CN103215239A - 杂交酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杂交酶，其包含至少一种碳水化合物结合模块氨基酸序列和至少葡糖淀粉酶氨基酸序列的催化模块。本发明还涉及这种杂交酶在淀粉处理以及尤其是乙醇产生中的用途。

Description

杂交酶
本发明申请是基于申请日为2004年10月27日，申请号为“200480032025.4”(国际申请号为PCT/US2004/035991)、名称为“杂交酶”的发明专利申请的分案申请。
参考序列表
该申请包含计算机可读形式的序列表。其在此处一并作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及至少一种碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，"CBM")和至少葡糖淀粉酶的催化模块(catalytic module，CM)的杂交体及其它。本发明也涉及杂交酶在淀粉处理中的用途，在此处理中，颗粒淀粉降解为糖，例如，浆液(slurry)、或者可以用作产生发酵产物，尤其是乙醇所用的酵母的营养。
相关现有技术描述
已经描述了大量的将淀粉转化为淀粉水解产物，如麦芽糖、葡萄糖或特制浆液以用作甜味剂或作为其它糖类如果糖的前体的方法。葡萄糖也可发酵为乙醇或其它的发酵产物。
淀粉是由葡萄糖单位的链所组成的高分子量多聚体。其通常由约80%的支链淀粉和20%直链淀粉组成。支链淀粉为支链多糖，其中α-1,4D-葡萄糖残基的线性链通过α-1,6糖苷键连接起来。
直链淀粉是由D-吡喃葡萄糖单位通过α-1,4糖苷键连接在一起而构成的线性多糖。在将淀粉转化为可溶性淀粉水解产物的例子中，所述淀粉被解聚化。传统的解聚方法由糊化步骤(gelatinization step)和两个连续的处理步骤即液化处理和糖化处理所组成。
颗粒淀粉由显微镜下可见的颗粒组成，其在室温下不溶于水。水性淀粉浆液加热时，颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在此“糊化”处理期间粘性急剧增加。由于典型工业处理中固体水平为30-40%，淀粉必须稀释或“液化”以使之能够处理。目前粘性的降低主要通过酶学降解获得。在液化步骤期间，长链淀粉被α-淀粉酶降解为更小的支链和线性单位(麦芽糊精)。通常，液化处理在约105-110℃实施约5到10分钟，接下来约95℃实施约1-2小时。然后将温度降至60℃，加入葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和可选的脱支酶如异淀粉酶或支链淀粉酶(pullulanase)，糖化处理进行约24至72小时。
传统的淀粉转化处理是非常耗能的，因为许多步骤中在温度方面有不同的需求。因此需要能够选择和/或设计此处理中所使用的酶以使整个过程能够在无需糊化淀粉的情况下进行。
发明概述
第一个方面本发明提供了包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列的杂交酶。优选催化模块可以是真菌、细菌、或植物起源的。
更多方面，本发明提供编码第一方面所述杂交酶的分离的DNA序列，包含编码第一方面所述杂交酶的DNA序列的DNA构建体，包含编码第一方面所述杂交酶的DNA序列的表达载体，用载体转化的宿主细胞，其中宿主细胞能够表达编码第一方面所述杂交酶的DNA序列。
最后一方面，本发明提供由颗粒淀粉产生浆液或发酵产物的方法，包括用水性介质中的α-淀粉酶和本发明具有葡糖淀粉酶活性的杂交酶处理天然淀粉(raw starch)。当需要发酵产物时，所述方法包括发酵生物的存在。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.杂交酶，包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列。
2.项1的杂交酶，其中碳水化合物结合模块的氨基酸序列是真菌起源的，优选源于曲霉、阿太菌或踝节菌。
3.项2的杂交酶，其中碳水化合物结合模块的氨基酸序列源于川地曲霉，例如具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的CBM，或者碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列源于黑曲霉，优选具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CBM，或者碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列源于阿太菌，优选源于罗耳阿太菌，尤其是SEQ ID NO:28所示的CBM氨基酸序列。
4.项1-3任一项的杂交酶，其中所述催化模块是真菌起源的葡糖淀粉酶，优选源于曲霉菌株，优选源于黑曲霉或米曲霉菌株；尤其是SEQ ID NO:24所示的序列；阿太菌，优选罗耳阿太菌；尤其是SEQ ID NO:26所示的序列；踝节菌，优选埃默森踝节菌，尤其是SEQ ID NO:25所示的序列。
5.编码项1-4任一项的杂交酶的DNA序列。
6.包含项5所述DNA序列的DNA构建体。
7.包含项5所述DNA序列的表达载体。
8.用项7的载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞能够表达项5的DNA序列。
9.产生浆液的方法，包括用项1-4任一项的杂交酶在水介质中处理颗粒淀粉。
10.项9的方法，其中所述颗粒淀粉进一步用α-淀粉酶处理。
11.项10的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选源于真菌，优选源于曲霉属，尤其源于黑曲霉或米曲霉。
12.项9-11任一项的方法，其中所述浆液是葡萄糖或麦芽糖。
13.产生发酵产物的方法，包括在发酵生物存在时，用项1-4任一项的杂交酶在水介质中处理颗粒淀粉。
14.项13的方法，其中所述颗粒淀粉进一步用α-淀粉酶处理。
15.项14的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选源于真菌，优选源于曲霉属，尤其源于黑曲霉或米曲霉。
16.项13的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选糖酵母，尤其是啤酒糖酵母。
17.项13-16任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇或饮用乙醇。
18.项1-4任一项的杂交酶用于产生发酵产物或浆液的用途。
19.项18的用途，用于产生乙醇。
20.项1-4任一项的杂交酶在项9-17任一项的方法中的用途。
附图简述
图1比较了包含埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)催化结构域和黑曲霉(A.niger)SBM的两个葡糖淀粉酶-SBM(淀粉结合模块)杂交体(TEAN-1和TEAN-3)与野生型埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的每g DS的乙醇产量。
发明详述
术语“颗粒淀粉(granular starch)”理解为天然(raw)的未煮过的淀粉，即未被糊化的淀粉。淀粉作为不溶于水的微小颗粒在植物中形成。这些颗粒在低于起始糊化温度的温度中储存在淀粉中。当置于冷水中时，谷物可以吸收少量的液体。达到50℃至70℃时膨胀是可逆的，可逆程度依赖于具体淀粉。当温度更高时，称为糊化作用的不可逆膨胀开始。
术语“起始糊化温度”理解为淀粉糊化作用开始时的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃和75℃之间开始糊化；糊化的确切温度依赖于具体淀粉，熟练技术人员可以很容易地测定。因此，根据植物种类、植物种类的具体品种以及生长条件，起始糊化温度可以不同。在本发明的上下文中，给定淀粉的起始糊化温度为使用Gorinstein.S.和Lii.C.,
Figure BDA00002960784500041
,Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法测定时，5%的淀粉颗粒中双折射(birefringence)消失时的温度。
术语“可溶性淀粉水解产物”理解为本发明方法的可溶性产物，可以包含单糖、二糖、和寡糖，例如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、环糊精及其任何混合物。优选至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或至少99%的颗粒淀粉的干燥固体转化为可溶性淀粉水解产物。
术语多肽“同源性”理解为两条序列之间的一致性程度，其表明第一条序列与第二条序列的衍生关系。可以使用本领域已知的电脑方法如GCG方法包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package,Version8,August1994,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal ofMolecular Biology,48,443-453)测定同源性。使用以下的氨基酸序列比对设置：GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1。
