CN114032228B - 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用 - Google Patents

一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114032228B
CN114032228B CN202111596412.2A CN202111596412A CN114032228B CN 114032228 B CN114032228 B CN 114032228B CN 202111596412 A CN202111596412 A CN 202111596412A CN 114032228 B CN114032228 B CN 114032228B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cel
thr
ala
gene
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111596412.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114032228A (zh
Inventor
黄火清
周樱
詹志春
张成杰
辜玲芳
刘文悦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Original Assignee
Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Sunhy Biological Co ltd filed Critical Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority to CN202111596412.2A priority Critical patent/CN114032228B/zh
Publication of CN114032228A publication Critical patent/CN114032228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114032228B publication Critical patent/CN114032228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酸性纤维素酶Cel‑Bi及其基因和应用。本发明提供的这种酸性纤维素酶Cel‑Bi最适pH为4.0，最适温度为70℃，能够有效降解可溶性纤维素底物，作为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料、食品、生物能源、纺织和造纸工业等领域。此外，本发明在不改变酸性纤维素酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子偏好性，密码子适应指数，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因素，对编码酸性纤维素酶的基因进行改造，得到三条编码酸性纤维素酶的基因序列，其中将经密码子优化的cel‑Bi‑m1基因转入到里氏木霉中进行表达，酸性纤维素酶Cel‑Bi的分泌表达量显著提高、酶活力显著增强。

Description

一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用。
背景技术
纤维素多糖是世界上分部最广、含量最丰富的可再生生物质，广泛存在于绿色植物的细胞壁中，少量存在于细菌和海藻等物种中。天然的纤维素分子是由葡萄糖残基通过糖苷键相连形成的线性大分子聚合物，其中相邻的两个葡萄糖残基相互旋转180°构成一分子的纤维二糖，其作为形成纤维素的最小单元。植物细胞壁是由50％的纤维素分子、半纤维素、木质素以及少量的果胶等构成。据统计，目前每年至少生产7×1011吨来源于植物细胞壁的纤维素多糖，并且被广泛应用于饲料、化工原料、纺织和生物能源等领域。
发明内容
本发明提供了一种酸性纤维素酶Cel-Bi，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MKAVLFTITAAAGSAYAAQSAWYVAQCGGQNWSGGTACVSGYTCTTYNPYYAQCIPGTSTDGPSTATSVKPMTTTVHTTSVKQTTSTSSAAASTAAASSVSSDSTSTSSGHVKYGGVNIAGFDFGCSTDGTCTLSSTDPPGETGIAQMNHFVKNDGLNAFRLPVAWQYLVNNNLGGTLDSANFAEYNDLVQGCLSAGAEMCIIDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFASLWSQLATKFKSNSKVTFGLMNEPHDLDMTEWAESVQAAVTAIRKAGATSQKILLPGTGYTSAQDFGTNSGQYLLKVTNLDGSTDNLIFDVHKYLDADNSGTSTECVTNNSAVFVQLAEWLRANKRQAMLTETGGGNTASCETDVCEELAVLNAHSDVLLGWTGWAAGMFDTSYALSETPTESGSTWTDQPLVKKCIAGMFKK
该酶全长430个氨基酸(SEQ ID NO.1)，N端22个氨基酸为其信号肽序列“MKAVLFTITAAAGSAYAAQSAW”。成熟的酸性纤维素酶的理论分子量为42.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
YVAQCGGQNWSGGTACVSGYTCTTYNPYYAQCIPGTSTDGPSTATSVKPMTTTVHTTSVKQTTSTSSAAASTAAASSVSSDSTSTSSGHVKYGGVNIAGFDFGCSTDGTCTLSSTDPPGETGIAQMNHFVKNDGLNAFRLPVAWQYLVNNNLGGTLDSANFAEYNDLVQGCLSAGAEMCIIDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFASLWSQLATKFKSNSKVTFGLMNEPHDLDMTEWAESVQAAVTAIRKAGATSQKILLPGTGYTSAQDFGTNSGQYLLKVTNLDGSTDNLIFDVHKYLDADNSGTSTECVTNNSAVFVQLAEWLRANKRQAMLTETGGGNTASCETDVCEELAVLNAHSDVLLGWTGWAAGMFDTSYALSETPTESGSTWTDQPLVKKCIAGMFKK
本发明还提供了编码上述酸性纤维素酶Cel-Bi的基因Cel-Bi-m0，该基因序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
TACGTCGCTCAGTGCGGTGGCCAAAACTGGTCCGGCGGCACCGCCTGCGTCTCCGGCTATACCTGCACCACCTACAACCCCTACTACGCCCAATGTATCCCCGGCACCTCCACCGACGGCCCGTCCACCGCCACCTCCGTCAAGCCGATGACCACGACCGTCCACACCACGTCCGTCAAGCAAACCACCTCCACGTCCTCCGCCGCTGCTTCCACCGCCGCTGCCTCCTCCGTCTCCTCCGACTCCACGTCCACGTCCTCCGGCCACGTCAAGTACGGCGGCGTCAACATCGCCGGCTTCGACTTCGGCTGCTCCACGGACGGCACCTGCACCCTCTCCTCCACGGATCCCCCCGGCGAGACCGGCATCGCTCAGATGAACCACTTCGTCAAGAACGACGGCCTCAACGCCTTCCGCCTCCCCGTCGCCTGGCAGTACCTCGTCAACAATAACCTCGGCGGCACCCTCGACTCCGCCAACTTCGCCGAGTACAACGACCTCGTCCAAGGCTGCCTCTCCGCCGGCGCCGAGATGTGCATCATCGACATCCACAATTACGCCCGCTGGAACGGCGGCATCATCGGCCAAGGCGGTCCCACCAACGCTCAGTTCGCCTCCCTCTGGTCCCAACTCGCCACCAAGTTCAAGTCCAACTCCAAGGTCACCTTCGGCCTCATGAACGAGCCCCACGACCTCGACATGACCGAGTGGGCCGAGTCCGTCCAAGCCGCCGTCACCGCCATCCGCAAGGCCGGCGCCACCTCCCAAAAGATCCTCCTCCCCGGCACCGGCTACACCTCCGCCCAAGACTTCGGCACCAACTCCGGTCAGTATCTCCTCAAGGTCACCAACCTCGACGGCTCCACCGACAACCTCATCTTCGACGTCCACAAGTACCTCGACGCCGACAACTCCGGTACCTCCACCGAGTGCGTCACCAACAACTCCGCCGTCTTCGTGCAGCTCGCCGAGTGGCTCCGCGCCAACAAGCGCCAAGCCATGCTGACCGAGACCGGTGGCGGCAACACCGCCTCCTGCGAGACCGACGTCTGCGAGGAGCTCGCCGTCCTCAACGCCCATAGCGACGTCCTCCTCGGTTGGACCGGCTGGGCCGCTGGCATGTTCGACACGTCCTACGCCCTCTCCGAGACCCCCACCGAGTCCGGCTCCACCTGGACCGATCAGCCCCTCGTCAAGAAGTGCATCGCCGGCATGTTCAAAAAG
本发明在不改变酸性纤维素酶氨基酸序列的前提下，对Cel-Bi-m0进行了改造，得到编码酸性纤维素酶Cel-Bi的优化基因Cel-Bi-m1、Cel-Bi-m2、cel-Bi-m3，其基因序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.4：
TACGTCGCTCAGTGTGGCGGCCAGAACTGGTCTGGCGGCACCGCTTGCGTCAGCGGCTACACCTGCACCACCTACAACCCCTACTACGCCCAGTGCATCCCTGGCACCAGCACCGACGGCCCTTCTACCGCTACCAGCGTCAAGCCTATGACCACCACCGTCCACACCACCAGCGTCAAGCAGACCACCTCCACCAGCTCCGCTGCTGCTAGCACCGCTGCTGCTTCTAGCGTCTCCTCTGACTCCACCTCTACCAGCTCCGGCCACGTCAAGTACGGCGGCGTCAACATCGCCGGCTTCGACTTCGGCTGCAGCACCGACGGCACCTGCACCCTCTCTAGCACCGACCCTCCTGGCGAGACCGGCATCGCTCAGATGAACCACTTCGTCAAGAACGACGGCCTCAACGCTTTCCGACTGCCTGTCGCTTGGCAGTACCTGGTCAACAACAACCTCGGCGGCACCCTGGACAGCGCTAACTTCGCCGAGTACAACGACCTCGTCCAGGGCTGCCTGTCCGCTGGCGCCGAGATGTGCATCATCGACATCCACAACTACGCCCGCTGGAACGGCGGCATCATCGGCCAGGGCGGCCCTACCAACGCTCAGTTCGCTTCCCTCTGGTCTCAGCTGGCCACCAAGTTCAAGAGCAACTCCAAGGTCACCTTCGGCCTCATGAACGAGCCCCACGACCTGGACATGACCGAGTGGGCTGAGTCTGTCCAGGCTGCTGTCACCGCTATCCGAAAGGCTGGCGCCACCAGCCAGAAGATCCTCCTGCCTGGCACCGGCTACACCTCCGCCCAGGACTTCGGCACCAACTCTGGCCAGTACCTCCTGAAGGTCACCAACCTCGACGGCAGCACCGACAACCTGATCTTCGACGTCCACAAGTACCTCGACGCCGACAACAGCGGCACCTCCACCGAGTGCGTCACCAACAACTCCGCTGTCTTCGTCCAGCTCGCTGAGTGGCTGCGAGCTAACAAGCGACAGGCTATGCTGACCGAGACCGGCGGCGGCAACACCGCTTCCTGCGAGACCGACGTCTGCGAGGAGCTCGCTGTCCTGAACGCCCACTCTGACGTCCTCCTGGGCTGGACCGGCTGGGCTGCTGGCATGTTCGACACCTCCTACGCCCTCTCTGAGACCCCTACCGAGTCTGGCAGCACCTGGACCGACCAGCCTCTGGTCAAGAAGTGCATCGCCGGCATGTTCAAGAAG
SEQ ID NO.5：
TACGTCGCCCAGTGCGGCGGTCAGAACTGGAGCGGCGGCACCGCTTGCGTCAGCGGTTACACCTGCACCACCTACAACCCCTACTACGCCCAGTGCATCCCTGGCACCAGCACCGACGGCCCCAGCACTGCTACCAGCGTCAAGCCTATGACCACCACCGTCCACACCACCAGCGTCAAGCAGACCACCAGCACCAGCAGCGCCGCCGCTAGCACCGCTGCTGCTAGCAGCGTCAGCAGCGACAGCACCAGCACCTCCAGCGGCCACGTCAAGTACGGCGGCGTCAACATCGCCGGCTTCGACTTCGGCTGCAGCACCGACGGTACCTGCACCCTCAGCAGCACCGACCCCCCTGGCGAGACCGGTATCGCCCAGATGAACCACTTCGTCAAGAACGACGGCCTGAACGCCTTCCGCCTCCCTGTCGCCTGGCAGTACCTGGTCAACAACAACCTCGGCGGCACCCTCGACAGCGCCAACTTCGCCGAGTACAACGACCTGGTCCAGGGCTGCCTCAGCGCCGGTGCTGAGATGTGCATCATCGACATCCACAACTACGCCCGCTGGAACGGCGGCATCATCGGCCAGGGCGGCCCTACTAACGCCCAGTTCGCCAGCCTCTGGAGCCAGCTCGCCACCAAGTTCAAGAGCAACAGCAAGGTCACCTTCGGCCTGATGAACGAGCCCCACGACCTCGACATGACCGAGTGGGCCGAGAGCGTCCAGGCCGCTGTCACCGCTATCCGCAAGGCCGGCGCCACCAGCCAGAAGATCCTGCTCCCCGGCACCGGCTACACCAGCGCTCAGGACTTCGGCACCAACAGCGGCCAGTACCTGCTCAAGGTCACCAACCTCGACGGCAGCACCGACAACCTGATCTTCGACGTCCACAAGTACCTCGACGCCGACAACAGCGGCACCAGCACTGAGTGCGTCACCAACAACAGCGCCGTCTTCGTCCAGCTCGCCGAGTGGCTGCGCGCCAACAAGCGCCAGGCCATGCTCACCGAGACCGGCGGTGGCAACACCGCCAGCTGCGAGACCGACGTCTGCGAGGAGCTCGCCGTCCTCAACGCCCACAGCGACGTCCTGCTGGGCTGGACCGGCTGGGCTGCTGGTATGTTCGACACCAGCTACGCCCTGAGCGAGACCCCCACCGAGAGCGGTAGCACCTGGACCGACCAGCCTCTGGTCAAGAAGTGCATCGCCGGCATGTTCAAGAAG
SEQ ID NO.6
