DE69838910T2 - Endo-beta-1,4-glukanasen aus saccharothrix - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Endo-β-1,4-Glucanasenpräparation, die aus einem Saccharothrix-Stamm stammt, ein isoliertes Polynukleotidmolekül kodierend für eine Endo-β-1,4-Glucanase, ein isoliertes Enzym, hergestellt durch rekombinante Techniken, und die Verwendung der Präparation oder das Enzyms in dem Detergens, Papier und Pulpe, Ölbohrung, Ölextraktion, Wein und Saft, Nahrungsmittel-Inhaltsstoffe, Tierfutter und Textilindustrien.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Zellulose ist ein Polymer aus Glukose, die über β-1,4-glykosidische Bindungen verknüpft ist. Zelluloseketten bilden zahlreiche intra- und intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen, welche in der Bildung von unlöslichen Zellulose-Mikrofibrillen resultieren. Mikrobielle Hydrolyse von Zellulose zu Glukose bezieht die folgenden drei Hauptklassen von Zellulasen ein: (i) Endoglucanasen (EC 3.2.1.4) welche β-1,4-glykosidische Verknüpfungen zufällig überall in Zellulosemolekülen spalten; (ii) Zellobiohydrolasen (EC 3.2.1.91), welche Zellulose vom nichtreduzierenden Ende her verdauen, wobei Zellobiose freigesetzt wird; und (iii) β-Glycosidasen (EC 3.2.1.21) welche Zellobiose und Zellodextrine von niedrigem Molekulargewicht hydrolysieren, so dass Glukose freigesetzt wird.
  • Zellulasen werden von vielen Mikroorganismen produziert und liegen oft in vielen Formen vor. Die Erkennung der wirtschaftlichen Bedeutung des enzymatischen Abbaus von Zellulose hat eine intensive Suche nach mikrobiellen Zellulasen gefördert, welche industriell verwendet werden können. Als ein Ergebnis sind die enzymatischen Eigenschaften und die Primärstrukturen einer großen Zahl von Zellulasen untersucht worden. Auf Basis der Ergebnisse einer Analyse der hydrophoben Cluster der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne sind diese Zellulasen in verschiedene Familien von Glycosylhydrolasen aufgeteilt worden; Pilz- und bakterielle Glycosylhydrolasen sind in 35 Familien gruppiert worden (Henrissat et al. (1991), (1993)). Die meisten Zellulasen bestehen aus einer Zellulosebindedomaine (CBD, cellulose-bindung domain) und einer katalytischen Domäne (CAD, catalytic domain), die durch einen Linker, der reich an Prolin und Hydroxyaminosäureresten sein kann, getrennt werden. Eine andere Klassifikation von Zellulasen ist auf der Basis der Ähnlichkeit ihrer CBDs (Gilkes et al. (1991)) aufgestellt worden, was fünf Familien von Glycosylhydrolasen (I-V) ergibt.
  • Zellulasen werden durch eine große Zahl von Mikroorganismen synthesisiert, welche Pilze, Actinomyzeten, Myxobakterien und echte Bakterien einschließen, aber auch durch Pflanzen. Insbesondere Endo-β-1,4-Glucanasen einer großen Vielzahl von Spezifitäten sind identifiziert worden. Viele bakterielle Endoglucanasen sind beschrieben worden (Henrissat (1993); Gilbert et al., (1993)).
  • Gemäß dem NCBI Taxonomy Browser (Internet-Adresse:
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html) gehört die taxonomische Familie Pseudonocardiaceae zu der Ordnung der Actinomycetes (Actinomyzeten) unter der Klasse der Gram-positiven Bakterien (Firmicutes) und erfasst die Gattungen Actinokineospora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis, Kibdelosporangium, Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Saccharothrix, und Thermocrispum. Gemäß der Taxonomie von Bakterien und Archaea bezieht sich auf das ribosomale Datenbankprojekt (Ribosomal Database Project. (B. L. Maidak et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 82-85)) umfasst der Gram-positive Stamm und die Untergruppe mit hohen mol.-% G + C die Gruppe Streptomyces (z. B. Kitasatosporia setae, Streptomyces alborgriseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces celluflavus, Streptomyces flavogriseus und Streptomyces griseus), die Arthrobaktergruppe (z. B. Cellulomonas fimi, Cellulomonas gelida, Cellulomonas flavigena und Cellulomonas uda) und die Sachharopolysporagruppe (z. B. Thermomonospora curvata, Thermomonospora mesouviformis micromonospora inositola, Saccharothix australiensis, Saccharothrix longispora, Saccharothrix mutabilis, Amycolatopsis mediterraner und Nocardiopsis albus).
  • Eine sehr wichtige industrielle Verwendung von zellulolytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung von zelluloseartigem Textil oder Gewebe, z. B. als Zusätze in Waschmittelzusammensetzungen oder als Gewebeweichmacherzusammensetzungen, zum Biopolishing von neuem Gewebe (zur Bekleidungsbehandlung) und zum Erhalten eines "stone-washed" Aussehens von zellulosehaltigem, Gewebe insbesondere Jeansgewebe, und verschiedene Verfahren für eine solche Behandlung sind vorgeschlagen worden, z. B. in GB-A-1 368 599 , EP-A-0 307 564 und EP-A-0 435 876 , WO 91/17243 , WO 91/10732 , WO 91/17244 , PCT/DK95/000108 und PCT/DK95/00132 . Eine andere wichtige industrielle Verwendung von zellulolytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung von Papier-Pulpe, z. B. zum Verbessern des Abflusses oder zum Entfernen von Tinte aus wiederverwendetem Papier.
  • Es gibt einen ständig vorhandenen Bedarf zum Bereitstellen neuer Zellulase-Enzyme oder Enzympräparationen welche für Anwendungen verwendet werden können, in welchen Zellulaseaktivität, vorzugsweise eine Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität, wünschenswert ist.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue Enzyme und Enzymzusammensetzungen bereitzustellen, die eine erhebliche zellulolytische Aktivität unter leicht sauren bis basischen Bedingungen haben und verbesserte Leistung in der Papier-Pulpe, der Textilbehandlung, Waschverfahren, Extraktionsverfahren oder in Tierfutter haben; vorzugsweise sind solche neuen leistungsstarken Endoglucanasen herstellbar oder hergestellt unter Verwendung rekombinanter Techniken mit hohen Ausbeuten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist nun gefunden worden, dass eine Vielzahl von Stämmen, die zu der Gattung Saccharothrix gehören, ein Enzym produzieren, dass eine erhebliche zellulolytische Aktivität hat, d. h. eine Endo-β-1,4-Glucanase, welche endogen in Saccharothrix vorkommt, und die Er finder haben erfolgreich eine DANN-Sequenz kloniert und exprimiert, die für ein solches Enzym kodiert.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine Enzymzusammensetzung umfassend einen Enzym, das eine Endo-β-1,4-Glucanaseaktivität hat, welche erhalten werden kann aus oder endogen in einem Stamm vorkommt, der zur Gattung Saccharothrix gehört, vorzugsweise gehörend zu einem Stamm ausgewählt aus den Arten Saccharothrix australiensis, Saccharothrix texasensis, Saccharothrix waywayandensis, Saccharothrix cryophilis, Saccharothrix flava, Saccharothrix coeruleofusca, Saccharothrix longispora, Saccharothrix mutabilis ssp. capreolus, Saccharothrix aerocolonigenes, Saccharothrix mutabilis ssp. mutabilis, Saccharothrix syringae, Saccharothrix sp., und in ihrem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynukleotidmolekül, vorzugsweise ein DNA-Molekül, kodierend für ein Enzym oder einen Enzymkern (d. h. die katalytisch aktive Domäne des Enzyms), das eine Endo-β-1,4-Glukanaseaktivität zeigt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynukleotidmoleküle umfassend eine Nukleotidsequenz wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 676 bis Nukleotid 1470, (b) Polynukleotidmolekül, die für ein Polypeptid kodieren das mindestens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 226 bis Aminosäurerest 490, und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); vorzugsweise ein Poly-Nukleotidmolekül, das in der Lage ist, zu einer denaturierten doppelsträngigen DNA-Probe unter Bedingungen mittlerer Stringenz zu hybridisieren, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Proben umfassend die Sequenz gezeigt in den Positionen 676–1470 von SEQ ID NO: 1 und DNA-Proben umfassend eine Teilsequenz von Positionen 676–1470 von SEQ ID NO: 1, die eine Länge von mindestens etwa 100 Basenpaaren hat.
  • Ein Plasmid pSJ1678 umfassend eine DNA-Sequenz, die für eine Endoglucanase der Erfindung kodiert, ist in einen Stamm von Escherichia coli transformiert worden, welcher von den Erfindern gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der Deut schen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, am 17. März 1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM 11476 hinterlegt worden ist.
  • In ihrem dritten, vierten und fünften Aspekt betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor umfassend einen DNA-Abschnitt, welcher zum Beispiel ein Polynukleotid der Erfindung ist; eine Zelle umfassend den DNA-Abschnitt oder Expressionsvektor; und ein Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, dass zellulolytische Aktivität zeigt, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Enzym bereit, das zellulolytische Aktivität zeigt, dadurch gekennzeichnet, dass es (i) frei von homologen Verunreinigungen ist, und (ii) dass das Enzym durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Endo-beta-1,4-Glucanase, die entweder ein Polypeptid ist, das von Saccharothrix australiensis, IFO 14444 produziert wird, oder ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz wie gezeigt in den Positionen 226–490 von SEQ ID NO: 2 oder ein Analogon von irgendeinem dieser Polypeptide welches mindestens 75% homolog dazu ist.
  • Des Weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von einem solchen Enzym oder einer solchen Enzympräparation der Erfindung für industrielle Anwendungen wie zum Beispiel in einer Detergenszusammensetzung oder einer Gewebeweichmacherzusammensetzung die für häusliche oder industrielle Verwendung in konventionellen Wäschewaschverfahren gedacht ist; in industriellen Reinigungsverfahren; und in der Textilindustrie zum Verbessern der Eigenschaften von zelluloseartigen Fasern oder Gewebe oder zum Bereitstellen eines stone-washed Aussehens von einem Jeansstoff.
  • Die Erfindung betrifft auch eine isolierte im Wesentlichen reine biologische Kultur des Escherichia coli Stammes DSM 11476, die eine DNA-Sequenz kodierend für eine Zellulase enthält (der zellulasekodierende Abschnitt der DNA-Sequenz, kloniert in das Plasmid pSJ1678, vorliegend in Escherichia coli DSM 11476, abstammend von einem Stamm der bakteriellen Art Saccharothrix australiensis, oder irgendeine Mutante von besagtem E. coli Stamm.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das Enzym oder die Enzympräparation der Erfindung ist aus einem Stamm oder kommt in einem Stamm vor, der zu der Gattung Saccharothrix gehört, vorzugsweise aus der Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharothrix australiensis, Saccharothrix texasensis, Saccharothrix waywayandensis, Saccharothrix cryophilis, Saccharothrix flava, Saccharothrix coeruleofusca, Saccharothrix longispora, Saccharothrix mutabilis ssp. capreolus, Saccharothrix aerocolonigenes, Saccharothrix mutabilis ssp. mutabilis, Saccharothrix syringae, Saccharothrix sp. Beispiele für brauchbare Stämme sind Saccharothrix australiensis IFO 14444, Saccharothrix texasensis, NRRL B-16134, Saccharothrix waywayandensis, NRRL B-16159, Saccharothrix cryophilis, NRRL B-16238, Saccharothrix sp., IFO 13785, Saccharothrix flava, ATCC 29533, Saccharolhrix coeruleofusca (Actinomadura coeruleofusca), ATCC 35108 oder DSM 43679, Saccharothrix longispora (Actinomadura longispora), ATCC 31109 oder DSM 43749, Saccharothrix mutabilis ssp. mutabilis, ATCC 31520, Saccharothrix aerocolonigenes, ATCC 23870, Saccharothrix mutabilis ssp. capreolus, ATCC 23892, Saccharothrix mutabilis, DSM 40225 oder DSM 43853, Saccharothrix syringae, DSM 43886.
  • Das Enzym oder die Enzympräparation der Erfindung ist über einen breiten pH-Bereich aktiv, vorzugsweise aktiv bei einem pH zwischen etwa 4 und etwa 11, vorzugsweise zwischen etwa 5,5 und etwa 10.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform gehört das Enzym oder die Enzympräparation der Erfindung zu der Familie 6 der Glykosylhydrolasen (Henrissat et al., op. cit.).
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff "Expressionsvektor" ein lineares oder zirkuläres DNA Molekül, das einen Abschnitt umfasst, der für ein interessierendes Polypeptid kodiert, funktionell verknüpft mit zusätzlichen Abschnitten, die für seine Transkription sorgen. Solche zusätzlichen Abschnitte können Promotor- und Terminator-Sequenzen einschließen und können optional ein oder mehrere Replikationsursprünge (origins of replication) einschließen, einen oder mehrere Selektionsmarker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal und ähnliches. Expressionsvektoren stammen im Allgemeinen von Plasmid- oder viraler DNA, oder sie können Elemente von beiden enthalten. Der Expressionsvektor der Erfindung kann irgendein Expressionsvektor sein, der auf bequeme Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in welche der Vektor eingeführt werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, dessen Replikation von chromosomaler Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, welcher, wem er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en) repliziert, in welche er integriert worden ist.
  • Der Begriff "rekombiniertes exprimiert" oder "rekombinant exprimiert", der hier in Verbindung mit der Expression eines Polypeptides oder Proteins verwendet wird, wird gemäß der Standarddefinition in der Technik verwendet. Rekombinante Expression eines Proteins wird im Allgemeinen unter Verwendung eines Expressionsvektors wie unmittelbar zuvor beschrieben durchgeführt.
  • Der Begriff "isoliert" bezeichnet, wenn er auf ein Polynukleotidmolekül angewandt wird, dass das Polynukleotid aus seiner natürlichen genetischen Umgebung entfernt worden und daher frei von anderen äußeren oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung in gentechnischen Produktionssystemen geeignet ist. Solche isolierte Moleküle sind solche, die aus ihrer natürlichen Umgebung getrennt worden sind, und schließen cDNA und genomische Klone ein. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit welchen sie gewöhnlich assoziiert sind, aber sie können natürlich vorkommende 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen wie z. B. Promotoren und Terminatoren einschließen. Die Identifizierung von assoziierten Regionen wird für einen normalen Fachmann offensichtlich sein (siehe z. B. Dynan und Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). Der Begriff "ein isoliertes Polynukleotid" kann alternativ als "ein kloniertes Polynukleotid" bezeichnet werden.
  • Wenn der Begriff "isoliert" auf ein Protein/Polypeptid verwendet wird, gibt er an, dass das Protein in einem Zustand gefunden wird, der anders ist als seine natürliche Umgebung. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere von anderen homologen Proteinen (i. e. "homologe Verunreinigungen" (siehe unten)). Es ist bevorzugt, das Protein in einer mehr als 40% reinen Form, mehr bevorzugt in einer mehr als 60% reinen Form, bereitzustellen.
  • Stärker bevorzugt ist es bevorzugt, das Protein in einer hoch gereinigten Form bereitzustellen, d. h. mehr als 80% rein, mehr bevorzugt mehr als 95% rein, und noch mehr bevorzugt mehr als 99% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
  • Der Begriff "isoliertes" Protein/Polypeptid kann alternativ als "gereinigtes Protein/Polypeptid" bezeichnet werden.
  • Der Begriff "homologe Verunreinigungen" bedeutet irgendeine Verunreinigung (z. B. ein anderes Polypeptid als das Polypeptid der Erfindung), welche aus der homologen Zelle stammt, aus der das Polypeptid der Erfindung ursprünglich erhalten worden ist.
  • Der Begriff "erhalten aus", wie er hier in Verbindung mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet wird, bedeutet, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid durch eine spezifische Quelle hergestellt wird, oder durch eine Zelle, in welche das Gen aus der Quelle eingefügt worden ist.
  • Der Begriff "funktionell verknüpft" bezeichnet, wenn er sich auf DNA-Abschnitte bezieht, dass die Abschnitte so angeordnet sind, dass sie im Einklang für ihre beabsichtigten Zwecke wirken, z. B. beginnt die Transkription im Promotor und schreitet durch den kodierenden Abschnitt zum Terminator voran.
  • Der Begriff "Polynukleotid" bezeichnet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer von Deoxyribonukleotid oder Ribonukleotid-Basen die vom 5'- zum 3'-Ende gelesen sind. Polynukleotide schließen RNA und DNA ein und können aus natürlichen Quellen isoliert sein, in vitro synthesisiert sein, oder aus einer Kombination von natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt sein.
  • Der Begriff "Komplementäre von Polynukleotidmolekülen" bezeichnet Polynukleotidmoleküle, die eine komplementäre Basensequenz und umgekehrte Orientierung im Vergleich zu einer Referenzsequenz haben. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
  • Der Begriff "degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die ein oder mehr degenerierte Codons einschließt (im Vergleich mit einem Referenznukleotidmolekül, das für das Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten verschiedene Triplets von Nukleotiden kodieren aber für denselben Aminosäurerest (d. h. GAU und GAC-Triplets kodieren jeweils für Asp).
  • Der Begriff "Promotor" bezeichnet einen Teil eines Gens, enthaltend DNA-Sequenzen, die für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription sorgen. Promo torsequenzen werden gewöhnlicherweise, aber nicht immer, in den 5'-nichtkodierenden Regionen von Genen gefunden.
  • Der Begriff "Sekretionssignalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid (ein "sekretorisches Polypeptid") kodiert, das als Teil eines größeren Polypeptides das größere Polypeptid durch einen Sekretionsweg einer Zelle leitet, in welcher es synthesisiert wird. Das größere Peptid wird gewöhnlicherweise gespalten, um das Sekretionspeptid während des Transits durch den Sekretionsweg zu entfernen.
  • POLYNUKLEOTIDE:
  • Innerhalb bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid der Erfindung unter mindestens mittelstringenten Bedingungen an ähnlich große Regionen von SEQ ID No. 1 oder einer dazu komplementären Sequenz hybridisieren.
  • Insbesondere werden Polynukleotide der Erfindung an eine denaturierte doppelsträngige DNA-Probe hybridisieren die entweder die gesamte Sequenz umfassen, die in Position 676–1470 von SEQ ID No. 1 gezeigt ist, oder irgendeine Probe umfassend eine Untersequenz von SEQ ID No. 1, die eine Länge von mindestens etwa 100 Basenpaaren hat, unter mindestens mittelstringenten Bedingungen, aber vorzugsweise bei hochstringenten Bedingungen, wie sie in Detail unten beschrieben sind. Geeignete experimentelle Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung bei mittlerer oder hoher Stringenz zwischen einer Nukleotidprobe und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beinhaltet das Voreinweichen des Filters enthaltend die DNA-Fragmente oder RNA, um in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat, Sambrook et al. 1989) für 10 Minuten zu hybridisieren, und die Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS und 100 µg/ml an denaturierter mit Ultraschall behandelter Lachssperm-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von Hybridisierung in der selben Lösung enthaltend eine Konzentration von 10 ng/ml einer zufallsgeprimeten (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13), 32P-dcTP-markierter Probe (spezifische Aktivität höher als 1 × 109 cpm/µg) für 12 Stunden bei ca. 45°C. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei mindestens 60°C (mittlere Stringenz), noch bevorzugter bei mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) und noch mehr bevorzugt bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz), gewaschen.
  • Moleküle, an welche die Oligonukleotid-Probe unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen. Wie bereits erwähnt, schließen die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA ein. Verfahren zum Isolieren von DNA und RNA sind im Stand der Technik gut bekannt. DNA und RNA, die für interessierende Gene kodieren, können in Genbanken oder DNA-Bibliotheken mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren kloniert werden.
  • Polynukleotide, die für Polypeptide kodieren, die Endoglucanaseaktivität der Erfindung aufweisen, werden dann identifiziert und zum Beispiel durch Hybridisierung oder PCR isoliert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Counterpart-Polypeptide und Polynukleotide aus unterschiedlichen bakteriellen Stämmen (Orthologe oder Paraloge) bereit. Von besonderem Interesse sind Endoglucanase-Polypeptide von Gram-positiven alkalophilen Stämmen, einschließlich der Art Saccharothrix.
  • Spezies-Homologe eines Polypeptides mit Endoglucanaseaktivität der Erfindung können unter Verwendung der Information und der Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt sind, in Kombination mit gewöhnlichen Klonierungstechniken kloniert werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von chromosomaler DNA, die aus einem Zelltyp erhalten ist, der das Protein exprimiert. Geeignete Quellen von DNA können durch das Testen von Northern Blots mit Proben, die nach den hier offenbarten Sequenzen entworfen wurden, identifiziert werden. Eine Bibliothek wird dann aus der chromosomalen DNA einer positiven Zelllinie hergestellt. Eine DNA-Sequenz der Erfindung, die für das Polypeptid kodiert, das Endoglucanaseaktivität hat, kann dann durch eine Vielzahl von Methoden isoliert werden, wie z. B. das Testen mit Proben, die anhand der Sequenzen entworfen wurden, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbart wurden, oder mit einem oder mehreren Sets von degenerierten Proben, die auf den offenbarten Sequenzen basieren. Eine DNA-Sequenz der Erfindung kann auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, oder PCR (Mullis, US Patent 4,683,202 ) kloniert werden, unter Verwendung von Primern, die nach den hier offenbarten Sequenzen entworfen worden sind. Innerhalb eines weiteren Verfahrens kann die DNA verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren und die Expression der interessierenden DNA kann mit einem Antikörper (monoklonal oder polyklonal) nachgewiesen werden, der gegen die Endoglucanase gerichtet ist, die aus S. australiensis, IFO 14444, kloniert worden ist, exprimiert und gereinigt, wie beschrieben in den Materialien und Methoden und den Beispielen 1 und 3 oder durch einen Aktivitätstest, der sich auf ein Polypeptid bezieht, das Endoglucanaseaktivität hat.
  • Der für die Endoglucanase kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pSJ1678 kloniert ist, das in Escherichia coli DSM 11476 vorliegt, und/oder eine analoge DNA-Sequenz der Erfindung kann aus einem Stamm der bakteriellen Art Saccharothrix australiensis kloniert werden, vorzugsweise dem Stamm IFO 14444, der das Enzym mit der Endoglucanaseaktivität produziert, oder aus einem anderen oder verwandten Organismus, der hier beschrieben ist.
  • Alternativ kann die analoge DNA-Sequenz auf der Basis der aus dem Plasmid, das in Escherichia coli DSM 11476 (von welcher geglaubt wird, dass sie identisch ist mit der angehängten SEQ ID No:1) erhältlich ist, gewonnen werden kann, konstruiert werden, z. B. eine Untersequenz davon und, und/oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, welche nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der Mannanase, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, führen, aber welche der Codonverwendung des Wirtsorganismus entspricht, der für die Produktion des Enzyms vorgesehen ist, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz führen (z. B. eine Variante des Mannan-abbauenden Enzyms der Erfindung).
  • POLYPEPTIDE:
  • Die Sequenz der Aminosäurenummern 226–490 von SEQ ID No: 2 ist eine reife Endoglucanasesequenz der katalytisch aktiven Domäne.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Endoglucanasepolypeptide bereit, die im Wesentlichen homolog zu dem Polypeptid von SEQ ID No: 2 sind, und Spezieshomologe (Paraloge oder Orthologe) davon. Der Begriff "im Wesentlichen homolog" wird hier verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die 75%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 85%, und noch mehr bevorzugt mindestens 90% Sequenzidentität zu der Sequenz haben, die in Aminosäurepositionen 226–490 von SEQ ID No: 2 gezeigt sind, oder ihre Orthologen oder Paralogen. Solche Polypeptide werden mehr bevorzugt mindestens 95% identisch und am meisten bevorzugt 98% oder mehr identisch zu der Sequenz sein, die in Aminosäurepositionen 226–490 von SEQ ID No: 2 gezeigt ist, oder ihren Orthologen oder Paralogen, sein.
  • Prozent Sequenzidentität wird bestimmt durch gewöhnliche Verfahren, mit Hilfe von Computerprogrammen, die im Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. GAP, das in dem GCG Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) bereitgestellt ist, wie offenbart in Needlman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453 welches hiermit durch Bezugnahme in seinem gesamten Umfang aufgenommen ist. GAP wird mit folgenden Einstellungen für den Polypeptidsequenzvergleich verwendet: GAP Creation Penalty von 3,0 und GAP Extension Penalty von 0,1.
  • Sequenzidentität der Polynukleotidmoleküle wird durch ähnliche Verfahren, in denen Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich bestimmt: GAP Creation Penalty von 5,0 und GAP Extension Penalty von 0,3.
  • Im Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch charakterisiert, dass sie eine oder mehrere Aminosäureaustausche, Deletionen oder Additionen haben. Diese Veränderungen sind vorzugsweise von einer geringfügigen Natur, das bedeutet konservativer Aminosäureaustausch (siehe Tabelle 2) und andere Austausche, die die Faltung oder Aktivität des Proteins oder Polypeptids nicht signifikant beeinflussen; kleinere Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; und kleine Amino- oder Carboxyterminale Extensionen, wie zum Beispiel eine aminoterminaler Methioninrest, ein kleines linker Peptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten oder eine kleine Extension, die die Reinigung erleichtert (ein Affinitäts-Tag), wie zum Beispiel ein Polyhistidine-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991). Siehe im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. DNAs, die für einen Affinität-Tag kodieren, sind von kommerziellen Lieferanten erhältlich (z. B., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).
  • Jedoch können, obwohl die Veränderungen, wie sie oben beschrieben sind, vorzugsweise von geringfügiger Natur sind, solche Veränderungen auch von einer größeren Natur sein, wie z. B. die Fusion von größeren Polypeptiden von bis zu 300 Aminosäuren oder mehr sowohl als amino- oder carboxyterminale Extensionen an ein Polypeptid der Erfindung, das Endoglucanaseaktivität hat. Tabelle 1 Konservativer Aminosäureaustausch
    Basisch: Arginin
    Lysin
    Histidin
    Sauer: Glutaminsäure
    Asparaginsäure
    Polar: Glutamin
    Asparagin
    Hydrophobisch: Leucin
    Isoleucin
    Valin
    Aromatisch: Phenylalanin
    Tryptophan
    Tyrosin
    Klein: Glycin
    Alanin
    Serin
    Threonin
    Methionin
  • Zusätzlich zu den 20 Standardaminosäuren, können nicht Standardaminosäuren (wie z. B. 4-hydroxyprolin, 6-N-methyl-Lysine, 2-aminoisobutyric acid, Isovalin und a-methyl Serin) für die Aminosäurereste eines Polypeptides gemäß der Erfindung ausgetauscht werden. Eine begrenzte Anzahl von nichtkonservativen Aminosäuren, die nicht durch den geneti schen Code kodiert sind und nicht natürliche Aminosäuren können für die Aminosäurereste substituiert werden.
  • "Unnatürliche Aminosäuren" sind nach Proteinsynthese modifiziert worden und/oder haben eine chemische Struktur in ihren Seitenkette(n), die unterschiedlich ist von derjenigen der Standardaminosäuren. Unnatürliche Aminosäuren können chemisch synthesiziert werden oder, vorzugsweise, sind kommerziell erhältlich und schließen Pipecolsäure, Thiazoline-Carboxylsäure, Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin, und 3,3-Dimethylprolin ein.
  • Essentielle Aminosäuren in den Endoglucanase-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können gemäß den Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden, wie z. B. durch Site-directed Mutagenesis oder Alanin-Scanning Mutagenesis (Cunningham und Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). Bei der letzteren Technologie, werden einzelne Alanin-Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische Aktivität (d. h. Mannanase-Aktivität) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheiden sind. Siehe auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Die aktive Stelle des Enzyms oder einer anderen biologischen Interaktion kann auch durch physikalische Analyse der Struktur bestimmt werden, wie bestimmt durch solche Techniken wie Kernspinresonanz, Kristallographie, Elektronenbrechung oder Photoaffinitäts-Labeling in Verbindung mit Mutation oder vermuteten Kontaktstellen-Aminosäuren. Siehe zum Beispiel de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Die Identitäten der essentiellen Aminosäuren können auch aus einer Analyse der Homologie mit Polypeptiden erschlossen werden, welche mit dem Polypeptid gemäß der Erfindung verwandt sind.
  • Es können mehrfache Aminosäureaustausche durchgeführt und nach den bekannten Verfahren der Mutagenese, Rekombination und/oder Mischung getestet werden, gefolgt von einem relevanten Screening-Verfahren, wie zum Beispiel denen, die durch Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie und Sauer (Proc Natl. Acad. Sci. USA) 86: 2152-2156, 1989), WO 95/17413 oder WO 95/22625 , offenbart sind. Kurz gefasst offenbaren diese Autoren Verfahren zum gleichzeitigen Randomisieren von 2 oder mehreren Positionen in einem Polypeptid oder zur Rekombination/Mischung von unterschiedlichen Mutationen ( WO 95/17413 , WO 95/22625 ), gefolgt vom Selektieren nach einem funktionellen Polypeptid und dann dem Sequenzieren des mutagenisierten Polypeptids um das Spektrum der zulässigen Austausche an jeder Position zu bestimmen. Andere Verfahren, die verwendet werden können, schließen Phage Display ein (z. B., Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., US Patent Nr. 5,223,409 ; Huse, WIPO Veröffentlichung WO 92/06204 ) und Region-Directed Mutagensis (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
  • Mutagenese-Shuffling-Verfahren, wie sie oben offenbart sind, können mit High-Throughput automatisierten Screening-Verfahren kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten mutagenisierten Polypeptiden in Wirtszellen nachzuweisen. Mutagenisierte DNA-Moleküle, die für aktive Polypeptide kodieren, können aus den Wirtszellen gewonnen werden und mit moderner Ausrüstung schnell sequenziert werden. Diese Verfahren erlauben die schnelle Bestimmung der Bedeutung von individuellen Aminosäureresten in einem Polypeptid von Interesse und sie können auf Polypeptide unbekannter Struktur angewandt werden.
  • Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren kann ein Durchschnittsfachmann eine Vielzahl von Polypeptiden identifizieren und/oder herstellen, die im Wesentlichen homolog zu den Resten 226-490 von SEQ ID Nr.: 2 sind, und die die Glucanaseaktivität des Wildtyp-Proteins beibehalten.
  • Das Endoglucanaseenzym der Erfindung kann zusätzlich zu dem Enzymkern, der die katalytische Domäne umfasst, auch eine Zellulosebindedomäne (CBD) umfassen, wobei die Zellulosebindedomäne und der Enzymkern (die katalytisch aktive Domäne) des Enzyms funktionell verknüpft sind. Die Zellulosebindedomäne (CBD) kann als integraler Bestandteil des kodierten Enzyms vorliegen oder eine CBD von anderem Ursprung kann in die Endoglucanase eingeführt werden, so dass ein Enzym-Hybrid erzeugt wird. In diesem Zusammenhang ist es beabsichtigt, dass der Begriff „Zellulosebindedomäne" so verstanden wird wie von Peter Tomme et al. definiert „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS Symposium Series, Nr. 618, 1996. Diese Definition klassifiziert mehr als 120 Zellulosebindedomänen in 10 Familien (I-X) und zeigt, dass die CBDs in verschiedenen Enzymen wie Zellulasen, Xylanasen, Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen gefunden werden. CBDs wurden auch in Algen z. B. der Rotalge Porphyra purpurea als nicht-hydrolytisches Polysaccharid-bindendes Protein gefunden, siehe Tomme et al., op.cit. Jedoch stammen die meisten CBDs aus Zellulasen und Xylanasen, CBDs werden an den N- und C-Termini von Proteinen gefunden oder sie befinden sich im Inneren. Enzymhybride sind im Stand der Technik bekannt, siehe z. B. WO 90/00609 und WO 95/16782 , und können durch das Transformieren eines DNA-Konstrukts in eine Wirtszelle hergestellt werden, wobei das DNA-Konstrukt mindestens ein Fragment von DNA umfasst, die für die Zellulosebindedomäne kodiert, welches mit oder ohne einen Linker an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die für die Endoglucanase kodiert, sowie das Kultivieren der Wirtszelle um das fusionierte Gen zu exprimieren. Enzymhybride können nach der folgenden Formel beschrieben werden: CBD-MR-X, wobei die CBD die N-terminale oder C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens der Zellulosebindedomäne entspricht; MR ist die mittlere Region (der Linker) und kann eine Bindung oder eine kurze Verbindungsgruppe von vorzugsweise etwa 2–100 Kohlenstoffatomen Länge sein, mehr bevorzugt von 2–40 Kohlenstoffatomen; oder sie ist vorzugsweise von etwa 2–100 Aminosäuren Länge, mehr bevorzugt von etwa 2–40 Aminosäuren; und X ist eine N-terminale oder C-terminale Region eines Polypeptids, die durch die erste oder zweite DNA-Sequenz der Erfindung kodiert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotidmolekül der Erfindung weiterhin eine Teil-DNA-Sequenz, die für eine Zellulosebindedomäne (CBD) kodiert. Ein Beispiel für eine solche Teil-DNA-Sequenz ist die Sequenz, die den Nukleotiden in Positionen 60–435 von SEQ ID Nr: 1 entspricht oder der für die CBD-kodierende Teil der DNA-Sequenz, die in das Plasmid pSJ1678, das in Escherichia coli, DSM 11476, kloniert ist, vorliegt. Das isolierte Polynukleotidmolekül der Erfindung kann eine weitere Teilnukleotidsequenz umfassen, die für eine Linker-Region kodiert, wobei die Linker-Region funktionell mit der Zellulosebindedomäne (CBD) und der katalytisch aktiven Domäne (CAD, catalytically active domain) des Enzyms verknüpft ist, das von der Nukleotidsequenz kodiert wird, die von dem isolierten Polynukleotidmolekül umfasst ist. Vorzugsweise besteht die Linker-Region aus etwa 2 Aminosäureresten bis etwa 120 Aminosäureresten, vorzugsweise 10–80 Aminosäureresten.
  • Die Polynukleotidmoleküle der Erfindung, die die oben beschriebenen Teil-DNA-Sequenzen einschließen, können aus dem Stamm Escherichia coli DSM 11476 unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. wie beschrieben von Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY, kloniert werden. Die Polynukleotidmoleküle der Erfindung und die Teil-DNA-Sequenzen davon können auch durch irgendein allgemeines Verfahren kloniert werden, das einbezieht
    • – das Klonieren, in geeignete Vektoren, einer DNA-Bibliothek aus irgendeinem Organismus, vorzugsweise einem Prokaryoten, mehr bevorzugt von einem Bakterium, mehr bevorzugt von einem Gram-positiven Bakterium, insbesondere von einem Stamm, der zu der Klasse der Actinomyceten gehört, genauer aus der Familie der Pseudonocardiaceae, z. B. aus der Gattung Saccharothrix, insbesondere von Saccharothrix australiensis, von dem erwartet wird, dass er die Endo-β-1,4-Glucanase von Interesse produziert,
    • – das Transformieren von geeigneten Wirtszellen mit den besagten Vektoren,
    • – das Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um ein beliebiges Enzym von Interesse, das von dem Klon in der DNA-Bibliothek kodiert wird, zu exprimieren,
    • – das Screenen nach positiven Klonen durch Bestimmen jedwelcher zellulolytischer Aktivität des Enzyms, das durch solche Klone produziert wird, und
    • – das Isolieren der für das Enzym kodierenden DNA aus solchen Klonen.
  • Alternativ kann die DNA, die für eine Zellulase der Erfindung kodiert, gemäß gut bekannten Verfahren in bequemer Weise aus einer geeigneten Quelle kloniert werden, wie z. B. aus irgendeinem der unten erwähnten Organismen, durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden, die auf Basis der DNA-Sequenz hergestellt werden, die aus dem Plasmid erhalten werden kann, das in Escherichia coli DSM 11476 vorliegt.
  • Wie eine Sequenz der Erfindung verwendet wird, um andere verwandte Sequenzen zu erhalten: Die hier offenbarte Sequenzinformation, die sich auf eine Polynukleotidsequenz, die für eine Endo-β-1,4-Glucanase der Erfindung kodiert, kann als ein Werkzeug verwendet werden um andere homologe Mannanasen zu identifizieren. Z. B. kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden, um Sequenzen zu amplifizieren, die für andere homologe Mannanasen aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen kodieren, insbesondere aus unterschiedlichen Saccharothrix-Arten.
  • Immunologische Kreuzreaktivität
  • Polyklonale Antikörper, insbesondere monospezifische polyklonale Antikörper, die zum Bestimmen von immunologischer Kreuzreaktivität verwendet werden sollen, können unter Verwendung eines gereinigten zellulolytischen Enzyms hergestellt werden. Genauer kann ein Antiserum gegen die Endoglucanase der Erfindung durch das Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagetieren) gemäß dem Verfahren erzeugt werden, dass von N. Axelsen et al. beschrieben ist in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27-31). Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren erhalten werden, z. B. durch Salzpräzipitation ((NH4)2SO4) gefolgt von Dialyse und Ionenaustauscherchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex. Immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Ouchterlony Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655-706), ausgeführt werden, durch gekreuzte Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4), oder durch Rocket Immunoelectrophoresis (N. Axelsen et al., Kapitel 2).
  • Mikrobielle Quellen
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „erhalten aus" oder „erhältlich aus" wie er hier in Verbindung mit einer spezifischen Quelle verwendet wird, dass das Enzym durch eine spezifische Quelle oder durch eine Zelle, in welche das Gen aus der Quelle inseriert worden ist, produziert worden ist oder produziert werden kann.
  • Es wird gegenwärtig erwogen, dass die Zellulase der Erfindung aus einem Gram-positiven Bakterium erhalten werden kann, das zu der Familie der Pseudonocardiaceae gehört, insbesondere zu einem Stamm der Gattung Saccharothrix, insbesondere ein Stamm von Saccharothrix australiensis.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellulase der Erfindung aus dem Stamm Saccharothrix australiensis, IFO 1444 erhalten. Es wird gegenwärtig erwogen, dass eine DNA-Sequenz, die für ein Enzym kodiert, das homolog zu dem Enzym der Erfindung aus anderen Stämmen ist, die zu der Gattung Saccharothrix gehören, erhalten werden kann.
  • Ein Isolat eines Stammes von Saccharothrix australiensis, aus welchem eine Endo-β-1,4-Glucanase der Erfindung erhalten werden kann, ist allgemein erhältlich vom Institute for Fermentation (IFO), 17-85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, unter der Hinterlegungsnummer IFO 14444.
  • Des Weiteren ist das Plasmid pSJ1678, das eine DNA-Sequenz umfasst, die für eine Endeglucanase der Erfindung kodiert, in einen Stamm von Escherichia coli transformiert und unter der Hinterlegungsnummer DSM 11476 hinterlegt worden.
  • Rekombinante Expressionsvektoren
  • Ein rekombinanter Vektor, der ein DNA-Konstrukt, das für das Enzym der Erfindung kodiert, umfasst, kann irgendein Vektor sein, welcher in bequemer Weise den rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen werden kann und die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingeführt werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit vorliegt, dessen Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, teilweise oder in seiner Gesamtheit in das Wirtszellgenom integriert und gemeinsam mit dem/den Chromosom(en) repliziert, in welche er integriert hat.
  • Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor in welchem die DNA-Sequenz, die für das Enzym der Erfindung kodiert, funktionell mit zusätzlichen Sequenzabschnitten verknüpft ist, die für die Transkription der DNA benötigt werden. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von einem Plasmid oder von viraler DNA abgeleitet oder er kann Elemente von beidem enthalten. Der Begriff „funktionell verknüpft" gibt an, dass die Sequenzen in einer solchen Weise angeordnet sind, dass sie gemeinsam für ihre beabsichtigten Zwecke zusammenwirken, z. B. die Transkription beginnt in einem Promotor und schreitet durch die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, fort.
  • Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und er kann von Genen abgeleitet sein, die für Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog in Bezug auf die Wirtszelle sind.
  • Beispiele für geeignete Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen den Promotor des maltogenen Amylasegens von Bacillus stearothermophilus ein, denjenigen des α-Amylasegens von Bacillus licheniformis, denjenigen des α-Amylasegens von Bacillus amyloliquefaciens, denjenigen für das Gen der alkalischen Phosphatase von Bacillus subtilis, oder denjenigen des Xylosidasegens von Bacillus pumilus, oder die Lambda PR- oder PL-Promotoren des Phagen Lambda, oder die Promotoren von E. coli lac, trp oder tac. Die DNA-Sequenz, die für das Enzym der Erfindung kodiert, kann auch, sofern nötig, funktionell mit einem geeigneten Terminator verknüpft sein.
  • Der rekombinante Vektor der Erfindung kann weiterhin eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren.
  • Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, oder ein Gen, das für eine Resistenz gegen z. B. Antibiotika wie Kanamycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder ähnliche kodiert, oder für eine Resistenz gegenüber Schwermetallen oder Herbiziden.
  • Um ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den Sekretionsweg der Wirtszellen zu leiten, kann eine sekretorische Signalsequenz (auch bekannt als Leader-Sequenz, Präpro-Sequenz oder Prä-Sequenz) in dem rekombinanten Vektor bereitgestellt werden. Die sekretorische Signalsequenz wird mit der DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, im richtigen Leseraster verbunden. Sekretorische Signalsequenzen werden im Allgemeinen 5' von der DNA-Sequenz positioniert, die für das Enzym kodiert. Die sekretorische Signalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Enzym assoziiert ist, oder sie kann von einem Gen stammen, das für ein anderes sekretiertes Protein kodiert.
  • Die Verfahren, die zum Ligieren der DNA-Sequenzen verwendet werden, die jeweils für das vorliegende Enzym, den Promotor und optional den Terminator und/oder die sekretorische Signalsequenz kodieren, oder die Verfahren zum Zusammensetzen dieser Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikations-Verfahren und zum Insertieren der Sequenzen in geeignete Vektoren, die die notwendige Information für die Replikation oder Integration enthalten, sind den Fachleuten bekannt (siehe z. B., Sambrook et al., op.cit.).
  • Wirtszellen
  • Das klonierte DNA-Molekül, das in die Wirtszelle eingeführt wird, kann entweder homolog oder heterolog zu dem fraglichen Wirt sein. Wenn sie homolog zu der Wirtszelle ist, d. h. in der Wirtszelle in der Natur produziert wird, wird sie typischerweise funktionell mit einer anderen Promotorsequenz oder gegebenenfalls mit einer anderen Signalsequenz und/oder Terminatorsequenz verbunden sein als in ihrer natürlich Umgebung. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „homolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die für ein Enzym kodiert, das in dem fraglichen Wirtsorganismus natürlicher Weise vorkommt. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „heterolog" eine DNA-Sequenz einschließt, die nicht natürlicher Weise in der Wirtszelle exprimiert wird. So kann die DNA-Sequenz aus einem anderen Organismus sein oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
  • Die Wirtszelle, in welche das klonierte DNA-Molekül oder der rekombinante Vektor der Erfindung eingeführt wird, kann jede beliebige Zelle sein, die in der Lage ist, das gewünschte Enzym zu produzieren und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryotische Zellen ein.
  • Beispiele für bakterielle Wirtszellen, welche bei Kultivierung in der Lage sind, das Enzym der Erfindung zu produzieren, können Gram-positive Bakterien sein, wie z. B. ein Stamm von Bacillus, insbesondere Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megatherium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis, ein Stamm von Lactobacillus, ein Stamm von Streptococcus, ein Stamm von Streptomyces, insbesondere Streptomyces lividans und Streptomyces murinus oder eine Wirtszelle kann ein Gram-negatives Bakterium sein, wie z. B. ein Stamm von Escherichia coli.
  • Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplastentransformation, Elektroporation, Konjugation oder durch Verwendung von kompetenten Zellen in einer Art und Weise bewirkt werden, wie sie als solche bekannt ist (vgl. z. B. Sambrook et al., oben).
  • Bei Expression des Enzyms in Bakterien wie z. B. Escherichia coli, kann das Enzym im Zytoplasma zurückgehalten werden, typischerweise als unlösliche Granula (bekannt als Einschlusskörperchen), oder das Enzym kann von einer bakteriellen Sekretionssequenz in den periplasmatischen Raum geleitet werden. Im ersten Fall werden die Zellen lysiert und die Granula gewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch Verdünnen des Denaturierungs-Mittels zurückgefaltet wird. Im zweiten Fall wird das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Zerstören der Zellen gewonnen, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder osmotischen Schock, um die Inhalte des periplasmatischen Raums freizusetzen, und Gewinnen des Enzyms.
  • Bei Expression des Enzyms in Gram-positiven Bakterien wie z. B. einem Stamm von Bacillus oder einem Stamm von Streptomyces, kann das Enzym im Zytoplasma zurückgehalten werden oder kann von einer bakteriellen Sekretionssequenz in das extrazelluläre Medium geleitet werden.
  • Beispiele für Pilz-Wirtszellen, welche bei Kultivierung in der Lage sind, das Enzym der Erfindung zu produzieren, sind z. B. ein Stamm von Aspergillus oder Fusarium insbesondere Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspegillus niger, Aspergillus oryzae, und Fusarium oxysporum, und ein Stamm von Trichoderma, vorzugsweise Trichoderma harzinanum, Trichoderma reesei und Trichoderma viride.
  • Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung und die Transformation der Protoplasten gefolgt von einer Regeneration der Zellwand einbezieht, in einer Art und Weise, wie sie als solche bekannt ist. Die Verwendung eines Stamms von Aspergillus als Wirtszelle ist beschrieben in EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
  • Beispiele für eine Wirtszelle von Hefe-Ursprung, welche bei Kultivierung in der Lage ist, das Enzym der Erfindung zu produzieren, sind z. B. ein Stamm von Hansenula sp., ein Stamm von Kluyveromyces sp., insbesondere Kluyveromyces lactis und Kluyveromyces marcianus, ein Stamm von Pichia sp., ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri und Saccharomyces uvarum, ein Stamm von Schizosaccharomyces sp., insbesondere Schizosaccharomyces pombe und ein Stamm von Yarrowia sp., insbesondere Yarrowia lipolytica.
  • Beispiele für eine Wirtszelle von pflanzlichem Ursprung, welche bei Kultivierung in der Lage ist, das Enzym der Erfindung zu produzieren, sind z. B. eine Pflanzenzelle von Solanum tuberosum oder Nicotiana tabacum.
  • Verfahren zum Herstellen eines zellulolytischen Enzyms
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellen eines isolierten Enzyms gemäß der Erfindung bereit, wobei eine geeignete Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz kodierend für das Enzym transformiert worden ist, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym wird aus der Kultur gewonnen.
  • Wie hier definiert, ist ein isoliertes Polypeptid (z. B. ein Enzym) ein Polypeptid, welches im Wesentlichen frei ist von anderen Polypeptiden, z. B. mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, mehr bevorzugt etwa 60% rein, noch mehr bevorzugt etwa 80% rein, am meisten bevorzugt etwa 90% rein und besonders am meisten bevorzugt etwa 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
  • Der Begriff „isoliertes Polypeptid" kann alternativ bezeichnet werden als „gereinigtes Polypeptid".
  • Wenn ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz kodierend für das Enzym umfasst, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, kann die heterologe rekombinante Herstellung des Enzyms der Erfindung ermöglicht werden.
  • Daher ist es möglich, eine hoch gereinigte oder einkomponentige zellulolytische Zusammensetzung herzustellen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei ist von homologen Verunreinigungen.
  • In diesem Zusammengang bedeuten homologe Verunreinigungen jegliche Verunreinigungen (z. B. andere Polypeptide als das Enzym der Erfindung), welche aus der homologen Zelle stammen, aus welcher das Enzym ursprünglich erhalten ist.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die homologe Wirtszelle ein Stamm von Saccharothrix australiensis sein.
  • Das Medium, das für die Kultur der transformierten Wirtszellen verwendet wird, kann jegliches konventionelle Medium sein, das geeignet ist um die fraglichen Wirtszellen wachsen zu lassen. Das exprimierte zellulolytische Enzym kann in bequemer Weise in das Kultur medium sekretiert werden und kann daraus durch gut bekannte Verfahren einschließlich der Trennung der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, durch Präzipitieren der proteinartigen Bestandteile des Mediums mit Hilfe eines Salzes wie z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie z. B. Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie, oder ähnlichem, gewonnen werden.
  • Enzymzusammensetzungen
  • In noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung umfassend ein Enzym, das zellulolytische Aktivität wie oben beschrieben zeigt.
  • Die Enzymzusammensetzung der Erfindung kann zusätzlich zu der Zellulase der Erfindung, ein oder mehrere Enzym-Typen umfassen, z. B. Hemicellulase wie z. B. Xylanase und Mannanase, andere Zellulase oder Endo-β-1,4-Glucanase-Bestandteile, Chitinase, Lipase, Esterase, Pectinase, Cutinase, Phytase, Oxidoreductase (Peroxidase, Haloperoxidase, Oxidase, Laccase), Protease, Amylase, Reductase, Phenoloxidase, Ligninase, Pullulanase, Pectatlyase, Xylolglucanase, Pectinacetylesterase, Polygalacturonase, Rhamnogalacturonase, Pectinlyase, Pectinmethylesterase, Cellobiohydrolase, Transglutaminase; oder Mischungen davon.
  • Die Enzymzusammensetzung kann gemäß Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden und kann in der Form einer Flüssigkeit oder einer trocknen Zusammensetzung sein. Z. B. kann die Enzymzusammensetzung in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats sein. Das Enzym, das in der Zusammensetzung beinhaltet werden soll, kann gemäß Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, stabilisiert sein. Endoglucanasen haben potentielle Verwendungen in einer Zahl von unterschiedlichen Industrien und Anwendungen. Beispiele von bevorzugten Verwendungen der Enzymzusammensetzung sind unten angegeben. Die Dosierung der Enzymzusammensetzung der Erfindung und anderer Bedingungen unter welchen die Zusammensetzung verwendet wird, kann auf der Basis von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden.
  • Die Enzymzusammensetzung gemäß der Erfindung kann für mindestens einen der folgenden Zwecke nützlich sein.
  • Verwendungen
  • Während des Waschens und Tragens wird gewöhnlicherweise Farbstoff von gefärbten Geweben oder Kleidung aus dem Gewebe ausbluten, welches dann verblasst und getragen aussieht. Die Entfernung von Oberflächenfasern aus dem Gewebe wird die ursprünglichen Farben und Aussehen des Gewebes teilweise wiederherstellen. Durch den Begriff „Farbklärung", wie er hier verwendet wird, ist die teilweise Wiederherstellung der anfänglichen Farben des Gewebes oder der Bekleidung über mehrfache Waschzyklen gemeint.
  • Der Begriff „De-Pilling" bezeichnet das Entfernen von Knöllchen (engl. pills) von der Oberfläche des Gewebes. Der Begriff „Einweichflüssigkeit" (engl. soaking liquor) bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welche Wäsche eingetaucht werden kann bevor sie einem konventionellen Waschverfahren unterzogen wird. Die Einweichlösung kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die gewöhnlicherweise in einem Wasch- oder Wäschewaschverfahren verwendet werden.
  • Der Begriff „Waschflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welcher die Wäsche einem Waschverfahren unterzogen wird, d. h. gewöhnlich eine kombinierte chemische und mechanische Wirkung, entweder manuell oder in einer Waschmaschine. Gewöhnlicherweise ist die Waschlösung eine wäßrige Lösung von einer pulverförmigen oder flüssigen Detergens-Zusammensetzung.
  • Der Begriff „Spülflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welche die Wäsche eingetaucht und behandelt wird, gewöhnlicherweise unmittelbar nachdem sie einem Waschverfahren unterzogen worden ist, um die Wäsche zu spülen, d. h. im Wesentlichen um die Detergenslösung aus der Wäsche zu entfernen. Die Spülflüssigkeit kann eine Gewebekonditioner- oder Weichmacherzusammensetzung enthalten.
  • Die Wäsche, die dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen wird, kann eine konventionell waschbare Wäsche sein. Vorzugsweise sind der größere Teil der Wäsche genähte oder ungenähte Gewebe, einschließlich Wirkwaren, Geweben, Jeansstoffen, Garnen, und Frottee, hergestellt aus Baumwolle, Baumwollmischungen oder natürlichen oder von Menschenhand hergestellten Zellulosematerialien (z. B. abstammend aus Xylanenthaltenden Zellulose-Fasern wie z. B. von Holz-Pulpe) oder Mischungen davon. Beispiele für Mischungen von Baumwolle oder Reyon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien wie z. B. Wolle, synthetischen Fasern (z. B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Zellulose enthaltende Fasern (z. B. Reyon/Viskose, Bastfaser (Ramie), Flachs/Leinen, Jute, Zelluloseacetatfasern, Lyocell).
  • OFFENBARUNG UND BEISPIELE BEZÜGLICH DETERGENTIEN
  • Tensidsystem
  • Die Detergenszusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Tensid-System, wobei das Tensid ausgewählt werden kann aus nicht-ionischen und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder ampholytischen und/oder zwitterionischen und/oder semipolaren Tensiden.
  • Das Tensid liegt typischerweise in einem Spiegel von 0,1–60 Gew.-% vor. Das Tensid ist vorzugsweise so formuliert, dass es mit den Enzymbestandteilen, die in der Zusammenset zung vorliegen, kompatibel ist. In flüssigen oder in Gelzusammensetzungen ist das Tensid vorzugsweise auf eine solche Weise formuliert, dass es die Stabilität jedwelchen Enzyms in diesen Zusammensetzungen fördert, oder zumindest nicht abbaut.
  • Bevorzugte Systeme, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, umfassen als Tensid ein oder mehrere hier beschriebene nicht-ionische und/oder anionische Tenside.
  • Polyethylen, Polypropylen und Polybutylenoxid-Kondensate von Alkylphenolen sind zur Verwendung als nicht-ionisches Tensid des Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung geeignet, wobei Polyethylenoxid-Kondensate bevorzugt sind. Diese Verbindungen schließen die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen ein, die eine Alkylgruppe von etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von etwa 8–14 Kohlenstoffatomen beinhalten, entweder als eine gerade Kette oder in einer verzweigten Kettenkonfiguration mit dem Alkylenoxid. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Ethylenoxid in einer Menge vor, die gleich ist zu von etwa 2 bis etwa 25 mol, mehr bevorzugt zu von etwa 3 bis etwa 15 mol an Ethylenoxid pro mol Alkylphenyl. Kommerziell erhältliche nicht-ionische Tenside dieses Typs beinhalten IgepalTM CO-630, vermarktet von der GAF Corporation; und TritonTM X-45, X-114, X-100 und X-102, die alle von der Rohm & Haas Company vermarktet werden. Diese Tenside werden allgemein als Alkylphenolalkoxylate (z. B. Alkylphenolethoxylate) bezeichnet.