杂交酶
本说明书及权利要求中的酶分类号(EC编号)与生物化学与分子生物学国际联合会的命名委员会，Academic Press Inc.,1992所推荐(1992)的一致。
此处所称杂交酶包括包含葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)的氨基酸序列且其连接(即共价结合)至包含碳水化合物结合模块(CBM)的氨基酸序列的那些。术语“碳水化合物结合模块(CBM)”也可称“碳水化合物结合结构域(CBD)”。
含CBM的杂交酶，及其制备和纯化的详述描述是本领域已知的[参见，例如WO90/00609，WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwood等,Biotechnology and Bioengineering44(1994)pp.1295-1305]。其可以通过例如将DNA构建体转化到宿主细胞中并培养该转化的宿主细胞以表达融合基因来制备，所述DNA构建体包含至少一个编码碳水化合物结合模块的DNA片段，该DNA片段通过或不通过接头连接至编码目标葡糖淀粉酶的DNA序列，此DNA序列具有或不具有其自身的天然碳水化合物结合模块。所得的重组产物(杂交酶)-本领域通常称为“融合蛋白”-可以用下述的通式描述：
A-CBM-MR-X
在后者的通式中，A-CBM为至少包含碳水化合物结合模块(CBM)本身的氨基酸序列的N端或C端区域。MR为中间区域(“接头”)，X为由编码CBM所连接的酶(或其它蛋白)的DNA序列所编码的多肽的氨基酸残基序列。
A部分可以不存在(这样A-CBM为CBM本身，即不包含除构成CBM的氨基酸残基之外的其它氨基酸残基)，或者可以为具有一个或多个氨基酸残基的序列(作为CBM本身的末端延伸体而发挥功能)。接头(MR)可以不存在，或者是键，或者为包含约2至约100个碳原子，特别地2至40个碳原子的短的连接基团。然而，MR优选为约2至约100个氨基酸残基的序列，更优选2至40个氨基酸残基，例如2至15个氨基酸残基。
X部分可以构成整个杂交酶的N端或C端区域。
这样，由以上所述很明显所讨论的杂交酶类型中的CBM可以位于杂交酶的C端、N端或内部。
在CBM位于内部的实施方案中，CBM可以通过两个接头连接。
应了解，本发明的杂交酶可以具有一个以上CBM，例如两个或三个CBM。本发明涉及加入一个以上CBM的实施方案：例如，N或C端具有两个或多个CBD的串联构建体，具有N端+C端CBM的构建体。
因此，本发明杂交体的例子也包括下述通式的杂交体：
A-CBM1-MR1-X-MR2-CBM2-B
A-CBM1-MR1-B-CBM2-MR2-X
A-CBM1-MR1-CBM2-X-MR3-CBM3-C
CBM1和CBM2可以不同或相同。B和C可以不存在(这样，例如，B-CBM2为CBM2本身，即不包含除构成CBM2的氨基酸残基之外的其它氨基酸残基)，或者可以(如A)为具有一个或多个氨基酸残基的序列(作为CBM2本身的末端延伸体而发挥功能)。接头可以不存在也可以存在。
接头序列
接头序列可以为任何适合的接头序列。在优选实施方案中，接头序列衍生于罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)葡糖淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、或川地曲霉(A.kawachii)α-淀粉酶。这样的接头序列的具体例子包括：
-黑曲霉AMG接头：
TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA(SEQ ID NO:20)，
-川地曲霉α-淀粉酶接头：
TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS(SEQ ID NO:21)，
-罗耳阿太菌AMG接头：
STGATSPGGSSGS(SEQ ID NO:27)，
PEPT接头：
PEPTPEPT(SEQ ID NO:22)。
所述接头也可以是上述接头的片段。
在另一优选实施方案中，所述杂交酶具有在不超过10个位置、不超过9个位置、不超过8个位置、不超过7个位置、不超过6个位置、不超过5个位置、不超过4个位置、不超过3个位置、不超过2个位置、或者甚至不超过1个位置不同于SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的接头序列。
碳水化合物结合模块(CBM)
碳水化合物结合模块(CBM)为优先结合于多糖或寡糖(碳水化合物)的多肽氨基酸序列，经常-但不一定仅仅-结合于其水不溶性(包括晶体)形式。
衍生于淀粉降解酶的CBM通常称为淀粉结合模块或SBM(可见于一些水解淀粉的酶的CBM，例如一些葡糖淀粉酶、或见于例如环糊精糖基转移酶(glucanotransferase)、或见于α-淀粉酶)。同样，其它的CBM亚类将包含例如，纤维素结合模块(源于水解纤维素的酶的CBM)、几丁质结合模块(通常见于几丁质酶的CBM)、木聚糖结合模块(通常见于木聚糖酶的CBM)、甘露聚糖结合模块(通常见于甘露聚糖酶的CBM)。SBM通常也称为SBD(淀粉结合结构域)。
可以发现CBM为由两个或多个多肽氨基酸序列区域组成的大型多肽或蛋白质的内在部分(integral parts)，尤其是在水解性酶(水解酶)中，这样的酶通常包含催化模块，其中含有底物水解活性位点和结合目标碳水化合物底物的碳水化合物结合模块(CBM)。这样的酶可以包含不止一个催化模块，例如一个、两个或三个CBM，可选地进一步包含与具有催化模块的CBM连接的一个或多个多肽氨基酸序列区域，后一类型的区域通常称为“接头”。包含CBM的水解性酶的例子-其中一些在上面已经提到-为纤维素酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶。CBM也已发现以非水解多糖结合蛋白的形式存在于藻类例如红藻Porphyra purpurea中。
在有CBM的蛋白质/多肽中(例如，酶、通常水解性酶)，CBM可以位于N或C端或位于内部位置。
构成CBM本身的多肽或蛋白质(例如，水解性酶)部分通常由约30个以上但少于约250个氨基酸残基组成。
“碳水化合物结合模块家族20”或CBM-20模块在本发明上下文中定义为与Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.19:1027-1031图1的多肽的碳水化合物结合模块(CBM)具有至少45%同源性的大约100个氨基酸的序列。所述CBM包含所述多肽的至少102个氨基酸，即从氨基酸582至氨基酸683的子序列。本说明书中应用的糖苷水解酶家族的编号遵循URL:afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html上Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes server或Coutinho,P.M.&Henrissat,B.1999；The modular structure of cellulases and othercarbohydrate-active enzymes:an integrated database approach.In"Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation".,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita和T.Kimura编,Uni Publishers Co.,Tokyo,pp.15-23，和Bourne,Y.&Henrissat,B.2001;Glycoside hydrolases andglycosyltransferases:families and functional modules,Current Opinion inStructural Biology11:593-600的概念。
包含适合用于本发明上下文中的CBM的酶的例子为α-淀粉酶、产麦芽糖α-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶。与本发明有关的更多的目标CBM包括衍生于葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)或CGT酶(EC2.4.1.19)的CBM。
衍生于真菌、细菌或植物来源的CBM一般会适合用于本发明上下文中。优选的为源于曲霉(Aspergillus sp.)、阿太菌(Athelia sp.)、踝节菌(Talaromycessp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)、或根霉(Rhizopus sp.)物种的CBM。优选的为真菌来源的CBM。就此而论，适合于分离相关基因的技术是本领域所熟知的。
