DE69833197T2

DE69833197T2 - Alkalische xyloglukanase

Info

Publication number: DE69833197T2
Application number: DE69833197T
Authority: DE
Inventors: Martin Schülein; Helle Outtrup; Lina Per JORGENSEN; Eskelund Mads BJORNVAD
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2018-07-02
Also published as: JP2001509377A; ATE315639T1; CN1177928C; JP3961767B2; EP1002060A1; EP1002060B1; BR9810548A; DE69833197D1; WO1999002663A1; AU7908598A; CN1261914A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft alkalische Xyloglucanasen, d.h. Enzyme, die Xyloglucanaseaktivität als ihre enzymatische Hauptaktivität in neutralen und alkalischen pH-Bereichen aufweisen; ein Verfahren zum Herstellen solcher Enzyme; und Verfahren zum Verwenden solcher Enzyme in der Textil-, Detergent- und Cellulosefaserverarbeitenden Industrie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Xyloglucan ist ein wichtiges Strukturpolysaccharid in der primären (wachsenden) Zellwand von Pflanzen. Strukturell bestehen Xyloglucane aus einem Cellulose-ähnlichen beta-1,4-verknüpften Glucoserückgrat, welches häufig mit verschiedenen Seitenketten substituiert ist. Die Xyloglucane der meisten dikotylen Pflanzen, einiger Monokotylen und Gymnospermen, sind hoch verzweigte Polysaccharide, in welchen ungefähr 75 % der Glucosereste in dem Rückgrat eine Glycosylseitenkette an 0 bis 6 tragen. Der Glycosylrest, der direkt an den verzweigten Glucoserest angelagert ist, ist ausnahmslos alpha-D-Xylose. Bis zu 50 % der Seitenketten in den Xyloglucanen enthalten mehr als einen Rest aufgrund der Anwesenheit von beta-D-Galactose- oder alpha-L-Fucose-(1-2)-beta-D-galactose-Anteilen an 0 bis 2 der Xylosereste (C. Ohsumi und T. Hayashi (1994) Plant and Cell Physiology 35: 963–967; G. J. McDougall und S. C. Fry (1994) Journal of Plant Physiology 143: 591–595; J. L. Acebes et al. (1993) Phytochemistry 33: 1343 – 1345). Bei einer sauren Hydrolyse ergibt Xyloglucan, das aus Baumwollfasern extrahiert wird, Glucose, Xylose, Galactose und Fucose in dem Verhältnis von 50:29:12:7 (Hayashi et al., 1988).
Xyloglucane, die von Solanaceae-Pflanzen hergestellt werden, sind insofern ungewöhnlich, dass typischerweise lediglich 40 % der beta-1,4-verknüpften Glucosereste eine Glycosyl-Seitenkette an 0 bis 6 tragen. Weiterhin sind bis zu 60 % der Xylosereste an 0 bis 2 mit alpha-L-Arabinose-Resten substituiert und einige Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, weisen ebenfalls Xyloglucane mit beta-D-Galactose-Substituenten an 0 bis 2 von einigen der Xylosereste auf (York et al. (1996)).
Von Xyloglucan wird angenommen, dass es in der primären Wand von Pflanzen funktioniert, indem es Cellulose-Mikrofibrillen quervernetzt, und so ein Cellulose- Xyloglucan-Netzwerk bildet. Dieses Netzwerk wird als erforderlich für die Strukturintegrität von primären Zellwänden betrachtet (Carpita et al., 1993). Eine andere wichtige Funktion von Xyloglucan ist es, als ein Depot für Oligosaccharide mit Xyloglucan-Untereinheiten zu wirken, die physiologisch wirksame Regulatoren des Pflanzenzellwachstums sind. Xyloglucan-Untereinheiten können ebenfalls die Wirkung einer Xyloglucan-Endotransglycosylase (XET) modulieren, einem Zellwand-assoziierten Enzym, von dem angenommen wird, dass es eine Rolle in der Verlängerung der Pflanzenzellwände spielt. Daher könnte Xyloglucan eine wichtige Rolle in der Wandauflockerung und folglich der Zellausdehnung spielen (Fry et al., 1992).
Die Samen von vielen dikotylen Arten enthalten Xyloglucan als Polysaccharid-Hauptspeicherreserve. Diese Art von Xyloglucan, welche in den massiven Verdickungen auf der Innenseite der Keimblattzellwand des Samens lokalisiert ist, ist vor allem aus Glucose, Xylose und Galactose aufgebaut (Rose et al., 1996).
Samen des Tamarindenbaums Tamarindus indica wurden 1943 eine kommerzielle Quelle für Gummi, als Gummi verwendbar als eine Papier- und Textilgröße befunden wurde. Das Schlichten von Jute und Baumwolle mit Tamarinden-Xyloglucan ist in Asien extensiv praktiziert worden, infolge der geringen Kosten des Gummis und seiner exzellenten Eigenschaften. Anwendungen von Tamarinden-Xyloglucan in Nahrungsmitteln schließen die Verwendung in Konfekten, Marmeladen und Gelees und als Stabilisator in Eiskrem und Mayonnaise ein (Whistler et al., 1993).
Die Xyloglucanaseaktivität ist nicht in die Enzymklassifikation eingeschlossen, die durch die Enzymnomenklatur (1992) bereitgestellt wird. Bislang ist diese enzymatische Aktivität einfach als Glucanaseaktivität klassifiziert worden und es ist häufig angenommen worden, dass sie identisch mit der cellulolytischen Aktivität (EC 3.2.1.4) ist, d.h. der Aktivität gegenüber β-1,4-glycosidischen Bindungen in Cellulose- oder Cellulosederivat-Substraten, oder sie ist zumindest als eine Nebenaktivität bei Enzymen angesehen worden, die cellulolytische Aktivität aufweisen. Eine echte Xyloglucanase jedoch ist ein echtes Xyloglucan-spezifisches Enzym, das in der Lage ist, die Löslichmachung von Xyloglucan in Xyloglucanoligosaccharide zu katalysieren, welches jedoch keine wesentliche cellulolytische Aktivität aufweist, z. B. eine Aktivität gegenüber den herkömmlich verwendeten Cellulose-ähnlichen Substraten CMC (Carboxymethylcellulose), HE-Cellulose und Avicel (mikrokristalline Cellulose). Eine Xyloglucanase spaltet die beta-1,4-glycosidischen Verbindungen in dem Rückgrat von Xyloglucan.
Die Xyloglucanaseaktivität wird von Vincken et al. (1997) beschrieben, der drei unterschiedliche Endoglucanasen von Trichoderma viride (ähnlich zu T. reesei) charakterisiert, welche alle eine hohe Aktivität gegenüber Cellulose oder CMC aufweisen, und zeigt, dass die EndoI (welche tatsächlich der Familie 5 der Glycosylhydrolasen angehört, siehe Henrissat, B. et al. (1991, 1993)) im Wesentlichen keine (d. h. sehr geringe) Aktivität gegenüber Xyloglucan aufweist, und dass EndoV (der Familie 7 der Glycoxylhydrolasen angehörend) und EndoIV (der Familie 12 der Glycosylhydrolasen angehörend) beide eine Aktivität gegenüber Xyloglucan bzw. CMC aufweisen, in der gleichen Größenordnung.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 97/13862 beschreibt zwei Cellulasen von dem Aspergillus niger Stamm N400, wie in EP-A 0 463 706 beschrieben. Die Sequenz von lac12 kann der Familie 12 zugeschrieben werden, und die Sequenz von lac64 wird als zu der Familie 5 angehörend bestimmt, durch einen Vergleich mit bekannten homologen Cellulasen in der EMBL-Datenbank. Beide Enzyme weisen Cellulase- und β-Glucanaseaktivität auf. Sie weisen die höchste Aktivität gegenüber β-Glucan aus Gerste auf, und sie zeigen beide eine gute CMC-Aktivität und einige Xyloglucanaseaktivität. Beide Enzyme weisen pH-Optima bei 3,5 gegenüber CMC und 5,5 gegenüber β-Glucan aus Gerste auf.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 94/14953 offenbart eine Xyloglucanase (EG II), kloniert aus dem Pilz Aspergillus aculeatus und exprimiert in dem Pilz Aspergillus oryzae, welcher eine hohe Xyloglucanaseaktivität und eine sehr geringe Cellulaseaktivität aufweist. Dieses EG II -Enzym, welches Xyloglucanaseaktivität in dem pH-Bereich 2,5 bis 6 und optimale Aktivität bei pH 3 bis 4 zeigt, gehört ebenfalls der Familie 12 der Glycosylhydrolasen an.
Zusammengefasst ist bis jetzt eine Xyloglucanaseaktivität lediglich bei Enzymen von Pilzen gefunden worden, die den Familien 7 und 12 der Glycosylhydrolasen angehören, und die diese Aktivität im sauren bis annährend neutralen pH-Bereich aufweisen.
Viele wichtige Verfahren, entweder industrielle oder unter Verwenden von industriell hergestellten Mitteln, werden jedoch bei einem alkalischen pH durchgeführt. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein echtes Xyloglucanaseenzym bereitzustellen mit einer hohen Xyloglucanaseaktivität bei einem alkalischen pH und im Wesentlichen keiner Aktivität gegenüber Cellulose oder Cellulosederivaten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben nun Enzyme gefunden, die eine wesentliche Xyloglucanaseaktivität im alkalischen Bereich aufweisen, wobei solche Enzyme entweder keine oder eine nicht-signifikante cellulolytische Aktivität aufweisen.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzubereitung, welche eine Xyloglucanase umfasst, die eine relative Xyloglucanaseaktivität von mindestens 50 % bei pH 7 oder einem pH oberhalb von 7, und bevorzugt eine geringe oder keine Aktivität gegenüber Cellulose- oder Cellulosederivat-Substraten aufweist, z. B. ein Verhältnis von maximaler Xyloglucanaseaktivität zu maximaler Aktivität gegenüber CMC oder Avicel von mindestens 2:1 aufweist.
Die Erfinder haben ebenfalls eine Xyloglucanase erfolgreich kloniert und exprimiert, d.h. die Erfindung betrifft in weiteren Aspekten eine Xyloglucanase, welche (a) ein Polypeptid ist, das von Bacillus agaradhaerens, N CIMB 40482, produziert wird, oder (b) ein Polypeptid ist, welches eine Aminosäuresequenz, wie in den Positionen 1 bis 537 aus SEQ ID NR: 4 dargestellt, umfasst oder (c) ein Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids ist, welches mindestens 70 % homolog zu dem Polypeptid ist, oder von dem Polypeptid abgeleitet ist, durch Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren, oder immunologisch reaktiv mit einem polyklonalen Antikörper ist, der gegen das Polypeptid in gereinigter Form gerichtet ist; und eine Xyloglucanase, welche (a) ein Polypeptid ist, das von Bacillus licheniformis, ATCC 14580 produziert wird, oder (b) ein Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz, wie in den Positionen 30 bis 261 aus SEQ ID NR: 2 dargestellt, umfasst oder (c) ein Analog des in (a) oder (b) definierten Polypeptids ist, welches mindestens 70 % homolog zu dem Polypeptid ist, oder von diesem Polypeptid abgeleitet ist, durch Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren, oder immunologisch reaktiv mit einem polyklonalen Antikörper ist, der gegen das Polypeptid in gereinigter Form gerichtet ist; und ein isoliertes Polynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches Xyloglucanaseaktivität aufweist, ausgewählt aus (a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NR: 1 von Nukleotid 88 bis Nukleotid 783 dargestellt, umfassen; (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 % identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 von Aminosäurerest 30 bis Aminosäurerest 261 ist; und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und ein isoliertes Polynukleotidmolekül, welches ein Polypeptid kodiert, das Xyloglucanaseaktivität aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NR: 3 von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1611 dargestellt, umfassen; (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 % identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 4 von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 537 ist; und (c) degenerierten Nukleotidsequenzen von (a) oder (b).
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der ein DNA-Segment umfasst, welches z. B. ein Polynukleotidmolekül der Erfindung ist; eine Zelle, die das DNA-Segment oder den Expressionsvektor umfasst; und ein Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, das Xyloglucanaseaktivität aufweist, welches Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Herstellung des Enzyms erlauben, und Rückgewinnen des Enzyms aus der Kultur, umfasst.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Enzym bereit, welches Xyloglucanaseaktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass (i) es frei von homologen Verunreinigungen ist und (ii) das Enzym durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wird.
Das neue Enzym der vorliegenden Erfindung ist verwendbar für die Behandlung von cellulosehaltigem Material, besonders Cellulose-enthaltende Fasern, Fäden, gewebtem oder nicht-gewebtem Stoff. Die Behandlung kann während des Verarbeitens von cellulosehaltigem Material in ein Material, das fertig für die Bekleidungsfertigung oder Stofffertigung ist, durchgeführt werden, z. B. im Entschlichtungs- oder Spülschritt; oder während des industriellen Waschens oder des Waschens im Haushalt von solchem Stoff oder Bekleidung durchgeführt werden.
Demgemäß betrifft die Erfindung in weiteren Aspekten eine Detergentzusammensetzung, welche ein Enzym umfasst, das wesentliche Xyloglucanaseaktivität im alkalischen Bereich aufweist; und die Verwendung des Enzyms der Erfindung für die Behandlung von Cellulose-enthaltenden Fasern, Garn, gewebtem oder nicht-gewebtem Stoff.
Die vorliegende Erfindung hat es jetzt möglich gemacht, einen wirklich enzymatischen Spülprozess („scouring process") in der Zubereitung von cellulosehaltigem Material, z. B. für eine exakte Reaktion in nachfolgenden Färbebehandlungen, zu verwenden. Weiterhin wird in Erwägung gezogen, dass Detergentzusammensetzungen, die das neue Enzym umfassen, in der Lage sind, bestimmte Verschmutzungen oder Flecken, die in der Wäsche vorhanden sind, besonders Verschmutzungen und Flecken, die von Xyloglucanenthaltenden Nahrungsmitteln, Pflanzen und dergleichen resultieren, zu entfernen oder zu bleichen. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass eine Behandlung mit Detergentzusammensetzungen, die das neue Enzym umfassen, die Bindung von bestimmten Verschmutzungen an das Xyloglucan, das auf dem cellulosehaltigen Material verbleibt, zu verhindern.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Cellulasen werden in mehr als 10 verschiedenen Familien von Glycosylhydrolasen gefunden. Einige der Cellulasen weisen ebenfalls Xyloglucanaseaktivität auf. Heute sind solche Cellulasen zwischen solchen gefunden worden, die in den Familien 5, 7 und 12 klassifiziert sind. Die Substratspezifität korreliert jedoch nicht direkt mit der Familie: innerhalb einer Familie kann die enzymatische Hauptaktivität Cellulase- oder Mannanase-(Familie 5), oder Lichinase-, β-1,3-Glucanase- oder Xyloglucantransferaseaktivität (Familie 16) sein. Das einzige Enzym, das bisher als ein Enzym offenbart wurde, das Aktivität gegenüber Xyloglucan als die wichtigste oder hauptsächliche enzymatische Aktivität aufweist, ist EG II von Aspergillus aculeatus, offenbart in WO 94/14953. Wie oben erwähnt, hat diese Aktivität bislang keinen Zugriff in der offiziellen Enzymnomenklatur.
In dem vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „Enzymzubereitung" entweder ein konventionelles enzymatisches Fermentationsprodukt, möglicherweise isoliert und aufgereinigt, von einer einzigen Spezies eines Mikroorganismus, wobei eine solche Zubereitung gewöhnlich eine Anzahl verschiedener enzymatischer Aktivitäten umfasst; oder eine Mischung von Einzelkomponenten-Enzymen, bevorzugt Enzymen, die von Bakterien- oder Pilzspezies unter Verwenden von herkömmlichen Rekombinationstechniken abgeleitet sind, welche Enzyme separat fermentiert und möglicherweise isoliert und aufgereinigt worden sind, und welche von verschiedenen Spezies stammen können, bevorzugt Pilz- oder Bakterienspezies; oder das Fermentationsprodukt eines Mikroorganismus, welcher als Wirtszelle für die Expression einer rekombinanten Xyloglucanase wirkt, wobei dieser Mikroorganismus jedoch gleichzeitig andere Enzyme produziert, z. B. Xyloglucanasen, Proteasen oder Cellulasen, die natürlich vorkommende Fermentationsprodukte des Mikroorganismus sind, d.h. den Enzymkomplex, der herkömmlich durch den entsprechenden natürlich vorkommenden Mikroorganismus produziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 7 von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 75 %, stärker bevorzugt mindestens 80 %, besonders mindestens 90 % im Vergleich zu der Aktivität bei dem optimalen pH auf.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 8 von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, stärker bevorzugt mindestens 75 %, besonders mindestens 90 % im Vergleich zu der Aktivität bei dem optimalen pH auf.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 9 von mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 20 %, stärker bevorzugt mindestens 25 % im Vergleich zu der Aktivität bei dem optimalen pH auf.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 9,5 von mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 %, stärker bevorzugt mindestens 15 % im Vergleich zu der Aktivität bei dem optimalen pH auf.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 10 von mindestens 5 % im Vergleich zu der Aktivität bei dem optimalen pH auf.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase eine relative Aktivität bei einer Temperatur von 50 °C, von bevorzugt von mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 70 %, im Vergleich zu der Aktivität bei der optimalen Temperatur auf.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt die relative Xyloglucanaseaktivität bei einer Temperatur von 60 °C mindestens 40 %, bevorzugt mindestens 50 %; bei einer Temperatur von 70 °C beträgt die relative Xyloglucanaseaktivität mindestens 40 %, bevorzugt mindestens 45 %, besonders mindestens 50 %.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Xyloglucanase geringe oder keine Aktivität gegenüber Cellulose- oder Cellulosederivat-Substraten auf. Ein herkömmliches Substrat zur Bestimmung der Cellulaseaktivität (Endo-β-1,4-Glucanaseaktivität, jf. EC 3.2.1.4) ist Carboxymethylcellulose (CMC). Andere herkömmliche Substrate zur Bestimmung der Cellulase- oder Cellobiohydrolaseaktivität (EC 3.2.1.91) ist Avicel, welches eine mikrokristalline Cellulose ist, die dem Fachmann gut bekannt ist. Bevorzugt beträgt das Verhältnis der maximalen Xyloglucanaseaktivität zu der maximalen Aktivität gegenüber entweder CMC oder Avicel mindestens 2:1, stärker bevorzugt mindestens 3:1, stärker bevorzugt mindestens 4:1, noch stärker bevorzugt mindestens 5:1, noch stärker bevorzugt mindestens 8:1, besonders mindestens 10:1.
Die Xyloglucanase-Zubereitung der Erfindung kann weiterhin ein oder mehrere Enzyme umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen (Endo-β-1,4-glucanasen), β-Glucanasen (Endo-β-1,3(4)-glucanasen), Lipasen, Cutinasen, Peroxidasen, Laccasen, Amylasen, Glucoamylasen, Pectinasen, Reductasen, Oxidasen, Phenoloxidasen, Ligninasen, Pullulanasen, Arabinasen, Hemicellulasen, Mannanasen, Galactanasen, Xylanasen, Pectinacetylesterasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pectinlyasen, Pectatlyasen, Pectinmethylesterasen, Cellobiohydrolasen, Transglutaminasen; oder Mischungen hiervon. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eines oder mehrere oder alle Enzyme in der Zubereitung unter Verwendung von rekombinanten Techniken hergestellt, d.h. das Enzym/die Enzyme ist/sind Einzelkomponenten-Enzym(e), welche/welches mit dem/den anderem/anderen Enzym/Enzymen gemischt wird, um eine Enzymzubereitung mit der gewünschten Enzymmischung zu bilden.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen der Enzymzubereitung der Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Xyloglucanase unter Bedingungen, welche die Produktion des Enzyms erlauben, zu produzieren, und Rückgewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
Das Kultivieren kann unter Verwenden von herkömmlichen Fermentationstechniken durchgeführt werden, z. B. Kultivieren in Schüttelflaschen oder Fermentatoren mit Rühren, um eine ausreichende Belüftung sicherzustellen, auf einem Wachstumsmedium, welches die Produktion des Xyloglucanaseenzyms induziert. Das Wachstumsmedium kann eine herkömmliche N-Quelle enthalten, wie Pepton, Hefeextrakt oder Casaminosäuren, eine reduzierte Menge einer herkömmlichen C-Quelle, wie Dextrose oder Saccharose, und einen Induzierer, wie Xyloglucan oder zusammengesetzte Pflanzensubstrate, wie Getreidekleie (z. B. Weizenkleie oder Reishülse). Die Rückgewinnung kann unter Verwendung von herkömmlichen Techniken durchgeführt werden, z. B. der Separation von Biomasse und Überstand durch Zentrifugation oder Filtration, Rückgewinnung des Überstandes oder Zerstörung der Zellen, wenn das interessierende Enzym intrazellulär ist, gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Aufreinigung, wie beschrieben in EP 0 406 314 oder durch eine Kristallisation, wie in WO 97/15660 beschrieben.
In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff „Expressionsvektor" ein DNA-Molekül, linear oder zirkulär, das ein Segment umfasst, welches ein interessierendes Polypeptid kodiert, das funktionsfähig verknüpft ist mit weiteren Segmenten, die seine Transkription bereitstellen. Solche weiteren Segmente können Promotor- und Terminatorsequenzen einschießen und können wahlweise einen oder mehrere Replikationsursprünge, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal und dergleichen einschließen. Expressionsvektoren werden im Allgemeinen von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet, oder können Elemente von beiden enthalten. Der Expressionsvektor der Erfindung kann jeder beliebige Expressionsvektor sein, der herkömmlicherweise rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterworfen wird, und die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängig sein, in welche der Vektor einzuführen ist. Demnach kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation erfolgt, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert wird, und zusammen mit dem/den Chromosom/Chromosomen, in welches/welche er integriert worden ist, repliziert wird.
Der Begriff „rekombinant exprimiert" oder „auf rekombinante Weise exprimiert", der hierin in Verbindung mit der Expression eines Polypeptids oder Proteins verwendet wird, ist gemäß der Standarddefinition im Stand der Technik definiert. Die Expression eines Proteins auf rekombinante Weise wird im Allgemeinen durch Verwenden eines Expressionsvektors, wie unmittelbar zuvor beschrieben, durchgeführt.
Der Begriff „isoliert", wenn er auf ein Polynukleotidmolekül angewendet wird, zeigt an, dass das Polynukleotid aus seinem natürichen genetischen Milieu entfernt worden ist, und demnach frei von anderen externen oder unerwünschten Kodierungssequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung in gentechnischen Proteinherstellungssystemen geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind solche, die aus ihrer natürlichen Umgebung separiert sind und schließen cDNA und genomische Klone ein.
Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie normalerweise assoziiert sind, können jedoch natürlich vorkommende 5'- und 3' nicht-translatierte Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, einschließen. Die Identifizierung von assoziierten Regionen ist für einen Fachmann offensichtlich (siehe z. B. Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985). Der Begriff „ein isoliertes Polynukleotid" kann alternativ mit „ein kloniertes Polynukleotid" bezeichnet werden.
Wenn auf ein Protein/Polypeptid angewendet, zeigt der Begriff „isoliert" an, dass das Protein in einem Zustand vorgefunden wird, die anders ist als seine natürliche Umgebung. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen homologen Proteinen (d.h. „homologen Verunreinigungen" (siehe nachfolgend)). Es ist bevorzugt, das Protein in einer höher als 40 % reinen Form, stärker bevorzugt höher als 60 % reinen Form, bereitzustellen. Noch stärker bevorzugt wird es bevorzugt, das Protein in einer hochreinen Form bereitzustellen, d.h. höher als 80 % rein, stärker bevorzugt höher als 95 % rein und noch stärker bevorzugt höher als 99 % rein, wie mittels SDS-PAGE bestimmt.
Der Begriff „isoliertes Protein/Polypeptid" kann alternativ mit „aufgereinigtes (gereinigtes) Protein/Polypeptid" bezeichnet werden.
Der Begriff „homologe Verunreinigungen" bedeutet jede beliebige Verunreinigung (z. B. ein anderes Polypeptide als das Polypeptid der Erfindung), welche von der homologen Zelle stammt, von der das Polypeptid der Erfindung ursprünglich erhalten wurde.
Der Begriff „erhalten von", wie hierin in Verbindung mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet, bedeutet, dass das Polynukleotid und/oder Polypeptid durch die spezifische Quelle oder durch eine Zelle, in welche ein Gen aus der Quelle eingefügt wurde, produziert wird.
Der Begriff „funktionsfähig verknüpft", wenn er auf DNA-Segmente bezogen wird, zeigt an, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke im Zusammenhang funktioniert, z. B. beginnt die Transkription bei dem Promotor und wird durch das Kodierungssegment bis zu dem Terminator fortgesetzt.
Der Begriff „Polynukleotid" zeigt ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen an, welches vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird. Polynukleotide schließen RNA und DNA ein und können aus natürlichen Quellen isoliert sein, in vitro synthetisiert sein oder aus einer Kombination von natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt sein.
Der Begriff „Komplemente von Polynukleotidmolekülen" zeigt Polynukleotidmoleküle an, die eine komplementäre Basensequenz und eine reverse Orientierung im Vergleich zu einer Referenzsequenz aufweisen. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" zeigt eine Sequenz (Abfolge) von Nukleotiden an, die ein oder mehrere degenerierte Codons einschließt (im Vergleich zu einem Referenz-Polynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Kodons enthalten unterschiedliche Nukleotidtriplets, kodieren jedoch den gleichen Aminosäurerest (d.h., GAU- und GAC-Triplets kodieren jeweils Asp).
Der Begriff „Promotor" zeigt einen Teil eines Gens an, der DNA-Sequenzen enthält, welche die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription bereitstellen. Promotorsequenzen befinden sich gewöhnlich, jedoch nicht immer, in den 5'-nicht-kodierenden Regionen von Genen.
Der Begriff „Sekretionssignalsequenz" zeigt eine DNA-Sequenz an, welche ein Polypeptid (ein „Sekretionspeptid") kodiert, das, als eine Komponente eines längeren Polypeptids, das längere Polypeptid durch eine Sekretionsbahn einer Zelle, in welcher es synthetisiert wird, leitet. Das längere Peptid wird üblicherweise gespalten, um das Sekretionspeptid während der Überführung durch die Sekretionsbahn zu entfernen.
POLYNUKLEOTIDE:
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hybridisiert ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung mit Regionen von ähnlicher Größe aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 3 oder einer hierzu komplementären Sequenz, unter mindestens mittleren Stringenzbedingungen.
Insbesondere hybridisieren Polynukleotide der Erfindung mit einer denaturierten doppelsträngigen DNA-Sonde, umfassend entweder die vollständige in SEQ ID NR: 3 dargestellte Sequenz oder die vollständige in den Position 88 bis 783 aus SEQ ID NR: 1 dargestellte Sequenz oder jeder beliebigen Sonde, welche eine Untersequenz aus SEQ ID NR: 3 oder SEQ ID NR: 1 mit einer Länge von mindestens ungefähr 100 Basenpaaren umfasst, unter mindestens mittleren Stringenzedingungen, jedoch bevorzugt bei hohen Stringenzbedingungen, wie nachfolgend im Detail beschrieben. Geeignete experimentelle Bedingungen zum Bestimmen einer Hybridisierung bei mittlerer oder hoher Stringenz zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz schließt das Vortränken des Filters, welcher die zu hybridisierende(n) DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC ((Sodium chloride/Sodium citrat), Natriumchlorid/Natriumcitrat, Sambrook et al. 1989) für 10 Min und das Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierte, beschallte Lachssperma-DNA (Sambrook et al., 1989), gefolgt von der Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer Zufallsgeprimten („random primed") (Feinberg, A.P. und Vogelstein B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6–13), 32P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität höher als 1 × 109 cpm/μg) Sonde enthält, für 12 Stunden bei ungefähr 45 °C. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0.5% SDS bei mindestens 60°C (mittlere Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz), noch stärker bevorzugt bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) und noch stärker bevorzugt bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Moleküle, mit denen die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines Röntgenfilms detektiert.
Wie zuvor angemerkt, schließen die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA ein. Verfahren zum isolieren von DNA und RNA sind im Stand der Technik gut bekannt. Interessierende DNA- und RNA-kodierende Gene können aus Genbanken oder DNA-Bibliotheken mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren kloniert werden.
Polynukleotide, welche Polypeptide kodieren, welche die Endoglucanaseaktivität der Erfindung aufweisen, werden dann identifiziert und isoliert mittels, zum Beispiel, Hybridisierung oder PCR.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Gegenstück-Polypeptide und -Polynukleotide aus verschiedenen Bakterienstämmen (Orthologe oder Paraloge) bereit. Von besonderem Interesse sind Xyloglucanasepolypeptide von grampositiven alkalophilen Stämmen einschließlich der Spezies von Bacillus.
Spezieshomologe von einem Polypeptid mit Xyloglucanaseaktivität der Erfindung können unter Verwenden der Informationen und Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt werden, in Kombination mit herkömmlichen Klonierungstechniken kloniert werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung unter Verwenden von chromosomaler DNA, die von einem Zelltyp erhalten wird, der das Protein exprimiert, kloniert werden. Geeignete DNA-Quellen können durch Sondierungs-Northern-Blots mit Sonden, die von hierin offenbarten Sequenzen gestaltet werden, identifiziert werden. Dann wird eine Bibliothek von chromosomaler DNA einer positiven Zelllinie zubereitet. Eine DNA-Sequenz der Erfindung, welche ein Polypeptid, dass Xyloglucanaseaktivität aufweist, kodiert, kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren isoliert werden, wie durch Sondieren mit Sonden, die aus Sequenzen gestaltet werden, die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbart werden, oder mit einem oder mehreren Sätzen von degenerierten Sonden, die auf den offenbarten Sequenzen basieren. Eine DNA-Sequenz der Erfindung kann ebenfalls unter Verwenden der Polymerasekettenreaktion, oder PCR (Mullis, US-Patent 4,683,202), kloniert werden, unter Verwenden von Primern, die aus den hierin offenbarten Sequenzen gestaltet werden. In einem weiteren Verfahrens kann die DNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder transfizieren und die Expression der interessierenden DNA kann mit einem Antikörper (monoklonal oder polyklonal), der gegen die Xyloglucanase, kloniert von B. licheniformis, ATCC 14580, oder von B. agaradhaerens, NCIMB 40482, gerichtet ist, detektiert werden, exprimiert und aufgereinigt werden, wie in Materialien und Methoden und den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben, oder durch einen Aktivitätstest, der sich auf ein Polypeptid bezieht, das Xyloglucanaseaktivität aufweist.
POLYPEPTIDE:
Die Sequenz aus SEQ ID NR: 4 bzw. der Aminosäuren Nr. 30 bis 261 aus SEQ ID NR: 2 ist eine reife Xyloglucanasesequenz der katalytischen aktiven Domäne. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Xyloglucanasepolypeptide bereit, die im Wesentlichen homolog zu dem Polypeptid aus SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 4 sind und Spezies homologe (Paraloge oder Orthologe) hiervon. Der Begriff „im Wesentlichen homolog" wird hierin verwendet, um Polypeptide anzuzeigen, die 75%, bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85% und noch stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzidentität mit der SEQ ID NR: 4 dargestellten Sequenz oder den Aminosäuren Nr. 30 bis 261 aus SEQ ID NR: 2 oder ihren Orthologen oder Paralogen, aufweisen. Solche Polypeptide sind stärker bevorzugt mindestens 95% identisch und am stärksten bevorzugt 98% oder mehr identisch mit der Sequenz dargestellt in SEQ ID NR: 4 oder in den Aminosäuren Nr. 226 bis 490 aus SEQ ID NR: 2 oder seinen Orthologen oder Paralogen. Der Prozentsatz der Sequenzidentität wir mittels herkömmlicher Verfahren bestimmt, mittels im Stand der Technik bekannter Computerprogramme, wie GAP, bereitgestellt in dem CGC-Programmpaket (Programmhandbuch für das Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US 53711 ), wie offenbart in Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453, welches hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen ist. GAP wird mit den folgenden Einstellungen für einen Polypeptidsequenzvergleich verwendet: GAP Creation Penalty von 3.0 und GAP Extension Penalty von 0.1.
Die Sequenzidentität von Polynukleotidmolelülen wir durch ähnliche Verfahren unter Verwenden von GAP mit den folgenden Einstellungen für DNA-Sequenzvergleiche: GAP Creation Penalty von 5.0 und GAP Extension Penalty von 0.3 bestimmt.
Im Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Aminosäurensubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen.
Diese Veränderungen sind vorzugsweise von geringerer Natur, dies sind konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle 2) und andere Substitutionen, welche die Faltung oder Aktivität des Proteins oder Polypeptids nicht signifikant beeinflussen; kleine Deletionen typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren; und kleine Amino- oder Carboxy-terminale Verlängerungen, wie ein Amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten oder eine kleine Verlängerung, welche die Aufreinigung erleichtert (ein Affinitäts-Tag) wie ein Polyhistidinstrang, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et at., Methods Enzymol. 198:3, 1991. Siehe im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991, welche hierin durch Bezugnahme einbezogen ist). DNA, die Affinitäts-Tags kodieren, sind von herkömmlichen Anbietern erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).

