ES2230594T3 - Proceso para eliminacion o decoloracion de la suciedad o manchas de tejido celulosico. - Google Patents
Proceso para eliminacion o decoloracion de la suciedad o manchas de tejido celulosico.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA ELIMINACION O BLANQUEADO DE LA SUCIEDAD O DE LAS MANCHAS PRESENTES EN UN TEJIDO CELULOSICO, EN EL QUE EL TEJIDO SE PONE EN CONTACTO EN MEDIO ACUOSO CON UNA ENZIMA MODIFICADA (HIBRIDO DE ENZIMA) QUE CONTIENE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS CATALITICAMENTE ACTIVOS DE UNA ENZIMA NO CELULOSICA UNIDA A UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS QUE CONTIENE UN DOMINIO DE UNION A LA CELULOSA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UNA COMPOSICION DETERGENTE QUE CONTIENE UN HIBRIDO DE ENZIMA DEL TIPO EN CUESTION Y UN TENSIOACTIVO Y A UN PROCEDIMIENTO PARA EL LAVADO DE TEJIDOS CELULOSICOS SUCIOS O CON MANCHAS, EN EL QUE EL TEJIDO SE LAVA EN UN MEDIO ACUOSO AL QUE SE AÑADE DICHA COMPOSICION DE DETERGENTE.
Description
Proceso para eliminación o decoloración de la
suciedad o manchas de tejido celulósico.
La presente invención se refiere a un proceso
enzimático mejorado para limpiar tejidos o telas, sobre todo
tejidos o telas celulósicos, particularmente para la eliminación o
blanqueamiento de manchas del tejido celulósico.
Los procesos enzimáticos para lavar la ropa
(lavandería) y otros tipos de tejidos o telas han sido conocidos
durante muchos años.
Ciertos tipos de suciedad o manchas generalmente
están considerados difíciles de eliminar en estos procedimientos de
lavado. Se trata normalmente de manchas procedentes de almidón,
proteínas, grasas, vino tinto, fruta (como grosella negra, cereza,
fresa o tomate), verduras (como zanahoria o remolacha), té, café,
especies (como curry o paprica), fluidos corporales, hierba, o
tinta (p. ej. de bolígrafos o plumas estilográficas).
Es un objeto de la presente invención el hecho de
mejorar el rendimiento de una enzima de lavado bajo condiciones de
lavado convencionales modificando la enzima para alterar (aumentar)
la afinidad de la enzima con respecto al tejido celulósico, donde
se cree que la enzima modificada es capaz de estar en contacto más
cercano, y/o de mayor duración, con la suciedad o mancha en
cuestión.
Se ha hallado sorprendentemente que es posible
lograr una limpieza mejorada del tejido o tela de celulosa, en
particular una eliminación mejorada o un blanqueamiento de las
manchas presentes en estos, mediante un proceso enzimático donde el
tejido o tela es puesto en contacto con una enzima que ha sido
modificada para que tenga mayor afinidad (con respecto a la enzima
no modificada) para unirse a un tejido o tela de celulosa.
La presente invención se refiere por lo tanto,
entre otras cosas, a un proceso para eliminar o blanquear la
suciedad o las manchas presentes en tejidos o telas de celulosa,
donde el tejido o tela es puesto en contacto en medio acuoso con
una enzima modificada (híbrido enzimático) que comprende una
secuencia de aminoácidos catalíticamente (enzimáticamente) activa de
una enzima no-celulolítica conectada a una secuencia
de aminoácidos que comprende un dominio de unión a celulosa.
La suciedad o las manchas que pueden ser
eliminadas según la presente invención incluyen aquellas ya
mencionadas anteriormente, es decir suciedad o manchas originadas,
por ejemplo, por almidón, proteínas, grasas, vino tinto, fruta
[como grosella negra, cereza, fresa o tomate (en particular tomate
ketchup o salsa de espaguetis)], vegetales (como zanahoria o
remolacha), té, café, especies (como curry o paprica), fluidos
corporales, hierba, o tinta (p. ej. de bolígrafos o plumas
estilográficas). Otros tipos de suciedad o manchas que son
objetivos apropiados de eliminación o blanqueamiento según la
invención incluyen sebo, polvo (es decir tierra), arcilla, aceite y
pintura.
El término "tejido celulósico" pretende
indicar cualquier tipo de tejido, en particular uno tejido,
preparado a partir de un material que contenga celulosa, como
algodón, o de un material derivado de celulosa (preparado, p. ej., a
partir de pasta de madera o de algodón).
En este contexto, el término "tejido"
pretende incluir prendas y otros tipos de tejidos procesados, y se
usan de forma intercambiable con el término "tela".
Ejemplos de tejidos celulósicos hechos a partir
de fibra celulósíca de origen natural son tejidos de algodón,
ramio, yute y lino (hilo). Ejemplos de tejidos celulósicos hechos a
partir de fibra celulósica artificial son viscosa (rayón) y liocel
(p. ej. tejido Tencel^{TM}; también de relevancia en el contexto
de la invención son todas las mezclas de fibras celulósicas (como
viscosa, liocel, algodón, ramio, yute o lino) con otras fibras, p.
ej. con fibras de pelo animal como lana, alpaca o pelo de camello,
o con fibras poliméricas como fibras de poliéster, poliacrílicas,
de poliamida o de poliacetato.
Ejemplos específicos de tejido celulósico
mezclado son mezclas de viscosa/algodón, mezclas de liocel/algodón
(p. ej. mezclas de Tencel^{TM}/algodón), mezclas de viscosa/lana,
mezclas de liocel/lana, mezclas de algodón/lana, mezclas de
algodón/poliéster, mezclas de viscosa/algodón/poliéster, mezclas de
lana/algodón/poliéster, y mezclas de lino/algodón.
Aunque varios tipos de dominios de unión a
carbohidratos han sido descritos en la patente y biografía
científica, en su mayoría -muchos de los cuales derivan de enzimas
celulolíticas (celulasas)- se les denomina de forma común
"dominios de unión a celulosa"; un dominio de unión a celulosa
típico (CBD) será por lo tanto uno que se produzca en una celulosa
o que se una preferiblemente a celulosa y/o a fragmentos de poli u
oligosacáridos.
Dominios de unión a celulosa (y de unión a otros
carbohidratos) son secuencias de aminoácidos de polipéptidos que se
producen como partes íntegras de grandes polipéptidos o proteínas
consistentes en dos o más regiones de secuencias de aminoácidos de
polipéptidos, especialmente en enzimas hidrolíticas (hidrolasas)
que normalmente comprenden un dominio catalítico que contiene el
centro activo para la hidrólisis del sustrato y un dominio de unión
a carbohidratos para el enlace con el sustrato de los carbohidratos
en cuestión. Estos enzimas pueden comprender más de un dominio
catalítico y uno, dos o tres dominios de unión a carbohidratos, y
éstos pueden también comprender una o más regiones de secuencias de
aminoácidos de polipéptidos que conectan el(los)
dominio(s) de unión a carbohidratos con el(los)
dominio(s) catalítico(s), una región de este tipo
normalmente se denomina "enlazador".
Ejemplos de enzimas hidrolíticas que comprenden
un dominio de unión a celulosa son celulasas, xilanasas, mananasas,
arabinofuranosidasas, acetilesterasas y quitinasas. "Dominios de
unión a celulosa" han sido también encontrados en algas, p. ej.
en el alga rojo Pophyra purpurea en forma de una proteína de unión
a polisacáridos no hidrolítica [ver P. Tomme et al.,
Cellulose-Bindinq Domains - Classification and
Properties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates,
John N. Saddler y Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series,
No. 618 (1996)]. No obstante, la mayor parte de los CBDs conocidos
[que están clasificados y denominados por P. Tomme et al. (op
cit.) como "dominios de unión a celulosa"] derivan de
celulasas y xilanasas.
En este contexto, el término "dominio de unión
a celulosa" pretende que se entienda de la misma manera que en
la última referencia (P. Tomme et al., op. cit). La
referencia de P. Tomme et al. clasifica más de 120
"dominios de unión a celulosa" en 10 familias
(I-X) que pueden tener funciones diferentes o
funciones en relación con el mecanismo de unión de sustratos. No
obstante, se debe anticipar que en el futuro aparecerán nuevos
representantes de la familia y de otras familias, y en conexión con
la presente invención un representante de una de estas nuevas
familias de CBD ha sido de hecho identificada (ver Ejemplo 2
aquí).
En proteínas/polipéptidos en que se producen los
CBDs (p. ej. enzimas, normalmente enzimas hidrolíticas como
celulasas), un CBD puede ser localizado en el terminal N o C o en
una posición interna.
La parte de un polipéptido o proteína (p. ej.
enzima hidrolítica) que constituye un CBD por sí mismo normalmente
consiste en más de unos 30 y menos de unos 250 residuos de
aminoácidos. Por ejemplo: los CBDs catalogados y clasificados en la
Familia 1 según P. Tomme et al. (op. cit.) consisten en
33-37 residuos de aminoácidos, los catalogados y
clasificados en familia IIa consisten en 95-108
residuos de aminoácidos, los catalogados y clasificados en Familia
VI consisten en 85-92 residuos de aminoácidos,
mientras que un CBD (derivado de una celulasa de Clostridium
thermocellum) catalogado y clasificado en la Familia VII
consiste en 240 residuos de aminoácidos. En consecuencia, el peso
molecular de una secuencia de aminoácidos que constituye un CBD
per se normalmente está en la gama de unos 4kD hasta unos
40kD, y normalmente por debajo de unos 35kD.
Los números de clasificación enzimática (números
EC) a los que se hace referencia en la presente descripción con
reivindicaciones cumplen las Recommendations (1992) of the
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, Academic Press Inc.,1992.
Una enzima modificada (híbrido enzimático) para
el uso según la invención comprende una secuencia de aminoácidos
(en general una secuencia de aminoácidos de polipéptido)
catalíticamente activa (enzimáticamente activa) de una enzima
no-celulolítica (es decir una secuencia de
aminoácidos catalíticamente activa de una enzima además de una
celulasa) útil en relación con la limpieza de un tejido o tela
(normalmente la eliminación o blanqueamiento de suciedad o manchas
de tejidos o telas en procesos de lavado), en particular de una
enzima seleccionada del grupo que se compone de amilasas (p. ej.
\alpha-amilasas, EC 3.2.1.1), proteasas (es decir
peptidasas, EC 3.4), lipasas (p. ej. lipasas de triacilglicerol, EC
3.1.1.3) y oxidorreductasas (p. ej. peroxidasas, EC 1.11.1, como
las clasificadas bajo EC 1.11.1.7; u oxidasas oxidantes de fenol,
como lacasas, EC 1.10.3.2, u otras enzimas clasificadas en EC
1.10.3), fusionadas (conectadas) a una secuencia de aminoácidos que
comprende un dominio de unión a celulosa. La secuencia de
aminoácidos catalíticamente activa en cuestión puede comprender o
consistir en toda -o sustancialmente toda- la secuencia de
aminoácidos completa de la enzima madura en cuestión, o bien puede
consistir en una parte de la secuencia completa que contiene
sustancialmente las mismas propiedades catalíticas (enzimáticas)
que la secuencia completa.
Enzimas modificadas (híbridos enzimáticos) del
tipo en cuestión, así como descripciones detalladas de la
preparación y purificación de éstas, son conocidas en la técnica
[ver, p. ej., WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, así como
Greenwood et al., Biotechnology and Bioengineering 44
(1984) págs. 1295-1305]. Se pueden preparar, p. ej.,
para transformar en una célula huésped un constructo de ADN que
comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio
ligado de unión a celulosa, con o sin un enlazador, a una secuencia
de ADN que codifica la enzima en cuestión, y que desarrolla la
célula huésped transformada para expresar el gen fusionado. Un tipo
de producto recombinante (híbrido enzimático) relevante, pero no
limitativo, que se puede obtener de esta forma -al que se hace
frecuentemente referencia en la técnica como una "proteína de
fusión"- puede ser descrito por una de las fórmulas generales
siguientes:
A-CBD-MR-X-B
A-X-MR-CBD-B
En estas fórmulas, el CBD es una secuencia de
aminoácidos que comprende al menos el dominio de unión a celulosa
(CBD) per se.
La MR (la región media; un enlazador) puede ser
un enlace, o un grupo de enlace que comprende de 1 a
aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, en particular de 2 a
40 residuos de aminoácidos, p. ej. de 2 a 15 residuos de
aminoácidos. La MR puede, en principio, de forma alternativa ser un
enlace sin aminoácidos.
X es una secuencia de aminoácidos que comprende
la secuencia catalíticamente (enzimáticamente) activa de residuos
de aminoácidos, mencionada arriba, de un polipéptido codificado por
una secuencia de ADN que codifica la enzima no celulolítica de
interés.
Las fracciones A y B son independientemente
opcionales. Si las hay, una fracción A o B constituye una extensión
terminal de un CBD o fracción X, y normalmente comprende uno o más
residuos de aminoácidos.
Será por lo tanto evidente, entre otras cosas, a
partir de lo anterior que un CBD en un híbrido enzimático del tipo
en cuestión puede ser situado C-terminalmente,
N-terminalmente o internamente en el híbrido
enzimático. Correspondientemente, una fracción X en un híbrido
enzimático del tipo en cuestión puede ser situado
N-terminalmente, C-terminalmente o
internamente en el híbrido enzimático.
Los híbridos enzimáticos que interesan en el
contexto de la invención incluyen híbridos enzimáticos que
comprenden más de un CBD, p. ej. de manera que dos o más CBDs estén
conectados directamente entre sí, o están separados el uno del otro
mediante un separador o secuencias de enlace (que normalmente
constan de una secuencia de residuos de aminoácidos con la longitud
apropiada). Dos CBDs en un híbrido enzimático del tipo en cuestión
pueden, por ejemplo, también ser separados uno del otro mediante una
fracción - MR-X según se ha definido
anterior-
mente.
mente.
Una conclusión muy importante en la construcción
de híbridos enzimáticos del tipo en cuestión es la estabilidad
frente a la degradación proteolítica. Las proteínas bi- y
multi-dominio son particularmente susceptibles de
la disociación proteolítica de regiones enlazadoras que conectan los
dominios. Las proteasas que provocan esta disociación pueden, por
ejemplo, ser subtilisinas, las cuales se sabe que frecuentemente
muestran especificidades de sustrato ancho [ver, p. ej.: Grøn et
al., Biochemistrv 31 (1992), págs.
6011-6018; Teplyakov et al., Protein
Engineering 5 (1992), págs. 413-420].
La glicosilación de residuos de enlace en
eucariotas es una de las vías de la naturaleza para prevenir la
degradación proteolítica. Otra es la de emplear aminoácidos que
están menos favorecidos por las proteasas circundantes. La longitud
del enlazador también tiene un papel en relación con la
accesibilidad por proteasas. El hecho de establecer qué
"solución" es óptima depende del entorno en el que va a
funcionar el híbrido enzimático.
Cuando se construyen moléculas de híbridos
enzimáticos nuevas, la estabilidad del enlazador por lo tanto se
vuelve un hallazgo de gran importancia. Los distintos enlazadores
descritos en los ejemplos presentados aquí (véase abajo) en el
contexto de la presente invención están destinados a tener en
cuenta este hallazgo.
Las técnicas adecuadas para aislar un gen de
celulasa son bien conocidas en la técnica. En este contexto, los
términos "celulasa" y "enzima celulolítica" se refieren a
una enzima que cataliza la degradación de celulosa en glucosa,
celobiosa, triosa y/o otros celo-oligosacáridos.
Las celulasas preferidas (es decir celulasas que
comprenden CBDs preferidos) en el contexto presente son celulasas
microbianas, particularmente bacterianas o celulasas micóticas.
Endoglucanasas, sobre todo
endo-1,4-\beta-glucanasas
(EC 3.2.1.4), particularmente
endo-1,4-\beta-glucanasas
monocomponentes (recombinantes), son una clase preferida de
celulasas.
Ejemplos útiles de celulasas bacterianas son
celulasas derivadas de o producibles por bacterias del grupo que
consiste en Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Clostridium,
Microspora, Thermotoga, Caldocellum y Actinomycets como
Streptomyces, Termomonospora y Acidothemus, en particular
del grupo que se compone por Pseudomonas cellulolyticus, Bacillus
lautus, Cellulomonas fimi, Clostridium thermocellum, Microspora
bispora, Termomonospora fusca, Termomonospora cellulolyticum y
Acidothemus cellulolyticus.
La celulasa puede ser una celulasa ácida, neutral
o alcalina, es decir que muestra actividad celulolítica máxima en
la gama ácida, neutral o alcalina, respectivamente.
Una celulasa útil es una celulasa ácida,
preferiblemente una celulasa de ácido fúngica, que está derivada de
o es producible por hongos del grupo de géneros consistentes en
Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Phanaerochaete,
Neurospora, Neocallimastix y Botrytis.
Una celulasa ácida útil preferida es una derivada
de o producible por hongos del grupo de especies que consisten en
Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma
Iongibrachiatum, Myrothecium verrucaria, Aspergillus Níger,
Aspergillus oryzae, Phanaerochaete chrysosporium, Neurospora
crassa, Neocallimastix partriciarum y Botrytis
cinerea.
Otra celulasa útil es una celulasa neutral o
alcalina, preferiblemente una celulasa neutral fúngica o alcalina,
que está derivada de o es producible por hongos del grupo de
géneros consistentes en Aspergillus, Penicillium, Myce-
liophthora, Humicola, Irpex, Fusarium, Stachybotrys, Scopulariopsis,
Chaetomium, Mycogone, Verticillium, Myro- thecium,
Papulospora, Gliocladium, Cephalosporium y
Acremonium.
Una celulasa alcalina preferida es una derivada
de o producible por hongos del grupo de especies consistentes en
Humicola insolens, Fusarium oxysporum, Myceliopthora
thermophila, Penicillium janthinellum y Cephalosporium
sp., preferiblemente del grupo de especies consistentes en
Humicola insolens DSM 1800, Fusarium oxysporum DSM
2672, Myceliopthora thermophila CBS 117.65, y
Cephalosporium sp. RYM-202.
Una celulasa preferida es una endoglucanasa
alcalina que es inmunológicamente reactiva con un anticuerpo
desarrollado contra una \sim43kD endoglucanasa altamente
purificada derivada de Humicola insolens DSM 1800, o que es
un derivado de esta \sim43kD endoglucanasa y muestra actividad
celulasa.
Otros ejemplos de celulasas útiles son variantes
de celulasas genitoras de origen fúngico o bacteriano, p. ej.
variantes de una celulasa genitora derivable de una cepa de unas
especies dentro de uno de los géneros fúngicos de Humicola,
Trichoderma o Fusarium.
Con el objetivo de aislar un dominio de unión a
celulosa de, p. ej., una celulasa, diferentes aproximaciones de
ingeniería genética pueden ser usados. Un método usa enzimas de
restricción para eliminar una parte del gen y luego para fusionar
el restante fragmento gen-vector enmarcado para
obtener un gen mutado que codifica una proteína truncada para un
fragmento de gen particular. Otro método implica el uso de
exonucleasas como Ba131 para eliminar sistemáticamente nucleótidos
bien externamente de los extremos 5' y 3' del ADN o dentro de un
espacio restringido dentro del gen. Estos métodos de eliminación de
genes dan como resultado un gen mutado que codifica una molécula de
gen acortada cuyo producto de expresión puede luego ser evaluado
por su capacidad de unión a sustratos (p. ej. unión a celulosa).