本发明优选的为碳水化合物结合模块家族20的CBM。“碳水化合物结合模块家族20”或CBM-20模块在本发明上下文中定义为与Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.19:1027-1031图1的多肽的碳水化合物结合模块(CBM)具有至少45%同源性的大约100个氨基酸的序列。所述CBM包含所述多肽的最后102个氨基酸，即从氨基酸582至氨基酸683的子序列。本说明书中应用的CMB编号遵循Coutinho&Henrissat1999的概念(Coutinho,P.M.&Henrissat,B.The modular structure of cellulases and othercarbohydrate-active enzymes:an integrated database approach.In"Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation".,K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita和T.Kimura编,Uni Publishers Co.,Tokyo,pp.15-23or alternatively:Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes server at URL:afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html)。
适合于本发明的碳水化合物结合模块家族20的CBM可以衍生自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(SWISSPROT Q12537)、川地曲霉(SWISSPROTP23176)、黑曲霉(SWISSPROT P04064)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(SWISSPROTP36914)的葡糖淀粉酶，衍生自川地曲霉(EMBL:#AB008370)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(NCBI AAF17100.1)的α-淀粉酶，衍生自腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(SWISSPROT P36924)的β-淀粉酶、或者衍生自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)(SWISSPROT P43379)的CGT酶。优选为衍生自川地曲霉(EMBL:#AB008370)α-淀粉酶的CBM以及与川地曲霉(EMBL:#AB008370)α-淀粉酶的CBM有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的CBM，即与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的CBM。本发明还优选具有SEQ ID NO:3(黄热芽孢杆菌(Bacillus flavorthermus)CBM)、SEQ IDNO:4(芽孢杆菌CBM)、和SEQ ID NO:5(嗜碱芽孢杆菌(Alcaliphilic Bacillus)CBM)所示氨基酸序列的碳水化合物结合模块家族20的CBM。更多优选的CBM包括来自Hormoconis sp.例如来自Hormoconis resinae(与杂酚真菌或脂暗膜菌(Amorphotheca resinae)同义)的葡糖淀粉酶的CBM，例如CBMSWISSPROT:Q03045(SEQ ID NO:6)，来自香菇(Lentinula sp.)如埃杜香菇(Lentinula edodes)(花菇(Shiitake mushroom))的葡糖淀粉酶的CBM如CBMSPTREMBL:Q9P4C5(SEQ ID NO:7)、来自脉孢霉(Neurospora sp.)如粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的葡糖淀粉酶的CBM如CBM SWISSPROT:P14804(SEQID NO:8)、来自踝节菌如Talaromyces byssochlamydioides的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN005220(SEQ ID NO:9)，来自Geosmithia sp.如Geosmithiacylindrospora的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48286(SEQ ID NO:10)，来自Scorias sp.如Scorias spongiosa的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN007096(SEQID NO:11)，来自正青霉(Eupenicillium sp.)如Eupenicillium ludwigii的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN005968(SEQ ID NO:12)，来自曲霉如日本曲霉(Aspergillus japonicus)的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN001136(SEQ ID NO:13)，来自青霉(Penicillium sp.)如米舒青霉(Penicillium cf.miczynskii)的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48691(SEQ ID NO:14)，来自Mz1青霉的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48690(SEQ ID NO:15)，来自Thysanophora sp.的葡糖淀粉酶的CBM如CBM NN48711(SEQ ID NO:16)，和来自腐质霉(Humicola sp.)如灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)的葡糖淀粉酶的CBM如CBM SPTREMBL:Q12623(SEQ ID NO:17)。最优选的CBM包括来自曲霉例如黑曲霉葡糖淀粉酶的CBM，如SEQ ID NO:18，和来自阿太菌如罗耳阿太菌葡糖淀粉酶的CBM，如SEQ ID NO:19。本发明还优选与前述任何CBD氨基酸序列有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的任何CBD。
更多合适的碳水化合物结合模块家族20的CBM可见于URL:afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html)的碳水化合物活性酶服务器。
其它的CBM可以在来自卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、米根霉(Rhizopus oryzae)、Arxula adeninivorans的葡糖淀粉酶中找到。
一旦鉴定了编码底物结合(碳水化合物结合)区域的核苷酸序列(它们为cDNA或染色体DNA)，接下来就可以以许多方式操作而将其融合到编码目标酶的DNA序列中。然后编码结合碳水化合物的氨基酸序列的DNA片段和编码目标酶的DNA用或不用接头而连接起来。然后所得的连接DNA可以以许多方式操作而获得表达。
葡糖淀粉酶序列
适合作为本发明的CBM/葡糖淀粉酶杂交体的基础的葡糖淀粉酶包括例如衍生自真菌生物、细菌或植物的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶为真菌或细菌起源，选自曲霉葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)，SEQ ID NO:24所示)，或其变体，例如WO92/00381，WO00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)，或其变体或片段。其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌葡糖淀粉酶(美国专利4,727,046)，见SEQ ID NO:26，踝节菌葡糖淀粉酶，特别是衍生自埃默森踝节菌(WO99/28448)，见SEQ ID NO:25)、Talaromyces leycettanus(美国再版专利32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(美国专利4,587,215)的葡糖淀粉酶。本发明涉及的细菌葡糖淀粉酶包括源于梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)，和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以具有或不具有天然CBM，但至少包含所述催化模块(CM)。
优选的葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:24所公开的黑曲霉葡糖淀粉酶，或者与SEQ ID NO:24所示氨基酸序列具有大于50%，例如60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。
应了解葡糖淀粉酶(催化模块)在一个实施方案中可以为具有葡糖淀粉酶活性的活性片段。
另一优选的葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:26所示的罗耳阿太菌葡糖淀粉酶，或者与SEQ ID NO:26所示氨基酸序列具有大于50%，例如60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。