Jedoch, obwohl die oben beschriebenen Veränderungen vorzugsweise von geringerer Natur sind, können solche Veränderungen ebenfalls von größerer Natur sein, wie die Fusion von längeren Polypeptiden von bis zu 300 Aminosäuren oder mehr, beide als Amino- oder Carboxy-terminale Verlängerungen zu einem Polypeptid der Erfindung, welches Xyloglucanaseaktivität aufweist. Konservative Aminosäuresubstitutionen Tabelle 1

Basisch:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Glutaminsäure Asparaginsäure
Polar:	Glutamin Asparagin
Hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
Aromatisch:	Phenylalanin Thryptophan Tyrosin
Klein:	Glycin Alanin Serin Threonin Methonin

Zusätzlich zu den 20 Standardaminosäuren, können Aminosäurereste eines Polypeptids gemäß der Erfindung durch nicht-Standardaminosäuren (wie 4-Hydroxyprolin, 6-N-Methyllysin, 2-Aminoisobuttersäure, Isovalin und a-Methylserin) substituiert sein. Aminosäurereste können durch eine begrenzte Anzahl nicht-konservativer Aminosäuren, Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code kodiert werden, und nicht-natürliche Aminosäuren substituiert sein. „Nicht-natürliche Aminosäuren" sind nach der Proteinsynthese modifiziert worden und/oder weisen eine chemische Struktur in ihrer/ihren Seitenkette(n) auf, die unterschiedlich zu der der Standardaminosäuren ist. Nicht-natürlche Aminosäuren können chemisch synthetisiert werden oder, bevorzugt, sind kommerziell erhältlich und schließen Pipecolinsäure, Thiazolidincarbonsäure, Dehydroprolin, 3- und 4- Methylprolin und 3,3-Dimethylprolin ein.
Essentielle Aminosäuren in den Xyloglucanasepolypeptiden der vorliegenden Erfindung können gemäß im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen identifiziert werden, wie der ortsgerichteten Mutagenese oder Alanin-Abtastungs-Mutagenese („alanine-scanning mutagenesis") (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085, 1998). Bei der letztgenannten Technik werden einzelne Alaninmutationen in jeden Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische Aktivität hin (d.h. Xyloglucanaseaktivität) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die kritisch für die Aktivität des Moleküls sind. (Siehe ebenfalls Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699–4708, 1996). Die aktive Seite des Enzyms oder eine andere biologische Interaktion kann ebenfalls durch eine physikalische Analyse der Struktur bestimmt werden, wie bestimmt durch solche Techniken, wie Kernmagnetische Resonanz, Kristallographie, Elektronenbeugung oder Photoaffinitätsmarkierung, in Verbindung mit einer Mutation der putativen Aminosäuren der Kontaktseite. Siehe z. B. de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 244: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992. Die Identitäten von essentiellen Aminosäuren können ebenfalls aus einer Analyse von Homologien zu Polypeptiden gefolgert werden, die mit einem Polypeptid gemäß der Erfindung verwandt sind.
Mehrfache Aminosäuresubstitutionen können vorgenommen und überprüft werden unter Verwenden von bekannten Mutageneseverfahren, Rekombinationsverfahren und/oder Mehrfachverteilungsverfahren („methods of shuffling") gefolgt von einer einschlägigen Screening-Vorgehensweise, wie solcher, die von Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241: 53–57, 1988), Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152–2156, 1989), WO 95/17413 oder WO 95/22625 offenbart sind. Kurz beschrieben, offenbaren diese Autoren Verfahren zum gleichzeitigen Randomisieren (Zufallsverteilen) von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid oder Rekombination/Mehrfachverteilung von verschiedenen Mutationen (WO 95/17413, WO 95/22625), gefolgt von einem Selektieren nach einem funktionellen eines Polypeptids und dann Sequenzieren des mutagenisierten Polypeptids, um das Spektrum der erlaubten Mutationen an jeder Position zu bestimmen. Andere Verfahren, die verwendet werden können, schließen Phagen-Display (z.B. Lowman et al., Biochem. 30: 10832–10837, 1991; Ladner et al., US Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO Publikation WO 92/06204) und gebietsspezifische Mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988) ein.
Mutagenese/Mehrfachverteilungsverfahren, wie oben offenbart, können mit automatisierten Hochdurchsatz-Screening-Verfahren kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten, mutagenisierten Polypeptiden in Wirtszellen zu dedektieren. Mutagenisierte DNA-Moleküle, welche aktive Polypeptide kodieren, können aus den Wirtszellen wiedergewonnen werden und unter Verwenden einer modernen Ausrüstung schnell sequenziert werden. Diese Verfahren ermöglichen die schnelle Bestimmung der Bedeutung von einzelnen Aminosäureresten in einem interessierenden Polypeptid und können auf Polypeptide mit unbekannter Struktur angewendet werden.
Unter Verwenden der oben diskutierten Verfahren kann ein Fachmann eine Vielzahl von Polypeptiden identifizieren und/oder herstellen, die im Wesentlichen homolog zu SEQ ID NR: 4 oder den Resten 30 bis 261 aus SEQ ID NR: 2 sind, und die die Xyloglucanaseaktivität des Wildtyp-Proteins beibehalten.
Das Xyloglucanasenzym der Erfindung kann, zusätzlich zu dem Enzymkern, welcher die katalytische Domäne umfasst, ebenfalls eine Cellulosebindungsdomäne (CBD) umfassen, wobei die Cellulosebindungsdomäne und der Enzymkern (die katalytisch aktive Domäne) des Enzyms funktionsfähig verknüpft sind. Die Cellulosebindungsdomäne (CBD) kann als ein integraler Teil des kodierten Enzyms existieren oder es kann eine CBD mit anderer Herkunft in die Xyloglucanase eingeführt werden, wodurch ein Enzymhybrid erzeugt wird. In diesem Zusammenhang ist der Begriff „Cellulosebindungsdomäne" so zu verstehen, wie von Peter Tomme et al. „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in „Enxymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Herausgeber), ACS Symposium Series, No. 618, 1996 definiert. Diese Definition klassifiziert mehr als 120 Cellulosebindungsdomänen in 10 Familien (I bis X) und zeigt, dass CBD in verschiedenen Enzymen, wie Cellulasen, Xylanasen, Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen gefunden werden. CBD sind ebenfalls in Algen gefunden worden, z.B. der Rotalge Porphyra purpurea als ein nicht-hydrolytische Polysaccharid-Bindungsprotein, siehe Tomme et al., op. cit. Die meisten CBD sind jedoch von Cellulasen und Xylanasen, wobei die CBD sind an den N- und C-Termini der Proteinen oder intern gefunden worden sind. Enzymhybride sind im Stand der Technik bekannt, siehe z.B. WO 90/00609 und WO 95/16782, und können durch Transformieren eines DNA-Konstrukts, welches mindestens ein DNA-Fragment umfasst, das die Cellulasebindungsdomäne kodiert, ligiert, mit oder ohne einen Linker, mit einer DNA-Sequenz, welche die Xyloglucanase kodiert, in eine Wirtszelle und Wachsen der Wirtszelle, um das fusionierte Gen zu exprimieren. Enzymhybride können durch die folgende Formel beschrieben werden: CBD-MR-X wobei CBD die N-terminale oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens der Cellulosebindungsdomäne entspricht; MR die mittlerer Region ist (der Linker) und eine Bindung oder eine kurze Verknüpfungsgruppe, bevorzugt von ungefähr 2 bis ungefähr 100 Kohlenstoffatomen, stärker bevorzugt von 2 bis 40 Kohlenstoffatomen, sein kann; oder bevorzugt von ungefähr 2 bis ungefähr 100 Aminosäuren, stärker bevorzugt von 2 bis 40 Aminosäuren ist; und X eine N-terminale uder C-terminale Region eines Polypeptids ist, das durch das Polynukleotidmolekül der Erfindung kodiert wird.
Das Xyloglucansubstrat
Zusätzlich zu dem vorstehend zu Xyloglycan ausgeführten, sollte angemerkt werden, dass Xyloglucan von Tamerindensamen, angeboten von Megazym, Australien, eine komplex verzweigte Struktur mit Glucose, Xylose, Galactose und Arabinose in dem Verhältnis 45:36:16:3 aufweist. Demgemäß wird stark angenommen, dass ein Enzym, welches katalytische Aktivität gegenüber diesem Xyloglugan zeigt, ebenfalls katalytische Aktivität gegenüber anderen Xyloglucanstrukturen von verschiedenen Quellen (Angiospermen bis Gymnospermen) aufweist.
Verwendung in der Detergentindustrie
Während des Waschens und Tragens bluten Farbstoffe von gefärbten Stoffen oder Bekleidung üblicherweise aus dem Stoff aus, welche dann ausgeblichen und getragen aussehen. Ein Entfernen der Oberflächenfasern von dem Stoff stellt teilweise die Originalfarben und das Aussehen des Stoffes wieder her. Mit dem Begriff „Farbklärung", wie hierin verwendet, ist die teilweise Wiederherstellung der anfänglichen Farbe des Stoffes oder der Bekleidung während mehrfacher Waschzyklen. Der Begriff „de-pilling" bezeichnet das Entfernen von Faserbällchen von der Stoffoberfläche.
Der Begriff „Einweichflüssigkeit (Vortränkflüssigkeit)" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welche die Wäsche eingetaucht werden kann bevor sie einem herkömmlichen Waschvorgang unterzogen wird. Die Einweichflüssigkeit kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die herkömmlich in einem Wasch- oder Reinigungsvorgang verwendet wird/werden.
Der Begriff "Waschflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welcher die Wäsche einem Waschvorgang unterzogen wird, d.h. gewöhnlich einer kombinierten chemischen und mechanischen Aktion, entweder mit der Hand oder in einer Waschmaschine. Herkömmlicherweise ist die Waschflüssigkeit eine wässrige Lösung von einer pulverförmigen oder flüssigen Detergentzusammensetzung.
Der Begriff "Spülflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in welcher die Wäsche eingetaucht und behandelt wird, herkömmlicherweise unmittelbar nachdem sie einem Waschvorgang unterworfen worden ist, um die Wäsche zu spülen, d.h. die Detergentlösung aus der Wäsche im Wesentlichen zu entfernen. Die Spülflüssigkeit kann eine Stoff-Konditionierungs- oder Weichmacherzusammensetzung enthalten.
Die Wäsche, welche dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen wird, kann herkömmlich waschbare Wäsche sein. Bevorzugt ist der Hauptanteil der Wäsche genähter oder nicht genähter Stoff, einschließlich Maschenwaren, gewebter Stoffe, Baumwolldrilliche (Jeansstoffe), Fäden und Frotteestoff, hergestellt aus Baumwolle, Baumwollmischungen oder natürliche oder künstliche Cellulosematerialien (z.B. von Xylan-enthaltenden Cellulosefasern, wie von Faserholz, stammend) oder Mischungen hiervon. Beispiele von Mischungen sind Mischungen aus Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, wie Wolle, synthetische Fasern (z.B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Cellulose-enthaltenden Fasern (z.B. Rayon/Viskose, Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Celluloseacetatfasern, Lyocell).
DETERGENT-OFFENBARUNG UND BEISPIELE
Tensid-System
Die Detergentzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein System von Tensiden, wobei das Tensid ausgewählt sein kann aus nicht-ionischen und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder ampholytischen und/oder zwitterionischen und/oder semi-polaren Tensiden.
Das Tensid ist typischerweise mit einem Level von 0,1 Gew.-% bis 60 Gew.-% vorhanden.
Das Tensid ist vorzugsweise so formuliert, dass es mit den Enzymkomponenten, die in der Zusammensetzung vorhanden sind, kompatibel ist. In flüssigen Zusammensetzungen oder Gelzusammensetzungen ist das Tensid am stärksten bevorzugt derart formuliert, dass es die Stabilität eines jeden Enzyms in diesen Zusammensetzungen fördert oder zumindest nicht degradiert.
Bevorzugte Systeme, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, umfassen als Tensid ein oder mehrere der hierin beschriebenen nicht-ionischen und/oder anionischen Tenside.
Polyethylen-, Polypropylen- und Polybutylenoxidkondensate von Alkylphenolen sind geeignet für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid des Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung, wobei die Polyethylenoxidkondensate bevorzugt sind. Diese Verbindungen schließen die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen ein, die eine Alkylgruppe aufweisen, welche von ungefähr 6 bis ungefähr 14 Kohlenstoffatome, bevorzugt von ungefähr 8 bis ungefähr 14 Kohlenstoffatome enthält, in entweder einer geradkettigen oder einer verzweigtkettigen Konfiguration mit dem Alkylenoxid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ethylenoxid in einer Menge vorhanden, die gleich zu ungefähr 2 bis ungefähr 25 Mol, stärker bevorzugt von ungefähr 3 bis ungefähr 15 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkylphenol ist. Kommerziell erhältliche nicht-ionische Tenside dieser Art schließen Igepal^TM CO-630, vermarktet durch die GAF Corporation; und Triton^TM X-45, X-114, X-100 und X-102, alle vermarktet von der Firma Rohm & Haas ein. Diese Tenside werden üblicherweise als Alkylphenolalkoxylate (z. B. Alkylphenolethoxylate) bezeichnet.
Die Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit ungefähr 1 bis ungefähr 25 Mol Ethylenoxid sind geeignet für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid des nicht-ionischen Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder gerade oder verzweigt sein, primär oder sekundär sein und im Allgemeinen von ungefähr 8 bis ungefähr 22 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugt sind die Kondensationsprodukte von Alkoholen, welche eine Alkylgruppe aufweisen, die von ungefähr 8 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatome enthält, mit von ungefähr 2 bis ungefähr 10 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol. Ungefähr 2 bis ungefähr 7 Mol Ethylenoxid und am stärksten bevorzug von 2 bis 5 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol sind in den Kondensationsprodukten vorhanden. Beispiele von kommerziell erhältlichen nicht-ionischen Tenside dieser Art schließen Tergitol^TM 15-S-9 (das Kondensationsprodukt von C₁₁-C₁₅ linearem Alkohol mit 9 Mol Ethylenoxid), Tergitol^TM 24-L-6 NMW (das Kondensationsprodukt von C₁₂-C₁₄ primärem Alkohol mit 6 Mol Ethylenoxid mit einer engen Molekulargewichtsverteilung), beide vermarktet von Union Carbid Corporation; Neodol^TM 45-9 (das Kondensationsprodukt von C₁₄-C₁₅ linearem Alkohol mit 9 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 23-3 (das Kondensationsprodukt von C₁₂-C₁₃ linearem Alkohol mit 3,0 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-7 (das Kondensationsprodukt von C₁₄-C₁₅ linearem Alkohol mit 7 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-5 (das Kondensationsprodukt von C₁₄-C₁₅ linearem Alkohol mit 5 Mol Ethylenoxid), vermarktet von Shell Chemical Company, Kyro^TM EOB (das Kondensationsprodukt von C₁₃-C₁₅ Alkohol mit 9 Mol Ethylenoxid), vermarktet von Procter & Gamble Company und Genapol LA 050 (das Kondensationsprodukt von C₁₂-C₁₄ Alkohol mit 5 Mol Ethylenoxid), vermarktet von Hoechst, ein. Bevorzugte Bereiche von HLB in diesen Produkten betragen von 8 bis 11 und am stärksten bevorzugt von 8 bis 10.
Ebenfalls verwendbar als nicht-ionisches Tensid des Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung sind Alkylpolysaccharide, offenbart in US 4,565,647 , welche eine hydrophobe Gruppe aufweisen, die von ungefähr 6 bis ungefähr 30 Kohlenstoffatomen, bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 16 Kohlenstoffatomen enthält, und ein Polysaccharid, z. B. ein Polyglycosid, mit einer hydrophilen Gruppe, die von ungefähr 1,3 bis ungefähr 10, bevorzugt von ungefähr 1,3 bis ungefähr 3, am stärksten bevorzugt von ungefähr 1,3 bis ungefähr 2,7 Saccharideinheiten enthält. Jedes beliebige reduzierende Saccharid, welches 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält, kann verwendet werden, z. B. können Glucose-, Galactose- und Galactosylanteile für die Glycosylanteile substituiert werden (optional ist die hydrophobe Gruppe an die 2-, 3-, 4- usw. Positionen angelagert, was eine Glucose oder Galactose im Gegensatz zu einem Glucosid oder einem Galactosid ergibt). Die Intersaccharidbindung kann z. B. zwischen der einen Position der zusätzlichen Saccharideinheiten und den 2-, 3-, 4- und/oder 6-Positionen der vorangehenden Saccharideinheiten sein.
Die bevorzugten Alkylpolyglucoside weisen die Formel auf R²O(C_nH_2nO)_t(Glycosyl)_x wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Alkylphenyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkylphenyl und Mischungen hiervon, in welchen die Alkylgruppen von ungefähr 10 bis ungefähr 18, bevorzugt von ungefähr 12 bis ungefähr 14 Kohlenstoffatome enthalten; n 2 oder 3 ist, bevorzugt 2; t von 0 bis ungefähr 10 ist, bevorzugt 0; und x von ungefähr 1,3 bis ungefähr 10 ist, bevorzugt von ungefähr 1,3 bis ungefähr 3, am stärksten bevorzugt von ungefähr 1,3 bis ungefähr 2,7. Das Glycosyl ist bevorzugt von Glucose abgeleitet. Um diese Verbindungen herzustellen, wird der Alkohol oder Alkylpolyethoxyalkohol zuerst gebildet und dann mit Glucose oder einer Quelle von Glucose in Reaktion gebracht, um das Glucosid (angelagert an die 1-Position) zu bilden. Die zusätzlichen Glycosyleinheiten können dann zwischen ihrer 1-Position und der 2-, 3-, 4- und/oder 6-Position, bevorzugt überwiegend der 2-Position der vorangehenden Glycosyleinheiten, angelagert sein.
Die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, gebildet durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol, sind ebenfalls geeignet zur Verwendung als zusätzliches nicht-ionisches Tensid-System der vorliegenden Erfindung. Der hydrophobe Teil dieser Verbindungen weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 1500 bis ungefähr 1800 auf und zeigt eine Unlöslichkeit in Wasser. Die Zugabe von Polyoxyethylenanteilen zu diesem hydrophoben Teil führt zu der Tendenz, die Wasserlöslichkeit des Moleküls als Ganzes zu erhöhen und der flüssige Charakter des Produktes wird beibehalten bis zu dem Punkt, an dem der Polyoxyethylengehalt ungefähr 50 % des Gesamtgewichtes des Kondensationsprodukts beträgt, welches der Kondensation mit bis zu ungefähr 40 Mol Ethylenoxid entspricht. Beispiele von Verbindungen dieser Art schließen bestimmte der kommerziell erhältlichen Pluronic^TM Tenside ein, vermarktet von BASF.
Ebenfalls geeignet zur Verwendung als nicht-ionisches Tensid des nicht-ionischen Tensid-Systems der vorliegenden Erfindung sind die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Produkt, das aus der Reaktion von Propylenoxid und Ethylendiamin resultiert. Der hydrophobe Anteil dieser Produkte besteht aus dem Reaktionsprodukt von Ethylendiamin und einem Überschuss an Propylenoxid, und weist im Allgemeinen ein Molekulargewicht von ungefähr 2500 bis ungefähr 3000 auf. Dieser hydrophobe Anteil ist mit Ethylenoxid zu dem Ausmaß kondensiert, das das Kondensationsprodukt von ungefähr 40 Gew.-% bis ungefähr 80 Gew.-% Polyoxyethylen enthält und ein Molekulargewicht von ungefähr 5000 bis ungefähr 11.000 aufweist. Beispiele dieser Art von nicht-ionischem Tensid schließen bestimmte der kommerziell erhältlichen Tetronic^TM -Verbindungen ein, die von BASF vermarktet werden.
Bevorzugt für die Verwendung als nicht-ionisches Tensid der Tensid-Systeme der vorliegenden Erfindung sind Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit von ungefähr 1 bis ungefähr 25 Mol Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Mischungen hiervon. Am stärksten bevorzugt sind C₈-C₁₄-Alkylphenolethoxylate, die von 3 bis 15 Ethoxygruppen aufweisen, und C₈-C₁₈-Alkoholethoxylate (bevorzugt durchschnittlich C₁₀), die von 2 bis 10 Ethoxygruppen aufweisen, und Mischungen davon.
Hoch bevorzugte nicht-ionische Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamid-Tenside der Formel
wobei R¹ H ist, oder R¹ C_1–4-Hydrocarbyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder eine Mischung davon ist, R² C_5–31-Hydrocarbyl ist und Z ein Polyhydroxyhydrocarbyl ist, das eine lineare Hydrocarbylkette mit mindestens 3 Hydroxylgruppen („hydroxyls") aufweist, die direkt mit der Kette verbunden sind, oder ein alkoxyliertes Derivat davon. Bevorzugt ist R¹ Methyl, ist R² eine gerade C_11–15-Alkyl- oder C_16–18-Alkyl- oder Alkenylkette, wie Kokosalkyl oder Mischungen davon, und ist Z abgeleitet von einem reduzierenden Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose oder Lactose in einer reduzierenden Aminierungsreaktion.
Hoch bevorzugte anionische Tenside schließen alkylalkoxylierte Sulfat-Tenside ein. Beispiele hiervon sind wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)_mSO3M, wobei R ein unsubstituiertes C₁₀-C₂₄-Alkyl oder eine Hydroxyalkylgruppe, die eine C₁₀-C₂₄-Alkylkomponente aufweist, bevorzugt ein C₁₂-C₂₀-Alkyl oder -Hydroxyalkyl, stärker bevorzugt ein C₁₂-C₁₈-Alkyl oder -Hydroxyalkyl, ist, A eine Ethoxy- oder Propoxyeinheit ist, m größer als Null ist, typischerweise zwischen ungefähr 0,5 und ungefähr 6, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 0,5 und ungefähr 3, und M H ist oder ein Kation, welches beispielsweise ein Metallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium usw.), Ammonium- oder substituiertes Ammoniumkation sein kann. Alkylethoxylierte Sulfate ebenso wie alkylpropoxylierte Sulfate sind hierin eingeschlossen. Spezifische Beispiele von substituierten Ammoniumkationen schließen Methyl-, Dimethyl-, Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium und Dimethylpiperidiniumkationen, und solche, die von Alkylaminen, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Mischungen hiervon abgeleitet sind, und dergleichen, ein. Exemplarische Tenside sind C_12–18-Alkylpolyethoxylat (1,0) Sulfat (C₁₂-C₁₈E(1,0)M), C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat (2,25) Sulfat (C₁₂-C₁₈(2,25)M), und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat (3,0) Sulfat (C₁₂-C₁₈E(3,0)M), und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat (4,0) Sulfat (C₁₂-C₁₈E(4,0)M), wobei M passend aus Natrium und Kalium ausgewählt ist.