Sustratos apropiados para valorar la capacidad de unión incluyen
materiales celulósicos como Avicel^{TM} y fibras de algodón.
Otros métodos incluyen el uso de una proteasa selectiva o
específica capaz de segmentar un CBD, p. ej. un CBD terminal, del
resto de la cadena polipetídica de la proteína en cuestión.
Como ya se ha indicado (véase arriba), una vez
identificada una secuencia de nucleótidos que codifica la región de
unión a sustratos (unión a carbohidratos), bien como ADNc o ADN
cromosómico, se puede luego manipular de muchas maneras para
fusionarlo a una secuencia de ADN que codifica la enzima o
secuencia de aminoácidos enzimáticamente activa de interés. El
fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de enlace
de carbohidratos, y el ADN que codifica la enzima o secuencia de
aminoácidos enzimáticamente activa en cuestión son luego ligados con
o sin enlazador. El ADN ligado resultante puede luego ser
manipulado de varias maneras para conseguir la expresión. Los
huéspedes de expresión microbiana preferidos incluyen determinadas
especies de Aspergillus (p. ej. A. Niger o A.
oryzae), especies de Bacillus, y organismos como
Escherichia Coli o Saccharomyces cerevisiae.
Las amilasas (p. ej. \alpha- o
\beta-amilasas) que son apropiadas como base para
híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de la
presente invención incluyen aquellas de origen bacteriano o
micótico. Mutantes modificados química o genéticamente de tales
amilasas están incluidos con este propósito.
\alpha-amilasas relevantes incluyen, por ejemplo,
\alpha-amilasas que se pueden obtener a partir de
especies de Bacillus, en particular una cepa especial de
B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1296839. Las
amilasas comercialmente disponibles relevantes incluyen
Duramyl^{TM} Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM} (todos
disponibles por Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), y
Rapidase^{TM} y Maxamyl^{TM} P (disponible por
Gist-Brocades, Holanda).
Otras enzimas amilolíticas útiles son las CGTasas
(ciclodextrina glucanotransferasas, EC 2.4.1.19), p. ej. las que se
pueden obtener a partir de especies de Bacillus,
Thermoanaerobactor o Thermoanaerobacterium.
Las proteasas (peptidasas) que son apropiadas
como la base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el
contexto de la presente invención incluyen aquellas de origen
animal, vegetal o microbiano. Las proteasas de origen microbiano
son preferidas. Mutantes modificados química o genéticamente de
estas proteasas están incluidos con este propósito. La proteasa
puede ser una serina proteasa, preferiblemente una proteasa
microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de
proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente las derivadas
de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina
Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168
(descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina
son tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de
Fusarium descrita en WO 89/06270.
Enzimas proteásicas comercialmente disponibles
relevantes incluyen Alcalase^{TM}, Savinase^{TM}, Primase,
Durazym^{TM} y Esperase^{TM} (todos disponibles por Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), Maxatase^{TM}, Maxacal^{TM}
Maxapem^{TM} y Properase^{TM} (disponible por
Gist-Brocades, Holanda), Purafect^{TM} y
Purafect^{TM} OXP (disponible por Genencor International), y
Opticlean^{TM} y Optimase^{TM} (disponible por Solvay
Enzymes).
Enzimas lipolíticas (lipasas) que son apropiadas
como base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el
contexto de la presente invención incluyen aquellas de origen
bacteriano o micótico. Mutantes modificados química o genéticamente
de tales lipasas están incluidas con este propósito.
Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa de
Humicola lanuginosa, p. ej. como se describe en EP 258 068 y
EP 305 216; una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej. como se
describe en EP 238 023; una lipasa de Candida, como una
lipasa de C. antarctica, p. ej. la lipasa de C.
antarctica A o B descrita en EP 214 761; una lipasa de
Pseudomonas, como una de las descritas en EP 721 981 (p. ej.
una lipasa que se puede obtener a partir de una cepa de
Pseudomonas sp. La cepa SD705 que tiene un número de acceso
de depósito FERM BP-4772), en PCT/JP96/00426, en
PCT/JP96/00454 (p. ej. una lipasa de P. solanacearum), en EP
571 982 o en WO 95/14783 (p. ej. una lipasa de P.
mendocina), una lipasa de P. alcaligenes o P.
pseudoalcaligenes, p. ej. como se describe en EP 218 272, una
lipasa de P. cepacia, p. ej. como se describe en EP 331 376,
una lipasa de P. stutzeri, p. ej. como se describe en GB
1,372,034, o una lipasa de P. fluorescens; una lipasa de
Bacillus, p. ej. una lipasa de B. subtilis [Dartois
et al., Biochemica et Biophvisica Acta 1131 (1993)
págs. 253-260], una lipasa de B.
stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B.
pumilus (WO 91/16422).
Además, varias lipasas clonadas pueden ser
útiles, incluida la lipasa de Penicillium camembertii
descrita por Yamaguchi et al. en Gene 103 (1991),
págs. 61-67, la lipasa de Geotricum candidum
[Y. Schimada et al., J. Biochem. 106 (1989), págs.
383-388], y varias lipasas de Rhizopus como
una lipasa de R. delemar [M.J. Hass et al., Gene
109 (1991) págs. 117-113], una lipasa de
R.niveus [Kugimiya et al., Biosci. Biotech.
Biochem. 56 (1992), págs. 716-719] Y una lipasa
de R. oryzae.
Otros tipos de enzimas lipolíticas útiles de
forma potencial incluyen cutinasas, p. ej. una cutinasa derivada de
Pseudomonas mendocina como se describe en WO 88/09367, o una
cutinasa derivada de f. pisi de Fusarium solani
(descrita, p. ej., en WO 90/09446).
Las lipasas comercialmente disponibles adecuadas
incluyen Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (disponible por
Novo Nordisk A/S), M1 Lipase^{TM}, Lumafast^{TM} y
Lipomax^{TM} (disponible por Gist-Brocades) y
lipasa P "Amano" (disponible por Amano Pharmaceutical Co.
Ltd.).
Las oxidorreductasas que son apropiadas como base
para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el contexto de
la presente invención incluyen peroxidasas (EC 1.11.1) y oxidasas,
como lacasas (EC 1.10.3.2) y algunas enzimas relacionadas.
Las peroxidasas (EC 1.11.1) son enzimas que
actúan en un peróxido (p. ej. peróxido de hidrógeno) como
aceptador. Unas peroxidasas muy adecuadas son las clasificadas en
EC 1.11.1.7, o cualquier fragmento derivado de éste, que muestre
actividad peroxidasa. Sus derivados sintéticos o semisintéticos (p.
ej. con sistemas de anillo de porfirina, o microperoxidasas, ver,
por ejemplo, US 4,077,768, EP 537 381, WO 91/05858 y WO 92/16634)
pueden también ser valiosas en el contexto de la invención.
Unas peroxidasas muy adecuadas son las
peroxidasas que se pueden obtener a partir de vegetales (p. ej.
peroxidasa de rábano o peroxidasa de soja) o de microorganismos,
como hongos o bacterias. En este aspecto, algunos hongos preferidos
incluyen cepas que pertenecen a la subdivisión
Deuteromycotina, clase Hyphomycetes, p. ej.
Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum,
Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia,
Cladosporium o Dreschlera, en particular Fusarium
oxysporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii,
Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum,
Verticillum dahlie, arthromyces ramosus (FERM
P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium
chartarum, Embellisia alli o Dreschlera halodes.
\newpage
Otros hongos preferidos incluyen cepas que
pertenecen a la subdivisión Basidiomycotina, clase
Basidiomycetes, p. ej. Coprinus, Phanerochaete,
Coriolus o Trametes, en particular Coprinus cinereus
f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus,
Phanerochaete chrysosporium (p. ej. NA-12) o
Trametes versicolor (p. ej. PR4 28-A).
Además los hongos preferidos incluyen cepas que
pertenecen a la subdivisión Zygomycotina, clase
Mycoraceae, p. ej. Rhizopus o Mucor, en
particular Mucor hiemalis.
Algunas bacterias preferidas incluyen cepas del
tipo de Actinomycetales, p. ej. Streptomyces
spheroides (ATTC 23965), Streptomyces termoviolaceus
(IFO 12382) o Streptoverticillum verticillium ssp.
verticillium.
Otras bacterias preferidas incluyen Bacillus
pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus,
Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis,
Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) o Pseudomonas
fluorescens (NRRL B-11).
Otras bacterias preferidas incluyen cepas que
pertenecen a Myxococcus, p. ej. M. virescens.
Otras fuentes potenciales de peroxidasas
particularmente útiles están catalogadas en B.C. Saunders et
al., Peroxidase, Londres 1964, págs. 41-43.
La peroxidasa puede además ser una producible por
un método que comprende el cultivo de una célula huésped
-transformada con un vector de ADN recombinante que lleva una
secuencia de ADN que codifica dicha peroxidasa así como secuencias
de ADN que codifican funciones que permiten la expresión de la
secuencia de ADN que codifica la peroxidasa- en un medio de cultivo
bajo condiciones que permiten la expresión de la peroxidasa, y la
recuperación de la peroxidasa del cultivo.
Una peroxidasa producida mediante una
recombinación adecuada es una peroxidasa derivada de Coprinus
sp., en particular C. macrorhizus o C. cinereus
según WO 92/16634, o una variante suya, p. ej. una variante como se
describe en WO 94/12621.
Las oxidasas preferidas en el contexto de la
presente invención son oxidasas clasificadas en EC 1.10.3, que son
oxidasas que usan oxígeno molecular como aceptador (es decir
enzimas que catalizan reacciones oxidantes en las que el oxígeno
molecular funciona como agente oxidante).
Como se ha indicado anteriormente, las lacasas
(EC 1.10.3.2) son oxidasas muy adecuadas en el contexto de la
invención. Ejemplos de otras oxidasas útiles en el contexto de la
invención incluyen las oxidasas de catecol (EC 1.10.3.1) y oxidasas
de bilirrubina (EC 1.3.3.5). Otras enzimas útiles relacionadas
incluyen monofenol monooxigenasas (EC 1.14.18.1).
Las lacasas son obtenibles a partir de una
variedad de fuentes vegetales y microbianas, sobre todo de
bacterias y hongos (incluidos hongos filamentosos y levaduras), y
ejemplos adecuados de lacasas se hallan entre aquellas que se
pueden obtener a partir de hongos, incluidas lacasas obtenibles a
partir de cepas de Aspergillus, Neurospora (p. ej. N.
crassa), Botrytis, Collybia, Forres, Lentinus, Pleurotus,
Trametes (p. ej. T. villosa o T. versicolor
[algunas especies/cepas de Trametes que son conocidas con
varios nombres y/o han sido clasificadas previamente en otros
géneros; p. ej. Trametes villosa = T. pinsitus =
Polyporus pinsitis (también conocido como P. pinsitus
o P. villosus) = Coriolus pinsitus], Polyporus,
Rhizoctonia (p. ej. R. solani), coprinus (p. ej.
C. plicatilis o C. cinereus), Psatyrella,
Myceliophthora (p. ej. M. thermophila),
Schyitalidium, Phlebia (p. ej. P. radita; ver WO
92/01046), Coriolus (p. ej. C.hirsutus; ver JP 2
238885), Pyricularia o Rigidoporus.
Las lacasas preferidas en el contexto de la
invención incluyen la lacasa que se puede obtener a partir de
especies/cepas de Trametes (p. ej. T. villosa),
Myceliophthora (p. ej. M. thermophila),
Schyitalidium o Polyporus.
Otras clases de enzimas que son apropiadas como
base para híbridos enzimáticos de los tipos empleados en el
contexto de la presente invención incluyen pectinasas
(poligalacturonasas; EC 3.2.1.15).
La preparación de plásmidos capaces de expresar
proteínas de fusión cuyas secuencias de aminoácidos deriven de
fragmentos de más de un polipéptido es bien conocida en la técnica
(ver, por ejemplo, WO 90/00609 y WO 95/16782). El cassette de
expresión puede ser incluido dentro de un sistema de replicación
para el mantenimiento episómico en un huésped celular apropiado o
puede ser proporcionado sin un sistema de replicación, donde puede
volverse integrado en el genoma huésped. El ADN puede ser
introducido en el huésped según unas técnicas conocidas como
transformación, microinyección o similares.
Una vez introducido el gen fusionado en el
huésped apropiado, el huésped puede ser desarrollado para expresar
el gen fusionado. Normalmente es deseable añadir también una
secuencia señal que proporcione la secreción del gen fusionado.
Ejemplos típicos de genes fusionados útiles son:
Secuencia señal - - (pro-péptido)
- - dominio de unión a carbohidratos - - enlazador - - secuencia
enzimática de interés, o
Secuencia señal - - (pro-péptido)
- - secuencia enzimática de interés - - enlace - - dominio de unión
a carbohidratos,
donde la secuencia
pro-peptídica normalmente contiene
5-100, p. ej. 5-25, residuos de
aminoácidos.
El producto recombinante puede ser glicosilado o
no glicosilado.
Las composiciones detergentes según la presente
invención comprenden un sistema de surfactante, donde el
surfactante puede ser seleccionado de surfactantes no fónicos y/o
aniónicos y/o catiónicos y/o anfolíticos y/o zwitteriónicos y/o
semi-polares.
El surfactante está normalmente presente en un
nivel del 0.1% al 60% en peso. El surfactante está preferiblemente
formulado para ser compatible con un híbrido enzimático y
componentes enzimáticos presentes en la composición. En
composiciones líquidas o en gel, el surfactante es más
preferiblemente formulado de tal manera que promueve, o al menos no
degrada, la estabilidad de cualquier híbrido enzimático o enzima en
estas composiciones.
Sistemas adecuados para el uso según la presente
invención comprenden como surfactante uno o más de los surfactantes
no fónicos y/o aniónicos descritos aquí.
Los condensados de óxido de polietileno,
polipropileno, y polibutileno de alquil-fenoles son
adecuados para el uso como surfactante no iónico de los sistemas
surfactantes de la presente invención, siendo preferidos los
condensados de óxido de polietileno. Estos compuestos incluyen los
productos de condensación de alquil-fenoles que
tienen un grupo alquilo que contiene de aproximadamente 6 a
aproximadamente 14 átomos de carbono, preferiblemente de
aproximadamente 8 a aproximadamente 14 átomos de carbono, sea en
una configuración de cadena lineal o de cadena ramificada con el
óxido de alquileno. En una forma de realización preferida, el óxido
de etileno está presente en una cantidad igual a aproximadamente 2
hasta aproximadamente 25 moles, más preferiblemente de
aproximadamente 3 a aproximadamente 15 moles, de óxido de etileno
por mol de alquil fenol. Los surfactantes no fónicos de este tipo
comercialmente disponibles incluyen Igepal^{TM}
CO-630, comercializado por GAF Corporation; y
Triton^{TM} X-45, X-114,
X-100 y X-102, todos comercializados
por Rohm & Haas Company. Estos surfactantes son denominados de
forma común alquilofenol alcoxilatos (p. ej., alquil fenol
etoxilatos).
Los productos de condensación de alcoholes
alifáticos primarios y secundarios con de aproximadamente 1 a
aproximadamente 25 moles de óxido de etileno son adecuados para el
uso como surfactante no iónico de los sistemas surfactantes no
fónicos de la presente invención. La cadena de alquilo del alcohol
alifático puede bien ser recta o ramificada, primaria o secundaria,
y generalmente contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 22
átomos de carbono. Preferidos son los productos de condensación de
alcoholes que tienen un grupo alquilo que contiene de
aproximadamente 8 a aproximadamente 20 átomos de carbono, más
preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos
de carbono, con de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 moles de
óxido de etileno por mol de alcohol. Aproximadamente de 2 a
aproximadamente 7 moles de óxido de etileno y más preferiblemente
de 2 a 5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol están
presentes en dichos productos de condensación. Ejemplos de
surfactantes no fónicos de este tipo comercialmente disponibles
incluyen Tergitol^{TM} 15-S-9 (El
producto de condensación de alcohol lineal
C_{11}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno),
Tergitol^{TM} 24-L-6 NMW (El
producto de condensación de alcohol primario
C_{12}-C_{14} con 6 moles óxido de etileno con
una estrecha distribución de peso molecular), ambos comercializados
por Union Carbide Corporation; Neodol^{TM} 45-9
(el producto de condensación de alcohol lineal
C_{14}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno),
Neodol^{TM} 23-3 (el producto de condensación de
alcohol lineal C_{12}-C_{13} con 3.0 moles de
óxido de etileno), Neodol^{TM} 45-7 (el producto
de condensación de alcohol lineal C_{14}-C_{15}
con 7 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 45-5
(el producto de condensación de alcohol lineal
C_{14}-C_{15} con 5 moles de óxido de etileno)
comercializado por Shell Chemical Company, Kyro^{TM} EOB (el
producto de condensación de alcohol
C_{13}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno),
comercializado por The Procter & Gamble Company, y Genapol LA
050 (el producto de condensación de alcohol
C_{12}-C_{14} con 5 moles de óxido de etileno)
comercializado por Hoechst. La gama preferida de HLB en estos
productos es de 8-11 y más preferiblemente de
8-10.
También útil como surfactante no fónico de los
sistemas surfactantes de la presente invención son los
alquilpolisacáridos descritos en US 4,565,647, que tienen un grupo
hidrofóbico que contiene de aproximadamente 6 a aproximadamente 30
átomos de carbono, preferiblemente de aproximadamente 10 a
aproximadamente 16 átomos de carbono y un polisacárido, p. ej. una
poliglicosida, grupo hidrofílico que contiene de aproximadamente 1.3
a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1.3 a
aproximadamente 3, más preferiblemente de aproximadamente 1.3 a
aproximadamente 2.7 unidades sacáridas. Cualquier sacárido de
reducción que contiene de 5 ó 6 átomos de carbono pueden ser
usados, p. ej., fracciones de glucosa, galactosa y galactosil pueden
ser sustituidos para las fracciones de glucosil (opcionalmente el
grupo hidrofóbico está unido en las posiciones 2, 3, 4, etc. dando
así una glucosa o galactosa como oposición a una glucosida o
galactosida). Los enlaces intersacáridos pueden estar, p. ej., entre
una posición de las unidades sacáridas adicionales y las posiciones
2, 3, 4, y/o 6 en las unidades sacáridas precedentes.
Las alquilpoliglucosidas preferidas tienen la
fórmula
R^{2}O(C_{n}H_{2n}O)_{t}
(glicosil)_{x}
donde R^{2} está seleccionado del
grupo que se compone de alquilo, alquilfenilo, hidroxialquilo,
hidroxialquilfenilo, y sus mezclas derivadas donde los grupos
alquilo contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 18,
preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 14, átomos
de carbono; n es 2 ó 3, preferiblemente 2; t es de 0 a
aproximadamente 10, preferiblemente 0; y x es de aproximadamente
1.3 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 1.3 a
aproximadamente 3, más preferiblemente de aproximadamente 1.3 a
aproximadamente 2.7. El glicosilo es preferiblemente derivado de
glucosa. Para preparar estos compuestos, el alcohol o
alquilpolietoxi alcohol es formado primero y luego reaccionado con
glucosa, o una fuente de glucosa, para formar el glucósido (fijación
en la posición 1). Las unidades de glicosilo adicionales pueden
después ser unidas entre su posición 1 y las unidades de glicosilo
precedentes en la posición 2, 3, 4, y/o 6, preferiblemente
predominantemente la posición
2.