第三个优选的葡糖淀粉酶为SEQ ID NO:25所示的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶，或者与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有大于50%，例如60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%同源性(一致性)的葡糖淀粉酶。
杂交体
一方面本发明涉及杂交酶，其包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述催化模块为真菌起源的。在更优选的实施方案中，所述催化模块衍生于踝节菌菌株(优选埃默森踝节菌)，曲霉菌株(优选黑曲霉)，或阿太菌菌株(优选罗耳阿太菌)。
在优选实施方案中，本发明的杂交酶包含衍生自埃默森踝节菌的具有葡糖淀粉酶活性的催化模块和衍生自黑曲霉或罗耳阿太菌的碳水化合物结合模块。在一个实施方案中，所述杂交体在催化模块和碳水化合物结合模块之间可以包括接头序列，优选来自黑曲霉、罗耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝节菌。
在优选实施方案中，本发明的杂交酶包含衍生自黑曲霉的具有葡糖淀粉酶活性的催化模块和衍生自罗耳阿太菌或埃默森踝节菌的碳水化合物结合模块。在一个实施方案中，所述杂交体在催化模块和碳水化合物结合模块之间可以包括接头序列，优选来自黑曲霉、罗耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝节菌。
在另一优选实施方案中，本发明的杂交酶包含衍生自罗耳阿太菌的具有葡糖淀粉酶活性的催化模块和衍生自黑曲霉或埃默森踝节菌的碳水化合物结合模块。在一个实施方案中，所述杂交体在催化模块和碳水化合物结合模块之间可以包括接头序列，优选来自黑曲霉、罗耳阿太菌、川地曲霉或埃默森踝节菌。
优选的黑曲霉，罗耳阿太菌或埃默森踝节菌分别为SEQ ID NOS:24，25，和26中所示。
优选所述杂交酶包含与SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，或SEQID NO:19任一所示的氨基酸序列具有至少50%，60%，70%，80%，90%，95%，97%或者甚至至少99%同源性的CBM序列。
更优选所述杂交酶包含具有SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的CBM序列。在又一优选实施方案中，所述CBM序列具有与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，或其它CBM序列中的任何一个，在不超过10个氨基酸位置、不超过9个位置、不超过8个位置、不超过7个位置、不超过6个位置、不超过5个位置、不超过4个位置、不超过3个位置、不超过2个位置、或者甚至不超过1个位置不同的氨基酸序列。在最优选的实施方案中，所述杂交酶包含衍生于来自罗耳阿太菌的葡糖淀粉酶的CBM，例如美国专利4,727,026中所述的来自罗耳阿太菌AHU9627的AMG或者来自黑曲霉的CBM。
根据本发明考虑的具体杂交体包括下述：
Figure BDA00002960784500121
CM:催化模块；SBM:淀粉结合模块；AN:黑曲霉；TE:埃默森踝节菌；AR:罗耳阿太菌。
表达载体
本发明还涉及可包含编码杂交酶、启动子、信号肽序列、和转录及翻译终止信号的DNA序列的重组表达载体。上述的多种DNA和控制序列可以结合在一起来制备重组表达载体，其可以包括一个或多个便利的限制性位点以允许在这些位点插入或取代编码所述多肽的DNA序列。可选地，本发明的DNA序列可以通过将所述DNA序列或包含该序列的DNA构建体插入适当的用于表达的载体来表达。在创建表达载体过程中，将编码序列定位于载体中，使编码序列与用于表达以及可能用于分泌的适当控制序列可操作相连。
所述重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地用于重组DNA方法，能够引发DNA序列的表达。载体的选择一般依赖于载体与所述载体所要插入的宿主细胞的兼容性。所述载体可以是线性的或者是封闭的环状质粒。该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，质粒，染色体外成分，微小染色体、粘粒或人工染色体。该载体可以包含确保自我复制的任何手段。可选地，该载体可以是当引入到所述宿主细胞中时整合到基因组中，并与其所整合的染色体一起复制的一种载体。该载体系统可以是单一载体或质粒或总体上包含要引入到宿主细胞基因组中的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
标记
本发明的载体优选包含一个或多个可选择的标记，其允许容易地选择转化的细胞。可选择标记为基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性，重金属抗性，针对营养缺陷型的原养型等。
用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记的例子可以选自包括但不限于以下的组：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、和草丁膦(glufosinate)抗性标记、以及来自其它物种的等同物。优选用于曲霉细胞的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。另外，选择可通过共转化完成，例如见WO91/17243，其中可选择标记在分离的载体上。
本发明的载体优选包含允许载体稳定地整合于宿主细胞基因组或者允许载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。
当引入到宿主细胞时，本发明的载体可以整合到宿主细胞基因组中。为了整合，载体可依赖于编码目标多肽的DNA序列，或者用于通过同源和非同源重组将载体稳定地整合于基因组的载体的其它任何元件。可选地，载体可以包含通过同源重组引导向宿主细胞基因组整合的额外的DNA序列。额外的DNA序列使载体能够整合于宿主细胞基因组中染色体的精确位置。为了增加在精确位点整合的可能性，整合元件应优选包含足够数量的DNA，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，最优选800至1,500个碱基对，这些碱基对与相应的目标序列高度同源，以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非编码或编码DNA序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞基因组。这些DNA序列可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列，另外，可以是非编码或编码序列。
为了自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。可以使用WO00/24883中所公开的复制AMA1质粒载体的附加体。
可以将超过一个拷贝的编码目标多肽的DNA序列插入宿主细胞以增强DNA序列的表达。可以使用本领域已知的方法通过将至少一个额外的序列拷贝整合于宿主细胞基因组中以获得所述DNA序列的稳定扩增，并选择转化体。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,分子克隆，实验指南，第二版，冷泉港，纽约)。
宿主细胞
宿主细胞可以是真菌例如丝状真菌或酵母来源，或者为细菌来源，例如芽孢杆菌来源。
包含含有编码杂交酶的DNA序列的DNA构建体或表达载体的本发明的宿主细胞，在杂交酶的重组产生中方便地用作宿主细胞。所述细胞可以用表达载体转化。可选地，可以方便地通过将编码所述杂交酶的本发明DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而用该DNA构建体转化所述细胞。DNA构建体向宿主染色体的整合可以根据传统的方法进行，例如通过同源或异源重组。
在优选的实施方案中，宿主细胞为下述子囊菌门(Ascomycota)组的丝状真菌，包括例如，脉胞菌、正青霉(Eupenicillium)(=青霉(Penicillium))、裸孢壳(Emericella)(=曲霉)、散囊菌(Eurotium)(=曲霉)。在更优选的实施方案中，丝状真菌包括真菌门(Eumycota)、卵菌门(Oomycota)的亚门(如Hawksworth等,在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第八版,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中定义)的所有丝状形式。丝状真菌通过由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖构成的营养菌丝体鉴别。营养生长通过菌丝延长进行，碳代谢为需氧型。