Geeignete zu verwendende anionische Tenside sind Alkylestersulfonat-Tenside, einschließlich linearen Estern von C₈-C₂₀-Carbonsäuren (d.h. Fettsäuren), welche mit gasförmigen SO₃ sulfoniert werden, gemäß „The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), S. 323–329. Geeignete Ausgangsmaterialien schließen natürliche Fettsäuresubstanzen, wie von Talk, Palmenöl, usw. abgeleitet, ein.
Das bevorzugte Alkylestersulfonat-Tensid besonders für Wäscheanwendungen, umfasst Alkylestersulfonat-Tenside der Strukturformel:
wobei R³ ein C₈-C₂₀-Hydrocarbyl, bevorzugt ein Alkyl, oder eine Kombination davon ist, R⁴ ein C₁-C₆-Hydrocarbyl, bevorzugt ein Alkyl oder eine Kombination davon ist, und M ein Kation ist, welches ein wasserlösliches Salz mit dem Alkylestersulfonat bildet. Geeignete Salz-bildende Kationen schließen Metalle, wie Natrium, Kalium und Lithium, und substituierte und nicht-substituierte Ammoniumkationen, wie Monoethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin, ein. Bevorzugt ist R³ C₁₀-C₁₆-Alkyl und ist R⁴ Methyl, Ethyl oder Isopropyl. Besonders bevorzugt sind Methylestersulfonate, wobei R³ C₁₀-C₁₆-Alkyl ist.
Andere geeignete anionische Tenside schließen die Alkylsulfat-Tenside ein, welche wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO₃M sind, wobei R vorzugsweise ein C₁₀-C₂₄-Hydrocarbyl, bevorzugt ein Alkyl oder Hydroxyalkyl, welches eine C₁₀-C₂₀-Alkylkomponente aufweist, stärker bevorzugt ein C₁₂-C₁₈-Alkyl oder -Hydroxyalkyl ist, und M H oder ein Kation ist, z. B. ein Alkalimetallkation (z. B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium (z. B. Methyl-, Dimethyl- und Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium und Dimethylpiperidiniumkationen, und quaternäre Ammoniumkationen, die von Alkylaminen abgeleitet sind, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, und Mischungen davon, und dergleichen, ist). Typischerweise werden Alkylketten mit C₁₂-C₁₆ für niedrigere Waschtemperaturen (z. B. unterhalb von ungefähr 50 °C) bevorzugt und C₁₆-C₁₈-Alkylketten werden für höhere Waschtemperaturen (z. B. oberhalb von ungefähr 50 °C) bevorzugt.
Andere anionische Tenside, die für Reinigungsmittelzwecke verwendbar sind, können ebenfalls in die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein. Diese können Salze (einschließlich z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und substituierte Ammoniumsalze, wie Mono-, Di- und Triethanolaminsalze) von Seifen, C₈-C₂₂ primäre oder sekundäre Alkansulfonate, C₈-C₂₄-Olefinsulfonate, sulfonierte Polycarbonsäuren, hergestellt durch Sulfonierung des pyrolysierten Produktes von Erdalkalimetallcitraten, z. B. wie beschrieben in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1,082,179, C₈-C₂₄-Alkylpolyglycolethersulfate (die bis zu 10 Mol Ethylenoxid enthalten); Alkylglycerolsulfonate, Fettacylglycerolsulfate, Fettoleylglycerolsulfate, Alkylphenolethylenoxidethersulfate, Paraffinsulfonate, Alkylphosphate, Isethionate, wie das Acylisethionat, N-Acyltaurate, Alkylsuccinamate und Sulfosuccinate, Monoester von Sulfosuccinaten (besonders gesättigte und ungesättigte C₁₂-C₁₈-Monoester) und Diester von Sulfosuccinaten (besonders gesättigte und ungesättigte C₆-C₁₂-Diester), Acylsarcosinate, Sulfate von Alkylpolysacchariden, wie die Sulfate von Alkylpolyglucosid (die nicht-ionischen nicht-sulfatierten Verbindungen werden nachfolgend beschrieben), verzweigte primäre Alkylsulfate und Alkylpolyethoxycarboxylate, wie solche der Formel RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO-M+, wobei R ein C₈-C₂₂-Alkyl ist, k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, und M ein Kation ist, das ein lösliches Salz bildet, einschließen. Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren sind ebenfalls geeignet, wie Terpentinharz, hydriertes Terpentinharz, und Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren, die in Tallöl vorhanden sind oder von Tallöl abgeleitet sind.
Alkylbenzolsulfonate sind hoch bevorzugt. Besonders bevorzugt sind lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), wobei die Alkylgruppe vorzugsweise von 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthält.
Weitere Beispiele sind beschrieben in „Surface Active Agents and Detergents" (Bd. I und II von Schwartz, Perry und Berch). Eine Vielzahl solcher Tenside ist ebenfalls allgemeinen offenbart in US 3,929,678 (Spalte 23, Zeile 58 bis Spalte 29, Zeile 23, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen).
Wenn sie darin eingeschlossen sind, umfassen die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 40 Gew.-%, bevorzugt von ungefähr 3 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-% solcher anionischen Tenside.
Die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls andere als die hierin bereits beschriebenen kationischen, ampholytischen, zwitterionischen und semipolaren Tenside, ebenso wie nicht-ionischen und/oder anionischen Tenside enthalten.
Kationische Reinigungsmitteltenside, die für die Verwendung in den Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind, sind solche, die eine langkettige Hydrocarbylgruppe aufweisen. Beispiele von solchen kationischen Tenside schließen die Ammonium-Tenside, wie Alkyltrimethylammoniumhalogenide, ein und solche Tenside, die die Formel aufweisen: [R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N+X- wobei R² eine Alkyl- oder Alkylbenzylgruppe ist, die von ungefähr 8 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette aufweist, jeder R³ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)-, -CH₂CH(CH₂OH)-, -CH₂CH₂CH₂- und Mischungen davon; jeder R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzylringstrukturen, die durch Vereinigen der zwei R⁴-Gruppen gebildet werden, -CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH, wobei R⁶ eine beliebige Hexose oder ein beliebiges Hexosepolymer ist, welche/welches ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 1000 aufweist, und Wasserstoff ist, wenn y nicht 0 ist; R⁵ das gleiche wie R⁴ ist, oder eine Alkylkette ist, wobei die Gesamtanzahl der Kohlenstoffatome oder R² plus R⁵ nicht mehr als ungefähr 18 ist; jedes y von 0 bis ungefähr 10 ist und die Summe der y-Werte von 0 bis ungefähr 15 ist; und X ein beliebiges kompatibles Anion ist.
Hoch bevorzugte kationische Tenside sind die wasserlöslichen quaternären Ammoniumverbindungen, die verwendbar in der vorliegenden Zusammensetzung sind, welche die Formel aufweist: R₁R₂R₃R₄N⁺X^– (i)wobei R₁ C₈-C₁₆-Alkyl ist, jeder von R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzyl und -(C₂H₄₀)_xH ist, worin x einen Wert von 2 bis 5 aufweist, und X ein Anion ist. Nicht mehr als einer von R₂, R₃ oder R₄ sollte Benzyl sein.
Die bevorzugte Alkylkettenlänge für R₁ ist C₁₂-C₁₅, insbesondere, wenn die Alkylgruppe eine Mischung aus Kettenlängen ist, die von Kokos- oder Palmkernfett abgeleitet ist oder synthetisch durch Olefin-Ausbilden oder Oxo-Alkoholsynthese abgeleitet ist. Bevorzugte Gruppen für R₂, R₃ und R₄ sind Methyl- und Hydroxyethylgruppen und das Anion X kann ausgewählt sein aus Halogenid-, Methosulfat-, Acetat- und Phosphationen.
Beispiele von geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen der Formel (i) für die Verwendung hierin sind:
Kokostrimethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosmethyldihydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Decyltriethylammoniumchlorid;
Decyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
C_12–15-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosdimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Myristyltrimethylammoniummethylsulfat;
Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid oder -bromid;
Lauryldimethyl(ethenoxy)₄-Ammoniumchlorid oder -bromid;
Cholinester (Verbindungen der Formel (i), wobei R₁
und R₂R₃R₄ Methyl sind).
Dialkylimidazoline [Verbindungen der Formel (i)].
Andere kationische Tenside, die hierin verwendbar sind, sind ebenfalls in US 4,228,044 und in EP 000 224 beschrieben.
Wenn sie darin enthalten sind, umfassen die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 Gew.-% bis ungefähr 25 Gew.-%, bevorzugt von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 8 Gew.-% solcher kationischen Tenside.
Ampholytische Tenside sind ebenfalls geeignet für die Verwendung in den Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Diese Tenside können breit beschrieben werden als aliphatische Derivate von sekundären oder tertiären Aminen oder aliphatischen Derivaten von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen, in welchen das aliphatische Radikal geradkettig oder verzweigtkettig sein kann. Einer der aliphatischen Substituenten enthält mindestens ungefähr 8 Kohlenstoffatome, typischerweise von ungefähr 8 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatome, und mindestens einer enthält eine anionische Wasser-löslichmachende Gruppe, z. B. Carboxy, Sulfonat, Sulfat. Siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeilen 18–35) für Beispiele von ampholytischen Tenside.
Wenn sie darin eingeschlossen sind, umfassen die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 Gew.-% bis ungefähr 15 Gew.-%, bevorzugt von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% solcher ampholytischen Tenside.
Zwitterionische Tenside sind ebenfalls geeignet zur Verwendung in Waschdetergentzusammensetzungen. Diese Tenside können breit beschrieben werden als Derivate von sekundären und tertiären Aminen, Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen oder Derivate von quaternären Ammonium-, quaternären Phosphonium- oder tertiären Sulfoniumverbindungen. Für Beispiele von zwitterionischen Tensiden siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeile 38 bis Spalte 22, Zeile 48).
Wenn sie darin eingeschlossen sind, umfassen die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 Gew.-% bis ungefähr 15 Gew.-%, bevorzugt von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% solcher zwitterionischer Tenside.
Semi-polare nicht-ionische Tenside sind eine spezielle Kategorie von nicht-ionischen Tensiden, welche wasserlösliche Aminoxide, die einen Alkylanteil von ungefähr 10 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen und zwei Anteile, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen, die von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatome enthalten; wasserlösliche Phosphinoxide, die einen Alkylanteil von ungefähr 10 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen und 2 Anteile enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen enthalten, die von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatome bestehen, enthalten; und wasserlösliche Sulfoxide, die einen Alkylanteil von ungefähr 10 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen und einen Anteil enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkylanteilen von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatomen einschließen.
Semi-polare anionische Detergenttenside schließen die Aminoxid-Tenside ein, welche die Formel aufweisen:
wobei R³ eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkylphenylgruppe oder Mischungen hiervon, die von ungefähr 8 bis ungefähr 22 Kohlenstoffatome enthalten, ist; R⁴ eine Alkylen- oder Hydroxyalkylengruppe ist, die von ungefähr 2 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatome enthält oder Mischungen hiervon; x von 0 bis ungefähr 3 ist; und jeder R⁵ eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe, die von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine Polyethylenoxidgruppe, die von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Ethylenoxidgruppen enthält, ist. Die R⁵-Gruppen können aneinander angelagert sein, z. B. über ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom, um eine Ringstruktur zu bilden.
Diese Aminoxid-Tenside schließen insbesondere C₁₀-C₁₈-Alkyldimethylaminoxide und C₈-C₁₂-Alkoxyethyldihydroxyethylaminoxide ein.
Wenn sie darin eingeschlossen sind, umfassen die Waschdetergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 Gew.-% bis ungefähr 15 Gew.-%, bevorzugt von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% solcher semi-polaren nicht-ionischen Tenside.
Builder-System
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können weiterhin ein Builder-System umfassen. Jedes beliebige herkömmliche Builder-System ist für die Verwendung hierin geeignet, einschließlich Aluminosilikatmaterialien, Silikaten, Polycarboxylaten und Fettsäuren, Materialien wie Ethylendiamintetraacetat, Metallionenkomplexbildner, wie Aminopolyphosphonate, insbesondere Ethylendiamintetramethylenphosphonsäure und Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure. Obwohl sie aus umweltbedingten Gründen weniger bevorzugt sind, können Phosphat-Builder hierin ebenfalls verwendet werden.
Geeignete Builder können ein anionisches Ionenaustauschmaterial sein, üblicherweise ein anorganisches hydriertes Aluminosilikatmaterial, ganz besonders ein hydriertes synthetisches Zeolith, wie hydriertes Zeolith A, X, B, HS oder MAP.
Ein anderes geeignetes anorganisches Buildermaterial ist Schichtsilikat, z. B. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 ist ein kristallines Schichtsilikat, welches aus Natriumsilikat (Na₂Si₂O₅) besteht.
Geeignete Polycarboxylate, die eine Carboxygruppe enthalten, schließen Milchsäure, Glykolsäure und Etherderivate davon ein, wie in den belgischen Patenten Nr. 831,368, 821,369 und 821,370 offenbart. Polycarboxylate, die zwei Carboxygruppen enthalten, schließen die wasserlöslichen Salze von Succinsäure, Malonsäure, (Ethylendioxy-) Diessigsäure, Maleinsäure, Diglykolsäure, Weinsäure, Tartronsäure und Fumarsäure ein, ebenso wie die Ethercarboxylate, beschrieben in der deutschen Offenlegungsschrift 2,446,686 und 2,446,487, US 3,935,257 , und die Sulfinylcarboxylate, wie in dem belgischen Patent Nr. 840,623 beschrieben.
Polycarboxylate, welche drei Carboxygruppen enthalten, schließen insbesondere wasserlösliche Citrate, Aconitrate und Citraconate ein, ebenso wie Succinatderivate, wie die Carboxymethyloxysuccinate, beschrieben in dem britischen Patent Nr. 1,379,241, Lactoxysuccinate, beschrieben in der niederländischen Anmeldung 7205873, und die Oxypolycarboxylatmaterialien, wie 2-Oxa-1,1,3-propantricarboxylate, beschrieben in dem britischen Patent Nr. 1,387,447.
Polycarboxylate, welche vier Carboxygruppen enthalten, schließen Oxydisuccinate, offenbart in dem britischen Patent Nr. 1,261,829, 1,1,2,2,-Ethantetracarboxylate, 1,1,3,3-Propantetracarboxylate, die Sulfosubstituenten enthalten, einschließlich der Sulfosuccinatderivate, offenbart in den britischen Patenten Nr. 1,398,421 und 1,398,442 und in US 3,936,448 , und die sulfonierten pyrolysierten Citrate, beschrieben in dem britischen Patent Nr. 1,082,179, während Polycarboxylate, die Phosphonsubstituenten enthalten, in dem britischen Patent Nr. 1,439,000 offenbart sind, ein.
Alicyclische und heterocyclische Polycarboxylate schließen Cyclopentan-cis,cis-cis-tetracarboxylate, Cyclopentadienidpentacarboxylate, 2,3,4,5-Tetrahydrofuran-cis,cis,cis-tetracarboxylate, 2,5-Tetrahydrofuran-cis,discarboxylate, 2,2,5,5,-Tetrahydrofurantetracarboxylate, 1,2,3,4,5,6-Hexan-hexacarboxylate und Carboxymethylderivate von mehrwertigen Alkoholen (Polyalkoholen), wie Sorbitol, Mannitol und Xylitol, ein. Aromatische Polycarboxylate schließen Mellithsäure-, Pyromellithsäure- und die Phthalsäurederivate ein, offenbart in dem britischen Patent Nr. 1,425,343.
Von den oben genannten sind die bevorzugten Polycarboxylate Hydroxycarboxylate, welche bis zu drei Carboxygruppen pro Molekül enthalten, ganz besonders Citrate.
Bevorzugte Builder-Systeme zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen schließen eine Mischung aus einem wasser-unlöslichen Aluminosilikat-Builders, wie Zeolith A, oder einem Schichtsilikat (SKS-6), und einem wasserlöslichen Carboxylat-Chelatbildner, wie Zitronensäure, ein.
Ein geeignetes Chelat („chelant") zur Einbeziehung in die Detergentzusammensetzungen gemäß der Erfindung ist Ethylendiamin-N,N'-Disuccinsäure (EDDS) oder die Alkalimetall-Erdalkalimetallammonium- oder substituierten Ammoniumsalze davon oder Mischungen davon. Bevorzugte EDDS-Verbindungen sind die freie Säureform und das Natrium- oder Magnesiumsalz davon. Beispiele von solchen bevorzugten Natriumsalzen von EDDS schließen Na₂EDDS und Na₄EDDS ein. Beispiele von solchen bevorzugten Magnesiumsalzen von EDDS schließen MgEDDS und Mg₂EDDS ein. Die Magnesiumsalze sind am stärksten bevorzugt für die Einbeziehung in Zusammensetzungen gemäß der Erfindung.
Bevorzugte Builder-Systeme schließen eine Mischung eines wasser-unlöslichen Aminosilikat-Builders, wie Zeolith A, und eines wasserlöslichen Carboxylat-Chelat-Bildners, wie Zitronensäure, ein.
Andere Builder-Materialien, die ein Teil des Builder-Systems für die Verwendung in granulären Zusammensetzungen sein können, schließen anorganische Materialien wie Alkalimetallcarbonate, Bicarbonate, Silikate, und organische Materialien, wie die organischen Phosphonate, Aminopolyalkenphosphonate und Aminopolycarboxylate, ein.
Andere geeignete wasserlösliche organische Salze sind die homo- oder copolymeren Säuren oder ihre Salze, in welchen die Polycarbonsäure mindestens zwei Carboxylradikale umfasst, die voneinander durch nicht mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt sind.
Polymere dieser Art sind in GB-A-1,596,756 offenbart. Beispiele von solchen Salzen sind Polyacrylate mit MW 2000 bis 5000 und ihre Copolymere mit Maleinanhydrid, wie Copolymere, die ein Molekulargewicht von 20.000 bis 70.000, besonders ungefähr 40.000, aufweisen.
Detergentbuildersalze sind normalerweise in Mengen von 5 Gew.-% bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung eingeschlossen. Ein bevorzugter Level eines Builders für flüssige Detergentien beträgt von 5 % bis 30 %.
Enzyme
Bevorzugte Detergentzusammensetzungen umfassen zusätzlich zu der Enzymzubereitung der Erfindung ein anderes Enzym/andere Enzyme, welche eine Reinigungsleistung und/oder Vorteile für die Stoffpflege bereitstellen.
Solche Enzyme schließen Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulasen, Peroxidasen, Oxidasen (z. B. Laccasen) ein.
Proteasen: Jede beliebige Protease, die für die Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Proteasen schließen solche von tierischer, pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft ein. Eine mikrobielle Herkunft ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Die Protease kann eine Serinprotease, bevorzugt eine alkalische mikrobielle Protease, oder eine Trypsinähnliche Protease sein. Beispiele von alkalischen Proteasen sind Subtilisine, besonders solche, die von Bacillus abgeleitet sind, z. B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele von Trypsin-ähnlichen Proteasen sind Trypsin (z. B. mit Herkunft vom Schwein oder Rind) und die Protease von Fusarium, beschrieben in WO 89/06270.
Bevorzugte kommerziell erhältliche Proteaseenzyme schließen solche ein, die unter den Handelsnamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauft werden, solche, die unter den Handelsnamen Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauft werden und solche, die unter den Handelsnamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauft werden. Die Proteaseenzyme können in die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut werden.
Lipasen: Jede beliebige Lipase, die für die Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Lipasen schließen solche von Bakterien- oder Pilzherkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Beispiele von verwendbaren Lipasen schließen eine Lipase von Humicola lanuginosa, wie beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216 , eine Lipase von Rhizomucor miehei, z. B., wie beschrieben in EP 238 023 , eine Lipase von Candida, wie eine Lipase von C. antarctica, z. B. die Lipase A oder B von C. antarctica, beschrieben in EP 214 761 , eine Lipase von Pseudomonas, wie eine Lipase von P. alcaligenes und P. pseudoalcaligenes, z. B., wie in EP 218 272 beschrieben, eine Lipase von P. cepacia, z. B., wie beschrieben in EP 331 376 , eine Lipase von P. stutzeri, z. B., wie offenbart in GB 1,372,034 , eine Lipase von P. fluorescens, eine Lipase von Bacillus, z. B. eine Lipase von B. subtilis (Dartois et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253–260), eine Lipase von B. stearothermophilus (JP 64/744992) und eine Lipase von B. pumilus (WO 91/16422), ein.
Weiterhin können eine Anzahl klonierter Lipasen verwendbar sein, einschließlich der Lipase von Penicillium camembertii, die von Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67) beschrieben wird, die Lipase von Geotricum candidum (Schimada, Y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388), und verschiedener Lipasen von Rhizopus, wie einer Lipase von R. delemar (Hass, M. J. et al., (1991), Gene 109, 117–113), einer Lipase von R. niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) und einer Lipase von R. oryzae.
