CN110484524B

CN110484524B - 阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110484524B
Application number: CN201910820907.5A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 苏小运; 邢亚欣; 罗会颖; 黄火清; 王苑; 柏映国; 涂涛; 王亚茹; 张�杰; 师霞
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110484524A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码和应用。发明提供了一种来源于稻平脐蠕孢的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶能有效的降解不同结构类型的木聚糖尤其是玉米糠来源的木聚糖，可作为一种新型的酶制剂，广泛用于食品和饲料领域。

Description

阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码基因和应用。

背景技术

农业生产过程中会产生大量废弃物，如农作物收获时残留在农田内的农作物秸秆(包括玉米秸、高粱秸、稻草和小麦秸秆等)以及在农作物加工过程中产生的废弃物，比如米糠、麦麸和玉米糠(玉米皮)等，都属于可再生的生物质资源。然而由于植物纤维结构的复杂性,使用糖苷水解酶来降解其中的生物质多糖效率不高，例如，在生产生物燃料和生物基化学品时纤维素酶的成本是产品的主要成本，而在养殖领域，由于玉米皮中多糖的复杂侧链结构，很少有酶能有效的将其降解，因此阻碍了玉米中营养成分的释放。

木聚糖是植物细胞壁的重要组成成分，作为最常见的半纤维素，它连接细胞壁中的木质素和纤维素，是人类谷物来源食物的常见成分。木聚糖是自然界中除纤维素外第二丰富的可再生生物质多糖，并广泛存在于硬木、软木和草本类植物中。木聚糖的主链由木糖单元经β-1,4-糖苷键连接而成，其支链结构由于来源的不同而有所差异。异质性木聚糖侧链的存在限制了β-1,4-内切木聚糖酶和β-木糖苷酶与木聚糖的结合，从而降低了木聚糖的可降解性。侧链的组成成分主要包括阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸和4-甲基葡萄糖醛酸等。因此对于异质性木聚糖、尤其是如玉米糠类侧链结构极为复杂的异质性木聚糖，侧链必须首先被相应的阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡萄糖醛酸酶降解，才能使木聚糖主链发生有效的降解。木聚糖完全降解成单糖组分，需要不同酶混合使用，这包括内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、α-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。

阿拉伯呋喃糖苷酶在木聚糖酶法解聚中的功能是从异质性阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖的木糖主链去除阿拉伯糖侧链。阿拉伯呋喃糖苷酶主要存在于四个不同的家族(GH43、GH51、GH54和GH62)，它们使用反转(GH 43)或保留(GH 51、GH54)的机制来水解阿拉伯呋喃糖苷键。其中GH43家族的阿拉伯呋喃糖苷酶最为常见，此家族的成员具有不同的底物特异性。根据底物特异性，阿拉伯呋喃糖苷酶可分为三大类：(i)A型酶：仅对短链阿拉伯寡糖和pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷有活性(PITSON1996)；(ii)B型酶：底物特异性更广，能降解短寡糖和长多糖(如阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖)；(iii)C型酶：主要对阿拉伯木聚糖有活性。

由于阿拉伯糖侧链和木聚糖主链连接方式的不同，即使对于降解阿拉伯木聚糖寡糖的阿拉伯呋喃糖苷酶，还可以进一步依据它们是否仅从单取代的木糖残基(Ara-m)或仅从双取代的木糖残基(Ara-d)中释放α-L-阿拉伯糖来区分它们。例如，Ara-m是最常见的阿拉伯呋喃糖苷酶，它们只降解单取代的阿拉伯呋喃糖苷键，在所有GH家族中均能找到；从双取代的木糖主链切割α-(1→3)-连接的阿拉伯呋喃糖的酶则可被命名为Ara-d3，表明该酶可对于双取代底物切割的特异性。同Ara-m阿拉伯呋喃糖苷酶相比，Ara-d型阿拉伯呋喃糖苷酶发现的非常少。玉米糠是一种异质性木聚糖，并含有丰富的2,3-双取代阿拉伯糖侧链，而其有效的阿拉伯呋喃糖苷酶却较少发现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A。

本发明的再一目的在于提供上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的应用。

本发明的野生型的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1所示：

MRVSTVSSLSLLLAGLSVAGPVSDKRALSSRATTFNNPVIYQDYPDLDVFRIGDVFYYSSSTFAFSPGAPVLKSYDLVNWTPVTHSVPRLNFGSPYDLPNPTTRSYVKGIWASSLRYRKSSDKFIWMGCVQSTGQTYIWTAPGQNAAANNGEVSSWNWTAAGSINKCYYDNGIFIDDDDTMYVVHGNPAVRVAQLNKDGTAEVKNQEVYRDPNGLTLEGSRMYKINGTYYIFSTKPADDEWVLKSKSPWGPFEARILVDSISGPLSNAGHAHQGGVVDTKDGKWYYVAFLDSYPAGRIPVVAPLTFDNNGWPSVVKVNNAWGASYPTPVTTSKTVPALTGIDKFTGTSLSAEWEWNHNPDTSKFSLLGGAGGLKLSTATVTNDLYGARNTLTHRIIGPKSSGTFRLDISQMASGDRAGAVLFRDTAAYIGIHKSGSTASLVMVNGLELNADRTTKSTGTVVATGPAIPAGSTDLYLRIQADITPAFGTNTLRQATFWYSTDGTSYKQLGPSFGLANTWQFFTGFRYGVFNFATSAVGGSVTVKSFEMQKI*其中，该酶基因编码550个氨基酸，N端19个氨基酸为其信号肽序列，信号肽的序列如SEQ ID NO.2所示：

MRVSTVSSLSLLLAGLSVA

因此，成熟的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的理论分子量为57.8kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

GPVSDKRALSSRATTFNNPVIYQDYPDLDVFRIGDVFYYSSSTFAFSPGAPVLKSYDLVNWTPVTHSVPRLNFGSPYDLPNPTTRSYVKGIWASSLRYRKSSDKFIWMGCVQSTGQTYIWTAPGQNAAANNGEVSSWNWTAAGSINKCYYDNGIFIDDDDTMYVVHGNPAVRVAQLNKDGTAEVKNQEVYRDPNGLTLEGSRMYKINGTYYIFSTKPADDEWVLKSKSPWGPFEARILVDSISGPLSNAGHAHQGGVVDTKDGKWYYVAFLDSYPAGRIPVVAPLTFDNNGWPSVVKVNNAWGASYPTPVTTSKTVPALTGIDKFTGTSLSAEWEWNHNPDTSKFSLLGGAGGLKLSTATVTNDLYGARNTLTHRIIGPKSSGTFRLDISQMASGDRAGAVLFRDTAAYIGIHKSGSTASLVMVNGLELNADRTTKSTGTVVATGPAIPAGSTDLYLRIQADITPAFGTNTLRQATFWYSTDGTSYKQLGPSFGLANTWQFFTGFRYGVFNFATSAVGGSVTVKSFEMQKI*

本发明还提供了编码上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的基因序列，其基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

ATGCGCGTTTCTACTGTTTCTTCATTGTCGTTGCTCTTGGCGGGCTTGTCCGTTGCAGGACCCGTATCGGACAAGCGTGCGCTGTCGAGCCGCGCCACGACGTTTAACAACCCTGTTATATACCAAGACTATCCTGATCTTGACGTTTTCAGGATCGGAGATGTGTTCTATTACTCTTCATCGACCTTTGCGTTTAGTCCAGGAGCTCCCGTGCTCAAGTCGTACGACCTGGTGAACTGGACGCCCGTCACTCACAGTGTACCAAGACTGAACTTCGGCTCTCCATATGACCTGCCAAACCCGACTACCCGGTCTTATGTCAAGGGTATCTGGGCGAGTTCGTTGCGGTACCGTAAGTCGAGCGACAAGTTCATTTGGATGGGCTGTGTTCAATCGACGGGCCAGACATATATCTGGACAGCCCCCGGTCAAAACGCCGCTGCCAACAACGGCGAGGTATCGAGCTGGAACTGGACTGCTGCGGGTAGCATTAACAAATGCTACTACGACAACGGCATCTTCATCGATGACGACGACACCATGTATGTCGTGCACGGCAACCCTGCCGTTCGAGTTGCCCAACTCAACAAAGACGGCACAGCCGAAGTGAAGAACCAAGAGGTATACCGCGATCCTAACGGCCTCACTCTCGAGGGATCCCGCATGTACAAGATCAACGGCACCTACTACATCTTCTCGACCAAGCCCGCCGACGACGAATGGGTCCTGAAATCCAAGAGCCCCTGGGGTCCCTTCGAAGCCCGCATCCTCGTCGACAGCATCTCCGGCCCCCTCTCCAACGCCGGCCACGCCCACCAAGGCGGTGTCGTCGACACCAAAGACGGAAAATGGTACTACGTCGCCTTCCTCGACTCGTACCCCGCGGGCCGCATCCCCGTCGTCGCACCTCTCACCTTTGACAACAACGGCTGGCCTTCAGTCGTCAAGGTGAACAACGCCTGGGGTGCCTCCTACCCAACCCCCGTAACCACCAGCAAGACCGTCCCCGCACTCACTGGCATCGACAAATTCACCGGCACCTCACTCAGCGCAGAATGGGAATGGAACCATAACCCCGACACCTCCAAGTTCAGCCTCCTCGGCGGCGCAGGCGGTCTCAAACTCTCCACCGCAACCGTAACCAACGACCTCTACGGCGCCCGCAACACCCTCACCCACCGCATCATCGGCCCCAAGTCCTCCGGTACCTTCCGCCTCGACATCAGTCAAATGGCCTCCGGCGACCGCGCAGGCGCCGTCCTCTTCCGCGACACAGCCGCCTACATCGGCATCCACAAATCCGGCTCTACCGCCTCCCTCGTCATGGTCAACGGCCTCGAACTCAACGCCGACCGCACCACCAAATCCACCGGCACGGTGGTCGCTACAGGCCCGGCCATTCCCGCGGGCTCGACGGATTTGTACCTCAGGATCCAGGCGGATATCACACCCGCATTTGGAACAAACACCCTGCGCCAGGCGACGTTTTGGTACAGCACTGATGGCACATCGTACAAGCAGCTGGGACCGTCGTTTGGGCTCGCGAATACCTGGCAGTTTTTCACCGGGTTCAGGTATGGTGTTTTCAACTTTGCGACCAGTGCGGTGGGTGGCAGTGTTACGGTGAAGAGTTTTGAGATGCAGAAGATTTAA阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A编码基因序列全长1653bp。其中，信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.5所示：

ATGCGCGTTTCTACTGTTTCTTCATTGTCGTTGCTCTTGGCGGGCTTGTCCGTTGCA

成熟的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的核酸(去信号肽)序列如SEQ ID NO.6所示：

GGACCCGTATCGGACAAGCGTGCGCTGTCGAGCCGCGCCACGACGTTTAACAACCCTGTTATATACCAAGACTATCCTGATCTTGACGTTTTCAGGATCGGAGATGTGTTCTATTACTCTTCATCGACCTTTGCGTTTAGTCCAGGAGCTCCCGTGCTCAAGTCGTACGACCTGGTGAACTGGACGCCCGTCACTCACAGTGTACCAAGACTGAACTTCGGCTCTCCATATGACCTGCCAAACCCGACTACCCGGTCTTATGTCAAGGGTATCTGGGCGAGTTCGTTGCGGTACCGTAAGTCGAGCGACAAGTTCATTTGGATGGGCTGTGTTCAATCGACGGGCCAGACATATATCTGGACAGCCCCCGGTCAAAACGCCGCTGCCAACAACGGCGAGGTATCGAGCTGGAACTGGACTGCTGCGGGTAGCATTAACAAATGCTACTACGACAACGGCATCTTCATCGATGACGACGACACCATGTATGTCGTGCACGGCAACCCTGCCGTTCGAGTTGCCCAACTCAACAAAGACGGCACAGCCGAAGTGAAGAACCAAGAGGTATACCGCGATCCTAACGGCCTCACTCTCGAGGGATCCCGCATGTACAAGATCAACGGCACCTACTACATCTTCTCGACCAAGCCCGCCGACGACGAATGGGTCCTGAAATCCAAGAGCCCCTGGGGTCCCTTCGAAGCCCGCATCCTCGTCGACAGCATCTCCGGCCCCCTCTCCAACGCCGGCCACGCCCACCAAGGCGGTGTCGTCGACACCAAAGACGGAAAATGGTACTACGTCGCCTTCCTCGACTCGTACCCCGCGGGCCGCATCCCCGTCGTCGCACCTCTCACCTTTGACAACAACGGCTGGCCTTCAGTCGTCAAGGTGAACAACGCCTGGGGTGCCTCCTACCCAACCCCCGTAACCACCAGCAAGACCGTCCCCGCACTCACTGGCATCGACAAATTCACCGGCACCTCACTCAGCGCAGAATGGGAATGGAACCATAACCCCGACACCTCCAAGTTCAGCCTCCTCGGCGGCGCAGGCGGTCTCAAACTCTCCACCGCAACCGTAACCAACGACCTCTACGGCGCCCGCAACACCCTCACCCACCGCATCATCGGCCCCAAGTCCTCCGGTACCTTCCGCCTCGACATCAGTCAAATGGCCTCCGGCGACCGCGCAGGCGCCGTCCTCTTCCGCGACACAGCCGCCTACATCGGCATCCACAAATCCGGCTCTACCGCCTCCCTCGTCATGGTCAACGGCCTCGAACTCAACGCCGACCGCACCACCAAATCCACCGGCACGGTGGTCGCTACAGGCCCGGCCATTCCCGCGGGCTCGACGGATTTGTACCTCAGGATCCAGGCGGATATCACACCCGCATTTGGAACAAACACCCTGCGCCAGGCGACGTTTTGGTACAGCACTGATGGCACATCGTACAAGCAGCTGGGACCGTCGTTTGGGCTCGCGAATACCTGGCAGTTTTTCACCGGGTTCAGGTATGGTGTTTTCAACTTTGCGACCAGTGCGGTGGGTGGCAGTGTTACGGTGAAGAGTTTTGAGATGCAGAAGATTTAA

本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因的重组载体，优选为pPIC9γ-BoAra43A。将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A插入到质粒pPIC9γ上的EcoRI-NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX启动子的下游并受其调控，得到重组毕赤酵母表达质粒pPIC9γ-BoAra43A。

本发明还提供了包含上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/BoAra43A。

本发明还提供了一种制备阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的方法，包括以下步骤：

(1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组阿拉伯呋喃糖苷酶的表达；

(3)纯化阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A。

本发明提供了上述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的应用，尤其是在降解玉米糠木聚糖方面，其对水溶性小麦阿拉伯木聚糖、玉米糠碱提物具有良好的降解率。

本发明的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A能有效的降解不同结构类型的木聚糖，尤其是玉米糠来源的木聚糖，例如小麦阿拉伯木聚糖、玉米糠、玉米糠碱提物等，具有较好的底物特异性。BoAra43A的最适温度为50℃，最适pH为5.0，该酶在40℃和50℃温浴10min均可保持85％左右的酶活性，在pH 2.0-12.0的范围内37℃保温1h，BoAra43A均可以保持80％左右的酶活力。

附图说明

图1显示阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的酶学特性，其中，A为BoAra43A的最适温度；B为BoAra43A的最适pH；C为BoAra43A的热稳定性；D为BoAra43A的pH稳定性；

图2显示重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A降解多糖的HPAEC-PAD分析结果；其中，A：阿拉伯糖；X1-X6：木糖-木六糖；CX：玉米糠；CX-NaOH：玉米糠木聚糖(碱提法)；WAX：小麦阿拉伯木聚糖；箭头所指处为阿拉伯糖；

图3显示重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A降解寡糖的HPAEC-PAD分析结果；其中，A：阿拉伯糖；X1-X6：木糖-木六糖；A^2,3XX(2³,3³-di-α-L-阿拉伯呋喃糖基木三糖)：2³,3³-di-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose；XA^2,3XX(2³,3³-di-α-L-阿拉伯呋喃糖基木四糖)：2³,3³-di-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose；AAA^2,3A/AAA³A(2²,3²-di-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1,5)-α-L-阿拉伯三糖与3²-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1,5)-α-L-阿拉伯四糖)：2²,3²-di-α-L-arabinofuranosyl-(1,5)-α-L-arabinotriose plus3²-α-L-arabinofuranosyl-(1,5)-α-L-arabinotetraose。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、基因及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9γ及菌株GS115；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、水溶性小麦阿拉伯木聚糖、玉米糠碱提物。

3、培养基：

(1)MD培养基：葡萄糖2％，琼脂糖2％，使用前加入10％YNB，1‰生物素；

(2)BMGY：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，甘油2％，使用前加入10％YNB，1‰生物素；

(3)BMMY：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，使用前加入10％YNB，1‰生物素，0.5％甲醇；

(4)YNB：13.4g YNB定容至100mL。

实施例1阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A编码基因的克隆

本发明目的基因来源于稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)。设计特异性引物：

pPIC9γ-BoAra43A-F1：

5'-AGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCGGACCCGTATCGGACAAGCGTGCGC-3'；

pPIC9γ-BoAra43A-R1：

5'-TCACCAGGTCGTACGACTTGAGCACGGGAGCTCCTGGACTAAACGCAAAG-3'；

pPIC9γ-BoAra43A-F2：

5'-CTTTGCGTTTAGTCCAGGAGCTCCCGTGCTCAAGTCGTACGACCTGGTGA-3'；

pPIC9γ-BoAra43A-R2：

5'-TTAATTCGCGGCCGCTTAAATCTTCTGCATCTC-3'。

以带有目的基因的质粒为模板进行PCR扩增。

将已去除内含子和编码信号肽的部分的BoAra43A目的片段与pPIC9γ载体用重组酶连接，转化Trans1-T1，通过PCR和测序筛选获得重组表达质粒pPIC9γ-BoAra43A。

以同样的方式对BoAra43A基因含信号肽完整蛋白的编码区构建重组表达载体。

在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，切胶得到目的片段，将该片段回收后与EcoRI-NotI双酶切的pPIC9γ载体通过同源重组的方法相连，转化TransI克隆宿主，测序验证，得到阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A编码基因。

实施例2重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的制备

将获得的含有阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A重组大肠杆菌表达质粒pPIC9γ-BoAra43A转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/BoAra43A。

提取表达质粒用限制性内切酶BglⅡ线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板，30℃培养2d；待长出菌落后，挑取单克隆到3mL BMGY培养基中，30℃培养48h后4500r/min离心5min去上清，加入1.5mL BMMY培养基(0.5％V/V甲醇)进行诱导；诱导结束后，离心获得上清，测定阿拉伯呋喃糖苷酶酶活。将筛选获得的酶活最高的转化子进行摇瓶发酵培养，先在400mL BMGY中培养48h后，4500r/min离心5min去上清，然后用200mLBMMY培养基进行甲醇诱导(0.5％V/V甲醇)，每24h补加0.5％V/V甲醇进行持续诱导，48h后离心收集上清，用于后续蛋白纯化和酶学性质测定。

重组蛋白的纯化：蛋白等电点pI＝8.5，将酶液在pH＝6.5缓冲液条件下进行透析，由于pI>pH，因此选用阳离子柱进行纯化，在相应的峰下收集BoAra43A蛋白。

实施例3阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的酶学特性

以10mg/mL的小麦阿拉伯木聚糖、玉米糠、玉米糠碱提物作为底物，在50℃、pH 5.0的条件下进行还原糖测定，发现BoAra43A对三种底物均可测得一定活性，其中对小麦阿拉伯木聚糖的活性最高。使用HPAEC-PAD分析，发现从三种底物中均只释放出阿拉伯糖为最终产物，证明BoAra43A为阿拉伯糖呋喃糖苷酶。以pNPA为底物，未检测到相关活性。

选择活性最高的小麦阿拉伯木聚糖为底物，测得BoAra43A的最适温度为50℃，在40℃仍有68％活性，在30℃有60％活性。当孵育温度从50℃升为60℃，酶活快速下降至25％，并缓慢下降至80℃的12％，如图1中A所示。

如图1中B所示，BoAra43A的最适pH为5.0，在pH 3.0时仍有20％活性，在pH 7.0时有50％活性，但在pH 2.0和9.0活性下降至几乎检测不到。

如图1中C所示，该酶在40℃和50℃温浴10min均可保持85％左右的酶活性，在60℃温浴10min则基本丧失酶活力。在40℃保温2h后，阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A还可保持80％酶活性。但在50℃温浴30min只剩下20％左右的酶活性，温浴1h基本丧失酶活力。

如图1中D所示，在pH 2.0-12.0的范围内37℃保温1h，BoAra43A均可以保持80％左右的酶活力。

对小麦阿拉伯木聚糖，BoAra43A的比活为191.21U/mg，动力学常数Km和kcat分别是9.54mg/ml和1.043×10^-3s^-1。

实施例4重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A降解多糖

将水溶性阿拉伯木聚糖、玉米糠碱提物、玉米糠溶解到柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(0.1M，pH 5.0)中。以未加入重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在50℃下进行，4h后煮沸失活。采用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析降解产物。离子色谱为赛默飞Chromeleon高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为CarboPac^TMPA100(4.0×250mm,8.5μm)，流动相A(超纯水)，流动相D(1M的NaOH)；梯度洗脱条件0％A洗脱4分钟，0％-100％D洗脱16分钟，0％D洗脱6分钟。

结果如图2所示，三种多糖的侧链均可被降解生成阿拉伯糖，其中，X1-X6为标品，标品能够很好地确定具有特征量值的物质，X1-X6依次在对应时间段出峰，对比出峰时间可对样品中的物质构成进行定性分析。

实施例5重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A降解寡糖

将寡糖A^2,3XX、XA^2,3XX和AAA^2,3A/AAA³A溶解到柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(0.1M，pH5.0)中。以未加入重组阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在50℃下进行，4h后煮沸失活。采用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析降解产物。离子色谱为赛默飞Chromeleon高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为CarboPac^TM PA100(4.0×250mm,8.5μm)，流动相A(超纯水)，流动相D(1M的NaOH)；梯度洗脱条件0％A洗脱4分钟，0％-100％D洗脱16分钟，0％D洗脱6分钟。

结果如图3所示，三种寡糖的侧链均可被降解生成阿拉伯糖。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A及其编码基因和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 1

Met Arg Val Ser Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ser Val Ala Gly Pro Val Ser Asp Lys Arg Ala Leu Ser Ser Arg Ala

20 25 30

Thr Thr Phe Asn Asn Pro Val Ile Tyr Gln Asp Tyr Pro Asp Leu Asp

35 40 45

Val Phe Arg Ile Gly Asp Val Phe Tyr Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Ala

50 55 60

Phe Ser Pro Gly Ala Pro Val Leu Lys Ser Tyr Asp Leu Val Asn Trp

65 70 75 80

Thr Pro Val Thr His Ser Val Pro Arg Leu Asn Phe Gly Ser Pro Tyr

85 90 95

Asp Leu Pro Asn Pro Thr Thr Arg Ser Tyr Val Lys Gly Ile Trp Ala

100 105 110

Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Lys Ser Ser Asp Lys Phe Ile Trp Met Gly

115 120 125

Cys Val Gln Ser Thr Gly Gln Thr Tyr Ile Trp Thr Ala Pro Gly Gln

130 135 140

Asn Ala Ala Ala Asn Asn Gly Glu Val Ser Ser Trp Asn Trp Thr Ala

145 150 155 160

Ala Gly Ser Ile Asn Lys Cys Tyr Tyr Asp Asn Gly Ile Phe Ile Asp

165 170 175

Asp Asp Asp Thr Met Tyr Val Val His Gly Asn Pro Ala Val Arg Val

180 185 190

Ala Gln Leu Asn Lys Asp Gly Thr Ala Glu Val Lys Asn Gln Glu Val

195 200 205

Tyr Arg Asp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Glu Gly Ser Arg Met Tyr Lys

210 215 220

Ile Asn Gly Thr Tyr Tyr Ile Phe Ser Thr Lys Pro Ala Asp Asp Glu

225 230 235 240

Trp Val Leu Lys Ser Lys Ser Pro Trp Gly Pro Phe Glu Ala Arg Ile

245 250 255

Leu Val Asp Ser Ile Ser Gly Pro Leu Ser Asn Ala Gly His Ala His

260 265 270

Gln Gly Gly Val Val Asp Thr Lys Asp Gly Lys Trp Tyr Tyr Val Ala

275 280 285

Phe Leu Asp Ser Tyr Pro Ala Gly Arg Ile Pro Val Val Ala Pro Leu

290 295 300

Thr Phe Asp Asn Asn Gly Trp Pro Ser Val Val Lys Val Asn Asn Ala

305 310 315 320

Trp Gly Ala Ser Tyr Pro Thr Pro Val Thr Thr Ser Lys Thr Val Pro

325 330 335

Ala Leu Thr Gly Ile Asp Lys Phe Thr Gly Thr Ser Leu Ser Ala Glu

340 345 350

Trp Glu Trp Asn His Asn Pro Asp Thr Ser Lys Phe Ser Leu Leu Gly

355 360 365

Gly Ala Gly Gly Leu Lys Leu Ser Thr Ala Thr Val Thr Asn Asp Leu

370 375 380

Tyr Gly Ala Arg Asn Thr Leu Thr His Arg Ile Ile Gly Pro Lys Ser

385 390 395 400

Ser Gly Thr Phe Arg Leu Asp Ile Ser Gln Met Ala Ser Gly Asp Arg

405 410 415

Ala Gly Ala Val Leu Phe Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Ile His

420 425 430

Lys Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Val Met Val Asn Gly Leu Glu Leu

435 440 445

Asn Ala Asp Arg Thr Thr Lys Ser Thr Gly Thr Val Val Ala Thr Gly

450 455 460

Pro Ala Ile Pro Ala Gly Ser Thr Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Gln Ala

465 470 475 480

Asp Ile Thr Pro Ala Phe Gly Thr Asn Thr Leu Arg Gln Ala Thr Phe

485 490 495

Trp Tyr Ser Thr Asp Gly Thr Ser Tyr Lys Gln Leu Gly Pro Ser Phe

500 505 510

Gly Leu Ala Asn Thr Trp Gln Phe Phe Thr Gly Phe Arg Tyr Gly Val

515 520 525

Phe Asn Phe Ala Thr Ser Ala Val Gly Gly Ser Val Thr Val Lys Ser

530 535 540

Phe Glu Met Gln Lys Ile

545 550

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 2

Met Arg Val Ser Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ser Val Ala

<210> 3

<211> 531

<212> PRT

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 3

Gly Pro Val Ser Asp Lys Arg Ala Leu Ser Ser Arg Ala Thr Thr Phe

1 5 10 15

Asn Asn Pro Val Ile Tyr Gln Asp Tyr Pro Asp Leu Asp Val Phe Arg

20 25 30

Ile Gly Asp Val Phe Tyr Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Ala Phe Ser Pro

35 40 45

Gly Ala Pro Val Leu Lys Ser Tyr Asp Leu Val Asn Trp Thr Pro Val

50 55 60

Thr His Ser Val Pro Arg Leu Asn Phe Gly Ser Pro Tyr Asp Leu Pro

65 70 75 80

Asn Pro Thr Thr Arg Ser Tyr Val Lys Gly Ile Trp Ala Ser Ser Leu

85 90 95

Arg Tyr Arg Lys Ser Ser Asp Lys Phe Ile Trp Met Gly Cys Val Gln

100 105 110

Ser Thr Gly Gln Thr Tyr Ile Trp Thr Ala Pro Gly Gln Asn Ala Ala

115 120 125

Ala Asn Asn Gly Glu Val Ser Ser Trp Asn Trp Thr Ala Ala Gly Ser

130 135 140

Ile Asn Lys Cys Tyr Tyr Asp Asn Gly Ile Phe Ile Asp Asp Asp Asp

145 150 155 160

Thr Met Tyr Val Val His Gly Asn Pro Ala Val Arg Val Ala Gln Leu

165 170 175

Asn Lys Asp Gly Thr Ala Glu Val Lys Asn Gln Glu Val Tyr Arg Asp

180 185 190

Pro Asn Gly Leu Thr Leu Glu Gly Ser Arg Met Tyr Lys Ile Asn Gly

195 200 205

Thr Tyr Tyr Ile Phe Ser Thr Lys Pro Ala Asp Asp Glu Trp Val Leu

210 215 220

Lys Ser Lys Ser Pro Trp Gly Pro Phe Glu Ala Arg Ile Leu Val Asp

225 230 235 240

Ser Ile Ser Gly Pro Leu Ser Asn Ala Gly His Ala His Gln Gly Gly

245 250 255

Val Val Asp Thr Lys Asp Gly Lys Trp Tyr Tyr Val Ala Phe Leu Asp

260 265 270

Ser Tyr Pro Ala Gly Arg Ile Pro Val Val Ala Pro Leu Thr Phe Asp

275 280 285

Asn Asn Gly Trp Pro Ser Val Val Lys Val Asn Asn Ala Trp Gly Ala

290 295 300

Ser Tyr Pro Thr Pro Val Thr Thr Ser Lys Thr Val Pro Ala Leu Thr

305 310 315 320

Gly Ile Asp Lys Phe Thr Gly Thr Ser Leu Ser Ala Glu Trp Glu Trp

325 330 335

Asn His Asn Pro Asp Thr Ser Lys Phe Ser Leu Leu Gly Gly Ala Gly

340 345 350

Gly Leu Lys Leu Ser Thr Ala Thr Val Thr Asn Asp Leu Tyr Gly Ala

355 360 365

Arg Asn Thr Leu Thr His Arg Ile Ile Gly Pro Lys Ser Ser Gly Thr

370 375 380

Phe Arg Leu Asp Ile Ser Gln Met Ala Ser Gly Asp Arg Ala Gly Ala

385 390 395 400

Val Leu Phe Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Ile His Lys Ser Gly

405 410 415

Ser Thr Ala Ser Leu Val Met Val Asn Gly Leu Glu Leu Asn Ala Asp

420 425 430

Arg Thr Thr Lys Ser Thr Gly Thr Val Val Ala Thr Gly Pro Ala Ile

435 440 445

Pro Ala Gly Ser Thr Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Gln Ala Asp Ile Thr

450 455 460

Pro Ala Phe Gly Thr Asn Thr Leu Arg Gln Ala Thr Phe Trp Tyr Ser

465 470 475 480

Thr Asp Gly Thr Ser Tyr Lys Gln Leu Gly Pro Ser Phe Gly Leu Ala

485 490 495

Asn Thr Trp Gln Phe Phe Thr Gly Phe Arg Tyr Gly Val Phe Asn Phe

500 505 510

Ala Thr Ser Ala Val Gly Gly Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Glu Met

515 520 525

Gln Lys Ile

530

<210> 4

<211> 1653

<212> DNA

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 4

atgcgcgttt ctactgtttc ttcattgtcg ttgctcttgg cgggcttgtc cgttgcagga 60

cccgtatcgg acaagcgtgc gctgtcgagc cgcgccacga cgtttaacaa ccctgttata 120

taccaagact atcctgatct tgacgttttc aggatcggag atgtgttcta ttactcttca 180

tcgacctttg cgtttagtcc aggagctccc gtgctcaagt cgtacgacct ggtgaactgg 240

acgcccgtca ctcacagtgt accaagactg aacttcggct ctccatatga cctgccaaac 300

ccgactaccc ggtcttatgt caagggtatc tgggcgagtt cgttgcggta ccgtaagtcg 360

agcgacaagt tcatttggat gggctgtgtt caatcgacgg gccagacata tatctggaca 420

gcccccggtc aaaacgccgc tgccaacaac ggcgaggtat cgagctggaa ctggactgct 480

gcgggtagca ttaacaaatg ctactacgac aacggcatct tcatcgatga cgacgacacc 540

atgtatgtcg tgcacggcaa ccctgccgtt cgagttgccc aactcaacaa agacggcaca 600

gccgaagtga agaaccaaga ggtataccgc gatcctaacg gcctcactct cgagggatcc 660

cgcatgtaca agatcaacgg cacctactac atcttctcga ccaagcccgc cgacgacgaa 720

tgggtcctga aatccaagag cccctggggt cccttcgaag cccgcatcct cgtcgacagc 780

atctccggcc ccctctccaa cgccggccac gcccaccaag gcggtgtcgt cgacaccaaa 840

gacggaaaat ggtactacgt cgccttcctc gactcgtacc ccgcgggccg catccccgtc 900

gtcgcacctc tcacctttga caacaacggc tggccttcag tcgtcaaggt gaacaacgcc 960

tggggtgcct cctacccaac ccccgtaacc accagcaaga ccgtccccgc actcactggc 1020

atcgacaaat tcaccggcac ctcactcagc gcagaatggg aatggaacca taaccccgac 1080

acctccaagt tcagcctcct cggcggcgca ggcggtctca aactctccac cgcaaccgta 1140

accaacgacc tctacggcgc ccgcaacacc ctcacccacc gcatcatcgg ccccaagtcc 1200

tccggtacct tccgcctcga catcagtcaa atggcctccg gcgaccgcgc aggcgccgtc 1260

ctcttccgcg acacagccgc ctacatcggc atccacaaat ccggctctac cgcctccctc 1320

gtcatggtca acggcctcga actcaacgcc gaccgcacca ccaaatccac cggcacggtg 1380

gtcgctacag gcccggccat tcccgcgggc tcgacggatt tgtacctcag gatccaggcg 1440

gatatcacac ccgcatttgg aacaaacacc ctgcgccagg cgacgttttg gtacagcact 1500

gatggcacat cgtacaagca gctgggaccg tcgtttgggc tcgcgaatac ctggcagttt 1560

ttcaccgggt tcaggtatgg tgttttcaac tttgcgacca gtgcggtggg tggcagtgtt 1620

acggtgaaga gttttgagat gcagaagatt taa 1653

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 5

atgcgcgttt ctactgtttc ttcattgtcg ttgctcttgg cgggcttgtc cgttgca 57

<210> 6

<211> 1596

<212> DNA

<213> 稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)

<400> 6

ggacccgtat cggacaagcg tgcgctgtcg agccgcgcca cgacgtttaa caaccctgtt 60

atataccaag actatcctga tcttgacgtt ttcaggatcg gagatgtgtt ctattactct 120

tcatcgacct ttgcgtttag tccaggagct cccgtgctca agtcgtacga cctggtgaac 180

tggacgcccg tcactcacag tgtaccaaga ctgaacttcg gctctccata tgacctgcca 240

aacccgacta cccggtctta tgtcaagggt atctgggcga gttcgttgcg gtaccgtaag 300

tcgagcgaca agttcatttg gatgggctgt gttcaatcga cgggccagac atatatctgg 360

acagcccccg gtcaaaacgc cgctgccaac aacggcgagg tatcgagctg gaactggact 420

gctgcgggta gcattaacaa atgctactac gacaacggca tcttcatcga tgacgacgac 480

accatgtatg tcgtgcacgg caaccctgcc gttcgagttg cccaactcaa caaagacggc 540

acagccgaag tgaagaacca agaggtatac cgcgatccta acggcctcac tctcgaggga 600

tcccgcatgt acaagatcaa cggcacctac tacatcttct cgaccaagcc cgccgacgac 660

gaatgggtcc tgaaatccaa gagcccctgg ggtcccttcg aagcccgcat cctcgtcgac 720

agcatctccg gccccctctc caacgccggc cacgcccacc aaggcggtgt cgtcgacacc 780

aaagacggaa aatggtacta cgtcgccttc ctcgactcgt accccgcggg ccgcatcccc 840

gtcgtcgcac ctctcacctt tgacaacaac ggctggcctt cagtcgtcaa ggtgaacaac 900

gcctggggtg cctcctaccc aacccccgta accaccagca agaccgtccc cgcactcact 960

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gtggtcgcta caggcccggc cattcccgcg ggctcgacgg atttgtacct caggatccag 1380

gcggatatca cacccgcatt tggaacaaac accctgcgcc aggcgacgtt ttggtacagc 1440

actgatggca catcgtacaa gcagctggga ccgtcgtttg ggctcgcgaa tacctggcag 1500

tttttcaccg ggttcaggta tggtgttttc aactttgcga ccagtgcggt gggtggcagt 1560

gttacggtga agagttttga gatgcagaag atttaa 1596

Claims

1.阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3所示。

2.阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A。

3.根据权利要求2所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。

4.包含权利要求2所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)用包含编码阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养所述重组菌株，诱导阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A表达；

(3)分离纯化所述阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A。

7.权利要求1所述的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A在降解玉米糠木聚糖方面的应用。