在更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不限于选自由属于曲霉物种的菌株优选米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、川地曲霉、或镰刀霉(Fusarium)菌株如尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporium)、禾谷镰刀霉(Fusariumgraminearum)(更准确的说法叫作玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)，以前为Sphaeria zeae，与玉米赤霉(Gibberella zeae)和Gibberella roseum f.sp.cerealis同义)、或硫色镰刀霉(Fusarium sulphureum)(更准确的说法叫作Gibberellapuricaris，与Fusarium trichothecioides、杆孢状镰刀霉(Fusariumbactridioides)、接骨木镰刀霉(Fusarium sambucium)、玫瑰色镰刀霉(Fusariumroseum)、和玫瑰色镰刀霉禾谷变种(Fusarium roseum var.graminearum)同义)、Fusarium cerealis(与Fusarium crookwellense同义)、或Fusariumvenenatum菌株所组成的组的细胞。
在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞为属于曲霉的菌株优选米曲霉或黑曲霉的细胞。
宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或变体、突变体或遗传改造的丝状真菌宿主细胞。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞为蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性菌株。特别预期的是曲霉菌株，例如经遗传改造以破坏或减少葡糖淀粉酶、酸稳定性α-淀粉酶、α-1,6转葡糖苷酶和蛋白酶活性表达的黑曲霉菌株。
在另一优选实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。此处所用“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous)、和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类将来可能会有所变化，为了本发明的目的，应该按照Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述定义酵母。
在更为优选的实施方案中，酵母宿主细胞为假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或者西洋蓍霉(Yarrowia)细胞。
在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞为卡尔糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地糖酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一最优选实施方案中，酵母宿主细胞为乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一最优选实施方案中，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
转化真菌宿主细胞
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生等的方法以其原本已知的方式来转化。EP238023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474中描述了转化曲霉宿主细胞的适当的方法。Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀霉物种的适当方法。
酵母可以用Becker和Guarente,Abelson,J.N.和Simon,M.I.,编著的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,Journalof Bacteriology153:163;和Hinnen等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA75:1920中描述的方法转化。
分离并克隆DNA序列
用于分离或克隆编码目标多肽的DNA序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA中分离，从cDNA制备，或其组合。从这样的基因组DNA中克隆本发明的DNA序列可以使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或者用抗体筛选表达文库以检测具有共有结构特征的克隆化DNA片段来实现。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,NewYork。可以使用其它的DNA扩增方法例如连接酶链式反应法(ligase chainreaction,LCR)、连接激活转录(ligated activated transcription)(LAT)和基于DNA序列的扩增(DNA sequence-based amplification,NASBA)。
分离的DNA序列
本发明涉及包含编码杂交酶的DNA序列的分离的DNA序列及其它，所述杂交酶包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列，其中催化模块。
此处所用术语“分离的DNA序列”指DNA序列，其基本不含有其它DNA序列，例如，当用琼脂糖电泳测定时至少约20%纯，优选至少约40%纯，更优选至少约60%纯，再优选至少约80%纯，最优选至少约90%纯。
例如，分离的DNA序列可用遗传工程的标准克隆方法将DNA序列从其天然位置重新定位到不同位置、并在该位置使其再生来获得。该克隆方法可涉及切除并分离包含编码目标多肽的DNA序列的所需DNA片段，将该片段插入载体分子，将重组载体掺入宿主细胞并在其中复制DNA序列的多个拷贝或克隆。可以以多种方法操作分离的DNA序列，以供目标多肽表达之用。DNA序列在插入载体之前可能需要或必需进行操作，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰DNA序列的技术是本领域熟知的。
DNA构建体
本发明涉及包含编码杂交酶的DNA序列的DNA构建体，所述杂交酶包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块的氨基酸序列和碳水化合物结合模块的氨基酸序列。在一实施方案中，所述催化模块是真菌起源的。此处“DNA构建体”定义为单链或双链的DNA分子，其分离于天然发生的基因，或者是经过修饰而包含了以自然界不存在的方式组合和邻接(juxtaposed)的DNA片段。当DNA构建体包含本发明编码序列的表达所需的所有控制序列时，术语DNA构建体与术语表达盒同义。
制备方法
本发明的杂交体可以用任何方法制备，例如包括(a)在有利于制备杂交体的条件下培养宿主细胞；和(b)回收杂交体。
在本发明的制备方法中，用本领域已知的方法将所述细胞培养于适于所述杂交体产生的营养培养基中。例如，可以在实验室规模或者工业规模发酵罐中，在适当的培养基中以及允许杂交体表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批的、或者固态发酵)来培养细胞。培养在包含碳源和氮源以及无机盐的适当营养培养基中，以本领域已知的方法进行。合适的培养基可以从供应商处获得，或者可以用公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)制备。当杂交体分泌到营养培养基中，可以直接从培养基回收杂交体。当杂交体未被分泌，可从细胞裂解产物来回收。
杂交体可以用本领域已知的专门用于所述杂交体的方法检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体、形成酶产物、或使酶底物消失。例如，可以用酶试验来测定此处所述杂交体的活性。
可以用本领域已知的方法回收所得杂交体。例如，可以通过传统方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀从营养培养基中回收杂交体。
可以用本领域已知的多种方法来纯化本发明的杂交体，包括但不限于层析(例如，离子交换层析、亲合层析、疏水层析、聚焦层析、和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异溶解(differential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
淀粉处理
本发明第一方面的杂交酶可用于产生浆液或发酵产物(例如尤其是乙醇)的产生过程中，其中颗粒淀粉在水性介质中用具有葡糖淀粉酶活性的本发明的杂交酶处理。在具体实施方案中，可以以0.02-20AGU/g干燥固体(DS)，优选0.1-10AGU/g DS，如约0.1，0.3，0.5，1或2AGU/g DS，如0.1-0.5AGU/gDS的量加入具有葡糖淀粉酶活性的杂交酶。颗粒淀粉可进一步用α-淀粉酶(优选下述的一种)处理。
α-淀粉酶
根据本发明，α-淀粉酶可以是任何来源。优选为真菌或细胞来源的α-淀粉酶。α-淀粉酶可以是芽孢杆菌α-淀粉酶，例如，来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株。其它的α-淀粉酶包括源于WO95/26397中详细记载的芽孢杆菌NCIB12289，NCIB12512，NCIB12513或DSM9375菌株的α-淀粉酶，和Tsukamoto等,Biochemical andBiophysical Research Communications,151(1988),pp.25-31所描述的α-淀粉酶。其它的α-淀粉酶变体和杂交体描述于WO96/23874，WO97/41213，和WO99/19467。
其它的α-淀粉酶包括源于曲霉菌株的α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。在优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶。在更优选的实施方案中，所述酸性α-淀粉酶为酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。更优选地，所述酸性α-淀粉酶为源于曲霉属的酸性真菌α-淀粉酶。商业上可获得的酸性真菌淀粉酶为SP288(可由Novozymes A/S,Denmark获得)。在优选实施方案中，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意思是以有效量添加时，在3.0至7.0、优选3.5-6.0、或更优选4.0-5.0的pH范围具有活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl样α-淀粉酶。在本说明书中，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指显示与WO96/23874中SEQ ID NO:10所示氨基酸序列有高度同源性，例如超过50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或者甚至为100%同源性(一致性)的α-淀粉酶。
优选α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，优选来自曲霉属，优选来自黑曲霉物种。在优选实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶为Swiss-prot/TeEMBL数据库中以原始登录号P56271公开为“AMYA_ASPNG”的来自黑曲霉的α-淀粉酶。也包括与所述酸性真菌淀粉酶具有至少70%一致性，如至少80%或甚至至少90%一致性，如至少95%，96%，97%，98%，或至少99%一致性的该酶的变体。
所述淀粉酶也可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶,E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解为α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖α-淀粉酶商业上可从Novozymes A/S获得，商用名为NOVAMYLTM。产麦芽糖α-淀粉酶记载于美国专利4,598,048，4,604,355和6,162,628，此处一并作为参考。优选地，产麦芽糖α-淀粉酶用于天然淀粉水解方法中，例如见WO95/10627，此处一并作为参考。
当α-淀粉酶用作例如产麦芽糖的酶时，真菌α-淀粉酶可以以0.001-1.0AFAU/g DS，优选0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS的量添加。
优选的包含α-淀粉酶的商用组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASE，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX和SANTMSUPER，SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEYME FRED，SPEZYMETMAA，和SPEZYMETMDELTA AA(Genencor Int.)，以及出售的商用名为SP288(可由NovozymesA/S,Denmark获得)的酸性真菌α-淀粉酶。
α-淀粉酶可以以本领域熟知的量添加。当以AAU单位测定时，酸性α-淀粉酶活性优选以5-50,0000AAU/kg DS的量，以500-50,000AAU/kg DS的量，或更优选以100-10,000AAU/kg DS的量，例如500-1,000AAU/kg DS的量提供。真菌酸性α-淀粉酶优选以10-10,000AFAU/kg DS的量，以500-2,500AFAU/kg DS的量，或更优选以100-1,000AFAU/kg DS的量，例如约500AFAU/kg DS的量添加。
处理
在一个实施方案中，本发明的处理包括颗粒淀粉浆的水解，特别是在低于所述颗粒淀粉的起始糊化温度的温度中将颗粒淀粉水解为可溶性淀粉水解产物。
欲用本发明的方法处理的颗粒淀粉浆可以具有20-55%的干燥固体颗粒淀粉，优选25-40%干燥固体颗粒淀粉，更优选30-35%干燥固体颗粒淀粉。
在本发明的第七个方面的处理之后，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或优选至少99%的颗粒淀粉的干燥固体转化为可溶性淀粉水解产物。
根据本发明，所述处理在低于起始糊化温度的温度中进行。优选进行处理的温度在30-60℃，例如至少30℃，至少31℃，至少32℃，至少33℃，至少34℃，至少35℃，至少36℃，至少37℃，至少38℃，至少39℃，至少40℃，至少41℃，至少42℃，至少43℃，至少44℃，至少45℃，至少46℃，至少47℃，至少48℃，至少49℃，至少50℃，至少51℃，至少52℃，至少53℃，至少54℃，至少55℃，至少56℃，至少57℃，至少58℃，至少59℃，或优选至少60℃。
本发明第七个方面进行处理时的pH可以在3.0至7.0范围内，优选3.5至6.0，或更优选4.0-5.0。
特别地，将要在本发明的方法中处理的颗粒淀粉可以从块茎、根、茎、豆类、谷类或谷物整体获得。更特别地，颗粒淀粉可以从玉米、玉米芯(cob)、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱(milo)、西米(sago)、木薯(cassava)、木薯粉(taouica)、高粱、水稻、豌豆、大豆(bean)、香蕉或马铃薯获得。特别还考虑糯性和非糯性类型的玉米和大麦。所要处理的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%纯，或者可以是更为粗制的含有包含碾碎的谷物整体的材料的玉米，所述谷物整体包括非淀粉成分如胚芽残渣和纤维。将天然材料如谷物整体碾碎以打开结构并允许进一步处理。根据本发明，两种碾磨处理是优选的：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾碎后使用。湿磨使胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好地分离开，在淀粉水解产物用于产生浆液的情况下有几个例外。干磨和湿磨在淀粉处理领域都是熟知的，且都同样考虑用于本发明处理中。
发酵产物的产生
最后一个方面，本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的杂交酶在产生发酵产物尤其是乙醇的方法中的用途。该方法包括在发酵生物存在下用α-淀粉酶和本发明的杂交酶处理水性介质中的颗粒淀粉。所述α-淀粉酶可以是任何的α-淀粉酶，优选以上提到的一种。优选为酸性真菌α-淀粉酶，尤其是曲霉来源的。
优选的发酵生物是酵母。优选所述方法包括在用α-淀粉酶和本发明的杂交酶水解颗粒淀粉浆的同时，用酵母实施发酵。与水解同时进行的发酵的温度在30℃和35℃之间，更优选在31℃和34℃之间。
“发酵生物”指适合用于所需发酵过程的任何微生物。根据本发明，合适的发酵生物能够将糖如葡萄糖和/麦芽糖直接或间接地发酵，即转化为所需的发酵产物。发酵生物的例子包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括糖酵母(Sacchromyces sp.)菌株，特别是啤酒糖酵母。商业上可获得的酵母包括，例如REDLesaffre Ethanol Red(可由Red Star/Lesaffre,USA获得)，FALI(可由Fleischmann’s Yeast,a division of Burns Philp Food Inc.,USA获得)，SUPERSTART(可由Alltech获得)，GERT STRAND(可由Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可由DSM Specialties获得)。
本发明杂交体的用途
最后一个方面本发明涉及本发明的杂交酶产生发酵产物，例如特别是乙醇，或浆液(优选葡萄糖或麦芽糖)的用途。本发明的杂交体可以用于本发明的方法中。