  • Die Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwa 1 bis etwa 25 mol an Ethylenoxid sind für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid der nicht-ionischen Tensid-Systeme der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder gerade oder verzweigt sein, primär oder sekundär, und enthält im Allgemeinen etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatome. Bevorzugt sind die Kondensationsprodukte von Alkoholen, die eine Alkylgruppe haben, die etwa 8–20 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatome beinhaltet, mit etwa 2 bis etwa 10 mol an Ethylenoxid pro mol Alkohol. Etwa 2 bis etwa 7 mol Ethylenoxid und am meisten bevorzugt 2–15 mol Ethylenoxid pro mol an Alkohol liegen in den besagten Kondensationsprodukten vor. Beispiele für kommerziell erhältliche nicht-ionische Tenside dieses Typs schließen TergitolTM 15-S-9 (das Kondensationsprodukt von linearem C11-C15 Alkohol mit 9 mol Ethylenoxid), und TergitolTM 24-L-6 NMW (das Kondensationsprodukt von primärem C12-C14 Alkohol mit 6 mol Ethylenoxid mit einer engen Molekulargewichtsverteilung) ein, die beide von der Union Carbide Corporation vermarktet werden; NeodolTM 45-9 (das Kondensationsprodukt von linearem C14-C15 Alkohol mit 9 mol an Ethylenoxid), NeodolTM 23-3 (das Kondensationsprodukt von linearem C12-C13 Alkohol mit 3,0 mol an Ethylenoxid), NeodolTM 45-7 (das Kondensationsprodukt von linearem C14-C15 Alkohol mit 7 mol an Ethylenoxid), NeodolTM 45-5 (das Kondensationsprodukt von linearem C14-C15 Alkohol mit 5 mol an Ethylenoxid), die von der Shell Chemical Company vermarktet werden, KyroTM EOB (das Kondensationsprodukt von C13-C15 Alkohol mit 9 mol Ethylenoxid), vermarktet von der The Procter & Gamble Company, und Genapol LA 050 (das Kondensationsprodukt von C12-C14 Alkohol mit 5 mol an Ethylenoxid) vermarktet von Hoechst. Bevorzugter Bereich von HLB (engl. HLB) in diesen Produkten ist 8–11 und am meisten bevorzugt 8–10.
  • Auch geeignet als nicht-ionisches Tensid der Tensid-Systeme der vorliegenden Erfindung sind Alkylpolysaccharide, die in US 4,565,674 offenbart sind, die eine hydrophobe Gruppe haben, enthaltend etwa 6 bis etwa 30 Kohlenstoffatome, bevorzugt etwa 10 bis etwa 16 Kohlenstoffatome und eine Polysaccharid-, z. B. eine Polyglycosid-, hydrophile Gruppe, die etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, am meisten bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7 Saccharideinheiten enthält. Ein beliebiges reduzierendes Saccharid, das 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält, kann verwendet werden, z. B. Glucose, Galactose und Galactosyl-Reste können an die Stelle der Glycosyl-Reste treten (optional ist die hydrophobe Gruppe an den 2-, 3-, 4-, etc. Positionen angefügt, so dass sie eine Glucose oder Galactose im Gegensatz zu einem Glucosid oder Galactosid ergibt). Die Zwischensaccharidbindungen können z. B. zwischen der 1-Position der zusätzlichen Saccharideinheiten und den 2-, 3-, 4-, und/oder 6-Positionen der vorangehenden Saccharideinheiten sein
  • Die bevorzugten Alkylpolyglucoside haben die Formel R2O(CnH2nO)t(glycosyl)x wobei R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkylphenyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkylphenyl, und Mischungen davon, in welchen die Alkylgruppen etwa 10 bis etwa 18, vorzugsweise etwa 12 bis etwa 14 Kohlenstoffatome enthalten; n ist 2 oder 3, vorzugsweise 2; t ist 0 bis etwa 10, vorzugsweise 0; und x ist etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, am meisten bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7. Das Glycosyl ist vorzugsweise von Glucose abgeleitet. Um diese Verbindungen herzustellen, wird zuerst der Alkohol oder Alkylpolyethoxyalkohol gebildet und dann mit Glucose oder einer Glucose-Quelle zur Reaktion gebracht, um das Glucosid (Verknüpfung an der 1-Position) zu bilden. Die zusätzlichen Glycosyleinheiten können zwischen ihrer 1-Position und der 2-, 3-, 4- und/oder 6-Position, vorzugsweise überwiegend der 2'-Position, der vorhergehenden Glycosyleinheiten verknüpft werden.
  • Die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid, die mit einer hydrophoben Base durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildet werden, sind auch zur Verwendung als zusätzliche nicht-ionische Tensid-Systeme der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Der hydrophobe Anteil dieser Verbindungen wird vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1500 bis etwa 1800 haben und eine Wasserunlöslichkeit zeigen. Die Hinzufügung von Polyoxyethylen-Resten an diesem hydrophoben Anteil neigt dazu, die Wasserlöslichkeit des Moleküls als Ganzes zu erhöhen, und der flüssige Charakter des Produkts wird bis zu einem Punkt aufrechterhalten, an dem der Polyoxyethylengehalt etwa 50% des Gesamtgewichts des Kondensationsprodukts beträgt, welches einer Kondensation mit bis zu etwa 40 mol Ethylenoxid entspricht. Beispiele für Verbindungen dieser Art schließen be stimmte kommerziell erhältliche PluronicTM-Tenside ein, die von BASF vermarktet werden.
  • Ebenfalls für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid des nicht-ionischen Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung sind die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit dem Produkt geeignet, das aus der Reaktion von Propylenoxid und Ethylendiamin resultiert. Der hydrophobe Rest dieser Produkte besteht aus dem Reaktionsprodukt von Ethylendiamin und überschüssigem Propylenoxid und hat im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 2500 bis etwa 3000. Dieser hydrophobe Rest wird mit Ethylenoxid bis zu dem Ausmaß kondensiert, dass das Kondensationsprodukt etwa 40 bis etwa 80 Gew.-% an Polyoxyethylen enthält und ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 11000 hat. Beispiele für diese Art von nicht-ionischem Tensid schließen bestimmte TetronicTM-Verbindungen ein, die von BASF vermarktet werden.
  • Bevorzugt für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid der Tensid-Systeme der vorliegenden Erfindung sind Polyethylenoxid-Kondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit von etwa 1 bis etwa 25 mol an Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Mischungen davon. Am meisten bevorzugt sind C8-C14 Alkylphenolethoxylate, die etwa 3 bis 15 Ethoxygruppen haben und C8-C18 Alkoholethoxylate (vorzugsweise im Mittel C10), die 2 bis 10 Ethoxygruppen haben, und Mischungen davon. Hochbevorzugte nicht-ionische Tenside sind Polyhydroxy-Fettsäureamidtenside der Formel
    Figure 00340001
    mit R1 ist H, oder R1 ist C1-4 Kohlenwasserstoff, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder eine Mischung davon, R2 ist C5-31 Kohlenwasserstoff, und Z ist ein Polyhydroxykohlen wasserstoff, das eine lineare Kohlenwasserstoffkette mit mindestens 3 Hydroxylresten hat, die direkt mit der Kette verbunden sind oder ein alkoxyliertes Derivat davon. Vorzugsweise ist R1 Methyl, R2 ist ein gerades C11-15-Alkyl oder C16-18-Alkyl oder eine Alkenylkette, wie z. B. Kokosnuss-Alkyl oder Mischungen davon und Z ist von einem reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Maltose oder Lactose, in einer reduktiven Aminierungsreaktion abgeleitet.
  • Hochbevorzugte anionische Tenside schließen alkylalkoxylierte Sulfat-Tenside ein. Beispiele hierfür sind wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)mSO3M, mit R ist ein unsubstituiertes C10-C24-Alkyl oder eine Hydroxyalkylgruppe, die eine C10-C24-Alkylkomponente aufweist, vorzugsweise ein C12-C20-Alkyl oder Hydroxyalkyl, am meisten bevorzugt C12-C18-Alkyl oder Hydroxyalkyl, A ist eine Ethoxy- oder eine Propoxy-Einheit, m ist größer als 0, typischerweise zwischen etwa 0,5 und etwa 6, am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,5 und etwa 3, und M ist H oder ein Kation, welches z. B. ein Metallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Kalzium, Magnesium, etc.) sein kann, Ammonium oder substituiertes Ammoniumkation. Alkylethoxylierte Sulfate wie auch alkylpropoxylierte Sulfate werden hier in Erwägung gezogen. Spezifische Beispiele für substituierte Ammoniumkationen schließen Methyl-, Dimethyl-, Trimethyl-Ammonium-Kationen ein und quaternäre Ammonium-Kationen wie z. B. Tetramethyl-Ammonium und Dimethylpiperidinium-Kationen und solche, die von Alkylaminen abgeleitet sind, wie z. B. Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Mischungen davon und ähnliches. Beispielhafte Tenside sind C12-C18-Alkylpolyethoxylat (1,0) Sulfat (C12-C18E(1,0)M), C12-C18-Alkylpolyethoxylat (2,25) Sulfat (C12-C18(2,25)M und C12-C18-Alkylpolyethoxylat (3,0) Sulfat (C12-C18E(3,0)M) und C12-C18-Alkylpolyethoxylat (4,0) Sulfat (C12-C18E(4,0)M), wobei M in bequemer Weise aus Natrium und Kalium ausgewählt werden kann.
  • Geeignete nicht-ionische Tenside, die verwendet werden sollen, sind Alkylestersulfonattenside, einschließlich linearer Ester von C8-C20 Carbonsäuren (d. h., Fettsäuren), welche mit gasförmigem SO3 gemäß dem The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), S. 323-329, sulfoniert sind. Geeignete Ausgangsmaterialien würden natürliche Fettsubstanzen beinhalten wie abgeleitet aus Talg, Palmöl, etc.
  • Das bevorzugte Alkylestersulfonat-Tensid, speziell für Wasch-Anwendungen, umfasst Alkylestersulfonat-Tenside der Strukturformel:
    Figure 00360001
    wobei R3 ist ein C8-C20 Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein Alkyl, oder eine Kombination davon, R4 ist ein C1-C6-Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein Alkyl oder eine Kombination davon, und M ist ein Kation, welches ein wasserlösliches Salz mit dem Alkylsulfonat bildet. Geeignete salzbildende Kationen schließen Metalle wie z. B. Natrium, Kalium und Lithium ein und substituierte Ammoniumkationen, wie z. B. Monoethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin. Vorzugsweise ist R3 C10-C16 Alkyl, und R4 ist Methyl, Ethyl oder Isopropyl. Speziell bevorzugt sind Dimethylestersulfonate, wo R3 ein C10-C16-Alkyl ist.
  • Andere geeignete anionische Tenside schließen die Alkylsulfat-Tenside ein, die wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO3M sind, wobei R vorzugsweise ein C10-C24-Kohlenwasserstoff ist, vorzugsweise ein Alkyl oder Hydroxyalkyl, das eine C10-C20-Alkylkomponente aufweist, mehr bevorzugt ein C12-C18-Alkyl oder Hydroxyalkyl, und M ist H oder ein Kation, z. B. ein Alkalimetall-Kation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium (z. B. Methyl-, Dimethyl- und Trimethylammonium-Kationen und quaternäre Ammonium-Kationen wie z. B. Tetramethyl-Ammonium und Dimethylpiperadinium-Kationen und quaternäre Ammonium-Kationen, die von Alkylaminen wie z. B. Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin und Mischungen davon und ähnli chem) abgeleitet sind. Typischerweise sind Alkylketten von C12-C16 bevorzugt für niedrigere Waschtemperaturen (z. B. unterhalb etwa 50°C) und C16-C18 Alkylketten sind bevorzugt für höhere Waschtemperaturen (z. B. oberhalb etwa 50°C).
  • Andere anionische Tenside, die für reinigende Zwecke nützlich sind, können ebenfalls in den Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sein. Diese können Salze einschließen (einschließlich, z. B. Natrium, Kalium, Ammonium, und substituierte Ammoniumsalze wie z. B. Mono-, Di- und Triethanolaminsalze) von Seife, primäre oder sekundäre C8-C22 Alkansulfonate, C8-C24 Olefinsulfonate, sulfonierte Polycarboxylsäuren, hergestellt durch Sulfonierung des pyrolysierten Produkts von Erdalkalimetallcitraten, z. B. wie beschrieben in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1,082,179, C8-C24 Alkylpolyglykolethersulfate (enthaltend bis zu 10 mol Ethylenoxid); Alkylglycerolsulfonate, Fettacylglycerolsulfonate, Fettoleylglycerolsulfate, Alkylphenolethylenoxidethersulfate, Paraffinsulfonate, Alkylphosphate, Isethionate, wie z. B. Acylisethionate, N-Acyltaurate, Alkylsuccinamate und Sulfosuccinate, Monoester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C12-C18 Monoester) und Diester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C6-C12-Diester), Acylsarcosinate, Sulfate von Alkylpolysacchariden, wie z. B. die Sulfate von Alkylpolyglucosid (die nicht-ionischen, nicht-sulfatierten Verbindungen sind unten beschrieben), verzweigte primäre Alkylsulfate und Alkylpolyethoxycarboxylate wie z. B. solche der Formel RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+, wobei R ein C8-C22-Alkyl ist, k ist ein e ganze Zahl von 1–10, und M ist ein lösliches salzbildendes Kation. Harzsäuren und hydrogenierte Harzsäuren sind auch geeignet, wie z. B. Rosin, hydrogeniertes Rosin und Harzsäuren und hydrogenierte Harzsäuren, die in Tallöl vorliegen oder davon abgeleitet sind.
  • Alkylbenzolsulfonate sind stark bevorzugt. Insbesondere bevorzugt sind lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), wobei die Alkylgruppe vorzugsweise von 10–18 Kohlenstoffatomen enthält.
  • Weitere Beispiele sind beschrieben in „Surface Active Agents and Detergents" (Band I und II von Schwartz, Perry und Berch). Eine Vielzahl von solchen Tensiden ist auch allgemein in US 3,929,678 offenbart (Spalte 23, Zeile 58 bis Spalte 29, Zeile 23, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind).
  • Sofern darin enthalten, umfassen die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise etwa 1 bis etwa 40 Gew.-%, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% solcher anionischer Tenside.
  • Die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch kationische, ampholytische, zwitterionische und semipolare Tenside enthalten, wie auch nicht-ionische und/oder anionische Tenside, die andere sind als die hier bereits beschriebenen. Kationische reinigende Tenside, die für die Verwendung in Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind solche, die eine langkettige Kohlenwasserstoffgruppe aufweisen. Beispiele für solche kationischen Tenside schließen die Ammoniumtenside wie z. B. Alkyltrimethylammoniumhalogenide ein und solche Tenside, die die Formel haben: [R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X wobei R2 eine Alkyl- oder Alkylbenzylgruppe ist, die etwa 8–18 Kohlenstoffatome in der Alkylkette aufweist, wobei jedes R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH(CH2OH)-, -CH2CH2CH2-, und Mischungen davon; jedes R4 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C1-C4-Alkylen, C1-C4-Hydroxyalkyl, Benzyl-Ringstrukturen geformt durch Verbinden der zwei R4-Gruppen, -CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH, wobei R6 eine beliebige Hexose oder ein Hexosepolymer ist, das ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 aufweist und Wasserstoff sofern y nicht 0 ist; R5 ist das Gleiche wie R4 oder ist eine Alkylkette, wobei die Gesamtzahl von Kunststoffatomen oder R2 + R5 nicht mehr als etwa 18 ist; jedes y ist etwa 0 bis etwa 10, und die Summe der y-Werte ist von 0 bis etwa 15; und X ist irgendein kompatibles Anion.
  • Stark bevorzugte kationische Tenside sind die in der vorliegenden Zusammensetzung geeigneten wasserlöslichen quaternären Ammoniumverbindungen, die die Formel haben: R1R2R3R4N+X– (i)wobei R1 ein C8-C16-Alkyl ist, jedes von R2, R3 und R4 ist unabhängig ein C1-C4-Alkyl, C1-C4-Hydroxyalkyl, Benzyl, und -(C2H40)xH, wobei x einen Wert von 2–5 hat und X ein Anion ist. Nicht mehr als eines von R2, R3 oder R4 sollte ein Benzyl sein.
  • Die bevorzugte Alkylkettenlänge für R1 ist C12-C15, insbesondere, wenn die Alkylgruppe eine Mischung von Kettenlängen ist, die aus Kokosnuss- oder Palmkern-Fett ist, oder synthetisch abgeleitet ist durch Olefin-Aufbau (engl. olefin build up) oder OXO-Alkoholsynthesis.
  • Bevorzugte Gruppen für R2R3 und R4 sind Methyl- und Hydroxyethylgruppen und das Anion X kann ausgewählt sein aus Halogenid, Methosulfat, Acetat und Phosphationen.
  • Beispiele für geeignete quaternäre Ammoniumverbindungen der Formel (i) zur hiesigen Verwendung sind:
    Kokosnuss-Trimethylammoniumchlorid oder -bromid;
    Kokosnuss-Methyldihydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
    Decyltriethylammoniumchlorid;
    Decyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
    C12-C15-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
    Kokosnuss-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
    Myristyltrimethylammoniummethylsulfat;
    Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid oder -bromid;
    Lauryldimethyl(ethenoxy)4-ammoniumchlorid oder -bromid;
    Cholinester (Verbindungen der Formel (i), wobei R1 ist:
    Figure 00400001
    Di-Alkylimidazoline[Verbindungen der Formel (i)].
  • Andere hier geeignete kationische Tenside sind auch beschrieben in US 4,228,044 und in EP 000 224 .
  • Sofern darin enthalten, umfassen die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 bis etwa 25 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 8 Gew.-% solcher kationischer Tenside.
  • Ampholytische Tenside sind auch geeignet für die Verwendung in Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Diese Tenside können im weiteren Sinne beschrieben werden als aliphatische Derivate von sekundären oder tertiären Aminen oder aliphatische Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen, in welchen das aliphatische Radikal geradkettig oder verzweigtkettig sein kann. Eine der aliphatischen Substituenten enthält mindestens etwa 8 Kohlenstoffatome, typischerweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatome, und mindestens eine enthält eine anionische wasserlöslichkeitsvermittelnde Gruppe, z. B. Carboxy, Sulfonat, Sulfat. Siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeilen 18–35) bezüglich Beispielen von ampholytischen Tensiden.
  • Sofern darin enthalten, umfassen die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise 0,2 bis etwa 15%, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% solcher ampholytischen Tenside.
  • Zwitterionische Tenside können auch zur Verwendung in Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen geeignet sein. Diese Tenside können im weiteren Sinne als Derivate von sekundären und tertiären Aminen beschrieben werden, Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen oder Derivate von quaternären Ammonium-, quaternären Phosphonium- oder tertiären Sulfonium-Verbindungen. Siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeile 38 bis Spalte 22, Zeile 48) bezüglich Beispielen für zwitterionische Tenside.
  • Sofern darin enthalten, umfassen die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 bis etwa 15%, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% solcher zwitterionischen Tenside.