Los productos de condensación de óxido de etileno
con una base hidrofóbica formados por la condensación de óxido de
propileno con propilenoglicol son también adecuados para el uso
como sistemas surfactantes no iónicos adicionales de la presente
invención. La parte hidrofóbica de estos compuestos preferiblemente
tienen un peso molecular de aproximadamente 1500 a aproximadamente
1800 y mostrarán insolubilidad al agua. La adición de fracciones de
polioxietileno a esta parte hidrofóbica tiende a aumentar la
solubilidad al agua de la molécula como conjunto, y el carácter
líquido del producto es retenido hasta el punto en que el contenido
de polioxietileno es aproximadamente el 50% del peso total del
producto de condensación, que corresponde a una condensación con
hasta aproximadamente 40 moles de óxido de etileno. Ejemplos de
compuestos de este tipo incluyen algunos de los surfactantes
Pluronic^{TM} comercialmente disponibles, comercializados por
BASF.
También adecuado para el uso como surfactante no
iónico del sistema surfactante no fónico de la presente invención,
son los productos de condensación de óxido de etileno con el
producto que resulta de la reacción de óxido de propileno y
etilenodiamina. La fracción hidrofóbica de estos productos consiste
en el producto de reacción de etilenodiamina y óxido de propileno en
exceso, y generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente
2500 a aproximadamente 3000. Esta fracción hidrofóbica está
condensada con óxido de etileno hasta tal punto que el producto de
condensación contiene aproximadamente del 40% hasta aproximadamente
el 80% en peso de polioxietileno y tiene un peso molecular de
aproximadamente 5,000 a aproximadamente 11,000. Ejemplos de
surfactantes no fónicos de este tipo incluyen algunos de los
compuestos de Tetronic^{TM} comercialmente disponibles,
comercializados por BASF.
Preferido para el uso como surfactante no fónico
de los sistemas surfactantes de la presente invención son
condensados de óxido de polietileno de
alquil-fenoles, productos de condensación de
alcoholes alifáticos primarios y secundarios con de aproximadamente
1 a aproximadamente 25 moles de óxido de etileno,
alquilpolisacáridos, y sus mezclas derivadas. Más preferidos son los
C_{8}-C_{14} alquil fenol etoxilatos que tienen
de 3 a 15 grupos etoxi y C_{8}-C_{18} alcohol
etoxilatos (preferiblemente C_{10} media) que tienen de 2 a 10
grupos etoxi, y sus mezclas derivadas.
Unos surfactantes no iónicos altamente preferidos
son surfactantes de polihidroxi amida de ácido graso de la
fórmula
R^{2} ---
\delm{C}{\delm{\dpara}{O}} ---
\delm{N}{\delm{\dpara}{R ^{1} }} ---
Z,
donde R^{1} es H, o R^{1} es
C_{1-4} hidrocarbilo,
2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o
una mezcla derivada, R^{2} es C_{5-31}
hidrocarbilo, y Z es un polihidroxihidrocarbilo que tiene una
cadena de hidrocarbilo lineal con al menos 3 hidroxilos directamente
conectados a la cadena, o un derivado alcoxilado. Preferiblemente,
R^{1} es metilo, R^{2} es una cadena recta de
C_{11-15} alquilo o C_{16-18}
alquilo o de alquenilo como alquilo de coco o mezclas derivadas, y
Z está derivado de un azúcar de reducción como glucosa, fructosa,
maltosa o lactosa, en una reacción de aminación
reductora.
Los surfactantes aniónicos altamente preferidos
incluyen surfactantes de alquil sulfato alcoxilado. Ejemplos de
esto son sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula
RO(A)-SO3M donde R es un grupo
C_{10}-C_{24} alquilo o hidroxialquilo
insustituido con un componente C_{10}-C_{24}
alquilo, preferiblemente un C_{12}-C_{20}
alquilo o hidroxialquilo, más preferiblemente
C_{12}-C_{18} alquilo o hidroxialquilo, A es
una unidad etoxi o propoxi, m es superior a cero, normalmente entre
aproximadamente 0.5 y aproximadamente 6, más preferiblemente entre
aproximadamente 0.5 y aproximadamente 3, y M es H o un catión que
puede ser, por ejemplo, un catión metálico (p. ej., sodio, potasio,
litio, calcio, magnesio, etc.), catión de amonio o sustituido con
amonio. Los alquil sulfatos etoxilados así como los alquil sulfatos
propoxilados están contemplados en la presente. Unos ejemplos
específicos de cationes de amonio sustituido incluyen cationes de
metilo, dimetilo, trimetil-amonio y cationes de
amonio cuaternario como cationes de
tetrametil-amonio y dimetil piperdinio y aquellos
derivados de alquilaminas como etilamina, dietilamina,
trietilamina, mezclas derivadas, y similares. Unos surfactantes
ejemplares son C_{12}-C_{18} alquil
polietoxilato (1.0) sulfato
(C_{12}-C_{18}E(1.0)M),
C_{12}-C_{18} alquil polietoxilato (2.25)
sulfato (C_{12}-C_{18}(2.25)M, y
C_{12}-C_{18} alquil polietoxilato (3.0)
sulfato (C_{12}-C_{18}E(3.0)M, y
C_{12}-C_{18} alquilo polietoxilato (4.0)
sulfato (C_{12}-C_{18}E(4.0)M),
donde M está convenientemente seleccionado de sodio y potasio. Unos
surfactantes aniónicos adecuados para ser usados son agentes
surfactantes de alquil éster sulfonato que incluyen ésteres lineales
de ácidos carboxílicos C_{8}-C_{20} (es decir,
ácidos grasos) que son sulfonatados con SO_{3} gaseoso según
"The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975),
págs. 323-329. Precursores adecuados incluirían
sustancias grasas naturales como derivados de sebo, aceite de
palma, etc.
El surfactante de alquil éster sulfonato
preferido, especialmente para aplicaciones de lavandería,
comprenden surfactantes de alquil éster sulfonato de la fórmula
estructural:
R^{3} ---
\melm{\delm{\para}{SO _{3} M}}{CH}{\uelm{\dpara}{O}} ---
C ---
OR^{4}
donde R^{3} es un
C_{8}-C_{20} hidrocarbilo, preferiblemente un
alquilo, o una combinación derivada, R^{4} es un
C_{1}-C_{6} hidrocarbilo, preferiblemente un
alquilo, o combinación derivada, y M es un catión que forma una sal
hidrosoluble con el alquil éster sulfonato. Los cationes que forman
sales adecuados incluyen metales como sodio, potasio, y litio, y
cationes de amonio sustituido o insustituido, como monoetanolamina,
dietonolamina, y trietanolamina. Preferiblemente, R^{3} es
C_{10}-C_{16} alquilo, y R^{4} es metilo,
etilo o isopropilo. Especialmente preferidos son los metil éster
sulfonatos donde R^{3} es C_{10}-C_{16}
alquilo.
Otros surfactantes aniónicos adecuados incluyen
los surfactantes de alquil sulfato que son sales o ácidos
hidrosolubles de la fórmula ROSO_{3}M donde R preferiblemente es
un C_{10}-C_{24} hidrocarbilo, preferiblemente
un alquilo o hidroxialquilo que tiene un componente de
C_{10}-C_{20} alquilo, más preferiblemente un
C_{12}-C_{18} alquilo o hidroxialquilo, y M es H
o un catión, p. ej., un catión de metal alcalino (p. ej. sodio,
potasio, litio), o cationes de amonio o amonio sustituido (p. ej.
metilo, dimetil, y trimetil amonio y cationes de amonio cuaternario
como cationes de tetrametil-amonio y dimetil
piperdinium y cationes de amonio cuaternario derivados de
alquilaminas como etilamina, dietilamina, trietilamina, y sus
mezclas derivadas, y similares). Normalmente, se prefieren las
cadenas de C_{12}-C_{16} alquilo para
temperaturas de lavado inferiores (p. ej. por debajo de
aproximadamente 50°C) y cadenas de C_{16}-C_{18}
alquilo son preferidas para temperaturas de lavado más elevadas (p.
ej. aproximadamente por encima de 50°C).
Otros surfactantes aniónicos útiles para
objetivos detergentes pueden también resumirse en las composiciones
de detergente de lavado de la presente invención. Estas pueden
incluir sales (que incluyen, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, y
sales de amonio sustituido como sales mono- di y trietanolamina) de
jabón, alcanosulfonatos primarios o secundarios
C_{8}-C_{22}, olefinsulfonatos
C_{8}-C_{24}, ácidos policarboxílicos
sulfonatados preparados por sulfonación del producto pirolizado de
citratos de metal alcalinotérreo, p. ej., como se describe en la
descripción de la patente Británica N°. 1,082,179,
C_{8}-C_{24} alquilpoliglicoletersulfatos (que
contienen hasta 10 moles de óxido de etileno); alquil glicerol
sulfonatos, acil glicerol sulfonatos grasos, oleil glicerol
sulfatos grasos, sulfatos de éter del óxido de alquil fenol etileno,
sulfonatos de parafina, alquil fosfatos, isetionatos como los acil
isetionatos, N-acil tauratos, alquil succinamatos y
sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente
C_{12}-C_{18} monoésteres saturados e
insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente
C_{6}-C_{12} diésteres saturados e insaturados),
acil sarcosinatos, sulfatos de alquilpolisacáridos como los
sulfatos de alquilpoliglucosida (los compuestos no fónicos y no
sulfatados que están descritos más abajo), alquil sulfatos
primarios ramificados, y alquil polietoxi carboxilatos como los de
la fórmula
RO(CH_{2}CH_{2}O)k-CH_{2}COO-M+
donde R es un C_{8}-C_{22} alquilo, K es un
número entero del 1 al 10, y M es un catión de formación de sal
soluble. Ácidos resínicos y ácidos resínicos hidrogenados son
también adecuados, como la rosina, rosina hidrogenada, y ácidos
resínicos y ácidos resínicos hidrogenados presentes en o derivados
de aceite de bogol.
Son muy preferidos los alquilbenceno sulfonatos.
Especialmente preferidos son los alquil benceno sulfonatos (LAS)
lineales (cadena lineal) donde el grupo alquilo preferiblemente
contiene de 10 a 18 átomos de carbono.
Otros ejemplos están descritos en "Surface
Active Agents and Detergents" (Vol. 1 y II por Schwartz, Perry y
Berch). Una variedad de estos surfactantes también están descritos
de forma general en US 3,929,678, (columna 23, línea 58 en la
Columna 29, línea 23, aquí incorporada por referencia).
Cuando se incluyen, las composiciones de
detergente para lavandería de la presente invención normalmente
comprenden de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40%,
preferiblemente aproximadamente del 3% a aproximadamente el 20% en
peso de estos surfactantes aniónicos.
Las composiciones de detergente para lavandería
de la presente invención pueden también contener surfactantes
catiónicos, anfolíticos, zwitteriónicos, y
semi-polares, así como surfactantes no iónicos y/o
aniónicos además de los ya descritos en la presente.
Surfactantes detergentes catiónicos adecuados
para el uso en las composiciones de detergente de lavandería de la
presente invención son los que tienen un grupo hidrocarbilo de
cadena larga. Ejemplos de estos surfactantes catiónicos incluyen
los surfactantes de amonio como los halogenuros de
alquiltrimetilamonio, y los surfactantes que tienen la fórmula:
[R^{2}(OR^{3})_{y}][R^{4}(OR^{3})_{y}]_{2}R^{5}N+X
donde R^{2} es un grupo alquilo o
alquil bencilo que tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 18
átomos de carbono en la cadena de alquilo, cada R^{3} está
seleccionado para formar el grupo que se compone por
-CH_{2}CH_{2}-, CH_{2}CH(CH_{3}),
-CH_{2}CH(CH_{2}OH), -CH_{2}CH_{2}CH_{2}, y sus
mezclas derivadas; cada R^{4} está seleccionado del grupo que se
compone de C_{1}-C_{4} alquilo,
C_{1}-C_{4} hidroxialquilo, estructuras de
anillo de bencilo formadas juntando los dos grupos R^{4},
-CH_{2}CHOHCHOHCOR^{6}CHOHCH_{2}OH, donde R^{6} es cualquier
hexosa o polímero de hexosa que tiene un peso molecular inferior a
aproximadamente 1000, e hidrógeno cuando y no es 0; R^{5} es igual
que R^{4} o es una cadena de alquilo, donde el número total de
átomos de carbono o R^{2} más R^{5} no es superior a
aproximadamente 18; cada y es de 0 a aproximadamente 10,y la suma
de los valores de y es de 0 a aproximadamente 15; y X es cualquier
anión
compatible.
Surfactantes catiónicos muy preferidos son los
compuestos de amonio cuaternario solubles en agua útiles en esta
composición que tienen la fórmula:
(i)R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}N^{+}X^{-}
donde R_{1} es
C_{8}-C_{16}alquilo, cada R_{2}, R_{3} y
R_{4} es independientemente C_{1}-C_{4}
alquilo, C_{1}-C_{4} hidroxi alquilo, bencilo, y
-(C_{2}H_{40})_{x}H donde x tiene un valor de 2 a 5, y
X es un anión. No más de uno de R_{2}, R_{3} o R_{4} debería
ser
bencilo.
La longitud de cadena de alquilo preferida para
R_{1} es C_{12}-C_{15}, particularmente donde
el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena derivadas de
coco o grasa de palmiste o derivan sintéticamente de la acumulación
de olefina o síntesis de OXO alcoholes.
Grupos preferidos para R_{2}R_{3} y R_{4}
son grupos metilo y hidroxietilo y el anión X puede ser
seleccionado de haluro, metosulfato, acetato y iones fosfato.
Ejemplos de compuestos de amonio cuaternario
adecuados de fórmulas (i) para su uso en la presente son:
cloruro o bromuro de trimetil amonio de coco;
cloruro o bromuro de dihidroxietil metil amonio
de coco;
cloruro de decil trietil amonio;
cloruro o bromuro de decil dimetil hidroxietil
amonio;
cloruro o bromuro de C_{12-15}
dimetil hidroxietil amonio;
cloruro o bromuro de dimetil hidroxietil amonio
de coco;
metil sulfato de miristil trimetil amonio;
cloruro o bromuro de lauril dimetil bencil
amonio;
cloruro o bromuro lauril dimetil (etanoxi)
amonio;
ésteres de colina (compuestos de fórmula (i)
donde R_{1} es
CH2-CH2-
\delm{O}{\delm{\dpara}{O}}-C-C12-14
alquilo y R2R3R4 son metilo).
di-alquil imidazolinas
[compuestos de la fórmula (i)].
Otros surfactantes catiónicos útiles aquí están
también descritos en US 4,228,044 y en EP 000 224.
Cuando se incluye en su interior, las
composiciones de detergente de lavado de la presente invención
normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 25%,
preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 8% en
peso de estos surfactantes catiónicos.
Los surfactantes anfolíticos son también
adecuados para el uso en las composiciones de detergente de lavado
de la presente invención. Estos surfactantes pueden ser descritos
de forma aproximada como derivados alifáticos de aminas secundarias
o terciarias, o derivados alifáticos de aminas secundarias y
terciarias heterocíclicas en las que el radical alifático puede ser
de cadena recta o ramificada. Uno de los sustituyentes alifáticos
contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono, normalmente
de aproximadamente 8 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y al
menos uno contiene un grupo aniónico de solubilización en agua, p.
ej. carboxi, sulfonato, sulfato. Ver US 3,929,678 (columna 19,
líneas 18-35) para ejemplos de surfactantes
anfolíticos.
Cuando se incluye en su interior, las
composiciones de detergente de lavado de la presente invención
normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 15%,
preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%
en peso de tales surfactantes anfolíticos.
Los surfactantes bipolares son también adecuados
para el uso en composiciones de detergente de lavado. Estos
surfactantes pueden ser descritos de forma aproximada como
derivados de aminas secundarias y terciarias, derivados de aminas
secundarias y terciarias heterocíclicas, o derivados de compuestos
de amonio cuaternario, fosfonio cuaternario o sulfonio terciario.
Ver US 3,929,678 (columna 19, línea 38 en la columna 22, línea 48)
para ejemplos de surfactantes bipolares.
Cuando se incluye en su interior, las
composiciones de detergente de lavado de la presente invención
normalmente comprenden de 0.2% a aproximadamente 15%,
preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% en peso
de tales surfactantes bipolares.
Los surfactantes semipolares no fónicos son una
categoría especial de surfactantes no iónicos que incluyen óxidos
de amina hidrosoluble que contienen una fracción de alquilo de
aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono y 2
grupos seleccionados del grupo que se compone por grupos alquilo y
grupos hidroxialquilo que contienen de aproximadamente 1 a
aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos de fosfina solubles en
agua que contienen una fracción de alquilo de aproximadamente 10 a
aproximadamente 18 átomos de carbono y 2 grupos seleccionados del
grupo que se compone de grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que
contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 átomos de
carbono; y sulfóxidos hidrosolubles que contienen una fracción de
alquilo de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de
carbono y una mitad seleccionada del grupo que se compone de grupos
alquilo e hidroxialquilo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3
átomos de carbono.
Surfactantes de detergentes no iónicos
semipolares incluyen los surfactantes de óxidos de amina que tienen
la fórmula:
R^{3}(OR^{4})x
\uelm{N}{\uelm{ \uparrow }{O}}(R^{5})2
donde R^{3} es un grupo alquilo,
hidroxialquilo, o alquil fenilo o mezclas derivadas que contienen
de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono;
R^{4} es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene de
aproximadamente 2 a aproximadamente 3 átomos de carbono o mezclas
derivadas; X es de 0 a aproximadamente 3: y cada R^{5} es un grupo
alquilo o hidroxialquilo que contiene de aproximadamente 1 a
aproximadamente 3 átomos de carbono o un grupo de óxido de
polietileno que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 3
grupos de óxido de etileno. Los grupos R^{5} pueden ser unidos
entre sí, p. ej., a través de un átomo de oxígeno o de nitrógeno,
para formar una estructura
anular.
Estos surfactantes de óxidos de amina en
particular incluyen óxidos de C_{10}-C_{18}
alquil dimetil amina y óxidos de C_{8}-C_{12}
alcoxi etil dihidroxi etil amina.
Cuando se incluyen en su interior, las
composiciones de detergente de lavado de la presente invención
normalmente comprenden del 0.2% a aproximadamente el 15%,
preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%
en peso de estos surfactantes no fónicos semipolares.
Las composiciones según la presente invención
pueden adicionalmente comprender un sistema constructor. Cualquier
sistema constructor convencional es conveniente para el uso en la
presente incluyendo materiales de aluminosilicato, silicatos,
policarboxilatos y ácidos grasos, materiales como tetraacetato de
etilenodiamina, secuestrantes iónicos como aminopolifosfonatos,
particularmente ácido fosfónico de tetrametileno de etilenodiamina
y ácido pentametilenofosfónico de dietilentriamina. Aunque menos
preferido por cuestiones medioambientales obvias, los constructores
de fosfato pueden también ser usados en la presente.
Unos constructores adecuados pueden ser un
material de intercambio fónico inorgánico, comúnmente un material
de aluminosilicato hidratado inorgánico, más particularmente una
zeolita sintética hidratada como zeolita hidratada A, X, B, HS o
MAP.
Otro material constructor inorgánico adecuado es
silicato estratificado, p. ej. SKS-6 (Hoechst).
SKS-6 es un silicato estratificado cristalino
consistente en silicato sódico (Na_{2}Si_{2}O_{5}).
Unos policarboxilatos adecuados que contienen un
grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólico y sus
derivados de éter como se describe en las Patentes Belgas Nos.