TACGTCGCCCAGTGCGGCGGTCAGAACTGGAGCGGCGGCACCGCTTGCGTCAGCGGTTACACCTGCACCACCTACAACCCCTACTACGCCCAGTGCATCCCCGGCACCAGCACCGACGGCCCTAGCACTGCCACCAGCGTCAAGCCTATGACCACCACCGTCCACACCACCAGCGTCAAGCAGACCACCAGCACCAGCAGCGCCGCCGCTAGCACCGCTGCTGCTAGCAGCGTCAGCAGCGACAGCACCAGCACCTCCAGCGGCCACGTCAAGTACGGCGGCGTCAACATCGCCGGCTTCGACTTCGGCTGCAGCACCGACGGTACCTGCACCCTGAGCAGCACCGACCCCCCCGGTGAGACCGGTATCGCCCAGATGAACCACTTCGTCAAGAACGACGGCCTGAACGCCTTCCGCCTGCCCGTCGCTTGGCAGTACCTGGTCAACAACAACCTGGGCGGCACCCTGGACAGCGCCAACTTCGCCGAGTACAACGACCTCGTCCAGGGCTGCCTGAGCGCCGGTGCTGAGATGTGCATCATCGACATCCACAACTACGCCCGCTGGAACGGCGGCATCATCGGCCAGGGCGGCCCTACTAACGCCCAGTTCGCCAGCCTGTGGAGCCAGCTGGCCACCAAGTTCAAGAGCAACAGCAAGGTCACCTTCGGCCTGATGAACGAGCCTCACGACCTGGACATGACCGAGTGGGCCGAGAGCGTCCAGGCCGCTGTCACCGCTATCCGCAAGGCCGGCGCCACCAGCCAGAAGATCCTCCTGCCCGGCACCGGCTACACCAGCGCTCAGGACTTCGGCACCAACAGCGGCCAGTACCTGCTGAAGGTCACCAACCTGGACGGCAGCACCGACAACCTGATCTTCGACGTCCACAAGTACCTCGACGCCGACAACAGCGGCACCAGCACTGAGTGCGTCACCAACAACAGCGCCGTCTTCGTCCAGCTGGCCGAGTGGCTCCGCGCCAACAAGCGCCAGGCCATGCTGACCGAGACCGGCGGTGGCAACACCGCCAGCTGCGAGACCGACGTCTGCGAGGAGCTCGCCGTCCTGAACGCCCACAGCGACGTCCTCCTGGGCTGGACCGGCTGGGCTGCTGGTATGTTCGACACCAGCTACGCCCTGAGCGAGACCCCCACCGAGAGCGGTAGCACCTGGACCGACCAGCCCCTGGTCAAGAAGTGCATCGCCGGCATGTTCAAGAAG
本发明还提供了包含上述酸性纤维素酶基因的重组载体。
具体的，上述重组载体为pCbh1-Cel-Bi，其中，将编码本发明提供的所述酸性纤维素酶Cel-Bi的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作地与表达调控序列相连。优选的，将编码纤维素酶Cel-Bi的基因插入pCbh1的SnaBI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该基因位于pCbh1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pCbh1-Cel-Bi。
本发明还提供了包含上述酸性纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组里氏木霉菌株。
本发明还提供了一种制备酸性纤维素酶Cel-Bi的方法，包括以下步骤：
(1)使用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
(3)回收并纯化所表达的酸性纤维素酶Cel-Bi。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供的这种酸性纤维素酶Cel-Bi最适pH为4.0，最适温度为70℃，能够有效降解可溶性纤维素底物，作为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料、食品、生物能源、纺织和造纸工业等领域。
(2)本发明在不改变酸性纤维素酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子偏好性，密码子适应指数(CAI)，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因素，对编码酸性纤维素酶的基因进行多种策略的改造，得到三条编码酸性纤维素酶的基因序列，其中cel-Bi-m1基因转入到里氏木霉中进行表达时，酸性纤维素酶Cel-Bi的分泌表达量显著提高、酶活力显著增强。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例2中Cel-Bi-m0密码子使用频率统计图。
图2是本发明实施例2中Cel-Bi-m1密码子使用频率统计图。
图3是本发明实施例2中Cel-Bi-m2密码子使用频率统计图。
图4是本发明实施例2中Cel-Bi-m3密码子使用频率统计图。
图5是本发明实施例2中Cel-Bi-m0(A)、Cel-Bi-m1(B)、Cel-Bi-m2(C)和Cel-Bi-m3(D)基因的mRNA二级结构预测图。
图6是本发明实施例4中酸性纤维素酶活力测定结果图。
图7是本发明实施例5中以CMC-Na为底物时重组Cel-Bi的酶学性质结果图；其中，A为pH对酶活力的影响；B为pH稳定性；C为温度对酶活力的影响；D为不同温度下的热稳定性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
Bispora sp.MEY-1作为一种高效降解纤维素的真菌，是重要的生物资源。本发明从Bispora sp.MEY-1菌株中得到一个新的酸性纤维素酶基因，通过基因优化后，以异源表达的方式在里氏木霉中得到重组酸性纤维素酶Cel-Bi，研究了其最适pH、温度及pH稳定性和热稳定性，为进一步将其应用于更多的工业领域提供可靠的理论依据。
下面通过具体实施例对本发明的酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因的效果进行研究。
实验材料和试剂
1、菌株及载体：Bispora sp.MEY-1菌株由本实验室分离，保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记号为CGMCC No.250027；自行构建里氏木霉表达载体pCbh1；里氏木霉菌株TU-6购自美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC MYA-256。
2、培养基：
(1)Bispora sp.MEY-1产酶培养基：20g/L的葡萄糖，2.5g/L的酵母提取物，1g/L的KH2PO4，0.05g/L的Na2HPO4·12H2O，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.01g/L的CaCl2，0.01g/L的FeSO4·7H2O，0.001g/L的MnSO4·H2O，0.001g/L的ZnSO4·7H2O，0.002g/L的CuSO4。
(2)里氏木霉产酶培养基：葡萄糖20g，玉米浆54mL，KH2PO428g，乳清粉148g，MgSO46g，(NH4)2SO416g，CaCl22g，麸皮20g，微晶纤维素1g，微量元素0.8mL，配制药品后定容至3.5L，调节pH 5.5。
3、酶及生化试剂：内切酶购自Fermentas公司；连接酶购自Invitrogen公司；羧甲基纤维素钠(CMC)购自Sigma公司；其它都为市售普通生化试剂。
实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：Bispora sp.MEY-1酸性纤维素酶基因Cel-Bi的克隆
提取Bispora sp.MEY-1的总RNA：收集液体培养5天的Bispora sp.MEY-1菌丝体，在滤纸上压干，液氮中彻底研磨成粉末；将800μl的Trizol试剂加入到100mg菌丝中，吹打混匀，室温放置5min；加入200μl氯仿，剧烈振摇15s，室温放置3min，于4℃，12000rpm离心15min；吸取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，于4℃，12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤1次，沉淀在空气中干燥5min；加入适量RNase-Free去离子水溶解RNA，在NanoDrop微量核酸蛋白测定仪上测定RNA浓度；1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。