Andere Arten von lipolytischen Enzymen, wie Cutinasen, können ebenfalls verwendbar sein, z. B. eine Cutinase, die von Pseudomonas mendocina abgeleitet ist, wie beschrieben in WO 88/09367, oder eine Cutinase, die von Fusarium solani pisi abgeleitet ist (z. B. beschrieben in WO 90/09446).
Besonders geeignete Lipasen sind Lipasen, wie die M1 Lipase^TM, Luma fast^TM (Genencor), Lipolase^TM und Lipolase U1tra^TM (Novo Nordisk A/S) und Lipase P „Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Die Lipasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % des Enzymproteins per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut.
Amylasen: Jede beliebige Amylase (a und/oder b), die für die Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Amylasen schließen solche von Bakterien- oder Pilzherkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen schließen z. B. a-Amylasen ein, die von einem speziellen Stamm von B. licheniformis erhalten werden, genauer in GB 1,296,839 beschrieben. Kommerziell erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und Rapidase^TM und Maxamyl P^TM (erhältlich von Genencor).
Die Amylasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut.
Cellulasen: Jede beliebige Cellulase, die für die Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Cellulasen schließen solche von Bakterien- oder Pilzherkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind offenbart in US 4,435,307 , die Pilzcellulasen offenbart, welche von Humicola insolens produziert werden, in WO 96/34108 und WO 96/34092, die bakterielle alkalophile Cellulasen (BCE 103) von Bacillus offenbaren, und in WO 94/21801, US 5,475,101 und US 5,419,778 , welche EG III-Cellulasen von Trichoderma offenbaren. Besonders geeignete Cellulasen sind Cellulasen, die Vorteile für die Farbpflege aufweisen. Beispiele von solchen Cellulasen sind Cellulasen, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 495 257 beschrieben sind. Kommerziell erhältliche Cellulasen schließen Celluzyme^TM und Carezyme^TM, die von einem Stamm von Humicola insolens produziert werden (Novo Nordisk A/S), KAC-500(B)^TM (Kao Corporation) und Puradax^TM (Genencor International), ein.
Cellulasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut.
Peroxidasen/Oxidasen: Peroxidaseenzyme werden in Kombination mit Wasserstoffperoxid oder einer Quelle davon (z. B. ein Percarbonat, Perborat oder Persulfat) verwendet. Oxidaseenzyme werden in Verbindung mit Sauerstoff verwendet. Beide Arten von Enzymen werden zum „Lösungsbleichen", d.h. um den Transfer eines Textilfarbstoffs von einem gefärbten Stoff auf einen anderen Stoff zu verhindern, wenn die Stoffe zusammen in einer Waschflüssigkeit gewaschen werden, bevorzugt zusammen mit einem Verstärkungsmittel, wie beispielsweise in WO 94/12621 und WO 95/01426 beschrieben, verwendet. Geeignete Peroxidasen/Oxidasen schließen solche von Pflanzen-, Bakterien- oder Pilzherkunft ein. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Peroxidase- und/oder Oxidaseenzyme werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut.
Mischungen der oben erwähnten Enzyme sind hierin umfasst, insbesondere eine Mischung aus einer Protease, einer Amylase, einer Lipase und/oder einer Cellulase.
Das Enzym der Erfindung oder jedes beliebige andere Enzym, das in die Detergentzusammensetzung eingebaut wird, wird normalerweise in die Detergentzusammensetzung bei einem Level von 0,00001 % bis 2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, bevorzugt bei einem Level von 0,0001 % bis 1 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, stärker bevorzugt bei einem Level von 0,001 % bis 0,5 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt bei einem Level von 0,01 % bis 0,2 % Enzymprotein per Gewicht der Zusammensetzung eingebaut.
Bleichmittel
Zusätzliche optionale Detergentbestandteile, die in die Detergentzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, schließen Bleichmittel, wie PB1, PB4 und Percarbonat mit einer Partikelgröße von 400 bis 800 Mikrometer ein. Diese Bleichmittelkomponenten können ein oder mehrere Sauerstoffbleichmittel einschließen und, abhängig von dem gewählten Bleichmittel, einen oder mehrere Bleichaktivatoren. Wenn Sauerstoffbleichverbindungen vorhanden sind, sind sie typischerweise bei einem Level von ungefähr 1 % bis ungefähr 25 % vorhanden. Im Allgemeinen sind Bleichverbindungen optional hinzugefügte Komponenten in nicht-flüssigen Formulierungen, z. B. granulären Detergentien.
Die Bleichmittelkomponente zur Verwendung hierin kann jedes beliebige Bleichmittel sein, das für Detergentzusammensetzungen verwendbar ist, einschließlich Sauerstoffbleichen, ebenso wie andere im Stand der Technik bekannte.
Das für die vorliegende Erfindung geeignete Bleichmittel kann ein aktiviertes oder nicht-aktiviertes Bleichmittel sein.
Eine Kategorie von Sauerstoffbleichmittel, die verwendet werden kann, umfasst Percarbonsäure-Bleichmittel und Salze davon. Geeignete Beispiele von dieser Klasse von Mitteln schließen Magnesiummonoperoxyphthalathexahydrat, das Magnesiumsalz von meta-Chlorperbenzoesäure, 4-Nonylamino-4-oxoperoxybuttersäure und Diperoxydodecandionsäure ein. Solche Bleichmittel sind in US 4,483,781 , US 740,446 , EP 0 133 354 und US 4,412,934 offenbart. Hoch bevorzugte Bleichmittel schließen ebenfalls 6-Nonylamino-6-oxoperoxycapronsäure ein, wie in US 4,634,551 beschrieben.
Eine andere Kategorie von Bleichmitteln, die verwendet werden kann, umfassen die Halogenbleichmittel. Beispiele von Hypohalogenidbleichmitteln, z. B., schließen Trichlorisocyanursäure und die Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate und N-Chlor- und N-Bromalkansulfonamide ein. Solche Materialien werden normalerweise bei 0,5 bis 10 Gew.-% des Endproduktes, bevorzugt 1 bis 5 Gew.-% hinzugefügt.
Die Wasserstoffperoxid-freisetzenden Mittel können in Kombination mit Bleichaktivatoren verwendet werden, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED), Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS, beschrieben in US 4,412,934 ), 3,5-Trimethylhexanoloxybenzolsulfonat (ISONOBS, beschrieben in EP 120 591 ), oder Pentaacetylglucose (PAG), welche perhydrolysiert sind, um eine Persäure als aktive Bleichspezies zu bilden, was zu einem verbesserten Bleicheffekt führt. Zusätzlich sind die Bleichaktivatoren C8 (6-Octanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat, C9 (6-Nonanamido-caproyl)oxybenzolsulfonat und C10 (6-Decanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat oder Mischungen davon sehr geeignet. Ebenfalls geeignete Aktivatoren sind acetylierte Citratester, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 91870207.7 offenbart.
Verwendbare Bleichmittel, einschließlich Peroxysäuren und Bleichsysteme, die Bleichaktivatoren und Peroxidbleichverbindungen umfassen, für die Verwendung in den Reinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung sind in der Anmeldung USSN 08/136,626 beschrieben.
Das Wasserstoffperoxid kann ebenfalls durch Hinzufügen eines Enzymsystems (d.h. ein Enzym und ein Substrat davon) vorhanden sein, welches in der Lage ist, Wasserstoffperoxid bei Beginn oder während des Wasch- und/oder Spülvorganges zu erzeugen. Solche Enzymsysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 537 381 beschrieben.
Andere Bleichmittel als Sauerstoffbleichmittel sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und können hierin benutzt werden. Eine Art von Nicht-Sauerstoffbleichmitteln von besonderem Interesse schließt photoaktivierte Bleichmittel ein, wie sulfonierte Zink- und/oder Aluminiumphthalocyanine. Diese Materialien können während des Waschvorganges auf dem Substrat aufgelagert werden. Durch die Bestrahlung mit Licht in der Gegenwart von Sauerstoff, wie es bei Aufhängen von Kleidung zum Trocknen bei Tageslicht erfolgt, wird das sulfonierte Phthalocyanin aktiviert und folglich wird das Substrat gebleicht. Ein bevorzugtes Zinkphthalocyanin und ein photoaktivierter Bleichvorgang sind in US 4,033,718 beschrieben. Typischerweise enthält die Detergentzusammensetzung ungefähr 0,025 Gew.-% bis ungefähr 1,25 Gew.-% eines sulfonierten Zinkphthalocyanins.
Bleichmittel können ebenfalls einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatalysator kann beispielsweise einer der Verbindungen sein, die in „Efficient manganese catalyst for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, S. 637–639 beschrieben sind.
Schaumunterdrücker
Ein anderer optionaler Bestandteil ist ein Schaumunterdrücker, wobei Silikone und Kieselsäure-Silikon-Mischungen als Beispiele dienen. Silikone können im Allgemeinen durch alkylierte Polysiloxanmaterialien dargestellt werden, während Kieselsäure normalerweise in fein geteilten Formen („finely divided forms") verwendet wird, beispielhaft dargestellt durch Kieselsäure-Aerogele und -Xerogele und hydrophobe Kieselsäuren verschiedener Arten. Diese Materialien können als Partikel eingebaut werden, in welche der Schaumunterdrücker vorteilhafterweise freisetzbar eingebaut ist, in einem wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, im Wesentlichen nicht oberflächenaktiven Detergent-impermeablen Träger. Alternativ kann der Schaumunterdrücker in einem flüssigen Träger aufgelöst oder dispergiert werden und durch Aufsprühen auf eine oder mehrere der anderen Komponenten appliziert werden.
Ein bevorzugtes Schaum-kontrollierendes Silikon-Mittel ist in US 3,933,672 offenbart. Andere insbesondere verwendbare Schaumunterdrücker sind die selbst-emulgierenden Silikon-Schaumunterdrücker, beschrieben in der deutschen Patentanmeldung DTOS 2,646,126. Ein Beispiel einer solchen Verbindung ist DC-544, kommerziell erhältlich von Dow Corning, welche ein Siloxan-Glykol-Copolymer ist. Ein besonders bevorzugtes Schaum-kontrollierendes Mittel sind die Schaumunterdrückersysteme, welche eine Mischung aus Silikonölen und 2-Alkyl-Alkanolen umfassen. Geeignete 2-Alkyl-Alkanole sind 2-Butyloctanol, welches kommerziell erhältlich ist unter dem Handelsnamen Isofol 12 R.
Solche Schaumsuppressorsysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 593 841 beschrieben.
Besonders bevorzugte Schaum-kontrollierende Silikon-Mittel sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 92201649.8 beschrieben. Die Zusammensetzungen können eine Silikon/Kieselsäure-Mischung in Kombination mit abgerauchter nicht-poröser Silicasäure, wie Aerosil^®, umfassen.
Die oben beschriebenen Schaumunterdrücker werden normalerweise bei einem Level von 0,001 Gew.-% bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung, bevorzugt von 0,01 Gew.-% bis 1 Gew.-%, angewendet.
Andere Komponenten
Andere in Detergentzusammensetzungen verwendete Komponenten können angewendet werden, wie Verschmutzungs-suspendierende Mittel, Verschmutzungs-freisetzende Mittel, optische Aufheller, Schleifmittel, Bakteriozide, Trübungsinhibitoren, colorierende Mittel und/oder verkapselte oder nicht-verkapselte Duftstoffe.
Besonders geeignete Verkapselungsmaterialien sind wasserlösliche Kapseln, welche aus einer Matrix aus Polysaccharid- und Polyhydroxyverbindungen bestehen, wie in GB 1,464,616 beschrieben.
Andere geeignete wasserlösliche Verkapselungsmaterialien umfassen Dextrine, abgeleitet von nicht-gelierten Stärkesäureestern von substituierten Dicarbonsäuren, wie beschrieben in US 3,455,838 . Diese Säureesterdextrine sind bevorzugt aus solchen Stärken hergestellt, wie wachshlatigem Mais, wachshalteger Hirse, Sago, Tapioka und Kartoffel. Geeignete Beispiele der Verkapselungsmaterialien schließen N-Lok ein, hergestellt von National Starch. Das Verkapselungsmaterial N-Lok besteht aus einer modifizierten Maisstärke und Glucose. Die Stärke ist modifiziert, indem monofunktionelle substituierte Gruppen, wie Octenylsuccinsäureanhydrid, hinzugefügt werden.
Wiederablagerungs-verhindernde (Anti-Redepositions-) und Verschmutzungssuspensionsmittel, die hierin geeignet sind, schließen Cellulosederivate, wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxymethylcellulose und homo- und copolymere Polycarbonsäuren oder ihre Salze ein. Polymere dieser Art schließen die Polyacrylate und Maleinanhydrid-Acrylsäure-Copolymere ein, die vorab als Builder erwähnt werden, ebenso wie Copolymere von Maleinanhydrid mit Ethylen, Methylvinylether oder Methacrylsäure, wobei das Maleinanhydrid mindestens 20 Mol-% des Copolymers ausmacht. Diese Materialien werden normalerweise bei einem Level von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,75 % bis 8 %, am stärksten bevorzugt von 1 Gew.-% bis 6 Gew.-% der Zusammensetzung verwendet.
Bevorzugte optische Aufheller haben anionischen Charakter, Beispiele hiervon sind Dinatrium-4,4'-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,-4'-bis-(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino-stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2:2'-disulfonat, Mononatrium-4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2-sulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)-stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium-4,4'-bis-(2-anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)- stilben-2,2'-disulfonat, Natrium-2(stilbyl-4''-(naphtho-1',2':4,5)-1,2,3,-triazol-2''-sulfonat und 4,4'-bis(2-sulfostyryl)biphenyl.
Andere verwendbare polymere Materialien sind Polyethylenglycole, insbesondere solche mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10.000, ganz besonders von 2000 bis 8000 und am stärksten bevorzugt ungefähr 4000. Diese werden bei einem Level von 0,20 Gew.-% bis 5 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,25 Gew.-% bis 2,5 Gew.-% verwendet. Diese Polymere und die vorab erwähnten homo- oder copolymeren Polycarboxylatsalze sind wertvoll zum Verbessern des Erhalts der Weiße, der Ascheablagerung auf dem Stoff („fabric ash deposition") und der Reinigungsleistung gegenüber Tonerde, proteinhaltigen und oxidierbaren Verschmutzungen in Gegenwart von Verunreinigungen mit Übergangsmetallen. Verschmutzungs-freisetzende Mittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind herkömmliche Copolymere oder Terpolymere von Terephthalsäure mit Ethylenglykol- und/oder Propylenglykoleinheiten in verschiedenen Anordnungen. Beispiele solcher Polymere sind in US 4,116,885 und 4,711,730 und EP 0 272 033 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Polymer gemäß EP 0 272 033 weist die Formel auf: (CH₃(PFG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75 wobei PET -(OC₂H₄)O- ist, PO(OC₃H₆O) ist und T (pOOC₆H₄CO) ist.
Ebenfalls sehr gut verwendbar sind modifizierte Polyester, wie Zufalls-Copolymere aus Dimethylterephthalat, Dimethylsulfoisophthalat, Ethylenglykol und 1,2-Propandiol, wobei die Endgruppen primär aus Sulfobenzoat und sekundär aus Monoestern von Ethylenglykol und/oder 1,2-Propandiol bestehen. Das Ziel ist es, ein Polymer zu erhalten, das an beiden Enden durch Sulfobenzoatgruppen gekappt („capped") ist, „primär", im vorliegenden Zusammenhang, sind die meisten der Copolymere hierin durch Sulfobenzoatgruppen endkappt („endcapped"). Jedoch werden einige Copolymere nicht ganz vollständig gekappt, und daher können ihre Endgruppen aus Monoester von Ethylenglykol und/oder 1,2-Propandiol bestehen, demnach bestehen „sekundäre" dieser Spezies.
Die hierin ausgewählten Polyester enthalten ungefähr 46 Gew.-% Dimethylterephthalsäure, ungefähr 16 Gew.-% 1,2-Propandiol, ungefähr 10 Gew.-% Ethylenglykol, ungefähr 13 Gew.-% Dimethylsulfobenzoesäure und ungefähr 15 Gew.-% Sulfoisophthalsäure, und weisen ein Molekulargewicht von ungefähr 3000 auf. Die Polyester und das Verfahren für ihre Herstellung sind ausführlich in EP 311 342 beschrieben.
Weichmacher
Stoff-weichmachende Mittel können ebenfalls in Wäschedetergentlösungen gemäß der vorliegenden Erfindung eingebaut werden. Diese Mittel können anorganisch oder organisch in ihrer Art sein. Anorganische Weichmacher sind beispielhaft durch die in GB-A-1 400898 und in US 5,019,292 offenbarten smektischen Tonerden dargestellt. Organische Stoff-weichmachende Mittel schließen die wasser-unlöslichen tertiären Amine ein, wie in GB-A-1 514 276 und EP 0 011 314 offenbart, und ihre Kombination mit mono-C_12–14-quaternären Ammoniumsalzen, offenbart in EP-B-0 026 528, und di-langkettige Amide, wie in EP 0 242 919 offenbart, ein. Andere verwendbare organische Bestandteile von Stoff-weichmachenden Systemen schließen Polyethylenoxidmaterialien mit hohem Molekulargewicht ein, wie in EP 0 299 575 und 0 313 146 offenbart, ein.
Der Level von smektischer Tonerde liegt normalerweise in dem Bereich von 5 % bis 15 %, stärker bevorzugt von 8 Gew.-% bis 12 Gew.-% bezogen auf das Material, welches als Trockenmischkomponente zu dem Rest der Formulierung hinzugefügt wird. Organische Stoff-Weichmacher, wie die wasser-unlöslichen tertiären Amine oder di-langkettige („dilong chain") Amidmaterialien werden bei einem Level von 0,5 Gew.-% bis 5 Gew.-%, normalerweise von 1 Gew.-% bis 3 Gew.-% eingebaut, während die Polyethylenoxidmaterialien mit hohem Molekulargewicht und die wasserlöslichen kationischen Materialien bei einem Level von 0,1 Gew.-% bis 2 Gew.-%, normalerweise von 0,15 Gew.-% bis 1,5 Gew.-% hinzugefügt werden. Diese Materialien werden normalerweise zu dem Spray-getrockneten Teil der Zusammensetzung hinzugefügt, obwohl es in einigen Fällen zweckmäßiger sein kann, sie als Trockenmischpartikel hinzuzufügen oder sie als geschmolzene Flüssigkeit auf die anderen Festkomponenten der Zusammensetzung aufzusprühen.
Polymere Farbstoff-Transfer-inhibierende Mittel
Die Detergentzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls von 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 Gew.-% bis 2 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,05 Gew.-% bis 1 Gew.-% polymere Farbstoff-Transfer-inhibierende Mitteln umfassen. Die polymeren Farbstoff-Transfer-inhibierenden Mittel werden normalerweise in Detergentzusammensetzungen eingebaut, um den Transfer von Farbstoffen von gefärbten Stoffen auf Stoffe, die mit diesen gewaschen werden, zu inhibieren. Diese Polymere weisen die Fähigkeit auf, die unechten Farbstoffe, die aus gefärbtem Stoff ausgewaschen werden, zu komplexieren oder zu adsorbieren, bevor die Farbstoffe die Gelegenheit haben, an andere Artikel in der Wäsche angelagert zu werden.
Besonders geeignete polymere Farbstoff-Transfer-inhibierende Mittel sind Polyamin-N-Oxidpolymere, Copolymere von N-Vinylpyrrolidon und N-Vinylimidazol, Polyvinylpyrrolidonpolymere, Polyvinyloxazoldione und Polyvinylimidazole oder Mischungen davon.
Die Zugabe von solchen Polymeren erhöht ebenfalls die Leistung der Enzyme gemäß der Erfindung.
Die Detergentzusammensetzung gemäß der Erfindung kann in flüssiger, pastöser, Gel-, Strang- oder granulärer Form vorliegen.
Nicht-staubende Granulate können hergestellt werden, z. B. wie in US 4,106,991 und 4,661,452 offenbart (beide von Novo Industri A/S) und können optional beschichtet werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren. Beispiele von wachhaltigen Beschichtungsmitteln sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglykol, PEG) mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 1000 bis 20.000; ethoxylierte Nonylphenole, die von 16 bis 50 Ethylenoxideinheiten aufweisen; ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, und in welchen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorhanden sind; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele von filmbildenden Beschichtungsmaterialien, die für die Anwendung mittels Flussbetttechniken geeignet sind, sind in GB 1483591 gegeben.
Granuläre Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in „kompakter Form" vorliegen, d.h. sie können eine relativ höhere Dichte aufweisen, als herkömmliche granuläre Detergentien, d.h. von 550 bis 950 g/l; in einem solchen Fall enthalten die granulären Detergentzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung eine geringere Menge an „anorganischem Füllsalz", im Vergleich zu herkömmlichen granulären Detergentien; typische Füllsalze sind Erdalkalimetallsalze von Sulfaten und Chloriden, typischerweise Natriumsulfat; ein „kompaktes" Detergent umfasst typischerweise nicht mehr als 10 % Füllsalz. Die flüssigen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in „konzentrierter Form" vorliegen, in einem solchen Fall enthält die flüssige Detergentzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine geringere Menge an Wasser, im Vergleich zu herkömmlichen flüssigen Detergentien. Typischerweise beträgt der Wassergehalt des konzentrierten flüssigen Detergents weniger als 30 Gew.-%, stärker bevorzugt weniger als 20 Gew.-%, am stärksten bevorzugt weniger als 10 Gew.-% der Detergentzusammensetzungen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können beispielsweise als Detergentzusammensetzungen für Hand- und Maschinenwäsche, einschließlich Waschadditivzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die für die Verwendung in der Vorbehandlung von verschmutzten Stoffen geeignet sind, Stoff-Weichmacherzusammensetzungen, die dem Spülvorgang hinzugefügt werden, und Zusammensetzungen zur Verwendung in allgemeinen Reinigungsvorgängen von harten Oberflächen und Geschirrwaschvorgängen im Haushalt, formuliert sein.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beispielhaft darzustellen, sie sind jedoch nicht notwendigerweise dazu gedacht, den Gegenstand (Schutzbereich) der Erfindung zu beschränken oder in irgendeiner anderen Weise zu definieren.
In den Detergentzusammensetzungen haben die abgekürzten Komponentenidentifikationen die folgenden Bedeutungen:

LAS:: lineares C₁₂-Natriumalkylbenzolfsulfonat ("Sodium linear C₁₂ alkyl benezene sulphonate")
TAS:: Natriumtalkalkylsulfat ("Sodium tallow alkyl sulphate")
XYAS:: C_1X-C_1Y-Natriumalkylsulfat ("Sodium C_1X-C_1Y alkyl sulfate")
SS:: sekundäres Seifentensid der Formel 2-Butyloctansäure
25EY:: ein überwiegend linearer primärer C₁₂-C₁₅-Alkohol, kondensiert mit einem Durchschnitt von Y Mol Ethylenoxid
XYEZS:: C_1X-C_1Y-Natriumalkylsulfat, kondensiert mit einem Durchschnitt von Z Mol Ethylenoxid pro Mol
Nicht-ionisch:: gemischt ethoxylierter/propoxylierter C₁₃-C₁₅-Fettalkohol mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3,8 und einem durchschnittlichen Propoxylierungsgrad von 4,5, verkauft unter dem Handelsnamen Plurafax LF404 von BASF GmbH
CFAA:: C₁₂-C₁₄-Alkyl-N-methylglucamid
TFAA:: C₁₆-C₁₈-Alkyl-N-methylglucamid
Silikat:: amorphes Natriumsilikat (SiO₂:Na₂O-Verhältnis = 2,0)
NaSKS-6:: kristallines Schichtsilikat der Formel d-Na₂Si₂O₅
Carbonat:: wasserfreies Natriumcarbonat
Phosphat:: Natriumtripolyphosphat
MA/AA:: Copolymer aus 1:4 Malein-/Acrylsäure, durchschnittliches Molekulargewicht ungefähr 80.000
Polyacrylat:: Polyacrylat-Homopolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8000, verkauft unter dem Handelsnamen PA30 von BASF GmbH
Zeolith A:: hydriertes Natriumaluminosilikat der Formel Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27 H₂O, welches eine primäre Partikelgröße in dem Bereich von 1 bis 10 Mikrometer aufweist
Citrat:: Tri-Natriumcitratdihydrat
Citric:: Zitronensäure
Perborat:: wasserfreie Natriumperboratmonohydrat-Bleiche, empirische Formel NaBO₂·H₂O₂
PB4:: wasserfreies Natriumperborattetrahydrat
Percarbonat:: wasserfreie Natriumpercarbonat-Bleiche der empirischen Formel 2Na₂CO₃·3H₂O₂
TAED:: Tetraacetylethylendiamin
CMC:: Natriumcarboxymethylcellulose
DETPMP:: Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure), vermarktet von Monsanto unter dem Handelsname Dequest 2060
PVP:: Polyvinylpyrrolidon-Polymer
EDDS:: Ethylendiamin-N,N'-Disuccinsäure, [S,S]-Isomer in der Form des Natriumsalzes
Schaumunterdrücker:: 25 % Paraffinwachs, Schmelzpunkt 50 °C, 17 % hydrophobe Kieselsäure, 58 % Paraffinöl
Granulärer Schaumunterdrücker:: 12 % Silikon/Kieselsäure, 18 % Stearylalkohol, 70 % Stärke in granulärer Form
Sulfat:: wasserfreies Natriumsulfat
HMWPEO:: Polyethylenoxid mit hohem Molekulargewicht
TAE 25:: Talkalkoholethoxylat (25)

Detergent-Beispiel I

Eine granuläre Reinigungszusammensetzung für Stoff gemäß der Erfindung kann wie folgt zubereitet werden:

Lineares C₁₂-Natriumalkylbenzolsulfonat	6,5
Natriumsulfat	15,0
Zeolith A	26,0
Natriumnitrilotriacetat	5,0
Enzym der Erfindung	0,1
PVP	0,5
TAED	3,0
Borsäure	4,0
Perborat	18,0
Phenolsulfonat	0,1
Nebenbestandteile ("Minors")	bis 100

Detergent-Beispiel II

Eine kompakte granuläre Reinigungszusammensetzung für Stoff (Dichte 800 g/l) gemäß der Erfindung kann wie folgt zubereitet werden:

45AS	8,0
25E3S	2,0
25E5	3,0
25E3	3,0
TFAA	2,5
Zeolith A	17,0
NaSKS-6	12,0
Zitronensäure	3,0
Carbonat	7,0
MA/AA	5,0
CMC	0,4
Enzym der Erfindung	0,1
TAED	6,0
Percarbonat	22,0
EDDS	0,3
Granulärer Schaumunterdrücker	3,5
Wasser/Nebenbestandteile	bis 100 %

Detergent-Beispiel III
Granuläre Reinigungszusammensetzungen für Stoff gemäß der Erfindung, welche insbesondere für das Waschen von gefärbten Stoffen verwendbar sind, wurden wie folgt zubereitet:
Detergent-Beispiel IV
Granuläre Reinigungszusammensetzungen für Stoff gemäß der Erfindung, welche die Fähigkeit bereitstellen, „während des Waschens weichzumachen" („softening through the wash"), können wie folgt zubereitet werden:
Detergent-Beispiel V
Flüssige Hochleistungs-Reinigungszusammensetzungen für Stoff gemäß der Erfindung können wie folgt zubereitet werden:
Verwendung in der Textil- und Cellulosefaser-verarbeitenden Industrie
In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff „cellulosehaltiges Material" Fasern, genähte oder nicht genähte Stoffe, einschließlich Maschenwaren, gewebte Stoffe, Baumwolldrilliche (Jeansstoffe), Fäden und Frotteestoff, hergestellt aus Baumwolle, Baumwollmischungen oder natürliche oder künstliche Cellulosematerialien (z.B. von Xylan-enthaltenden Cellulosefasern, wie von Faserholz, stammend) oder Mischungen hiervon. Beispiele von Mischungen sind Mischungen aus Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, wie Wolle, synthetische Fasern (z.B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Cellulose-enthaltenden Fasern (z.B. Rayon/Viskose, Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Celluloseacetatfasern, Lyocell).
Die Zubereitung der vorliegenden Erfindung ist in der Verarbeitungsindustrie für cellulosehaltige Fasern für die Vorbehandlung oder zum Rotten („retting") von Fasern aus Hanf, Flachs und Leinen verwendbar.
Die Verarbeitung von cellulosehaltigem Material für die Textilindustrie, wie z. B. Baumwollfasern, in ein Material, das fertig für die Bekleidungsfertigung ist, schließt mehrere Schritte ein: Spinnen der Fasern in ein Faden (Garn); Konstruktion von gewebtem oder gestricktem Stoff aus dem Faden (Garn) und nachfolgende Zubereitungs-, Färbungs- und Abschluß- (Finish-) Behandlungen. Gewebte Waren werden konstruiert, indem ein Füllfaden zwischen einer Reihe von Kettenfäden gewebt wird; wobei die Fäden von zwei unterschiedlichen Arten sein könnten. Gestrickte Waren werden konstruiert, indem ein Netzwerk von ineinandergreifenden Schlaufen von einer fortlaufenden Fadenlänge gebildet wird. Die cellulosehaltigen Fasern können ebenfalls für nicht-gewebten Stoff verwendet werden.
Das Aufbereitungsverfahren bereitet das Textil für die einwandfreie Reaktion in Färbungsbehandlungen vor. Die in die Aufarbeitung involvierten Unterschritte sind das Entschlichten (für gewebte Waren), das Spülen („scouring") und das Bleichen. In der Industrie wird ebenfallst ein Ein-Schritt-Prozess mit kombiniertem Spülen/Bleichen verwendet. Obwohl die Aufbereitungsverfahren am häufigsten auf der Stoff-Ebene angewendet werden, können Spül-, Bleich- und Färbungsbehandlungen ebenfalls auf der Faser- oder Faden-Ebene vorgenommen werden.
Die Verarbeitungsabfolge kann entweder chargenweise (diskontinuierlich) oder kontinuierlich erfolgen, indem der Stoff mit dem flüssigen Verarbeitungsstrom („liquid processing stream") in voller Breite oder in Form eines Stoffstrangs in Kontakt gebracht wird. Kontinuierliche Behandlungen erfolgen im Allgemeinen unter Verwendung eines Befeuchters, wodurch ein ungefähr gleiches Gewicht des chemischen Bades per Gewicht des Stoffes auf den Stoff appliziert wird, gefolgt von einer Verweilzeit in einer beheizten Kammer, in der die chemische Reaktion erfolgt. Ein Waschabschnitt bereitet den Stoff dann für den nächsten Verarbeitungsschritt vor. Chargenweises (diskontinuierliches) Verarbeiten erfolgt im Allgemeinen in einem Verarbeitungsbad, wodurch der Stoff mit ungefähr 8- bis 15-mal seines Gewichtes in dem chemischen Bad in Kontakt gebracht wird.
Nach einer Reaktionsdauer werden die Chemikalien abgelassen, der Stoff wird gespült und die nächste Chemikalie wird appliziert. Diskontinuierliches „pad-batch" Verarbeiten schließt einen Befeuchter ein, wodurch ein ungefähr gleiches Gewicht des chemischen Bades pro Gewicht Stoff auf den Stoff appliziert wird, gefolgt von einer Verweilzeit, welche in dem Fall von kaltem „pad-patch" ein oder mehrere Tage betragen könnte.
Gewebte Waren sind die vorherrschende Form einer Textilstoffkonstruktion. Die Webverarbeitung erfordert ein „Schlichten" des Kettfadens, um ihn vor einer Abnutzung zu schützen. Stärke, Polyvinylalkohol (PVA), Carboxymethylcellulose, Wachse und Acrylbinder sind Beispiele von typischen Schlichtungschemikalien, die aufgrund ihrer Verfügbarkeit und Kosten verwendet werden. Die Schlichte muss nach der Webverarbeitung als erster Schritt im Aufbereiten der gewebten Waren entfernt werden.
Der geschlichtete Stoff entweder in Form eines Stoffstrang oder in Form der gesamten Breite wird mit der Verarbeitungsflüssigkeit, welche Entschlichtungsmittel enthält, in Kontakt gebracht. Das Entschlichtungsmittel, welches angewendet wird, hängt von der Art der zu entfernenden Schlichte ab. Für PVA-Schlichten werden häufig heißes Wasser oder oxidative Prozesse verwendet. Das am häufigsten verwendete Schlichtungsmittel für Baumwollstoff basiert auf Stärke. Dadurch werden gewebte Baumwollstoffe am häufigsten mit einer Kombination aus heißem Wasser, dem Enzym α-Amylase, um die Stärke zu hydrolysieren, und einem Benetzungsmittel oder Tensid entschlichtet. Das cellulosehaltige Material wird mit den E ntschlichtungschemikalien für eine „Haltedauer" stehengelassen, die ausreichend lang ist, um die Entschlichtung fertigzustellen. Die Haltedauer ist abhängig von der Art des Verarbeitungsfolge und der Temperatur und kann von 15 Minuten bis 2 Stunden, oder in einigen Fällen, mehreren Tagen, variieren. Typischerweise werden die Entschlichtungschemikalien in einem Befeuchtungsbad appliziert, welches im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 15 °C bis ungefähr 55 °C liegt. Der Stoff wird dann in einer Apparatur gehalten, wie einer „J-box", welche eine ausreichende Hitze bereitstellt, üblicherweise zwischen ungefähr 55 °C und ungefähr 100 °C, um die Aktivität der Entschlichtungsmittel zu verstärken. Die Chemikalien, einschließlich der entfernten Schlichtungsmittel, werden aus dem Stoff ausgewaschen, nach der Beendigung der Haltedauer. Um einen hohen Weißheitsgrad oder eine gute Benetzbarkeit und resultierende Färbungsfähigkeit zu gewährleisten, müssen die Schlichtungschemikalien und andere applizierte Chemikalien gründlich entfernt werden. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass eine effiziente Entschlichtung von äußerster Wichtigkeit für die nachfolgenden Aufbereitungsverfahren: Spülen und Bleichen, ist.
Der Spülprozess entfernt viele der nicht-cellulosehaltigen Verbindungen, die natürlich in Baumwolle vorkommen. Zusätzlich zu den natürlichen, nicht-cellulosehaltigen Verunreinigungen kann das Spülen Schmutz, Verschmutzung und restliche, bei der Fertigung eingeführte Materialien entfernen, wie Gleitmittel für das Spinnen, Spulen oder Schlichten. Bei dem Spülprozess werden Natriumhydroxid oder verwandte Ätzmittel, wie Natriumcarbonat, Kaliumhydroxid oder Mischungen davon, angewendet. Im Allgemeinen wird ein alkalisch stabiles Tensid zu dem Prozess hinzugefügt, um das Löslichmachen von hydrophoben Verbindungen zu verstärken und/oder ihre Wiederablagerung zurück auf den Stoff zu verhindern. Die Behandlung wird im Allgemeinen bei einer hohen Temperatur, 80 °C bis 100 °C, unter Anwenden von stark alkalischen Lösungen, pH 13 bis 14, des Spülmittels vorgenommen. Aufgrund der nicht-spezifischen Natur von chemischen Prozessen werden nicht nur die Verunreinigungen, sondern die Cellulose selbst angegriffen, was zu Beschädigungen in der Stärke oder anderen wünschenswerten Stoffeigenschaften führt. Die Weichheit des cellulosehaltigen Stoffs ist eine Funktion der restlichen natürlichen Baumwollwachse. Die nicht-spezifische Natur des stark alkalischen Spülprozesses bei hoher Temperatur kann nicht zwischen den wünschenswerten natürlichen Baumwollschmiermitteln und den während der Fertigung eingeführten Schmiermitteln unterscheiden. Weiterhin kann der herkömmliche Spülprozess Umweltprobleme verursachen, aufgrund des stark alkalischen Abwassers, das aus diesen Prozessen resultiert. Die Spülstufe bereitet den Stoff für eine optimale Reaktion beim Bleichen auf. Ein inadequat gespülter Stoff benötigt einen höheren Level an Bleichchemikalie in den nachfolgenden Bleichstufen.
Der Bleichschritt entfärbt die natürlichen Baumwollpigmente und entfernt jegliche restlichen natürlichen holzartigen Baumwollabfallkomponenten, die während des Baumwollentkörnens, Kardierens oder Spülens nicht vollständig entfernt worden sind. Der heutzutage hauptsächlich verwendete Prozess ist eine alkalische Wasserstoffperoxidbleiche. In vielen Fällen, besonders wenn eine sehr hohe Weißheit nicht benötigt wird, kann das Bleichen mit dem Spülen kombiniert werden.
Es wird in Erwägung gezogen, dass der Spülschritt unter Verwenden der Xyloglucanase oder der Xyloglucanase-Zubereitung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einigen anderen Enzymaktivitäten bei einer Temperatur von ungefähr 50 °C bis 80 °C und einem pH von ungefähr 7 bis 11 vorgenommen werden kann, und dadurch die hochätzenden Mittel ersetzt oder ergänzt.
MATERIALIEN UND METHODEN
Stämme:

Bacillus licheniformis, ATCC 14580, bzw. Bacillus agaradhaerens, NCIMB 40482 umfasst eine DNA-Sequenz der Erfindung, die eine Xyloglucanase kodiert.

Andere Stämme:
E. coli Stamm: Zellen von E. coli SJ2 (Diderichsen et al., 1990) wurden für eine Transformation zubereitet und durch Elektroporation transformiert unter Verwenden eines Gene Pulser^TM-Elektroporators von BIO-RAD, wie von dem Anbieter beschrieben.
B. subtilis PL1885. (Diderichsen et al., (1990)).
B. subtilis PL2306. Dieser Stamm ist der B. subtilis DN1885 mit zerstörten apr- und npr-Genen (Diderichsen et al. (1990)), bei dem die Transkriptionseinheit des bekannten Cellulasegens von Bacillus subtilis zerstört wurde, was in Cellulase-negativen Zellen resultiert.
B. subtilis PL2316. Dieser Stamm ist der B. subtilis DN1885 mit zerstörten apr- und npr-Genen (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990), Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315–4321), bei welchem die Transkriptionseinheit des bekannten Xylanasegens von Bacillus subtilis zerstört wurde, was in Xylanase-negativen Zellen resultiert. Die Zerstörungen wurden im Wesentlichen durchgeführt, wie in A. L. Sonenshein et al. (1993) beschrieben.
Kompetente Zellen wurden zubereitet und transformiert, wie von Yasbin et al. (1975) beschrieben.
Plasmide:

pSJ1678 (siehe WO 94/19454).

pMOL944. Dieses Plasmid ist ein pUB110 -Derivat, welches im Wesentlichen die Elemente, die das Plasmid in Bacillus subtilis vermehrungsfähig machen, und ein Kanamycin-Resistenzgen enthält, und welches einen starken Promotor und ein Signalpeptid, kloniert von dem amyL-Gen von B. licheniformis ATCC 14580, aufweist. Das Signalpeptid enthält eine SacII-Stelle, wodurch es geeignet ist, die DNA zu klonieren, die den reifen Teil eines Proteins in Fusion mit dem Signalpeptid kodiert. Dieses resultiert in der Expression eines Prä-Proteins, welches in Richtung auf das Zelläußere geleitet wird.
Das Plasmid wurde mittels gewöhnlicher Gentechnik konstruiert und wird kurz im Folgenden beschrieben.
Konstruktion von pMOL944:
Das Plasmid pUB 110 (McKenzie, T. et al., 1986) wurde verdaut mit dem einzigen Restriktionsenzym NciI. Ein PCR-Fragment, das von dem amyL-Promotor amplifiziert wurde, der auf dem Plasmid pDN1981 kodiert wird (Jørgensen et al., 1990), wurde mit NciI verdaut und in das NciI-verdaute pUB 110 eingefügt, um das Plasmid pSJ2624 zu ergeben.
Die zwei PCR-Primer, die verwendet wurden, weisen die folgenden Sequenzen auf:
# LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
# LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAA TGAGGCAGCAAGAAGAT-3'.
Der Primer #LWN5494 fügt eine NotI-Stelle in das Plasmid ein.
Das Plasmid pSJ2624 wurde dann mit SacI und NotI verdaut und ein neues PCR-Fragment, welches von dem amyL-Promotor, der auf pdN1981 kodiert ist, amplifiziert wurde, wurde mit SacI und NotI verdaut, und dieses DNA-Fragment wurde in das SacI-NotI-verdaute pSJ2624 eingefügt, um das Plasmid pSJ2670 zu ergeben.
Dieses Klonieren ersetzt den ersten amyL-Promotor, durch den gleichen Promotor, jedoch in entgegengesetzter Richtung. Die zwei Primer, die für die PCR-Amplifizierung verwendet wurden, weisen die folgenden Sequenzen auf:
#LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGCCGCTGATGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATG AGGCAGCAAGAAGAT-3'
#LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCTAATTGGTFACTGTATCTCAGC-3'
Das Plasmid pSJ2670 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und BclI verdaut und ein PCR-Fragment, welches von einer klonierten DNA-Sequenz amplifiziert wurde, die die alkalische Amylase SP722 (Internationale Patentanmeldung, veröffentlicht als WO 95/26397, welche hierdurch durch Bezugnahme eingeschlossen wird) kodiert, wurde mit PstI und BclI verdaut und eingefügt, um das Plasmid pMOL944 zu ergeben. Die zwei Primer, die für die PCR-Amplifizierung verwendet wurden, weisen die folgende Sequenz auf:
#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3'
#LWN7901 5'-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3.
Der Primer #LWN7901 fügt eine SacII-Stelle in das Plasmid ein.
Medien:

TY (wie beschrieben in Ausubel, F. M. et al., 1995).
LB-Agar (wie beschrieben in Ausubel, F. M. et al., 1995).
LBPG ist LB-Agar, ergänzt mit 0,5 % Glucose und 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7,0.
AZCL-Xyloglucan wird zu LBPG-Agar zu 0,5 % hinzugefügt. AZCL-Xyloglucan ist von Megazyme, Australien.
BPX-Medium, wird beschrieben in EP 0 506 780 (WO 91/09129).
Medium A: Pro Kolben: 30 g Weizenkleie, 45 ml der folgenden Lösung: 10 g Rofec (Roquette 101-0441), 10 g NH₄NO₃ (Merck 1187), 10 g KH₂PO₄ (Merck 4873), 40 g Solcafloc (Dicacel, erhältlich von Dicalite-Europe-Nord, 9000 Gent, Belgien), 0,75 g MgSO₄·7H₂O (Merck 5886), 15 g CaCO₃, Leitungswasser (zum Auffüllen) auf 1000 ml, pH, eingestellt auf 6,5. Autoklaviert für 40 Minuten bei 121 °C.
Medium B: 30 g Sojabohnenmehl, 15 g Maltodex 01 (Roquette 101-7845), 5 g Pepton (Difco 0118), 0,2 ml Pluronic (PE-6100, 101-3068), deionisiertes Wasser (zum Auffüllen) auf 1000 ml. 100 ml in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Bafflen. Autoklaviert bei 121 °C für 40 Minuten.
Medium C: 15 g Weizenkleie, 5 g Dextrose, 6,7 g Bacto-Hefe Stickstoffbase („Bacto Yeast Nitrogen Base"), deionisiertes Wasser (zum Auffüllen) auf 1000 ml. 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Bafflen. Autoklaviert bei 121 °C für 40 Minuten.
Medium D: 20 % Saccharose, 5 % Sojaflocken und 1 % Natriumphosphat.
Medium E: 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton, 3 g (NH₄)₂SO₄, 3 g K₂HPO₄, 2 g KH₂PO₄, 1 g CMC, 10 g Maltodextrin, 30 g Weizenkleie, deionisiertes Wasser (zum Auffüllen) auf 1000 ml, pH, eingestellt auf 7,0. 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Bafflen. Autoklaviert bei 121 °C für 40 Minuten.