本发明此处所描述和要求的不受此处公开的具体实施方案范围的限制，因为这些实施方案的目的是作为本发明几个方面的例示。任何等同的实施方案都将落在本发明的范围内。事实上，由前面所描述的，除此处所列举和描述的那些之外，对本发明的许多修改对本领域熟练技术人员来说都将是显而易见的。这样的修改也将落入所附的权利要求的保护范围内。有不清楚的情况，本说明书包括定义将用于解释。
此处引用了许多参考文献和序列表，其全文整体一并作为参考。
材料和方法
酵母：
RED
Figure BDA00002960784500212
Lesaffre Ethanol Red(可由Red Star/Lesaffre,USA获得)
酸稳定性α-淀粉酶活性
根据本发明使用时，可以测定任何酸稳定性α-淀粉酶的AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)活性，其相对于酶标准来测定。1FAU定义为在下面所提到的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸稳定性α-淀粉酶、内切-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖基-水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域的α-1,4-糖苷键，形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度直接与淀粉的浓度成比例。用反向比色法测定，在具体分析条件下，随淀粉浓度的降低的淀粉酶活性。
α-淀粉酶
λ=590nm
蓝/紫    t=23秒    脱色
标准条件/反应条件：
Figure BDA00002960784500222
文件包EB-SM-0259.02/01更详细描述了此分析方法，可以向NovozymesA/S,Denmark请求提供而获得，该文件包包括在参考文献中。
葡糖淀粉酶活性
可以测定葡糖淀粉酶的活性，以淀粉葡萄糖苷酶单位(AmyloGlucosidaseUnits,AGU)表示。AGU定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下，每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可以使用自动分析仪系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶，使存在的任何α-D–葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。在以上提及的反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，用光度计在340nm处测定NADH，作为初始葡萄糖浓度的测量值。
AMG保温：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH: 4.30±0.05
保温温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作浓度： 0.5-4.0AGU/mL
颜色反应：
葡萄糖脱氢酶： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD: 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M;0.15M NaCl
pH: 7.60±0.05
保温温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
文件包EB-SM-0131.02/01更详细描述了此分析方法，可以向NovozymesA/S,Denmark请求提供而获得，该文件包包括在参考文献中。
DNA操作
除非另有说明，DNA操作和转化使用Sambrook等(1989)分子克隆:实验指南,冷泉港实验室,冷泉港,纽约;Ausubel,F.M.等(编)"Currentprotocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.,和Cutting,S.M.(编)中所记载的标准方法进行。
实施例
实施例1
葡糖淀粉酶催化结构域-淀粉结合结构域杂交体的构建与表达
构建表达18种不同AMG杂交体(表1)的质粒，所述杂交体是黑曲霉(AN)，埃默森踝节菌(TE)，和罗耳阿太菌(AR)的葡糖淀粉酶的催化结构域(CD)和淀粉结合结构域(SBD)之间的杂交体。将质粒转化到啤酒糖酵母中以表达重组蛋白，或者随后将构建的葡糖淀粉酶杂交体重新克隆到黑曲霉表达载体中以在黑曲霉中表达杂交蛋白。
表1:葡糖淀粉酶杂交体中的融合邻接。
试验方法
细菌和真菌菌株和质粒
大肠杆菌(E.coli)DH10B(mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80dlacZM15lacX74deoR recA1endA1araD139(ara,leu)7697galU galK,rpsL nupG),啤酒糖酵母INVSc1(MATa,his3D1,leu2,trp1-289,ura3-52)和大肠杆菌/酵母质粒穿梭载体pYES2购自Invitrogen Inc.(San Diego,CA)。
DNA构建体
DNA操作基本上按照Sambrook等,(1989)Maniatis,T.,1989.分子克隆:实验指南(第二版),冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,和Dan Burke,DeanDawson,Tim Stearns(2000)Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual,冷泉港实验室，中的记载的方法进行。限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶来自New England Biolabs。Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)基本如提供商所述使用。为进行SOE pcr反应，使每种所需pcr片段100ng发生凝胶纯化，混合后进行25个PCR循环，不添加任何引物。反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，将迁移到预计大小的DNA条带从胶上切下，用旋转柱纯化，在新的pcr反应中用作模板，使用侧翼引物。在两个步骤中构建质粒pSteD226：首先将埃默森踝节菌葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:80)的编码序列作为HindIII-XbaI片段克隆到pYES2中制得pSteD212。此后用包含组成型TPI启动子(Alber and Kawasaki(1982)Nucleotide sequence of the triosephosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae.J.Mol.Appl.Gen.,1:419-434)的AgeI-HindIII片段置换包含半乳糖诱导型启动子的pSteD212的AgeI-HindIII片段，制得pSteD226。将G1形式的黑曲霉葡糖淀粉酶(SEQ IDNO:81)的编码序列克隆到酵母/大肠杆菌穿梭载体pMT742中，作为EcoRI-HinDIII片段，以此构建质粒pLac102。为扩增CD和SBD，使用下述的DNA模板：携带编码G1-形式黑曲霉G1葡糖淀粉酶的cDNA的质粒pLAc102；携带编码G1-形式埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的cDNA的质粒pSteD226；从包含G1形式罗耳阿太菌葡糖淀粉酶的罗耳阿太菌合成的cDNA。
用于扩增CD和SBD pcr产物的寡聚物分别列于表2和表3。SOE PCR产物用凝胶电泳和Qiagen旋转柱纯化，用HindIII/XbaI消化并连接到已被HindIII/XbaI切割并经凝胶纯化的pSteD226中。连接过夜后将反应产物电泳到DH10B中，在添加有100微克/ml氨苄青霉素(Sigma)的LB琼脂板上铺板。将转化体平板纯化，提取的质粒用于测序。通过限制性分析和DNA测序验证整个克隆的HindIII-XbaI片段的完整性。然后将选择的质粒转化到感受态酵母InvScI中，在选择性培养基上铺板。将酵母转化体纯化为单一菌落，将等份样品-80°C储存在15%甘油中。
表2：用于扩增葡糖淀粉酶催化结构域的寡聚物；位于正向引物中的HinDIII位点带下划线；起始密码子ATG以粗体表示。
Figure BDA00002960784500251
Figure BDA00002960784500261
表3.用于扩增葡糖淀粉酶淀粉结合结构域的寡聚物；位于反向引物5`端的XbaI位点带下划线。
Figure BDA00002960784500262
Figure BDA00002960784500271
通过SOE(重叠延伸拼接)PCR融合催化结构域和淀粉结合结构域。
用试验方法章节所述SOE PCR制备所需的CD-SBD融合体。SOE反应中使用的PCR产物组合和所得的SOE杂交体列于表4。
表4:SOE pcr反应。
CD片段 SBD产物 SOE杂交体名称 SOE杂交体
TE1 TEANsbd1 ANTE1 SEQ ID NO:82
TE2 TEANsbd2 ANTE2 SEQ ID NO:83
TE3 TEANsbd3 ANTE3 SEQ ID NO:84
AR1 ARANsbd1 ANAR1 SEQ ID NO:85
AR2 ARANsbd2 ANAR2 SEQ ID NO:86
AR3 ARANsbd3 ANAR3 SEQ ID NO:87
AR1 ARTEsbd1 ARTE1 SEQ ID NO:88
Ar2 ARTEsbd2 ARTE2 SEQ ID NO:89
AR3 ARTEsbd3 ARTE3 SEQ ID NO:90
AN1 ANTEsbd1 ARAN1 SEQ ID NO:91
AN2 ANTEsbd2 ARAN2 SEQ ID NO:92
AN3 ANTEsbd3 ARAN3 SEQ ID NO:93
TE1 TEARsbd1 TEAN1 SEQ ID NO:94
TE2 TEARsbd2 TEAN2 SEQ ID NO:95
TE3 TEARsbd3 TEAN3 SEQ ID NO:96
AN1 ANARsbd1 TEAR1 SEQ ID NO:97
AN2 ANARsbd2 TEAR2 SEQ ID NO:98
AN3 ANARsbd3 TEAR3 SEQ ID NO:99
实施例2
在“一步”燃料乙醇发酵中评估葡糖淀粉酶-SBM杂交体
通过微小规模发酵评估葡糖淀粉酶-SBM杂交体(TEAN-1,TEAN-3)相对于纯化的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的相对性能。约380g磨碎的玉米(在高速锤磨(pilot scale hammer mill)中磨碎，通过1.65mm筛)加到约620g的自来水中。此混合物中添加3mL1g/L的青霉素。用40%H2SO4将此浆液的pH调整到5.0。一式三份地测定干燥固体(DS)水平为32%。将约5g的这种浆液加至15mL试管中。该研究中使用的酶详情如下：
酶
纯化的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶
TEAN-1(埃默森踝节菌催化模块和黑曲霉SBM的杂交体)
TEAN-3(埃默森踝节菌催化模块和黑曲霉SBM的杂交体)
用每种酶实施四个剂量的剂量反应。所用剂量为0.1，0.3，0.6和1.0AGU/g DS。每个处理有六份重复。
加料后，所述试管用0.04mL/g酵母繁殖物(Red StarTM酵母)糖化醪(mash)接种，所述酵母繁殖物糖化醪已在玉米糖化醪上培养22.5小时。用旋盖盖在试管上部，用小针在旋盖上穿孔以允许空气释放，在称重和32℃保温前简短涡旋。发酵处理后在不同时间对试管称重。称重前将试管简短涡旋。使发酵连续进行约200小时。试验结果如图1所示。
由图1可以看到，两种杂交体TEAN-1、TEAN-3给出了明显高于野生型埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的乙醇产量/g DS。
实施例3
在“一步”燃料乙醇发酵中评估葡糖淀粉酶-SBM杂交体
通过小规模发酵评估葡糖淀粉酶-SBM杂交体(TEAR-1,TEAR-1)相对于纯化的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的相对性能。约380g磨碎的玉米(在高速锤磨中磨碎，通过1.65mm筛)加到约620g的自来水中。此混合物中添加3mL1g/L的青霉素。用40%H2SO4将此浆液的pH调整到5.0。一式三份地测定干燥固体(DS)水平为32%。将约5g的这种浆液加至15mL试管中。每种酶用0.3AGU/g DS的量实施剂量反应。加料后，所述试管用0.04mL/g酵母繁殖物(Red StarTM酵母)糖化醪接种，所述酵母繁殖物糖化醪已在玉米糖化醪上培养22.5小时。用旋盖盖在试管上部，用小针在旋盖上穿孔以允许空气释放，在称重和32℃保温前简短涡旋。发酵处理后在不同时间对试管称重。称重前将试管简短涡旋。使发酵连续进行约70小时。试验结果如以下表1所示：
表1
酶 相对活性
纯化的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶 100%
TEAR-1(埃默森踝节菌催化模块和罗耳阿太菌SBM的杂交体) 250%
TEAR-2(埃默森踝节菌催化模块和罗耳阿太菌SBM的杂交体) 215%
由表1可以看到，两种杂交体TEAR-1、TEAR-3具有明显高于野生型埃默森踝节菌葡糖淀粉酶的相对活性。
Figure IDA00002960785100011
Figure IDA00002960785100021
Figure IDA00002960785100041
Figure IDA00002960785100051
Figure IDA00002960785100061
Figure IDA00002960785100071
Figure IDA00002960785100081
Figure IDA00002960785100101
Figure IDA00002960785100111
Figure IDA00002960785100121
Figure IDA00002960785100131
Figure IDA00002960785100141
Figure IDA00002960785100151
Figure IDA00002960785100161
Figure IDA00002960785100171
Figure IDA00002960785100181
Figure IDA00002960785100191
Figure IDA00002960785100201
Figure IDA00002960785100211
Figure IDA00002960785100221
Figure IDA00002960785100231
Figure IDA00002960785100241
Figure IDA00002960785100251
Figure IDA00002960785100271
Figure IDA00002960785100281
Figure IDA00002960785100291
Figure IDA00002960785100301
Figure IDA00002960785100311
Figure IDA00002960785100321
Figure IDA00002960785100331
Figure IDA00002960785100341
Figure IDA00002960785100361
Figure IDA00002960785100371
Figure IDA00002960785100381
Figure IDA00002960785100391
Figure IDA00002960785100411
Figure IDA00002960785100421
Figure IDA00002960785100431
Figure IDA00002960785100441
Figure IDA00002960785100451
Figure IDA00002960785100461
Figure IDA00002960785100481
Figure IDA00002960785100491

Claims (11)

1.一种包含具有葡糖淀粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的杂交酶，其中
(a)催化模块与SEQ ID NO:25的氨基酸序列的序列具有至少99%序列同一性：并且来源于埃默森踝节菌；
(b)碳水化合物结合模块与SEQ ID NO:19具有至少99%序列同一性，并且来源于罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)。
2.权利要求1的杂交酶，其中所述的催化模块由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，且碳水化合物结合模块是SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
3.权利要求1的杂交酶，其中所述的催化模块由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，且碳水化合物结合模块是SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
4.权利要求1的杂交酶，其由SEQ ID NOs:97-99中任一序列所编码。
5.一种产生乙醇的方法，包括在发酵生物存在时，用权利要求1-4任一项的杂交酶在水性介质中处理颗粒淀粉。
6.权利要求5的方法，另外其中对所述颗粒淀粉进行α-淀粉酶处理。
7.权利要求6的方法，其中所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。
8.权利要求7的方法，其中所述酸性α-淀粉酶源于黑曲霉菌株。
9.权利要求5的方法，其中杂交酶以0.02-20AGU/g DS的量加入。
10.权利要求5的方法，其中所述颗粒淀粉在低于该颗粒淀粉的初始糊化温度下被水解为可溶性淀粉水解产物。
11.权利要求5的方法，其中所述发酵生物是啤酒糖酵母的菌株。
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