根据酶基因编码序列设计合成特异性引物，引物序列为：
Cel-Bi-F：5’-GCGTACGTATACGTCGCTCAGTGCGGTGG-3’，
和
Cel-Bi-R：5’-GCCGAATTCTTACTTTTTGAACATGCCGGCGATG-3’。
以Bispora sp.MEY-1总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环后72℃保温10min。得到与预期大小相符合的目的片段，将该片段回收后与pEASY-Blunt载体相连送睿博生物技术有限公司测序。
测序及序列分析结果显示，Cel-Bi的cDNA序列(Cel-Bi-m0，SEQ ID NO.3)编码430个氨基酸(SEQ ID NO.1)，N端22个氨基酸为其信号肽序列“MKAVLFTITAAAGSAYAAQSAW”。成熟的酸性纤维素酶Cel-Bi的理论分子量为42.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：酸性纤维素酶基因的优化
在不改变纤维素酶基因Cel-Bi所编码的氨基酸序列的前提下，对从Bisporasp.MEY-1中克隆获得的酸性纤维素酶Cel-Bi野生型基因Cel-Bi-m0序列进行优化，根据表达宿主密码子使用偏好性，尽可能减少稀有密码子串联的概率，改变其CAI值分布范围；控制基因序列中GC含量和分布区域，避免高GC和连续AT区域的出现；对mRNA的茎环结构(能量)进行优化以延长mRNA的半衰期。通过优化设计，得到3条序列Cel-Bi-m1(SEQ ID NO.4)、Cel-Bi-m2(SEQ ID NO.5)和Cel-Bi-m3(SEQ ID NO.6)。如图1-5所示，优化后基因的碱基组成、密码子使用频率及mRNA二级结构与野生型基因相比都具有明显差异。
实施例3：制备包含酸性纤维素酶基因的重组载体和重组菌株
将表达载体pCbh1进行SnaBI和EcoRI双酶切，同时将编码酸性纤维素酶Cel-Bi的Cel-Bi-m0、Cel-Bi-m1、Cel-Bi-m2和Cel-Bi-m3基因序列进行SnaBI和EcoRI双酶切，切出编码成熟酸性纤维素酶的基因片段，分别插入到表达载体pCbh1的SnaBI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该基因位于pCbh1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pCbh1-Cel-Bi-m0，pCbh1-Cel-Bi-m1，pCbh1-Cel-Bi-m2和pCbh1-Cel-Bi-m3。
使用pCbh1-Cel-Bi-m0，pCbh1-Cel-Bi-m1，pCbh1-Cel-Bi-m2和pCbh1-Cel-Bi-m3分别转化里氏木霉，获得对应的重组里氏木霉菌株。
实施例4：重组里氏木霉菌株的上罐发酵
使用实施例3中获得的重组里氏木霉菌进行发酵：
将里氏木霉菌株涂布于PDA平板上，置于28℃培养箱中培养产孢；用无菌棉签刮取1/6孢子于无菌水中混匀并过200目筛。将滤液接种于PDB液体培养基中，28℃，220rpm摇床中培养两天，为“一级种子液”；将“一级种子液”转入200mLPDB液体培养基中，接种量为40mL/瓶。于28℃，220rpm摇瓶中培养24h；配制上罐培养基。称取6L的组分量并加入5mL消泡剂，用水定容至4L，调整pH＝5.5，121℃灭菌30min；接种三瓶200mL“二级种子液”。培养温度设定为28℃，转速为300rpm进行菌体培养；开始补料后，定时取样测定酸性纤维素酶的酶活。
酶活性分析方法为：取1000mg羧甲基纤维素钠，以pH为5.0的0.05M柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液定容至50ml，得到2％的羧甲基纤维素钠溶液，在4℃下避光保存，有效期为3天(羧甲基纤维素钠溶液应立即使用，使用前适当摇匀)。取酶液做适当稀释，在各试管中加入2％的羧甲基纤维素钠溶液和柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(0.05M、pH 5.0)各0.45ml，50℃水浴平衡后，加入已经稀释的酶液0.1ml(空白先不加)，振荡混合均匀。50℃水浴保温30min，迅速冷却。向各试管中加入1.5ml DNS试剂，再向空白中加酶液0.1ml，混合均匀。在沸水中煮10min，迅速冷却。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。1ml液体酶，在50℃、pH5.0的条件下，每小时水解羧甲基纤维素钠，产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
如图6所示，Cel-Bi-m0及其突变体基因Cel-Bi-m1、Cel-Bi-m2和Cel-Bi-m3在里氏木霉中均成功实现了高效表达(图6)，其中Cel-Bi-m0表达菌株发酵165小时后的未浓缩粗酶液中酸性纤维素酶活力为4580U/mL，优化基因Cel-Bi-m1、Cel-Bi-m2和Cel-Bi-m3表达菌株发酵165小时未浓缩粗酶液中酸性纤维素酶活力分别为9060U/mL、2865U/mL、4399U/mL。结果表明，Bispora sp.MEY-1来源酸性纤维素酶基因Cel-Bi-m0经多种策略改造后得到的3个基因均能转入到里氏木霉中实现酸性纤维素酶Cel-Bi的表达。
实施例5：酸性纤维素酶Cel-Bi的性质测定
将实施例3获得的重组里氏木霉菌株接种于300mL的一级培养基，30℃，200rpm摇床培养120h；将培养菌液5500rpm离心5min，取上清，得到纯化的酸性纤维素酶Cel-Bi。
1、酸性纤维素酶Cel-Bi的最适pH和pH稳定性
25℃下，在不同pH的缓冲液中进行酶促反应测定酸性纤维素酶Cel-Bi活力，结果如图7A所示，酸性纤维素酶Cel-Bi的最适pH为4.0。
将酸性纤维素酶Cel-Bi于不同pH的缓冲液中30℃处理60min，再在pH4.0缓冲液体系中于55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果如图7B所示，酸性纤维素酶Cel-Bi在pH2.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％左右，表明此酶在酸性偏中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、酸性纤维素酶Cel-Bi的最适温度及热稳定性
不同温度下，使用酸性纤维素酶Cel-Bi在pH为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系中进行酶促反应，最适温度测定结果如图7C所示，Cel-Bi最适温度为70℃。
将酸性纤维素酶Cel-Bi在不同温度下处理不同时间后，再在55℃、pH4.0下进行酶活性测定。热稳定性试验结果如图7D所示，在里氏木霉中表达的重组酸性纤维素酶Cel-Bi在65℃处理10min后仍具有约90％的残余活性。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉新华扬生物股份有限公司
<120> 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 430
<212> PRT
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 1
Met Lys Ala Val Leu Phe Thr Ile Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Ser Ala Trp Tyr Val Ala Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp
20 25 30
Ser Gly Gly Thr Ala Cys Val Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Thr Tyr Asn
35 40 45
Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Thr Ser Thr Asp Gly Pro Ser
50 55 60
Thr Ala Thr Ser Val Lys Pro Met Thr Thr Thr Val His Thr Thr Ser
65 70 75 80
Val Lys Gln Thr Thr Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ala Ala
85 90 95
Ala Ser Ser Val Ser Ser Asp Ser Thr Ser Thr Ser Ser Gly His Val
100 105 110
Lys Tyr Gly Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys Ser Thr
115 120 125
Asp Gly Thr Cys Thr Leu Ser Ser Thr Asp Pro Pro Gly Glu Thr Gly
130 135 140
Ile Ala Gln Met Asn His Phe Val Lys Asn Asp Gly Leu Asn Ala Phe
145 150 155 160
Arg Leu Pro Val Ala Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly
165 170 175
Thr Leu Asp Ser Ala Asn Phe Ala Glu Tyr Asn Asp Leu Val Gln Gly
180 185 190
Cys Leu Ser Ala Gly Ala Glu Met Cys Ile Ile Asp Ile His Asn Tyr
195 200 205
Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala
210 215 220
Gln Phe Ala Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Thr Lys Phe Lys Ser Asn
225 230 235 240
Ser Lys Val Thr Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu Asp Met
245 250 255
Thr Glu Trp Ala Glu Ser Val Gln Ala Ala Val Thr Ala Ile Arg Lys
260 265 270
Ala Gly Ala Thr Ser Gln Lys Ile Leu Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr
275 280 285
Ser Ala Gln Asp Phe Gly Thr Asn Ser Gly Gln Tyr Leu Leu Lys Val
290 295 300
Thr Asn Leu Asp Gly Ser Thr Asp Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Asp Ala Asp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Glu Cys Val Thr Asn
325 330 335
Asn Ser Ala Val Phe Val Gln Leu Ala Glu Trp Leu Arg Ala Asn Lys
340 345 350
Arg Gln Ala Met Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Thr Ala Ser Cys
355 360 365
Glu Thr Asp Val Cys Glu Glu Leu Ala Val Leu Asn Ala His Ser Asp
370 375 380
Val Leu Leu Gly Trp Thr Gly Trp Ala Ala Gly Met Phe Asp Thr Ser
385 390 395 400
Tyr Ala Leu Ser Glu Thr Pro Thr Glu Ser Gly Ser Thr Trp Thr Asp
405 410 415
Gln Pro Leu Val Lys Lys Cys Ile Ala Gly Met Phe Lys Lys
420 425 430
<210> 2
<211> 408
<212> PRT
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 2
Tyr Val Ala Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser Gly Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
Val Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Thr Tyr Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys
20 25 30
Ile Pro Gly Thr Ser Thr Asp Gly Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Lys
35 40 45
Pro Met Thr Thr Thr Val His Thr Thr Ser Val Lys Gln Thr Thr Ser
50 55 60
Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ala Ala Ala Ser Ser Val Ser Ser
65 70 75 80
Asp Ser Thr Ser Thr Ser Ser Gly His Val Lys Tyr Gly Gly Val Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys Ser Thr Asp Gly Thr Cys Thr Leu
100 105 110
Ser Ser Thr Asp Pro Pro Gly Glu Thr Gly Ile Ala Gln Met Asn His
115 120 125
Phe Val Lys Asn Asp Gly Leu Asn Ala Phe Arg Leu Pro Val Ala Trp
130 135 140
Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Thr Leu Asp Ser Ala Asn
145 150 155 160
Phe Ala Glu Tyr Asn Asp Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser Ala Gly Ala
165 170 175
Glu Met Cys Ile Ile Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly
180 185 190
Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Leu Trp
195 200 205
Ser Gln Leu Ala Thr Lys Phe Lys Ser Asn Ser Lys Val Thr Phe Gly
210 215 220
Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu Asp Met Thr Glu Trp Ala Glu Ser