  • Semipolare nichtionische Tenside sind eine besondere Kategorie der nichtionischen Tenside, welche wasserlösliche Aminoxide einschließen, die einen Alkylrest enthalten von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Reste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen enthaltend von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen; wasserlösliche Phosphinoxide enthaltend einen Alkylrest von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und zwei Reste, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen enthaltend von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen; und wasserlösliche Sulfoxide enthaltend einen Alkylrest von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und einen Rest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkylresten von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen.
  • Semipolare nichtionische Detergens-Tenside schließen die Aminoxidtenside ein, die die Formel haben:
    Figure 00420001
    wobei R3 eine Alkylhydroxyalkyl- oder Alkylphenylgruppe ist oder Mischungen davon enthaltend von etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen; R4 ist eine Alkylen- oder Hydroxyalkylengruppe, enthaltend von etwa 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen oder Mischungen davon; x ist von 0 bis etwa 3: und jedes R5 ist eine Alkyl- oder Hydroxylalkylgruppe enthaltend von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen oder eine Polyethylenoxidgruppe enthaltend von etwa 1 bis etwa 3 Ethylenoxidgruppen. Die R5-Gruppen können aneinander angehängt sein, z. B. über ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom, um eine Ringstruktur zu bilden. Diese Aminoxidtenside schließen insbesondere C10-C18-Alkyldimethylaminoxid und C8-C12-Alkoxyethyldihydroxyethylaminoxide ein.
  • Sofern darin enthalten, umfassen die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 bis etwa 15%, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% solcher semipolaren ionischen Tenside.
  • Builder System
  • Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können weiterhin ein Builder System umfassen. Jedes herkömmliche Builder System ist hier zur Verwendung geeignet, einschließlich Aluminosilikat-Materialien, Silikaten, Polycarboxylaten und Fettsäuren, Materialien wie z. B. Ethylendiamintetraacetat, Metallionen-Sequestranten wie z. B. Aminopolyphosphonate, insbesondere Ethylendiamintetramethylenphosphonsäure und Diethy lentriaminpentamethylenphosphonsäure. Obwohl weniger bevorzugt aus offensichtlichen Umweltschutzgründen, können auch Phosphatbuilder hier enthalten sein.
  • Geeignete Builder können ein anorganisches Ionenaustauschermaterial sein, im Allgemeinen ein anorganisches hydriertes Aluminosilikat-Material, genauer ein hydriertes synthetisches Zeolith, wie z. B. hydrierte Zeolithe A, X, B, HS oder MAP.
  • Ein anderes geeignetes anorganisches Buildermaterial ist Phyllosilikat, z. B. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 ist ein kristallines Phyllosilikat, das aus Natriumsilikat (Na2Si2O5) besteht.
  • Geeignete Polycarboxylate enthalten eine Carboxygruppe einschließlich Milchsäure, Glycolsäure und Etherderivate davon wie in den belgischen Patentnummern 831,368 , 821,369 und 821,370 offenbart. Polycarboxylate enthaltend zwei Carboxygruppen schließen die wasserlöslichen Salze von Bernsteinsäure, Malonsäure, (Ethylendioxy-)Diessigsäure, Maleinsäure, Diglykollsäure, Weinsäure, Tartronsäure und Fumarsäure ein, ebenso wie die Ethercarboxylate, die in der deutschen Offenlegungsschrift 2,446,686 und 2,446,487 , US 3,935,257 beschrieben sind und die Sulfinylcarboxylate, die in dem belgischen Patent Nr. 840,623 beschrieben sind.
  • Polycarboxylate enthaltend drei Carboxylgruppen schließen insbesondere wasserlösliche Citrate, Aconitrate und Citrazonate wie auch Succinatderivate wie z. B. Carboxymethyloxysuccinate, die im britischen Patent Nr. 1,379,241 beschrieben sind, Lactoxysuccinate, beschrieben in der niederländischen Anmeldung 7205873 , und die Oxypolycarboxylat-Materialien wie z. B. 2-Oxa-1,1,3-propantricarboxylate, die im britischen Patent Nr. 1,387,447 beschrieben sind, ein.
  • Polycarboxylate enthaltend vier Carboxygruppen schließen ein Oxydisuccinate, offenbart in dem britischen Patent Nr. 1,261,829 , 1,1,2,2-Ethantetracarboxylate, 1,1,3,3- Propantetracarboxylate enthaltend Sulfosubstituenten schließen die Sulfosuccinatderivate ein, die in den britischen Patenten Nr. 1,398,421 und 1,398,422 und in US 3,936,448 offenbart sind und die sulfonierten pyrolysierten Citrate, die in dem britischen Patent Nr. 1,082,179 beschrieben sind ein, während Polycarboxylate enthaltend Phosphonsubstituenten in dem britischen Patent Nr. 1,439,000 offenbart sind.
  • Alicyclische und heterocyclische Polycarboxylate schließen Cyclopentan-cis, cis-cis-Tetracarboxylate, Cyclopentadienidpentacarboxylate, 2,3,4,5-Tetrahydro-furan-cis, cis, cis-Tetracarboxylate, 2,5-Tetrahydrofuran-cis, Discarboxylate, 2,2,5,5-Tetrahydrofurantetracarboxylate, 1,2,3,4,5,6-Hexan-hexacarboxylate und Carboxymethylderivate von polyhydrierten Alkoholen wie z. B. Sorbit, Mannitol und Xylitol, ein. Aromatische Polycarboxylate schließen Mellitinsäure, Pyromellitinsäure und die Phthalsäurederivate ein, die in dem britischen Patent Nr. 1,425, 343 offenbart sind.
  • Nach dem Obigen sind die bevorzugten Polycarboxylate Hydroxycarboxylate enthaltend bis zu drei Carboxygruppen pro Molekül, genauer Citrate. Bevorzugte Builder-Systeme zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen schließen eine Mischung von wasserunlöslichen Aluminosilikat-Buildern wie z. B. Zeolith A oder von einem Phyllosilikat (SKS-6) und einem wasserlöslichen carboxylatartigen chelatierenden Agens wie z. B. Zitronensäure, ein.
  • Ein geeigneter Chelator zum Einsatz in den Detergens-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung ist Ethylendiamin-N,N-di-Bernsteinsäure (EDDS) oder das Alkalimetall, Erdalkalimetall, Ammonium, oder die substituierten Ammoniumsalze davon, oder von Mischungen davon. Bevorzugte EDDS-Verbindungen sind die Form der freien Säure und das Natrium- oder Magnesiumsalz davon. Beispiele für solche bevorzugten Natriumsalze von EDDS schließen Na2EDDS und Na4EDDS ein. Beispiele für solche bevorzugten Magnesiumsalze von EDDS schließen MgEDDS und Mg2EDDS ein. Die Magnesiumsalze sind am meisten bevorzugt für den Einsatz in Zusammensetzungen gemäß der Erfindung.
  • Bevorzugte Builder-Systeme schließen eine Mischung eines wasserunlöslichen Aluminosilikat-Builders wie z. B. Zeolith A und eines wasserlöslichen carboxylatartigen chelatierenden Mittels wie z. B. Zitronensäure ein.
  • Andere Builder-Materialien, die einen Teil des Builder-Systems zur Verwendung in körnigen Zusammensetzungen bilden können, schließen anorganische Materialien wie z. B. Alkalimetallcarbonate, Bicarbonate, Silikate und organische Materialien wie z. B. die organischen Phosphonate, Aminopolyalkylenphosphonate und Aminocarboxylate ein.
  • Andere geeignete wasserlösliche organische Salze sind die homo- oder copolymeren Säuren oder ihre Salze, in welchen die Polycarbonsäure mindestens zwei Carboxylradikale umfasst, die voneinander durch nicht mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt sind. Polymere dieser Art sind in GB-A-1,596,756 offenbart. Beispiele für solche Salze sind Polyacrylate mit einem MW 2000–5000 und ihre Copolymere mit Maleinsäureanhydrid, wie Copolymere, die ein Molekulargewicht von 20000 bis 70000, insbesondere etwa 40000 haben.
  • Detergensbuildersalze sind normalerweise in Mengen von 5 bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung enthalten. Bevorzugte Mengen an Builder für flüssige Detergenzien sind von 5% bis 30%.
  • Enzyme
  • Bevorzugte Detergens-Zusammensetzungen umfassen zusätzlich zur Enzympräparation der Erfindung, ein anderes Enzym oder andere Enzyme, welches/welche eine Reinigungswirkung und/oder Gewebepflegevorteile bereitstellen.
  • Solche Enzyme schließen Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Zellulasen, Peroxidasen, Oxidasen (z. B. Laccasen) ein.
  • Proteasen: Jegliche Protease, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Proteasen schließen solche von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung ein. Mikrobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind umfasst. Die Protease kann eine Serinprotease sein, vorzugsweise eine alkalische mikrobielle Protease oder eine Trypsin-artige Protease. Beispiele für alkalische Proteasen sind Subtilisine, insbesondere solche, die von Bacillus abgeleitet sind, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279 ). Beispiele für Trypsin-artige Proteasen sind Trypsin (z. B. von Schweine- oder Rinderherkunft) und die Fusarium-Protease, die in WO 89/06270 beschrieben ist.
  • Bevorzugte kommerziell erhältliche Proteaseenzyme schließen solche ein, die unter den Handelsnamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauft werden, und solche, die unter den Handelsnamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauft werden. Proteaseenzyme können in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung mit einer Menge von 0,00001 bis 2 Gew.-% an Enzymprotein der Zusammensetzung inkorporiert werden, vorzugsweise in einer Menge von 0,00001 bis 1% an Enzymproteinen gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, mehr bevorzugt in einer Menge von etwa 0,001 bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, noch bevorzugter bei einem Spiegel von etwa 0,01 bis etwa 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung.
  • Lipasen: Jegliche Lipase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Lipasen schließen solche von bakterieller oder Pilz-Herkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind umfasst.
  • Beispiele für geeignete Lipasen schließen eine Humicola lanuginosa-Lipase ein, z. B. wie beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216 , eine Rhizomucor miehei-Lipase, z. B. wie in EP 238 023 beschrieben, eine Candida-Lipase, wie z. B. eine C. antarctica-Lipase, z. B. die C. antarctica-Lipase A oder B, die in EP 214 761 beschrieben ist, eine Pseudomonas-Lipase, wie z. B. eine P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes-Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 218 272 , eine P. cepacia-Lipase, z. B. wie beschrieben in EP 331 376 , eine P. stutzeri-Lipase, z. B. wie offenbart in GB 1,372,034 , eine P. fluorescens-Lipase, eine Bacillus-Lipase, z. B. eine B. subtilis-Lipase (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), eine B. stearothermophilus-Lipase ( JP 64/744992 ) und eine B. pumilus-Lipase ( WO 91/16422 ).
  • Weiterhin kann eine Anzahl von klonierten Lipasen geeignet sein, einschließlich der Penicillium Camemberti-Lipase, beschrieben durch Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67), die Geotricum Candidum-Lipase, (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem. 106, 383-388), und verschiedene Rhizopus-Lipasen wie z. B. eine R. delemar-Lipase (Hass, M.J. et al., (1991), Gene 109, 117-113), eine R. niveus-Lipase (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719) und eine R. oryzae-Lipase.
  • Andere Arten an lipolytischen Enzymen wie z. B. Cutinasen können auch geeignet sein, z. B. eine Cutinase, die von Pseudomonas mendocina stammt, wie beschrieben in WO 88/09367 , oder eine Cutinase, die von Fusarium solani pisi stammt (z. B. beschrieben in WO 90/09446 ).
  • Besonders geeignete Lipasen sind Lipasen wie z. B. M1-LipaseTM, Luma fastTM und LipomaxTM (Genencor), LipolaseTM und Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S), und Lipase P „Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
  • Die Lipasen sind normalerweise in der Detergens-Zusammensetzung in einer Menge von 0,00001% bis 2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001% bis 1% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt in einer Menge von von 0,001% bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, noch mehr bevorzugt bei einem Spiegel von 0,01% bis 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung.
  • Amylasen: Jegliche Amylase (a und/oder b), die geeignet zur Verwendung in alkalischen Lösungen ist, kann verwendet werden. Geeignete Amylasen schließen solche von bakterieller oder Pilz-Herkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen schließen z. B. a-Amylasen ein, die erhalten werden von einem besonderen Stamm von B. Lichiniformis, genauer beschrieben in GB 1,296,893 , ein. Kommerziell erhältliche Amylasen sind DuramylTM, TermanylTM, FungamylTM und BANTM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und RapidaseTM und Maxamyl PTM (erhältlich von Genencor).
  • Die Amylasen werden normalerweise in die Detergens-Zusammensetzung in einer Menge von 0,00001% bis 2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001% bis 1% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, mehr bevorzugt in einer Menge von 0,001% bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, noch mehr bevorzugt in einer Menge von 0,01% bis 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, beinhaltet.
  • Zellulasen: Jegliche Zellulase, die geeignet ist zur Verwendung in alkalischen Lösungen kann verwendet werden. Geeignete Zellulasen schließen solche von bakterieller oder Pilz-Herkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind beinhaltet. Geeignete Zellulasen sind in US 4,435,307 offenbart, welche Pilzzellulasen offenbart, die von Humicola Insolens produziert werden, in WO 96/34108 und WO 96/34092 , welche bakterielle alkalophile Zellulasen (BCE 103) aus Bacillus offenbaren und in WO 94/21801 , US 5,475,101 und US 5,419,778 , welche EG III Zellulasen aus Trichoderma offenbaren. besonders geeignete Zellulasen sind Zellulasen, die für die Farbpflege Vorteile haben. Beispiele für solche Zellulasen sind Zellulasen, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 495 257 beschrieben sind und die Endoglucanase der vorliegenden Erfindung. Kommerziell erhältliche Zellulasen schließen CelluzymeTM und CarezymeTM ein, die von einem Stamm von Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) produziert werden, KAC-500(B)TM (Kao Corporation) und PuradaxTM (Genencor International).
  • Zellulasen sind normalerweise in der Detergens-Zusammensetzung enthalten in einer Menge von 0,00001% bis 2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001% bis 1% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, mehr bevorzugt in einer Menge von 0,001% bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, noch bevorzugter in einer Menge von 0,01% bis 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung.
  • Peroxidasen/Oxidasen: Peroxidaseenzyme werden in Kombination mit Wasserstoffperoxid oder einer Quelle davon (z. B. einem Percarbonat, Perborat oder Persulfat) verwendet. Oxidase-Enzyme werden in Verbindung mit Sauerstoff verwendet. Beide Arten von Enzymen werden zum „Lösungsbleichen" verwendet, d. h. um der Übertragung eines Textilfarbstoffs von einem gefärbten Gewebe auf ein anderes Gewebe vorzubeugen, wenn die besagten Gewebe gemeinsam in einer Waschlösung gewaschen werden, vorzugsweise gemeinsam mit einem Verstärkungsmittel, wie es z. B. in WO 94/12621 und WO 95/01426 beschrieben ist. Geeignete Peroxidasen/Oxidasen schließen solche von pflanzlicher, bakterieller oder Pilz-Herkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind beinhaltet.
  • Peroxidasen und/oder Oxidasenzyme sind in der Detergens-Zusammensetzung normalerweise enthalten in einer Menge von 0,00001% bis 2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,001% bis 1% ab Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt in einer Menge von 0,001% bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, noch mehr bevorzugt in einer Menge von 0,01% bis 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung.
  • Mischungen der oben erwähnten Enzyme sind hier umfasst, insbesondere eine Mischung einer Protease, einer Amylase, einer Lipase und/oder einer Zellulase.
  • Das Enzym der Erfindung oder irgendein anderes Enzym, das in der Detergens-Zusammensetzung enthalten ist, ist in der Detergens-Zusammensetzung normalerweise in einer Menge von 0,00001% bis 2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001% bis 1% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, mehr bevorzugt in einer Menge von 0,001% bis 0,5% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, sogar noch mehr bevorzugt in einer Menge von 0,01% bis 0,2% an Enzymprotein gemessen am Gewicht der Zusammensetzung, enthalten.
  • Bleichmittel
  • Zusätzliche optionale Detergens-Inhaltsstoffe, die in den Detergens-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, schließen Bleichmittel wie z. B. PB1, PB4 und Percarbonat mit einer Partikelgröße von 400 bis 800 µm ein. Diese Bleichmittelkomponenten können ein oder mehrere Sauerstoff-Bleichmittel enthalten und, abhängig von dem gewählten Bleichmittel, ein oder mehrere Bleichaktivatoren. Sofern vorhanden, werden die Sauerstoffbleichmittelverbindungen typischerweise in Mengen von etwa 1% bis etwa 25% vorhanden sein. Im Allgemeinen sind Bleichmittelverbindungen optional hinzugefügte Komponenten in nicht-flüssigen Formulierungen, z. B. in körnigen Detergenzien.
  • Die Bleichmittelkomponente zur hiesigen Verwendung kann eines der Bleichmittel sein, die für Detergens-Zusammensetzungen einschließlich Sauerstoffbleichen geeignet sind, genauso wie andere, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Das Bleichmittel, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, kann ein aktiviertes oder nicht aktiviertes Bleichmittel sein.
  • Eine Kategorie eines Sauerstoffbleichmittels, das verwendet werden kann, umfasst Percarbonsäurebleichmittel und Salze davon. Geeignete Beispiele für diese Klasse von Mitteln schließen Magnesiummonoperoxyphthalathexahydrat, das Magnesiumsalz von Meta-Chloroperbenzoesäure, 4-Nonylamino-4-oxoperoxybuttersäure und Diperoxydodecandiolsäure ein. Solche Bleichmittel sind offenbart in US 4,483,781 , US 740,446 , EP 0 133 354 und US 4,412,934 . Stark bevorzugte Bleichmittel schließen ferner 6-Nonylamino-6-oxoperoxycapronsäure wie in US 4,634,551 beschrieben, ein.
  • Eine andere Kategorie von Bleichmitteln, die verwendet werden kann, umfasst die Halogenbleichmittel. Beispiele für Hypohalit-Bleichmittel schließen z. B. Trichlorisocyanursäure und die Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate und N-chloro- und N-bromoalkansulfonamide ein. Solche Materialien werden normalerweise mit 0,5 bis 10 Gew.-% des Endproduktes hinzugefügt, vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-%.
  • Das Wasserstoffperoxid freisetzende Mittel kann in Verbindung mit Bleichaktivatoren verwendet werden, wie z. B. Tetraacetylethylendiamin ((TAED), Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS, beschrieben in US 4,412,934 ), 3,5-Trimethyl-hexanoloxybenzolsulfonat (ISONOBS, beschrieben in EP 120 591 ) oder Pentaacetylglucose (PAG), welche perhydrolysiert werden, um eine Persäure als die aktive bleichende Form zu bilden, was zu verbessertem Bleicheffekt führt. Zusätzlich sind sehr geeignet die Bleichaktivatoren C8(6-Octanamido-caproyl)oxybenzolsulfonat, C9(6-Nonaamido-caproyl)oxybenzolsulfonat und C10(6-Decanamido-caproyl)oxybenzolsulfonat, oder Mischungen davon. Ferner geeignete Aktivatoren sind acylierte Citratester wie sie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 91870207.7 offenbart sind.
  • Geeignete Bleichmittel, einschließlich Peroxysäuren und Bleichsystemen umfassend Bleichaktivatoren und bleichende Peroxy-Sauerstoffverbindungen zur Verwendung in Reinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung sind in der Anmeldung USSN 08/136,626 beschrieben.
  • Das Wasserstoffperoxid kann auch durch Zusatz eines enzymatischen Systems vorliegen (d. h. ein Enzym und ein Substrat dafür), welches in der Lage ist, Wasserstoffperoxid am Beginn oder während des Wasch- und/oder Spülprozesses freizusetzen. Solche enzymatischen Systeme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 537 381 offenbart.
  • Andere Bleichmittel als die Sauerstoffbleichmittel sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und können hier verwendet werden. Eine Art von Nicht-Sauerstoffbleichmittel von besonderem Interesse schließt fotoaktivierte Bleichmittel wie z. B. sulfoniertes Zink und/oder Aluminiumphthalocyanin ein. Diese Materialien können auf dem Substrat während des Verfahrens abgelagert werden. Bei Bestrahlung mit Licht in der Anwesenheit von Sauerstoff, wie z. B. beim Aushängen der Kleidungsstücke im Tageslicht zum Trocknen, wird das sulfonierte Zinkphthalocyanin aktiviert und das Substrat wird folglich gebleicht. Bevorzugte Zinkphthalocyanine und fotoaktivierte Bleichverfahren sind in US 4,033,718 beschrieben. Typischerweise wird die Detergens-Zusammensetzung etwa 0,025 bis etwa 1,25 Gew.-% an sulfoniertem Zinkphthalocyanin enthalten.
  • Bleichmittel können auch einen Mangankatalysator umfassen. Der Mangankatalysator kann z. B. eine der Verbindungen sein, die in „Efficient manganese catalysts for lowtemperature bleaching", Nature 369, 1994, Seiten 637-639 beschrieben sind.
  • Schauminhibitoren
  • Ein anderer optionaler Inhaltsstoff ist ein Schauminhibitor, veranschaulicht durch Silikone, und Kieselsäure-Silikon-Mischungen. Silikone können im Allgemeinen durch alkylierte Polysiloxanmaterialien repräsentiert werden, während Kieselsäure normalerweise in feinverteilten Formen, veranschaulicht durch Kieselsäureaerogele und -xerogele und hydrophobe Kieselsäuren von verschiedenen Arten. Diese Materialien können als partikulare Bestandteile aufgenommen werden, in welchen der Schauminhibitor vorteilhafterweise freisetzbar aufgenommen ist, in einem wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, im Wesentlichen nicht oberflächenaktiven Detergens-undurchlässigen Träger. Alternativ kann der Schauminhibitor auch in einem flüssigen Träger gelöst oder dispergiert werden und durch Aufsprühen auf eine oder mehrere der anderen Bestandteile aufgebracht werden.
  • Ein bevorzugtes Silikonschaum-kontrollierendes Mittel ist in US 3,933,672 offenbart. Andere besonders nützliche Schauminhibitoren sind die selbstemulgierenden Silikonschauminhibitoren, beschrieben in der deutschen Patentanmeldung DTOS 2,646,126 . Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist DC-544, welches ein Siloxan-Glykol-Copolymer ist, kommerziell erhältlich von Dow Corning. Ein besonders bevorzugtes schaumkontrollierendes Mittel sind die Schauminhibitorsysteme umfassend eine Mischung von Silikonölen und 2-Alkylalkanolen. Geeignete 2-Alkylalkanole sind 2-Butyloctanol, welche kommerziell unter dem Handelsnamen Isofol 12 R erhältlich sind.
  • Solche Schauminhibitorsysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 593 841 beschrieben.
  • Besonders bevorzugte silikonschaumkontrollierende Mittel sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 92201649.8 beschrieben. Besagte Zusammensetzungen können eine Silikon/Silika-Mischung in Kombination mit pyrogener nicht poröser Kieselsäure (engl. fumed silica) wie z. B. AerosylR umfassen.
  • Die oben beschriebenen Schauminhibitoren werden normalerweise in Mengen von 0,001% bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise von 0,01 bis 1 Gew.-% eingesetzt.
  • Andere Bestandteile
  • Andere Bestandteile in Detergens-Zusammensetzungen verwendete Bestandteile können eingesetzt werden wie z. B. Schmutz tragende Mittel, Schmutz freisetzende Mittel, optische Aufheller, Scheuermittel, Bakterizide, Trübungsinhibitoren, Färbemittel und/oder verkapselte oder nicht verkapselte Parfüme.
  • Besonders geeignete Verkapslungsmaterialien sind wasserlösliche Kapseln, die aus einer Matrix von Polysaccharid und Polyhydroxy-Verbindungen bestehen, wie z. B. beschrieben in GB 1,464,616 .
  • Andere geeignete wasserlösliche Verkapselungsmaterialien umfassen Dextrine, die aus nicht-gelatinierten Stärkesäureestern von substituierten Bicarboxylsäuren wie z. B. beschrieben in US 3,455,838 stammen. Diese Säureesterdextrine sind vorzugsweise hergestellt aus solchen Stärken wie wachshaltigem Mais, wachshaltiger Hirse, Sago, Tapioka und Kartoffel. Geeignete Beispiele für besagte Verkapselungsmaterialien umfassen N-Lok, hergestellt von National Starch. Das N-Lok-Verkapselungsmaterial besteht aus einer modifizierten Maisstärke und Glukose. Die Stärke ist durch Hinzufügen monofunktionaler substituierter Gruppen wie z. B. Octenylbernsteinsäureanhydrid modifiziert.
  • Hier geeignete Mittel gegen Rückverschmutzung und Schmutz tragende Mittel schließen Zellulosederivate wie z. B. Methylzellulose, Carboxymethylzellulose und Hydroxyethylzellulose, und homo- oder copolymere Polycarbonsäuren oder ihre Salze ein. Polymere dieser Art schließen die Polyacrylate und Maleinsäureanhydrid-Acrylsäurecopolymere ein, die zuvor als Builder erwähnt wurden, ebenso wie die Copolymere von Maleinsäureanhydrid mit Ethylen, Methylvinylether oder Methacrylsäure, wobei das Maleinsäureanhydrid zu mindest 20 mol-% des Copolymers bildet. Diese Materialien werden normalerweise in Mengen von 0,5% bis 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von 0,75% bis 8%, am meisten bevorzugt von 1% bis 6 Gew.-% der Zusammensetzung verwendet.
  • Bevorzugte optische Aufheller sind von anionischer Art, Beispiele dafür sind Dinatrium-4,4-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,-4'-bis-(2-Morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino-stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonat, Mononatrium-4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2-sulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)-stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'bis(2-anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'-disulfonat, Natrium-2(stilbyl-4''-(naphtho-1',2':4,5)-1,2,3-triazol-2''-sulfonat und 4,4'-bis(2-sulfostyryl)biphenyl.
  • Andere geeignete Polymermaterialien sind die Polyethylenglykole, besonders diejenigen von einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000, besonders 2000 bis 8000 und am meisten bevorzugt etwa 4000. Diese werden in Mengen von 0,20% bis 5%, mehr bevorzugt von 0,25% bis 2,5 Gew.-% verwendet. Diese Polymere und die zuvor erwähnten homo- oder copolymeren Polycarboxylatsalze sind wertvoll um die Erhaltung des Weißtons, die Ablagerung von Gewebeasche, und die Reinigungswirkung in Bezug auf Lehm (engl. clay), proteinartige und oxidierbare Verschmutzungen in der Gegenwart von Übergangsmetallverunreinigungen zu verbessern.
  • Schmutzfreisetzungsmittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind herkömmliche Copolymere oder Terpolymere von Terephthalsäure mit Ethylenglykol und/oder Propylenglykol-Einheiten in verschiedenen Anordnungen. Beispiele für solche Polymere sind in US 4,116,885 und 4,711,730 und in EP 0 272 033 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Polymer gemäß EP 0 272 033 hat die Formel: (CH3(PEG)43)0,75(POH)0,25[T-PO)2,8(T-PEG)0,4]T(POH)0,25((PEG)43CH3)0,75 wobei PEG-(OC2H4)O- ist, PO ist (OC3H6O) und T ist (pOOC6H4CO).
  • Ebenfalls sehr nützlich sind modifizierte Polyester wie z. B. zufällige Copolymere von Dimethylterephthalat, Dimethylsulfoisophthalat, Ethylenglykol und 1,2-Propandiol, wobei die Endgruppen primär aus Sulfobenzoat und sekundär aus Monoestern von Ethylenglykol und/oder 1,2-Propandiol bestehen. Das Ziel ist es, ein Polymer zu erhalten, das an beiden Enden von Sulfobenzoatgruppen gecapped ist, „primär" in dem vorliegenden Kontext bedeutet, dass die meisten der hier besagten Copolymere an den Enden durch Sulfobenzoatgruppen gecapped sind. Jedoch werden einige Copolymere weniger als vollständig gecapped sein und daher können ihre Endgruppen aus Monoestern von Ethylenglykol und/oder 1,2-Propandiol bestehen, sie bestehen daher „sekundär" aus solchen Arten.
  • Die hier ausgewählten Polyester enthalten etwa 46 Gew.-% an Dimethylterephthalsäure, etwa 16 Gew.-% an 1,2-Propandiol, etwa 10 Gew.-% Ethylenglykol, etwa 13 Gew.-% Dimethylsulfonbenzoesäure und etwa 15 Gew.-% Sulfoisophthalsäure, und sie haben ein Molekulargewicht von etwa 3,000. Die Polyester und Verfahren für ihre Herstellung sind im Detail in EP 311 342 beschrieben.
  • Weichmacher
  • Gewebeweichmacher können auch in die Waschmittel-Detergens-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung aufgenommen werden. Diese Mittel von können anorganischer oder organischer Art sein. Anorganische Weichmacher sind veranschaulicht durch die Seifentone (engl. smectite clays), die in GB-A-1 400 898 und in US 5,019,292 offenbart sind. Organische Gewebeweichmacher schließen die wasserunlöslichen tertiären Amine ein, wie sie in GB-A-1 514 276 und EP 0 011 340 offenbart sind und ihre Kombination mit Mono-C12-C14 quaternären Ammoniumsalzen wie sie in EP-B-0 026 528 offenbart sind und di-langkettige Amide wie sie in EP 0 242 919 offenbart sind. Andere nützliche organische Inhaltsstoffe des Gewebeweichmachersystems schließen Polyethylenoxid-Materialien von hohem Molekulargewicht ein, wie sie in EP 0 299 575 und 0 313 146 offenbart sind.
  • Die Mengen des Seifentones sind normalerweise im Bereich von 5 bis 15%, mehr bevorzugt von 8 bis 12 Gew.-%, wobei das Material als ein trocken gemischter Bestandteil zu dem Rest der Formulierung hinzugefügt wird. Organische Gewebeweichmacher wie z. B. die wasserunlöslichen tertiären Amine oder die di-zweikettigen Amidmaterialien werden in Mengen von 0,5 bis 5 Gew.-% normalerweise 1 bis 3 Gew.-% beinhaltet, während die hochmolekularen Polyethylenoxidmaterialien und die wasserlöslichen kationischen Materialien in Mengen von 0,1 bis 2% normalerweise 0,15 bis 1,5 Gew.-% hinzugefügt werden. Diese Materialien werden normalerweise zu dem sprühgetrockneten Anteil der Zusammensetzung hinzugefügt, obwohl es in manchen Fällen bequemer sein kann, sie als ein trocken gemischtes partikuläres Material hinzufügen oder sie als eine geschmolzene Flüssigkeit auf die anderen festen Bestandteile der Zusammensetzung aufzusprühen.
  • Polymere farbübertragungsinhibierende Mittel
  • Die Detergens-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch von 0,001% bis 10%, vorzugsweise von 0,01% bis 2%, mehr bevorzugt von 0,05% bis 1%, bezogen auf das Gewicht, an polymeren farbübertragungsinhibierenden Mitteln enthalten. Die besagten polymeren farbübertragungsinhibierenden Mittel werden normalerweise in die Detergens-Zusammensetzungen aufgenommen, um die Übertragung von Farben von gefärbten Geweben auf Gewebe, die damit gewaschen werden, zu inhibieren. Diese Polymere haben die Fähigkeit, die flüchtigen Farbstoffe, die aus den gefärbten Materialien ausgewaschen werden, zu komplexieren oder zu adsorbieren, bevor die Farbstoffe die Möglichkeit haben, sich an die anderen Artikel in der Wäsche anzuheften.
  • Besonders geeignete polymere farbübertragungsinhibierende Mittel sind Polyamin N-Oxid-Polymere, Copolymere von N-Vinyl-pyrrolidon und N-Vinylimidazol, Polyvinylpyrrolidon-Polymere, Polyvinyloxazolidone und Polyvinylimidazole oder Mischungen davon.
  • Die Hinzugabe von solchen Polymeren verstärkt auch die Leistung der erfindungsgemäßen Enzyme.
  • Die erfindungsgemäße Detergens-Zusammensetzung kann in flüssiger Form, in Form von Pasten, Gelen, Riegeln (engl. bars) oder in granulärer Form sein.
  • Es können nicht staubende Granulate hergestellt werden, z. B. wie offenbart in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide an Novo Industri A/S) und sie können optional durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Beispiele für wachsartige Beschichtungsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000; ethoxylierte Nonylphenole, die von 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in welchen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatomen beinhaltet und in welchen 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten vorliegen; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Beschichtungsmaterialien, die für die Anwendung durch Flüssigbetttechniken geeignet sind, sind in GB 1483591 angegeben.
  • Granuläre Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in „kompakter Form" sein, d. h. sie können eine relativ höhere Dichte haben als herkömmliche granuläre Detergenzien, d. h. von 550 bis 950 g/l; in einem solchen Falle werden die granulären Detergens-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten im Vergleich zu herkömmlichen granulären Detergenzien eine niedrigere Menge an „anorganischen Füllsalzen"; typische Füllsalze sind Erdalkalimetallsalze von Sulfaten und Chloriden, typischerweise Natriumsulfat; „kompakte" Detergenzien umfassen typischerweise nicht mehr als 10% Füllsalz. Die flüssigen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in „konzentrierter Form" vorliegen, in diesem Falle werden die flüssigen Detergens-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung eine niedrigere Menge an Wasser im Vergleich zu herkömmlichen flüssigen Detergenzien enthalten. Typischerweise beträgt der Wassergehalt eines konzentrierten flüssigen Detergens weniger als 30%, mehr bevorzugt weniger als 20%, am meisten bevorzugt weniger als 10%, gemessen am Gewicht der Detergens-Zusammensetzungen.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können z. B. als Hand- oder Maschinenwaschmittel-Detergens-Zusammensetzungen formuliert werden, einschließlich Waschmittelzusatzzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der Vorbehandlung von gefärbten Geweben geeignet sind, in Gewebe-Weichermacherzusammensetzungen, die zum Spülmittel hinzugefügt werden, und in Zusammensetzungen zur Verwendung für allgemeine Reinigungsverfahren für harte Oberflächen im Haushalt und für Geschirrspülverfahren.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, aber sind nicht notwendigerweise dazu gedacht, den Umfang der Erfindung zu begrenzen oder andersartig zu definieren. In den Detergens-Zusammensetzungen haben die abgekürzten Kennzeichnungen der Bestandteile die folgenden Bedeutungen:
    • LAS:
    lineares C12-Alkyl-Natriumbenzolsulfonat
    TAS:
    Natrium-Talgalkylsulfat
    XYAS:
    C1X-C1Y-Natriumalkylsulfat
    SS:
    sekundäres Seifentensid der Formel 2-Butyloktansäure
    25EY:
    ein vorwiegend linearer C12-C15 primärer Alkohol kondensiert mit im Mittel Y mol an Ethylenoxid
    45EY:
    ein C14-C15 vorwiegend linearer primärer Alkohol kondensiert mit im Mittel Y mol an Ethylenoxid
    XYEZS:
    C1X-C1Y Natriumalkylsulfat kondensiert mit im Mittel Z mol an Ethylenoxid pro mol
    Nichtionisch:
    gemischt ethoxylierter/propoxylierter C13-C15 Fettalkohol mit einem mittleren Grad an Ethoxylierung von 3,8 und einem mittleren Grad an Propoxylierung von 4,5, verkauft unter dem Handelsnamen Plurafax LF404 durch die BASF GmbH
    CFAA:
    C12-C14-Alkyl-N-Methylglucamid
    TFAA:
    C16-C18-Alkyl-N-Methylglucamid
    Silikat:
    amorphes Natriumsilikat (SiO2:Na2O Verhältnis = 2,0)
    NaSKS-6:
    kristallines Phyllosilikat der Formel d-Na2Si2O5
    Carbonat:
    wasserfreies Natriumcarbonat
    Phosphat:
    Natriumtripolyphosphat
    MA/AA:
    Copolymer von 1:4 Malein-/Acrylsäure, mittleres Molekulargewicht etwa 80000
    Polyacrylat:
    Polyacrylat-Homopolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8000, verkauft unter dem Handelsnamen PA30 durch die BASF GmbH
    Zeolith A:
    wasserhaltiges Natriumaluminosilikat der Formel Na12(AlO2SiO2)12·27 H2O, die eine primäre Partikelgröße im Bereich von 1 bis 10 Mikrometern aufweist.
    Citrat:
    Trinatriumcitratdihydrat
    Zitronensäure:
    Zitronensäure
    Perborat:
    wasserfreies Natriumperboratmonohydrat-Bleichmittel, empirische Formel NaBO2·H2O2
    PB4:
    wasserfreies Natriumperborattetrahydrat
    Percarbonat:
    wasserfreies Natriumpercarbonat-Bleichmittel der empirischen Formel 2Na2CO3·3H2O2
    TAED:
    Tetraacetylethylendiamin
    CMC:
    Natriumcarboxymethylzellulose
    DETPMP:
    Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure), vermarktet von Monsanto unter dem Handelsnamen Dequest 2060
    PVP:
    Polyvinylpyrrolidonpolymer
    EDDS:
    Ethylendiamin-N,N'-bernsteinsäure, [S,S] Isomer in der Form des Natriumsalzes
    Schauminhibitor:
    25% Parrafinwachs Schmelzpkt. 50°C, 17% hydrophobe Kieselsäure, 58% Paraffinöl
    granulärer Schauminhibitor:
    12% Silikon/Kieselsäure, 18% Stearylalkohol, 70% Stärke in granulärer Form
    Sulfat:
    wasserfreies Natriumsulfat
    HMWPEO:
    Polyethylenoxid von hohem Molekulargewicht (engl. high molecular weight polyethylene Oxide)
    TAE 25:
    Talgalkoholethoxylat (25)
  • Detergens-Beispiel I
  • Eine granuläre Gewebereinigungszusammensetzung gemäß der Erfindung kann wie folgt zubereitet werden:
    Lineares Natrium-C12-Alkylbenzolsulfonat 6,5
    Natriumsulfat 15,0
    Zeolith A 26,0
    Natriumnitrilotriacetat 5,0
    Enzym der Erfindung 0,1
    PVP 0,5
    TAED 3,0
    Borsäure 4,0
    Perborat 18,0
    Phenolsulfonat 0,1
    Nebenbestandteile bis zu 100
  • Detergens-Beispiel II
  • Eine kompakte granuläre Gewebereinigungszusammensetzung (Dichte 800 g/l) gemäß der Erfindung kann wie folgt zubereitet werden:
    45AS 8,0
    25E3S 2,0
    25E5 3,0
    25E3 3,0
    TFAA 2,5
    Zeolith A 17,0
    NaSKS-6 12,0
    Zitronensäure 3,0
    Carbonat 7,0
    MA/AA 5,0
    CMC 0,4
    Enzym der Erfindung 0,1
    TAED 6,0
    Percarbonat 22,0
    EDDS 0,3
    granulärer Schauminhibitor 3,5
    Wasser/Nebenbestandteile bis zu 100%
  • Detergens-Beispiel III
  • Granuläre Gewebereinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung, die besonders nützlich beim Waschen von gefärbten Geweben sind, wurden wie folgt zubereitet:
    LAS 10,7 -
    TAS 2,4 -
    TFAA - 4,0
    45AS 3,1 10,0
    45E7 4,0 -
    25E3S - 3,0
    68E11 1,8 -
    25E5 - 8,0
    Citrat 15,0 7,0
    Carbonat - 10
    Zitronensäure 2,5 3,0
    Zeolith A 32,1 25,0
    Na-SKS-6 - 9,0
    MA/AA 5,0 5,0
    DETPMP 0,2 0,8
    Enzym der Erfindung 0,10 0,05
    Silikat 2,5 -
    Sulfat 5,2 3,0
    PVP 0,5 -
    Poly(4-vinylpyridin)-N-Oxid/Copolymer von Vinylimidazol und Vinylpyyrolidon - 0,2
    Perborat 1,0 -
    Phenolsulfat 0,1 -
    Wasser/Nebenbestandteile bis zu 100%
  • Detergens-Beispiel IV
  • Granuläre Gewebereinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung, welche eine Fähigkeit zum „Weichmachen während des Waschens" bereitstellen, können wie folgt zubereitet werden:
    45AS - 10,0
    LAS 7,6 -
    68AS 1,3 -
    45E7 4,0 -
    25E3 - 5,0
    Kokos-alkyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid 1,4 1,0
    Citrat 5,0 3,0
    Na-SKS-6 - 11,0
    Zeolith A 15,0 15,0
    MA/AA 4,0 4,0
    DETPMP 0,4 0,4
    Perborat 15,0 -
    Percarbonat - 15,0
    TAED 5,0 5,0
    Seifenton 10,0 10,0
    HMWPEO - 0,1
    Enzym der Erfindung 0,10 0,05
    Silikat 3,0 5,0
    Carbonat 10,0 10,0
    granulärer Schauminhibitor 1,0 4,0
    CMC 0,2 0,1
    Wasser/Nebenbestandteile bis zu 100%
  • Detergens-Beispiel V
  • Flüssige Hochleistungs-Gewebereinigungszusammensetzungen für gemäß der Erfindung können wie folgt zubereitet werden:
    I II
    LAS in Form der Säure - 25,0
    Zitronensäure 5,0 2,0
    25AS in Form der Säure 8,0 -
    25AE2S in Form der Säure 3,0 -
    25AE7 8,0 -
    CFAA 5 -
    DETPMP 1,0 1,0
    Fettsäure 8 -
    Oleinsäure - 1,0
    Ethanol 4,0 6,0
    Propandiol 2,0 6,0
    Enzym der Erfindung 0,10 0,05
    Coco-alkyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid - 3,0
    Seifenton - 5,0
    PVP 2,0 -
    Wasser/Nebenbestandteile bis zu 100%
  • Textilanwendungen
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase in einem Biopolishing-Verfahren. Biopolishing ist eine spezielle Behandlung der Garnoberfläche, die die Gewebequalität in Bezug auf Handhabung und Erscheinung ohne Verlust der Gewebebenetzbarkeit verbessert. Die wichtigsten Wirkungen von Biopolishing können charakterisiert werden durch weniger Fusseln und Pilling, verstärkten Schein/Glanz, verbesserte Gewebehandhabung, verstärkte dauerhafte Weichheit und geänderte Wasserabsorption. Biopolishing geschieht üblicherweise in der feuchten Verarbeitung der Herstellung von gestrickten und gewebten Geweben. Feuchte Verarbeitung umfasst solche Schritte wie z. B. Appreturentfernung (engl. desizing), Reinigen, Bleichen, Waschen, Färben, Bedrucken und Endbehandlung. In jedem dieser Schritte wird das Gewebe mehr oder weniger einer mechanischen Wirkung unterzogen. Im Allgemeinen geht das Gewebe, nachdem die Textilien gestrickt oder gewebt worden sind, zu einem Desizing-Schritt über, gefolgt von einem Reinigungsschritt, etc. Desizing ist die Maßnahme des Entfernens von Appretur (engl. Size) aus Textilien. Vor dem Weben auf mechanischen Webstühlen werden die Anscherungsgarne (engl. warp yarns) häufig mit Appreturstärke oder Stärkederivaten beschichtet, um ihre Zugfestigkeit zu vergrößern. Nach dem Weben muss die Appreturschicht vor dem weiteren Verabeiten des Gewebes entfernt werden, um ein homogenes und waschechtes Ergebnis sicherzustellen. Es ist bekannt, dass eine Kombination von zellulolytischer und mechanischer Einwirkung benötigt wird, um die Wirkungen des Biopolishing zu erreichen. Es ist ebenfalls bekannt, dass eine „Superweichheit" erreichbar ist, wenn die Behandlung mit einer Zellulase mit einer konventionellen Behandlung mit Weichmachern kombiniert wird. Es wird daran gedacht, dass die Verwendung der Endoglucanase der Erfindung zum Biopolishing von Zellulose-Geweben vorteilhaft ist, z. B. dass ein gründlicheres Polishing erreicht werden kann. Biopolishing kann durch das Anwenden des Verfahrens, das z. B. in WO 93/20278 beschrieben ist, erhalten werden.
  • Stone-washing
  • Es ist bekannt, dass ein „stone-washed" Aussehen (der lokalisierte Abrieb von Farbe) in gefärbtem Gewebe erreicht werden kann, insbesondere in Jeansgewebe (engl. denim fabric) oder in Jeans, und zwar entweder durch das Waschen des Jeansgewebes oder der Jeans, die aus solch einem Gewebe hergestellt sind, in der Gegenwart von Bimssteinen, um die gewünschte lokalisierte Aufhellung der Farbe des Gewebes bereitzustellen oder durch das enzymatische Behandeln des Gewebes, insbesondere mit zellulolytischen Enzymen. Die Behandlung mit einer Endoglucanase der vorliegenden Erfindung kann entweder alleine ausgeführt werden, wie offenbart in US 4,832,864 , zusammen mit einer kleineren Menge an Bimsstein als in gewöhnlichen Verfahren benötigt, oder zusammen mit Perlit, wie offenbart in WO 95/09225 .
  • Materialien und Methoden
  • Organismen
  • Saccharothrix australiensis, IFO 14444, umfasst die für eine Zellulase kodierende DNA-Sequenz der Erfindung.
  • Escherichia coli, DSM 11476, enthaltend das Plasmid, das die DNA-Sequenz, die für das zellulolytische Enzym der Erfindung kodiert, umfasst, in dem Klonierungsvektor pSJ1678.
  • Andere Stämme
  • E. coli-Stamm: Zellen von E. coli SJ2 (Diderichsen, B. et al. (1990)) wurden für die Elektroporation vorbereitet und durch Elektroporation unter Verwendung eines Gene PulserTM-Elektroporators von BIORAD, wie beschrieben durch den Hersteller, transformiert.
  • Plasmide:
  • pSJ1678 (siehe WO 94/19454 , welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird).
  • Allgemeine molekuiarbiologische Verfahren:
  • DNA-Manipulationen und -transformationen wurden unter Verwendung der Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al., (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood et al. (1990)).
  • Enzyme für die DNA-Manipulation wurden gemäß den Spezifikationen der Hersteller verwendet.
  • Isolierung der DNA-Sequenz, die für das zellulolytische Enzym der Erfindung kodiert:
  • Die DNA-Sequenz, die die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte und für die erfindungsgemäße Endoglucanase kodierende DNA-Sequenz umfasst, kann aus dem hinterlegten Organismus E. coli, DSM 11476, durch Extraktion der Plasmid-DNA mit Hilfe von Verfahren erhalten werden, die im Stand der Technik bekannt sind (Sambrook et al. (1989)).
  • Klonieren des Saccharothrix australiensis Endo-β-1,4-Glucanase-Gens
  • Präparation genomischer DNA:
  • Der Stamm Saccharothrix australiensis, IFO 14444 wurde auf TY-Agar-Medium bei 30°C für 2 bis 3 Tage vermehrt. Die Zellen wurden durch Abkratzen von den Platten geerntet und die genomische DNA wurde durch das Verfahren, das von Pitcher et al. (1989) beschrieben ist, isoliert.
  • Die einzige Veränderung gegenüber dem publizierten Verfahren ist das Hinzufügen von Mutanolysin (Katalog Nr. M-9901, Sigma, USA) von 30 ug/ml zum Lyse-Puffer, der ursprünglich nur Lysozym enthält.
  • Konstruktion einer genomischen Bibliothek:
  • Die genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,7% Agarose-Gel größenfraktioniert. Fragmente zwischen 2 und 7 kb Größe wurden durch Elektrophorese auf DEAE-Zellulosepapier (Dretzen et al. (1981)) isoliert.
  • Isolierte DNA-Fragmente wurden an BamHI verdaute pSJ1678 Plasmid-DNA ligiert und die Ligationsmischung wurde zum Transformieren von E. coli SJ2 verwendet.
  • Die Zellen wurden auf LB-Agarplatten enthaltend 0,1% CMC (Natriumcarboxymethylzellulose, Aqualon, Frankreich) und 9 µg/ml Chloramphenicol ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Identifizierung positiver Klone durch Koloniehybridisierung
  • Eine DNA-Bibliothek in E. coli, hergestellt wie oben beschrieben, wurde auf LB-Agarplatten enthaltend 0,1% CMC (Natriumcarboxymethylzellulose, Aqualon, Frankreich) sowie 9 µg/ml Chloramphenicol gescreent und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Tranformanten wurden nachfolgend auf die gleiche Art von Platten replika-plattiert und diese neuen Platten wurden für 8 Stunden oder über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Die ursprünglichen Platten wurden unter Verwendung von 1 mg/ml Kongorot (Kongo Red, SIGMA, USA) gefärbt. Die Färbung wurde für eine halbe Stunde bei mäßigem kreisförmigem Schütteln (engl. orbital shaking) fortgesetzt, nach welchem die Platten zweimal 15 Minuten unter Verwendung von 1 M NaCl gewaschen wurden.
  • Gelbe Höfe erschienen an den Stellen, wo Zellulase-positive Klone vorhanden waren, diese Zellulase-positiven Klone wurden von den Replika-Platten wiedergewonnen und auf LB-Agarplatten enthaltend 0,1% CMC und 9 µg/ml Chloramphenicol erneut ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Charakterisierung positiver Klone:
  • Von den Wiederausstrich-Platten wurden die Endoglucanase-positiven Klone als einzelne Kolonien erhalten und die Plasmide wurden extrahiert. Die Phänotypen wurden durch Retransformation von E. coli SJ2 bestätigt und die Plasmide durch Restriktionsverdau charakterisiert.
  • Das Endoglucanase-Gen wurde durch DNA-Sequenzierung charakterisiert, unter Verwendung des Taq-Desoxyterminalen Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, USA), fluoreszenten markierte Terminatoren und 5 pmol des Primers #3507:
    5'-GGC TTT TAA GCC GTC TGT ACG-3'.
  • In einer anderen Reaktion wurde die Nukleotidsequenz unter Verwendung des Primers #8392 bestimmt:
    5'-CTC ACG TTA AGG GAT TTT GGT CTG G-3'
  • Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. (1984) ausgeführt. Die Sequenz entspricht der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Diese erste DNA-Sequenz, die auf diese Art erhalten wurde, wurde verwendet, um neue Primer für ein weiteres Sequenzieren des Endoglucanase-Gens zu gestalten und wiederum neue Primer wurden gestaltet, die zum Sequenzieren verwendet wurden usw.
  • Medien
  • TY- und LB-Agar (wie beschrieben in Ausubel et al., (1995)).
  • Bestimmung der zellulolytischen Aktivität
  • Die zellulolytische Aktivität der Endoglucanase wird in Bezug auf einen analytischen Standard bestimmt und kann in der Einheit ECU ausgedrückt werden.
  • Zellulolytische Enzyme hydrolysieren CMC, und senken dabei die Viskosität der Inkubationsmischung. Die resultierende Reduktion der Viskosität kann durch ein Vibrationsviskosimeter (z. B. MIVI 3000 von Sofraser, Frankreich) bestimmt werden.
  • Die Bestimmung der zellulolytischen Aktivität, gemessen in den Einheiten ECU, kann gemäß dem Analyseverfahren AF 301.1 bestimmt werden, welches vom Anmelder auf Anforderung erhalten werden kann.
  • Der ECU-Assay quantifiziert die Menge an katalytischer Aktivität, die in einer Probe vorhanden ist, durch das Messen der Fähigkeit der Probe, die Viskosität einer Lösung an Carboxymethylzellulose (CMC) zu reduzieren. Der Assay wird bei 40°C, pH 7,5 unter Ver wendung eines Vergleichs-Enzymstandards zum Reduzieren der Viskosität des CMC-Substrates ausgeführt.
  • Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Klonieren und Exprimieren einer Endo-β-1,4-Glucanase aus Saccharothrix australiensis, IFO 14444
  • Die Präparation genomischer DNA aus Saccharothrix australiensis, IFO 14444, die Klonierung des Endoglucanase-Gens und das DNA-Sequenzieren wurde ausgeführt, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Eine positive Transformante, die isoliert wurde, war DSM 11476, enthaltend das Plasmid pSJ1678, das ein Insert von etwa 2300 Basenpaaren enthält. Dieses Insert wurde teilweise DNA-sequenziert und offenbarte das Vorhandensein einer Sequenz eines Endoglucanase-kodierenden Gens. Gemäß der Klassifizierung von Glycosyl-Hydrolasen (Henrissat et al., (1993)) gehört die Endoglucanase zu der Familie 6 der Glycosyl-Hydrolasen.
  • Die Nukleotidsequenz wird als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet.
  • Die DNA entsprechend dem Endo-β-1,4-Glucanase-Gen ist aus dem Plasmid erhältlich, das aus dem Stamm erhalten werden kann, der als DSM 11476 hinterlegt ist.
  • BEISPIEL 2
  • Endo-β-1,4-Glucanase von verschiedenen Saccharothrix-Stämmen
  • Die folgenden Stämme wurden getestet:
    Saccharothrix texasenis, NRRL B-16134
    Saccharothrix waywayandensis, NRRL B-16159
    Saccharothrix cryophilis, NRRL B-16238,
    Saccharothrix sp., IFO 13785,
    Saccharothrix flava, ATCC 29533,
    Saccharothrix coeruleofusca, ATCC 35108
    Saccharothrix longispora, ATCC 31109,
    Saccharothrix mutabilis ssp. mutabilis, ATCC 31520,
    Saccharothrix aerocolonigenes, ATCC 23870,
    Saccharothrix mutabilis ssp. capreolus, ATCC 23892,
    Saccharothrix syringae, DSM 43886.
  • A. Southern-Hybridisierungstestung von Saccharothrix-Stämmen
  • Präparation von genomischer DNA
  • Jeder Saccharothrix-Stamm (siehe oben) wurde auf TY-Agar-Medium, das mit 2% löslicher Stärke ergänzt war, bei 25°C für 3–4 Tage vermehrt. Die Zellen wurden geerntet und die genomische DNA wurde durch das Verfahren, das durch Pitcher et al. beschrieben ist isoliert (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).
  • Hybridisierungsbedingungen
  • Geeignete Bedingungen für die Bestimmung der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beinhaltet das Voreinweichen des Filters, das die zu hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Standard saline citrate) für 10 min., und die Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC (Sambrook et al. 1989), 5 × Denhardts-Lösung (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS und 100 µg/ml an denaturierter ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA (Sambrook et al. 1989) gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung enthaltend eine zufalls-geprimete (Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13), 32P-dCTP-markierten Sonde (spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/µg) für 12 Stunden bei ca. 45°C. Der Filter wird dann zweimal für 30 min. in 2 × SSC, 0,5% SDS gewaschen, vorzugsweise bei mindestens 55°C, stärker bevorzugt bei mindestens 60°C, stärker bevorzugt bei mindestens 65°C, noch stärker bevorzugt bei mindestens 70°C, insbesondere bei mindestens 75°C.
  • Experimentell
  • Sonde:
    • 2,5 kb-Fragment aus pMB145 (Saccharothrix australiensis, IFO 14444).
  • Ergebnis:
    • alle Stämme hybridisierten an BamHI.
  • Dementsprechend produzieren alle Stämme eine Endo-β-1,4-Glucanase, die zur Familie 6 gehört.
  • B. CMC-Kongorot-Assay von Saccharothrix-Stämmen (Identifizierung positiver Klone durch Koloniehybridisierung)
  • Verfahren:
  • Die Stämme auf Weizenkleie-Medium (Weizenkleie 4%, Hefeextrakt 0,1% und Agar 1,5%) bei 30°C für 4 Tage wachsen gelassen. Agar-Stöpsel wurden auf CMC-Assayplatten (basal: CMC 0,1%, Agar 1,5%) bei verschiedenen pHs (pH 5, 7, 9, 10) platziert. LAS (lineares Alkylsulfat) wurde auf eine Endkonzentration von 0,1% hinzugefügt. AZCL-HE wurde bei pH 7 verwendet. Die Inkubation wurde bei 40°C über Nacht ausgeführt. Dann wurde die Platte mit Kongorot gefärbt, und der Durchmesser der Klärungszonen (mm) wurde gemessen. Ergebnisse (Durchmesser in mm):
    Quelle AZCL-HE pH 7 pH9
    IFO 14444 12 17 13
    NRRL B-16134 10 17 15
    NRRL B-16159 9 13 12
    NRRL B-16238 - 9 -
    IFO 13785 22 23 16
    ATCC 29533 8 9 -
    ATCC 35108 13 16 15
    ATCC 31109 13 18 10
    ATCC 31520 18 21 16
    ATCC 23870 13 16 10
    ATCC 23892 13 16 13
    DSM 43886 12 16 13
  • BEISPIEL 3
  • Reinigung und Charakterisierung einer Endo-β-1,4-Glucanase aus Saccharothrix australiensis, IFO 14444
  • Das Plasmid von Beispiel 1 wurde in E. coli JM 109 insertiert.
  • Der E. coli-Stamm wurde in Super-Broth (Pankreasverdau von Casein 32 g/l, Hefeextrakt 20 g/l und NaCl 5 Gramm/l, eingestellt auf pH 7,0) bei 37°C für einen Tag wachsen gelassen. Die Zellen wurden gesammelt und durch Utraschallbehandlung lysiert. Der Überstand wurde gefriergetrocknet. 24 Gramm wurden aus 13 1 der Fermentation mit einer Gesamtaktivität von 4600 ECU erhalten.
  • Reinigung
  • Das Pulver wurde in insgesamt 175 ml Ionenaustauscherwasser verdünnt. Unter Verwendung von 50 Gramm Avicel bei 4°C, auf einer Säule 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5 und gewaschen unter Verwendung von starkem Salz (0,5 M NaCl) in dem gleichen Puffer. Das Enzym eluierte unter Verwendung von Ionenaustauscher-gereinigtem Wasser. Insgesamt 2550 ECU wurden erhalten. Die Probe enthielt immer noch etwas Farbe und wurde weiter unter Verwendung von Ionenaustauscher-Chromatographie gereinigt. Eine HPQ-Säule, die mit 50 mM Tris pH 7,5 equilibriert worden war, wurde zum Binden des Enzyms verwendet, und die Farbe eluierte, das reine Enzym wurde unter Verwendung eines NaCl-Gradienten eluiert.
  • Charakterisierung:
  • Das gereinigte Protein ergab eine einzelne Bande in einer SDS-PAGE von 50 kDa mit einem pI von etwa 3,7.
  • Die spezifische Aktivität, bezogen auf ECU, betrug 50 ECU pro mg an Protein. Ein molarer Extinktionswert von 113380 basierte auf der Aminosäurezusammensetzung und wurde für die Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet, nachdem ein Verhältnis von 1,8 (E280/E260) erhalten worden war, und unter Verwendung des MW von 50 kDa.
  • Die katalytische Aktivität auf Phosphorsäure gequollener Zellulose bei pH 8,5 war eine apparente kcat von 22 pro Sekunde und eine apparente KM von 0,6 g/l. Die Zellulase hat keine Aktivität auf PNP-beta-Cellobiosid.
  • Puffer
  • Alle Enzym-Experimente wurden in einem der folgenden Puffer ausgeführt:
    pH 3,0 bis 3,5: 0,1 M Natriumcitrat
    pH 4,0 bis 5,5: 0,1 M Natriumacetat
    pH 6,0: 0,1 M Natrium-MES-Puffer
    pH 6,5 bis 7,5: 0,1 M Natrium-MOPS-Puffer
    pH 8,0 bis 8,5: 0,1 M Barbital-Puffer
    pH 9,0 bis 10,0: 0,1 M Glycin-Puffer
  • pH-Aktivitätsprofile
  • Die pH-Aktivitätsprofile wurden unter Verwendung von CMC erhalten. Die Endkonzentration von CMC betrug 7,5 Gramm pro Liter, die Inkubation war 20 min. bei 40°C und die Bildung von reduzierenden Zuckern wurde unter Verwendung von p-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PHBAH) bestimmt, modifiziert von Lever (1972) unter Verwendung von 5 g an Kaliumnatriumtartrat zusätzlich zu den 1,5 g an PHBAH. Das pH-Optimum betrug 8,0 und mehr als 50% relative Aktivität wurden zwischen pH 6,5 und 9,0 erhalten.
  • Bestimmung der apparenten kinetischen Konstante unter Verwendung von Phosphorsäuregequollener Zellulose (PASC) (phosphoric acid swollen cellulose)
  • PASC-Stocklösung wurde wie folgt hergestellt: 5 g an Zellulose (Avicel) wurden mit Wasser angefeuchtet und 150 ml eiskalte 85%ige ortho-Phosphorsäure wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde in einem Eisbad für eine Stunde langsam gerührt. Dann wurden 100 ml eiskaltes Aceton während des Rührens hinzugefügt. Der Schlamm wurde auf einen Büchner-Filter mit einer Pyrex-gesinterten Scheibe Nr. 3 übertragen und dann dreimal mit 100 ml eiskaltem Aceton gewaschen, wobei er nach jeder Waschung so trocken wie möglich gesaugt wurde. Schließlich wurde er zweimal mit 500 ml Wasser gewaschen und nach jeder Waschung so trocken wie möglich gesaugt. Das PASC wurde mit deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml gemischt. Es wurde bis zur Homogenität gemixt (unter Verwendung eines Ultra Turrax Homogenisators) und in einem Kühlschrank für bis zu einen Monat gelagert.
  • Das Substrat wurde mit Puffer unter Verwendung des folgenden Verfahrens equilibriert:
    20 g Phosphorsäure gequollene Zellulose PASC-Stocklösung wurde für 20 min. bei 5000 Upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Sediment wurde in 30 ml an Puffer resuspendiert. Nach 20 min. Zentrifugation bei 5000 Upm wurde der Überstand dekantiert und das Sediment wurde in einem Puffer auf eine Gesamtmenge von 30 g resuspendiert. Dies entspricht einer Substratkonzentration von 10 mg 1–1.
  • Um die kinetischen Parameter zu messen, wurden Substratkonzentrationen von 0,2 mg ml–1 bis 8 mg ml–1 verwendet. Die Geschwindigkeiten wurden bei acht unterschiedlichen Substratkonzentrationen jeweils zweifach gemessen. Die Menge an reduzierenden Zuckern wurde unter Verwendung des PHBAH-Verfahrens, modifiziert von Lever (1972) bestimmt.
  • Die Enzymkonzentration wurde unter Verwendung der molaren Extinktion bestimmt. Die scheinbaren (engl. apparent) kinetischen Konstanten KM(app.), Vmax(app.) und kcat(app.) wurden unter Verwendung der Gleichung für Enzymkinetik in dem Computerprogramm GraFit berechnet (Leatherbarrow, 1992).
  • BEISPIEL 4
  • Verlust an Zugfestigkeit, induziert durch das Behandeln von Gewebe mit Endo-β-1,4-Glucanase aus Saccharothrix australiensis, IFO 14444
  • Es wurde der Verlust an Zugfestigkeit induziert durch das Behandeln von Textilien mit der gereinigten Endoglucanase aus Beispiel 3 gemessen und mit einer Familie-6-Endoglucanase aus einem Pilz verglichen. Experimentelles Protokoll:
    Puffer: 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0
    Volumen: 100 ml
    Temperatur: Raumtemperatur
    Textilien: vorgealterte Geschirrtücher ED 9613829, 5 Stück 5 × 25 cm
    Dosierung: 2 × 0, 1000, 10000, 100000 ECU/1 Carezyme 59100 ECU/1 MB145 1900, 19000, 190000 ECU/1 an Familie-6-Zellulasen
    Zeit: 7 Tage Dunkellagerung
    Spülzeit: 10 min. in laufendem Leitungswasser
    Bewertung: Verlust an Zugfestigkeit gemessen auf einem Instron-Instrument 5564. Bruch innerhalb 20 +/–3 sec.
  • Vorgealtertes Gewebe wurde für eine Woche mit unterschiedlichen Dosierungen des Enzyms in Phosphatpuffer von pH 7,0 inkubiert. Danach wurde das Gewebe in Wasser gewaschen, in einem Klimaraum für 24 Stunden (60% relative Luftfeuchtigkeit, 20°C) akklimatisiert. Die Zugfestigkeit wurde auf einem Instron-Instrument gemessen. Der Verlust an Zugfestigkeit wird relativ zu einem vorgealterten Textil, das nicht inkubiert wurde (Referenz) berechnet. Leerprobe (kein Enzym) und die EG VI aus dem Pilz Humicola insolens (Familie-6-Endoglucanase) wurden in das Experiment zum Vergleich einbezogen. Ergebnisse:
    ECU/1 % TSL
    Referenz 0
    Leerprobe 0 –3,6
    Pilz-EG VI 19000 1,2
    190000 12,5
    Enzym der Erfindung 59100 –6,7
  • Das Enzym der Erfindung führte zu keinem Verlust an Zugfestigkeit.
  • BEISPIEL 5
  • Farbklärung in Terg-O-Meter
  • In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit der Endoglucanase der Erfindung, die Farbe von Baumwolltextilien zu verjüngen, unter Verwendung eines Tests zum Bestimmen von Farbpflege-Vorteilen gezeigt, d. h. „Farbklärung" von Baumwollstoff in einer verkleinerten Waschmaschine, dem 100 ml Terg-O-Meter.
  • 250 ml-Becher mit 100 ml Puffer (oder Detergens) wurden in das Terg-O-Meter gestellt und bei 35°C equlibriert. Dann wurden zwei 7 × 7 cm-Ausschnitte von schwarzem, gewebtem Baumwollstoff zu jedem Becher hinzugefügt, die Rührer wurden in Bewegung gesetzt und schließlich wurde das Enzym hinzugefügt: A) eine Leerprobe, B) drei unterschiedliche Dosierungen eines Standards (z. B. die kommerziell erhältliche Enzymzubereitung CelluzymeTM) und C) zwei unterschiedliche Dosierungen der erfindungsgemäßen Endoglucanase. Die Inkubation wurde dann für 30 min. bei 35°C fortgesetzt.
  • Nach 30 min. Inkubation wurden die Stoffproben in kaltem Leitungswasser für 10 min. gewaschen und in einem Tumbler getrocknet.
  • Der Zyklus von Inkubation und Spülen/Trocknen wurde einmal wiederholt – oder solange, bis die Stoffproben in Bezug auf ihre Farbe und/oder Fusseln in der Ausschnittsoberfläche sich deutlich unterschieden.
  • Schließlich wurden die Stoffproben im Vergleich zu den Stoffproben der Leerprobe (kein Enzym) und dem Standard (z. B. Celluzyme) eingestuft. Die visuelle Einstufung wurde von einem Panel von geübten Bewertern ausgeführt und die Farbe wurde mit einem Remissi onsspektrometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 als „Farbklärung" (CC colour clarification) der erhaltenen Stoffproben pro Aktivitätseinheit des Enzyms ausgedrückt. Tabelle 1
    Enzym Zellulase-Familie CC – schwarz, gewebt
    Celluzyme mehrkomponentig 1,0
    Leerprobe kein Enzym 0,0
    Saccharothrix australiensis Endoglucanase 1,8
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001

Claims (26)

  1. Eine Endo-β-1,4-Glucanase, welche (a) ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz wie gezeigt in den Positionen 226-490 von SEQ ID Nr: 2 ist, oder (b) ein Polypeptid ist, welches mindestens 75% homolog zu dem Polypeptid definiert in (a) ist.
  2. Ein isoliertes Polynukleotidmolekül kodierend für ein Polypeptid, dass eine Endo-beta-1,4-Endoglucanaseaktivität hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynukleotidmoleküle umfassend eine Nukleotidsequenz wie gezeigt in SEQ ID Nr: 1 von Nukleotid 676 bis Nukleotid 1470; (b) Polynukleotidmoleküle, die für ein Polypeptid kodieren, das zumindest 80% identisch zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 von Aminosäurerest 226 bis Aminosäurerest 490 ist; und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b).
  3. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 2, wobei das Polynukleotid DNA ist.
  4. Ein isoliertes Polynukleotidmolekül, dass für ein Polypeptid kodiert, dass Endo-beta-1,4-Glucanaseaktivität hat, wobei das Polynukleotidmolekül an eine denaturierte doppelsträngige DNA-Probe unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA-Proben umfassend die Sequenz gezeigt in Positionen 676–1470 von SEQ ID Nr: 1 und DNA-Proben umfassend eine Untersequenz von Positionen 676–1470 von SEQ ID Nr: 1, die eine Länge von mindestens etwa 100 Basenpaaren haben.
  5. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 4, welches isoliert ist aus oder produziert auf der Basis einer DNA-Bibliothek von einem Prokaryoten, vorzugsweise von einem Bakterium, am meisten bevorzugt von einem Grampositiven Bakterium.
  6. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 5, welches isoliert ist aus oder hergestellt ist auf der Basis einer DNA-Bibliothek von einem Stamm, der zu der Klasse der Aktinomyzeten gehört, bevorzugt zu der Familie Pseudonocardiaceae, am meisten bevorzugt zu der Gattung Saccharothrix, insbesondere zu einem Stamm von Saccharothrix australiensis, speziell Saccharothrix australiensis, IFO 14444.
  7. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß einem der Ansprüche 2–6, welches aus Escherichia coli, DSM 11476, isoliert ist.
  8. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß einem der Ansprüche 2–7 welches weiterhin eine Teil-DNA-Sequenz umfasst, die für eine Zellulosebindedomaine (cellulose binding domain, CBD) kodiert.
  9. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 8, wobei die Teilnukleotidsequenz kodierend für eine Zellulosebindedomaine (CBD) den Nukleotiden in Positionen 60–435 von SEQ ID Nr: 1 entspricht.
  10. Das isolierte Polynukleotidmolekül gemäß Anspruch 8 oder 9, welches weiterhin eine Teilnukleotidsequenz umfasst, die für einen Linker-Bereich kodiert, wobei der Linker-Bereich funktionell die Zellulosebindedomäne (CBD) und die katalytisch aktive Domäne (catalytically aktive domain, CAD) von dem Enzym verknüpft, für das die Nukleotidsequenz kodiert, die von dem isolierten Polynukleotidmolekül umfasst ist.
  11. Ein Expressionsvektor umfassend die folgenden funktionell verknüpften Elemente: Ein Transkriptionspromoter; ein DNA-Abschnitt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynukleotidmoleküle kodierend für ein Polypeptid, das Endo-beta-1,4-Glukanaseaktivität hat, umfassend einen Nukleotidsequenz wie gezeigt in SEQ ID Nr: 1 von Nukleotid 676–1470, (b) Polynukleotidmoleküle kodierend für ein Polypeptid, das Endo-beta-1,4-Glukanaseaktivität hat, das mindestens 80% identisch ist zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 2 von Aminosäurerest 226 bis Aminosäurerest 490, und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und ein Transkriptionsterminator.
  12. Eine kultivierte Zelle, in welche ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 11 eingeführt worden ist, wobei die Zelle das Polypeptid exprimiert, das von dem DNA-Abschnitt kodiert wird.
  13. Die Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist, insbesondere eine bakterielle Zelle, oder eine endogene Zelle, aus welcher der DNA-Abschnitt stammt, der für das Polypeptid kodiert, das Endoglucanaseaktivität zeigt.
  14. Die Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle zu einem Stamm von Bacillus gehört, vorzugsweise zu einem Stamm von Bacillus subtilis oder Bacillus lentus.
  15. Eine Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle zu einem Stamm von Saccharothrix australiensis gehört, vorzugsweise zu Saccharothrix australiensis, IFO 14444.
  16. Die Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle zu einem Stamm von Pseudomonas gehört, vorzugsweise zu einem Stamm von Pseudomonas fluorescens oder Pseudomonas mendocina.
  17. Die Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle zu einem Stamm von Streptomyces gehört.
  18. Eine Zelle gemäß Anspruch 12, wobei die Zelle zu einem Stamm von Saccharomyces, vorzugsweise einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae, gehört.
  19. Ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides, dass Endo-beta-1,4-Glucanaseaktivität hat, umfassend das Kultivieren einer Zelle, in welche ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 12 eingeführt worden ist, wobei die besagte Zelle ein Polypeptid, dass von dem DNA-Abschnitt kodiert wird, exprimiert; und Gewinnen des Polypeptids.
  20. Eine Enzymzubereitung umfassend ein gereinigtes Polypeptid gemäß Anspruch 1.
  21. Die Zubereitung gemäß Anspruch 20, welche weiterhin ein oder mehrere Enzyme umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Zellulasen (Endoglucanasen), β-Glucanasen, Hemizellulasen, Lipasen, Peroxidasen, Laccasen, α-Amylasen, Glucoamylasen, Cutinasen, Pectinasen, Reductasen, Oxidasen, Phenoloxidasen, Ligninasen, Pullulanasen, Pectatlyasen, Xyloglucanasen, Xylanasen, Pectin-Acetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pectinlyasen, andere Mannanasen, Pectinmethylesterasen, Zellobiohydrolasen, Transglutaminasen; oder Mischungen davon.
  22. Eine isoliertes Enzym, das Endo-beta-1,4-Glucanaseaktivität hat, in welchem das Enzym (i) frei von homologen Verunreinigungen und (ii) hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 19 ist.
  23. Eine isolierte im Wesentlichen reine biologische Kultur des Stammes Escherichia coli, DSM 11476.
  24. Die Verwendung eines Enzyms gemäß Anspruch 1 oder 22 oder der Enzymzubereitung gemäß Anspruch 20 oder 21 in der Textilindustrie zum Verbessern der Eigenschaften von Zellulosefasern oder Gewebe oder zum Bereitstellen eines stone-washed-Aussehens von Jeansstoff; oder in industriellen Reinigungsverfahren.
  25. Eine Detergenszusammensetzung umfassend das Enzym gemäß Anspruch 1 oder 22 oder die Enzymzubereitung gemäß Anspruch 20 und 21.
  26. Eine Gewebeweichmacherzusammensetzung umfassend das Enzym gemäß Anspruch 1 oder 22 oder die Enzymzubereitung gemäß Anspruch 20 und 21.
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