831,368, 821,369 y 821,370. Los policarboxilatos que contienen dos
grupos de carboxi incluyen las sales hidrosolubles de ácido
succínico, ácido malónico, ácido (etilenodioxi) diacético, ácido
maléico, ácido diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y
ácido fumárico, así como los carboxilatos de éter descritos en
German Offenleenschrift 2,446,686, y 2,446,487, US 3,935,257 y los
carboxilatos de sulfinilo descritos en la Patente Belga No.
840,623. Los policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi
incluyen, en particular, citratos hidrosolubles, aconitratos y
citraconatos así como derivados de succinato como los
carboximetiloxisuccinatos descritos en Patente Británica No.
1,379,241, los lactoxisuccinatos descritos en la solicitud
holandesa 7205873, y los materiales de oxipolicarboxilato como los
2-oxa-1,1,3-propano
tricarboxilatos descritos en Patente Británica N°. 1,387,447.
Los policarboxilatos que contienen cuatro grupos
carboxi incluyen los oxidisuccinatos descritos en la Patente
Británica N°. 1,261,829, 1,1,2,2,-etano tetracarboxilatos,
1,1,3,3-propano tetracarboxilatos que contienen
sustituyentes sulfo e incluyen los derivados de sulfosuccinato
descritos en la Patente Británica Nos. 1,398,421 y 1,398,422 y en
US 3,936,448, y los citratos sulfonatados pirolizados descritos en
la Patente Británica N°. 1,082,179, mientras que los
policarboxilatos que contienen sustituyentes fosfono están
descritos en la Patente Británica N°. 1,439,000.
Policarboxilatos alicíclicos y heterocíclicos
incluyen derivados de
ciclopentano-cis,cis-cis-tetracarboxilatos,
ciclopentadienida pentacarboxilatos,
2,3,4,5-tetrahidro-furan-cis,
cis, cis-tetracarboxilatos,
2,5-tetrahidro-furan-cis,
discarboxilatos,
2,2,5,5,-tetrahidrofurano-tetracarboxilatos,
1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos
y derivados de carboximetilo de alcoholes polihídricos como
sorbitol, manitol y xilitol. Los policarboxilatos aromáticos
incluyen ácido melítico, ácido piromelítico y los derivados de
ácido ftálico descritos en la Patente Británica N°. 1,425,343.
De lo anterior, los policarboxilatos preferidos
son los hidroxicarboxilatos que contienen hasta tres grupos carboxi
por molécula, más particularmente citratos.
Sistemas constructores preferidos para el uso en
estas composiciones incluyen una mezcla de un constructor de
aluminosilicato insoluble en agua como zeolita A o de un silicato
estratificado (SKS-6), y un agente quelante de
carboxilato hidrosoluble como el ácido cítrico.
Un agente quelante adecuado para la inclusión en
las composiciones de detergente según la invención es el ácido
etilenodiamina-N,N'-disuccínico
(EDDS) o el metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio, o sales
amónicas sustituidas derivadas, o mezclas derivadas. Unos
compuestos de EDDS preferidos son la forma ácida libre y el sodio o
sal magnésica derivada. Ejemplos de estas sales sódicas preferidas
de EDDS incluyen Na_{2}EDDS y Na_{4}EDDS. Ejemplos de estas
sales magnésicas preferidas de EDDS incluyen MgEDDS y Mg_{2}EDDS.
Las sales magnésicas son las más preferidas para la inclusión en
composiciones según la invención.
Sistemas constructores preferidos incluyen una
mezcla de un constructor de aluminosilicato insoluble en agua como
zeolita A, y un agente quelante de carboxilato soluble en agua como
el ácido cítrico.
Otros materiales constructores que pueden formar
parte del sistema constructor para el uso en composiciones
granulosas incluyen materiales inorgánicos como carbonatos de metal
alcalino, bicarbonatos, silicatos, y materiales orgánicos como los
fosfonatos orgánicos, fosfonatos de amino polialquileno y
policarboxilatos de amino.
Otras sales orgánicas hidrosolubles adecuadas son
los ácidos horno- o co-poliméricos o sus sales, en
las que el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales
de carboxilo separados formados cada uno por no más de dos átomos
de carbono.
Los polímeros de este tipo están descritos en
GB-A-1,596,756. Ejemplos de estas
sales son poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus
copolímeros con anhídrido maléico, tales copolímeros tienen un peso
molecular de 20,000 a 70,000, especialmente al rededor de
40,000.
Sales de constructores de detergencia son
normalmente incluidas en cantidades de entre el 5% y 80% en peso de
la composición. Los niveles preferidos de constructores para
detergentes líquidos se hallan entre el 5% y el 30%.
Además de la(s) enzima(s)
híbrida(s) en cuestión, las composiciones del detergente de
la invención pueden comprender otras enzimas que proporcionen
rendimiento de limpieza y/o beneficios para el cuidado de los
tejidos. Estas enzimas incluyen proteasas, lipasas, cutinasas,
amilasas, celulasas, peroxidasas y oxidasas (p. ej. lacasas).
Proteasas: Se puede usar, por ejemplo,
cualquier proteasa adecuada para el uso en soluciones alcalinas.
Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o
microbiano. Se prefieren de origen microbiano. Se incluyen mutantes
modificados química o genéticamente. La proteasa puede ser una
proteasa de cerina, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina
o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas
son subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus,
p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309,
subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279).
Ejemplos de proteasas de tripsina como son tripsina (p. ej. de
origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita
en WO 89/06270.
Las enzimas proteásicas comercialmente
disponibles preferidas incluyen aquellas vendidas con los nombres
comerciales Alcalase, Savinase, Primase, Durazym, y Esperase por
Novo Nordisk A/S (Dinamarca), aquellas vendidas con el nombre
comercial Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y
Purafect OXP por Genencor Internacional, y aquellas vendidas con el
nombre comercial Opticlean y Optimase por Solvay Enzymes. Enzimas
proteásicas pueden ser incorporadas en las composiciones según la
invención a un nivel entre el 0.00001% y 2% en peso de proteína
enzimática de la composición, idóneamente a un nivel entre el
0.0001% y 1% en peso de proteína enzimática de la composición, así
como a un nivel entre el 0.001% y 0.5% en peso de proteína
enzimática de la composición, de forma apropiada a un nivel entre el
0.01% y 0.2% en peso de proteína enzimática de la composición.
Lipasas: Se puede usar, por ejemplo,
cualquier lipasa adecuada para el uso en soluciones alcalinas. Las
lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o micótico. Se
incluyen mutantes modificados química o genéticamente.
Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa de
Humicola lanuginosa, p. ej., como se describe en EP 258 068
y EP 305 216, una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej., como
se describe en EP 238 023, una lipasa de Candida, como una
lipasa de C. antarctica, p. ej., la lipasa de C.
antarctica A o B descrita en EP 214 761, una lipasa de
Pseudomonas como una lipasa de P. alcaliqenes y P.
pseudoalcaligenes, p. ej. según se describe en EP 218 272, una
lipasa de P. cepacia, p. ej., como se describe en EP 331 376,
una lipasa de P.stutzeri, p. ej., como se describe en GB
1,372,034, una lipasa de P. fluorescens, una lipasa de
Bacillus, p. ej., una lipasa de B. subtilis (Dartois
et al., (1993), Biochemica et Biophyisica Acta 1131,
253-260), una lipasa de B.
stearothermophilus (JP 64/744992) y una lipasa de B.
pumilus (WO 91/16422).
Además, varias lipasas clonadas pueden ser
útiles, incluida la lipasa de Penicillium camembertii
descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103,
61-67), la liapasa de Geotricum candidum
(Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106,
383-388), y varias lipasas de Rhizopus como
una lipasa de R. delemar (Hass, M.J et al., (1991),
Gene 109, 117-113), una lipasa de R. niveus
(Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56,
716-719) y una lipasa de R. oryzae.
Otros tipos de enzimas lipolíticas como las
cutinasas pueden también ser útiles, p. ej., una cutinasa derivada
de Pseudomonas mendocina como se describe en WO 88/09367, o
una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (p. ej.
descrita en WO 90/09446).
Unas lipasas especialmente adecuadas son lipasas
como M1 Lipase^{TM} Luma fast^{TM} y Lipomax^{TM} (Genencor),
Lipolase^{TM} y Lipolasa Ultra^{TM} (Novo Nordisk A/S), y
lipasa P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Las lipasas están normalmente incorporadas en la
composición de detergente a un nivel entre el 0.00001% y el 2% en
peso de proteína enzimática de la composición, como a un nivel
entre el 0.0001% y el 1% en peso de proteína enzimática de la
composición, p. ej. a un nivel entre el 0.001% y el 0.5% en peso de
proteína enzimática de la composición, de forma apropiada a un
nivel entre el 0.01% y el 0.2% en peso de proteína enzimática de la
composición.
Amilasas: Se puede usar cualquier amilasa
(p. ej. \alpha- y/o \beta-) adecuada para el uso en soluciones
alcalinas. Las amilasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano
o micótico. Los mutantes modificados química o genéticamente están
incluidos. Las amilasas incluyen, por ejemplo,
\alpha-amilasas obtenidas a partir de una cepa
especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB
1,296,839. Las amilasas comercialmente disponibles son
Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM}
(disponibles por Novo Nordisk A/S) y Rapidase^{TM} y Maxamyl
P^{TM} (disponibles por Genencor).
Las amilasas son normalmente incorporadas en la
composición del detergente a un nivel entre el 0.00001% y el 2% en
peso de proteína enzimática de la composición, como a un nivel
entre el 0.0001% y el 1% en peso de proteína enzimática de la
composición, p. ej. a un nivel entre el 0.001% y el 0.5% en peso de
proteína enzimática de la composición, de forma apropiada a un
nivel entre el 0.01% y el 0.2% en peso de proteína enzimática de la
composición.
Celulasas: Se puede usar, por ejemplo,
cualquier celulasa adecuada para el uso en soluciones alcalinas.
Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o
micótico. Se incluyen mutantes modificados química o genéticamente.
Las celulasas adecuadas están descritas en US 4,435,307, que expone
celulasas micóticas producidas a partir de Humicola insolens.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas que tienen
beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de estas celulasas
son las celulasas descritas en la Solicitud de patente europea N°.
0 495 257.
Las celulasas comercialmente disponibles incluyen
Celluzyme^{TM} producidas por una cepa de Humicola
insolens, (novo Nordisk A/S), y KAC- 500(B) ^{TM} (Kao
Corporation).
Las celulasas están normalmente incorporadas en
la composición de detergente a un nivel entre el 0.00001% y el 2%
en peso de proteína enzimática de la composición, como a un nivel
entre el 0.0001% y el 1% en peso de proteína enzimática de la
composición, p. ej. a un nivel entre el 0.001% y el 0.5% en peso de
proteína enzimática de la composición, de forma apropiada a un
nivel entre el 0.01% y el 0.2% en peso de proteína enzimática de la
composición.
Peroxidasas/oxidasas: Normalmente se usan
enzimas peroxidasas en combinación con peróxido de hidrógeno o una
fuente derivada (p. ej. un percarbonato, perborato o persulfato).
Las enzimas oxidasas son usadas en combinación con oxígeno. Ambos
tipos de enzimas son usadas para "blanquear soluciones", es
decir para prevenir la transferencia de un tinte textil de un
tejido teñido a otro tejido cuando dichos tejidos son lavados juntos
en una solución de lavado, preferiblemente junto con un
intensificador como se describe en p. ej. WO 94/12621 y WO
95/01426. Unas peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen
vegetal, bacteriano o micótico. Mutantes modificados química o
genéticamente están incluidos.
Las enzimas peroxidasas y/o oxidasas son
normalmente incorporadas en la composición del detergente a un
nivel entre el 0.00001% y el 2% en peso de proteína enzimática de
la composición, como a un nivel entre el 0.0001% y el 1% en peso de
proteína enzimática de la composición, p. ej. a un nivel entre el
0.001% y el 0.5% en peso de proteína enzimática de la composición,
de forma apropiada a un nivel entre el 0.01% y el 0.2% en peso de
proteína enzimática de la composición.
Las mezclas de las enzimas mencionadas arriba
pueden también incluirse en composiciones del detergente de la
invención, p. ej. una mezcla de una proteasa, una amilasa, una
lipasa y/o una celulasa.
El híbrido enzimático, o cualquier otra enzima
incorporada en la composición del detergente, es normalmente
incorporada en la composición del detergente a un nivel del
0.00001% al 2% en peso de proteína enzimática de la composición,
preferiblemente a un nivel de 0.0001% a 1% en peso de proteína
enzimática de la composición, como a un nivel de 0.001% a 0.5% en
peso de proteína enzimática de la composición, p. ej. a un nivel
entre el 0.01% y el 0.2% en peso de proteína enzimática de la
composición.
Decolorantes: Ingredientes opcionales de
detergente adicionales que pueden ser incluidos en las
composiciones de detergentes de la presente invención incluyen
decolorantes como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de
partícula de 400-800 micras. Estos componentes de
agentes decolorantes pueden incluir uno o más decolorantes
oxigenados y, dependiendo del agente decolorante elegido, uno o más
activadores de la decoloración. Cuando están presentes compuestos
decolorantes oxigenados normalmente lo estarán en unos niveles
entre aproximadamente 1% y aproximadamente 25%. En general, los
compuestos decolorantes son componentes añadidos opcionales en
formulaciones no-líquidas, p. ej. detergentes
granulosos.
Un componente de agente decolorante para el uso
aquí puede ser cualquiera de los decolorantes útiles para
composiciones detergentes que incluyen decolorantes de oxígeno, así
como otros conocidos en la técnica.
Un agente decolorante adecuado para esta
invención puede ser un agente decolorante activado o
no-activado.
Una categoría de agentes decolorantes oxigenados
que pueden ser usados comprende decolorantes de ácido
percarboxílico y sales derivadas. Ejemplos adecuados de esta clase
de agentes incluyen hexahidrato de monoperoxiftalato de magnesio,
la sal magnésica de ácido meta-cloro perbenzoico,
ácido
4-nonilamino-4-oxoperoxibutírico
y ácido diperoxidodecanedioico. Estos decolorantes están descritos
en US 4,483,781, US 740,446, EP 0 133 354 y US 4,412,934. Unos
decolorantes muy preferidos también incluyen ácido
6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico
según se describe en US 4,634,551.
Otra categoría de decolorantes que pueden ser
usados comprenden los decolorantes halogenados. Ejemplos de
decolorantes de hipohalita, por ejemplo, incluyen ácido tricloro
isocianúrico y los dicloroisocianuratos de sodio y de potasio y
alcano sulfonamidas de N-cloro y
N-bromo. Estos materiales son normalmente añadidos
al 0.5-10% en peso del producto acabado,
preferiblemente 1-5% en peso.
Los agentes de liberación de peróxido de
hidrógeno pueden ser usados en combinación con activadores de
decolorante como tetra acetiletilenodiamina
(tetraacetiletilendiamina), nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS,
descrito en US 4,412,934),
3,5-trimetil-hexanoloxibencenosulfonato
(ISONOBS, descritos en EP 120 591) o pentaacetilglucosa (PAG), que
son perhidrolizados para formar un perácido como las especies
decolorantes activas, conduciendo a un efecto decolorante mejorado.
Además, muy adecuados son los activadores de la decoloración
C8(6-octanamido-caproil)
oxibencenosulfonato, C9(6-nonanamido
caproil) oxibencenosulfonato y C10 (6-decanamido
caproil) oxibencenosulfonato o mezclas derivadas. También
activadores adecuados son ésteres de citrato acilado como se
describe en la solicitud de patente europea N°. 91870207.7.
Unos decolorantes útiles, que incluyen
peroxiácidos y sistemas decolorantes que comprenden activadores de
la decoloración y compuestos decolorantes de peroxígeno para el uso
en composiciones de limpieza según la invención están descritos en
la solicitud USSN 08/136,626.
El peróxido de hidrógeno puede también estar
presente añadiendo un sistema enzimático (es decir una enzima y un
sustrato derivado) que sea capaz de generar peróxido de hidrógeno
al principio o durante el proceso de lavado y/o de aclarado. Estos
sistemas enzimáticos están descritos en la solicitud de patente
europea EP0537381.
Se conocen en la técnica también otros
decolorantes a parte de los decolorantes oxigenados y pueden ser
utilizados en la presente. Un tipo de decoloración no oxigenado de
interés particular incluye agentes decolorantes fotoactivados como
las ftalocianinas sulfonatadas de zinc y/o de aluminio. Estos
materiales pueden ser depositados sobre el sustrato durante el
proceso de lavado. En la irradiación con luz, en presencia de
oxígeno, como al tender ropa en el exterior para secarse bajo la
luz del día, la ftalocianina sulfonatada de zinc es activada y,
consecuentemente, el sustrato es decolorado. La ftalocianina de
zinc preferida y un proceso decolorante fotoactivado están
descritos en US 4,033,718. Normalmente, la composición de detergente
contendrá aproximadamente del 0.025% a aproximadamente el 1.25%, en
peso, de ftalocianina de zinc sulfonatada.
Los decolorantes pueden también comprender un
catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p.
ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese
catalysts for low-temperature bleaching",
Nature 369, 1994, págs. 637 639.
Supresores de jabón: Otro ingrediente
opcional es un supresor de jabón, ejemplificado por siliconas, y
mezclas de sílice-silicona. Las siliconas pueden
generalmente ser representadas por materiales de polisiloxano
alquilado, mientras que el sílice es normalmente usado en formas
finamente divididas ejemplificadas por aerogeles de sílice y
xerogeles y sílices hidrofóbicos de varios tipos. Estos materiales
pueden ser incorporados como partículas, donde el supresor de jabón
es ventajosamente libremente incorporado en un soporte impermeable
de detergente sustancialmente no tensioactivo hidrosoluble o
hidrodispersable. De forma alternativa el supresor de jabón puede
ser disuelto o disperso en un soporte líquido y aplicado
pulverizándolo en uno o más de los otros componentes.
Un agente controlador de jabón de silicona
preferido se describe en US 3,933,672. Otros supresores de jabón
particularmente útiles son los supresores de jabón de silicona
autoemulsificante, descritos en la solicitud de patente alemana
DTOS 2,646,126. Un ejemplo de un compuesto de este tipo es
DC-544, comercialmente disponible en la forma Dow
Corning, que es un copolímero de siloxano-glicol.
Los agentes de control de jabón especialmente preferidos son los
sistemas supresores de espuma que comprenden una mezcla de aceites
de silicona y 2-alquil-alcanoles.
Unos 2-alquil-alcanoles adecuados
son 2-butil-octanol comercialmente
disponibles bajo el nombre comercial Isofol 12 R.
Estos sistemas supresores de jabón están
descritos en la solicitud de patente europea EP 0 593 841.
Los agentes de control de jabón de silicona
especialmente preferidos están descritos en la solicitud de Patente
Europea No. 92201649.8. Dichas composiciones pueden comprender una
mezcla de silicona/sílice en combinación con sílice pirógena no
porosa como Aerosil^{R}.
Los supresores de jabón anteriormente descritos
son normalmente empleados a niveles entre el 0.001% al 2% en peso
de la composición, preferiblemente de 0.01% a 1% en peso.
Otros componentes: Otros componentes
usados en composiciones detergentes pueden ser empleados, como
agentes antimanchas, agentes quita- manchas, blanqueadores ópticos,
abrasivos, bactericidas, inhibidores de la decoloración, agentes
colorantes, y/o perfumes encapsulados o no encapsulados.
Materiales de encapsulación especialmente
adecuados son cápsulas solubles en agua que consisten en una matriz
de polisacáridos y compuestos polihidroxi como los descritos en GB
1,464,616.
Otros materiales de encapsulación hidrosolubles
adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres ácidos de
almidón no gelatinizados dicarboxílicos sustituidos como los
descritos en US 3,455,838. Estas dextrinas de ésteres ácidos son,
preferiblemente, preparadas a partir de estos almidones como maíz
céreo, sorgo céreo, sagú, tapioca y patata. Ejemplos adecuados de
dichos materiales de encapsulación incluyen N-Lok
fabricados por National Starch. El material de encapsulación
N-Lok consiste en un almidón de maíz modificado y
glucosa. El almidón se modifica añadiendo grupos sustituidos
monofuncionales como anhídrido de ácido octenil succínico.
Los agentes de antirredeposición y antimanchas
adecuados aquí incluyen derivados de celulosa como metilcelulosa,
carboximetilcelulosa y hidroxietilcelulosa, y ácidos horno- o
policarboxílicos co-poliméricos o sus sales.
Polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y copolímeros de
ácido anhídrido maléico-acrílico previamente
mencionados como constructores, así como copolímeros de anhídrido
maléico con etileno, éter de metilvinilo o ácido metacrílico, el
anhídrido maléico constituyendo al menos 20 moles por ciento del
copolímero. Estos materiales son normalmente usados a niveles entre
0.5% y 10% en peso, de forma más preferible 0.75% a 8%, más
preferiblemente del 1% al 6% en peso de la composición.
Blanqueadores ópticos preferidos son aniónicos de
forma característica, cuyos ejemplos son disodio
4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s
triazin-6-ilamino-estilbeno-2:2'-disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato,
monosodio
4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-tri-azin-6
ilamino)estilbeno-2-sulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)-estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'-bis(2-anilino-4-(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
sodio
2-(estilbil-4''-(nafto-l',2':4,5)-1,2,3,triazolo-2''-sulfonato
y 4,4'-bis(2-sulfostiril)
bifeni-
lo.
lo.
Otros materiales poliméricos útiles son los
glicoles de politileno, particularmente los de peso molecular
1000-10000, más particularmente 2000 a 8000 y más
preferiblemente aproximadamente 4000. Estos son usados a niveles
entre 0.20% y 5% más preferiblemente de 0.25% a 2.5% en peso. Estos
polímeros y las sales de policarboxilato homo- o
co-poliméricas previamente mencionadas son valiosas
para mejorar el mantenimiento de la blancura, deposición de
residuos de tejido, y rendimiento de limpieza en manchas de
arcilla, proteínicas y oxidables en presencia de impurezas de
metales de transición.
Agentes de antimanchas útiles en composiciones de
la presente invención son de forma convencional copolímeros o
termopolímeros de ácido tereftálico con etilenoglicol y/o unidades
de propilenoglicol en varias disposiciones. Ejemplos de estos
polímeros están descritos en US 4,116,885 y 4,711,730 y EP 0 272
033. Un polímero preferido particular según EP 0 272 033 tiene la
fórmula:
(CH_{3}(PEG)_{43})_{\text{0.75}}(POH)_{\text{0.25}}[T-PO)_{\text{2.8}}(T-PEG)_{\text{0.4}}]T(POH)_{\text{0.25}}((PEG)_{43}CH_{3})_{\text{0.75}}
donde PEG es
-(OC_{2}H_{4})O-, PO es (OC_{3}H_{6}O) y T es
(pOOC_{6}H_{4}CO).
También son muy útiles los poliésteres
modificados como los copolímeros aleatorios de dimetil tereftalato,
dimetil sulfoisoftalato, etilenoglicol y
1,2-propanediol, hasta los grupos terminales que
consisten principalmente en sulfobenzoato y en segundo lugar en
monoésteres de etilenoglicol y/o 1,2- propanodiol. El objetivo es el
de obtener un polímero terminado en ambos extremos por grupos de
sulfobenzoato, "en primer lugar", en el contexto presente la
mayor parte de dichos copolímeros serán terminados por grupos
sulfobenzoato. No obstante, algunos copolímeros no serán totalmente
terminados, y en consecuencia sus grupos terminales pueden consistir
en monoéster de etilenoglicol y/o 1,2-propanodiol,
en que consisten "en segundo lugar" estas especies.
Los poliésteres seleccionados aquí contienen
aproximadamente el 46% en peso de ácido dimetil tereftálico,
aproximadamente el 16% en peso de 1,2- propanodiol, aproximadamente
el 10% en peso de etilenoglicol, aproximadamente el 13% en peso de
ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente el 15% en peso de
ácido sulfoisoftálico, y tienen un peso molecular de
aproximadamente 3.000. Los poliésteres y su método de preparación
están descritos con detalle en EP 311 342.
Agentes suavizantes: Agentes suavizantes
de tejidos pueden también ser incorporados en composiciones de
detergentes de lavado según la presente invención. Estos agentes
pueden ser de tipo inorgánico u orgánico. Agentes suavizantes
inorgánicos están ejemplificados por las arcillas de esmectita
descritas en GB-A-1 400898 y en US
5,019,292. Agentes suavizantes de tejidos orgánicos incluyen las
aminas terciarias insolubles en agua como las descritas en
GB-Al 514 276 y EP 0 011 340 y su combinación con
sales mono C_{12}-C_{14} cuaternarias amónicas
se describe en EP-B-0 026 528 y
amidas de cadena larga como se describe en EP 0 242 919. Otros
ingredientes orgánicos útiles de sistemas suavizantes de tejidos
incluyen materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto
como se describe en EP 0 299 575 y 0 313 146.
Los niveles de arcilla de esmectita están
normalmente en la gama del 5% al 15%, más preferiblemente del 8% al
12% en peso, añadiéndose el material como un componente mezclado
seco al resto de la formulación. Agentes suavizantes de tejido
orgánico como las aminas terciarias insolubles en agua o materiales
de amidas de cadena larga son incorporados a niveles entre el 0.5%
y 5% en peso, normalmente del 1% al 3% en peso mientras que los
materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto y los
materiales catiónicos hidrosolubles son agregados a niveles entre
el 0.1% y el 2%, normalmente del 0.15% al 1.5% en peso. Estos
materiales son normalmente añadidos a la parte secada por
atomización de la composición, aunque en algunos ejemplos puede ser
más conveniente añadirlos como una partícula mezclada en seco, o
pulverizarlos como líquido fundido en otros componentes sólidos de
la composición.
Agentes inhibidores poliméricos de la
transferencia de color: Las composiciones detergentes según la
presente invención pueden también comprender del 0.001% al 10%,
preferiblemente del 0.01% al 2%, más preferiblemente del 0.05% al
1% en peso de agentes inhibidores poliméricos de la transferencia
de color. Dichos agentes inhibidores poliméricos de la
transferencia de color son normalmente incorporados en composiciones
detergentes con el objetivo de inhibir la transferencia del color
de los tejidos de color en tejidos que se laven con éstos. Estos
polímeros tienen la capacidad de agrupar o absorber los colores
fugitivos lavados de tejidos de color antes de que los colores
tengan la oportunidad de unirse a otros artículos en el lavado.
Los agentes inhibidores poliméricos de la
transferencia de color especialmente adecuados son los polímeros de
poliaminas de N-óxido, copolímeros de
N-vinil-pirrolidona y
N-vinilimidazola, polímeros de
polivinilpirrolidona, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o
mezclas derivadas.
La adición de estos polímeros también realza el
rendimiento de las enzimas según la invención.
La composición del detergente según la invención
puede ser en forma líquida, pasta, gel, barra o granulado (es decir
en forma granulada).
Los granulados no en polvo pueden ser producidos,
p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 (ambos de Novo
Industri A/S) y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos
conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento de
cera son productos poli(etileno óxido) (polietilenoglicol,
PEG) con pesos moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles
etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno;
alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a
20 átomos de carbono y en el cual existen de 15 a 80 unidades de
óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y
triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de
revestimiento que forman una película adecuada para aplicación por
técnicas de lecho fluidificado vienen proporcionadas en GB
1483591.
Las composiciones granulosas según la presente
invención pueden también estar en "forma compacta", es decir
pueden tener una densidad relativamente más alta que los
detergentes granulosos convencionales, es decir de 550 a 950 g/l;
en este caso, las composiciones detergentes granulosas según la
presente invención contendrán una cantidad inferior de "sal de
relleno inorgánica", en comparación con detergentes granulosos
convencionales; las sales de relleno típicas son sales de metal
alcalinotérreo de sulfatos y cloruros, normalmente sulfato de
sodio; un detergente "compacto" normalmente comprende no más
del 10% de sal de relleno. Las composiciones líquidas según la
presente invención pueden también estar en "forma concentrada",
en este caso, las composiciones detergentes líquidas según la
presente invención contendrán una cantidad inferior de agua, en
comparación con detergentes líquidos convencionales. Normalmente,
el contenido de agua del detergente líquido concentrado es inferior
al 30%, más preferiblemente inferior al 20%, más preferiblemente
inferior al 10% en peso de las composiciones detergentes.
Las composiciones de la invención pueden, por
ejemplo, ser formuladas como composiciones de detergente de lavado
a mano y a máquina que incluyen composiciones aditivas de lavado y
composiciones adecuadas para el uso en el pretratamiento de tejidos
de color.
Los ejemplos siguientes están destinados a
ejemplificar composiciones dentro del campo de la presente
invención, pero no están destinados a limitar o, por el contrario,
definir el objetivo de la invención. En las composiciones de
detergentes, las identificaciones abreviadas de los componentes
tienen los significados siguientes:
- LAS:
- C_{12} alquil benceno sulfonato de sodio lineal
- TAS:
- alquil sulfato de sodio de sebo
- XYAS:
- C_{1X} - C_{1Y} alquil sulfato de sodio
- SS:
- Surfactante de jabón secundario de la fórmula ácido 2-butil octanoico
- 25EY:
- C_{12}-C_{15} alcohol primario predominantemente lineal condensado con una media de Y moles de óxido de etileno
- 45EY:
- C_{14}-C_{15} alcohol primario predominantemente lineal condensado con una media de Y moles de óxido de etileno
- XYEZS:
- C_{1X} - C_{1Y} alquil sulfato de sodio condensado con una media de Z moles de óxido de etileno por mol
- No fónico:
- C_{13}-C_{15} alcohol graso etoxilado/propoxilado mezclado con un grado medio de etoxilación de 3.8 y un grado medio de propoxilación de 4.5 vendido bajo el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF Gmbh
- CFAA:
- C_{12} - C_{14} alquil N-metil glucamida
- TFAA:
- C-{16} - C_{18} alquil N-metil glucamida
- Silicato:
- Silicato sódico amorfo (SiO_{2} :Na_{2} proporción de O = 2.0)
- NaSKS-6:
- Silicato estratificado cristalino de fórmula \delta-Na_{2}Si_{2}O_{3}
- Carbonato:
- Carbonato sódico anhídrico
- Fosfato:
- Tripolifosfato de sodio
- MA/AA:
- Copolímero de 1:4 ácido maléico/acrílico, peso molecular medio de aproximadamente 80,000
- Poliacrilato:
- Homopolímero de poliacrilato con un peso molecular medio de 8,000 vendido bajo el nombre comercial PA30 por BASF Gmbh
- Zeolita A:
- Aluminosilicato de sodio hidratado de fórmula Na_{12}(AlO_{2} SiO-{2})_{12} .27H_{2}O que tiene un tamaño de partícula primario en la gama de 1 a 10 micrómetros
- Citrato:
- Dihidrato de citrato tri-sódico
- Cítrico:
- Ácido cítrico
- Perborato:
- Decolorante de perborato de sodio anhídrico monohidrato, fórmula empírica NaBO_{2} .H_{2}O_{2}
- PB4:
- Tetrahidrato de perborato de sodio anhídrico
- Percarbonato:
- Decolorante de percarbonato de sodio anhídrico de fórmula empírica 2Na_{2}CO_{3} .3H_{2}O_{2}
- TAED:
- Tetraacetil etilenodiamina
- CMC:
- Carboximetilcelulosa de sodio
- DETPMP:
- dietileno triamina penta (ácido fosfónico de metileno), comercializado por Monsanto bajo el Nombre comercial Dequest 2060
- PVP:
- Polímero de polivinilpirrolidona
- EDDS:
- Etilenodiamina-N, N'-ácido disuccínico, [S,S] isómero en forma de sal sódica
- Jabón
- 25% de cera de parafina punto fusión 50°C, 17% sílice hidrofóbico, 58%
- Supresor:
- aceite de parafina
- Jabón granuloso
- Silicona/sílice al 12%, estearil alcohol al 18%, 70%
- supresor:
- almidón en forma granulosa
- Sulfato:
- Sulfato de sodio anhídrico
- HMWPEO:
- óxido de polietileno de peso molecular elevado
- TAE 25:
- Etoxilato de alcohol de sebo (25)
En las composiciones siguientes, "Enzima" se
refiere a híbrido(s) enzimático(s) y cualquier
enzima(s) añadida:
Ejemplo 1 de
detergente
Una composición de limpieza de tejido granuloso
según la invención puede ser preparada como sigue:
| C_{12} alquilo benceno sulfonato de sodio lineal | 6.5 |
| sulfato de sodio | 15.0 |
| Zeolita A | 26.0 |
| Nitriloacteato de sodio | 5.0 |
| Enzima | 0.1 |
| PVP | 0.5 |
| TAED | 3.0 |
| Ácido bórico | 4.0 |
| Perborato | 18.0 |
| Fenol sulfonato | 0.1 |
| Auxiliares | Hasta 100 |
Ejemplo II de
detergente
Una composición de limpieza de tejido granuloso
compacto (densidad 800 g/l) según la invención puede ser preparada
como sigue:
| 45AS | 8.0 |
| 25E3S | 2.0 |
| 25E5 | 3.0 |
| 25E3 | 3.0 |
| TFAA | 2.5 |
| Zeolita A | 17.0 |
| NaSKS-6 | 12.0 |
| Ácido Cítrico | 3.0 |
| Carbonato | 7.0 |
| MA/AA | 5.0 |
| CMC | 0.4 |
| Enzima | 0.1 |
| TAED | 6.0 |
(Continuación)
| Percarbonato | 22.0 |
| EDDS | 0.3 |
| Supresor de jabón granulado | 3.5 |
| Agua/auxiliares | Hasta 100% |
Ejemplo III de
detergente
Composiciones de limpieza de tejido granuloso
según la invención que son útiles en el lavado de tejidos
coloreados pueden ser preparados como sigue:
| LAS | 10.7 | - |
| TAS | 2.4 | - |
| TFAA | - | 4.0 |
| 45AS | 3.1 | 10.0 |
| 45E7 | 4.0 | - |
| 25E3S | - | 3.0 |
| 68E11 | 1.8 | - |
| 25E5 | - | 8.0 |
| Citrato | 15.0 | 7.0 |
| Carbonato | - | 10 |
| Ácido cítrico | 2.5 | 3.0 |
| Zeolita A | 32.1 | 25.0 |
| Na-SKS-6 | - | 9.0 |
| MA/AA | 5.0 | 5.0 |
| DETPMP | 0.2 | 0.8 |
| Enzima | 0.10 | 0.05 |
| Silicato | 2.5 | - |
| Sulfato | 5.2 | 3.0 |
| PVP | 0.5 | - |
| Poli (4-vinilpiridina)-N-Óxido/copolímero de vinil-imidazolo y vinil-pirrolidona | - | 0.2 |
| Perborato | 1.0 | - |
| Fenol sulfonato | 0.2 | - |
| Agua/Auxiliares | Hasta 100% |
Ejemplo IV de
detergente
Composiciones de limpieza de tejido granuloso
según la invención que proporcionan capacidad "suavizante a
través del lavado" pueden ser preparadas como sigue:
| 45AS | - | 10.0 |
| LAS | 7.6 | - |
| 68AS | 1.3 | - |
| 45E7 | 4.0 | - |
| 25E3 | - | 5.0 |
| Cloruro de coco-alquil-dimetil hidroxi-etil amónico | 1.4 | 1.0 |
| Citrato | 5.0 | 3.0 |
| Na-SKS-6 | - | 11.0 |
| Zeolita A | 15.0 | 15.0 |
| MA/AA | 4.0 | 4.0 |
| DETPMP | 0.4 | 0.4 |
| Perborato | 15.0 | - |
| Percarbonato | - | 15.0 |
| TAED | 5.0 | 5.0 |
(Continuación)
| Arcilla de esmectita | 10.0 | 10.0 |
| HMWPEO | - | 0.1 |
| Enzima | 0.10 | 0.05 |
| Silicato | 3.0 | 5.0 |
| Carbonato | 10.0 | 10.0 |
| Supresor de jabón granulado | 1.0 | 4.0 |
| CMC | 0.2 | 0.1 |
| Agua/Auxiliares | Hasta 100% |
Ejemplo V de
detergente
Composiciones de limpieza de tejido líquidas de
mucha suciedad según la invención puede ser preparada como
sigue:
| I | II | |
| Forma ácida LAS | - | 25.0 |
| Ácido cítrico | 5.0 | 2.0 |
| Forma ácida 25AS | 8.0 | - |
| Forma ácida 25AE2S | 3.0 | - |
| 25AE7 | 8.0 | - |
| CFAA | 5 | - |
| DETPMP | 1.0 | 1.0 |
| Ácido graso | 8 | - |
| Ácido oléico | - | 1.0 |
| Etanol | 4.0 | 6.0 |
| Propanodiol | 2.0 | 6.0 |
| Enzima | 0.10 | 0.05 |
| Cloruro de coco-alquil dimetil hidroxi etil amónico | - | 3.0 |
| Arcilla de esmectita | - | 5.0 |
| PVP | 2.0 | - |
| Agua / Auxiliares | Hasta 100% |
El híbrido enzimático puede ser incorporado en
concentraciones empleadas de forma convencional en detergentes.
Actualmente se observa que, en la composición de detergente de la
invención, el híbrido enzimático puede idóneamente ser añadido en
una cantidad correspondiente a 0.00001-1 mg
(calculado como proteína enzimática pura) de híbrido enzimático por
litro de solución de lavado.
El tiempo de reacción para la eliminación o
decoloración de la suciedad o mancha(s) del tejido puede
variar; el tejido puede ser puesto a remojo durante uno o dos días,
o el lavado puede ser realizado en período más corto, normalmente
lavado a máquina durante un periodo de 1 a 90 minutos,
preferiblemente durante un periodo de 1 a 30 minutos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
construcción del ADN descrita aquí que codifica, o que comprende
una secuencia que codifica, un híbrido enzimático como se describe
en la presente descripción.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere
a un polipéptido (proteína de fusión o híbrido enzimático) que está
codificado por un constructo o secuencia de ADN de este tipo, y/o
que está descrito en la presente descripción. Así, la invención
encierra un híbrido enzimático codificado por una secuencia de ADN
de codificación híbrida comprendida dentro de las secuencias de ADN
de la SEC ID No. 1, SEC ID No. 3, SEC ID No. 5, SEC ID No. 7, SEC
ID No. 9, SEC ID No. 10, SEC ID No. 11, SEC ID No. 12, SEC ID No.
13, SEC ID No. 14, SEC ID No. 15, SEC ID No. 16, SEC ID No. 17, SEC
ID No. 18 o SEC ID No. 19, o un híbrido enzimático que tiene una
secuencia de aminoácidos comprendida en las secuencias de
aminoácidos de SEC ID No. 2, SEC ID No. 4, SEC ID No. 6 o SEC ID
N°. 8.
La invención está posteriormente ilustrada en el
ejemplo siguiente, que no está destinado a ser de ninguna manera
limitador del objetivo de la invención según se reivindica.
Bacillus agaradherens NCIMB No. 40482:
comprende la secuencia de ADN de codificación de la enzima
endoglucanasa del Ejemplo 2, a continuación.
Escherichia coli SJ2 [Diderichsen et
al., J. Bacteriol. 172 (1990), págs.
4315-4321].
Células electrocompetentes preparadas y
transformadas que usan un Bio-Rad GenePulser^{TM}
según lo recomienda el fabricante.
Bacillus subtilis PL2306: esta cepa es la
B.subtilis DN1885 con los genes apr y npr desasociados
[Diderichsen et al., J. Bacteriol. 172 (1990),
págs. 4315-4321] desasociados en la unidad
transcripcional del gen de celulasa de Bacillus subtilis
conocido, dando como resultado células de celulasa negativas. La
ruptura fue realizada esencialmente como se describe en Sonenshein
et al. (Eds.), bacillus subtilis y otras Bacterias
gram-positivas, American Society for Microbiology
(1993), p.618.
pDN1528 [Jørgensen et al., J.
Bacteriol. 173 (1991), p.559-567].
pBluescriptKSll (Stratagene, EEUU).
pDN1981 [Jørgensen et al., Gene
96 (1990), p37-41].
El agar TY y LB [como se describe en Ausubel
et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons (1995)].
SB: 32 g de Triptona, 20 g de extracto de
levadura, 5 g de cloruro sódico y 5 ml de hidróxido sódico 1 N
están mezclados en agua estéril hasta un volumen final de 1 litro.
La solución está esterilizada por autoclave durante 20 minutos a
121°C.
10% Avicel^{TM}: 100 g de Avicel^{TM} (FLUKA,
Suiza) son mezclados con agua estéril hasta un volumen final de 1
litro, y el resultante 10% Avicel^{TM} es esterilizado por
autoclave durante 20 minutos a 121°C. Tampón: 0.05 M de Fosfato
potásico, pH 7.5.
Las manipulaciones y transformaciones de ADN
fueron realizadas usando métodos estándar de biología molecular
[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY (1989);
Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons (1995); C.R. Harwood y S.M.
Cutting (Eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus,
John Wiley and Sons (1990)].
Enzimas para manipulaciones de ADN fueron usadas
según las especificaciones de los proveedores.
El gen alfa-amilasa codificado en
pDN1528 fue amplificado en PCR para la introducción de un sitio
BamHI en el extremo 3' de la zona de codificación. La PCR y la
donación se realizaron como sigue:
Aproximadamente 10-20 ng de
plásmido pDN1528 fueron amplificados en PCR en un tampón de PCR
HiFidelity^{TM} (Boehringer Mannheim, Alemania) completado con
200 \muM de cada dNTP, 2.6 unidades de una mezcla enzimática de
Hifidelity^{TM} Expand, y 300 pmol de cada cebador:
#5289
5'-GCT TTA CGC CCG ATT GCT GAC
GCT G -3'
#26748
5'-GCG ATG AGA CGC GCG GCC GCC
TAT CTT TGA ACA TAA ATT GAA ACG GAT CCG -3'
(lugar de restricción BamHI subrayado).
Las reacciones de PCR fueron realizadas usando un
variador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Una incubación a 94°C
durante 2 minutos, 60°C durante 30 seg y 72°C durante 45 seg fue
continuada por diez ciclos de PCR realizados usando un perfil de
ciclo de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, recocimiento a
60°C durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 45sec y veinte
ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, 60°C durante 30
seg y 72°C durante 45 seg (a esta fase de alargamiento, 20 seg son
agregados a cada ciclo). 10 \mul de partes alícuotas de producto
de amplificación fueron analizados por electroforesis en 1.0% de
geles de agarosa (NuSieve^{TM}, FMC) con ReadyLoad^{TM} 100bp
ADN ladder (GibcoBRL, Dinamarca) como marcador de tamaño.
40 \mul de partes alícuotas de producto de PCR
generado en el modo descrito anteriormente fueron purificados
usando un QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según
las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en
50 \mul de 10 mM de Tris-HCI, pH 8.5. 25 \mul
del fragmento purificado en PCR fue digerido con BamHI y PstI,
sometido a electroforesis en 1.0% de geles de agarosa de
temperatura de gelificación baja (SeaPlaque^{TM} GTG, FMC), y el
fragmento relevante fue cortado del gel y purificado usando un
QIAquick^{TM} Gel extraction kit (Qiagen, EEUU) según las
instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN aislado fue luego
ligado a pBluescriptll KS- digerido con BamHI-PstI,
y la mezcla de ligadura fue usada para transformar SJ2 de E.
coli.
Las células fueron colocadas en placas de agar LB
que contenían Ampicilina (200 \mug/ml) y completadas con
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\alpha-D-galactopiranosida,
50 \mug/ml), e incubadas a 37°C durante toda la noche. Al día
siguiente, las colonias blancas fueron redispuestas sobre placas de
agar LB-ampicilina frescas e incubadas a 37°C
durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias individuales
fueron transferidas a un medio líquido de LB que contenía
Ampicilina (200 \mug/ml) y se incubaron durante toda la noche a
37°C con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos usando cultivos
líquidos usando un Qiagen Plasmid Purification mini kit (Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. 5 \mul de muestras
de plásmidos fueron digeridas con PstI y BamHI. Las digestiones
fueron controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa
al 1.0% (NuSieve^{TM}, FMC). Un clon positivo, que contenía el
fragmento de PstI-BamHI que contenía parte del gen
de \alpha-amilasa, fue denominado pMB335. Este
plásmido fue luego usado en la construcción del híbrido de
\alpha-amilasa-CBD.
Clostridium stercorarium NCIMB 11754 fue
desarrollado anaeróbicamente a 60°C en medios especificos según lo
recomendado por The National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Ltd. (NCIMB), Escocia. Se recogieron las células por
centrifugado.
El ADN genómico fue aislado según se describe por
Pitcher et al, Lett. Appl. Microbiol. 8
(1989), págs. 151-156.
Aproximadamente 100-200 ng de ADN
genómico fue amplificado en PCR en un tampón PCR HiFidelity^{TM}
(Boehringer Mannheim, Alemania) completado con 200 \muMde cada
dNTP, 2.6 unidades de mezcla enzimática de HiFidelity^{TM}
Expand, y 300 pmol de cada cebador:
#27183
5'-GCT GCA GGA TCC GTT TCA
ATT TAT GTT CAA AGA TCT GGC GGA CCT GGA ACG CCA AAT AAT GGA AGA GG
-3'
#27182
5'-GCA CTA GCT AGA CGG CCG
CTA CCA GTC AAC ATT AAC AGG ACC TGA G -3'
(lugares de restricción de BamHI y Eagl
subrayados).
Los cebadores fueron diseñados para amplificar el
ADN que codifica el dominio de unión a celulosa del gen
codificación de XynA de Clostridium stercorarium NCIMB
11754; la secuencia de ADN fue extraída de la base de datos GenBank
bajo el número de acceso D13325.
Las reacciones de PCR fueron realizadas usando un
variador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Una incubación a 94°C
durante 2 minutos, 60°C durante 30 seg y 72°C durante 45 seg
seguida de diez ciclos de PCR realizados usando un perfil de ciclo
de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, recocimiento a 60°C
durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 45 seg y veinte ciclos
de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg y
72°C durante 45 seg (en esta fase de alargamiento, se añaden 20 seg
a cada ciclo). 10 \mul de partes alícuotas de producto de
amplificación fueron analizadas por electroforesis en geles de
agarosa al 1.0% (NuSieve^{TM}, FMC) con ReadyLoad^{TM} 100bp
ADN ladder (GibcoBRL, Dinamarca) como un marcador de tamaño.
40 \mul de partes alícuotas de producto PCR
generado según el modo descrito anteriormente fueron purificados
usando un QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según
las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en
50 \mul de 10 mM de Tris-HCI, pH 8.5. 25 \mul
del fragmento purificado de PCR fueron digeridos con BamHI y Eagl,
sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.0% de
temperatura de gelificación baja (SeaPlaque^{TM} GTG, FMC), y el
fragmento relevante fue cortado de los geles y purificado usando un
QIAquick^{TM} Gel extraction kit (Qiagen, EEUU) según las
instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN aislado fue luego
ligado a pMB335 digerido con BamHI-NotI y la mezcla
de ligadura fue usada para transformar SJ2 de E.coli..
Las células fueron colocadas en placas de agar LB
que contenían Ampicilina (200 \mug/ml) y se incubaron a 37°C
durante toda la noche. Al día siguiente, se redispusieron las
colonias en placas de agar LB-ampicilina y se
incubaron a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente, las
colonias individuales fueron transferidas a un medio líquido de LB
que contenía Ampicilina (200 \mug/ml) y se incubaron durante toda
la noche a 37°C con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos de los cultivos
líquidos usando Qiagen Plasmid Purification mini kit (Qiagen, EEUU)
según las instrucciones del fabricante. 5 \mul de muestras de los
plásmidos fueron digeridas con BamHI y NotIl. Las digestiones
fueron controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa
al 1.0% (NuSieve^{TM}, FMC). La aparición de un fragmento de ADN
del mismo tamaño como se ha visto a partir de la amplificación de
PCR indicó un clon positivo.
Un clon positivo, que contenía el constructo de
fusión del gen de \alpha-amilasa y el
CBD-dímero de XynA (NCIMB 11754) de Clostridium
stercorarium, fue denominado MBamyX.
El vector pDN1528 contiene el gen amyL de
B.licheniformis; este gen está activamente expresado en
B. subtilis, dando como resultado la producción de
\alpha-amilasa activa que aparece en el
sobrenadante. Por objetivos de expresión, el ADN que codifica la
proteína de fusión según se ha construido antes fue introducida en
pDN1528. Esto fue realizado mediante la digestión de pMBamyX y
pDN1528 con SalI-NotI, depuración de los fragmentos
y enlace del fragmento de 4.7 kb pDN1528 SalI-NotI
con el fragmento 1.0 kb pMBamyX SalI-NotI. Esto
creó una fusión interna del constructo híbrido con el gen de
Termamyl^{TM} (\alpha-amilasa de B.
licheniformis). La secuencia de ADN de la construcción de
fusión de pMB206, y la secuencia de aminoácidos correspondiente,
están mostradas en la SEC ID No. 1 y la SEC ID N°. 2,
respectivamente.
La mezcla de ligadura fue usada para transformar
células competentes de PL2306 de B. subtilis. Las células
fueron colocadas en placas de agar LB que contenían cloranfenicol
(6 \mug/ml), glucosa al 0.4% y 10 mM de fosfato de hidrógeno de
potasio, y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Al día
siguiente, las colonias fueron redispuestas en placas de agar
cloranfenicol LBPG frescas (placas de LB con glucosa al 0.4% y 10
mM de fosfato potásico, pH 10) e incubadas a 37°C durante toda la
noche. Al día siguiente, las colonias individuales de cada clon
fueron transferidas a un medio líquido de LB que contenía
cloranfenicol (6 \mug/ml) e incubadas durante toda la noche a 37°C
con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos de cultivos
líquidos usando un Qiagen Plasmid Purification mini kit (Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. No obstante, el
tampón de resuspensión fue completado con 1 mg/ml de lisozima de
clara de huevo de pollo (Sigma, EEUU) antes de lisar las células a
37°C durante 15 minutos. 5 \mul de las muestras de plásmidos
fueron digeridos con BamHI y NotI. Las digestiones fueron
controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1.5%
(NuSieve^{TM}, FMC). La aparición de un fragmento de ADN del
mismo tamaño como se ha visto a partir de la amplificación de PCR
indicó un clon positivo. Un clon positivo fue denominado
MB-BSamyx.
El clon MB-BSamyx (que expresa
Termamyl^{TM} fusionado al XynA CBD-dímero de
C.stercorarium) fue incubado durante 20 horas en un medio de
SB a 37°C con agitación a 250 rpm. 1 ml de sobrenadante libre de
células fue mezclado con 200 \mul de Avicel^{TM} al 10%. La
mezcla fue incubada durante 1 hora a 0°C y luego centrifugada
durante 5 minutos a 5000 X g. El granulado fue resuspendido en 100
\mul de tampón de SDS-PAGE, y la suspensión fue
hervida a 95°C durante 5 minutos, centrifugada a 5000 x g durante 5
minutos, y 25 \mul fueron cargados en un gel
SDS-PAGE NOVEXO Laemmli de
Tris-glicina al 4-20% (Novex,
EEUU). Las muestras fueron sometidas a electroforesis en una
XceII^{TM} Mini-Cell (Novex, EEUU) según lo
recomendado por el fabricante. Toda manipulación posterior de los
geles, incluyendo la coloración (Coomassie), decoloración y secado;
fue realizada según se describe por el fabricante.
La aparición de un enlace proteínico de un peso
molecular de aprox. 85 kDa indicó la expresión en B.subtilis
del amyx de fusión de Termamyl-CBD.
La celulasa alcalina donada en Bacíllus
subtilis como se describe abajo fue expresada por incubación
del clon durante 20 horas en un medio de SB a 37°C con agitación a
250 rpm. La celulasa expresada mostró que contenía un CBD por su
capacidad para enlazarse específicamente con Avicel^{TM}
Cuando se dejó incubar durante otras 20 horas, la
celulasa fue proteolíticamente dividida y dos enlaces proteínicos
específicos aparecieron en SDS-PAGE, uno
correspondiente a la parte catalítica de la celulasa, 35 kD de peso
molecular (PM) aproximado, y el otro correspondiente a un enlazador
propuesto y CBD de PM aproximado de 8 kD.
El CBD resultó ser la parte
C-terminal de la celulasa, y no se enlazó con
ninguna de las familias de CBD descritas previamente [Tomme et
al., Cellulose-Binding Domains:
Classification and Properties, In: J.N. Saddler and M.H. Penner
(Eds.), Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, ACS
Symposium Series No. 618 (1996)]. En consecuencia, este CBD parece
ser el primer elemento de una familia nueva.
La secuencia de nucleótidos que codifica la
celulasa alcalina de Bacillus agaradherens (depositado bajo
la accesión No. NCIMB 40482) fue donada por PCR para su
introducción en un plásmido de expresión pDN1981. La PCR fue
realizada esencialmente en el modo descrito anteriormente en 500 ng
de ADN genómico, usando los dos cebadores siguientes que contienen
sitios de restricción de NdeI y KpnI para introducir la secuencia de
ADN de codificación de endoglucanasa en pDN1981 para la
expresión:
#20887
5'-GTA GGC TCA GTC ATA TGT
TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AAT CAT GAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT
CG-3'
#21318
5'-GTA CCT CGC GGG TAC CAA
GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCC CAC GGA CCG-3'
Después del ciclo de PCR, el fragmento de PCR fue
purificado usando un QIA-quick^{TM} PCR column
kit (Qiagen, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El ADN
purificado fue eluido en 50 \mul de 10 mM
Tris-HCI, pH 8.5, digerido con NdeI y KpnI,
purificado y ligado a pDN1981 digerido. La mezcla de ligadura fue
usada para transformar PL2306 de B. subtilis. Las células
competentes fueron preparadas y transformadas como se describe por
Yasbin et al., J. Bacteriol. 121 (1975), págs.
296-304.
Las células transformadas fueron colocadas en
placas de LB agar que contenían Canamicina (10 mg/ml), 0.4%
glucosa, 10 mM de fosfato potásico y AZCL
HE-celulosa al 0.1% (Megazyme, Australia), y se
incubó a 37ºC durante 18 horas. Las colonias de
endoglucanasa-positiva fueron identificadas como
colonias rodeadas por un halo azul.
Cada uno de los transformantes positivos fue
inoculado en 10 ml de un medio TY que contenía Canamicina (10
mg/mi). Después de 1 día de incubación a 37°C con agitación a
25Orpm, se extrajeron 50 ml de sobrenadante. La actividad
endoglucanasa fue identificada añadiendo 50 mI de sobrenadante a
unos orificios punzados en el agar de las placas de agar LB que
contenían AZCL HE-celulosa al 0.1%.
Después de 16 horas de incubación a 37°C, los
halos azules que rodeaban los orificios indicaron la expresión de
la endoglucanasa en B. subtilis. Un clon de este tipo fue
denominado MB208. La secuencia de ADN de codificación y la
secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa están mostradas en la
SEC ID No. 3 y la SEC ID N°. 4, respectivamente.
La secuencia de ADN fue determinada como sigue:
ADN plásmido purificado por Qiagen fue secuenciado con el Taq deoxy
terminal cycle sequencing kit (Perkin Elmer, EEUU) usando los
cebadores #21318 y #20887 (ver arriba) y utilzando un secuenciador
automatizado Applied Biosystems 373A accionado según las
instrucciones del fabricante. El análisis de los datos de secuencia
se realiza según Devereux et al., Carcinoaenesis
14 (1993), págs. 795-
801.
801.
Unos 10-20 ng del plásmido pMB208
fueron amplificados por PCR en un tampón de PCR HiFidelity^{TM}
(Boehringer Mannheim, Alemania) completado con 200 \muM de cada
dNTP, 2.6 unidades de la mezcla enzimática HiFidelity^{TM} Expand
y 300 pmol de cada cebador:
#27184
5'-GCT GCA GGA TCC GTT TCA
ATT TAT GTT CAA AGA TCT CCT GGA GAG TAT CCA GCA TGG GAC CCA
A-3'
#28495
5'-GC ACA AGC TTG CGG CCG
CTA ATT GAG TGG TTC CCA CGG ACC G -3'
(lugares de restricción BamHI y NotI
subrayados).
Los cebadores fueron diseñados para amplificar el
ADN de codificación de CBD del gen de codificación de celulasa de
NCIMB 40482 de Bacillus agaradherens.
La reacción de PCR fue realizada usando un
variador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Una incubación a 94°C
durante 2 minutos, 60°C durante 30 seg y 72°C durante 45 seg
seguida de diez ciclos de PCR realizados usando un perfil de ciclo
de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, recocimiento a 60°C
durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 45 seg y veinte ciclos
de desnaturalización a 94°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg y
72°C durante 45 seg (en esta fase de alargamiento, se añaden 20 seg
a cada ciclo). 10 \mul de partes alícuotas del producto de
amplificación fueron analizadas por electroforesis en geles de
agarosa al 1.5% (NuSieve^{TM}, FMC) con ReadyLoad^{TM} 100bp
ADN ladder (GibcoBRL, Dinamarca) como marcador de tamaño.
40 \mul de partes alícuotas de productos de PCR
generados en el modo descrito anteriormente fueron purificados
usando un QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según
las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en
50 \mul de 10 mM de Tris-HCI, pH 8.5. 25 \mul
del fragmento purificado de PCR fue digerido con BamHI y NotI,
sometido a electroforesis en geles de agarosa de temperatura de
gelificación baja al 1.5% (SeaPlaque^{TM} GTG, FMC), y el
fragmento relevante fue cortado de los geles y purificado usando un
QIAquick^{TM} Gel extraction kit (Qiagen, EEUU) según las
instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN aislado fue luego
ligado a pMB335 digerido con BamHI-NotI, y la
mezcla de ligadura fue usada para transformar SJ2 de E.
coli.
Las células fueron colocadas en placas de agar LB
que contenían Ampicilina (200 \mug/ml) y se incubaron a 37°C
durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias fueron
redispuestas en placas de agar LB-ampicilina
frescas y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Al día
siguiente, las colonias individuales fueron transferidas a un medio
LB líquido que contenía Ampicilina (200 \mug/ml) y se incubaron a
37°C durante toda la noche con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos de los cultivos
líquidos usando un QIAgen Plasmid Purification mini kit (Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. 5 \mul de muestras
de los plásmidos fueron digeridas con BamHI y NotI. Las digestiones
fueron controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa
al 1.5% (NuSieve^{TM}, FMC). La aparición de un fragmento de ADN
del mismo tamaño como se ha visto a partir de la amplificación de
PCR indicó un clon positivo.
Un clon positivo, que contenía el constructo de
fusión del gen de \alpha-amilasa Termamyl^{TM}
y el CBD de Cel5A celulasa alcalina de NCIMB 40482 de Bacillus
agaradherens, fue denominado MBamiC5A.
Tal y como se ha mencionado previamente, el gen
amyL de B. licheniformis (contenido en el vector pDN1528)
está activamente expresado en B. subtilis, dando como
resultado la producción de \alpha-amilasa activa
que aparece en el sobrenadante. Por objetivos de expresión, el ADN
que codifica la proteína de fusión como se ha construido arriba fue
introducido en pDN1528. Esto se hizo por la digestión de pMBamiC5A
y pDN1528 con SalI-NotI, depuración de los
fragmentos y enlace del fragmento 4.7 kb pDN1528
SalI-NotI con el fragmento 0.5 kb pMBamiC5A
SalI-NotI. Esto creó una fusión interna de la
construcción híbrida con el gen Termamyl^{TM}. La secuencia de ADN
de la construcción de fusión de pMB378, y la secuencia de
aminoácidos correspondiente, están mostradas en las SEC ID No. 5 y
SEC ID N°. 6, respectivamente.
La mezcla de la ligadura fue usada para
transformar células competentes de B. subtilis PL2306. Las
células fueron colocadas en placas de LB agar que contenían
cloranfenicol (6 \mug/ml), glucosa al 0.4% y 10 mM de fosfato de
hidrógeno de potasio, y se incubaron a 37°C durante toda la noche.
Al día siguiente, las colonias fueron redispuestas en placas de agar
cloranfenicol LBPG fresco y se incubaron a 37°C durante toda la
noche. Al día siguiente, las colonias individuales de cada clon
fueron transferidas a un medio líquido de LB que contenía
cloranfenicol (6 \mug/ml) y se incubaron durante toda la noche a
37°C con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos de los cultivos
líquidos usando un Qiagen Plasmid Purification mini kit (Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. No obstante, el
tampón de resuspensión fue completado con 1 mg/ml de lisozima de
clara de huevo de pollo (Sigma, EEUU) antes de lisar las células a
37°C durante 15 minutos. 5 \mul de muestras de los plásmidos
fueron digeridas con BamHI y NotI. Las digestiones fueron
controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1.5%
(NuSieve^{TM}, FMC). La aparición de un fragmento de ADN del
mismo tamaño como se ha visto a partir de la amplificación de PCR
indicó un clon positivo. Un clon positivo fue designado MB378.
El clon MB378 (expresión Termamyl^{TM}
fusionado a Cel5A CBD de Bacíllus agaradherens) fue incubado
durante 20 horas en un medio SB a 37°C con agitación a 250 rpm. 1 mI
de sobrenadante libre de células fue mezclado con 200 \mul de
Avicel^{TM} al 10%. La mezcla fue incubada durante 1 hora a 0°C y
luego centrifugada durante 5 minutos a 5000 x g. El granulado fue
resuspendido en 100 \mul de un tampón de SDS-PAGE,
y la suspensión fue hervida a 95°C durante 5 minutos, centrifugada
a 5000 x g durante 5 minutos, y 25 \mul fueron cargados en una
Laemmli Tris-glicina al 4-20%, gel
SDS-PAGE NOVEX^{TM} (Novex, EEUU). Las muestras
fueron sometidas a electroforesis en una Xcell^{TM}
Mini-Cell (Novex, EEUU) según lo recomendado por el
fabricante. Toda manipulación posterior de los geles, incluyendo la
coloración (Coomassie), decoloración y secado, fue realizada según
está descrito por el fabrican-
te.
te.
La aparición de un enlace proteínico de peso
molecular de aprox. 60 kDa indicó la expresión en B.
subtilis de la fusión de Termamyl^{TM}-CBD
codificada en el plásmido pMB378.
Este ejemplo describe la fusión de
Termamyl^{TM} y del CBD del gen cenA de Cellulomonas fimi
(ATCC484) que usa el procedimiento de extension de superposición de
secuencias (SOE) [ver, p. ej., Sambrook et al., Ausubel et
al., o C.R. Harwood and S.M. Cutting (loc.cit.)]. La
construcción final es la siguiente: promotor Termamyl^{TM} -
péptido señal de Termamyl^{TM} - CBD de cenA - enlazador -
Termamyl^{TM} maduro.
Aproximadamente 10-20 ng de
pDN1528 plásmido fue amplificado en PCR en un tampón PCR
HiFidelity^{TM} (Boehringer Mannheim, Alemania) completado con
200 \muMde cada dNTP, 2.6 unidades de mezcla enzimática
HiFidelity^{TM} Expand, y 100 pmol de cada cebador:
HiFidelity^{TM} Expand, y 100 pmol de cada cebador:
#4576
5'-CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC
-3'
#28403
5'-TGC ACT GGT ACA GTT CCT ACA
ACT AGT CCT ACA CGT GCA AAT CTT AAT GGG ACG CTG -3'
La parte del cebador #28403 que constituye un
fragmento de la secuencia Termamyl^{TM} está subrayada. La
secuencia en el lado 5' de esta secuencia subrayada es aquella que
codifica para la región del enlazador al CBD.
La reacción de PCR fue realizada usando un
variador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Una incubación a 94°C
durante 2 minutos, 55°C durante 30 seg y 72°C durante 45 seg
seguida de veinte ciclos de PCR realizados usando un perfil de
ciclo de desnaturalización a 96°C durante 10 seg, recocimiento a
55°C durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 45 seg. 10 \mul
de partes alícuotas del producto de amplificación fueron analizados
por electroforesis en geles de agarosa al 1.0% (NuSieve^{TM},
FMC) con ReadyLoad^{TM} 100bp ADN ladder (GibcoBRL, Dinamarca)
como un marcador de tamaño.
40 \mul de partes alícuotas del producto PCR
generado según el modo descrito anteriormente fueron purificados
usando un QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según
las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en
50 \mul de Tris-HCI 10 mM, pH 8.5.
ATCC484 de Cellulomonas fimi fue
desarrollado en un medio TY a 30°C con agitación a 250 rpm durante
24 horas. Las células fueron recogidas por centrifugado.
El ADN genómico fue aislado como se describe por
Pitcher et al., Lett. Appl. Microbiol. 8
(1989), págs. 151-156.
Aproximadamente 100-200 ng de ADN
genómico fue amplificado en PCR en un tampón de PCR
HiFidelity^{TM} (Boehringer Mannheim, Alemania) completado con
200 \muMde cada dNTP, 2.6 unidades de mezcla enzimática
HiFidelity^{TM} Expand, y 100 pmol de cada cebador:
HiFidelity^{TM} Expand, y 100 pmol de cada cebador:
#8828
5'-CTG CCT CAT TCT GCA GCA
GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCC GGC TGC CGC GTC GAC
TAC -3'
TAC -3'
#28404
5'-TGT AGG AAC TGT ACC AGT GCA
CGT GGT GCC GTT GAG C -3'
(lugar de restricción de PstI subrayado).
Los cebadores fueron diseñados para amplificar el
ADN que codifica el dominio de unión a celulosa del gen de
codificación CenA de Cellulomonas fimi (ATCC484). La
secuencia de ADN fue extraída de la base de datos GenBank bajo el
número de accesión M15823.
El ciclo de PCR fue realizado como sigue: Una
incubación a 94°C durante 2 minutos, 55°C durante 30 seg y 72°C
durante 45 seg seguido de treinta ciclos de PCR realizados usando
un perfil de ciclo de desnaturalización a 96°C durante 10 seg,
recocimiento a 55°C durante 30 seg, y extensión a 72°C durante 45
seg. 10 \mul de partes alícuotas del producto de amplificación
fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.0%
(NuSieve^{TM} FMC) con ReadyLoad^{TM} 100bp ADN ladder
(GibcoBRL, Dinamarca) como marcador de tamaño.
40 \mul de partes alícuotas del producto de PCR
generados según el modo descrito anteriormente fueron purificados
usando un QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según
las instrucciones del fabricante.
El ADN purificado fue eluido en 50 \mul de
Tris-HCI 10 mM, pH 8.5.
Unos 100-200 ng del fragmento de
Termamyl amplificado por PCR y el fragmento de cenA de CBD
amplificado por PCR fueron usados en un segundo turno de PCR. SOE
de los dos fragmentos fue realizado en un tampón de PCR
HiFidelity^{TM} (Boehringer Mannheim, Alemania) completado con 200
\muM de cada dNTP, 2.6 unidades de mezcla enzimática
HiFidelity^{TM} Expand.
Un intento de ciclo de PCR fue realizado como
sigue: Una incubación a 96°C durante 2 minutos, 60°C durante 2
minutos y 72°C durante 45 seg. Este ciclo fue repetido diez veces
con una reducción de 1°C de la temperatura de recocimiento en cada
ciclo.
Una tercera reacción de PCR fue comenzada
añadiendo 100 pmol de los dos cebadores flanqueadores #8828 y #4576
(véase arriba) para amplificar el híbrido de ADN. El PCR fue
realizado incubando la mezcla reactiva de SOE a 96°C durante 2
minutos, 55°C durante 30 seg y 72°C durante 45 seg. Esto seguido de
veinte ciclos de PCR realizados usando un perfil de ciclo de
desnaturalización a 96°C durante 10 seg, recocimiento a 55°C durante
30 seg, y extensión a 72°C durante 45 seg. 10 \mul de partes
alícuotas del producto de amplificación fueron analizados por
electroforesis en geles de agarosa al 1.0 (NuSieve^{TM}, FMC) con
ReadyLoad^{TM} 100bp ADN ladder (GibcoBRL, Dinamarca) como un
marcador de tamaño. El fragmento SOE tiene el tamaño esperado de
879 pares de bases.
40 \mul del producto SOE-PCR
generados según el modo descrito anteriormente fue purificado
usando un
QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en 50 \mul de Tris-HCI 10 mM, pH 8.5. 25 \mul del fragmento de PCR purificado fue digerido con PstI y KpnI, sometido a electroforesis en geles de agarosa de temperatura de gelificación baja al 1.0% (SeaPlaque^{TM} GTG, FMC), y un fragmento de 837 pares de bases fue cortado del gel y purificado usando un QIAquick^{TM} Gel extraction kit (Qiagen, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN aislado fue luego ligado a pDN1981 digerido con PstI y KpnI, y la mezcla de ligadura fue usada para transformar células competentes de B. subtilis PL2306. Las células fueron colocadas en placas de LB agar que contenían Canamicina (10 \mug/ml), glucosa al 0.4% y 10 mM de fosfato de hidrógeno de potasio, y se incubó a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias fueron redispuestas en placas de agar LBPG de canamicina e incubadas a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias individuales de cada clon fueron transferidas a un medio LB líquido que contenía Canamicina (10 \mug/ml) y se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación a 250 rpm.
QIAquick^{TM} PCR purification kit (Qiagen, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El ADN purificado fue eluido en 50 \mul de Tris-HCI 10 mM, pH 8.5. 25 \mul del fragmento de PCR purificado fue digerido con PstI y KpnI, sometido a electroforesis en geles de agarosa de temperatura de gelificación baja al 1.0% (SeaPlaque^{TM} GTG, FMC), y un fragmento de 837 pares de bases fue cortado del gel y purificado usando un QIAquick^{TM} Gel extraction kit (Qiagen, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN aislado fue luego ligado a pDN1981 digerido con PstI y KpnI, y la mezcla de ligadura fue usada para transformar células competentes de B. subtilis PL2306. Las células fueron colocadas en placas de LB agar que contenían Canamicina (10 \mug/ml), glucosa al 0.4% y 10 mM de fosfato de hidrógeno de potasio, y se incubó a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias fueron redispuestas en placas de agar LBPG de canamicina e incubadas a 37°C durante toda la noche. Al día siguiente, las colonias individuales de cada clon fueron transferidas a un medio LB líquido que contenía Canamicina (10 \mug/ml) y se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación a 250 rpm.
Los plásmidos fueron extraídos de los cultivos
líquidos usando un Qiagen Plasmid Purification mini kit (Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. No obstante, el
tampón de resuspensión fue completado con 1 mg/ml de lisozima de
clara de huevo de pollo (Sigma, EEUU) antes de lisar las células a
37°C durante 15 minutos. 5 \mul de muestras de los plásmidos
fueron digeridas con PstI y KpnI. Las digestiones fueron
controladas por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1.5%
(NuSieve^{TM}, FMC). La aparición de un fragmento de ADN de 837
pares de bases, el mismo tamaño que se ha visto a partir de la
amplificación de PCR, indicó un clon positivo. Un clon positivo fue
denominado MOL1297.
El clon MOL1297 (que expresa el cen A de CBD de
C. fimi fusionado al N-terminal de
Termamyl^{TM}) fue incubado durante 20 horas en un medio SB a
37°C con agitación a 250 rpm. 1 ml de sobrenadante libre de células
fue mezclado con 200 \mul de Avicel^{TM} al 10%. La mezcla fue
incubada durante 1 hora a 0°C y luego centrifugada durante 5
minutos a 5000 X g. El granulado fue resuspendido en 100 \mul de
tampón de SDS-PAGE, hervido a 95°C durante 5
minutos, centrifugado a 5000 X g durante 5 minutos, y 25 \mul
fueron cargados en un gel de SDS-PAGE NOVEX (Novex,
EEUU) de Laemmli Tris-glicina al
4-20%. Las muestras fueron sometidas a
electroforesis en una XceII^{TM} Mini-Cell
(Novex, EEUU) según lo recomendado por el fabricante. Toda
manipulación posterior de geles que incluyen la coloración
(Coomassie), decoloración y secado, fue realizada según está
descrito por el fabricante.
La aparición de un enlace proteínico de PM
aproximado de 85 kDa indicó la expresión en B. subtilis de
la fusión CBD-Termamiyl^{TM}
La secuencia de codificación para el híbrido de
cenA de CBD-Termamyl de C. fimi está
mostrada en SEC ID No. 7 (en que las letras minúsculas indican la
parte de codificación de CBD de la secuencia). La secuencia de
aminoácidos correspondiente del híbrido está mostrada en SEC ID No.
8 (en que las letras minúsculas indican la secuencia de aminoácidos
de CBD).
Este ejemplo describe la construcción de
proteínas de fusión (híbrido enzimático) de una lipasa
(Lipolase^{TM}; Lipasa de Humicola lanuginosa) y un CBD.
Se eligió una construcción con un CBD de N-terminal,
puesto que el N-terminal de la enzima está lejos
del centro activo, mientras que el C-terminal está
relativamente cerca del centro activo.
Esta construcción fue hecha con el objetivo de
expresar una proteína que tiene el CBD de celulasa de
Myce- liophthora thermophila y el enlazador en el
N-terminal de Lipolase^{TM}
Un fragmento de PCR fue creado usando el clon
pA2C161 (DSM 9967) que contenía el gen celulasa de M.
thermophila como molde, y los oligomeros siguientes como
cebadores:
#8202
5' ACGTAGTGGCCACGCTAGGCGAGGTGGTGG 3'
#19672
5' CCACACTTCTCTTCCTTCCTC 3'
El fragmento de PCR fue cortado con BamHI y BalI,
y clonado en PAHL que fue también cortado con BamHI y BalI justo
hacia arriba del sitio de procesamiento del péptido señal
presumido. La clonación fue verificada por secuenciación (ver SEC
ID N°. 9).
Esta construcción se hace de tal modo que
cualquier enlace de interés puede ser introducido entre el CBD y la
lipasa con el objetivo de encontrar un enlace óptimo.
Un sitio NheI está introducido por la técnica USE
(catálogo Stratagene No. 200509) entre el CBD y la región de enlace
en pIVI450, creando un sitio pIVI450+NheI. El sitio pIVI450+NheI es
cortado con XhoI y NheI, aislando el vector que contenía la parte
de CBD.
El plásmido pIVI392 es cortado con XhoI y NheI, y
el fragmento que contenía el gen Lipolase^{TM} (menos la
secuencia de codificación del péptido señal) es aislado.
Los fragmentos de ADN son ligados, generando
pIVI450 CBD-NheI
sitio-Lipolase^{TM} que contenía un sitio NheI
entre el CBD y el gen de lipasa. En este sitio NheI se pueden
introducir varios enlaces diferentes.
La proteína expresada a partir de la construcción
aquí descrita contiene una construcción del tipo:
enlazador-lipasa
CBD-nonglicosilado.
La secuencia de aminoácidos del enlace es como
sigue:
NNNPQQGNPNQGGNNGGGNQGGGNGG
La PCR está realizada con los cebadores
siguientes:
#29315
5'
GATCTAGCTAGCAACAATAACCCCCAGCAGGGCAACCCCAACCAGGGCGGGAACAACGGC 3'
#29316
5'
GATCTAGCTAGCGCCGCCGTTGCCGCCGCCCTGGTTGCCGCCGCCGTTGTTCCCGCCCTG 3'
El fragmento de PCR es cortado con NheI, el
vector pIVI450
CBD-NheI-Lipolase^{TM} es así
mismo cortado con NheI, y los dos fragmentos son ligados,
dando:
enlazador-Lipolase^{TM} de
CBD-Noglicosilado pIVI450 (SEC ID N°. 10).
La proteína expresada de la construcción aquí
descrita contiene una construcción del tipo:
enlazador-lipasa de
CBD-glicosilado.
La secuencia de aminoácidos del enlace es la
siguiente:
VQIPSSSTSSPVNQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPS
La PCR está realizada con los cebadores
siguientes:
#29313
5' GATACTGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGC 3'
#29314
5' GATACTGCTAGCGCTGGGAGTCGTAGGCTG 3'
El fragmento de PCR es cortado con NheI, el
vector pIVI450
CBD-NheI-Lipolase^{TM} es
asimismo cortado con NheI, y los dos fragmentos son ligados,
dando:
enlazador-Lipolase^{TM} de
celulasa de la familia 45 de pIVI450 de CBD-H.insolens (SEC
ID N°. 11).
Este ejemplo concierne a proteínas de fusión que
comprenden un CBD conectado a Peroxidasa de Coprinus
cinereus (CiP) o a un mutante suyo (mCiP842) (ver, p. ej., WO
95/10602).
El sistema huésped/vector pJC106/YNG344 fue
elegido como el sistema de expresión estándar para todos los
experimentos CiP que utilizan la expresión de levadura. mCiP842
mutante contiene las sustituciones de aminoácidos siguientes
relativos al genitor CiP: V53A, E239G, Y272F, M242I. Las
construcciones que usan este plásmido fueron realizadas con el mismo
procedimiento que fue usado para la fusión de CBD al gen de tipo
salvaje CiP.
La fusión de CBD-CiP fue
construida amplificando cuatro fragmentos de gen separados usando
una PCR. A) La región no traducida 5' de CiP y la secuencia de
codificación de CiP del plásmido JC106 o mCiP842 que codifica los
aminoácidos 1 a 22, B) el CBD de celulasa de la familia 45 de H.
insolens del plásmido pCaHj4l8 que codifica los aminoácidos
248-305, C) el dominio enlazador de celulasa de la
familia 45 de H. insolens del plásmido pCaHj4l8 que codifica los
aminoácidos 213-247, y D) la secuencia de
codificación CiP del plásmido JC106 o mCiP842 que codifica los
aminoácidos 21 a 344.
La secuencia de la celulasa 45 de la familia 45
de H. insolens se describe en WO 91/17244.
Los cebadores usados en amplificaciones de A a D
fueron las siguientes:
Amplificación A:
1. CiPpcrdwn: CCCCCTTCCCTGGCGAATTCCGCATGAGG
2. JC20.1: ACCTTGGGGTAGAGCGAGGGCACCGATG
Amplificación B:
3. JC20.2: TGCACTGCTGAGAGGTGGGC
4. JC20.3: CAGGCACTGATGATACCAGT
Amplificación C:
5. JC20.4: CCCTCCAGCAGCACCAGCTCT
6. JC20.5:
TCCTCCAGGACCCTGACCGCTCGGAGTCGTAGGCTG
Amplificación D:
7. JC20.6:
TACGACTCCGAGCGGTCAGGGTCCTGGAGGAGGCGGG
8. YES2term: GGGAGGGCGTGAATGTAAG
Los productos amplificados de las reacciones A) y
B) fueron purificados y fosforilados usando una T4 Polinucleótido
quinasa, ligados entre sí durante 15 min. a temperatura ambiente, y
amplificados con cebadores 1 y 4 para generar el producto AB. Los
productos amplificados de las reacciones C) y D) fueron purificados
y mezclados, luego amplificados por PCR para generar el producto CD.
Productos reactivos AB y CD fueron purificados y fosforilados
usando una T4 Polinucleótido quinasa, ligados entre sí durante 15
min. a temperatura ambiente, y amplificados con los cebadores 1 y 8
para generar el producto final. El producto resultante fue
purificado, mezclado con el plásmido JC106 que tenía el gen CiP
extraído por digestión con BamHI y XhoI. El plásmido JC20A contiene
el gen CiP de tipo salvaje, mientras que el plásmido JC20D contiene
el mCiP842 mutante peróxido-estable. Los
transformantes fueron seleccionados en medios mínimos carentes de
uridina.
Otros plásmidos que contienen enlaces alternos
entre el CBD y CiP de celulasa de la familia 45 de H.
insolens fueron construidos esencialmente de la misma manera
que se ha descrito anteriormente para el plásmido JC20A, usando PCR
y extension de superposición. Los plásmidos resultantes codifican
proteínas de fusión con las composiciones de dominio
siguientes:
JC21: sec señal CiP.-CBD truncado de celulasa de
la familia 45 de H. insolens- enlazador-CiP
de celulasa de la familia 45 de H. insolens
JC22: sec. señal
CiP.-CBD-enlazador de celulasa de la familia 45 de
H. insolens del gen NifA de Klebsiella
pneumoniae-CiP
JC23: sec. señal
CiP.-CBD-enlazador de celulasa de la familia 45 de
H. insolens del gen-CiP OmpA de E.
coli.
Ensayo de placa: Los transformantes de levadura
fueron desarrollados en placas de medios mínimos que contenían
galactosa al 2% (para inducir al promotor de levadura GAL1 que
conduce la expresión de CBD-CiP) que ha sido
cubierta con una doble capa de filtro consistente en acetato de
celulosa sobre nitrocelulosa. Después de haberse desarrollado
durante la noche, ambos filtros fueron lavados dos veces con 100 mI
de tampón fosfato 20 mM, pH 7.0 durante 5 minutos, tras lo cual no
se pudo detectar ningún fragmento de la colonia. Los filtros fueron
luego evaluados por la actividad peroxidasa enlazada mediante su
revestimiento con un tampón fosfato 100 mM, pH 7.0, que contiene 50
\mug/ml de diamino benzidina y peróxido de hidrógeno 1 mM. La
actividad peroxidasa unida aparece como un precipitado marrón en el
filtro.
Ensayo líquido: Los cultivos líquidos de mutantes
que demuestran la unión de celulosa en el ensayo de filtro fueron
desarrollados durante toda la noche en medios mínimos que contenían
galactosa al 2%. 20 \mul de muestras de caldo de cultivo fueron
mezcladas con celulosa cristalina Avicel (20 g/l) en un tampón
fosfato 0.1 M, pH 7, 0.01% Tween 20 en un volumen total de 100
\mul y se incubó a 22°C durante 10 minutos. La mezcla fue luego
centrifugada hasta granular la fracción de celulosa insoluble, y
los sobrenadantes fueron evaluados por la actividad peroxidasa
usando el ensayo CiP estándar (ver, p. ej, WO 95/10602). La unión
fue marcada como el % de actividad enlazada a la fracción de
celulosa insoluble en base a la reducción de la actividad
soluble.
Este proceso de selección utiliza unas muestras
de caldos de cultivos de levadura desarrolladas en placas de
microtitración. La selección de placas de 96 pocillos se realiza en
primer lugar por transformantes de levadura de crecimiento de una
agrupación de mutantes en 50 \mul de volúmenes de un medio
URA(-), pH 6.0 en placas de microtitración de 96 pocillos. Los
cultivos son inoculados por dilución en un medio y colocación en
pipetas (autopipetador robótico o manual) en placas de 96 pocillos.
Estos se colocan en una incubadora dispuesta a 30°C, 350 RPM y se
agita durante aproximadamente 5 días. Las placas se colocan
directamente desde la caja de cultivo en el sistema robótico.
Ambos CiP y mCiP842 y las proteínas de fusión
relacionadas fueron sometidas a una prueba de tensión combinada de
pH - temperatura - H_{2}O_{2}: Después de un ensayo de
actividad inicial, los cultivos se diluyen hasta aprox. 0.06
PODU/ml (ver WO 95/10602 para definición de PODU) y se incubaron en
200 \muM de peróxido de hidrógeno, fosfato/borato 100 mM, pH 10.5
a 50ºC. Después de 0, 10, 20 y 30 minutos, se extrajeron las
muestras y la actividad residual se midió usando el ensayo de ABTS
estándar, pH 7.0. Los mutantes mejorados son los que muestran
actividad residual más alta que CiP y se expresan como actividad
residual porcentual relativa al resultado del ensayo del momento
0.
Los plásmidos de expresión de levadura diseñados
para hacer cinco fusiones de CBD-CiP de celulasa de
la familia 45 de H. insolens fueron construidos y
secuenciados. La diferencia primaria entre las fusiones está en el
tipo de dominio de unión que conecta el CBD al CiP, ya que se
consideró importante para maximizar la unión del CBD a sustratos
celulósicos.
Todos los constructos codifican una fusión de
cuatro dominios separados:
Secuencia señal
CiP-CBD-enlazador-CiP
de celulasa de la familia 45 de H. insolens. El plásmido
JC20A es una fusión de CBD-CiP al CiP de tipo
salvaje, mientras que el plásmido JC20D es una fusión al mutante
estable mCiP842 que contiene las sustituciones de aminoácidos V53A,
E239G, M2421 y Y272F. Los dos constructos de JC20 contienen el
dominio de unión a celulasa de la familia 45 de H. insolens
natural.
El plásmido JC21 codifica una proteína de fusión
idéntica al producto JC20 con la excepción de que contiene los
residuos 7 a 23 carentes del enlazador truncado del enlazador de
celulasa de la familia 45 de H. insolens. El plásmido JC22
tiene el dominio del enlazador de celulasa de la familia 45 de H.
insolens reemplazado con un enlazador rico en prolina de 12
residuos de la proteína de membrana externa de E. coli (del
gen OmpA). El plásmido final, JC23, contiene un cuarto enlazador
(llamado enlazador Q) derivado del gen NifA de Klebsiella
pneumoniae. Este enlazador, 14 aminoácidos de longitud,
contiene 3 residuos de glutamina (de ahí el nombre de enlazador Q)
así como 3 residuos de arginina, dando una carga positiva con un pH
neutro.
Estos plásmidos de las series JC20 fueron
transformados en S. cerevisae para la expresión y
evaluación. Después de la transformación, las colonias de levadura
fueron desarrolladas en placas selectivas cubiertas con una doble
capa de filtro: filtros de acetato de celulosa sobre nitrocelulosa.
El CiP de tipo salvaje segregado por levadura JC106 y el mutante
estable mCiP842 pasan a través del acetato de celulosa, luego se
une a la nitrocelulosa donde puede visualizarse usando
diaminobenzidina (DAB) y H_{2}O_{2}. El filtro de acetato de
celulosa no enlaza cualquier tipo salvaje o mCiP842 peroxidasa. Por
el contrario, las fusiones de N-terminales de
CBD-CiP codificados por los plásmidos JC20A, JC20D,
JC21, JC22, y JC23 son todos detectables en ambos filtros usando el
ensayo DAB, lo que indica que las proteínas de fusión tienen a la
vez peroxidasa y actividades de unión a celulosa. La inspección
visual de filtros sugiere que el enlazador NifA puede mejorar la
unión ligeramente sobre los demás, aunque la diferencia es
marginal. En cualquier caso la actividad peroxidasa unida al filtro
de acetato de celulosa permanece enlazada incluso después de lavarse
en gran medida con un tampón de pH 7. La actividad enlazada al
filtro de nitrocelulosa inferior sugiere que la unión del
CBD-CiP puede estar incompleta, o que el filtro de
celulosa está saturado, permitiendo que alguna proteína de fusión
pase a través del filtro inferior, o que algún porcentaje de la
proteína de fusión quede truncado para incluir sólo el dominio de
peroxidasa.
Los identificadores de secuencias aquí
correspondientes a los constructos son según se indica abajo. Las
abreviaturas son las siguientes:
EGV: endoglucanasa (celulasa) de la familia 45 de
Humicola insolens
CiPss: secuencia señal CiP
CiP842: mCiP842 mutante/variante de CiP;
SEC ID N°. 12: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-EGV
enlazador-CiP fusión en JC20.A;
SEC ID No.13: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-EGV
enlazador-CiP842 fusión en JC20.D1;
SEC ID N°. 14: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-truncado EGV
enlazador-CiP fusión en JC21;
SEC ID N°. 15: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-E. coli OmpA
enlazador-CiP fusión en JC22;
SEC ID N°. 16: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-NifA
enlazador-CiP fusión en JC23.
Este ejemplo concierne a proteínas de fusión que
comprenden un CBD conectado a lacasa de Myceliophthora
thermophila (MtL) (MtL está descrita en, p. ej., WO
95/33836).
Un fragmento de ADN que contenía la secuencia
señal (22 aminoácidos) de peroxidasa de Coprinus cinereus
(CiP), el CBD de celulasa de la familia 45 de H. insolens
(37 aminoácidos) y un dominio NifA de enlace de Klebsiella
pneumoniae (14 aminoácidos) fue amplificado en PCR usando dos
cebadores específicos para el plásmido pJC23.
| nombre del cebador | secuencia |
| CiPpcrdwn: | CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATG |
| JC24.1 | AGCGCGTGGACGTTCGATGC |
La amplificación en PCR fue realizada usando la
polimerasa Pwo (Boehringer Mannheim) usando el tampón suministrado
según las instrucciones del fabricante. La reacción fue iniciada
después de 3 min. a 96°C añadiendo la polimerasa, y permitió
ciclarse 30 veces con 30 seg a 96°C, 30 seg a 60°C y 2 minutos a
72°C. Un segundo fragmento de PCR que codificaba el péptido maduro
MtL carente a la vez del péptido señal y propéptido (residuos
48-620) fue amplificado en PCR a partir de un clon
de ADNc de lacasa de Myceliophthora contenida en el plásmido
pJRoC30. La amplificación en PCR fue realizada usando las mismas
condiciones que en el modo descrito anteriormente y el par cebador
siguiente:
| nombre del cebador | secuencia |
| JC24.2 | CAGCAGAGCTGCAACACCCCCAG |
| YES2term | GGGGAGGGCGTGAATGTAAG |
Tras la amplificación, ambos fragmentos de ADN
fueron purificados usando el QiaQuick^{TM} Spin purification kit
(Qiagen, Inc.) según las recomendaciones del fabricante. Los dos
fragmentos de ADN fueron luego ligados entre sí y una parte de la
mezcla de ligadura fue usada como molde para la amplificación en
PCR usando los cebadores CiPpcrdwn y YES2term bajo las mismas
condiciones que en el modo descrito anteriormente. El fragmento de
ADN quimérico de 2.3 kb resultante fue purificado en gel, cortado
con enzimas de restricción BamHI y NotI, y ligado en el hueso del
vector del plásmido pJC106 para obtener el plásmido pJC24.
Un fragmento de PCR que codifica todo el péptido
MtL (residuos 1-620) y 232 pares de bases de la
secuencia hacia arriba fue amplificado a partir del plásmido
pJRoC30 usando el par cebador siguiente:
| nombre del cebador | secuencia |
| CiPpcrdwn: | CTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATG |
| JC25.2 | CGCCTTGACCAGCCACTCGCCCTCCTCG |
Un segundo fragmento de ADN que codifica el
dominio unión a celulasa de la familia 45 de H. insolens (35
aminoácidos), la CBD de celulasa de la familia 45 de H.
insolens (37 aminoácidos) y 20 pares de bases de la secuencia
no codificadora 3' fue amplificada del plásmido pCaHj4l8 de la
familia 45 de H. insolens usando el par cebador
siguiente:
\newpage
| nombre del cebador | secuencia |
| JC20.4 | CCCTCCAGCAGCACCAGCTCTC |
| JC25.1NotI | ATAAGAATGCGGCCGCCTACAGGCACTGATGGTACCAGT |
Los dos fragmentos de ADN fueron ligados
brevemente y el producto de fusión de 2.3 kb de cuerpo entero fue
amplificado según el modo descrito anteriormente, usando los
cebadores CiPpcrdwn y JC25.1 NotI. Este producto de PCR final fue
clonado en el plásmido pJC106 para obtener el plásmido pJC25.
El plásmido pJC26 fue construido exactamente de
la misma manera que el pJC25, excepto por el hecho de que el
cebador MI-ct fue sustituido para el cebador JC25.1
y resultó en un producto truncado del gen MtL carente de los 17
codones finales.
| nombre del cebador | secuencia |
| ML-ct | CAGCAGAGCTGCAACACC |
Los identificadores de secuencias que
corresponden aquí a las construcciones son según lo indicado abajo.
Las abreviaturas son las siguientes:
EGV: endoglucanasa de la familia 45 de
Humicola insolens (celulasa)
CiPss: secuencia señal CiP
MtLss: secuencia señal MtL
SEC ID N°. 17: Secuencia de nucleótidos del
CiPss(+ 2 amino ácidos)-EGV
CBD-NifA
enlazador-MtL fusión en pJC24;
SEC ID N°. 18: Secuencia de nucleótidos del
MtLss-MtL
propéptido-MtL-EGV
enlazador-EGV fusión de CBD en
pJC25;
SEC ID N°. 19: Secuencia de nucleótidos del
MtLss-MtL propéptido-MtL (menos 17
amino ácidos)-EGV enlazador-EGV
fusión de CBD en pJC26. Los codones correspondientes a los 17
aminoácidos en cuestión están mostrados en negrita en la SEC ID N°.
18.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- (CÓDIGO POSTAL): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCESO PARA ELIMINACIÓN O DECOLORACIÓN DE SUCIEDAD O MANCHAS DE TEJIDO CELULÓSICO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N°: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2253 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 750 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1203 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC No: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC No: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 400 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1683 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 560 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO. 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID No. 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID No. 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID No. 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID No. 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 19:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un proceso para la eliminación o decoloración
de la suciedad o manchas presentes en tejido celulósico, donde el
tejido es puesto en contacto en medio acuoso con una enzima
modificada (híbrido enzimático) que comprende una secuencia de
aminoácidos catalíticamente activa de una enzima
no-celulolítica conectada a una secuencia de
aminoácidos que comprende un dominio de unión a celulosa.
2. Un proceso según la reivindicación 1, donde
dicha suciedad o mancha está originada a partir de almidón,
proteína, grasa, tierra, arcilla, fruta, verduras, café, té,
especies, vino tinto, fluidos corporales, hierba o tinta.
3. Un proceso según la reivindicación 1, donde
dicha secuencia de aminoácidos catalíticamente activa deriva de una
enzima seleccionada del grupo que se compone de amilasas,
proteasas, lipasas, pectinasas y oxidorreductasas.
4. Un proceso según la reivindicación 3, donde
dicha amilasa es una \alpha-amilasa que se puede
obtener a partir de unas especies de Bacillus.
5. Un proceso según la reivindicación 3 ó 4,
donde dicha \alpha-amilasa se puede obtener a
partir de Bacillus licheniformis.
6. Un proceso según la reivindicación 3, donde
dicha proteasa se puede obtener a partir de unas especies de
Bacillus o Fusarium.
7. Un proceso según la reivindicación 3, donde
dicha lipasa se puede obtener a partir de unas especies de
Humicola, Candida, Pseudomonas o
Bacillus.
8. Un proceso según la reivindicación 3, donde
dicha oxidorreductasa es una peroxidasa o una lacasa.
9. Un proceso según la reivindicación 8, donde
dicha peroxidasa se puede obtener a partir de unas especies de
Coprinus.
10. Un proceso según la reivindicación 8 o 9,
donde dicha peroxidasa se puede obtener a partir de C.
cinereus.
11. Un proceso según la reivindicación 8, donde
dicha lacasa se puede obtener a partir de unas especies de
Trametes, Myceliophthora, Schyitalidium o
Polyporus.
12. Un proceso según la reivindicación 1, donde
dicho dominio de unión a celulosa se puede obtener a partir de una
celulasa, una xilanasa, una mananasa, una arabinofuranosidasa, una
acetilesterasa o una quitinasa.
13. Un proceso según la reivindicación 1, donde
dicho híbrido enzimático se obtiene por un método que comprende el
crecimiento de una célula huésped transformada que contiene un
cassette de expresión que comprende una secuencia de ADN que
codifica dicho híbrido enzimático, donde se expresa dicho híbrido
enzimático.
14. Una composición de detergente que
comprende:
un híbrido enzimático que comprende una secuencia
de aminoácidos catalíticamente activa de una enzima
no-celulolítica conectada a una secuencia de
aminoácidos que comprende un dominio de unión a celulosa, y un
surfactante.
15. Un proceso para el lavado de tejidos
celulósicos con suciedad o de color, donde dicho tejido es lavado
en un medio acuoso al que se añade una composición de detergente
según la reivindicación 14.
16. Un híbrido enzimático que comprende un
dominio catalíticamente activo de una enzima
no-celulolítica conectada a un dominio de unión a
celulosa, el híbrido estando codificado por una secuencia de ADN
comprendida dentro de las secuencias de ADN de ID SEC No. 1, SEC ID
No. 5, SEC ID No. 7, SEC ID No. 9, SEC ID No. 10, SEC ID No. 11,
SEC ID No. 12, SEC ID No. 13, SEC ID No. 14, SEC ID No. 15, SEC ID
No. 16, SEC ID No. 17, SEC ID No. 18 o SEC ID N°. 19.
17. Un híbrido enzimático que comprende un
dominio catalíticamente activo de una enzima
no-celulolítica conectada a un dominio de unión a
celulosa que tiene una secuencia de aminoácidos comprendida dentro
de las secuencias de aminoácidos de SEC ID No. 2, SEC ID No. 6 o SEC
ID No. 8.
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