225 230 235 240
Val Gln Ala Ala Val Thr Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Thr Ser Gln
245 250 255
Lys Ile Leu Leu Pro Gly Thr Gly Tyr Thr Ser Ala Gln Asp Phe Gly
260 265 270
Thr Asn Ser Gly Gln Tyr Leu Leu Lys Val Thr Asn Leu Asp Gly Ser
275 280 285
Thr Asp Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ala Asp Asn
290 295 300
Ser Gly Thr Ser Thr Glu Cys Val Thr Asn Asn Ser Ala Val Phe Val
305 310 315 320
Gln Leu Ala Glu Trp Leu Arg Ala Asn Lys Arg Gln Ala Met Leu Thr
325 330 335
Glu Thr Gly Gly Gly Asn Thr Ala Ser Cys Glu Thr Asp Val Cys Glu
340 345 350
Glu Leu Ala Val Leu Asn Ala His Ser Asp Val Leu Leu Gly Trp Thr
355 360 365
Gly Trp Ala Ala Gly Met Phe Asp Thr Ser Tyr Ala Leu Ser Glu Thr
370 375 380
Pro Thr Glu Ser Gly Ser Thr Trp Thr Asp Gln Pro Leu Val Lys Lys
385 390 395 400
Cys Ile Ala Gly Met Phe Lys Lys
405
<210> 3
<211> 1224
<212> DNA
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 3
tacgtcgctc agtgcggtgg ccaaaactgg tccggcggca ccgcctgcgt ctccggctat 60
acctgcacca cctacaaccc ctactacgcc caatgtatcc ccggcacctc caccgacggc 120
ccgtccaccg ccacctccgt caagccgatg accacgaccg tccacaccac gtccgtcaag 180
caaaccacct ccacgtcctc cgccgctgct tccaccgccg ctgcctcctc cgtctcctcc 240
gactccacgt ccacgtcctc cggccacgtc aagtacggcg gcgtcaacat cgccggcttc 300
gacttcggct gctccacgga cggcacctgc accctctcct ccacggatcc ccccggcgag 360
accggcatcg ctcagatgaa ccacttcgtc aagaacgacg gcctcaacgc cttccgcctc 420
cccgtcgcct ggcagtacct cgtcaacaat aacctcggcg gcaccctcga ctccgccaac 480
ttcgccgagt acaacgacct cgtccaaggc tgcctctccg ccggcgccga gatgtgcatc 540
atcgacatcc acaattacgc ccgctggaac ggcggcatca tcggccaagg cggtcccacc 600
aacgctcagt tcgcctccct ctggtcccaa ctcgccacca agttcaagtc caactccaag 660
gtcaccttcg gcctcatgaa cgagccccac gacctcgaca tgaccgagtg ggccgagtcc 720
gtccaagccg ccgtcaccgc catccgcaag gccggcgcca cctcccaaaa gatcctcctc 780
cccggcaccg gctacacctc cgcccaagac ttcggcacca actccggtca gtatctcctc 840
aaggtcacca acctcgacgg ctccaccgac aacctcatct tcgacgtcca caagtacctc 900
gacgccgaca actccggtac ctccaccgag tgcgtcacca acaactccgc cgtcttcgtg 960
cagctcgccg agtggctccg cgccaacaag cgccaagcca tgctgaccga gaccggtggc 1020
ggcaacaccg cctcctgcga gaccgacgtc tgcgaggagc tcgccgtcct caacgcccat 1080
agcgacgtcc tcctcggttg gaccggctgg gccgctggca tgttcgacac gtcctacgcc 1140
ctctccgaga cccccaccga gtccggctcc acctggaccg atcagcccct cgtcaagaag 1200
tgcatcgccg gcatgttcaa aaag 1224
<210> 4
<211> 1224
<212> DNA
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 4
tacgtcgctc agtgtggcgg ccagaactgg tctggcggca ccgcttgcgt cagcggctac 60
acctgcacca cctacaaccc ctactacgcc cagtgcatcc ctggcaccag caccgacggc 120
ccttctaccg ctaccagcgt caagcctatg accaccaccg tccacaccac cagcgtcaag 180
cagaccacct ccaccagctc cgctgctgct agcaccgctg ctgcttctag cgtctcctct 240
gactccacct ctaccagctc cggccacgtc aagtacggcg gcgtcaacat cgccggcttc 300
gacttcggct gcagcaccga cggcacctgc accctctcta gcaccgaccc tcctggcgag 360
accggcatcg ctcagatgaa ccacttcgtc aagaacgacg gcctcaacgc tttccgactg 420
cctgtcgctt ggcagtacct ggtcaacaac aacctcggcg gcaccctgga cagcgctaac 480
ttcgccgagt acaacgacct cgtccagggc tgcctgtccg ctggcgccga gatgtgcatc 540
atcgacatcc acaactacgc ccgctggaac ggcggcatca tcggccaggg cggccctacc 600
aacgctcagt tcgcttccct ctggtctcag ctggccacca agttcaagag caactccaag 660
gtcaccttcg gcctcatgaa cgagccccac gacctggaca tgaccgagtg ggctgagtct 720
gtccaggctg ctgtcaccgc tatccgaaag gctggcgcca ccagccagaa gatcctcctg 780
cctggcaccg gctacacctc cgcccaggac ttcggcacca actctggcca gtacctcctg 840
aaggtcacca acctcgacgg cagcaccgac aacctgatct tcgacgtcca caagtacctc 900
