DE60028052T2

DE60028052T2 - Alkalische xyloglukanase aus malbranchea

Info

Publication number: DE60028052T2
Application number: DE60028052T
Authority: DE
Inventors: Room 103 Wenping WU; Martin Schülein; Sakari Markus KAUPPINEN; Ann Mary STRINGER
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2020-08-12
Also published as: CN100523183C; CA2381616A1; AU6558000A; EP1210414A1; EP1210414B1; MXPA02001455A; ATE326528T1; ES2265960T3; WO2001012794A1; DE60028052D1; KR20020022804A; JP2003507039A; CN1369007A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Xyloglucanaseenzyme, die endogen zu einem Stamm sind, der zu Malbranchea gehört, insbesondere Enzyme, die eine Xyloglucanase-Aktivität im pH-Bereich von 4 bis 11 aufweisen, ein Verfahren zur Herstellung solcher Enzyme und die Verwendung solcher Enzyme bei Textilien, als Detergenz und in der Cellulosefaser-verarbeitenden Industrie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Xyloglucan ist das Hauptstrukturpolysaccarid in der primären (wachsenden) Zellwand von Pflanzen. Strukturell bestehen Xyloglucane aus einer Cellulose-ähnlichen beta-1,4-verbundenen Glucosehauptkette, die oft mit verschiedenen Seitenketten substituiert ist. Die Xyloglucane der meisten diocotyledonen Pflanzen, einigen Monocotyledonen und Gymnospermen sind hoch verzweigte Polysaccharide, in denen etwa 75 % der Glucose-Reste in der Hauptkette eine Glycosyl-Seitenkette bei O-6 tragen. Der Glycosyl-Rest, der direkt an den verzweigten Glucose-Rest gebunden ist, ist eine invariable alpha-D-Xylose. Bis zu 50 % der Seitenketten in den Xylogucanen enthalten wegen der Gegenwart von beta-D-Galaktose- oder alpha-L-Fucose-(1-2)-beta-D-Galctose-Resten am O-2 des Xylolose-Restes mehr als einen Rest (C. Ohsumi und T. Hayashi (1994) Plant and Cell Physiology 35:963–967; G. J. McDougall und S. C. Fry (1994) Journal of Plant Physiology 143:591–595; J.L. Acebes et al. (1993) Phytochemistry 33:1343–1345). Nach saurer Hydrolyse von Xyloglucan, die aus Baumwollfasern extrahiert wurde, wird Glucose, Xylose, Galactose und Fucose im Verhältnis 50 : 29 : 12 : 7 erhalten (Hayashi et al. 1988).
Von Nachtschattengewächsen produziert Xyloglucane sind dahingehend ungewöhnlich, dass nur 40 % der beta-1,4-verbundene Reste eine Glycosyl-Seitenkette am O-6 tragen. Ferner sind bis zu 60 % der Xylose-Reste am O-2 mit alpha-L-Arabinose-Resten substituiert, und einige Nachtschattengewächse, wie Kartoffel, besitzen auch Xyloglucane mit beta-D-Galactose-Substituenten am O-2 von einigen der Xylose-Resten (York et al (1996)).
Von Xyloglucan wird angenommen, dass es in den primären Pflanzenwänden durch Vernetzung von Cellulose-Mikrofibrillen wirkt, wodurch ein Cellulose-Xyloglucan-Netzwerk gebildet wird. Dieses Netzwerk wird als notwendig für die strukturelle Integrität der primären Pflanzenzellwänden angesehen (Carpita et al 1993). Eine andere wichtige Funktion des Xyloglucans ist, dass es als Behältnis für die Xyloglucan-Untereinheitologosaccharide wirkt, die physiologisch aktive Regulatoren für das Pflanzenzellwachstum sind. Xyloglucan-Untereinheiten können auch die Wirkung einer Xyloglucan-Endotransglycosylase (XET) modulieren, ein mit der Zellwand assoziiertes Enzym, von dem angenommen wird, das es eine Rolle bei der Elongation der Pflanzenzellwände spielt. Daher kann Xyloglucan eine wichtige Rolle beim Wandabbau und folglich der Zellexpansion spielen (Fry et al 1992).
Die Samen vieler dicotyledoner Spezien enthalten Xyloglucan als Hauptlagerreservepolysaccarid. Diese Xyloglucan-Art, die in massiven Dicken an der Innenseite der Cotyledonzellwänden der Samen loklisiert ist, ist hauptsächlich aus Glucose, Xylose und Galactose zusammengesetzt (Rose er al. 1996).
Die Samen des Tamarindbaumes Tamarindus indica wurden 1943 zu einer kommerziellen Quelle von Gummi, als Gummi als Papier- und Textilversiegelung für brauchbar gefunden wurde. Das Versiegeln von Jute und Baumwolle mit Tamarinxyloglucan wurde wegen der niedrigen Kosten des Gummis und wegen der exzellenten Eigenschaften in Asien weit verbreitet praktiziert. Nahrungsmittelanwendungen von Tamarinxyloglucan umfassen Süßwaren, Marmeladen und Gelles, und als Stabilisatoren in Eiscreme und Mayonese (Whistler et al., 1993).
Die Xyloglucanase-Aktivität ist in der Klassifikation von Enzymen, die von der Enzym-Nomenclature (1992) bereitgestellt wird, nicht umfasst. Bisher wurde diese Enzymaktivität einfach als Glucanase-Aktivität klassifiziert, und es wurde oft angenommen, dass sie mit der Cellulose-Aktivität (EC 3.2.1.4) identisch ist, d.h. eine Aktivität gegen β-1,4-glycosidische Bindungen in der Cellulose oder Cellulosederivat-Substraten besitzt oder zumindest eine Nebenaktivität in Enzymen mit cellulolytischer Aktivität aufweist. Eine echte Xyloglucanase ist jedoch ein für echtes Xyloglucan spezifisches Enzym, das die Löslichmachung von Xyloglucan in Xyloglucan-Oligosacchariden katalysiert, aber die im wesentlichen keine cellulolytische Aktivität zeigt, z.B. Aktivität gegen die herkömmlich verwendete Cellulose-ähnlichen Substrate CMC (Carboxymethylcellulose), HE-Cellulose und Avicel (mikrokristalline Cellulose). Eine Xyloglucanase spaltete die beta-1,4-glycosidische Bindung in der Hauptkette der Xyloglucane.
Die Xyloglucanase-Aktivität wird von Vincken et al. (1997) beschrieben, der drei verschiedene Endoglucanasen aus Trichoderma viride (ähnlich mit T. reesei) charakterisiert, die alle eine hohe Aktivität gegen Cellulose oder CMC besitzten und zeigen, dass EndoI (das tatsächlich zur Familie 5 der Glycosylhydrolasen gehört, vgl. Henrissat, B. et al. (1991, 1993)) im wesentlichen keine (d.h. eine sehr geringe) Aktivität gegen Xyloglucan zeigt, und dass sowohl EndoV (das zur Familie 7 der Glycosylhydrolasen gehört) als auch EndoIV (das zur Familie 12 der Glycosylhydrolasen gehört) eine Aktivität gegen Xyloglucan bzw. CMC in der gleichen Größenordnung besitzen.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 94/14953 offenbart eine Xyloglucanase (EG II), die aus dem Pilz Aspergillus aculeatus kloniert wurde.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 98/38288 offenbart die Aminosäuresequenz von Xyloglucanase aus Tiarasporella phaseolina bzw. Dichotomocladium hesseltinei.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 98/50513 offenbart Wasch- und Reinigungszusammensetzungen, die eine Xyloglucanase-Enzym enthalten.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 99/02663 offenbart eine Xyloglucanase, die aus Bacillus licheniformis und Bacillus agaradhaerens geklont wurde.
Viele wichtige Verfahren, sowohl industrielle Prozesse als auch Prozesse im Haushalt, die industrielle Produktagenzien verwenden, werden bei hohem pH im alkalischen Bereich durchgeführt. Dementsprechend besteht ein Bedarf für ein echtes Xyloglucanase-Enzym mit einer hohen Xyloglucanase-Aktivität bei alkalischem pH.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben nun Enzyme mit einer wesentlichen Xyloglucanase-Aktivität bei hohem pH im alkalischen Bereich gefunden, wobei solche Enzyme erhalten werden aus oder endogen sind zu einem Stamm, der zu der Pilzgattung Malbranchea gehört.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Xyloglucanase-Enzym, das aus einem Stamm erhalten wird, der zur Gattung Malbranchea, gehört, vorzugsweise aus einem Stamm der zu einer Spezies ausgewählt aus der Gruppe aus Malbaranchea cinnamomea (und die drei Synonyme Malbranchea sulfurea, Malbranchea pulchella var. sulfurea und Thermoidium sulfureum), Malbranchea graminicola, Malbranchea pulchella, Malbranchea filamentosa, Malbranchea gypsea, Malbranchea albolutea, Malbranchea arcuata, Malbranchea aurantiaca, Malbranchea bologenesii-chiurcoi, Malbranchea chrysosporioidea, Malbranchea circinata, Malbranchea flava, Malbranchea flavorosea, Malbranchea flocciformis, Malbranchea fulva, Malbranchea kambayashii. Malbrancea multicolor, Malbranchea sclerotica, Malbranchea setosa und Malbranchea dendritica, deren Enzym eine Xyloglucanase-Aktivität und keine Aktivität gegen Cellulose und Cellulosederivat-Substrate zeigen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Xyloglucanase ein scheinbares Molekulargewicht von 25 ± 10 kDa, einen pI zwischen 3 und 5 und zeigt eine Xyloglucanase-Aktivität im pH-Bereich von 4 bis 11, gemessen bei 50 °C.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Xyloglucanase bereit, die aus einem zu Malbranchea gehörenden Stamm kloniert wurde, d.h. eine Xyloglucanase, die ausgewählt ist unter (a) einem Polypeptid, das ein Fragment einschließt, das durch die DNA-Sequenz der Positionen 141–806 der SEQ ID. Nr. 1 kodiert wird, (b) einem Polypeptid, das durch Kultivieren einer Zelle, die die Sequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, unter Bedingungen, wobei die DNA-Sequenz exprimiert wird, hergestellt wird und (c) einem Xyloglucanase-Enzym mit einer Sequenz von mindestens 80 %iger Identität mit den Positionen 1–222 der SEQ ID Nr. 1, wenn die Identität durch GAP, bereitgestellt in der GCG_Programmpaketversion 10.0, unter Verwendung einer GAP Creation Penalty von 8 und einer GAP Extension Penalty von 2 bestimmt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Polypeptid mit einer Xyloglucanase-Akktivität bereit, das aus einem Stamm der Gattung Malbranchea erhalten wurde und besitzt:

(i) Xyloglucanase-Aktivität in pH-Bereich von 4 bis 11, gemessen bei 50 °C;
(ii) eine Molekularmasse von 25 ± kDa, bestimmt mittels SDS-PAGE,
(iii) einen isoelektrischen Punkt (pI) im Bereich von 3–5, und/oder
(iv) die N-terminale Sequenz Ala-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Ser-Glu-Gln-Ser-Gly-Pro-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu.

Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Xyloglucanase-Enzym bereit, das (i) frei von homologen Verunreinigungen ist und (ii) durch Kultivieren einer Zelle hergestellt wird, die die DNA-Sequenz der Positionen 141 bis 806 der SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Das neue Enzym der vorliegenden Erfindung ist nützlich zur Behandlung von Cellulose-Materialien, insbesondere Cellulose-haltigen Fasern, Garnen, gewebten Stoffen und Fliesen. Die Behandlung kann erfolgen während der Verarbeitung des Cellulosematerials in das für die Fadenherstellung oder Herstellung einer textilen Fläche gebrauchsfertig Material, z.B. im Schritt der Entschlichtung oder der Reinigung; oder während des industriellen Waschens oder des Waschens im Haushalt von solchen textilen Flächen oder Fäden.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Detergenz-Zusammensetzung, die eine Xyloglucanase umfasst, die endogen zu einem Stamm ist, der zur Pilzgattung Malbranchea gehört, insbesondere der zur Pilzspezies Malbranchea cinnomomea gehört, und im wesentlichen eine Aktivität im alkalischen pH-Bereich besitzt, und die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms zur Behandlung von Cellulose-haltigen Fasern, Garnen, gewebten Stoffen oder Fliesen.
Die vorliegende Erfindung macht es nun möglich, einen rein enzymatischen Reinigungsprozess bei der Herstellung von Cellulosematerialien zu verwenden, z.B. als geeignete Antwort in nachfolgende Färbungsoperationen. Des weiteren wird in Betracht gezogen, dass die Detergenz-Zusammensetzung, die das neue Enzym enthält, dazu in der Lage ist, bestimmte Verschmutzungen oder Flecken zu entfernen oder zu bleichen, die auf der Wäsche vorliegen, insbesondere Verschmutzungen und Flecken, die von Xyloglucan-haltigen Nahrungsmitteln, Pflanzen und Ähnlichem stammt. Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die Behandlung mit der Detergenz-Zusammensetzung, die das neue Enzym enthält, das Binden bestimmter Verschmutzungen an Xyloglucan-Reste auf dem Cellulose-Material verhindert.
DIE FIGUREN
In den beigefügten Figuren zeigt
1 die Konstruktion von pCaHj 527;
2 die relative Xyloglucanase- und CMC-ase-Aktivität bei 595 nm der Fraktionen aus dem Stamm UAMH2485;
3 die relative Xyloglucanase- und CMC-ase-Aktivität bei 595 nm der Fraktionen aus dem Stamm CBS 343.55, und
4 die relative Xyloglucanase- und CMC-ase-Aktivität bei 595 nm der Fraktionen aus dem Stamm CBS 960.72.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Cellulasen werden in mehr als 10 verschiedenen Familien der Glycosylhydrolasen gefunden. Einige der Cellulasen zeigen auch eine Xyloglucanase-Aktivität. Heute werden solche Zellulasen unter denen gefunden, die in den Familien 5, 7 und 12 klassifiziert sind. Die Substratspezifizät korreliert aber nicht direkt mit der Familie: innerhalb einer Familie kann die enzymatische Hauptaktivität Cellulase oder Mannase (Familie 5) oder Lichinase-, β-1,3-Glucanase- oder Xyloglucantransferase-Aktivität sein (Familie 16). Nur von sehr wenigen Enzymen wird bisher beschrieben, dass sie eine Aktivität gegen Xyloglucan als wichtigste oder Hauptenzymaktivität haben. Wie vorstehend erwähnt, hat diese Aktivität noch keinen Eingang in die offizielle Enzymnomenklatur gefunden.
Im vorliegenden Kontext ist beabsichtigt, dass der Ausdruck „Enzympräparation" bedeutet entweder ein konventionelles enzymatisches Fermantationsprodukt, möglicherweise isoliert und gereinigt aus einer einzelnen Spezies eines Mikroorganismus, wobei eine solche Präparation üblicherweise eine Anzahl verschiedener Enzymaktivitäten aufweist, oder eine Mischung von Monokomponentenenzymen, vorzugsweise Enzyme, die aus Bakterien- oder Pilzspezien durch Einsatz konventioneller rekombinanter Techniken stammen, wobei die Enzyme fermentiert und möglicherweise getrennt isoliert und gereinigt sind und die von verschiedenen Spezien stammen können, vorzugsweise Pilz- oder Bakterienspezien, oder das Fermentationsprodukt eines Mikroorganismus, der als Wirtszelle für die Expression einer rekombinanten Xyloglucanase fungiert, wobei der Mikroorganismus aber simultan andere Enzyme produziert, z.B. Xyloglucanase, Protease oder Cellulase, die natürlich vorkommende Fermaentierungsprodukte der Mirkoorganismen sind, d.h. den konventionell durch die entsprechenden natürlich vorkommenden Mikroorganismen erzeugte Enzymkomplex.
In einer bevorzugten Ausführungsfomr besitzt die erfindungsgemäße Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 9,5 von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, bevorzugter mindestens 60 %, insbesondere mindestens 65 %, ganz besonders mindestens 70 %, verglichen mit der Aktivität bei optimalem pH.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt die efindungsgemäße Xyloglucanase eine relative Aktivität bei pH 10 von mindestens 40 %, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter mindestens 55 %, insbesondere mindestens 60 %, verglichen mit der Aktivität bei optimalem pH.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die erfidungsgemäße Xyloglucanase bei einer Temperatur zwischen 20 °C und 70 °C aktiv. Vorzugsweise hat die Xyloglucanase eine relative Aktivität im Temperaturbereich 40–60 °C von mindestens 40 %, bevorzugter mindestens 50 %, insbesondere mindestens 55 %, ganz besonders mindestens 60 %, verglichen mit der Aktivität bei optimaler Temperatur.
Die erfindungsgemäße Xyloglucanase zeigt keine Aktivität für Cellulose oder Celluloesderivatsubstraten. Ein konventionelles Substrat zur Bestimmung der Cellulase-Aktivität (endo-β-1,4-Glucanaseaktivtät jf. EC 3.2.1.4) ist Carboxymethylcellulose (CMC). Ein anderes konventionelles Substrat zur Bestimmung der Cellulase- oder Cellobiohydrolase-Aktivität (EC 3.2.1.91) ist Avicel, ein dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannte mikrokristalline Cellulose.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Enzympräparation, die die hier beschriebene Xyloglucanase und optional ein Enzym oder mehrere Enzyme enthalten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteasen Cellulase (endo-β-1,4-Glucanase), β-Glucanase (endo-β-1,3(4)-Glucanase), Lipasen, Cutinasen, Peroxidasen, Laccasen, Amylasen, Glucoamylasen, Pectinasen, Reductasen, Oxidasen, Phenoloxidasen, Ligninasen, Pullulanasen, Arabinasen, Hemicellulasen, Mannasen, Galactanasen, Xylanasen, Pektinacetylesterasen, Rhamnogalcturonanacetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pektinlyasen, Pektatlyasen, Pektinmethylesterasen, Cellobiohydrolasen, Transglutaminasen oder Mischungen davon. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein oder mehrere oder alle der Enzyme in der Präparation durch rekombinante Techniken hergestellt, d.h. das/die Enzyme ist/sind Monokomponentenenzym/e, das/die ist/sind mit anderen Enzymen gemischt, um eine Enzympräparation mit der gewünschten Enzymmischung zu ergeben.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Xyloglucanase oder einer Xyloglucanase-Präparation der Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Mikroorganismus umfasst, z.B eines Stammes der Pilzgattung Malbranchea, vorzugsweise eines Stammes, der gehört zu den Spezien Malbaranchea cinnamomea (und die drei Synonyme Malbranchea sulfurea, Malbranchea pulchella var. sulfurea und Thermoidium sulfureum), Malbranchea graminicola, Malbranchea pulchella, Malbranchea filamentosa, Malbranchea gypsea, Malbranchea albolutea, Malbranchea arcuata, Malbranchea aurantiaca, Malbranchea bologenesii-chiurcoi, Malbranchea chrysosporioidea, Malbranchea circinata, Malbranchea flava, Malbranchea flavorosea, Malbranchea flocciformis, Malbranchea fulva, Malbranchea kambayashii. Malbrancea multicolor, Malbranchea sclerotica, Malbranchea setosa und Malbranchea dendritica, z.B. ein Stamm der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malbranchea cinnamomea, CBS 115.68, MUCL 11291, CBS 343.55, MUCL 9500, UAMH 3827, CBS 423.54, CBS 960.72 und UAMH 2485, wobei der Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Herstellung von Enzymen erlauben, in der Lage ist, Xyloglucanase zu erzeugen, und Gewinnen der Enzyme aus der Kultur. Das Kultivieren kann unter Verwendung konventioneller Fermentationstechniken durchgeführt werden, z.B. Kultivieren in Schüttelkolben oder Fermentatoren mit Schütteln, um eine ausreichende Belüftung des Wachstumsmediums sicher zu stellen, um die Produktion des Xyloglucanase-Enzyms zu induzieren. Das Wachstumsmedium kann eine konventionelle N-Quelle enthalten, wie ein Pepton, Hefeextrakt oder Casaminosäuren, eine verringerte Menge einer konventionellen C-Quelle, wie Dextrose oder Sucrose, und ein Induktionsmittel, wie Xyloglucan oder ein zusammengesetztes Pflanzensubstrat, wie Cerealienkleie (z.B. Weizenkleie oder Reisschrot). Die Gewinnung kann unter Einsatz konventioneller Techniken durchgeführt werden, z.B. Trennung der Biomasse und der Überstandes durch Zentrifugation oder Filtration, Gewinnung des Überstandes oder Zerstörung der Zellen, falls die interessierenden Enzyme intrazellulär vorliegen, vielleicht gefolgt von einer weiteren Reinigung, wie sie in der EP 0 406 314 beschrieben ist, oder durch Kristallisation, wie sie in der WO 97/15660 beschrieben ist.
Im vorliegenden Kontext bezeichnet der Ausdruck „Expressionsvektor" ein lineares oder circuläres DNA-Molekül, das ein Segment enthält, das ein interessierendes Polypeptid kodiert, das operativ mit zusätzlichen Segmenten verbunden ist, die ihre Transkription sicher stellen. Solche zusätzliche Segmente beinhalten Promotor- und Terminator-Sequenzen, und sie könne optional einen oder mehrere Peplikationsursprünge, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylationssignal und dergleichen enthalte. Expressionsvektoren stammen im Allgemeinen von Plasmid-DNA oder viraler DNA oder können Elemente von beiden enthalten. Der Expressionsvektor der Erfindung kann jeder Expressionsvektor sein, der konventionell der rekombinanten DNA-Herstellung unterzogen wird, und die Wahl des Vektors hängt oft von der Wirstzelle ab, in die der Vektor eingeführt wird. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, wobei die Replikation unabhängig von der Chromosomen-Replikation ist, z.B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in die Wirtszelle eingebracht wird, in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem/den Chromosomen, in die er integriert ist, repliziert wird.
Der Ausdruck „rekombinante exprimiert" oder „in rekombinanter Weise exprimiert", wie er hier in Verbindung mit der Expression eines Polypeptides oder Proteins verwendet wird, ist gemäß der Standarddefinition auf diesem Gebiet definiert. Die rekombinante Expression eines Proteins wird durch Verwendung eines Expressionsvektors, wie er unmittelbar vorstehend beschrieben ist, durchgeführt.
Der Ausdruck „isoliert", bezeichnet, wenn er auf ein Polynucleotid-Molekül angewendet wird, dass das Polynucleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die zur Verwendung in genetisch technischem Proteinproduktionssystem geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind diejenigen, die aus ihrer natürlichen Umgebung getrennt wurden und cDNA und genomische Klone umfassen. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie üblicherweise assoziiert sind, aber sie können natürlich vorkommende 5'- und 3'- nicht translatierte Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, umfassen. Die Identifikation von assoziierten Regionen ist für den Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet evident (vgl. z.B. Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985). Der Ausdruck „ein isoliertes Polynucleotid" kann alternativ als „ein geklontes Polynucleotid" bezeichnet werden.
Wenn es für ein Protein/Polypeptid verwendet wird, gibt der Ausdruck „isoliert" an, dass das Protein unter einer Bedingung gefunden wird, die anders als die native Umgebung ist. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere andere homologe Proteine (d.h. „homologe Verunreinigungen" (vgl. nachstehend)). Es ist bevorzugt, die Proteine in einer mehr als 40 % reinen Form bereitzustellen, bevorzugter mehr als 60 % reine Form.
Noch bevorzugter ist es bevorzugt, das Protein in einer hoch gereinigten Form, d.h. mehr als 80 Reinheit, bevorzugter mehr als 95 % Reinheit und am bevorzugtesten mehr als 99 % Reinheit, bereitzustellen, bestimmt mit SDS-PAGE.
Der Ausdruck „isoliertes Protein/Polypeptid" kann alternativ als „gereinigtes Protein/Polypeptid" bezeichnet werden.
Der Ausdruck „homologe Verunreinigungen" bedeutet jede Verunreinigung (z.B. ein anderes Polypeptid als das erfindungsgemäße Polypeptid), das von homologen Zellen stammt, von denen das erfindungsgemäße Polypeptid ursprünglich stammt.
Der Ausdruck „erhalten von" wie er hier in Verbindung mit einer spezifischen mikrobiellen Quelle verwendet wird, bedeutet, dass das Polynucleotid und/oder Polypeptid von der spezifischen Quelle hergestellt wird oder von einer Zelle produziert wird, in der ein Gen von der Quelle eingesetzt wurde.
Der Ausdruck „operativ verbunden" bezeichnet, wenn er sich auf DNA-Segmente bezieht, dass die Segmente so arrangiert sind, dass sie zusammen für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, z.B. Transkription beim Promotor initieren und über das kodierende Segment bis zu Terminator voranschreiten.
Der Ausdruck „Polynucleotid" bezeichnet ein einzel- oder dopplesträngiges Polymer von Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotid-Basen, die vom 5'- zu 3'-Ende gelesen werden. Polynucleotide umfassen RNA und DNA und können aus natürlichen Quellen gewonnen, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination natürlicher und synthetischer Moleküle hergestellt werden.
Der Ausdruck „Komplemente der Polynecleotid-Moleküle" bezeichnet Polynucleotid-Moleküle mit einer komplementären Basensequenz und einer reversen Orientierung verglichen mit der Referenzsequenz. Beispielsweise ist die Sequenz 5'-ATGCACGGG-3' komplementär zu 5'-CCCGTGCAT-3'.
Der Ausdruck „degenerierte Nucleotidsequenz" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die ein oder mehrere degenerierte Codons enthält (verglichen mit einem Referenzpolynucleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert). Degenerierte Codons enthalten verschiedene Nucleotidtripletts, aber sie kodieren den gleichen Aminosäurerest (d.h. GAU- und GAC-Tripletts kodieren jeweils für Asp).
Der Ausdruck „Promotor" bezeichnet einen Teil eines Gens, das DNA-Sequenzen enthält, die das binden der RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription ermöglichen. Promotor-Sequenzen werden üblicherweise aber nicht immer in der nicht kodierenden 5'-Region eines Gens gefunden.
Der Ausdruck „Sekretionssignalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „Sekretionspeptid") kodiert, das als Bestandteil eines größeren Polypeptides das größere Polypeptid über den Sekretionsweg einer Zelle leitet, in der es synthetisiert wird. Das größere Peptid wird üblicherweise gespalten, um das Sekretionspeptid während des Durchganges durch den Sekretionsweg zu entfernen.
POLYNEUCLEOTIDE
Innerhalb der bevorzugten Ausführungsformem der Erfindung wird ein isoliertes erfindungsgemäßes Polynucleotid an ähnlich große Regionen der SEQ ID Nr. 1 oder einer dazu komplementären Sequenz unter mindestens stringenten Mediumbedingungen hybridisieren.
Insbesondere werden erfindungsgemäße Polynucleotide an denaturierte doppelsträngige DNA-Sonden hybridisieren, die umfassen entweder die gesamte Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 oder die in den Positionen 141–806 der SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind oder irgendeine Sonde, die eine Subsequenz der SEQ ID Nr. 1 mit einer Länge von mindestens 100 Basenpaaren unter mindestens stringenten Mediumbedingungen, aber bevorzugt hohe Stringenzbedingungen, wie sie nachfolgend detailiert beschrieben werden. Geeignete experimentelle Bedingungen zur bestimmung der Hybridisierung bei mittlerer oder hoher Stringenz zwischen einer Nucleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz umfassen das Vortränken des die DNA-Fragmente oder die RNA enthaltenden Filter, um in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat, Sambrook et al. 1998) während 10 Minuten zu hybridisieren, und Prähybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung (Sambrook et al. 1998), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierter beschallter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von der Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine Konzentration von 10 ng/ml einer random-geprimten (Feinberg A.P. Und Vogelstein B. (1983) Anal. Biochem. 132:6–13), 32P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität höher als 1 × 109 cpm/μg) Sonde enthält, während 12 Stunden bei ca. 45 °C. Der Filter wird dann zwei mal während 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5 % SDS bei mindestens 60 °C (mittlere Stringenz), noch bevorzugter mindestens 65 °C (mittlere/hohe Stringenz) noch mehr bevorzugt mindestens 70 °C (hohe Stringenz), und noch mehr bevorzugt mindestens 75 °C (sehr hohe Stringenz) gewaschen.
Moleküle, an die die Oligonucleotid-Sonden unter diesen Bedingungen hybridisieren werden unter Verwendung eines Röntgenfilms nachgewiesen.
Wie vorstehend bemerkt, umfassen solche isolierten Polynucleotide DNA und RNA. Verfahren zur Isolierung von DNA und RNA sind auf dem Gebiet gut bekannt. DNA- und RNA-kodierende interessierende Gene können in Genbanken oder DNA-Bibliotheken mittels auf dem Gebiet bekannter Methoden kloniert werden.
Für Polypeptide kodierende Polynucleotide, die Xyloglucanase-Aktivität besitzen, werden dann identifiziert und isoliert, beispielsweise durch Hybridisierung und PCR.
Es wird ferner in Betracht gezogen, das Gegenstück-Polypeptide und -Polynucleotide von verschiedenen Pilzstämmen (Orthologe und Paraloge) bereitgestellt werden können.
Spezieshomologe von Polypeptiden mit Xyloglucanase-Aktivität können unter Verwendung von Informationen und Zusammensetzungen, die vom Klonieren von Malbranchea-Xyloglucanase der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit konventionellen Klonierungstechniken erhalten werden, kloniert werden Beispielsweise kann eine DNA-Sequenz unter Verwendung chromosomaler DNA geklont werden, die von einem Zelltyp erhalten wird, der das Protein exprimiert. Geeignete Quellen der DNA können durch Sondieren mit Northern-Blots mit Sonden identifiziert werden, die von der Malbranchea-Xyloglucanase-DNA und verfügbaren Polypeptidsequenzen konstruiert sind. Eine Bibliothek wird dann aus der chromosomalen DNA von einer positiven Zelllinie hergestellt. Eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, die eine Xyloglucanase-Aktivität aufweist, kann mittels einer Vielzahl von Verfahren isoliert werden, so wie das Sondieren mit Sonden, die von den vorstehenden Sequenzen konstruiert werden, oder mit einem oder mehreren Sets von degenerierten Sonden, die auf dieser Sequenz basieren. Eine DNA-Sequenz kann auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion oder PCR (Mullis, US Patent 4, 683,202) geklont werden, wobei Primer von den vorstehenden Sequenzen konstruiert werden. In einerm zusätzlichen Verfahren kann die DNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder transfizieren, und die Expression der interessierenden DNA kann mit einem Antikörper (monoklonal oder polyklonal) nachgewiesen werden, der gegen eine Xyloglucanase gerichtet ist, die aus Malbranchea cinnamomea, CBS 115.68, MUCL 11291, CBS 343.55, MUCL 9500, UAMH 3827, CBS 423.54, CBS 960.72 oder UAMH 2485 stammt, expremiert und gereinigt, oder durch einen Aktivitätstest, der das Polypeptid mit der Xyloglucanase-Aktivität betrifft.
POLYPEPTIDE
Von der Sequenz der Aminosäuren Nr. 29–250 der SEQ ID Nr. 2 wird angenommen, dass sie eine reife Xyloglucanase ist, die N-terminale Sequenz beginnt an Position 29 der SEQ ID Nr. 2.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Xyloglucanase-Polypeptide bereit, die im wesentlichen homolog zu den Polypeptiden der Aminosäuren Nr. 1–250 oder 29–250 der SEQ ID Nr. 2 sind, und Spezieshomolog (Paralog oder Ortholog) dazu. Der Ausdruck „im wesentlichen homolog" wird hier verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die 70 %, vorzugsweise mindestens 75 %, bevorzugter mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 % und am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität zu den Sequenzen hat, die in den Aminosäuren 1–250 oder 29–250 der SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, oder ihren Orthologen oder Paralogen. Solche Polypeptide werden bevorzugt mindestens zu 95 % identisch und mehr bevorzugt zu 98 % oder mehr identisch sein mit der in den Aminosäuren Nr. 1–250 oder 29–250 der SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz, oder ihren Orthologen oder Paralogen.
Die prozentuale Sequenzidentität wird durch konventionelle Verfahren mittels auf dem Gebiet bekannten Computerprogrammen ermittelt, wie GAP, das im GCG Programmpaket (Program Manual für das Wisconsin Package, Version 10.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) bereitgestellt ist. GAP wird mit den folgenden Einstellungen für den Polypeptidsequenzvergleich verwendet: GAP Creation Penalty von 8 und GAP Extension Penalty von 2.
Die deduzierte Aminosäuresequenz der XYG1011-kodierten Familie 12 der Xyloglucanase-Vorläufer aus Malbranchea cinnamomea (SEQ ID Nr. 2) zeigt 49,1–66,2 % Sequenzähnlichkeit und 43,9–61,2 % Sequenzidentität zu einer Auswahl von 7 Enzymen der Pilzfamilie 12. Die Sequenzen werden unter Verwendung des GAP-Programms des GCG-Wisconsin-Softwarepacketes, Version 10.0 Genetics Computer Group (GCG) Madison mit einer GAP Creation Penalty von 8 und einer GAP Extension Penalty von 2 ausgerichtet:
Im wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch charakterisiert, dass sie eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen besitzten. Diese Änderungen sind vorzugsweise von geringer Art, d.h. konservative Aminosäuresubstitutionen (vgl. Tabelle 2) und andere Substitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins oder Polypeptides nicht signifikant beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von 1 bis 30 Aminosäuren; und kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie ein Amino-terminaler Methion-Rest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten oder eine kleine Extension, die die Reinigung erleichtert (ein Affinitäts-Tag), wie ein Poly-Histidin-Trackt-Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985, Nilsson et al. Methods Enzymol. 198: 3, 1991. vgl im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991, die hier unter Bezugnahem aufgenomme sind. DNA, die Affinitäts-Tag kodieren sind von kommerziellen Lieferanten (z.B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA) erhältlich.

Obwohl jedoch die vorstehend beschriebenen Änderungen von geringer Art sind, können solche Änderungen auch von größerer Art sein, wie die Fusion größerer Polypeptide von bis zu 300 Aminosäuren oder mehr, sowohl als Amino- oder Carboxyl-terminale Extension an das erfindungsgemäße Polypeptid mit Xyloglucanase-Aktivität. Tabelle 1 Konservative Aminosäure-Substitutionen

Basisch	Arginin
	Lysin
	Histidin
Sauer	Glutaminsäure
	Aspartinsäure
Polar	Glutamin
	Asparagin
Hydrophob	Leucin
	Isoleucin
	Valin
Aromatisch	Phenylalanin
	Tryptophan
	Tyrosin
Klein	Glycin
	Alanin
	Serin
	Threonin
	Methionin