Fermentationsvorgehensweise:
Die Pilzstämme wurden in Schüttelflaschen unter den folgenden Wachstumsbedingungen wachsen gelassen:

Medien: A, B oder C (siehe Liste der Medien)

Temperatur: 26 °C

UPM: A, stationär B und C, 125–200

Inkubationszeit: A, 6–30 Tage B und C, 2–21 Tage
Die Bakterien wurden in Schüttelflaschen, die Medium D oder E enthielten, bei 30 °C unter Schütteln bei 250 upm für 3 bis 4 Tage wachsen gelassen.
Xyloglucanase-Test (XGU):
Die Xyloglucanaseaktivität wird unter Verwenden von AZCL-Xyloglucan von Megazym, Australien, als Substrat gemessen.
Eine Lösung aus 0,2 % des blauen Substrats wird in einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, unter Rühren suspendiert. Die Lösung wird unter Rühren auf 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen verteilt (0,75 ml in jedes), 50 μl Enzymlösung wird hinzugefügt und sie werden in einem Eppendorf-Thermomixer, Modell 5436 für 20 Minuten bei 40 °C unter Mischen bei 1200 upm inkubiert. Nach der Inkubation wird die gefärbte Lösung von der Flüssigkeit separiert, indem 4 Minuten bei 14.000 upm zentrifugiert wird, und die Absorbanz des Überstandes wird bei 600 nm gemessen.
Eine XGU-Einheit wird definiert als die Menge an Enzym, welche eine Absorbanz von 0,24 in einer 1 cm Küvette bei 600 nm ergibt.
Isoelektrische Fokussierung:
Die isoelektrische Fokussierung wurde in vorgefertigten Ampholin-PAG-Platten, pH 3,5 bis 9,5 (Pharmacia, Schweden) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden zweifach (doppelt) angesetzt und nach der Elektrophorese wurde das Gel in zwei (Teile) geteilt. Eine Überschichtung, die 1 % Agarose und 0,4 % AZCL-Xyloglucan in Wasser enthielt, wurde auf eine Hälfte des Gels gegossen, eine ähnliche Überschichtung, die AZCL-HE-Cellulose enthielt, wurde auf die andere Hälfte gegossen. Eine Inkubation erfolgte bei 30 °C für 2 bis 16 Stunden. Die Enzymaktivität wurde anhand der blauen Gebiete identifiziert.
Allgemeine molekularbiologische Verfahren:
DNA-Manipulationen und -Transformationen wurden unter Verwenden von Standardverfahren der Molekularbiologie ausgeführt (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Enzyme für DNA-Manipulationen wurden gemäß den Beschreibungen der Anbieter verwendet.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
BEISPIEL 1
Screening nach Mikroorganismen, die alkalische Xyloglucanase produzieren
Die zu screenenden Mikroorganismen wurden in einer Flüssigkultur wachsen gelassen, wie in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Nach einer Zentrifugation wurden die Kulturüberstände auf Xyloglucanase- und Cellulaseaktivität hin untersucht. Die folgenden Tests wurden verwendet: Agaroseplatten, die 1 % Agarose in 0,08 M Britton-Robinson Puffer, pH 7 oder pH 9, und 0,2 % AZCL-Xyloglucan bzw. 0,2 % AZCL-HE-Cellulose enthielten, 10 ml Proben wurden in Löcher mit d = 4 mm in den Agaroseplatten eingebracht, eine Inkubation erfolgte bei 30 °C für 2 bis 16 Stunden. Die Enzymaktivität wurde anhand der blauen Halos identifiziert.
Kulturbrühen mit guter Aktivität gegenüber AZCL-Xyloglucan und keiner oder geringer Aktivität gegenüber AZCL-HE-Cellulose wurden weiter durch isoelektrische Fokussierung (IEF) untersucht, wie in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben. Für die in dem Abschnitt Materialien und Methoden aufgelisteten Mikroorganismen wurde herausgefunden, dass sie ein Enzym mit einer Aktivität gegenüber AZCL-Xyloglucan produzieren, welches durch IEF separierbar war von der Aktivität gegenüber AZCL-HE-Cellulose. Wenn nach Xyloglucanaseaktivität gescreent wurde, wurde ebenfalls Cellulaseaktivität gefunden und es wurde bestimmt, ob beide Aktivitäten von dem gleichen Enzym stammen. Dieses wurde durch eine Separation der Enzyme durch IEF isoelektrische Fokussierung ausgeführt, welche das Protein gemäß der Ladung oder dem pI separiert. Nach dieser Separation wurden die verschiedenen enzymatischen Aktivitäten erneut identifiziert unter Verwenden von Überschichtungstechniken („overlayer techniques"). Die Probe wurde in zwei parallelen Vertiefungen (Wells) laufen gelassen: eine gefärbt für Xyloglucanase und die andere für AZCL-HE-Cellulose. Wenn dieselbe Bahn beide Aktivitäten aufweist, ist es eine Cellulase, wenn lediglich eine Bahn Xyloglucanase- und keine Cellulaseaktivität aufweist, ist es eine Xyloglucanase, welche durch Aufreinigung oder durch Klonierung weiter charakterisiert werden kann.
BEISPIEL 2
Produktion einer Xyloglucanase (XG) von Bacillus licheniformis
Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zum Herstellen einer Xyloglucanase von Bacillus licheniformis dar.
Bacillus licheniformis, ATCC 14580, wurde in Schüttelflaschen unter Verwenden des Substrats PS 1 (20 % Saccharose und 5 % Sojaflocken und 1 % Natriumphosphat) bei 30 °C unter Schütteln bei 250 upm für 4 Tage wachsen gelassen. Die Kulturbrühe (insgesamt 101) wurde mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt, gefolgt von einer Behandlung mit 50 ml eines kationischen Flockungsmittels unter Rühren bei Raumtemperature und nachfolgend 450 ml einer 0,1 %-Lösung eines anionischen Flockungsmittels. Das ausgeflockte Material wurde durch Zentrifugation unter Verwenden einer Sorval RC 3B 10.000 upm für 30 Minuten separiert. Der Überstand wurde unter Verwenden eines Whatman-Glasfilters, Nummer F geklärt. Ein Gesamtvolumen von 9 Liter wurde erhalten, mit einer Aktivität von 10 XGU pro ml.
Die Flüssigkeit wurde auf 1,5 l konzentriert über einen Filter („filtron") mit einem Rückhaltevermögen bei 10 kDa.
Bacitracin, quervernetzt mit Sepharose, wurde für eine Affinitätssäulenchromatographie zum Entfernen der Proteasen verwendet. Dann wurde das nicht-gebundene Material auf pH 5,0 unter Verwenden von Essigsäure eingestellt und auf eine SP-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit 20 mM Natriumacetatpuffer auf pH 5,0 eingestellt wurde. Die XG-Aktivität wurde von der Säule unter Verwenden eines 0,5 M NaCl-Gradienten eluiert. Die Fraktionen, die XG-Aktivität enthielten, wurden gesammelt und mit einer GR 81 Polysulfonmembran mit einem Rückhaltevermögen von 8 kDa in einer Amicon-Zelle konzentriert.
Die konzentrierte Lösung, die 363 XGU pro ml enthielt, wurde für eine Größenchromatographie auf eine hierfür verwendete Superdex 200 Säule aufgetragen, die mit einem Puffer von 0,1 M Natriumacetat auf pH 6,0 equilibriert wurde. Das reine XG 1 wurde mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 26 kDa eluiert und ergab im SDS-PAGE eine Einzelbande von 26 kDa. Die spezifische Aktivität wurde auf 221 XGU pro A.280 bestimmt.
BEISPIEL 3
Charakterisierung einer Xyloglucanase von Bacillus licheniformis
Die Aminosäuresequenz des, wie in Beispiel 2 beschriebenen, produzierten Enzyms wurde nach SDS-PAGE und Elektroblotting des Proteins mit 26 kDa erhalten. Die Aminosäuresequenz ist in der angefügten SEQ ID NR: 2 aufgelistet.
Diese Aminosäuresequenz zeigt höchste Homologie mit Glycosylhydrolasen der Familie 12, die zurzeit als Endo-beta-1,4-glucanasen (EC 3.2.1.4) klassifiziert sind: 65 % Homologie mit der Familie 12 Erwinia carotovora β-1,4-Glucanglucanohydrolase (celS – P16630 Swissprot).
Demgemäß betrifft die vorliegenden Erfindung weiterhin ein Enzym, welches die in SEQ ID NR: 2 aufgelistete Aminosäuresequenz aufweist oder eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 75 %, stärker bevorzugt mindestens 80 %, stärker bevorzugt mindestens 85 %, noch stärker bevorzugt mindestens 90 %, besonders mindestens 95 % homolog hierzu ist.
Das erhaltene Xyloglucanaseenzym von Bacillus licheniformis wurde unter Verwenden von Megazyme AZCL-Xyloglucan für eine Xyloglucanase-Aktivitätsbestimmung und ACZL-HE-Cellulose für eine Endoglucanase-Aktivitätsbestimmung analysiert. Die relative Freisetzung an blauer Farbe war 40-mal höher gegenüber dem Xyloglucansubstrat im Vergleich zu der HE-Cellulose, unter Verwenden der gleichen Menge an aufgereinigtem Enzym.
Das gleiche Resultat wurde für das saure Xyloglucanaseenzym (EG II) von Aspergillus aculeatus, beschrieben in der Patentanmeldung WO 94/14953, gefunden, welches ebenfalls 2 % relative Aktivität gegenüber HE-Cellulose zeigte.
Temperaturoptimum
Das AZCL-Xyloglucan von Megazyme wurde ebenfalls verwendet zur Bestimmung des Temperaturoptimums. Die Aktivität wurde bei verschiedenen Temperaturen nach einer Inkubation mit der Xyloglucanase aus Beispiel 2 für 20 Minuten gemessen und die Freisetzung an blauer Farbe wurde bei 600 nm bestimmt. Der Hauptteil der Farbe wurde bei 60 °C freigesetzt, jedoch wurde noch 50 % relative Aktivität bei 70 °C erhalten.
pH-Aktivitätsprofil
Zum Erhalten eines realistischen pH-Aktivitätsprofils wurden die Aktivitätsbestimmungen unter Verwenden von Puffern durchgeführt, die einen pKa-Wert innerhalb von 1,0 des aktuellen pHs aufweisen. Die folgenden Puffersysteme wurden verwendet: pH 4–5,5 Natriumacetat, pH 6 Mes-Puffer (Sigma), pH 6,5–7,5 Mops-Puffer (Sigma), pH 8–8,5 Barbiturate, pH 9–10,5 Glycin.
Der pH wurde nach Inkubation in einem parallel gehandhabten Röhrchen gemessen. Die Inkubation erfolgte 20 Minuten bei 40 °C. Die Endkonzentration des Substrats betrug 1,33 Gramm Xyloglucan pro L. Dies ist der K_M (siehe nachfolgend für steady state (stationäres Gleichgewicht) bei pH 7,5). Die Aktivität wurde nach dem Messen der Bildung von reduzierenden Enden bestimmt, wie für die steady state Kinetik beschrieben.
BEISPIEL 4
Vergleichsbeispiel: Steady state-Kinetiken gegenüber löslichem Xyloglucan und CMC
Ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität gegenüber Xyloglucan ist entwickelt worden.
Das Substrat ist Xyloglucan (Amyloid) aus Tamarindensamen (das Substrat ist kommerziell erhältlich von Megazyme). Der Puffer ist 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5.
Das Sustrat wird als Stammlösung zubereitet, enthaltend 5 g pro L in Puffer. Nach dem Mischen wird sie unter Verwenden eines magnetischen Rührers erhitzt, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die Lösung wird dann auf 40 °C abgekühlt und in einem Temperatur-kontrollierten Wasserbad bei 40 °C gehalten.
Die verdünnte Enzymlösung von 0,5 ml wird für 10 Minuten vorerhitzt und mit 1,0 ml Substrat gemischt und für 20 Minuten inkubiert.
Die Bildung von reduzierenden Zuckern wird durch Verwenden von p-Hydroxybenzoesäurehydrazid (PHBAH), modifiziert von Lever (1972), unter Verwenden von 5 Gramm Kaliumnatriumtartrat zusätzlich zu 1,5 Gramm PHBAH, bestimmt. Glucose wird als Referenz für die Bestimmung der reduzierenden Gruppen verwendet.
Die offensichtlichen katalytischen Eigenschaften von 2 bekannten Cellulasen (Endo-beta-1,4-glucanasen) gegenüber Xyloglucan aus Tamarindensamen wurden gemessen:

a. EG I von Humicola insolens (klassifiziert, als der Familie 7 der Glycosylhydrolasen angehörend), offenbart in WO 95/24471.
b. EG III von Trichoderma (klassifiziert, zu der Familie 12 der Glycosylhydrolasen angehörend), offenbart in dem US-Patent US 5,475,101 .

Alle Enzyme wurden bis zu hoher Homogenität aufgereinigt, was eine Einzelbande im SDS-PAGE ergab, und der molare Extinktionskoeffizient wurde für die Berechnung der Enzymkonzentration verwendet. Die Bestimmung basierte auf verschiedenen Konzentrationen des Substrats von 0,25 bis 3,3 Gramm pro Liter. Die Kinetikbestimmung erfolgte gemäß des Computerprogramms Grafit und unter Übernehmen der Michelis-Menten-Kinetik.
Ergebnisse
Enzym der Erfindung: Die Xyloglucanase 1 von Bacillus licheniformis mit einem Molekulargewicht (MW) von 26 kDa. Basierend auf einer molaren Absorbanz von 78.000, bestimmt durch Aminosäureanalyse, betrug der k_cat 16,5 pro Sekunde (Std. Fehler 0,6) gegenüber Xyloglucan bei pH 7,5, K_m 1,1 g/l (Std. Fehler 0,1). Unter Verwenden von CMC als Substrat war es unmöglich, den k_cat zu messen, er lag jedoch unterhalb von 3 pro Sekunde. Das Verhältnis von maximaler Xyloglucanaseaktivität zu maximaler Aktivität gegenüber CMC beträgt mindestens 5:1.

a. Vergleich EG I, alkalische Cellulase von Humicola insolens, MW 50 kDa, molarer Extinktionskoeffizient von 66310. Ein k_cat von 19 pro Sekunde (Std. Fehler 0,7) gegenüber Xyloglucan bei pH 7,5, K_m 0,7 g/l (Std. Fehler 0,08). Gegenüber CMC beträgt der k_cat 86 pro Sekunde (Std. Fehler 5). Das Verhältnis von maximaler Xyloglucanaseaktivität zu maximaler Aktivität gegenüber CMC beträgt 2:9.
b. Vergleich EG III, saure Cellulase von Trichoderma, MW 24 kDa, molarer Extinktionskoeffizient von 71930. Ein k_cat von 16 pro Sekunde (Std. Fehler 1,7) gegenüber Xyloglucan bei pH 7,5, K_m 0,5 g/l (Std. Fehler 0,15). Gegenüber CMC beträgt der k_cat 18 pro Sekunde (Std. Fehler 0,6). Das Verhältnis von maximaler Xyloglucanaseaktivität zu maximaler Aktivität gegenüber CMC beträgt 8:9.

BEISPIEL 5
Klonieren und Expression des Xyloglucanasegens von Bacillus licheniformis
Präparation genomischer DNA:
Der Stamm Bacillus licheniformis, ATCC 14580, wurde in flüssigem TY-Medium vermehrt. Nach 16 Stunden Inkubation bei 30 °C und 300 upm wurden die Zellen geerntet und die genomische DNA anhand des von Pitcher et al., (1989) beschriebenen Verfahrens isoliert.
Konstruktion einer genomischen Bibliothek:
Die genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise verdaut und größenfraktioniert durch Elektrophorese über ein 0,7 % Agarosegel. Fragmente zwischen 2 und 10 kB Größe wurden durch Elektrophorese auf DEAE-Cellulosepapier isoliert (Dretzen et al., (1981)).
Isolierte DNA-Fragmente wurden mit pSJ1678 Plasmid-DNA, die mit BamHI verdaut wurde, ligiert, und die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli SJ2 zu transformieren.
Identifikation von positiven Klonen:
Eine DNA-Bibliothek in E. coli, konstruiert wie oben beschrieben, wurde auf LB-Agarplatten, die 0,5 % AZCL-Xyloglucan (Megazyme) und 9 μg/ml Chloramphenicol enthielten, und über Nacht bei 37 °C inkubiert wurden, gescreent. Klone, die eine hydrolysierende Aktivität exprimierten, erschienen durch blaue Diffusionshalos. Positive Klone wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 0,5 % AZCL-Xyloglucan (Megazyme) enthielten. Die Plasmide dieser Klone wurden durch Qiagen-Plasmid-Spin-Preps auf 1 ml über Nacht-Kulturbrühe isoliert (die Zellen wurden bei 37 °C in TY mit 9 μg/ml Chloramphenicol und unter Schütteln bei 200 upm inkubiert). Einer dieser Klone (PL2949) wurde durch DNA-Sequenzierung des klonierten Sau3A-DNA-Fragments weiter charakterisiert.
Die DNA wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwenden des „Taq deoxy terminal cycle" Sequenzierungskits (Perkin-Elmer, USA), fluoreszent markierten Terminatoren und geeigneten Oligonukleotiden als Primer charakterisiert.
Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. (1984) ausgeführt. Die Sequenz, welche das reife Protein kodiert, ist in SEQ ID NR: 1 gezeigt (Signal plus reifer Teil; der reife Teil entspricht den Positionen 88 bis 783. Die abgeleitete Proteinsequenz ist in SEQ ID NR: 2 gezeigt, wobei das reife Protein den Positionen 30 bis 261 der SEQ ID NR: 2 entspricht.
Subklonieren und Expression des Xyloglucanasegens von B. licheniformis in B subtilis:
Die Xyloglucanase-kodierende DNA-Sequenz der Erfindung wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden des PCR-Primer-Satzes, der aus diesen zwei Oligonukleotiden besteht:
Xyloglu.upper.PstI

5'-GCCTCATTCTGCAGCAGCGGCGGCTTCGTCATCAAACCCGTCGG-3'

Xyloglu.lower.NotI

5'-GCTGCATCGGCATCGCGGCCGCGGCAATACGTAAGGATGGTATCG-3'

Die Restriktionsstellen PstI und NotII sind unterstrichen.
Chromosomale DNA, isoliert von B. licheniformis, wie oben beschrieben, wurde als Template in einer PCR-Reaktion unter Verwenden der Amplitaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (Gew./Vol.) (w/v) Gelatine) enthaltend 200 μM von jedem dNTP, 2,5 Einheiten AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) und 100 pmol von jedem Primer, vorgenommen.
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwenden eines DNA Thermal Cyclers (Landgraf, Deutschland) ausgeführt. Auf eine Inkubation bei 94 °C für 1 Minute folgten 30 PCR-Zyklen, die ausgeführt wurden, unter Verwenden eines Zyklusprofils der Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 60 °C für 1 Minute und Extension bei 72 °C für 2 Minuten. 5 μl Aliquots des Amplifizierungsproduktes wurden mittels Elektrophorese in 0,7 % Agarosegelen (NuSieve, FMC) analysiert. Das Erscheinen eines DNA-Fragments mit der Größe von ungefähr 0,8 kB zeigte eine exakte Amplifizierung des Gensegments an.
Subklonieren des PCR-Fragments.
45 μl Aliquots des wie oben beschrieben erzeugten PCR-Produktes wurden unter Verwenden des QIAquick PCR-Aufreinigungskits (Qiagen, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA wurde in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. 5 μg pMOL944 und 25 μl des aufgereinigten PCR-Fragments wurden mit PstI und NotI verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt (elektrophorisiert) in 0,8 % Agarosegelen mit niedriger Gelierungstemperatur (SeaPlaque GTG, FMC), die relevanten Fragmente wurden aus den Gelen ausgeschnitten und unter Verwenden des QIAquick Gelextraktions-Kits (Qiagen, USA), gemäß den Instruktionen des Herstellers aufgereinigt. Das isolierte PCR-DNA-Fragment wurde dann mit dem PstI-NotI-verdauten und aufgereinigten pMOL944 ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 16 °C unter Verwenden von 0,5 μg von jedem DNA-Fragment, 1 U T4-DNA-Ligase und T4-Ligasepuffer (Boehringer Mannheim, Deutschland) ausgeführt.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetentes B. subtilis PL2316 zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf LBPG – 10 μg/ml Kanamycin – Agarplatten ausplattiert. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C waren Kolonien auf den Platten zu sehen. Mehrere Klone wurden analysiert, indem Plasmid-DNA aus der über Nacht-Kulturbrühe isoliert wurde.
Ein solcher positiver Klon wurde mehrere Male auf Agarplatten, wie oben verwendet, wieder ausgestrichen, dieser Klon wurde PL2954 genannt. Der Klon PL2954 wurde über Nacht in TY – 10 μg/ml Kanamycin bei 37 °C wachsen gelassen und am nächsten Tag wurde 1 ml Zellen verwendet, um das Plasmid aus den Zellen unter Verwenden des Qiarep Spin Pasmid Minprep-Kits #27106, gemäß den Anweisungen des Herstellers für Plasmidpräparationen bei B. subtilis, zu isolieren. Diese DNA wurde DNA-sequenziert und bestätigte die DNA-Sequenz, die dem reifen Teil der Xyloglucanase aus der SEQ ID NR: 1, welcher in den Positionen 88 bis 783 gezeigt ist, entspricht.
Expression und Aufreinigung der Xyloglucanase von B. licheniformis:
PL2954 wurde in 25 × 200 ml BPX-Medium mit 10 μg/ml Kanamycin in 500 ml Schüttelflaschen mit zwei Bafflen für 5 Tage bei 37 °C bei 300 upm wachsen gelassen.
BEISPIEL 6
Klonieren und Expression des Xyloglucanasegens von Bacillus agaradhaerens
Zubereitung genomischer DNA:
Der Stamm Bacillus agaradhaerens, NCIMB 40482, wurde in flüssigem Medium vermehrt, wie in WO 94/01532 beschrieben. Nach 16 Stunden Inkubation bei 30 °C und 300 upm, wurden die Zellen geerntet und die genomische DNA anhand des von Pitcher et al. (1989) beschriebenen Verfahrens isoliert.
Konstruktion einer genomischen Bibliothek:
Genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise verdaut und durch Elektrophorese über ein 0,7 % Agarosegel größenfraktioniert. Fragmente zwischen 2 und 7 kB Größe wurden durch Elektrophorese auf DEAE-Cellulosepapier isoliert (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295–298).
Isolierte DNA-Fragmente wurde mit pSJ1678 Plasmid-DNA, die mit BamHI verdaut wurde, ligiert und die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli SJ2 zu transformieren.
Die Zellen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 0,1 % CMC (Natriumcarboxymethylcellulose, Aqualon, Frankreich) und 9 μg/ml Chloramphenicol enthielten und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Identifikation von positiven Klonen:
Eine DNA-Bibliothek in E. coli, konstruiert wie oben beschrieben, wurde auf LB-Agarplatten, die 0,1 % CMC (Natriumcarboxymethylcellulose, Aqualon, Frankreich) und 9 μg/ml Chloramphenicol enthielten und über Nacht bei 37 °C inkubiert wurden, gescreent. Die Transformanden wurden nachfolgend auf der gleichen Art von Platten Replika-plattiert und diese neuen Platten wurden 8 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Die Originalplatten wurden unter Verwenden von 1 mg/ml Congo Red (Sigma, USA) gefärbt. Die Färbung wurde für eine halbe Stunde bei moderatem orbitalem Schütteln fortgesetzt, wonach die Platten zweimal 15 Minuten unter Verwenden von 1 M NaCl gewaschen wurden.
Es erschienen gelbliche Halos an Positionen, an denen Cellulase-positive Klone vorhanden waren, diese Cellulase-positiven Klone wurden von den Replika-Platten gerettet und auf LB-Agarplatten, die 0,1 % CMC und 9 μg/ml Chloramphenicol enthielten, wieder ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Ein solcher Klon (MB110) wurde mittels DNA-Sequenzieren des klonierten Sau3A-DNA-Fragments weiter charakterisiert.
Die DNA wurde durch DNA-Sequenzieren mittels „Primerwalking", unter Verwenden des „Taq deoxy terminal Cycle" Sequenzierungskits (Perkin-Elmer, USA), fluoreszent markierten Terminatoren und geeigneten Oligonukleotiden als Primer, charakterisiert.
Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al. (1984) ausgeführt. Die Sequenz, die das reife Protein kodiert, subkloniert in dem nachfolgenden Beispiel, ist in SEQ ID NR: 3 gezeigt. Die abgeleitete Proteinsequenz ist in SEQ ID NR: 4 gezeigt.
Subklonieren und Expression der Xyloglucanase in B. subtilis:
Die Xyloglucanase-kodierende DNA-Sequenz der Erfindung wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung des PCR-Primer-Satzes, bestehend aus diesen zwei Oligonukleotiden:
Xyloglucanase.upper.SacII

5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GAA GAT GTC ACT TCG TCA CAG-3'

Xyloglucanase.lower.NotI

5'-GTT GAG AAA AGC GGC CGC CAC TTC TAA AGT TCT AAA GCA CG -3'

Die Restriktionsstellen SacII und NotI sind unterstrichen.
Chromosomale DNA, isoliert von B. agaradherans, wie oben beschrieben, wurde als Template in einer PCR-Reaktion unter Verwenden der Amplitaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) gemäß den Instruktionen des Herstellers, verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (Gew./Vol.) (w/v) Gelatine), enthaltend 200 μM von jedem dNTP, 2,5 Einheiten AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus, USA) und 100 pmol von jedem Primer, ausgeführt.
Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwenden eines DNA Thermal Cyclers (Landgraf, Deutschland) ausgeführt. Auf eine Inkubation bei 94 °C für 1 Minute folgten 30 PCR-Zyklen, die ausgeführt wurden, unter Verwenden eines Zyklusprofils der Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 60 °C für 1 Minute und Extension bei 72 °C für 2 Minuten. 5 μl Aliquots des Amplifizierungsproduktes wurden mittels Elektrophorese in 0,7 % Agarosegelen (NuSieve, FMC) analysiert. Das Erscheinen eines DNA-Fragments mit der Größe 1,6 kB zeigte eine exakte Amplifikation des Gensegments an.
Subklonieren des PCR-Fragments:
45 μl Aliquots der PCR-Produkte, wie oben beschrieben erzeugt, wurden unter Verwenden des QIAquick PCR-Aufreinigungskits (Qiagen, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA wurde in 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. 5 μg pMOL944 und 25 μl des aufgereinigten PCR-Fragments wurden mit SacII und NotI verdaut, elektrophoretisch aufgetrennt (elektrophorisiert) in 0,8 % Agarosegelen mit niedriger Gelierungstemperatur (SeaPlaque GTG, FMC), die relevanten Fragmente wurden aus den Gelen ausgeschnitten und unter Verwenden des QIAquick Gelextraktions-Kits (Qiagen, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers aufgereinigt. Das isolierte PCR-DNA-Fragment wurde dann mit dem SacII-NotI-verdauten und aufgereinigten pMOL944 ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 16 °C unter Verwenden von 0,5 μg von jedem DNA-Fragment, 1 U T4 DNA-Ligase und T4-Ligasepuffer (Boehringer Mannheim, Deutschland) ausgeführt.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetentes B. subtilis PL2306 zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf LBPG – 10 μg/ml Kanamycin – 0,1 % AZCL-Xyloglucan-Agarplatten ausplattiert. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C waren Zellen, die die klonierte Xyloglucanase positiv exprimieren, als Kolonien zu sehen, die durch blaue Halos umrundet waren. Ein solcher positiver Klon wurde mehrere Male auf Agarplatten, wie oben verwendet, wieder ausgestrichen, dieser Klon wurde MB563 genannt. Der Klon MB563 wurde über Nacht in TY – 10 μg/ml Kanamycin bei 37 °C wachsen gelassen und am nächsten Tag wurde 1 ml Zellen verwendet, um Plasmid aus den Zellen unter Verwenden des Qiaprep Spin Plasmid Miniprep-Kits #27106, gemäß den Anweisungen des Herstellers für Plasmidpräparationen von B. subtilis, zu isolieren.
Expression und Aufreinigung der Xyloglucanase von B. agaradhaerens:
MB563 wurde in 25 × 200 ml BPX-Medium mit 10 μg/ml Kanamycin in 500 ml Schüttelflaschen mit zwei Baffeln für 5 Tage bei 37 °C bei 300 upm wachsen gelassen.
BEISPIEL 7
Charakterisierung einer Xyloglucanase von Bacillus agaradhaerens
Aufreinigung und Charakterisierung:
7000 ml Schüttelflaschen-Kulturflüssigkeit von Bacillus mit dem Klon MB563, exprimiert wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde erhalten. Das Fermentationsmedium wurde auf pH 7,5 mit NaOH eingestellt und unter Verwenden des kationischen Flockungsmittels C521 (10 % Lösung) und 0,1 % Lösung des anionischen Mittels A130 ausgeflockt. Zu 7000 ml Fermentationsmedium wurden 168 ml C521 (10 %) gleichzeitig mit 335 ml A130 unter Rühren bei Raumtemperatur hinzugefügt. Das ausgeflockte Material wurde durch Zentrifugation separiert unter Verwenden einer Sorval RC 3B Zentrifuge bei 10.000 upm für 30 Minuten. Der Überstand wurde unter Verwenden eines Whatman-Glasfilters Nummer F geklärt. Insgesamt wurden 6500 ml klare Lösung, enthaltend 227.500 XGU-Einheiten.
Die klare Lösung von 2500 ml wurde auf eine 1000 ml Q-Sepharosesäule aufgetragen, die mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, equilibriert wurde. Das gebundene Enzym wurde unter Verwenden eines NaCl-Gradienten eluiert.
Das teilweise aufgereinigte Produkt wurde unter Verwenden einer Amplicon Ultrafiltrationszelle mit einer Membran mit einem Wert für das Rückhaltevermögen von 6 kDa konzentriert. Gesamt wurden 70.000 XGU-Einheiten und 2,5 Gramm Enzymprotein erhalten.
Die pure Probe ergab eine Einzelbande in SDS-PAGE mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 61 kDa. Ein molarer Extinktionskoeffizient von 123,040 wurde zur Berechnung der Enzymproteinkonzentration verwendet und basiert auf der Aminosäurezusammensetzung, die von der DNA-Sequenz abgeleitet ist.
Die konzentrierte Fraktion wurde mit 40 % Sorbitol formuliert und für Enzymversuche in Detergent- und Textilanwendungen verwendet.
Immunologische Verfahren:
Hochaufgereinigte XEG1 von Bacillus agaradhaerens, erhalten von Klon MB563, wurde zur Herstellung eines Antiserums verwendet.
Die Immunisierungsvorgehensweise wurde bei DAKO-verwendeten Kaninchen durchgeführt. Jedes Kaninchen wurde mit 100 μl Cellulase (0,4 mg Protein pro ml), gemischt mit 100 μl Adjuvans immunisiert. Jedes Kaninchen wurde 15-mal in Ein-Wochen-Intervallen immunisiert. Das Kaninchenserum wurde gesammelt und das Gammaglobulin aus dem Serum aufgereinigt.
Temperaturoptimum:
Das AZCL-Xyloglucan von Megazyme wurde ebenfalls für die Bestimmung des Temperaturoptimums verwendet. Die Aktivität wurde bei verschiedenen Temperaturen nach einer Inkubation mit der XEG1 von Bacillus agaradhaerens für 20 Minuten gemessen und die Freisetzung von blauer Farbe wurde bei 600 nm bestimmt. Der Hauptteil der Farbe wurde bei 50 °C freigesetzt, jedoch wurde noch 20 % relative Aktivität bei 60 °C erhalten.
Steady state-Kinetik gegenüber löslichem Xyloglucan und CMC:
Das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität gegenüber Xyloglucan, beschrieben in Beispiel 4, wurde auf die Xyloglucanase von B. agaradhaerens der Erfindung angewendet. Das Substrat wurde auf mindestens 8 verschiedene Konzentrationen verdünnt, wobei 4 unterhalb des offensichtlichen K_m lagen (siehe nachfolgend).
Die folgenden offensichtlichen katalytischen Eigenschaften der XEG1 (Endo-beta-1,4-xyloglucanasen) von Bacillus agaradhaerens gegenüber Xyloglucan aus Tamarindensamen wurden gefunden: Bei pH 7,5 wurde der k_cat von 183 pro Sekunde und ein offensichtlicher K_m von 0,05 Gramm pro L erhalten. Zum Vergleich wurden für die Aktivität gegenüber CMC (Substitutionsgrad 0,7 und ein Polymerisationsgrad von 200) unter Verwenden der gleichen steady state Kinetikmethode mit 8 verschiedenen Substratkonzentrationen zweifach (doppelt) unterhalb des K_m die folgenden Daten erhalten: k_cat von 64 pro Sekunde und ein K_m von 2,2 Gramm pro L, was anzeigt, dass dieses Enzym Xyloglucan gegenüber Carboxymethylcellulose bevorzugt.
Die alkalische Aktivität bei pH 10 unter Verwenden eines Glycinpuffers und Xyloglucansubstrat, resultierte in einem k_cat von 90 pro Sekunde und einem offensichtlichen K_{m von 0,08 Gramm pro
L, was anzeigt, dass diese Xyloglucanase eine} sehr hohe alkalische Aktivität aufweist.
Das pH-Aktivitätsprofil unter Verwenden von blue Megazyme AZCL-Xyloglucan zeigt an, dass das Enzym mehr als 50 % relative Aktivität in dem pH-Intervall von 5,0 bis 10,5 aufweist.
In Detergent-Matritzen unter Verwenden des blue Megazyme Substrats wurden die folgenden Daten erhalten. In dem US Tide Pulverdetergent, 1 Gramm pro L mit deutscher Wasserhärte von 9, ergab 66 % relative Aktivität zum Puffer pH 7,5 („66 % relative activity to buffer pH 7.5"). Unter Verwenden europäischer Bedingungen und dem Pulver Ariel in 5 Gramm pro L und deutschem Wasserhärtegrad von 18, wurde die relative Aktivität von 86 % erhalten. Diese Daten zeigen an, dass die XEG1 von Bacillus agaradhaerens gut geeignet ist, um in Detergent-Matritzen verwendet zu werden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das in der Lage ist, beta-1,4-glykosidische Bindungen in dem Grundgerüst von Xyloglucan zu spalten, wobei das Verhältnis von k_cat gegenüber Xyloglucan aus Tamarindensamen zu k_cat gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC) oder mikrokristalliner Cellulose (Avicel) mindestens 2 : 1 beträgt, gemessen bei pH 7,5.
Xyloglucanase nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis mindestens 4 : 1, bevorzugt mindestens 5 : 1, stärker bevorzugt mindestens 8 : 1, besonders mindestens 10 : 1 beträgt.
Xyloglucanase nach Anspruch 1, welche keine Aktivität gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC) oder mikrokristalliner Cellulose (Avicel) aufweist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 1, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NR: 4 von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 537 dargestellt; und (b) Polypeptidmolekülen, die mindestens 70% identisch mit den Aminosäuren aus SEQ ID NR: 4 von Rest 1 bis Rest 537 sind.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 4, welches von Bacillus agaradhaerens, bevorzugt Bacillus agaradhaerens, NCIMB 40482, hergestellt ist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 4, welches von dem Polypeptid, umfassend die Aminosäuren aus SEQ ID NR: 4 von Rest 1 bis Rest 537, durch Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren abgeleitet ist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 1, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NR: 2 von Aminosäurerest 30 bis Aminosäurerest 261 dargestellt; und (b) Polypeptidmolekülen, die mindestens 70% identisch mit den Aminosäuren aus SEQ ID NR: 2 von Rest 30 bis Rest 261 sind.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 7, welches von Bacillus licheniformis, bevorzugt Bacillus licheniformis, ATCC 14580, hergestellt ist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 7, welches von dem Polypeptid, umfassend die Aminosäuren aus SEQ ID NR: 2 von Rest 30 bis Rest 261, durch Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren abgeleitet ist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 4 oder 7, welches immunologisch reaktiv mit einem polyklonalen Antikörper ist, der gegen das Polypeptid in aufgereinigter Form spezifisch („raised") ist.
Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 4 oder 7, welches ausgewählt ist aus der Gruppe aus Xyloglucanasen, die der Familie 5, 7 und 12 der Glycosylhydrolasen angehören.
Isoliertes Polynukleotidmolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, beta-1,4-glykosidische Bindungen in dem Grundgerüst von Xyloglucan zu spalten, und das ein Verhältnis von k_cat gegenüber Xyloglucan aus Tamarindensamen zu k_cat gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC) oder mikrokristalliner Cellulose (Avicel) von mindestens 2 : 1, gemessen bei pH 7,5, aufweist, wobei das Polypeptidmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1611 dargestellt, umfassen; (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 4 von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 537 ist; (c) degenerierten Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und (d) Polynukleotidmolekülen, die mit einer denaturierten, doppelsträngigen DNA- Sonde, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DNA-Sonden, welche die in Positionen 1 bis 1611 aus SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz umfassen, und DNA-Sonden, die eine Untersequenz der Positionen 1 bis 1611 aus SEQ ID NO: 3 umfassen, die eine Länge von mindestens ungefähr 100 Basenpaaren besitzen, unter folgenden Bedingungen hybridisieren: Vortränken des Filters, der die zu hybridisierende(n) DNA Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Sodium chlorid/Sodium citrate; Natriumchlorid/Natriumcitrat) für 10 Minuten, Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte, beschallte Lachssperma-DNA, gefolgt von der Hybridisierung in dergleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer Zufalls-geprimten („random-primed"), 32P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität höher als 1 × 109 cpm/μg) Sonde enthält, für 12 Stunden bei ungefähr 45 °C; und dann zweimaliges Waschen des Filters für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 60 °C.
Isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 12, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden, funktionsfähig verknüpften Elemente: einen Transkriptionspromotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das Xyloglucanaseaktivität besitzt, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NR: 3 von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1611 dargestellt, umfassen (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das Xyloglucanaseaktivität besitzt, das mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 4 von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 537 sind, und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und einen Transkriptionsterminator.
Isoliertes Polynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, beta-1,4-glykosidische Bindungen in dem Grundgerüst von Xyloglucan zu spalten, und das ein Verhältnis von k_cat gegenüber Xyloglucan aus Tamarindensamen zu k_cat gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC) oder mikrokristalliner Cellulose (Avicel) von mindestens 2 : 1, gemessen bei pH 7,5, aufweist, wobei das Polynukleotidmolekül ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 88 bis Nukleotid 783 dargestellt, umfassen; (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 30 bis Aminosäurerest 261 ist, (c) degenerierten Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und (d) Polynukleotidmolekülen, die mit einer denaturierten, doppelsträngigen DNA- Sonde, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DNA-Sonden, welche die in Positionen 88 bis 783 aus SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen, und DNA-Sonden, die eine Untersequenz der Positionen 88 bis 783 aus SEQ ID NO: 1 umfassen, die eine Länge von mindestens ungefähr 100 Basenpaaren besitzen, unter folgenden Bedingungen hybridisieren: Vortränken des Filters, der die zu hybridisierende(n) DNA Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Sodium chlorid/Sodium citrate; Natriumchlorid/Natriumcitrat) für 10 Minuten, Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte, beschallte Lachssperma-DNA, gefolgt von der Hybridisierung in dergleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer Zufalls-geprimten („random-primed"), 32P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität höher als 1 × 109 cpm/μg) Sonde enthält, für 12 Stunden bei ungefähr 45 °C; und dann zweimaliges Waschen des Filters für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 60 °C.
Isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 15, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden, funktionsfähig verknüpften Elemente: einen Transkriptionspromotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das Xyloglucanaseaktivität besitzt, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NR: 1 von Nukleotid 88 bis Nukleotid 783 dargestellt, umfassen, (b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das Xyloglucanaseaktivität besitzt, das mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 30 bis Aminosäurerest 261 ist, und (c) degenerierte Nukleotidsequenzen von (a) oder (b); und einen Transkriptionsterminator.
Kultivierte Zelle, in welche ein Expressionsvektor nach Anspruch 14 oder 17 eingeführt worden ist, wobei die Zelle das Polypeptid, das durch das DNA-Segment kodiert wird, exprimiert.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, das in der Lage ist, beta-1,4-glykosidische Bindungen in dem Grundgerüst von Xyloglucan zu spalten, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle, in welche ein Expressionsvektor nach Anspruch 14 oder 17 eingeführt worden ist, wodurch die Zelle ein Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird; und Rückgewinnen des Polypeptids, umfasst.
Isoliertes Enzym, das in der Lage ist, beta-1,4-glykosidische Bindungen in dem Grundgerüst von Xyloglucan zu spalten, wobei das Enzym i. frei von homologen Verunreinigungen ist, und ii. durch das Verfahren nach Anspruch 19 hergestellt wird.
Enzymzubereitung, welche das Xyloglucanasepolypeptid nach Anspruch 4 oder 7 umfasst.
Zubereitung nach Anspruch 21, welche weiterhin ein oder mehrere Enzyme) umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen (Endoglucanasen), β-Glucanasen, Hemicellulasen, Lipasen, Peroxidasen, Laccasen, α-Amylasen, Glucoamylasen, Cutinasen, Pectinasen, Reductasen, Oxidasen, Phenoloxidasen, Ligninasen, Pullulanasen, Pectatlyasen, Xyloglucanasen, Xylanasen, Pectinacylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pectinlyasen, anderen Mannasen, Pektinmethylesterasen, Cellobiohydrolasen, Transglutaminasen; oder Mischungen hiervon.
Detergentzusammensetzung, welche die Enzymzubereitung nach Anspruch 21 oder das Xyloglucanaseenzym nach einem beliebigen der Ansprüche 4, 7 und 20 umfasst.
Prozess zur maschinellen Behandlung von Stoffen (Geweben; „fabrics"), wobei der Prozess das Behandeln von Stoffen während eines Waschzyklus eines Maschinenwaschprozesses mit einer Waschlösung, welche die Enzymzubereitung nach Anspruch 21 oder das Xyloglucanaseenzym nach einem beliebigen der Ansprüche 4, 7 und 20 enthält, umfasst.
Verwendung der Enzymzubereitung nach Anspruch 21 oder des Xyloglucanaseenzyms nach einem beliebigen der Ansprüche 4, 7 und 20 in der Textilindustrie zum Verbessern der Eigenschaften von cellulosehaltigen Fasern, Fäden, gewebtem oder nicht gewebtem Stoff.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Enzymzubereitung oder das Xyloglucanaseenzym in einem Spülprozessschritt („scouring process step") verwendet wird.
Verwendung der Enzymzubereitung nach Anspruch 21 oder des Xyloglucanaseenzyms nach einem beliebigen der Ansprüche 4, 7 und 20 in der Verabeitungsindustrie für Cellulose-haltiger Fasern zum Rotten („ratting") von Fasern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hanf, Jute, Flachs und Leinen.