emplea para generar las fusiones
CD-SBD deseadas. Las combinaciones de productos de
PCR usadas en las reacciones de SOE y los híbridos de SOE
resultantes se catalogan en la Tabla 4.
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Ejemplo
2
El rendimiento relativo de los híbridos
glucoamilasa-SBM (TEAN-1,
TEAN-3) para glucoamilasa de Talaromyces
emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña
escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (molido en un molino de
martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1,65 mm) se
añadieron a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se
suplemento con 3 ml de penicilina 1 g/l. El pH de este compuesto
acuoso se ajustó a 5.0 con un 40% de H_{2}SO_{4}. El nivel de
sólidos secos (DS) se determinó por triplicado como del 32%.
Aproximadamente 5 g de este compuesto acuoso se añadieron a tubos de
15 ml. Las enzimas usadas en este estudio se detallan abajo:
Una respuesta a dosis de cuatro dosis se llevó a
cabo con cada enzima. Las dosificaciones usadas fueron 0,1, 0,3, 0,6
y 1,0 AGU/g de DS. Se llevaron a cabo seis réplicas de cada
tratamiento.
Después de la dosificación los tubos se
inocularon con 0,04 mL/g de propagado de levadura (levadura Red
Star™) que se había cultivado durante 22,5 horas sobre puré de maíz.
Los tubos se taparon con un tornillo en la parte superior que se
había perforado con una pequeña aguja para permitir la liberación de
gas y se vortexearon brevemente antes de pesarlos y de la incubación
a 32ºC. El progreso de fermentación se siguió por el pesado de los
tubos con el tiempo. Los tubos fueron se vortexearon brevemente
antes de pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuasen
durante aproximadamente 200 horas. El resultado del experimento se
muestra en la Figura 1.
Se puede observar en la Figura 1 que los dos
híbridos TEAN-1, TEAN-3 dieron un
rendimiento de etanol significativamente más alto por g de DS que la
glucoamilasa de T. emersonii de tipo salvaje.
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Ejemplo
3
El rendimiento relativo de los híbridos
glucoamilasa-SBM (TEAR-1,
TEAR-1) a glucoamilasa de Talaromyces
emersonii pura se evaluó mediante fermentaciones a pequeña
escala. Aproximadamente 380 g de maíz molido (molido en un molino de
martillos a escala piloto a través de un tamiz de 1,65 mm) se
añadieron a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se
suplemento con 3 ml de penicilina de 1 g/L. El pH de este compuesto
acuoso se ajustó a 5 con un 40% de H_{2}SO_{4}. El nivel de
sólidos secos (DS) se determinó por triplicado como del 32%.
Aproximadamente 5 g de este compuesto acuoso se añadieron a tubos de
15 ml. La respuesta a la dosis se llevó a cabo con cada enzima
usando 0,3 AGU/g de DS. Después de la dosificación los tubos se
inocularon con 0,04 mUg de puré de propagado de levadura (levadura
RED STAR™) que se había cultivado durante 22,5 horas sobre puré de
maíz. Los tubos se cubrieron con un tornillo sobre el cual se había
perforado con una aguja pequeña para permitir la liberación de gas y
se vortexearon brevemente antes de pesarlos y se incubaron a 32ºC.
El progreso de fermentación fue seguido por el pesado de los tubos
con el tiempo. Los tubos se vortexearon brevemente antes de
pesarlos. Se dejó que las fermentaciones continuaran durante
aproximadamente 70 horas. El resultado del experimento se muestra en
la Tabla 1 abajo:
Se puede observar en la Tabla 1 que los dos
híbridos TEAR-1, TEAR-2 tienen una
actividad relativa significativamente más alta que la glucoamilasa
de T. emersonii de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 9000609 A [0018]
- \bullet US 4727026 A [0054]
- \bullet WO 9424158 A [0018]
- \bullet WO 9117243 A [0059]
- \bullet WO 9516782 A [0018]
- \bullet WO 0024883 A [0062]
- \bullet WO 9200381 A [0043]
- \bullet EP 238023 A [0074]
- \bullet WO 0004136 A [0043]
- \bullet WO 9600787 A [0074]
- \bullet WO 0104273 A [0043]
- \bullet WO 99526397 A [0087]
- \bullet WO 8402921 A [0043]
- \bullet WO 9623874 A [0087] [0088]
- \bullet US 4727046 A [0043]
- \bullet WO 9741213 A [0087]
- \bullet WO 9928448 A [0043]
- \bullet WO 9919467 A [0087]
- \bullet US RE32153 E [0043]
- \bullet US 4598048 A [0090]
- \bullet US 4587215 A [0043]
- \bullet US 4604355 A [0090]
- \bullet EP 135138 A [0043]
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<130> 10554.200-US
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<160> 99
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<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus kawachii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(396)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus kawachii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus flavothermus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bacillus sp.