Zusätzlich zu den 20 Standard-Aminosäuren können Nicht-Standard-Aminosäuren (wie 4-Hydroxyprolin, 6-N-Methyllysin, 2-Aminoisobuttersäure, Isovalin und α-Methylserin) für einen Aminosäurerest des erfindungsgemäße Polypeptides substituiert werden. Eine limitierte Zahl nicht-konservativer Aminosäuren, Aminosäuren, die nicht vom genetischen Code kodiert werden, und nicht natürliche Aminosäuren können für Aminosäurereste substituiert werden. „Nicht natürliche Aminosäuren" wurden nach der Proteinsynthese modifiziert und/oder besitzten eine chemische Struktur in ihren Seitenkette(n), die von den Standardaminosäuren verschieden sind. Nicht natürliche Aminosäuren können chemisch synthetisiert werden, oder vorzugsweise sind sie kommerziell erhältlich, und sie umfassen Pipecolinsäure, Thiazolidincarboxylsäure, Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin und 3,3-Dimehylprolin.
Essentielle Aminosäuren in dem erfindungsgemäßen Xyloglucanase-Polypeptid können mit auf dem Gebiet bekannten Verfahren identifiziert werden, wie ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenes (Cunninghem und Wells, Science 244: 1081–1085, 1989). Bei der letzteren Technik werden einzelne Alanin-Mutationen an jedem Rest des Moleküls eingeführt, und die resultierenden Mutanten-Moleküle werden hinsichtlich der biologischen Aktivität (d.h Xyloglucanase-Aktivität) getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind, vgl. auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699–4708, 1996. Die aktive Stelle des Enzyms oder andere biologische Interaktionen können auch durch eine physikalische Analyse der Struktur, wie sie durch solche Techniken wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie, Elektronenbeugung, Photoaffinitätsmarkierung, in Verbindung mit der Mutation putativer Kontaktstellen-Aminosäuren erhalten werden bestimmt werden, vgl. z.B. de Voss et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett 309: 59–64, 1992. Die Identitäten der essentiellen Aminosäuren kann auch durch die Analyse der Homologie mit Polypeptiden abgeleitet werden, die auf ein erfindungsgemäßes Polypeptid bezogen sind.
Multiple Aminosäure-Substitutionen können mittels bekannter Verfahren der Mutagenese, Rekombination und/oder Shuffeling hergestellt und getestet werden, gefolgt von relevanten Screeningverfahren, wie die bei Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241: 53–57, 1988), Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 2152–2156, 1989), WO 95/17413 oder WO 95/22625 offenbarten. Kurz gefasst offenbaren diese Autoren Verfahren zum simultanen Randomisieren von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid, oder Rekombination/Shuffeling von verschiedenen Mutationen (WO 95/17413, WO 95/22625), gefolgt von einem Auswählen hinsichtlich der Funktion eines Polypeptide, und dann das Sequenzierne des mutagenisierten Polypeptides, um das Spektrum der erlaubten Substitutionen bei jeder Position zu bestimmen. Andere Verfahren, die eingesetzt werden können, umfassen das Phagendisplay (z.B. Lowman et al., Biochem. 30: 10832–10837, 1991; Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung WO 92/06204) und regiongesteuerte Mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Mutagenese/Shuffling-Verfahren, wie sie vorstehend offenbart wurden, können mit hochdurchsatz automatischen Screening-Verfahren kombiniert werden, um die Aktivität geklonter mutagenisierter Polypeptide in Wirtszellen nachzuweisen. Mutagensierte DNA-Moleküle, die aktive Polypeptide kodieren, können aus der Wirtszelle gewonnen und schnell unter Verwendung eines modernen Equipments sequenziert werden. Diese Verfahren erlauben die schnelle Bestimmung der Wichtigkeit individueller Aminosäureresten in einem interessierenden Polypeptid, und kann auf Polypeptide unbekannter Struktur angewendet werden.
Unter Verwendung der vorstehend diskutierten Verfahren kann ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet eine Vielzahl von Polypeptiden identifizieren und/oder herstellen, die im wesentlichen zur Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäße Malbranchea-Xyloglucanase homolog sind und die Xyloglucanase-Aktivität des Wildtypproteins behält.
Das erfindungsgemäße Xyloglucanase-Enzym kann zusätzlich zum Enzymkern, der die katalytische Domäne umfasst, auch eine Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) umfassen, wobei die Cellulose-Bindungsdomäne und der Enzymkern (die katalytisch aktive Domäne) des Enzyms operativ verbunden sind. Die Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) kann als integraler Teil des kodierten Enzyms sein oder ein CBD von einem anderen Ursprung kann in die Xyloglucanase eingeführt werden, womit ein Enzymhybrid kreiert wird. In diesem Zusammenhang ist beabsichtigt, dass der Ausdruck „Cellulose-Bindungsdomäne" wie durch Peter Tomme et al. „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in „Enzym Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS Symposium Series Nr. 618, 1996, definiert ist. Diese Definition klassifiziert mehr als 120 Cellulose-Bindungsdomänen in 10 Familien (I–X), und zeigt, dass CBD in verschiedenen Enzymen gefunden werden, wie Cellulasen, Xylanasen, Mannasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen. CBD wurden auch in Algen, z.B. Rotalge Porphyra purpurea als nicht hydrolytisches Polysaccharid-bindendes Protein gefunden, vgl. Tomme et al., op. cit. Die meisten der CBD stamme jedoch von Cellulasen und Xylanasen, CBD werden in den N- und C-Termini von Proteinen oder intern gefunden. Enzymhybride sind auf dem Gebiet bekannt, vgl. z.B. WO 90/00609 und WO 95/16728, und könne durch Transformieren eines DNA-Konstrukts in eine Wirtszelle hergestellt werden, umfassend mindestens ein Fragment einer DNA, das die Cellulose-Bindungsdomäne kodiert, die mit oder ohne Linker an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die die Xylogenase kodiert, und Wachsen der Wirtszelle, um das fusionierte Gen zu exprimieren. Enzymhybride können durch die folgende Formel beschrieben werden: CBD-MR-X, in der CBD die N-terminale oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens der Cellulose-Bindungsdomäne entspricht; MR die mittlere Region (der Linker) ist und eine Bindung, eine kurze verbindende Gruppe, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 100 Kohlenstoffatomen und bevorzugter von 2 bis 40 Kohlenstoffatomen, oder vorzugsweise etwa 2 bis etwa 100 Aminosäuren, bevorzugter von 2 bis 40 Aminosäuren ist; und X für eine N-terminale oder C-terminale Region eines Polypeptides steht, das durch das erfindungsgemäße Polyneucleotid kodiert wird.
Das Xyloglucan-Substrat
Zusätzlich zu dem vorstehenden Xyloglucan sollte angemerkt werden, dass das Xyloglucan des Samens der Tamarinde, das von Megazyme, Irland, geliefert wird, eine komplexe verzweigte Struktur mit Glucose, Xylose, Galactose und Arabinose im Verhältnis 45 : 36 : 16 : 3 besitzt. Demgemäß wird stark vermutet, dass das Enzym, das eine katalytische Aktivität für Xyloglucan zeigt, auch eine katalytische Aktivität auf andere Xyloglucan-Strukturen von verschiedenen Quellen (Angiosperme oder Gymnosperme) besitzt.
Verwendung in der Detergenz-Industrie
Während des Waschen und Tragens werden üblicherweise Farbstoffe von gefärbten Stoffen und Kleidungsstücken aus dem Stoff bleichen, die dann ausgebleicht und getragen aussehen. Das entfernen der Oberflächenfasern vom Stoff wird teilweise die originalen Farben und Aussehen des Stoffs wieder herstellen. Mit dem Ausdruck „Farbklärung", wie er hier verwendet wird, ist die teilweise Wiederherstellung der anfänglichen Farben des Stoffs oder des Kleidungsstücks während mutlipler Waschzyklen gemeint.
Der Ausdruck „De-Pillingbildung" bezeichnet die Entfernung von Pillingbildungen von der Oberfläche des Stoffes.
Der Ausdruck „Einweich-Flüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in der Wäsche eingetaucht werden kann, bevor sie einem üblichen Waschverfahren unterzogen wird. Die Einweich-Flüssigkeit kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die üblicherweise in Waschprozessen verwendet werden.
Der Ausdruck „Waschflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in der Wäsche einem Waschprozess unterzogen wird. d.h. üblicherweise eine kombinierte chemische und mechanische Aktion entweder mit der Hand oder in einer Waschmaschine. Herkömmlicherweise ist die Waschflüssigkeit eine wässrige Lösung einer pulvrigen oder flüssigen Detergenz-Zusammensetzung.
Der Ausdruck „Spülflüssigkeit" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in der Wäsche eingetaucht und behandelt wird, üblicherweise unmittelbar nachdem sie einem Waschprozess unterzogen wurde, um die Wäsche zu spülen, d.h. im wesentlichen die Detergenzlösung von der Wäsche zu entfernen. Die Spülflüssigkeit kann einen Stoffkonditionierer oder eine Weichmacherzusammensetzung enthalten.
Die dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogene Wäsche kann üblicherweise waschbare Wäsche sein. Vorzugsweise besteht der Hauptteil der Wäsche aus genähten oder ungenähten Stoffen, einschließlich Strickwaren, Webwaren, Jeans, Garne und Handtücher, die aus Baumwolle, Baumwollmischungen oder natürlichen oder künstlich hergestellten Cellulsoics (z.B. die von Xylan-haltigen Cellulosefasern stammen, wie von Holzpulpe) oder Mischungen davon. Beispiele der Mischungen sind Mischungen aus Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, wie Wolle, synthetischen Fasern (z.B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Cellalose-haltigen Fasern (z.B. Rayon/Viskose, Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Celluloseacetat-Fasern, Lyocell).
DETERGENZOFFENBARUNG UND BEISPIELE
Surfactantsystem
Die erfindugsgemäße Detergenzzusammensetzung umfasst ein Surfactantsystem, wobei das Surfactant ausgewählt werden kann unter nicht ionischen und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder ampholytischen und/oder zwitterionischen und/oder semi-polaren Surfactanten.
Das Surfactant liegt typischerweise in einer Menge von 0,1 Gew.-% bis 60 Gew.-% vor.
Das Surfactant ist vorzugsweise formuliert, damit es mit den in der Zusammensetzung vorliegenden Enzymkomponenten kompatibel ist. In flüssiger oder Gel-Zusammensetzung ist das Surfactant am bevorzugtesten in einer solche Weise formuliert, dass es die Stabilität von jedem Enzym in dieser Zusammensetzung erhöht oder zumindest nicht abbaut.
Bevorzugte Systeme, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen ein Surfactant und ein oder mehrere nichtionische und/oder anionische Surfactanten, wie sie hier beschrieben werden.
Polyethylen-, Polypropylen- und Polybutylenoxid-Kondensate von Alkylphenolen sind zur Verwendung als nicht ionische Surfactantsysteme der vorliegenden Erfindung geeignet, wobei Polyethylenoxidkondensate bevorzugt sind. Diese Verbindungen umfassen die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen mit einer Alkylgruppe von etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen, entweder in einer geradkettigen oder verzweigtkettigen Konfiguration mit dem Alkylenoxid. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Ethylenoxid in einer Menge gleich von etwa 2 bis etwa 25 Mol, bevorzugt von etwa 3 bis etwa 15 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkylphenol vor. Kommerziell erhältliche nicht ionische Surfactanten dieses Typs umfassen Igepal^TM CO630, das von GAF Corporation vermarktet wird, und Triton X-45, X-114, X-100 und X-102, die alle von Rohm & Haas Company vermarktet werden. Diese Surfactanten werden üblicherweise als Alkylphenolalkoxylate (z.B. Alkylphenolethoxylate) bezeichnet.
Die Kondensationsprodukte primärer und sekundärer aliphatischer Alkohole mit etwa 1 bis etwa 25 Mol Ethylelnoxid sind zu Verwendung als nicht ionische Surfactant-Systeme der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder geradkettig oder verzweigt, primär oder sekundär sein, und im Allgemeinen enthält er von etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt sind die Kondensationsprodukte von Alkoholen mit einer Alkylgruppe, die von etwa 8 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugter von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen enthält, mit von etwa 2 bis etwa 10 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol. Etwa 2 bis etwa 7 Mol Ethylenoxid und am bevorzugtesten etwa 2 bis 5 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol liegen in dem Kondensationsprodukt vor. Beispiele von kommerziell erhältlichen nicht ionischen Surfactanten dieses Typs umfassen Tergitol^TM 15-S-9 (das Kondensationsprodukt eines C₁₁-C₁₅ linearen Alkohols mit 9 Mol Ethylenoxid), Tergitol^TM 24-L-6 NMW (das Kondensationsprodukt eines C₁₂-C₁₄ primären Alkohols mit 6 Mol Ethylenoxid mit einer engen Molekulargewichtsverteilung), beide werden von Union Carbid Corporation vermarktet; Neodol^TM 45-9 (das Kondensationsprodukt eines C₁₄-C₁₅ linearen Alkohols mit 9 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 23-3 (das Kondensationsprodukt eines C₁₂-C₁₃ linearen Alkohols mit 3,0 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-7 (das Kondensationsprodukt eines C₁₄-C₁₅ linearen Alkohols mit 7 Mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-5 (das Kondensationsprodukt eines C₁₄-C₁₅ linearen Alkohols mit 5 Mol Ethylenoxid), vermarktet von der Shell Chemical Company, Kyro^TM EOB (das Kondensationsprodukt eines C₁₃-C₁₅ Alkohols mit 9 Mol Ethylenoxid), vermarktet von The Procter & Gambel Company, und Genapol LA 050 (das Kondensationsprodukt eines C₁₂-C₁₄ Alkohols mit 5 Mol Ethylenoxid), vermarktet von Hoechst. Bevorzugte HLB-Bereiche dieser Produkte sind von 8 bis 11, bevorzugter von 8 bis 10.
Als nicht ionische Surfactanten des Surfactantensystems der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Alkylpolysaccharide, die in US 4,565,647 offenbart sind nützlich die eine hydrophobe Gruppe mit von etwa 6 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 16 Kohlenstoffatomen und eine Polysaccharid, z.B. ein polyglycosidische hydrophile Gruppe mit von etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 1,3 bis etwa 3, am bevorzugtesten von etwa 1,3 bis etwa 2,7 Saccarideinheiten aufweist. Jedes reduzierende Saccharid mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen kann verwendet werden, z.B. Glucose, Galactose, und die Galactosyl-Reste können für die Glucosyl-Reste substituiert sein (optional ist die hydrophobe Gruppe an den 2-, 3-, 4- etc. Positionen angebunden, womit eine Glucose oder Galactose im Gegensatz zu einem Glucosid oder einem Galactosid erhalten wird). Die Intersaccharidbindungen können zwischen einer Poition der zusätzlichen Polysaccharideinheiten und den 2-, 3-, 4- und/oder 6-Positionen an den vorhergehenden Saccharid-Einheiten sich befinden.
Die bevorzugten Alkylpolyglycoside haben die Formel R²O(C_nH_2nO)_t(Glycosyl)_x, in der R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkylphenyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkylphenyl und Mischungen davon, wobei die Alkylgruppe von etwa 10 bis etwa 18, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa 14 Kohlenstoffatomen enthält, n steht für 2 oder 3, vorzugsweise 2; t beträgt von 0 bis etwa 10, vorzugsweise 0, und x ist von etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 1,3 bis etwa 3, am bevorzugtesten von etwa 1,3 bis etwa 2,7. Das Glycosyl stammt bevorzugt von der Glucose. Um diese Verbindungen herzustellen, wird zuerst der Alkohol oder Alkylpolyethoxyalkohol gebildet und dann mit Glucose oder einer Glucosequelle umgesetzt, um das Glycosid zu bilden (Anbindung an die 1-Position). Die zusätzlichen Glycosyl-Einheiten können dann zwischen ihrer 1-Position und den vorhergehenden Glycosyleinheiten-Positionen 2-, 3-, 4- und/oder 6-, vorzugsweise hauptsächlich an der 2-Position, angebunden werden.
Das Kondensationsprodukt von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol hergestellt wird, ist als zusätzliches nicht ionisches Surfactant-System in der vorliegenden Erfindung geeignet. Der hydrophobe Teil dieser Verbindungen wird vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1 500 bis etwa 1 800 haben und Wasserunlöslichkeit zeigen. Die Zugabe von Polyoxyethylen-Resten zu diesem hydrophoben Teil tendiert dazu, die Wasserlöslichkeit der Moleküls als ganzes zu erhöhen, und der flüssige Charakter des Produkts wird bis zu dem Punkt beibehalten, an dem der Polyoxyethylengehalt etwa 50 % des Gesamtgewichts des Kondensationsproduktes beträgt, das der Kondensation mit bis zu 40 Mol Ethylenoxid entspricht. Beispiele von Verbindungen dieses Typs umfassen bestimmte kommerziell erhältliche Pluronic^TM-Surfactanten, die von der BASF vermarktet werden.
Als nicht ionisches Surfactant für das nicht ionische Surfactant-System der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit dem Produkt geeignet, das aus der Reaktion von Propylenoxid und Ethylendiamin resultiert. Der hydrophobe Rest dieser Produkte besteht aus dem Reaktionsprodukt von Ethylendiamin und einem Überschuss an Propylenoxid und besitzt im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 2 500 bis etwa 3 000. Dieser hydrophobe Rest wird mit Ethylenoxid in dem Maß kondensiert, dass das Kondensationsprodukt von etwa 40 Gew.-% bis 80 Gew.-% Polyoxyethylen enthält und ein Molekulargewicht von etwa 5 000 bis etwa 11 000 aufweist. Beispiele dieser Art nicht ionischer Surfactanten umfassen bestimmte kommerziell erhältliche Tetronic^TM-Verbindungen, die von der BASF vermarktet werden.
Bevorzugt zur Verwendung als nicht ionische Surfactanten für das Surfactantensystem der vorliegenden Erfindung sind Polyethylenoxidkondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit von etwa 1 bis etwa 25 Mol Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Mischungen davon, Am bevorzugtesten sind C8-C14 Alkylphenolethoxylate mit von 3 bis 15 Ethoxygruppen und C8-C18 Alkoholethyoxylate (vorzugsweise C10 im Durchschnitt) mit von 2 bis 10 Ethoxygruppen und Mischungen davon.
Hoch bevorzugte nicht ionische Surfactanten sind Polyhydroxyfettsäureamid-Surfactanten der Formel
in der R¹ für H steht oder R¹ ist C1-4-Hydoxycarbyl, 2-Hydoxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder eine Mischung davon, R² ist C5-31-Hydrocarbyl und Z ist ein Polyhydroxyhydrocarbyl mit einer linearen Hydoxycarbylkette mit midestens drei Hydroxylen, die direkt mit der Kette verbunden ist, oder ein alkoxyliertes Derivat davon. Bevorzugt ist R¹ Methyl, R² ist ein geradkettiges C11-15 Alkyl oder C16-18-Alkyl oder eine Alkenyl-Kette, wie Kokusnuss-Alkyl oder Mischungen davon, und Z ist abgeleitet von einem in der reduktiven Aminierungsreaktion reduzierenden Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose oder Lactose.
Hoch bevorzugte anionische Surfactanten umfassen alkylalkoxyilierte Sulfat-Surfactanten. Beispiele davon sind wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)_mSO₃M, in der R eine unsubstituierte C10-C24-Alkyl- oder Hydroxyalkyl-Gruppe mit C10-C24 Alkylkomponente ist, vorzugsweise C12-C20-Alkyl oder Hydroxyalkyl, bevorzugter C12-C18-Alkyl oder Hydroxyalkyl, A ist eine Ethoxy- oder Propoxy-Einheit, m ist größer als Null, typischerweise zwischen etwa 0,5 und etwa 6, bevorzugter zwischen etwa 0,5 und etwa 3, und M ist H oder ein Kation, das z.B. ein Metallkation (z.B. Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium etc.), Ammonium oder substituiertes Ammonium-Kation. Alkylethoxylierte Sulfate sowie alkylpropoxylierte Sulfate werden hier in Betracht gezogen. Spezifische Beispiele substituierter Ammoniumkationen umfassen Methyl-, Dimethyl-, Trimethyl-Ammonium-Kationen und quarternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium- und Dimethylpiperidinium-Kationen und diejenigen, die von Alkylaminen, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin und Mischungen davon und dergleichen, abgeleitet sind. Beispielhafte Surfactanten sind C12-C18-Alkylpolyethoxylat (1,0)sulfat(C12-C18 E (1,0)M) C12-C18-Alkylpolyethoxylat (2,25) sulfat (C12-C18(2,25)M und C12-C18-Alkylpolyethoxylat (3,0) sulfat (C12-C18E(3,0)M) und C12-C18-Alkylpolyethoxylat (4,0) sulfat (C 12-C18E(4,0)M), wobei M üblicherweise unter Natrium und Kalium ausgewählt ist. Geeignete anionische Surfactanten, die verwendet werden sollen, sind Alkylester-sulfonat-Surfactanten, einschließlich lineare Ester von C8-C20-Carboxylsäuren (d.h. Fettsäuren), die mit gasförmigem SO₃ gemäß dem „The Journal of the American Oil Chemist Society", 52 (1975), Seiten 323–329 sulfoniert wurde. Geeignete Ausgangsmaterialien würden natürliche fettige Substanzen umfassen, wie sie von Talg und Palmöl abgeleitet werden.
Die bevorzugten Alkylestersulfonat-Surfactanten, insbesondere für Waschanwendungen, umfassen Alkylestersulfonat-Surfactanten der Strukturformel
in der R³ ein C8-C20-Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl, oder Kombinationen davon ist, R⁴ ein C1-C6-Hydrocarbyl, vorzugsweise ein Alkyl, oder eine Kombination davon ist, und M ein Kation ist, das ein wasserlösliches Salz mit dem Alkylestersulfonat bildet. Geeignete Salz-bildende Kationen umfassen Metalle, wie Natrium, Kalium und Lithium und substituierte oder unsubstituierte Ammoniumkationen, wie Monoethanolamin, Diethanolamin und Triethynolamin. Vorzugsweise ist R³ C10-C16-Alkyl, und R⁴ ist Methyl, Ethyl oder Isopropyl, Besonders bevorzugt sind die Methylestersulfonate, in denen R³ C10-C16-Alkyl ist.
Andere geeignete anionische Surfactanten umfassen Alkylsulfatsurfactanten, die wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO₃M sind, in denen R vorzugsweise ein C10-C24-Hydrocarbly, vorzugsweise ein Alkyl, oder -Hydoxyalky mit C10-C20-Alkylkomponente, bevorzugter ein C12-C18-Alkyl oder -Hydroxalkyl, und M ist H oder ein Kation, z.B. ein Alkalimetallkation (z.B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium (z.B. Methyl-, dimethyl- und Trimethylammonium-Kationen und quarternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium und Dimethylpiperidinium-Kation und quarternäre Ammoniumkationen, die von Alkylaminen, wie Ethylamin, Diethylamin und Triethylamin und Mischungen davon abgeleitet sind, und der gleichen. Typische Alkylketten yon C12-C16 sind für niedrigere Waschtemperaturen (z.B. unter 50 °C) bevorzugt, und C16-C18-Alkylketten sind für höhere Waschtemperaturen (z.B. über etwa 50 °C) bevorzugt.
Andere anionische Surfactanten, die für die Zwecke als Reinigungsmittel nützlich sind, können auch in der Waschdetergenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst sein. Diese umfassen Salze (einschließlich z.B. Natrium, Kalium, Ammonium und substituierte Ammonium-Salze wie Mono-, Di-, und Triethanolaminsalze) einer Seife, C8-C22 primäre oder sekundäre Alkansulfonate, C8-C24 Olefinsulfonate, sulfonierte Polycarbonsäuren, die durch Sulfonierung der pyrolysierten Produkts eines Alkalierdmetall-Citrats, wie es z.B. in der Britischen Patentbeschreibung Nr. 1,082,179 beschrieben ist, C8-C24-Alkylpolyglycolethersulfate (die bis zu 10 Mol ethylenoxid enthalten), Alkylglycerolsulfonate, Fettacylglycerolsulfonate, Fettoleylglycerolsulfate, Alkylphenolethylenoxidethersulfate, Paraffinsulfonate, Alkylphosphate, Isethionate, wie Acylisethionat, N-Acyltaurate, Alkylsuccinamate und Sulfocuccinate, Monoester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C12-C18-Monoester) und Diester von Sulfocuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C6-C12-Diester), Acylsarcosinate, Sulfate und Alkylpolysaccharide, wie die Sulfate von Alkylpolyglucosiden (die nicht ionischen nicht sulfatierten Bestandteile werden nachfolgend beschrieben), verzweigte primäre Alkylsulfate und Alkylpolyethoxycarboxylate, wie die der Formel RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO-M+, in der R ein C8-C22-Alkyl ist, k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, und M ein ein lösliches Salz bildendes Kation ist. Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren sind auch geeignet, wie Kolophonium, hydriertes Kolophonium und Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren in oder abgeleitet von Tallöl.
Alkylbenzolsulfonate sind hoch bevorzugt. Insbesondere bevorzugt sind lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), in denen die Alkylgruppen bevorzugt von 10 bis 18 Kohlenstoffatomen enthalten.
Weitere Beispiele sind in „Surface Active Agents and Detergents" (Vol. I und II von Schwartz, Perry und Berch) beschrieben. Eine Vielzahl von solchen Surfactanten sind auch im allgemeinen in US 3,929,678 (Spalte 23, Zeile 58 bis Spalte 29, Zeile 23, die durch Bezugnahme aufgenommen wird) offenbart.
Wenn es darin enthalten ist, umfasst die Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung typischerweise von etwa 1 % bis etwa 40 %, vorzugsweise von etwa 3 % bis etwa 20 % des Gewichts an solchen anionischen Surfactanten.
Die Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch kationische, ampholytische, zwitterionische und semipolare Surfactanten sowie nicht ionische und/oder anionische Surfactanten, die anders als die vorstehend beschriebenen sind, umfassen.
Kationische Reinigungsmittelsurfactanten, die zur Verwendung in der Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind diejenigen, die eine langkettige Hydrocarbylgruppe besitzen. Beispiele solcher kationischer Surfactanten umfassen Ammoniumsurfactanten wie Alkylttrimethylammoniumhalogenide und die Surfactanten, die die Formel [R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N⁺ Xin der R² eine Aklyl- oder Alkylbenzyl-Gruppe mit von etwa 8 bis etwa 18 Kohlensotffatomen ind er Alkylkette ist, jedes R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)-, CH₂CH(CH₂OH)-, -CH₂CH₂CH₂- und Mischungen davon, jedes R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C4-Alkyl, C1-C4-Hydroxyalkyl, Benzylringstrukturen, die durch Verbinden der zwei R⁴-Gruppen gebildet werden, -CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH, in der R⁶ irgendeine Hexose oder Hexosepolymer mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1 000, und Wasserstoff ist, wenn y nicht 0 ist, R⁵ ist das gleiche wie R⁴ oder ist eine Alkylkette, in der die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome oder R² plus R⁵ nicht mehr als etwa 18 ist, jedes y von 0 bis etwa 10 beträgt und die Summe der y-Werte von 0 bis 15 beträgt, und X jedes kompatible Anion ist.
Hoch bevorzugte kationische Surfactanten sind die wasserlöslichen quarternären Ammoniumverbindungen, die in der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind, die die Formel R₁R₂R₃R₄N⁺X^– (i)in der R₁ ein C8-C16-Alkyl ist, jedes von R₂, R₃ und R₄ unabhängig ein C1-C4-Alkyl, ein C1-C4-Hydroxyalkyl, Benzyl und -(C₂H₄₀)_xH ist, in dem x einen Wert von 2 bis 5 hat und X ein Anion ist. Nicht mehr als eines von R₂, R₃ oder R₄ sollte Benzyl sein.
Die bevorzugte Alkylkettenlänge für R₁ ist C12-C15, insbesondere wo die Alkylgruppe eine Mischung von Kettenlängen ist, die von Kokusnuss oder Palmkernöl stammt oder synthetisch von Olefinaufbau oder OXO-Alkoholsynthesen abgeleitet sind.
Bevorzugte Gruppen für R₂R₃ und R₄ sind die Methyl- und Hydroxyethyl-Gruppen, und das Anion X kann unter Halid-, Methosulphat-, Acetat- und Phosphat-Ionen ausgewählt sein.
Beispiele geeingeter quarternärer Ammonium-Bestandteile der Formel (i) für die Verwendung hier sind:
Kokusnusstrimethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokusnussmethyldihydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Decyltriethylammoniumchlorid;
Decyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -Bromid;
C12-C15-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokusnussdimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Myristlytrimethylammoniummethylsulphat;
Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid oder -bromid;
Lauryldimethyl(ethenoxy)₄ ammoniumchlorid oder -bromid;
Cholinester (Verbindungen der Formel (i) in der R₁ ist
Dialkylimidazoline [Verbindungen der Formel (i)].
Andere kationische Surfactanten, die hier nützlich sind, sind auch in der US 4,228,044 und in der EP 000 224 beschrieben.
Wenn es hier enthalten ist, umfasst die Waschdetergenzzusammensatzung der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 % bis etwa 25 %, vorzugsweises von etwa 1 % bis etwa 8 % des Gewichts eines solchen kationischen Surfactants.
Ampholytische Surfactanten sind auch für die Verwendung der Waschzusammensetzung der vorliegenden Erfindung geeignet. Diese Surfactanten könne breit als aliphatische Derivative sekundärer oder tertiärer Amine oder aliphatische Derivates herterocyclischer sekundärer und tertiärer Amine in denen der aliphatische Rest gerad- oder verzweigtkettig sein kann. Eine dieser aliphatischen Substituenten enthält mindestens 8 Kohlenstoffatome, typischerweise von etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatome, und mindestens einer enthält ein anionische wasserlöslichmachende Gruppe, z.B. Carboxy, Sulfonat, Sulfat, siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeilen 18 . 35) für Beispiele ampholytischer Surfactanten.
Wenn es darin enthalten ist, umfasst die Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 % bis etwa 15 %, vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 10 % des Gewichts einer solchen ampholytischen Surfactants.
Zwitterionische surfactanten sind auch zur Verwendung in der Waschzusammensetzung geeignet. Diese Surfactanten können breit als Derivate sekundärer und tertiärer Amine, Dervate heterocyclischer sekundärer und tertiärer Amine oder Derivate quarternärer Ammonium-, quarternärer Phosphonium oder tertiärer Sulfonium-Verbindungen beschrieben werden, vgl. US 3,929,678 (Spalte 19, Zeile 38 bis Spalte 22, Zeile 48) für Beispiele zwitterionischer Surfactanten.
Wenn sie hier enthalten sind, umfasst die Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 % bis etwa 15 %, vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 10 % des Gewichts solcher zwitterionischer Surfactanten.
Semipolare nicht ionische Surfactanten sind eine spezielle Kategorie der nicht inonischen Surfactanten, die wasserlösliche Aminoxide umfassen, die enthalten einen Alkylrest von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Reste ausgewählt von der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen mit von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen; wasserlösliche Phosphinoxide mit einem Alkylrest von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Reste, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen mit von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen, und wasserlösliche Sulfoxide mit einem Alkylrest von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und einem Rest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkyl-Resten von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen.
Semi-polare nicht ionische Detergenzsurfactante umfassen die Aminoxide der Formel
in der R³ eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkylphenylgruppe oder eine Mischung davon ist, die von etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen enthält; R⁴ ist eine Alkylen- oder Hydroxyalkylen-Gruppe mit von etwa 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen oder Mischungen davon; x von 0 bis etwa 3 bedeutet; und jedes R⁵ ist eine Alkyl- oder Hydroxyalkyl-Gruppe mit von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen oder eine Polyethylenoxid-Gruppe mit von etwa 1 bis etwa 3 Ethylenoxid-Gruppen ist. Die R⁵-Gruppe kann an jedes andere, z.B. über das Sauerstoff- oder Stickstoffatom angebunden sein, um eine Ringstruktur zu bilden.
Diese Aminoxidsrufaktanten umfassen insbesondere C10-C18-Alkyldimethylaminoxide und C8-C12-Alkoxyethyldihydroxyethylaminoxide.
Wenn es darin enthalten ist, umfasst die Waschdetergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung typischerweise von 0,2 % bis etwa 15 %, vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 10 % des Gewichts eines solchen semi-polaren nicht ionische Surfactants.
Buildersystem
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin ein Buildersystem umfassen. Jedes herkömmliche Buildersystem ist zu Verwendung hierin geeignet, einschließlich Alumosilicat-Materialien, Silicate, Polycarboxylate und Fettsäuren, Materialien wie Ethylendiamintetraacetat, Metallionsequestranten, wie Aminopolyphosphonate, insbesondere Ethylendiamintetramethylenphosphonsäure und Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure. Obwohl wegen offensichtlichen Umweltgründen weniger bevorzugt, können auch Phosphatbuilder hier verwendet werden.
Geeignete Builder können anorganische Ionenaustauschmaterialien sein, üblicherweise ein anorganisches hydriertes Alumosilicatmaterial, insbesondere ein hydrierter synthetischer Zeolit, wie die hydrierten Zeolite A, X, B, HS oder MAP.
Ein anderes geeignetes anorganisches Buildermaterial ist ein geschichtetes Silicat, z.B. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 ist ein kristallines Schichtsilicat, das aus Natriumsilicat (Na₂Si₂O₅) besteht.
Geeignete Polycarboxylate, die eine Carboxyl-Gruppe enthalten, umfassen Miclchsäure, Glycolsäure und Ether-Derivate davon, wie sie in den Belgischen Patenten Nr. 831,368, 821,369 und 821,370 offenbart sind. Polycarboxylate, die zwei Carboxyl-Gruppen enthalten, umfassen die wasserlöslichen Salze der Succinsäure, Malonsäure, (Ethylendioxid)diessigsäure, Maleinsäure, Diglycolsäure, Weinsäure, Tartronsäure und Fumarsäure, sowie die Ethercarboxylate, die in den Deutschen Offenlegungschriften 2,446,686 und 2,446,487, US 3,935,257 beschrieben sind, und die Sulfinylcarboxylate, die in dem Belgischen Patent Nr. 840,623 beschrieben sind. Polycarboxylate, die drei Carboxyl-Gruppen enthalten, umfassen insbesondere wasserlösliche Citrate, Aconitrate und Citraconate sowie Succinatderivate, wie die Carboxymethyloxysuccinate, die in dem Britischen Patent Nr. 1,379,241 beschrieben sind, Lactosuccinate, die in der Niederländischen Anmeldung 7205873 beschrieben sind, und Oxypolycarboxylat-Materialien, wie 2-Oxa-1,1,3-propantricarboxylate, die in dem Britischen Patent 1,387,447 beschrieben sind.
Polycarboxylate, die vier Carboxygruppen enthalten umfassen Oxidisuccinate, die in dem Britischen Patent Nr. 1,261,829 offenbart sind, 1,1,2,2-Ethantetracarboxylate, 1,1,3,3-Propantetracarboxylate mit Sulfosubstituenten, einschließlich der in den Britischen Patenten Nr. 1,398,421 und 1,398,422 und in der US 3,936,448 offenbarten Sulfocuccinat-Derivaten, und die sulfonierten pyrolysierten Citrate, die in dem Britischen Patent Nr. 1,082,179 beschrieben sind, während die Polycarboxylate, die Phosphon-Substituenten enthalten, in dem Britischen Patent Nr. 1,439,000 offenbart sind.
Alicyclische und heterocyclische Polycarboxylate umfassen Cyclopentan-cis,cis,cis-tetracarboxylate, Cyclopentadienidpentacarboxylate, 2,3,4,5-Tetrahydrofuran-cis,cis,cis-tetracarboxylate, 2,5-Tetrahydrofuran-cis-discarboxylate, 2,2,5,5-Tetrahydrofuran-tetracarboxylate, 1,2,3,4,5,6-Hexan-hexacarboxylate und Carboxymethyl-derivate von mehrwertigen Alkoholen, wie Sorbitol, Mannitol und Xylitol. Aromatische Porlycarboxylate umfassen Mellithsäure, Pyromellithsäure und die Phthalsäurederivate, die im Britischen Patent Nr. 1,425,343 offenbart sind.
Von den vorstehenden sind die bevorzugten Polycarboxylate die Hydroxy-Carboxylate, die bis zu drei Carboxy-Gruppen pro Molekül enthalten, insbesondere Citrate.
Bevorzugte Buildersysteme zur Verwendung in der vorliegenden Zusammensetzung umfassen eine Mischung aus wasserunlöslichen Aluminosilicat-Buildern, wie Zeolit A oder ein geschichtetes Silicate (SKS-6), und einen wasserlöslichen Carboxylatchelatbildner, wie Citronensäure.
Ein geeigneter Chelatbildner für den Einschluss in die Detergenzzusammensetzung gemäß der Erfindung ist Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure (EDDS) oder die Alkalimetall-, Alkalierdmetall-, Ammonium- oder substituierten Ammoniumsalze davon, oder Mischungen davon. Bevorzugte EDDS-Verbindungen sind die freien Säureformen und die Natrium- und Magnesiumsalze davon. Beispiele von solchen bevorzugten Salzen von EDDS umfassen Na₂EDDS und Na₄EDDS. Beispiele von solchen bevorzugten Magnesiumsalzen von EDDS umfassen MgEDDS und Mg₂EDDS. Die Magnesiumsalze sind am bevorzugtesten zum Einschluss in die Zusammensetzung gemäß der Erfindung.
Bevorzugte Buildersysteme umfassen Mischungen von wasserunlöslichen Aluminosilicatbuildern, wie Zeolit A, und einen wasserlöslichen Carboxylatchelatbildner, wie Citronensäure.
Andere Buildermaterialien, die Teil des Buildersystems zur Verwendung in der Kornzusammensetzung umfassen anorganische Materialien, wie Alkalimetallcarbonate, Bicarbonate, Silicate und organische Materialien, wie organische Phosphonate, Aminopolyalkylenphosphonate und Aminocarboxylate.
Andere geeignete wasserlösliche organische Salze sind Homo- oder Copolymersäuren oder ihre Salze, in denen die Polycarboxylsäure mindestens zwei Carboxylradikale umfasst, die von einander durch nicht mehr als zwei Kohlenstoffatome getrennt sind.
Polymere dieses Typs sind in der GB-A-1,596,756 offenbart. Beispiele solcher Salze sind Polyacrylate mit einem MW von 2 000–5 000 und ihre Copolymere mit Maleinanhydrid, solche Copolymere besitzen ein Molekulargewicht von 20 000 bis 70 000, insbesondere etwa 40 000.
Detergenzbuildersalze liegen normalerweise in Mengen von 5 % bis 80 % des Gewichts der Zusammensetzung vor. Bevorzugte Mengen des Builders für flüssige Detergenzien sind von 5 bis 30 %.
Enzyme
Bevozugte Detergenzzusammensetzungen umfassen zusätzlich zur Enzympräparation der Erfindung ein anderes Enzym oder andere Enzyme, die Reinigungsleistung bereitstellen und/oder für die Stoffschonug nützlich sind.
Solche Enzyme umfassen Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulase, Peroxidasen, Oxidasen (z.B. Laccasen).
Proteasen: Jede zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignete Protease kann verwendet werden. Geeignete Proteasen umfassen die von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung. Mirkobieller Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetische modifizierte Mutanten sind umfasst. Die Proteasen können eine Serinprotease, vorzugsweise eine alkalische mirkobielle Protease oder eine Trypsin-ähnliche Protease sein. Beispiele alkalischer Proteasen sind Subtilisine, insbesondere die von Baziellen stammen, z.B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispieles der Trypsin-ähnlichen Proteasen sind Trypsin (z.B. die vom Schwein oder Rind stammen) und Fusarium-Proteasen, die in der WO 89/06270 beschrieben sind.
Bevorzugte kommerziell erhältliche Proteaseenzyme umfassen die unter dem Handelsnamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) verkauften, die unter den Marken Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect und Purafect OXP von Genencor International verkauften und die unter den Marken Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes verkauften. Proteaseenzyme können in die Zusammensetzungen der Erfindungen in einer Menge 0,00001 % bis 2 % des Gewichts des Enzymproteins der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Gewichts des Enzymproteins der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % des Gewichts des Enzymproteins der Zusammensetzung, und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Gewichts des Enzymproteins der Zusammensetzung.
Lipasen: Jede Lipase, die zur Verwendung in einer alkalischen Lösung geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Lipasen umfassen die von bakteriellem oder fungalem Ursprung. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten werden umfasst.
Beispiele geeigneter Lipasen umfassen Humicola lanuginosa-Lipase, z.B. wie sie in der EP 258 068 und EP 305 216 beschrieben ist, Rhizomucor miehei-Lipase, z.B. wie sie in der EP 238 023 beschrieben ist, eine Candida-Lipase, wie C. antarctica-Lipase, z.B. die C. antarctica-Lipase A oder B, die in EP 214 761 beschrieben ist, eine Pseudonomase-Lipase, wie P. alcaligenes- und P. pseudoalcaligenes-Lipase, wie sie z.B. in der EP 218 272 beschrieben ist, eine P. cepacia-Lipase, z.B. wie sie in der EP 331 376 beschrieben ist, eine P. stutzeri-Lipase, wie sie z.B. in GB 1,372,034 beschrieben ist, eine P. fluorescence-Lipase, eine Bacillus-Lipase, z.B. B.subtilis-Lipase (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta 1131, 253–260), ein B. stearothermophils-Lipase (JP 64/744992) und eine B.pumilus-Lipase (WO 91/16422).
Ferner können eine Anzahl klonierter Lipasen nützlich sein, einschließlich Penicillium camembertii-Lipase, die von Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67 beschrieben ist, die Geotricum candidum-Lipase (Schimada, Y. Et al., (1989), J. Biochem., 106, 383, 388) und verschiedene Rhizopus-Lipasen, wie R.delemar-Lipase (Hass, M.J. Et al., (1991), Gene 109, 117–113), eine R.niveus-Lipase (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech Biochem. 56, 716–719) und R.oryzae-Lipase.
Andere Arten lipolytischer Enzyme, wie Cutinasen, können auch geeignet sein, z.B. eine Cutinase, die von Pseudomonas mendocina stammt, wie sie in der WO 88/09367 beschrieben ist, oder eine Cutinase, die von Fusarium solani pisi stammt (z.B. WO 90/09446).
Besonders geeignete Lippasen sind Lipasen wie M1 Lipase^TM Luma fast und Lipomax^TM (Genencor), Lipolase^TM und Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S) und Lipase P „Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Die Lipasen werden normalerweise in Mengen in der Detergenzzusammensetzung von 0,00001 % bis 2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % der Enzymproteingewichts der Zusammensetzung und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung inkorporiert.
Amylasen: Jede Amylase (a und/oder b), die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Amylasen umfassen die von bakteriellem oder fungalem Ursprung. Chemisch oder genetische modifizierte Mutanten sind umfasst. Amylasen umfassen, z.B. a-Amylasen, die von einem speziellen Stamm von B.licheniformis erhalten wird, der detailliert in GB 1,296,839 beschrieben ist. Kommerziell erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von NOVO Nordisk A/S) und Rapidase^TM und MaxamylP^TM (erhältlich von Genencor).
Die Amylasen werden normalerweise in der Detergenzzusammensetzung in einer Menge von 0,00001 % bis 2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung inkorporiert.
Cellulasen: Jede Cellulase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Cellulasen umfassen solche von bakteriellem oder fungalem Ursprung. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind umfasst. Geeignete Cellulasen sind offenbart in US 4,435,307 , in der fungale Cellulasen offenbart sind, die von Humicola insolens hergestellt werden, in WO 96/34108 und WO 96/34092, die bakterielle alkalophile Cellulase (BCE 103) von Bacillus offenbaren, und in WO 94/21801, US 5,475,101 und US 5,419,778 , die EG III-Cellulae von Trichoderma offenbaren. Besonders geeignete Cellulasen sind die Cellulasen, die einen Nutzen für den Farbschutz haben. Beispiele solcher Cellulasen sind die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 495 257 beschriebenen. Kommerziell erhältliche Cellulasen umfassen Celluzym^TN und Crezym^TM, die von einem Stamm von Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) hergestellt werden, KAC-500(B)^TM (Kao Corporation) und Purades^TM (Genencor International).
Cellulasen werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in Mengen von 0,00001 % bis 2 % des des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung inkorporiert.
Peroxidasen/Oxidasen: Peroxidaseenzyme werden in Verbindung mit Wasserstoffperoxid oder einer Quelle dafür (z.B. ein Percarbonat, Perborat oder Persulfat) verwendet. Oxidaseenzyme werden in Verbindung mit Sauerstoff verwendet. Beide Arten von Enzyme werden für das „Lösungsbleichen" eingesetzt, d.h. um den Transfer eines Textilfarbstoffes von einem gefärbten Stoff zu einem andern Stoff zu verhindern, wenn diese Stoffe zusammen in einer Waschflüssigkeit gewaschen werden, vorzugsweise zusammen mit einem Verstärkungsmittel, wie es z.B. in der WO 94/12621 und der WO 95/01426 beschrieben ist. Geeignete Peroxidasen/Oxidasen umfassen die von pflanzlichem, bakteriellem oder fungalem Ursprung. Chemische oder genetisch modifizierte Mutanten sind umfasst.
Peroxidase- und/oder Oxidae-Enzyme werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in Mengen von 0,00001 % bis 2 % des des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung inkorporiert.
Mischungen der vorstehend genannten Enzyme werden hier in Betracht gezogen, insbesondere Mischungen einer Peroxidase, einer Amylase, einer Lipase und/oder einer Cellulase.
Das erfindungsgemäße Enzym oder jedes andere Enzym, das in die Detegenzzusammensetzung inkorporiert ist, ist normalerweise in die Detergenzzusammensetzung in Mengen von 0,00001 % bis 2 % des des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von 0,0001 % bis 1 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung, bevorzugter in einer Menge von 0,001 % bis 0,5 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung und noch bevorzugter in einer Menge von 0,01 % bis 0,2 % des Enzymproteingewichts der Zusammensetzung inkorporiert.
Bleichmittel
Ein zusätzlicher optionaler Detergenzbestandteil, der in der Detergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, umfasst Bleichmittel, wie PB1, PB4 und Percarbonate mit einer Teilchengröße von 400–800 μm. Diese Bleichmittelkomponenten umfassen ein oder mehrer Sauerstoffbleichmittel und, abhängig vom gewählten Bleichmittel, einen oder mehrere Bleichaktivatoren. Wenn sie vorliegen, dann werden die Sauerstoffbleichverbindungen typrischerweise in Mengen von etwa 1 % bis etwa 25 % vorliegen. Im Allgemeinen sind Bleichbestandteile optional zugegebene Bestandteil in nicht flüssigen Formulierungen, z.B. in körnigen Detergenzien.
Der Bleichmittelbestandteil zur Verwendung hier kann jedes der Bleichmittel sein, die für Detergenzzusammensetzung geeignet ist, einschließlich Sauerstoffbleichen sowie andere, die auf dem Gebiet bekannt sind.
Das für die vorliegende Erfindung geeignete Bleichmittel kann ein aktiviertes oder nicht aktiviertes Bleichmittel sein.
Eine Kategorie eines Sauerstoffbleichmittels, das verwendet werden kann, umfasst Percarboxysäure-Bleichmittel und Salze davon. Geeignete Beispiele dieser Klasse von Agenzien umfassen Magnesiummonoperoxyphthalat-Hexahydrat, das Magnesiumsalz von meta-Chloroperbenzoesäure, 4-nonylamino-4-oxoperoxybuttersäure und Diperoxydodecandisäure. Solche Bleichmittel sind in US 4,483,781 , US 740,446 , EP 0 133 354 und US 4,412,934 offenbart. Hoch bevorzugte bleichmittel umfassen auch 6-Nonylamino-6-oxoperoxycapronsäure, wie sie in US 4,634,551 offenbart ist.
Eine andere Kategorie von Bleichmitteln, die verwendet werden kann, umfassen die Halogenbleichmittel. Beispiele von Hypohalitbleichmitteln umfassen z.B. Trichlorisocyanursäure und die Natrium- und Kaliumdichloisocyanurate und N-Chlor- und N-Bromalkansulphoamide. Solche Materialien werden normalerweise in 0,5 % bis 10 % des Gewichts des Endproduktes, vorzugsweise 1 bis 5 % des Gewichts zugegeben.
Die Wasserstoffperoxid-freisetzenden Mittel können in Verbindung mit den Bleichaktivatoren, wie Tetraacetylenethylendiamin (TAED), Nonaoyloxybenzolsulfonat (NOBS, beschrieben in US 4,412,934 ), 3,5-Trimethylhexanoloxybenzolsulfonat (ISONOBS, beschrieben in EP 120 591 ) oder Pentaacetylglucose (PAG), die perhydrolysiert werden, um eine Persäure als aktive Bleichspezies zu bilden, was zu einem verbesserten Bleicheffekt führt. Zusätzlich sind die Bleichaktivatoren C8(6-Octanamidocaproyl)-oxybenzol-sulfonat, C9(6-Nonanamidocaproyl)-oxybenzolsulfonat und C10 (6-Decanamidocaproyl)-oxybenzolsulfonat oder Mischungen davon sehr geeignet. Auch geeignete Aktivatoren sind acetylierte Citratester, wie die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 91870207.7 offebarten.
Nützliche Bleichmittel, einschließlich Peroxysäuren und Bleichsysteme, die Bleichaktivatoren und Peroxygen-Bleichverbindungen enthalten, zu Verwendung in der Reinigungszusammensetzung gemäß der Erfindung sind in der Anmeldung USSN 08/136,626 beschrieben.
Das Wasserstoffperoxid kann auch vorliegen durch Zugabe eines enzymatischen Systems (d.h. eines Enzyms und eines Substrats dafür), das zur Bildung von Wasserstoffperoxid am Beginn und während der Wasch- oder Spülprozesses fähig ist. Solche enzymatischen Systeme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 537 381 beschrieben.
Andere Bleichmittel als die Sauerstoffbleichmittel sind ebenfalls auf diesem Gebiet bekannt und können hier verwendet werden. Eine Art von nicht-Sauerstoff-Bleichmittel von besonderem Interesse umfasst photoaktive Bleichmittel, wie sulfonierte Zink- und/oder Aluminium-Phthalocyanine. Diese Materialien können auf dem Substrat während des Waschprozesses abgelagert werden. Nach der Bestrahlung mit Licht in Gegenwart von Sauerstoff, wie bei hängenden Kleidungsstücken zum Trocknen im Tageslicht, wird das sulfonierte Zinkphthalocyanin aktiviert und das Substrat wird folglich gebleicht. Bevorzugte Zinkphthalocyanine und ein photoaktivierter Bleichprozess sind in US 4,033,718 beschrieben. Typischerweise wird die Detergenzzusammensetzung etwa 0,025 % bis etwa 1,25 % des Gewichts an sulfoniertem Zinkphthalocyanin aufweisen.
Bleichmittel können auch einen Mangankatalysator enthalten. Der Mangankatylsator kann eine der Verbindungen sein, die in „Efficient manganes catalysts for low temperature bleaching", Nature 369, 1994, Seiten 637–639 beschrieben ist.
Seifenschaumsuppressoren
Ein anderer optionaler Bestandteil ist ein Seifenschaumsuppressor, exemplifizier durch Silicone und Siliciumdioxid-Silicon-Mischungen. Silicone können im Allgemeinen durch alkylierte Polysiloxanmaterialien repräsentiert sein, während Siliciumdioxid normalerweise in fein verteilten Formen verwendet wird, exemplifiziert durch Siliciumdioxid-Aerogele und hydrophobe Siliciumdioxide von verschiedenen Typen. Diese Materialien können als Teilchen inkorporiert werden, in denen der Seifenschaumsuppressor vorteilhafterweise in einem wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, im wesentlichen nicht oberflächenaktiven Detergenz-impermeablen Träger freisetzbar inkorporiert ist. Alternativ kann der Seifenschaumsuppressor in einem flüssigen Träger aufgelöst oder dispergiert sein und durch Sprühen auf einen oder mehrere andere Bestandteile angewendet werden.
Ein bevorzugtes Silicon-Seifenschaum-Kontrollmittel ist in US 3,933,672 offenbart. Andere besonders nützliche Seifenschaumsuppressoren sind die selbst-emulgierenden Silicon- Seifenschaumsuppressoren, die in der Deutschen Patentanmeldung DTOS 2,646,126 offenbart sind. Ein Beispiel einer solchen Verbindung ist DC-544, die kommerziell von Dow Corning erhältlich ist, die ein Siloxan-Glycol-Copolymer ist. Besonders bevorzugte Seifenschaum-Kontrollmittel sind die Seifenschaumsuppressor-Systeme, die eine Mischung von Siliconölen und 2-Alkyl-alkanole umfassen. Geeignete 2-Alkyl-alkanole sind 2-Butyl-octanol, das unter der Marke Isofol 12 kommerziell erhältlich ist.
Solche Seifenschaumsuppressoren-Systeme sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 593 841 beschrieben.
Besonders bevorzugte Silicon-Seifenschaum-Kontrollmittel sind in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 92201649.8 beschrieben. Solche Zusammensetzungen können ein Silicon/Siliciumdioxid-Gemisch in Verbindung mit nicht porösem Quartzstaub, wie Aerosil^R, umfassen.
Die vorstehend beschrieben Seifenschaumsuppressoren werden normalerweise in Mengen von 0,001 % bis 2 % des Gewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise von 0,01 % bis 1 % des Gewichts eingesetzt.
Andere Bestandteile
Andere in der Detergenzzusammensetzunng verwendete Bestandteil, wie Schmutzfleckensuspendierende, Schmutzflecken-freisetzende Mittel, optische Aufheller, Scheuermittel, Bakerizide, Mattierungsinhibitoren, Färbemittel und/oder verkapselte oder nicht verkapselte Perfume, können verwendet werden.
Besonders geeignete verkapselnde Materialien sind wasserlösliche Kapseln, die aus einer Polysaccarid- und Polyhydroxy-Matrix bestehen, wie sie in GB 1,464,616 beschrieben ist.
Andere geeignete wasserlösliche verkapselnde Materialien umfassen Dextrine, die von ungelatinisierten Stärkesäureestern von substituierten Dicarbonsäuren stammen, wie sie in US 3,455,838 beschrieben sind. Diese Säure-Ester-Dextrine werden vorzugsweise aus solcher Stärke hergestellt, wie wachsartigen Mais, wachsartiger Sorgho, Sago, Tapioka und Kartoffel. Geeignete Beispiele von diesen Verkapslungsmaterialien umfassen N-Lok, das von National Starch hergestellt wird. Das N-Lok-Verkapslungsmaterial besteht aus modifizierter Maisstärke und Glucose. Die Stärke ist modifiziert durch Zugabe von monofunktionellen substituierten Gruppen, wie Ocatenyl-Succinsäureanhydrid.
Antiwiederabscheidungsmittel und Schmutzflecken-Auflösungsmittel, die hier geeignet sind, umfassen Cellulosederivate, wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose und homo- oder copolymere Polycarbonsäuren und deren Salze. Polymere dieses Typs umfassen Polyacrylate und Maleinsäureanhydrid-Acrylsäure-Copolymere, die früher als Builder erwähnt wurden, sowie Copolymere von Maleinsäureanhydrid mit Ethylen, Methylvinylether oder Methacrylsäure, wobei die Maleinsäure mindestens 20 Mol-% des Copolymers ausmacht. Diese Materialien werden normalerweise in Mengen von 0,5 % bis 10 % des Gewichts, bevorzugter von 0,75 % bis 8 %, am bevorzugtesten von 1 % bis 6 % des Gewichts der Zusammensetzung eingesetzt.
Bevorzugte optische Aufheller sind anionischen Charakters, Beispiele davon sind Dinatrium-4,4'-bis-(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2'-disulfonat, Dinatrium4,-4'-bis-(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino-stilben-2:2-disulfonat, Dinatrium4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ylamino)stilben-2:2-disulfonat, Mononattrium-4,4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6ylamino)stilben-2-sulfonat, Dinatrium4,4'-bis-(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'-disulfonat, Dinatrium4,4'-bis-(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)-stilben-2,2'disulfonat, Dinatrium 4,4'bis(2anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-ylamino)stilben-2,2'disulfonat, Natrium 2 (stilbyl-4''-naphtho-1',2',:4,5)-1,2,3-triazol-2''-sulfonat und 4,4'-bis (2-sulphostyryl)biphenyl.
Andere geeignete polymere Materialien sind die Polyethylenglycole, insbesondere die mit einem Molekulargewicht von 1 000 bis 10 000, insbesondere 2 000 bis 8 000 und am bevorzugtesten von etwa 4 000. Diese werden in Mengen von 0,20 % bis 5 %, bevorzugt von 0,25 % bis 2,5 % des Gewichts eingesetzt. Diese Polymeren und die vorstehend genannten Homo- oder Copolymeren Polycarboxylatsalze sind wertvoll zur Verbesserung des Erhalts der Weissheit, Stoffascheabscheidung und Reinigunsleistung für Lehm, proteinartige und oxidierbare Verschmutzungen in Gegenwart von Übergangsmetallverunreinigungen.
Schmutzfleckfreisetzungungsmittl, die in der Zusammensetzung der Erfindung geeignet sind, sind üblicherweise Copolymere oder Terpolymere von Terephthalsäure mit Ethylenglycol- und/oder Propylenglycol-Einheiten in verschiedenen Anordnungen. Beispiele von solchen Polymeren sind in US 4,116,885 und 4,711,730 und EP 0 272 033 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Polymer gemäß der EP 0 272 033 hat die Formel (CH₃(PEG)₄₃)_0,75(POH)_0,25[T-PO)_2,8(T-PEG)_0,4]T(POH)_0,25((PEG)₄₃CH₃)_0,75 wobei PEG für -(OC₂H₄)O-, PO für (OC₃H₆O) und T für (pOOC₆H₄CO) steht.
Auch sehr geeignet sind modifizierte Polyester als Randomcopolymere von Dimethylterephthalat, Dimethylsulfoisophthalate, Ethylenglycol und 1,2-Propandiol, die Endgruppen bestehen primär aus Sulfobenzoat und sekundär aus Monoester von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol. Es ist das Ziel, ein Polymer zu erhalten, dass an beiden Enden mit Sulfobenzoat-Gruppen abgedeckt ist, primär wird im vorliegenden Kontext das Meiste des Copolymers hier mit Sulfobenzoat-Gruppen abgedeckt sein. Einige Polymere werden aber weniger als vollständig abgedeckt sein, und daher können ihre Endgruppen aus Monoestern von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol bestehen, somit besteht sekundär aus dieser Spezies.
Die hier ausgewählten Polyester enthalten etwa 46 % des Gewichts an Dimethylterephthalsäure, etwa 16 % des Gewichts an 1,2-Propandiol, etwa 10 % des Gewichts an Dimethylsulfobenolsäure und etwa 15 % des gewichts an Sulfoisophthalsäure, und sie besitzen ein Molekulargewicht von etwa 3 000. Die Polyester und ihre Herstellverfahren sind detailliert in EP 311 342 beschrieben.
Weichmacher
Stoffweichmacher könne auch in die Waschdetergenzzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung inkorporiert werden. Diese Mittel können anorganischer oder organischer Art sein. Anorganische Weichmacher sind exemplifiziert in smectitischem Ton, der in GB-A-1 400898 und in US 5,019,292 offenbart ist. Organische Gewebeweichmacher umfassen die wasserlöslichen tertiären Amine, wie sie in GB-A1 514 276 und EP 0 011 340 offenbart sind, und ihre Kombination mit mono-C12-C14-quarternären Ammoniumsalzen sind in der EP-B-0 026 528 offenbart, und di-langkettige Amide, wie sie in der EP 0 242 919 offenbart sind. Andere geeignete organische Bestandteile von Stoffweichmachersystemen umfassen Polyethylenoxidmaterialien mit hohem Molekulargewicht, wie sie in der EP 0 299 575 und 0 313 146 offenbart sind.
Die Mengen des smectitischen Tons liegen normalerweise im Bereich von 5 % bis 15 %, bevorzugter von 8 % bis 12 % des Gewichts, wobei das Material als trockene gemischte Komponente zum Rest der Formulierung gegeben wird. Organische Stoffweichmachermittel, wie wasserunlösliche tertiäre Amine in di-langkettigen Amidmaterialien werden in Mengen von 0,5 % bis 5 % des Gewichts inkorporiert, normalerweise von 1 % bis 3 % des Gewichts, während die Polyethylenoxid-Materialien mit hohem Molekulargewicht und die wasserlöslichen kationischen Materialien in Mengen von 0,1 % bis 2 %, normalerweise von 0,15 % bis 1,5 % des Gewichts, zugegeben werden. Diese Materialien werden normalerweise zu dem sprühgetrocknetem Teil der Zusammensetzung gegeben, obwohl in einigen Fällen es bequemer sein kann, sie als trockene gemischte Teilchen zuzugeben oder sie als geschmolzene Flüssigkeit auf die anderen festen Komponenten der Zusammensetzung aufzusprühen.
Polymere Farbstofftransfer-inhibierende Mittel
Die Detergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch von 0,001 % bis 10 %, vorzugsweise von 0,01 % bis 2 %, bevorzugter von 0,5 % bis 1 % des Gewichts eines polymeren, den Farbstofftransfer-inhibierenden Mittels enthalten. Diese polymeren, den Farbstofftransfer-inhibierenden Mittel werden normalerweise in die Detergenzzusammensetzung inkorporiert, um den Transfer der Farbstoffe von gefärbten Stoffen auf damit gewaschenen Stoffe zu verhindern. Diese Polymere besitzen die Fähigkeit, die unechten Farbstoffe zu komplexieren oder zu adsorbieren, die aus gefärbten Stoffen ausgewaschen werden, bevor die Farbstoffe die Möglichkeit haben, an andere Gegenstände in der Wäsche anzubinden.
Besonders geeignete polymere Mittel, die den Farbstofftransfer inhibieren, sind Polyamine-N-Oxidpolymere, Copolymere von N-Vinylpyrrolidon und N-Vinylimidazol, Polyvinylpyrrolidon- Polymere, Polyvinyloxazolidone und Polyvinylimidazole oder Mischungen davon.
Die Zugabe solcher Polymere steigert die Leistung von erfindungsgemäßen Enzymen.
Die erfindungsgemäße Detergenzzusammensetzung kann in Form einer Flüssigkeit, einer Paste, Gelen, Riegeln oder Teilchen vorliegen.
Nicht staubende Granulate können hergestellt werden, wie es z.B. in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide von Novo Industri A/S) offenbart ist, und sie können optional mit auf dem Gebiet bekannten Verfahren überzogen werden. Beispiele von Waxüberzugsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 1 000 bis 20 000, ethoxylierte Nonylphenole mit von 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten, ethoxylierte Fettalkohole, in denen der Alkohol von 12 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält und in denen 15 bis 80 Ethylenoxideinheiten vorliegen, Fettalkohole, Fettsäuren und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele von Film-bildenden Materialien, die für Anwendungen für Fließbetttechniken geeignet sind, sind in der GB 1483591 angegeben.
Granuläre Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in „kompakter Form" vorliegen, d.h. sie können eine relativ höhere Dichte als konventionelle granuläre Detergenzien aufweisen, z.B. von 550 bis 950 g/l; in einem solchen Fall wird die granuläre Detergenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine niedrige Menge von „anorganischen Füllsalzen", verglichen mit konventionellen granulären Detergenzien, enthalten; typische Füllsalze sind Alkalierdmetallsalze von Sulfaten und Chloriden, typischerweise Natriumsulfat; „kompakte" Detergenzien umfassen typischerweise nicht mehr als 10 % Füllsalz. Die flüssige Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in „konzentrierter Form" vorliegen, in einem solchen Fall wird die flüssige Detergenzzusammesetzung der vorliegenden Erfindug eine niedrigere Menge Wasser enthalten, verglichen mit konventionellen flüssigen Detergenzien. Typischerweise beträgt der Wassergehalt des konzentrierten flüssigen Detergenz weniger als 30 %, bevorzugter weniger als 20 % und am bevorzugtesten weniger als 10 % des Gewichts der Detergenzzusammensetzung.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können z.B. als Hand- und Maschinenwaschdetergenz-Zusammensetzung einschließlich Waschadditivzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei der Vorbehandlung von fleckigen Stoffen, zum Spülen zugegebene Stoffweichmacherzusammensetzunge und Zusammensetzungen zur Verwendung für allgemeine Handlungen zum Reinigen harter Oberflächen im Haushalt und Handlungen zum Geschirrspülen formuliert sein.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu exemplifizieren, aber nicht notwendigerweise um den Gegenstand der Erfindung einzuschränken oder in anderer Weise zu definieren. In den Detergenzzusammensetzungen haben die abgekürzten Komponentenidentifikationen die folgende Bedeutung:

LAS:: Natriumsalz des linearen C12-Alkylbenzolsulfonat
TAS:: Natriumtalgalkylsulfat
XYAS:: Natrium C_1x-C_1y-Alkylsulfat
SS:: Sekundäres Seifensurfactant der Formel 2-Butyloctansäure
25EY:: ein hauptsächlich linearer primärer C12-C15-Alkohol, kondensiert mit durchschnittlich Y Mol Ethylenoxide
45EY:: ein hauptsächlich linearer primärer C14-C15-Alkohol, kondensiert mit durchschnittlich Y Mol Ethylenoxide
XYEZS:: Natrium C_1x-C_1y-Alkylsulfat, kondensiert mit durchschnittlich Z Mol Ethylenoxid pro Mol
Nichtionogenes Tensid:: gemischter C13-C15 ethoxylierter/propoxylierter Fettalkohol mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3,8 und einem durchschnittlichen Propoxylierungsgrad von 4,5, der unter der Marke Plurafax verkauft wird
LF404: von Bayer GmbH
CFAA:: C12-C14-Alkyl-N-Methylglucamid
TFAA:: C16-C18-Alkyl-N-Methylglucamid
Silicat:: Amorphes Nattriumsilicat (SiO₂:Na₂O-Verhältnis = 2,0)
NaSKS-6:: Kristallines geschichtetes Silicat der Formel d-Na₂Si₂O₅
Carbonat:: wasserfreies Natriumcarbonat
Phosphat:: Natriumtripolyphosphat
MA/AA:: Copolymer aus 1:4 Malein-/Acrylsäure, mittleres Molekulargewicht etwa 80 000 Poylacrylat Polyacrylat-Homopolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 8 000, unter der Marke PA 30 von der Bayer GmbH verkauft
Zeolit A:: hydratisiertes Natrium-Aluminiumsilicat der Na₁₂(AlO₂SiO₂)₁₂·27 H₂O mit einer primären Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 μm
Citrat:: Tri-natrium-citrat dihydrat
Citric:: Citronensäure
Perborat:: wasserfreie Natriumperborat-Monohydrat-Bleiche der empirischen Formel NaBO₂·H₂O₂
PB4:: wasserfreies Natriumperborat-Tetrahydrat
Percarbonat:: wasserfreie Natriumpercarbonat-Bleiche der empirischen Formel 2Na₂CO₃·3H₂O₂
TAED:: Tetraacetylethylendiamin
CMC:: Natriumcarboxylmethylcellulose
DETPMP:: Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure), von Monsanto unter der Marke Dequest 2060 vermarktet
PVP:: Polyvinylpyrrolidon-Polymer
EDDS:: Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure-[S,S]-Isomer in Form des Natrium-Salzes
Seifenschaum-Suppressor:: 25 % Paraffinwach, Smp 50 °C, 17 % Hydrophobes Siliciumdioxid, 58 % Paraffinöl
Granulärer Seifenschaumsuppressor:: 12 % Silicon/Siliciumdioxid, 18 % Stearyl-Alkohol, 70 Stärker in granulärer Form
Sulfat:: wasserfreies Natriumsulfat
HMWPEO:: Polyethylenoxid mit hohem Molekulargewicht
TAE 25:: Talgalkoholethoxylat (25)

Detergenzbeispiel I

Eine granuläre Stoffreinigungszusammensetzung gemäß der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden:

Natrium-lineares C12-Alkyl	6,5
Benzolsulfonat
Natriumsulfat	15,0
Zeolit A	26,0
Natrium-Nitrilotriacetat	5,0
erfindungsgemäßes Enzym	0,1
PVP	0,5
TAED	3,0
Borsäure	4,0
Perborat	18,0
Phenolsulfonat	0,1
Nebenbestandteile	auf 100

Detergenzbeispiel II
Eine kompakte granuläre Stoffreinigungszusammensetzung (Dichte 800 g/l) gemäß der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden:

45AS 8,0

25E3S 2,0

25E5 3,0

25E3 3,0

TFAA 2,5

Zeolit A 17,0

NaSKS-6 12,0

Citronensäure 3,0

Carbonat 7,0

MA/AA 5,0

CMC 0,4

erfindungsgemäßes Enzym 0,1

TAED 6,0

Percarbonat 22,0

EDDS 0,3

granulärer Seifenschaumsuppressor 3,5

Wasser/Nebenbestandteile auf 100%
Detergenzbeispiel III
Granuläre Stoffreinigungszusammensetzungen gemäß der Erfindung, die besonders für das Waschen von gefärbten Stoffen geeignet ist, wird wie folgt hergestellt:
Detergenzusammensetzung IV
Granuläre Stoffreinigungszusammensetzung gemäß der Erfindung, die ein Fähigkeit zum „Weichmachen während des Waschens" hat, kann wie folgt hergestellt werden:
Detergenzbeispiel V
Flüssige Hochleistungs-Stoffreinigungs-Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann wie folgt hergestellt werden:
Verwendung in der Textil- und Cellulosefaser-verarbeitende Industrie
Im vorliegenden Zusammenhang ist beabsichtigt, dass der Ausdruck „Cellulosematerial" Fasern, genähte und nicht genähte Stoffe, einschließlich Strickwaren, Webwaren, Jeans, Garne und Handtücher, die aus Baumwolle, Baumwollmischungen oder natürliche oder von Menschen hergestellte Cellulosederivate (die z.B. von Xylan-enthaltenden Cellulosefasern stammmen, wie Holzpulpe) oder Mischungen davon, hergestellt sind. Beispiele von Mischungen sind Mischungen aus Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien wie Wolle, synthetischen Fasern (z.B. Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Cellulose-enthaltende Fasern (z.B. Rayon/Viskose, Ramie, Hanf, Flachs/Leinen, Jute, Celluloseacetatfasern, Lyocell).
Die Präparation der vorliegenden Erfindung ist nützlich in der Cellulosefasern-verarbeitenden Industrie für die Vorbehandlung oder Rösten der Fasern von Hanf, Flach oder Leinen.
Das Verarbeiten von Cellulosematerial für die Textilindustrie, z.B. Baumwollfasern, in ein Material, das für die Herstellung von Kleidungsstücken gebrauchsfertig ist, umfasst mehrere Schritte: Spinnen der Fasern in ein Garn; Erzeugung gewebter oder gestrickter Stoffe aus dem Garn und nachfolgend die Herstellungs-, Färbungs- und Finishing-Arbeitsoperationen. Gewebte Waren werden durch Weben eins Füllgarns zwischen einer Reihe von Kettengarnen erzeugt, wobei die Garne von zwei verschiedenen Arten sein können. Gestrickte Waren werden dadurch erzeugt, dass ein Netzwerk von ineinandergreifenden Schleifen von einer kontinuierlichen Länge des Garns gebildet wird.
Das Herstellungsverfahren stellt die Textilien für die geeignete Ansprechbarkeit auf das Färbeverfahren her. Die Unterschritte, die bei der Herstellung involviert sind, ist das Entschlichten (für gewebte Waren), Reinigen und Bleichen. Ein Verfahren bei dem Reinigen und Bleichen in einem Schritt kombiniert ist wird in der Industrie ebenfalls eingesetzt. Obwohl die Herstellungsverfahren am üblichsten im Stoffzustand angewendet werden, können die Arbeitsoperationen des Reinigens, Bleichens und Färbens auch auf der Stufe der Fasern oder Garne durchgeführt werden.
Das Verarbeitungssystem kann entweder chargenweise oder kontinuierlich sein, wobei der Stoff mit der flüssigen Verarbeitungsstrom in offener Form oder Form eines Warenstrangs in Kontakt gebracht wird. Kontinuierliche Arbeitsweisen benutzen üblicherweise einen Saturateur, wobei ein etwa gleiches Gewicht des chemischen Bades pro Gewicht des Stoffs auf den Stoff angewendet wird, gefolgt von einer erwärmten Verweilkammer, wo die chemische Reaktion stattfindet. Ein Waschabschnitt stellt dann den Stoff für den nächsten Verarbeitungsschritt bereit. Chargenweise Verarbeitung findet üblicherweise in einem Verarbeitungsbad statt, wobei der Stoff mit dem etwa 8 bis 15 fachen seines Gewichts im chemischen Bad in Kontakt gebracht wird. Nach einer Reaktionsperiode werden die Chemikalien abgelassen, der Stoff gespült und die nächste Chemikalie angewendet. Diskontinuierliche Foulard-Chargen-Verarbeitung beteilige einen Saturateur, wobei ein etwa gleiches Gewicht des chemischen Bades pro Gewicht des Stoffes auf den Stoff angewendet wird, gefolgt von einer Verweilperiode, die im Fall eines kalten Foulard-Chargen-Verfahrens einen oder mehrere Tage dauern kann.
Gewebte Waren sind die vorherrschende Form der Textilstoffmacharten. Der Webprozess erfordert ein Schlichten des Webkettengarns, um es vor Abrasionen zu schützen. Stärke, Polyvinylalkohol (PVA), Carboxymethylcellulose, Wachse und Acrylbinder sind Beispiele typischer Schlichtechemikalien, die wegen der Verfügbarkeit und Kosten verwendet werden. Die Schlichte muss nach dem Webprozess als erster Schritt in der Herstellung von gewebten Waren entfernt werden. Die geschlichteten Stoffe in Form entweder eines Warenstranges oder in offener Form wird mit der Verarbeitungflüssigkeit in Kontakt gebracht, die die Entschlichtungsmittel enthält. Die verwendeten Entschlichtungsmittel, die verwendet werden, hängen von der Art der Schlichte ab, die entfernt werden soll. Für PVA-Schlichten, werden oft heißes Wasser oder oxidative Prozess eingesetzt. Das üblichste Schlichtemittel für Baumwollfasern basiert auf Stärke. Daher werden gewebte Baumwollstoffe am häufigsten mit einer Kombination von heißem Wasser, dem Enzym α-Amylase, um die Stärke zu hydrolysieren, und einem Benetzungsmittel oder Surfactant entschlichtet. Das Cellulosematerial lässt man mit dem Entschlichtungsmittel für eine „Wartezeit" stehen, die ausreichend lang ist, um das Entschlichten auszuführen. Die Wartezeit hängt von der Art des Verarbeitungssystems und der Temperatur ab, und kann von 15 Minuten bis 2 Stunden variieren, oder in einigen Fällen mehrere Tage. Typischerweise wird die Entschlichtungs-Chemikalien in einem Saturateurbad angewendet, das im Allgemeinen von etwa 15 °C bis etwa 55 °C liegt. Der Stoff wird dann in einer Vorrichtung gehalten, wie eine „J-Box", die ausreichend Wärme liefert, üblicherweise zwischen etwa 55 °C und etwa 100 °C liegt, um die Aktivität des Entschlichtungsmittels zu erhöhen. Die Chemikalien, einschließlich der entfernten Schlichtemittel, werden vom Stoff abgewaschen, nachdem die Haltedauer beendet wurde.
Um eine hohe Weissheit oder eine gute Benetzbarkeit und eine resultierende Färbbarkeit sicher zu stellen, müssen die Schlichtechemikalien und andere angewendete Chemikalien gründlich entfernt werden. Es wird allgemein angenommen, dass ein effektives Entschlichten von entscheidender Wichtigkeit für die folgenden Herstellungsprozesse ist: Reinigen und Bleichen.
Der Reinugungsprozess entfernt vieles der Nicht-Cellulose-Materialien, die natürliche in Baumwolle gefunden werden. Zusätzlich zu den natürlichen Nicht-Cellulose-Verunreinigungen, kann das Reinigen Dreck, Schmutzflecken und restliche während der Herstellung eingeführte Materialien, wie Spinn-, Spul- oder Schlichte-Schmiermittel, entfernen. Der Reinigungsprozess verwendet Natriumhydroxid oder ähnliche Kaustifizierungsmittel, wie Natriumcarbonat, Kaliumhydroxid oder Mischungen davon. Im Allgemeinen wird ein Alkali-stabiles Surfactant zu dem Prozess zugegeben, um die Solubilisierung der hydophoben Verbindungen zu verstärken und/oder ihre Wiederabscheidung zurück auf den Stoff zu verhindern. Die Behandlung wird im allgemeinen bei einer hohen Temperatur, 80 °C bis 100 °C, durchgeführt, wobei eine stark alkalische Lösung, pH 13–14, des Reinigunsmittels eingesetzt wird. Wegen der nicht-spezifischen Natur der chemischen Prozesse werden nicht nur die Verunreinigungen sondern auch die Cellulose selbst angegriffen, was zu Schäden in der Festigkeit oder anderen erwünschten Stoffeigenschaften führt. Die Weichheit der Cellulosestoffe ist eine Funktion von zurückbleibenden natürlichen Baumwollwachsen. Die nicht spezifische Natur der stark alkalischen Reinigungsprozesses bei hohen Temperaturen kann nicht unterscheiden zwischen erwünschten natürlichen Baumwollgleitmitteln und den durch die Herstellung eingeführten Geitmitteln. Ferner kann der konventionelle Reinigungsprozess Umweltprobleme wegen der hoch alkalischen Abwässer aus dem Prozess verursachen. Der Reinigunsschritt bereitet die Stoffe für ein optimales Ansprechen beim Bleichen vor. Ein nicht geeignet gereinigter Stoff wird eine höhere Menge Bleichchemikalien in den nachfolgenden Bleichschritten benötigen.
Der Bleichschritt entfärbt die natürlichen Baumwollpigmente und entfernt jede restliche natürliche holzige Baumwoll-Verunreinigungskomponente, die nicht vollständig während der Entkörnung, dem Kardieren oder Reinigen entfernt wurden. Der heute hauptsächlich verwendete Prozess ist die Alkalihydroxid-Bleiche. In vielen Fällen, insbesondere wenn eine hohe Weissheit nicht erfordert wird, kann das Bleichen mit dem Reinigen kombiniert werden.
Es ist beabsichtigt, dass der Reinigungsschritt unter Verwendung der Xyloglucanase oder der Xyloglucanase-Präparation der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit wenigen anderen Enzymaktivitäten bei einer Temperatur von etwa 50 °C–80 °C und einem pH von etwa 7–11 durchgeführt wird, womit die hoch kaustifizierenden Mittel ersetzt oder ergänzt werden.
MATERIAL UND METHODEN
Pilzstämme