gacgccgaca acagcggcac ctccaccgag tgcgtcacca acaactccgc tgtcttcgtc 960
cagctcgctg agtggctgcg agctaacaag cgacaggcta tgctgaccga gaccggcggc 1020
ggcaacaccg cttcctgcga gaccgacgtc tgcgaggagc tcgctgtcct gaacgcccac 1080
tctgacgtcc tcctgggctg gaccggctgg gctgctggca tgttcgacac ctcctacgcc 1140
ctctctgaga cccctaccga gtctggcagc acctggaccg accagcctct ggtcaagaag 1200
tgcatcgccg gcatgttcaa gaag 1224
<210> 5
<211> 1224
<212> DNA
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 5
tacgtcgccc agtgcggcgg tcagaactgg agcggcggca ccgcttgcgt cagcggttac 60
acctgcacca cctacaaccc ctactacgcc cagtgcatcc ctggcaccag caccgacggc 120
cccagcactg ctaccagcgt caagcctatg accaccaccg tccacaccac cagcgtcaag 180
cagaccacca gcaccagcag cgccgccgct agcaccgctg ctgctagcag cgtcagcagc 240
gacagcacca gcacctccag cggccacgtc aagtacggcg gcgtcaacat cgccggcttc 300
gacttcggct gcagcaccga cggtacctgc accctcagca gcaccgaccc ccctggcgag 360
accggtatcg cccagatgaa ccacttcgtc aagaacgacg gcctgaacgc cttccgcctc 420
cctgtcgcct ggcagtacct ggtcaacaac aacctcggcg gcaccctcga cagcgccaac 480
ttcgccgagt acaacgacct ggtccagggc tgcctcagcg ccggtgctga gatgtgcatc 540
atcgacatcc acaactacgc ccgctggaac ggcggcatca tcggccaggg cggccctact 600
aacgcccagt tcgccagcct ctggagccag ctcgccacca agttcaagag caacagcaag 660
gtcaccttcg gcctgatgaa cgagccccac gacctcgaca tgaccgagtg ggccgagagc 720
gtccaggccg ctgtcaccgc tatccgcaag gccggcgcca ccagccagaa gatcctgctc 780
cccggcaccg gctacaccag cgctcaggac ttcggcacca acagcggcca gtacctgctc 840
aaggtcacca acctcgacgg cagcaccgac aacctgatct tcgacgtcca caagtacctc 900
gacgccgaca acagcggcac cagcactgag tgcgtcacca acaacagcgc cgtcttcgtc 960
cagctcgccg agtggctgcg cgccaacaag cgccaggcca tgctcaccga gaccggcggt 1020
ggcaacaccg ccagctgcga gaccgacgtc tgcgaggagc tcgccgtcct caacgcccac 1080
agcgacgtcc tgctgggctg gaccggctgg gctgctggta tgttcgacac cagctacgcc 1140
ctgagcgaga cccccaccga gagcggtagc acctggaccg accagcctct ggtcaagaag 1200
tgcatcgccg gcatgttcaa gaag 1224
<210> 6
<211> 1224
<212> DNA
<213> Bispora sp. MEY-1
<400> 6
tacgtcgccc agtgcggcgg tcagaactgg agcggcggca ccgcttgcgt cagcggttac 60
acctgcacca cctacaaccc ctactacgcc cagtgcatcc ccggcaccag caccgacggc 120
cctagcactg ccaccagcgt caagcctatg accaccaccg tccacaccac cagcgtcaag 180
cagaccacca gcaccagcag cgccgccgct agcaccgctg ctgctagcag cgtcagcagc 240
gacagcacca gcacctccag cggccacgtc aagtacggcg gcgtcaacat cgccggcttc 300
gacttcggct gcagcaccga cggtacctgc accctgagca gcaccgaccc ccccggtgag 360
accggtatcg cccagatgaa ccacttcgtc aagaacgacg gcctgaacgc cttccgcctg 420
cccgtcgctt ggcagtacct ggtcaacaac aacctgggcg gcaccctgga cagcgccaac 480
ttcgccgagt acaacgacct cgtccagggc tgcctgagcg ccggtgctga gatgtgcatc 540
atcgacatcc acaactacgc ccgctggaac ggcggcatca tcggccaggg cggccctact 600
aacgcccagt tcgccagcct gtggagccag ctggccacca agttcaagag caacagcaag 660
gtcaccttcg gcctgatgaa cgagcctcac gacctggaca tgaccgagtg ggccgagagc 720
gtccaggccg ctgtcaccgc tatccgcaag gccggcgcca ccagccagaa gatcctcctg 780
cccggcaccg gctacaccag cgctcaggac ttcggcacca acagcggcca gtacctgctg 840
aaggtcacca acctggacgg cagcaccgac aacctgatct tcgacgtcca caagtacctc 900
gacgccgaca acagcggcac cagcactgag tgcgtcacca acaacagcgc cgtcttcgtc 960
cagctggccg agtggctccg cgccaacaag cgccaggcca tgctgaccga gaccggcggt 1020
ggcaacaccg ccagctgcga gaccgacgtc tgcgaggagc tcgccgtcct gaacgcccac 1080
agcgacgtcc tcctgggctg gaccggctgg gctgctggta tgttcgacac cagctacgcc 1140
ctgagcgaga cccccaccga gagcggtagc acctggaccg accagcccct ggtcaagaag 1200
tgcatcgccg gcatgttcaa gaag 1224

Claims (6)

1.一种酸性纤维素酶基因，其特征在于：所述酸性纤维素酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