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<400> 4
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Alcaliphilic Bacillus
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<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hormoconis resinae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lentinula edodes
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neurospora crassa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
byssochlamydioides
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Geosmithia cylindrospora:
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Scorias spongiosa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eupenicillium ludwigii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus japonicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium cf.
miczynskii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mz1 Penicillium sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thysanophora sp
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humicola grisea var.
thermoidea
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus kawachii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1605
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1602)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(72)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(1602)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelium rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Athelium rolfsii CBM
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus
niger-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Unión de fusión en la posición 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus
niger-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> punto de unión de fusión en la
posición 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus
niger-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> punto de unión de fusión en la
posición 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> punto de unión de fusión en la
posición 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición 8
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
24
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> punto de unión de fusión en la
posición 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISCFEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces
emersonii-Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> unión de fusión en la posición
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador plac102fwd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtaagctt caccatgtcg ttccgatctc tactcgcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador piad 02 rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaggtgccg ggcacgctgc tggc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pLac102 rev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccaatg gcagatgtgg ccgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pLac102 rev3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacgaggtg acagtcacac tgctg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pSteD226 fwd1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcaaagctt caccatggcg tccctcgttg ctgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pSteD226 rev1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagacggca gggacgctgc ttgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pSteD rev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcccgtg gcagaggtgg cagag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador pSteD226 rev3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagacggtg ttggtagccg tgct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador AR ADNc fwd1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaaagctt caccatgttt cgttcactcc tggccttggc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador AR ADNc rev1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaggaggta gagactccct tagca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador AR ADNc rev2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccgggctt gtagcaccag tcgag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> AR ADNc rev3 cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgacctcg acactacccg aggag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(48)
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<222> (1)..(48)
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(49)
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(49)
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<223> cebador AR ADNc fwd4
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<222> (1)..(49)
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(48)
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<222> (1)..(51)
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<223> cebador AR ADNc fwd7
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\hfill51
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1877
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyces emersonii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1920
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
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<211> 1954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN híbrido de Aspergillus
niger-Talaromyces
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus
niger-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus
niger-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger-Athelia
rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1850
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1850
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Talaromyces emersonii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1862
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1862
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
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\newpage
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<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1862
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Athelia
rolfsii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
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<211> 1790
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyce
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1790
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyce
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1790
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyce
emersonii-Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
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<211> 1775
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Talaromyce
emersonii-Athelia rolfsii
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<400> 97
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<210> 98
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<211> 1775
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Talaromyce
emersonii-Athelia rolfsii
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<400> 98
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<210> 99
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<211> 1775
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Talaromyce
emersonii-Athelia rolfsii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
Claims (12)
1. Proceso para la producción de jarabe,
comprendiendo someter almidón granulado a una enzima híbrida en
medio acuoso, donde la enzima híbrida comprende una secuencia de
aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa
y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a
carbohidratos.
2. Proceso según la reivindicación 1, donde la
secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos es de
origen fúngico, preferiblemente derivado de Aspergillus sp,
Athelia sp. o Talaromyces sp.
3. Proceso según la reivindicación 1, donde la
secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos se
deriva de Aspergillus kawachii, así como el CBM teniendo la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 2, o la secuencia
de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM) se deriva
de Aspergillus Niger, preferiblemente el CBM teniendo la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 18, o la
secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM)
se deriva de Athelia sp., preferiblemente de Athelia
rolfsii, especialmente la secuencia de aminoácidos de CBM
mostrada en la SEC ID nº: 28.
4. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones
1-3, donde el módulo catalítico es una glucoamilasa
de origen fúngico, preferiblemente derivada de una cepa de
Aspergillus, preferiblemente de una cepa de Aspergillus
Niger o Aspergillus oryzae, especialmente la secuencia
mostrada en la SEC ID nº: 24; Athelia, preferiblemente
Athelia rolfsii; especialmente la secuencia mostrada en la
SEC ID nº: 26; Talaromyces, preferiblemente Talaromyces
emersonii, especialmente la secuencia mostrada en la SEC ID nº:
25.
5. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, donde el almidón granulado se somete posteriormente a
una alfa-amilasa.
6. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, donde la alfa-amilasa es una
alfa-amilasa ácida, preferiblemente derivada de un
hongo, preferiblemente del género Aspergillus, especialmente
Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae.
7. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, donde el jarabe es glucosa o maltosa.
8. Proceso de producción de un producto de
fermentación, comprendiendo someter almidón granulado a una enzima
híbrida en medio acuoso en presencia de un organismo de
fermentación, donde la enzima híbrida comprende una secuencia de
aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa
y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a
carbohidratos.
9. Proceso según la reivindicación 8, donde el
almidón granulado se somete posteriormente a una
alfa-amilasa.
10. Proceso según la reivindicación 9, donde la
alfa-amilasa es una alfa-amilasa
ácida, preferiblemente derivada de un hongo, preferiblemente del
género Aspergillus, especialmente Aspergillus Niger o
Aspergillus oryzae.
11. Proceso según la reivindicación 8, donde el
organismo de fermentación es levadura, preferiblemente
Saccharomyces, especialmente Saccharomyces
cerevisiae.
12. Proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 8-11, donde el producto de
fermentación es etanol, tal como etanol combustible o potable.
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