Malbranchea cinnamomea CBS960.72
Malbranchea cinnamomea CBS343.55
Malbranchea cinnamomea UAMH2485

Diese Stämme sind alles öffentlich verfügbare Stämme von anerkannten Kultursammlungen:

CBS- Centraalbureau voor Schimmelcultures Oosterstraat 1 Postbus 273 NL-3740 AG Baarn Niederlande
UAMH University of Alberta Microfungus Collection & Herbarium Devonian Botanic Garden Edmonton, AB, Canada T6G 2E1

Medien
YG: Hefe-Glucose-Aar

5,0 g Difco-gepulvertes Hefeextrakt; 10,0 g Glucose; 20,0 g Agar; 1000 ml Leitungswasser. Autoklaviert bei 121 °C während 15–20 Minuten.

Medium A pro Kolben

Weizenkleie 30 g; 45 ml der folgenden Lösung: 4 g Hefeextrakt, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄·7H₂O 15 g Glucose; 1 000 ml Leitungswasser. Autoklaviert bei 121 °C während 30 Minuten.

Medium B (50 ml/Kolben)

Sojamehl 30 g; 15 g Maltose; 5 g Pepton, 1 000 ml H₂O, 1g Olivenöl (2 Tropfen/Kolben). 50 ml in 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit Baffle. Autoklaviert bei 121 °C während 30 Minuten.

Fermentationsverfahren
Die Pilzstämme werden auf YG-Agarplatten (4,5 cm im Durchmesser) während 3 Tagen bei 45 °C im Dunkeln wachsen gelassen und zur Beimpfung von Schüttelkolben verwendet. Die Platten mit voll gewachsenen Kulturen werden bei 4 °C vor Verwendung gelagert.
Zur Enzymproduktion wurden 4 bis 6 Pfropfen mit voll gewachsenen Kulturen der obigen Platten verwendet, um einen Schüttelkolben mit mMedium B zu beimpfen und bei 45 °C, 160 U/min. während 12 bis 24 Stunden wachsen zu lassen und zur Beimpfung von Schüttelkolben mit Medium A zu verwenden, um genug Kulturbrühe zu erhalten.
Etwa 1 ml der obigen kultivierten Kulturbrühe wurde verwendet, um jeden Kolben mit Medium A zu beimpfen. Die beimpften Kolben wurden während 4 Tagen bei 45 °C und stationären Bedingungen wachsen gelassen.
Probenpräparation für Enzymaktivitätstests und Reinigung
Zu jedem Kolben mit Weizenkleie und voll gewachsenen Kulturen in Medium A wurden 150 ml Leitungswasser gegeben und mit einem sterilisierten Glassstab homogenisiert. Die Enzymextraktion wurde dadurch extrahiert, dass der Kolben bei 4 °C während 2 Stunden gelassen wurde. Die Kulturbrühe wurde dann bei 8 000 U/min. zentrifugiert und bei 4 °C während 30 Minuten, und der Überstand wurde gesammelt und auf Cellulase-, β-Glucanase- und Xyloglucanase-Aktivität getestet.
Enzymaktivitätstests
Agaroseplattentest
Agaroseplatten, die 1 % Agarose in in einem Phosphat-Citrat-Puffer pH 3, pH 7 und pH 10 enthalten, 0,1 % AZCL-Xyloglucan, 0,1 % AZCL-HE-Cellulose bzw. 0,1 % AZCL-β-Glucan (Megazym, Australien); 20 μl Probe wurde in die Löcher mit d = 4 mm in der Agaroseplatte eingebracht, Inkubation bei 45 °C während 12–16 Stunden. Die Enzymaktivität wurde durch eine Blau-Haloeffekt identifiziert.
Mirotiterplattentest
Eine Lösung von 0,2 % Blausubstrat-AZCL-Substrat (AZCL-Xyloglucan, AZCL-HE-Cellulose, AZCL-β-Glucan) wird in einem 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer (pH 9–11) oder Borax/NaH₂PO₄-Puffer (pH 7–9) oder Glycin-Puffer (pH 9–11) unter Rühren suspendiert. Die Lösung wird unter Rühren in Mikrotiterplatten (80 μl in jede Vertiefung) verteilt, 20 μm Enzymprobe wird zugegeben und sie werden in einem Eppendorf-Thermomischer während 1 Stunde bei 50 °C und 800 U/min inkubiert. Denaturierte Enzymproben (100 °C kochen während 20 Minuten) wurden als Leerwert verwendet. Nach der Inkubation wird die gefärbte Lösung von Feststoffen durch Zentrifugation bei 3 000 U/min während 5 Minuten bei 4 °C abgetrennt. 60 μl des Überstandes wurden in eine Mikrotiterplatte übertragen, und die Absorption mit einem BioRad-Mikrotiterplatten-Reader bei 595 nm gemessen.
Eppendorfröhrchentest
Eine Lösung von 0,2 % Blauesubstrat-AZCL-Substrat (AZCL-Xyloglucan, AZCL-HE-Cellulose, AZCL-β-Glucan) wird in einem 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer (pH 3–6) oder Borax/NaH₂PO₄-Puffer (pH 7–9) oder Glycin-Puffer (pH 9–11) unter Rühren suspendiert. Die Lösung wird unter Rühren in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (900 μl jedes) verteilt, 100 μl Enzymprobe wird zugegeben und sie werden in einem Wasserbad während 10 bis 60 Minuten bei 50 °C inkubiert. Denaturierte Enzymproben (kochen bei 100 °C während 20 Minuten) wurden als Leerwerte verwendet. Nach Inkubation wird die gefärbte Lösung von Feststoffen durch Zentrifugation bei 5 000 U/min während 10 Minuten bei 4 °C getrennt. 200 μl des Überstandes wurden in eine Mikrotiterplatte transferiert, und die Absorption mit einem BioRad-Mikrotiterplatten-Reader gemessen.
Isoelektrisches Fokusieren
Isoelektrisches Fokusieren wird in vorgefertigten Ampholine-PGA-Platten pH 3,5–9,5 (Pharmacia, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Proben wurden dreifach angewendet, und nach der Elektrophorese wurde das Gel in drei geteilt. Eine Überschicht mit 1 % Agarose und 0,4 % AZCL-Xyloglucan oder 0,4 % AZCL-HE-Cellulose oder 0,4 % AZCL-β-1,4-Glucan in Puffer mit ph 9 wurden auf jedes Teil des Gels gegossen. Inkubation erfolgte bei 45 °C während 12 bis 16 Stunden. Die Enzymaktivität und der pI des Enzymproteins wurden durch die blauen Zonen identifiziert.
Allgemeine molekularbiologische Methoden
Soweit nicht anders angegeben ist, wurden alle DNA-Manipulationen und -Transformationen unter Verwendung von Standardverfahren der Molekulabiologie (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (Hrsg.) „Current protocols in Molekular Biology", John Wiley and Sons, 1995) durchgeführt. Enzyme für DNA-Manipulationen wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet (z.B. Restriktionsendonucleasen, Ligasen etc. sind von New England Biolabs, Inc. erhältlich).
Plasmide

pYES 2.0 (Invitrogen, USA)
pMT2188

Konstruktion des Expressionsplasmides pMT2188
Das Aspergilllus oryzae-Expressionsplasmid pCaHj 483 (WO 98/00529) besteht aus einer Expressionscassette, die auf dem Promotor der neutralen Amylase II von Aspergillus niger basiert, der an die nicht translatierte Leadersequenz (Pna2/tpi) der Triose-Phosphat-Isomerase von Aspergillus nidulans und den Amyloglycosidase-Terminator (Tamg) von Aspergillus niger fusioniert ist. Ferner liegt auf dem Plasmid der Aspergillus-selektive Marker amdS von Aspergillus nidulans vor, der das Wachsen in Acetamid als einzige Stickstoff-Quelle erlaubt. Diese Elemente werden in den E. coli-Vektor pUC19 kloniert. Der Ampecillin-Resistenzmarker, der die Selektion des Plasmids in E. coli ermöglicht, wurde durch den URA3-Marker von Saccharomyces cerevisiae ausgetauscht, das eine pyrF-Mutation in E.coli in der folgenden Weise komplementiert:
Der pUC19-Replikationsursprung wurde mit PCR von pCaHj483 amplifiziert mit den Primern:

142779: TTG AAT TGA AAA TAG ATT GAT TTA AAA CTT C
142780: TTG CAT GCG TAA TCA TGG TCA TAG C

Der Primer 142780 führt eine Bbu I-Stell in das PCR-Fragment ein.
Das Expand-PCR-System (Roch Molekular Biochemicals, Basel, Schweiz) wurde zur Amplifikation gemäß den Anweisungen des Herstellers für diese und die nachfolgenden PCR-Amplifikationen verwendet.
Das URA3-Gen wurde von dem allgemeinen Scerevisiae-Klonierungsvektor pYES2 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) amplifiziert, wobei folgende Primer verwendet wurden:

140288: TTG AAT TCA TGG GTA ATA ACT GAT AT
142778: AAA TCA ATC TAT TTT CAA TTC AAT TCA TCA TT

Der Primer 140288 führt eine EcoR I-Stelle in das PCR-Fragment ein.
Die zwei PCR-Fragmente wurden fusioniert, indem sie miteinander gemischt und unter Verwendung der Primer 142780 und 140288 unter Verwendung des Verfahrens „Splicing by Overlap" (Horton et al. (1989) Gene, 77, 61–68) amplifiziert wurden.
Das resultierende Fragment wurde mit EcoR I und Bbu I verdaut und an das größte Fragment von pCaHj483 ligiert, das mit dem gleichen Enzym verdaut wurde. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um den pyrF E.coli-Stamm DB6507 (ATCC 35673) zu transformieren, das durch das Verfahren von Mandel und Higa (Mandel, M. und A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45, 154) leistungsfähig gemacht wurde. Die Transformanten wurden an festem M9-Medium (Sambrook et al., (1989) Molekular cloning, a laboratory manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) selektiert, das mit 1 g/l Casaminosäure, 500 μg/l Thiamin und 10 mg/l Kanamycin ergänzt wurde.
Ein Plasmid von einem solchen Transformanten wurde als pCaHj 527 bezeichnet. Die Konstruktion des Plasmids ist in der figur xxx dargestellt. Der in pCaHj527 vorliegende Promotor Pna2/tpi wurde einer ortsspezifischen Mutagenese durch eine einfache PCR-Anwendung unterzogen:
Nucleotid 134–144 wurde geändert von GTACTAAAACC in CCGTTAAATTT unter Verwendung des mutagenen Primers 141223:

141223: GGA TGC TGT TGA CTC CGG AAA TTT AAC GGT TTG GTC TTG CAT CCC

Die Nucleotide 423–436 wurden geändert von ATGCAATTTAAACT in CGGCAATTTAACGG unter Verwendung des mutagenen Primers 141222:

141222: GGT ATT GTC CTG CAG ACG GCA ATT TAA CGG CTT CTG CGA ATC GC

Das resultierende Plasmid wurde als pMT 2188 bezeichnet.
Wachstumsbedingungen
Ein Stamm von Malbranchea cinnamomea wurde in einem 500 ml Schüttelkolbe in einem Medium kultiviert, das 30 g Weizenkleie und 45 ml der folgenden Lösung enthielt: 4 g Hefeextract, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄·7 H₂O, 15 g Glucose, 1 000 ml Leitungswasser (autoklaviert bei 121 °C während 30 Minuten), und das Pilzmyecel wurde nach 3 Tagen Wachstum geerntet. Das geerntete Myecel wurde sofort in flüssigem N₂ eingefroren und bei –80°C gelagert.
Konstruktion einer Eco I/Not I-direktionalen cDNA-Bibliothek aus Malbranchea cinnamomea
Gesamt-RNA wurde durch Extraktion mit Guanidiniumthiocyanat, gefolgt von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294–5299) unter Verwendung der folgenden Modifikationen hergestellt. Das gefrorene Myecel wurde in flüssigem N₂ gemahlen zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel, gefolgt vom Zerkleinern in einer vorgekühlten Kaffeemühle, und sofort in 5 Volumen RNA-Extraktionspuffer (4M Gunidiniumthiocyanat, 0,5 % Natriumlaurylsarcosin, 25 mM Natriumcitrat, pH 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol) suspendiert. Die Mischung wurde während 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert (20 Minuten bei 10 000 U/min, Beckman), um die Zellbruchstücke zu pelletisieren. Der Überstand wurde gesammelt, vorsichtig auf ein 5,7 M CsCl-Kissen geschichtet (5,7 M CsCl, 10 mM EDTA, pH 7,5, 0,1 % DEPC, vor Verwendung autoklaviert), wobei 26,5 ml Überstand pro 12,0 ml CsCl-Kissen verwendet werden, und es wurde zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu erhalten (Beckman, SW 28-Rotor 25 000 U/min, Raumtemperatur, 24 Stunden). Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand vorsichtig entfernt und der Boden des Röhrchens, der das RNA-Pellet enthält, wurde heraus geschnitten und mit 70 % Ethanol gewaschen. Das Gesamt-RNA-Pellet wurde in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen, in 500 μl TE, pH 7,6 suspendiert (falls es schwierig ist, gelegentlich während 5 Minuten bei 65 °C erwärmen), mit Phenol extrahiert und mit Ethanol während 12 Stunden bei –20 °C (2,5 Volumen Ethanol, 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2) präzipitiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit 70 % Ethanol gewaschen und in einem minimalen Volumen DEPC resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messen der OD_260/280 bestimmt.
Die Poly(A)⁺-RNA wurde durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitätschrommatographie (Aviv & Leder, 1972, Proceedings of the national Academy of Science USA 69: 1408–1412) isoliert. Insgesamt 0,2 g der oligo(dT)-Cellulose (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde in 10 ml von 1× dem Säulenbeladungspuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) vorgequellt, in eine DEPC-behandelte, verschlossene Plastiksäule (Poly-Prep-Chromatographie-Säule, BioRad, Hercules, CA) geladen, und mit 20 ml von 1× Ladepuffer equlibriert. Die Gesamt-RNA (1–2 mg) wurde auf 65 °C während 8 Minuten erwärmt, auf Eis während 5 Minuten gequencht und nach Zugabe von 1 Volumen von 2× Säulenladepuffer zur RNA-Probe in die Säule geladen. Das Eluat wurde gesammelt und 2–3 mal durch Erwärmen der Probe wie vorstehend wieder beladen und gequencht auf Eis vor jedem Laden. Die oligo(dT)-Säule wurde mit 10 Volumen von 1× Ladepuffer gewaschen, dann mit 3 Volumen Mediumsalzpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS), gefolgt von der Elution mit poly(A)⁺-RNA mit 3 Volumen des Elutionspuffers (10 mM Tris-Cl, pH 7,6, 1 mm EDTA, 0,05 % SDS), vorerwärmt auf 65 °C durch Sammeln von 500 μl-Fraktionen. Die OD₂₆₀ wurde für jede gesammelte Fraktion gelesen, und die mRNA-enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und mit Ethanol präzipitiert bei –20 °C während 12 Stunden. Die poly(A)⁺RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, in DEPC-DIW resuspendiert und in 5–10 μg Aliquoten bei –80 °C gelagert.
Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg Poly(A)⁺-RNA von Malbranchea cinnamomea durch die Rnase H-Methode (Gubler und Hoffmann 1983, supra; Sambrook et al., 1989, supra) unter Verwendung einer Haarnadel-Modifikation synthetisiert. Die Poly(A)⁺-RNA (5 μg in 5 μl) DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70 °C während 8 Minuten in einem präsiliconisierten, Rnase-freien Eppendorf-Röhrchen erwärmt, auf Eis gequencht und mit dem Endvolumen von 50 μl mit reversem Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mg MgCl₂, 10 mM DTT) mit 1 mM dATP, dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP, 40 Einheiten humaner Plazenta-Ribonuclease-Inhibitor, 4,81 μg oligo(dT)₁₈-Not I-Primer (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und 1 000 Einheiten SuperScript II reverse Transkriptase (Gibco-BRL, USA) kombiniert.
cDNA vom ersten Strang wurde durch Inkubation des Reaktionsgemisches bei 45 °C während 1 Stunde synthetisiert. Nach der Synthese wurde das mRNA : cDNA-Hybridgemisch durch eine MikroSpin S-400 HR-Drehsäule von Pharmacia nach den Anweisungen des Herstellers Gel-filtriert.
Nach der Gelfiltration wurde das Hybrid 250 μl Puffer für den zweiten Strang (20 mM Tris-Cl pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,16 mM βNAD⁺) mit 200 μM von jedem dNTP, 60 Einheiten E.coli-DNA-Polymerase I (Pharmacia, Uppsala, Schweden), 5,25 Einheiten Rnase H und 15 Einheiten von E.coli-DNA-Ligase verdünnt. Die Synthese des zweiten cDNA-Stranges wurde durch Inkubation eines Reaktionsröhrchens bei 16 °C während 2 Stunden und einer zusätzlichen Zeit von 15 Minuten bei 25 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu 20 mM der Endkonzentration gestoppt, gefolgt von einer Phenol- und Chloroform-Extraktion.
Die doppelsträngige cDNA wurde mit Ethanol bei –20 °C während 12 Stunden durch Zugabe von 2 Volumen von 96 % Ethanol und 0,2 Volumen 10 M Ammoniumacetat präzipitiert, durch Zentrifugation wieder gewonnen, in 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet (SpeedVac) und in 30 μl Mungbohnen(„Mung bean")-Nucleasepuffer (30 mM Natriumacetat pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM Dithiothreitol, 2 % Glycerin) mit 25 Einheiten Mungbohnen-Nuclease resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde durch Inkubation der Reaktion bei 30 °C während 30 Minuten geschnitten, gefolgt von der Zugabe von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation mit 2 Volumen 96 % Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 auf Eis für 30 Minuten.
Die doppelsträngigen cDNAs wurden durch Zentrifugation (20 000 U/min, 30 Minuten) wieder gewonnen, stumpf abgeschnitten mit T4 DNA-Polymerase in 30 μl T4 DNA-Polymerasepuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM Dithiotreitol) mit 0,5 mM jeder dNTP und 5 Einheiten T4 DNA-Polymerase durch Inkubation des Reaktionsgemisches bei +16 °C während 1 Stunde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu 20 mM Endkonzentration gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation während 12 Stunden bei –20 °C durch Zugabe von 2 Volumen 96 % Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2.
Nach der Einführreaktion („fill-in reaction") wurden die cDNAs durch Zenttrifugation wie vorstehend wieder gewonnen, in 70 % Ethanol gewaschen, und die DNA-Pellets wurden in einem SpeedVac getrocknet. Das cDNA-Pellet wurde in 25 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP) mit 2 μg EcoRI-Adaptoren (0,2 μg/μl, Pharmacia, Uppsala, Schweden) und 20 Einheiten T4 Ligase durch Inkubation des Reaktionsgemisches bei 16 °C während 12 Stunden resuspendiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65 °C während 20 Minuten gestoppt, und dann für 5 Minuten auf Eis plaziert. Die adaptierte cDNA wurde verdaut mit NotI durch Zugabe von 20 μl autoklavierten Wassers, 5 μl 10 × NotI-Restrictionsenzym-Puffer und 50 Einheiten NotI, gefolgt von der Inkubation während 3 Stunden bei 37 °C. Die Reaktion wurde gestoppt durch Erwärmen der Probe auf 65 °C während 15 Minuten. Die cDNAs wurde der Größe nach fraktioniert durch Agarose-Gel-Elektrophorese an einer 0,8% SeaPlaque GTG Agarose-Gel, das bei niedrigere Temperatur schmilzt (FMC, Rockland, ME) in 1 × TBE (in autoklaviertem Wasser, um unligierte Adaptoren und kleine cDNA abzutrennen. Das Gel lief während 12 Stunden bei 15 V, und die cDNA wurde der Größe nach ausgewählt bei einem Ausschluß von 0,7 kb durch Schneiden des unteren Teils des Agarosegels. Dann wurde ein 1,5 % Agarose-Gel vor das cDNA-enthaltende Gel gegossen, und die doppelsträngigen cDNAs wurden konzentriert, in dem das Gel rückwärts betrieben wird, bis sie als kompremierte Bande auf dem Gel erschien. Das cDNA-enthaltende Gel-Teil wurde aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA wurde aus dem Gel extrahiert, wobei der GFX-Gelbanden-Reinigungskit (Amersham, Arlington Heigth, IL) wie folgt verwendet wurde. Die getrimmten Gelscheiben wurden in ein 2 ml Biopure-Eppendorf-Röhrchen eingewogen, dann wurden 10 ml Fangpuffer („Capture Puffer") für jede 10 mg der Gelscheibe zugegeben, und die Gelscheibe wurde aufgelöst durch Inkubation bei 60 °C während 10 Minuten, bis die Agarose vollständig solubilisiert war, die Probe am Boden des Röhrchens durch kurze Zentrifugation. Die geschmolzene Probe wurde in eine GFX-Spinsäule übertragen, die in einem Sammelröhrchen plaziert war, bei 25 °C während 1 Minute inkubiert und dann mit voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge während 30 Sekunden rotiert. Der Durchfluss wurde verworfen, und die Säule wurde mit 500 μl Waschpuffer gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugation mit voller Geschwindigkeit während 30 Sekunden. Das Sammelröhrchen wurde verworfen, und die Säule wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben, gefolgt durch elution der cDNA durch Zugabe von 50 μl TE pH 7,5 zum Zentrum der Säule, Inkubation bei 25 °C während 1 Minute und schließlich durch Zentrifugation während 1 Minute mit maximaler Geschwindigkeit. Die eluierte cDNA wurde bei –20 °C bis zum Aufbau der Bibliothek gelagert.
Eine Plasmid-DNA-Präparation für ein EcoRI-NotI-Insert, das einen pYES2.0-cDNA-Klon enthält, wurde unter Verwendung eines QUIAGEN-Tip-100 nach den Anweisungen des Herstellers (Quiagen, Valencia, CA) gereinigt. Insgesamt 10 μg gereinigte Plasmid-DNA wurde mit NotI und EcoRI vollständig verdaut in einem Gesamtvolumen von 60 μl durch Zugabe von 6 μl 10 × NEBuffer für EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA), 40 Einheiten NotI und 20 Einheiten EcoRI, gefolgt von der Inkubation während 6 Stunden bei 37 °C. Die Reaktion wurde gestoppt durch Erwärmen der Probe auf 65 °C während 20 Minuten. Die verdaute Plasmid-DNA wurde ein mal mit Phenol-Chloroform, dann mit Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Ethanol-Präzipitation während 12 Stunden bei –20 °C durch Zugabe von 2 Volumen 96 % Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2. Die präzipitierte DNA wurde resuspendiert in 25 μl 1 × TE pH 7,5, auf ein 0,8 % SeaKem-Agarose-Gel in 1 × TBE beladen, und das Gel für 3 Stunden bei 60 V laufen gelassen. Der verdaute Vektor wurde aus dem Gel heraus geschnitten, und die DNA wurde aus dem Gel extrahiert unter Verwendung der GFX-Gelbanden-Reinigungskits (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers. Nach Messen der DNA-Konzentration durch OD_260/280, wurde der eluierte Vektor bei –20 °C bis zum Aufbau der Bibliothek gelagert.
Um die optimalen Ligationsbedingungen für die cDNA-Bibliothek herauszufinden, wurden vier Testligationen in 10 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) mit 7 μl doppelsträngiger cDNA (entsprechend etwa 1/10 des Gesamtvolumens in der cDNA-Probe), 2 Einheiten T4-Ligase und 25 ng, 50 ng bzw. 75 ng EcoRI-NotI-gespaltenem pYES2.0-Vektor (Invitrogen) durchgeführt. Die Vektor-Hintergrund-Kontroll-Ligationsreaktion enthielt 75 ng EcoRI-NotI-gespalteten pYES2.0-Vektor ohne cDNA. Die Ligationsreaktionen wurden durch Inkubation bei 16 °C während 12 Stunden, Erwärmen auf 65 °C während 20 Minuten durchgeführt, und dann wurden 10 μl autoklavierten Wassers in jedes Röhrchen gegeben. Ein μl des Ligationsgemisches wurde einer Elektrophorese unterzogen (200 W, 2,5 kV, 25 mF) zu 40 μl elektrokompetenten E.coli DH10B-Zellen (Life Technologies, Geithersburg, MD). Nach Zugabe von 1 ml SOC zu jedem Transformationsgemisch ließ man die Zellen bei 37 °C während 1 Stunde wachsen, 50 μl und 5 μl von jeder Elektroporation wurden auf LB-Platten platiert, die mit Ampicillin mit 100 μg pro ml ergänzt waren, und bei 37 °C während 12 Stunden wachsen gelassen. Unter Verwendung optimaler Bedingungen wurde eine Malbranchea cinnamomea-cDNA-Bibliothek mit 2 × 10⁷ unabhängigen Kolonie-bildenden Einheiten in E.coli mit einem Vektorhintergrund von ca. 1 % etabliert. Die cDNA-Bibliothek wurde gelagert als (1) individuelle Poole (25 000 c.f.u./Pool) in 20 % Glycerin bei –80 °C, (2) Zellpellets der gleichen Poole bei –20 °C, (3) Quiagen-gereinigte Plasmid-DNA aus individuellen Poolen bei –20 °C (Quiagen Tip 100) und (4) gerichtete doppelsträngige cDNA bei –20 °C.
Herstellung von cDNA-Sonden für Xyloglucane der Familie 12 unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR)
Etwa zwanzig (20) Nanogramm gerichtete, doppelsträngige cDNA aus Malbranchea cinnamomea wurde mit PCR amplifiziert unter Verwendung von 20 pmol degenerierter Deoxyinosin-enthaltenden Oligonucleotid-enthaltenden Sensprimern, die einem Peptid im NH₂-Terminus der gereinigten Xyloglucanase (5'-GA(C/T) TT(C/T) TG(C/T) GGI CA(A/G) TGG GA-3') entspricht, kombiniert mit 200 pmol Antisensprimer, der einem Peptid in der internen Aminosäuresequenz entspricht, die aus der gereinigten Xyloglucanase bestimmt wurde (5'-TGI C/G) (A/T) (C/T) TG(A/G) TCC ATI CC(C/T) TG(C/T) TC-3'), ein PTC-200 Peltier Themrmocycler (MJ Research, USA) und 2,5 Einheiten AmpliTag-Gold-Polymerase (Perkin Elmer, USA). Die Polymerasekettereaktion wurde durchgeführt, in dem die PCR durch einen Denaturierungsschritt bei 94 °C während 10 Minuten initiiert wurde, und dann durch 40 Zyklen einer PCR unter Verwendung eines Zyklusprofils der Denaturieren bei 94 °C während 30 Sekunden, Anlagerung bei 55 °C während 30 Sekunden und Extension bei 72 ° während 1 Minute. Die Amplifikationsprodukte wurde durch Elektrophorese in einem 2 % Agarosegel analysiert, und nachfolgenden wurde ein ca 0,6 kb PCR-Fragment aus dem Gel extrahiert unter Verwendung des GFX-Gelabanden-Reinigungskits (Amersham-Pharmacia Biothech, Uppsala, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers. Das gereingte PCR-Fragment wurde direkt durch die Dideoxy-Ketten-Terminations-Methode (Sanger, F., Nicklen, S., und Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) sequenziert, wobei 300 ng GFS-gereinigte Vorlage, der Tag Deoxyterminale Zyklussequenzierungskit (Perkin-Elmer USA), Fluoreszen-markierte Terminatoren und 5 pmol des degenerierte, Deoxyinosin-enthaltende Oligonucleotid-Primer (5'-ACI GA(C/T) ATI CA(A/G) AA(C/T) GA(A/G) GA(A/G) (C/T)TI TGG-3') verwendet wurden. Die Analyse der Sequenzdaten wurde gemäß Devereux et al., 1984 (Devereux, J., Haeberli, P., und Smithies, O. (1984) Nucleic Acid Res. 12, 387–395) durchgeführt.
Screening der cDNA-Bibliothek
30 000 Kolonie-bildende Einheiten aus der in pYES2.0 konstruierten Malbranchea cinnamomea cDNA-Bibliothek wurde gescreent durch Koloniehybridisierung (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a labortory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) in E.coli unter Verwendung eines random-geprimten (Feinberg, A.P. Und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6–13) ³²P-markierten (> 1 × 10⁹ cpm/μg) PCR-Produkts für Xyloglucanase als Sonde. Die Hybridisierung wurde durchgeführt in 2 × SSC (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY), 5 × Denhardt's Lösung (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY), 0,5 % (w/v) SDS, 100 μg/ml denaturierte DNA vom Lachssperma während 20 Stunden bei 65 °C, gefolgt vom Waschen in 5 × SSC bei 25 °C (2 × 15 Minuten), 2 × SSC, 0,5 % SDS bei 65 °C (30 Minuten), 0,2 × SSC, 0,5 % SDS bei 65 °C (30 Minuten) und schließlich in 5 × SSC (2 × 15 Minuten) bei 25 °C. Screenen der Malbranchea cinnamomea-cDNA-Bibliothek ergab 4 stark hybridisierende Klone, die weiter durch Sequenzieren der cDNA-Enden mit pYES vorwärts und reverse Polylinkerprimer (Invitrogen, USA) analysiert wurden, und bestimmen der Nucleotidsequenz der längsten Xyloglucanase-cDNA (als pC1XYG1011 bezeichnet) aus beiden Strängen.
Nucleotidsequenzanalyse
Die Nucleotidsequenzanalyse des vollständigen Malbranchea cinnamomea-Xyloglucanase-cDNA-klons pC1XYG1011 wurde von beiden Strängen durch die Dideoxy-Kettenterminations-Methode (Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A.R. (1977) Proc Natl Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) bestimmt unter Verwendung von 500 ng eines Quiagen-gereinigten Templates (Quiagen, USA), dem Taq Deoxyterminal-Zyklus-Sequenzierungs-Kits (Perkin-Elmer, USA), Fluoreszenz-markierten Terminatoren und 5 pmol von entweder pYES 2.0 Polylinkerprimer (Invitrogen, USA) oder synthetische Oligonucleotidprimer, resultierend aus der beigefügten Sequenz SEQ ID Nr. 1 und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Xyloglucanase-Precursors der Familie 12, die in der beigefügten SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. Die Analyse der Sequenzdaten erfolgte gemäß Devereux et al., 1984 (Derereux, J., Haeberli, P., und Smithies, O. (1984) Nucleic acids Res. 12, 387–395).
Heterologe Expression in Aspergillus oryzae
Transformation von Aspergillus oryzae
Die Transformation von Aspergillus oryzae wurde wie bei Christensen et al., (1988) Biotechnology 6, 1419–1422 durchgeführt.
Konstruktion der Xyloglucanase-Expressionscassette für die Aspergillus-Expression
Die Plasmid-DNA wurde aus dem Malbranchea cinnamomea-cDNA-Klon pC1XYG1011 isoliert unter Verwendung von Standardverfahren und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das XYG1011-cDNA-Insert wurde mit PCR amplifiziert, wobei 50 ng pC1XYG1011-Plasmid-DNA als Template, 100 pmol als Senseprimer (5'-CGGGATCCGATAGAGTCGAG-ATGAAGG-3'), kombiniert mit 100 pmol Antisensprimer (5'-CCGCTCGAGCCAA-AGAGCTAAAAAAGTTG-3'), ein PTC-200 Peltier-Theermocycler (MJ Research, USA) und eine Expand High Fidelity PCR System (Roch Molecular Biochemicals, Germany) nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt wurden. 30 PCR-Zyklen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Zyklusprofils der Denaturieren bei 94 °C während 30 Sekunden, Anlagerung bei 60 °C während 30 Sekunden und Extension bei 72 °C während 2 Minuten. Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel analysiert, und nachfolgend wurde das ca 1,0 kb XYG1011-PCR-Fragment aus dem Gel extrahiert unter Verwendung des GFX-Gelbanden-Reinigungskits (Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers. Sowohl das gereinigte PCR-Fragment als auch der Aspergillus-Expressionsvektor pMT2188 wurde doppelt mit BmaHI und XhoI verdaut. Der Vektor wurde nachfolgend mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Mannheim, Deutschland) verdaut nach den Anweisungen des Herstellers. Die Restriktionsenzyme und die Phosphatase wurden durch Phenol- und Chloroform-Extraktion entfernt, und das PCR-Fragment wurde in den Vektor unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al. 1989) ligiert. Der E.coli-Stamm DB6507 (F^–, pyrF74::Tn5, supE44, lacY1, ara14, galK2, xyl5, mtl1, leuB6, proA2, hsdS20, recA13, rpsL20, thi-1, ?^–) wurde mit dem Ligations-Gemisch transformiert, und die Transformanten wurden auf das Vorliegen der PCR-Inserts in pMT2188 durch Kolonie-PCR gescreent. Die Kolonie-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der Standard-PCR-Methode (Saiki et al., 1988, Science 239: 487–491) mit einem 10 μl Volumen, unlysierten E.coli-Zellen, die das Template bereitstellen, einer Anlagerungstemperatur von 55 °C und Primern mit den folgenden Sequenzen durchgeführt:

Primer 1: GTTTCCAACTCAATTTACCTC
Primer 2: TTGCCCTCATCCCAATCCTTT

Ein Expressionsklon, der so identifiziert wurde, wurde als pMStr43 bezeichnet, und die Sequenz des geklonten PCR-Fragmenst wurde bestimmt, um sicher zu stellen, dass keine Fehler während der Amplifikation eingebaut wurden. Eine einzelne Substitution C gegen A wurde stromabwärts vom Stoppkodon bei Position 849 gefunden.
Transformation von Aspergillus oryzae
Allgemeines Verfahren: 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wird mit Sporen von A. oryzae beimpft und unter Schütteln bei 37 °C während etwa 2 Tagen inkubiert. Das Myecel wird geerntet mittels Filtration durch Miracloth („miracloth") und mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Myecel wird in 15 ml 1,2 M MgSO₄ mit 10 mM NaH₂PO₄, pH 5,8, suspendiert, und 1 ml des gleichen Puffers mit 120 mg Novozym 234 wird zugegeben, und die Mischung wir unter sanftem Bewegen während 1,5 bis 2,5 Stunden bei 37 °C inkubiert, bis eine große Zahl von Protoplasten in der mit einem Mikroskop untersuchten Probe sichtbar wird. Die Suspension wird durch ein Miracloth filtriert, das Filtrat wird in ein steriles Röhrchen transferiert und mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0, überschichtet. Die Zentrifugation wird während 15 Minuten bei 100 g durchgeführt, und die Proteoplasten werden von oben von dem MgSO₄-Kissen gesammmelt. 2 Volumen von STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) wurden zu der Proteoplasten-Suspension zugegeben, und die Mischung wurde während 5 Minuten bei 1 000 g zentrifugiert. Das Proteoplasten-Pellet wird in 3 ml STC resuspendiert und repelletisiert. Das wird wiederholt. Schließlich wurden die Proteoplasten in 0,2–1 ml STC resuspendiert. 100 μl der Proteoplastensuspension wird mit 5 μg der transformierenden DNA, die in 10 μl STC suspendiert ist, gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten stehen gelassen. 1 ml 60 % PEG 4000 in 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCL, pH 7,5, wird zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten inkubiert, dann bei 2 500 g gedreht für 15 Minuten. Die pelletisierten Proteoplasten werden in 1 ml STC resuspendiert und auf einem selektiven Medium mit 1,0 M Sucrose für die osmotische Unterstützung der Proteoblasten verteilt. Für pMT2188 stellt ein Minimalmedium mit 10 mM Acetamid und 67 mM CsCl eine Selektion für den amdS-Marker bereit. Die Transformanten sind nach Inkubation für 4 bis 7 Tagen bei 37 °C unterscheidbar.
Identifikation und Isolierung von Xyloglucanase-produzierenden Aspergillus oryzae Transformanten
Jede Kolonie, die auf dem selektiven Medium nach der Transformtion von Aspergillus entstand, wurde auf Xyloglucanase-Produktion getestet, in dem Conidien transferiert werden auf ein festes Minimalmedium, das auf pH 7,5 eingestellt wurde und 1 % Glucose und 10 mM NaNO₃ enthielt, und mit einer Überschicht des Gleichen mit 0,1 % w/v des Substrats AZCL-Xyloglucan (Megazym, Bray, Irland) [versehen wurde]. Die Hydrolyse des Substrats wurde durch die sichtbare Diffusion des blauen Azurin-Farbstoffes nach Wachsen über Nacht der Conidien bei 37 °C nachgesiesen. Ein Transformante produzierte Xyloglucanase, wie mit diesem Assay nachgewiesen wurde.
Dieser Transformant wurde isoliert durch Strichverdünnung der Conidien auf einem selektiven Medium mit 0,01 % Triton X-100, um die Koloniengröße zu beschränken. Vier isolierte Kolonien, die von einzelnen Sporen zu entstehen schienen, wurden auf Xyloglucanase-Aktivität auf dem vorstehend beschriebenen Medium getestet, und wurden zusätzlich in 10 ml YP-Medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) mit 2 % Maltose bei 30 °C und 200 Umwälzungen pro Tag wachsen gelassen. Überstände von diesen Kulturen wurden mit SDS/PAGE fraktioniert, wobei ein 12 % Tris-Glycin-Polyacrylamid-Gel (Novex, San Diego, CA, USA) verwendet wurde, und das Protein wurde mit Coumassie-Blau nach den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Das die größte Menge an Xyloglucanase produzierende Aspergillus-Isolat wurde als MStr125 bezeichnet.
Bestimmung der Xyloglucanyse-Einheiten (XGU oder XyloU):
Die Xyloglucanase-Aktivität wird unter Verwendung von AZCL-Xyloglucan von Megazym, Irland, als Substrat gemessen.
Eine Lösung von 0,2 % des blauen Substrats wird in einem 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5 unter Rühren gelöst. Die Lösung wird unter Rühren in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (0,75 ml jedes) verteilt, 50 μl Enzym-Lösung wird zugegeben, und sie werden in einem Eppendorf-Thermomixer Modell 5436 während 20 Minuten bei 40° C mit einem Mischen bei 1 200 U/min. inkubiert. Nach der Inkubation wird die gefärbte Lösung von den Feststoffen durch 4 Minuten Zentrifugieren bei 14 000 U/min. getrennt, und die Absorption des Überstandes wird bei 600 nm gemessen. Der Assay wird zweifach durchgeführt, und der Hintergrund, zweifach gemessen, wird abgezogen. Das Auslesen muss 0,2 bis 1,5 für die Berechnung der katalytischen Aktivität betragen.
Eine XyloU ist definiert als die Menge an Enzym, die in einer Absorption von 0,24 in einer 1 cm Küvette bei 600 nm resultiert.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIEL 1
Screenen von Mikroorganismen, die alkalisch Xyloglucanase produzieren
Der fungalen Mikroorganismen Malbranchea cinnamomea, CBS 960.72, Malbranchea cinnamomea, CBS 343.55 und Malbranchea cinnamomea, UAMH 2485 wurden wie im Teil Materialien und Methoden beschrieben kultiviert. Die Kulturbrühen wurden auf Xyloglucansa-, beta-Glucanase- und Cellulase-Aktivität im Agarose-Plattenassay bei drei verschiedenen pH (pH 3, pH 7, pH 10) getestet. Die folgenden Aktivitäten wurden gefunden:
BEISPIEL 2
Reinigung von Xyloglucanase aus Malbranchea cinnamomea
A. Partielle Reinigung
Um die zwei Arten von Cellulase aus Xyloglucanase in den entsprechenden Kulturbrühen, die gemäß Beispiel 1 erhalten wurden, zu trennen, wurden Xyloglucanase und Cellulase partiell aus der Kulturbrühe aus Medium A (siehe Mediumliste) mittels dem in Material und Methoden beschriebenen Verfahren gereinigt.
Etwa 500 ml Kulturbrühe von jedem fungalen Stamm wurde durch Kultivieren des Pilzes in Medium A und dann Extraktion durch Zugabe von 100 ml sterilisiertem Wasser erhalten. Die Kulturbrühe wurde filtriert, und das Protein wurde mit 80 % Ammoniumsulfat präzipitiert.
Die präzipitierten Proteinpellets wurden aufgelöst in etwa 60 ml 25 mM KH₂PO₄/NaOH-Puffer bei pH 6,0. Dann wurden die Proben einer Ultrafiltration unterzogen (gewaschen mit dem gleichen Puffer) an einer Millipor Biomax-5 Cellulase-resistenten Membran mit einem Ausschluss von 5 kDa bis die Leitfähigkeit des Proteins unter 1 ms/cm lag. 10 ml dieser Probe wurden auf eine Ionenaustauschersäule (Q-Sepharose Fast Flow, 34 ml) aufgebracht und mit 0,025 M Phosphatpuffer pH 6,0 äqulibriert. Sowohl Xyloglucanase als auch CMCase banden an die Säule und wurden unter Verwendung eines 1N Natriumchlorid-Gradienten eluiert. Alle Fraktionen wurden gesammelt und hinsichtlich der Xyloglucanase- und Cellulase-Aktivität mittels Mikrotiterplattenassay mit 0,5 % AZCL-Substrat analysiert.
In 1 bis 3 sind die Xyloglucanase- und Cellulase-Aktivität in verschiedenen Fraktionen der partiellen Reinigung von jedem der drei Stämme von Malbranchea cinnamomea dargestellt: 1 zeigt die Fraktionen vom Stamm UAMH2485, 2 zeigt die Fraktionen vom Stamm CBS 343.55 und 3 zeigt die Fraktionen vom Stamm CBS 960.72. Aus den Figuren kann gesehen werden, dass die zwei Enzyme in verschiedenen Fraktionen vorkommen, und somit leicht getrennt werden können. Fraktionen 1 bis 3 enthielten das meiste der Xyloglucanase-Aktivität, und sie besitzen noch Cellulase-Aktivität an entweder Agarose-Platten CMC (1%), AZCL-HE-Cellulose (0,1 %) selbst nach Inkubation über Nacht bei 45 °C, oder flüssigem Assay (0,5 % AZCL-HE-Cellulose, pH 7 und 9, 45 °C, 800 U/min während 2½ Stunden).
Die Fraktionen mit Xyloglucanase-aktivität wurden gepoolt und konzentriert unter Verwendung einer Membrane mit einem Ausschluss von 10 kDa. Die konzentrierten Proben wurden für den IAF-Assay eingesetzt, um den pI zu bestimmen, und SDS-Page, um das Molekulargewicht zu bestimmen. Es wurde ermittelt, dass die Xyloglucanase von allen drei Stämmen von Malbranchea cinnamomea den gleichen pI (etwa pH 3,5) und das gleiche Molekulargewicht (etwa 25 kDa) besitzen. Des weiteren wurden die Proteinbanden elktro-geplotted und ein Teil der N-terminalen Sequenz wurde als FCGQXDSEQSGPYIVYNNL bestimmt, wobei X vermutlich für W (Tryptophan) steht.
Die Xyloglucanase-Aktivität wurde für jede der drei Xyloglucanasen wurde wie in Material und Methoden beschrieben bestimmt mit dem folgenden Ergebnis:

Stamm XGU/ml

CBS 960.72 27,5

CBS 343.55 9,1

UAMH 2485 12,3
B. Reinigung
Xyloglucanase aus Kulturbrühen wurde partiell wie vorstehend beschrieben gereinigt. Gesammelte Fraktionen mit Xyloglucanase-Aktivität wurden mit einer Hiprep26/10-Säule entsalzt, in Plastikröhrchen (15 ml pro Röhrchen) geteilt und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 2 ml deionisiertem Wasser gelöst; 1 ml wurde für die Charakterisierung und 1 ml für die weitere Reinigung verwendet. Die Lösung wurde in 25 mM Tris-Puffer pH 7,0 verdünnt, gefolgt von einer Konzentrierung an einer Amicon-Zelle mit einer Membran mit einem Ausschluss von 5 kDa zur Reduzierung der Leitfähigkeit. Wenn die Leitfähigkeit unter 3 mSi der Lösung lag, wurde eine 1 ml MonoQ-Säule , die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war, angewendet. Die an die Säule gebundene Xyloglucanase wurde eluiert unter Verwendung eines 0,5 M Natriumchlorid-Gradienten. Alle Fraktionen wurden analysiert auf Xyloglucanase-Aktivität, und 2 Fraktionen enthielten die gesamte Aktivität.
An einer SDS-PAGE der gepoolten Fraktionen konnte eine klare Bande mit einem MW von 25 kDa identifiziert werden. Diese Proteinbande wurde elektrogeplottet und ein Teil der N-terminalen Sequenz bestimmt und die folgenden Daten erhalten: FCGQXDSEQSGPYIVYNNL. Diese partielle N-terminale Sequenz besaß eine Homologie (63 %) zu Tiasporelle phaseolina XET, die in der internationalen Patentveröffentlichung WO 98/38288 offenbart ist.
Die an Xyloglucanase-aktiven Fraktionen zeigten keine Aktivität an AZCL-HE-Cellulose nach 2 Stunden Inkubation unter identischen Bedingungen wie der Xyloglucanase-Assay, der in Material und Methoden beschrieben ist.
BEISPIEL 3
Charakterisierung von Xyloglucanase aus Malbranchea cinnamomea UAHM 2485, CBC 343.55 und CBS 960.72
pH-Profile
Zur Bestimmung des pH-Profils der in Beispiel 2 gereinigten Xyloglucanase wird eine Lösung von 0,2 % des blauen Substrats-AZCL-Xyloglucan in 0,1 M Phosphat-Citrat-Puffer (pH 3, 4, 5) oder Borax/NaH₂PO₄-Puffer für pH 6, MOPS für pH 7, HEPES für pH 8 oder Glycin-Puffer für 9–11 unter Rühren suspendiert und für einen Mikrotiterplattenassay wie in Materialien und Methoden beschrieben verwendet. 80 μl de 0,2 % AZCL-Xyloglucan-Substrat-Lösung und 20 μl der partiell gereinigten Xyloglucanase-Probe wurden gemischt und für 1 Stunde bei 50 °C, 800 U/min in einem Eppendorf-Thermomixer inkubiert. Das pH-Profil für jede Xyloglucanase aus Malbranchea cinnamomea UAMA 2485, CBS 343.55 und CBS 960.72 ist in der folgenden Tabelle dargestellt (ausgedrückt in relativer Xyloglucanase-Aktivität):
Das Ergebnis zeigt, dass die Xyloglucanase aus diesen Stämmen nahezu identische pH-Profile aufweisen. Verglichen mit bekannten Xyloglucanasen haben sie eine alkalischere Aktivität: es gabe eine 50 bis 80 % je relative Xyloglucanase-Aktivität selbst bei pH 10.
Temperaturprofile:
Zur Bestimmung der Temperaturprofile wurden 70 μl von der 0,2 % der blauen Substrat-AZCL-Xyloglucan-Lösung in 0,1 M Glycinpuffer pH 9 unter Rühren suspendiert und 30 μl partiell gereinigte Xyloglucanase-Probe wurde in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt und während 40 Minuten bei verschiedenen Temperaturen (20, 30, 40, 50, 60 und 70 °C) im Wasserbad inkubiert. Eine denaturierte Enzymprobe (100 °C kochen für 20 Minuten) wurde als Leerwert verwendet. Nach der Inkubation wird die gefärbte Lösung vom Feststoff durch Zentrifugation bei 10 000 U/min während 5 Minuten bei 4 °C getrennt. 60 μl des Überstandes wurden in eine Mikrotiterplatte übertragen, und die Absorption wird mit einem BioRad-Mikroplatten-Ausleser bei 595 nm gemessen.
Die Temperaturprofile der Xyloglucanase von den Stämmen Malbranchea cinnamomea UAMH 2485, CBS 343.55 und CBS 960.72 sind nachfolgend dargestellt (in relativen Xyloglucanase-Aktivitäten):
Die Xyloglucanase aus den drei Malbranchea cinnamomea-Stämmen haben sehr ähnliche Temperaturprofile, sie sind aktiv von 20 bis 70 °C und besitzen eine optimale Aktivität bei einer Temperatur von um 50 °C.
Themostabilität
Für Thermostabilitätstests wurden die partiell gereinigten Enzymproben aus Beispiel 2 in einem 40 °C-Wasserbad inkubiert und nach verschiedenen Inkubationszeiten (0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Stunden) Proben entnommen; dann wurde die Xyloglucanase-Aktivität von diesen Proben durch einen Mikrotiterplattenassay bestimmt, in dem 70 μl von 0,2 % blauem Substrat-AZCL-Xyloglucan-Lösung, suspendiert in 0,1 M Glycin-Puffer pH 9 unter Rühren und 30 μl Probe in der Mikrotiterplatte gemischt wurden, und während 40 Minuten bei 50 °C 800 U/min in einem Eppendorf-Thermomixer inkubiert wurden. Denaturierte Enzymproben (100 °C kochen während 20 Minuten) wurden als Leerwerte verwendet. Nach Inkubation wird die gefärbte Lösung vom Feststoff durch Zentrifugation bei 10 000 U/min während 5 Minuten bei 4 °C getrennt. 60 μl des Überstandes wurden in eine Mikrotiterplatte transferiert, und die Absorption wird mit einem BioRad-Mikroplatten-Leser bei 595 nm gemessen.
Die Ergebnisse des Thermostabilitäts-Tests sind nachstehend gezeigt (in relativer Xyloglucanase-Aktivität):
Es kann gesehen werden, dass die Enzyme aus den drei Malbranchea cinnamomea-Stämmen unter den Testbedingungen sehr stabil sind. Es kann kaum irgendein Aktivitätsverlust selbst nach 6 Stunden Inkubationszeit bei 40 °C gesehen werden.
Substratspezifität
Partiell gereinigte Xyloglucanase aus den drei Malbranchea cinnamomea-Stämmen UAMH 2485, CBS 343.55 und CBS 960.72 wurden hinsichtlich der Substratspezifität durch Verwendung verschiedener Substrate getestet, einschließlich AZCL-Xyloglucan (Tamarinde) für Xyloglucanase, AZCL-Xylan (Haferdinkel) für Xylanase, AZCL-unverzweigtes Arabinan („debranched Arabinan) für Arabinase, AZCL-Galactomannan (Johannisbrotbaum) für Mannanase, AZCL-HE-Cellulose für Cellulase, AZCL-Dextran für endo-1,6-a-Glucanase, AZCL-Galactan (Kartoffel) für endo-1,4-β-Galactanase.
Es wurde gefunden, dass die partiell gereinigte Xyloglucanase aus diesen drei Malbranchea cinnamomea-Stämmen nur eine Xyloglucanase-Aktivität und keine andere Enzymaktivität zeigt. Es kann gefolgert werden, dass Xyloglucanase aus Malbranchea cinnamomea-Stämmen Xyloglucan-spezifische Enzyme sind.
Detergenzkompatibilität
Partiell gereinigte Xyloglucanase aus den drei Malbranchea cinnamomea-Stämmen UAMH 2485, CBS343.55 und CBS 960.72, wie in Beispiel 2 A beschrieben, wurden in 5 verschiedenen kommerziellen Europäischen und Chinesischen Detergenz-Zusammensetzungen in zwei Dosierungen (2 g/l und 4 g/l) getestet: die Europäischen Detergenzien werden als Ariel^®, Omo^® und die Chinesischen Detergenzien werden als Ariel^®, Tide^® und Whitecat^® vermarktet, im Vergleich mit der Xyloglucanase-Aktivität in Puffer pH 7.
Die in Beispiel 2 B beschriebene gereinigte Xyloglucanase wurde auch in der folgenden Detergenz-Zusammensetzung unter normalen Waschbedingungen (40 °C, 20 Minuten Inkubation) getestet: Ariel^®Futur flüssig, 6 g/l, 18 Körnerhärte („grain hardness"); Ariel^®Futur-Pulver, 6 g/l, 18 Körnerhärte, US Tide^® flüssig, 2 g/l, 8 Körnerhärte; US Tide^®-Pulver, 2 g/l, 8 Körnerhärte, japanisches flüssiges Bonus^TM 0,65 g/l, 8 Körnerhärte, japanisches Ariel^®-Pulver, 0,65 g/l, 8 Körnerhärte; alle relativ zur Aktivität in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5.
Es wurde gefunden, dass Xyloglucanase aus allen drei Stämmen voll aktiv in allen getesteten kommerziellen Detergenzien und in allen getesteten Dosen ist.
BEISPIEL 4
Reinigung und Charakterisierung von Xyloglucanase, die aus Malbranchea cinnamomea kloniert ist
Fermentationsbrühen wurden erhalten aus Charge #9947 unter Verwendung der Aspergillus oryzae-Transformante Mstr125 (vgl Material und Methoden). Basierend auf der Sequenz SEQ ID Nr. 2 konnten die folgenden Daten berechnet werden: MW 25 kDa, pI 3,9, molarer Extinktionskoeffizient 65530.
Die Fermentationsbrühe wurde durch ein Whatman-Glassfilter GF/D filtriert, und insgesamt 4 700 ml mit 515 Xylounits pro ml wurden erhalten.
Die klare Fermentations-Lösung wurde konzentriert und mit Monopropylenglycol zur Beurteilung der Leistung formuliert.
Eine kleine Probe wurde zu hoher Homogenität unter Verwendung einer Superdex75-Chromatographiesäule unter Verwendung eines Natriumacetat-Puffers pH 6,0 gereinigt. Das reine Enzym gab eine einzelne Band in der SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 25 kDa. Unter Verwendung von DSC wurde die Schmelztemperatur mit 74 °C bestimmt. Das reine Enzym besitzt eine spezifische Aktivität von 160 Xyloeinheiten pro mg Protein.
Kanninchenserum gegen das reine Enzym wurde unter Verwendung normaler Verfahren in dem Dänischen Labor DAKO erzeugt.
Die N-terminale Sequenz des reifen Enzyms wurde ermittelt als ADFCGQXDSEQSGPYIVYNNLWN unter Einsatz des Edman-Abbaus, wobei das X nicht identifiziert werden konnte, aber es ist basierend auf der Gensequenz ein W.
Das Enzym war mehr als 50 % aktiv zwischen pH 5,5 und 9,0 bei 40 °C und vollständig aktiv in kommerziellen Pulver-Detergenzien.
Es war in einem flüssigen Detergenz sehr stabil mit einer Halbwertszeit von über 30 Tagen bei 35 °C.
Das Enzym hatte keine Aktivität für CMC, so dass es keine Cellulase ist.
LITERATURE

Cooney, D. & Emerson, R. 1964. Thermophilie fungi. An account of their biology, activites and classification. W.H. Freeman und Co., San Francisco und London, 188 pp.
Hawskworth, H.D. et al. 1995. Dictionary of the Fungi., IMI, CAB.
Pauly, M. et al. 1999 A xyloglucan-specific endo-β-1-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology 9: 93–100.
Mouchacca, J. 1997. Thermophilie fungi: biodiversity and taxonomic status. Cryptogamie, Mycol. 18: 19–69.
Oorschot, C.A.N. van & Hoog, G.S. de 1984. Some hyphomycetes with thallic conidia. Mycotaxon 20: 129–132.
Sigler, L. 1987. Trichothecium cinnamomeum, an earlier name for the thermophilic hyphomycete Malbranchea sulphurea. Myeologia 79: 142–143.
Sigler, L. & Carmichael, J.W. 1976. Taxonomy of Malbranchea and some other hyphomycetes with arthroconidia. Mycotaxon 4: 349–488.
Ausubel, F. M. et al. (eds.) „Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995.
N. C. Carpita und D. M. Gibeaut (1993) The Plant Journal 3: 1–30.
T. Christensen et al. Biotechnology Bd. 6 Seiten 1419–1422, 1988.
Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387–395.
Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol. 172: 4315–4321.
Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acryl amide gels. Anal. Biochem., 112, 295–298.
Eriksson, O.E. & Hawksworth, D.L.: Systema Ascomycetum vol 12 (1993).
S. C. Fry et al (1992) Biochemical Journal 282: 821–828
Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C. und Pegler, D.N.: Dictionary of the fungi, International Mycological Institute, 616 pp (1995) i
T. Hayashi und D. P. Delmer (1988) Carbohydrate Research 181: 273–277.
Henrissat, B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similaritites. Biochem. J., 280: 309–316.
Henrissat, B., und A. Bairoch. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similaritites. Biochem. J., 293: 781–788.
Jülich, W.: Higher Taxa of Basidiomycetes, Bibliotheca Mycologia 85, Seite 485 (1981).
Jorgensen, P.L. et al., 1990, Gene, 96, S. 37–41.
McKenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15: 93–103.
Leatherbarrow, R. J. (1992) Grafit version 3.0 Erithacus Software Ltd. Staines, U.K.
Lever, M. (1972) A new reaction for colormetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273–279.
O'Donnell, K.: Zygomycetes in culture, University of Georgia, US, Seite 257 (1979).
Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151–156.
J. K. C. Rose et al (1996) Plant Physiology 110: 493–499
A.L. Sonenshein, J.A. Hoch und Richard Losick (Eds.) (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, p.618.
Vincken, J.P., Beldman, G., und Voragen, A.G.J. Substrate-specificity of endoglucanases – what determines xyloglucanase activity. Carbohydrate Research 298(4): 299–310, 1997.
Von Arx, J. A.: The genera of fungi sporulating in culture, 424 20 Seite (1981).
R. L. Whistler und J. N. BeMiller (1993) Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives, Academic Press Inc.
Yasbin, R.E., Wilson, G.A. und Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121: 296–304.
W.S. York et al (1996) Carbohydrate Research 285: 99–128.

Sequenzprotokoll

Claims

Xyloglucanase der Familie 12, die ausgewählt ist aus einem von (a) einem Polypeptid, das ein Fragment einschließt, das durch die DNA-Sequenz der Positionen 141–806 der SEQ-ID. Nr. 1 kodiert wird; (b) einem Polypeptid, das durch Kultivieren einer Zelle, die die Sequenz der SEQ-ID. Nr. 1 umfasst, unter Bedingungen, wobei die DNA-Sequenz exprimiert wird, hergestellt wird; (c) einem Xyloglucanaseenzym einer Sequenz von mindestens 80%iger Identität mit den Positionen 1–222 der SEQ-ID. Nr. 2, wenn die Identität durch GAP, bereitgestellt in der GCG-Programmpaketversion 10.0, unter Verwendung einer GAP creation penalty von 8 und einer GAP extension penalty von 2 bestimmt wird.
Xyloglucanase nach Anspruch 1, die aus einem Malbranchea-Stamm erhalten wird oder erhältlich ist.
Isoliertes Xyloglucanaseenzym, das (i) von homologen Verunreinigungen frei ist und (ii) durch Kultivieren einer Zelle, die die DNA-Sequenz der Positionen 141–806 der SEQ-ID. Nr. 1 einschließt, erzeugt wird.
Enzympräparat, das die isolierte Xyloglucanase nach einem der Ansprüche 1–3 einschließt.
Präparat nach Anspruch 4, das außerdem ein oder mehrere Enzyme einschließt, die aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen (Endoglucanasen), β-Glucanasen, Hemicellulasen, Lipasen, Peroxidasen, Laccasen, α-Amylasen, Glucoamylasen, Cutinasen, Pectinasen, Reductasen, Oxidasen, Phenoloxidasen, Ligninasen, Pullulanasen, Pectatlyasen, Xyloglucanasen, Xylanasen, Pectinacetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pectinlyasen, weiteren Mannanasen, Pectin, Methylesterasen, Cellobiohydrolasen, Transglutaminasen; oder Gemischen davon ausgewählt sind.
Detergenszusammensetzung, die das Enzympräparat nach einem der Ansprüche 4–5 oder die isolierte Xyloglucanase nach einem der Ansprüche 1–3 einschließt.
Verfahren zur maschinellen Behandlung von Textilstoffen, wobei das Verfahren die Behandlung von Textilstoff während eines Waschcyclus eines Maschinenwaschvorgangs mit einer Waschlösung, die das Enzympräparat nach einem der Ansprüche 4–5 oder die isolierte Xyloglucanase nach einem der Ansprüche 1–3 enthält, umfasst.
Verwendung des Enzympräparats nach einem der Ansprüche 4–5 oder der isolierten oder gereinigten Xyloglucanase nach einem der Ansprüche 1–3 in der Textilindustrie zur Verbesserung der Eigenschaften von cellulosischen Fasern, Garn, gewebtem Stoff oder Vlies.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Enzympräparat oder das Enzym in einem Spülverfahrensschritt verwendet wird.
Verwendung des Enzympräparats nach einem der Ansprüche 4–5 oder der isolierten oder gereinigten Xyloglucanase nach einem der Ansprüche 1–3 in der Cellulosefaser-verarbeitenden Industrie zum Ratinieren von Fasern, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Hanf, Jute, Flachs und Leinen.