2.一种包含如权利要求1所述酸性纤维素酶基因的重组载体。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pCbh1-Cel-Bi，其中，将酸性纤维素酶基因插入到表达载体pCbh1的SnaBI和EcoRI限制性酶切位点之间，使该基因位于pCbh1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pCbh1-Cel-Bi。
4.一种包含如权利要求1所述酸性纤维素酶基因的重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为里氏木霉。
6.一种制备酸性纤维素酶Cel-Bi的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用权利要求2或3中任意一项所述的重组载体转化里氏木霉，得到重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
(3)回收并纯化所表达的酸性纤维素酶Cel-Bi。
CN202111596412.2A 2021-12-24 2021-12-24 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用 Active CN114032228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111596412.2A CN114032228B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111596412.2A CN114032228B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114032228A CN114032228A (zh) 2022-02-11
CN114032228B true CN114032228B (zh) 2024-03-08

Family

ID=80141063

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111596412.2A Active CN114032228B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114032228B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996029397A1 (en) * 1995-03-17 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Novel endoglucanases
CA2239576A1 (en) * 1996-01-29 1997-08-07 Novo Nordisk A/S Process for removal or bleaching of soiling or stains from cellulosic fabric
CN105018448A (zh) * 2015-08-19 2015-11-04 中国农业科学院饲料研究所 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
CN106967701A (zh) * 2017-04-13 2017-07-21 中国农业科学院饲料研究所 酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用
CN109468302A (zh) * 2018-10-10 2019-03-15 深圳大学 一种纤维素酶基因及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996029397A1 (en) * 1995-03-17 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Novel endoglucanases
CA2239576A1 (en) * 1996-01-29 1997-08-07 Novo Nordisk A/S Process for removal or bleaching of soiling or stains from cellulosic fabric
CN105018448A (zh) * 2015-08-19 2015-11-04 中国农业科学院饲料研究所 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
CN106967701A (zh) * 2017-04-13 2017-07-21 中国农业科学院饲料研究所 酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用
CN109468302A (zh) * 2018-10-10 2019-03-15 深圳大学 一种纤维素酶基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114032228A (zh) 2022-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2041294T3 (en) CONSTRUCTION OF HIGH EFFECTIVE CELLULASE COMPOSITIONS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF CELLULOSE
CN110656099B (zh) 一种40℃下高比活木聚糖酶突变体及其构建方法与应用
JP2010536391A (ja) 補助酵素を使用するリグノセルロース系原料の酵素的加水分解
CN105018448B (zh) 一种真菌来源的耐热酸性纤维素酶及其基因和应用
CN104975039B (zh) 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
CN107254458A (zh) 一种里氏木霉几丁质酶及其制备方法和应用
EP0888455B1 (en) Alkaline cellulase and method of producing same
CN114107262B (zh) 一种高比活木聚糖酶突变体及其应用
CN113684198B (zh) 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2
CN110093326B (zh) 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
CN105154417B (zh) 一种真菌来源的酸性纤维素酶及其基因和应用
CN111770996B (zh) 突变β-葡萄糖苷酶
CN114032228B (zh) 一种酸性纤维素酶Cel-Bi及其基因和应用
CN115074345B (zh) 耐热β-1，4-内切木聚糖酶及其编码基因与应用
CN110564748B (zh) 一种茯苓纤维素内切酶基因及其表达载体和蛋白
CN112342208B (zh) 一种普鲁兰酶突变体
CN114381448A (zh) 一种葡聚糖酶突变体及其应用
CN111117986B (zh) 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用
CN114317500A (zh) 木聚糖酶Scxyn5及其编码基因和应用
CN114410562A (zh) 一种克雷伯氏菌工程菌及其在生产乙醇中的应用
CN109401991B (zh) 重组酿酒酵母及生料发酵生产乙醇的方法
CN112695022A (zh) 一种降解植物多糖的酶系及其应用
CN111757939A (zh) 突变β-葡萄糖苷酶
CN110484524B (zh) 阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码基因和应用
CN114507608B (zh) 一种在线粒体内生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant