CN100523183C

CN100523183C - 来自畸枝霉属的碱性木葡聚糖酶

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Publication number: CN100523183C
Application number: CNB008113904A
Authority: CN
Inventors: 吴文平; M·舒雷恩; M·S·考平恩; M·A·斯特里格
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2020-08-11
Also published as: DE60028052D1; DE60028052T2; MXPA02001455A; WO2001012794A1; ATE326528T1; CA2381616A1; AU6558000A; CN1369007A; ES2265960T3; JP2003507039A; KR20020022804A; EP1210414B1; EP1210414A1

Abstract

一种具有木葡聚糖酶活性的分离或纯化的多肽，它是从畸枝霉属的菌株中获得的并具有：pH为4-11时在50℃下的木葡聚糖酶活性；和/或通过SDS-PAGE测定的25±10kDa的分子量；等电点(pI)3-5；和/或N-端序列Ala-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Ser-Glu-Gln-Ser-Gly-Pro-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu。它可用于工业如洗衣洗涤剂组合物和用于处理织物。

Description

来自畸枝霉属的碱性木葡聚糖酶

本发明涉及内源于属于畸枝霉属(Malbranchea)的菌株的木葡聚糖酶(xyloglucanase)，特别是pH在4-11的范围内呈现木葡聚糖酶活性的酶；本发明还涉及这些酶的生产方法；和这些酶在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中的用途。

发明背景

木葡聚糖是植物初生(正生长的)细胞壁中的一种主要结构多糖。从结构上讲，木葡聚糖由频繁被多种侧链取代的纤维素样β-1，4-键连接的葡萄糖主链组成。多数双子叶植物，某些单子叶植物和裸子植物的木葡聚糖是高度支化的多糖，其中主链中约75％的葡萄糖残基在0-6位带有糖基侧链。直接与该支化葡萄糖残基连接的糖基残基都是α-D-木糖。由于木糖残基在0-2位上有β-D-半乳糖或α-L-岩藻糖-(1-2)-β-D-半乳糖组成部分，因此木葡聚糖中高达50％的侧链包含1个以上的残基(C.Ohsumi和T.Hayashi(1994)植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)35：963-967、G.J.McDougall和S.C.Fry(1994)植物生理学杂志(Journal of Plant Physiology)143：591-595、J.L.Acebes等人(1993)植物化学(Phytochemistry)33：1343-1345)。通过酸水解，抽提自棉纤维的木葡聚糖以50:29:12:7的比例产生葡萄糖、木糖、半乳糖和岩藻糖(Hayashi等人，1988)。

茄科植物产生的木葡聚糖比较特殊，因为通常其中只有40％的β-1，4-键连接的葡萄糖残基在0-6位上带有糖基侧链。此外，高达60％的木糖残基在0-2位被α-L-阿拉伯糖基取代，一些茄科植物，诸如马铃薯之类，也有在一些木糖残基的0-2位存在β-D-半乳糖取代基的木葡聚糖(York等人(1996))。

木葡聚糖据信通过交联纤维素细丝形成纤维素-木葡聚糖网而在植物初生壁中起作用。该网状结构被认为是初生细胞壁的结构完整性所必需的(Carpita等人，1993)。木葡聚糖的另一重要功能是作为木葡聚糖亚基寡糖的贮藏器，它是植物细胞生长的生理活性调节剂。木葡聚糖亚基也可调节木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)的作用，XET是一种推测在植物细胞壁延伸中起作用的细胞壁相关酶。因此木葡聚糖可能在壁松弛及由此产生的细胞膨胀中起重要作用(Fry等人，1992)。

许多双子叶品种的种子包含木葡聚糖作为主要的多糖贮藏后备。这种类型的木葡聚糖位于种子子叶细胞壁内侧的巨大增厚部分中，它主要由葡萄糖、木糖和半乳糖组成(Rose等人，1996)。

在1943年，当树胶被发现可用作纸和纺织品浆料时，罗望子树酸豆(Tamarindus indica)的种子就成为树胶的商业来源。由于树胶的低成本及其优良特性，在亚洲已广泛使用罗望子木葡聚糖来对黄麻和棉进行上浆。罗望子木葡聚糖的食品应用包括用于糖果、果酱和果子冻，并可作为冰淇淋和蛋黄酱中的稳定剂(Whistler等人，1993)。

木葡聚糖酶活性不包括在酶命名法提供的酶分类中(1992)。迄今为止，这一酶活性只被简单地归于葡萄糖酶活性类，并常被认为与纤维素分解活性(EC 3.2.1.4)，即水解纤维素或纤维素衍生底物中β-1，4-糖苷键的活性相同，或者至少是具有纤维素分解活性的酶的一种次要活性。然而，真正的木葡聚糖酶是真正具有木葡聚糖专一性的酶，它能够催化木葡聚糖至木葡聚糖寡糖的水解作用，但无实质性的纤维素分解活性，例如，水解常规使用的纤维素样底物CMC(羧甲基纤维素)、HE纤维素和Avicel(微晶纤维素)的活性。木葡聚糖酶裂解木葡聚糖主链中的β-1，4-糖苷键。

Vincken等人描述了木葡聚糖酶活性(1997)，他从绿色木霉(与T.reesei相似)中鉴定出了三种不同内切葡聚糖酶，这三种酶都具有水解纤维素或CMC的高活性，并表明EndoI(真正属于糖基水解酶家族5，参见Henrissat，B.等人(1991，1993))基本上无(即很少有)水解木葡聚糖的活性，而EndoV(属于糖基水解酶家族7)和EndoIV(属于糖基水解酶家族12)均分别具有水解木葡聚糖和CMC的活性，并且活性水平相当。

国际专利申请WO 94/14953公开了克隆自真菌棘孢曲霉的木葡聚糖酶(EGII)。

国际专利公开WO 98/38288公开了分别来自Tiarosporellaphaseolina和Dichotomocladium hesseltinei的木葡聚糖酶的氨基酸序列。

国际专利公开WO 98/50513公开了含木葡聚糖酶的洗衣和清洁组合物。

国际专利公开WO 99/02663公开了克隆自地衣形芽胞杆菌和Bacillus agaradhaerens的木葡聚糖酶。

由于许多重要的工艺，工业工艺和使用工业生产的试剂的家庭工艺，都是在碱性高pH条件下操作的。因此，需要一种在碱性pH下具有高木葡聚糖酶活性的真正木葡聚糖酶。

发明概述

本发明人已发现了在碱性范围的高pH下具有高木葡聚糖酶活性的酶，这些酶是从属于真菌畸枝霉属的菌株中获得或内源于该菌株。

因此，本发明涉及一种分离或纯化的木葡聚糖酶，它是从属于畸枝霉属的菌株中获得的，优选属于选自以下种的菌株：Malbrancheacinnamomea(和这三个同义词Malbranchea sulfurea、Malbrancheapulchella var.sulfurea和Thermoidium sulfureum)、Malbrancheagraminicola、Malbranchea pulchella、Malbranchea filamentosa、Malbranchea gypsea、Malbranchea albolutea、Malbranchea arcuata、Malbranchea aurantiaca、Malbranchea bolognesii-chiurcoi、Malbranchea chrysosporioidea、Malbranchea circinata、Malbrancheaflava、Malbranchea flavorosea、Malbranchea flocciformis、Malbranchea fulva、Malbranchea kambayashii、Malbrancheamulticolor、Malbranchea sclerotica、Malbranchea setosa和Malbranchea dendritica，该酶呈现木葡聚糖酶活性并且对纤维素或纤维素衍生底物没有活性。在本发明的一个优选实施方式中，木葡聚糖酶的表观分子量为25±10kDa，pI在3-5之间并且pH在4-11时在50℃下测得具有木葡聚糖酶活性。

在另一方面，本发明提供了一种克隆自属于畸枝霉属的菌株的木葡聚糖酶，即选自以下之一的木葡聚糖酶：(a)含有由SEQ ID NO：1的141-806位置的DNA序列编码的片段的多肽；(b)在表达所述DNA序列的条件下通过培养含SEQ ID NO：1的序列的细胞产生的多肽；和(c)当同源性是通过10.0版本的GCG程序包中提供的GAP且使用GAP产生罚分(creation penalty)为8且GAP延伸罚分(extension penalty)为2测定时，序列与SEQ ID NO：1的1-222位具有至少80％同源性的木葡聚糖酶。

另一方面，本发明提供了一种具有木葡聚糖酶活性的分离或纯化的多肽，它是从畸枝霉属的菌株获得的并具有：

i)pH为4-11时在50℃下测定的木葡聚糖酶活性；

ii)通过SDS-PAGE测定的分子量为25±10kDa；

iii)等电点(pI)在3-5；和/或

iv)N-端序列Ala-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Ser-Glu-Gln-Ser-Gly-Pro-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu。

本发明还提供了一种分离的木葡聚糖酶，它(i)无同源杂质，及(ii)是通过培养含有SEQ ID NO：1的141-806位的DNA序列的细胞产生的。

本发明的新型酶可用于处理纤维素材料，尤其是含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物。可在将纤维素材料加工成可备用于服装制造或织物制造的材料的过程中进行上述处理，例如，在脱浆或冲洗步骤中；或者在这种织物或服装的工业或家庭洗衣过程中进行处理。

因此，更进一步，本发明涉及一种含有在碱性pH范围内具有显著活性的木葡聚糖酶的洗涤剂组合物，该酶内源于属于真菌畸枝霉属的菌株，特别是属于真菌菌种Malbranchea cinnomomea；本发明还涉及本发明的酶在含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物的处理中的用途。

本发明现在已使将真正的酶促洗涤过程用于纤维素材料的制备中成为可能，例如使得在随后的染色操作中有适当反应。进一步地，预计含该新型酶的洗涤剂组合物能去除或漂白洗衣中出现的某些污物或色斑，特别是由含木葡聚糖食品、植物等产生的污迹或斑点。预计用含该新型酶的洗涤剂组合物进行处理能阻止某些污物与残留在纤维素物质上的木葡聚糖结合。

附图

在附图中：

图1显示了pCaHj 527的构建过程；

图2显示了源自菌株UAMH2485的级分(fraction)在595nm下的相对木葡聚糖酶和CMC-酶活性；

图3显示了源自CBS 343.55的级分在595nm下的相对木葡聚糖酶和CMC-酶活性；和

图4显示了源自CBS 960.72的级分在595nm下的相对木葡聚糖酶和CMC-酶活性。

发明详述

在糖基水解酶10多个不同家族中均发现了纤维素酶。一些纤维素酶也呈现木葡聚糖酶活性。今天，这些纤维素酶已发现可归类于家族5、7和12。而底物专一性却不与家族直接相关：在一家族内主要的酶活性可以是纤维素酶或甘露聚糖酶(家族5)，或地衣多糖酶(lichinase)、β-1，3-葡聚糖酶或木葡聚糖转移酶活性(家族16)。迄今为止仅仅非常少的酶被公开其大部分或主要酶活性是对木葡聚糖的活性。如上所述，该活性还未收入正式的酶命名法中。

在本发明上下文中，术语“酶制剂”表示或者是来自单个微生物菌种的常规酶发酵产品，可能已分离和纯化，这些制剂常含有许多不同的酶活性；或者是单组分酶的混合物，优选使用常规重组技术而得自细菌或真菌菌种的酶，这些酶已被发酵并且可能已分别分离和纯化，且它们可来源于不同的菌种，优选真菌或细菌的菌种；或者是作为表达重组木葡聚糖酶之宿主细胞的微生物的发酵产品，但该微生物同时还产生其它酶，如木葡聚糖酶、蛋白酶或纤维素酶，它们是该微生物的天然存在的发酵产物，即由相应的天然存在的微生物常规产生的酶复合物。

在一优选实施方式中，与最佳pH时的活性相比，本发明的木葡聚糖酶在pH9.5的相对活性为至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，特别是至少65％更特别是70％。

在另一优选实施方式中，与最佳pH时的活性相比，本发明的木葡聚糖酶在pH10时的相对活性为至少40％，优选至少50％，更优选至少55％，特别是至少60％。

在另一优选实施方式中，本发明的木葡聚糖酶在20℃-70℃的温度下有活性。与最佳温度下的活性相比，本发明的木葡聚糖酶在40-60℃的温度范围内的相对活性优选为至少40％，更优选至少50％，特别是至少55％，尤其是至少60％。

本发明的木葡聚糖酶对纤维素或纤维素衍生底物没有活性。测定纤维素酶活性(内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，即EC 3.2.1.4)的常规底物是羧甲基纤维素(CMC)。测定纤维素酶或纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)的另一常规底物是Ayicel，它是本领域技术人员公知的微晶纤维素。

本发明还涉及含有本文所述的木葡聚糖酶的酶制剂，任选还含有一种或多种选自以下的酶：蛋白酶、纤维素酶(内切-β-1，4-葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶(内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶)、脂酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(rhamnogalacturonan acetyl esterase)、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonase)、果胶分解酶、果胶酸酯分解酶(pectate lyase)、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、或它们的混合物。在一个优选实施方式中，制剂中的一种或多种或所有酶是利用重组技术制备的，即该(诸)酶是单组分酶，它(它们)与其它酶混合以形成具有所需酶混合的酶制剂。

另一方面，本发明还涉及一种生产本发明木葡聚糖酶或木葡聚糖酶制剂的方法，该方法包括培养一微生物，例如真菌畸枝霉属的菌株，优选属于以下菌种的菌株：Malbranchea cinnamomea(和这三个同义词Malbranchea sulfurea、Malbranchea pulchella var.sulfurea和Thermoidium sulfureum)、Malbranchea graminicola、Malbrancheapulchella、Malbranchea filamentosa、Malbranchea gypsea、Malbranchea albolutea、Malbranchea arcuata、Malbrancheaaurantiaca、Malbranchea bolognesii-chiurcoi、Malbrancheachrysosporioidea、Malbranchea circinata、Malbranchea flava、Malbranchea flavorosea、Malbranchea flocciformis、Malbrancheafulva、Malbranchea kambayashii、Malbranchea multicolor、Malbranchea sclerotica、Malbranchea setosa和Malbrancheadendritica，例如选自以下的菌株：Malbranchea cinnamomea、CBS115.68、MUCL 11291、CBS 343.55、MUCL 9500、UAMH 3827、CBS 423.54、CBS 960.72和UAMH 2485，所述微生物在允许产生木葡聚糖酶的条件下能够产生该酶，并从培养物中回收此酶。可利用常规发酵技术进行培养，如在摇瓶或带搅拌的发酵罐中培养以确保在诱导木葡聚糖酶产生的生长培养基中有足够的通气量。生长培养基中可包括诸如蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白氨基酸之类的常规N-源，少量的诸如葡萄糖或蔗糖之类的常规C-源，还有如木葡聚糖或谷糠(如小麦麸或米壳)之类复合植物底物的诱导剂。可用常规技术进行回收。，如用离心或过滤方法分离生物质和上清液，回收上清液、或如果感兴趣的酶在胞内就裂解细胞，可能还要如EP 0 406 314所述的进行纯化或如WO 97/15660所述进行结晶。

在本发明上下文中，术语“表达载体”指含目的多肽编码片段及与其可操作相连提供其转录的附加片段的线性或环状DNA分子。这些附加片段可能包括启动子和终止子序列，并可选择性地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可包括二者的元件在内。本发明的表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择常取决于它将引入的宿主细胞。因而，该载体可为自主复制型载体，即作为一染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种形式，当将其引入宿主细胞时，可以整合入宿主细胞基因组并与其整合入的染色体一起复制。

本文有关多肽或蛋白质表达时所用的术语“重组体表达”或“重组表达”是按照本领域的标准定义限定的。蛋白质的重组表达通常是利用上文刚提到的表达载体进行的。

当用于多核苷酸分子时，术语“分离的”表示已脱离天然的遗传环境因而无其它外源或不希望有的编码序列的多核苷酸，它为适用于基因工程蛋白质生产系统的形式。这些分离的分子是那些分离自其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含通常与它们相关的其它基因，但可以包括诸如启动子和终止子之类的天然存在的5’和3’非翻译区。相关区域的鉴定对本领域常规技术人员将是显而易见的(参见例如Dynan和Tijan，自然(Nature)316：774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”或者可称为“克隆的多核苷酸”。

当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表明该蛋白质是在非其天然环境的条件下发现的。在一优选形式中，该分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，尤其是物其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供纯度高于40％的蛋白质，更优选提供纯度超过60％的蛋白质。

甚至更优选提供高度纯化形式的蛋白质，即通过SDS-PAGE测定，纯度高于80％，更优选纯度高于95％，还更优选纯度高于99％。

术语“分离的蛋白质/多肽”或者可称为“纯化的蛋白质/多肽”。

术语“同源杂质”意指源自最初得到本发明多肽的同源细胞的任何杂质(如除本发明多肽之外的其它多肽)。

本文所用与特定微生物来源相关的术语“获自”指由该特定来源产生的多核苷酸和/或多肽，或已插入此来源的基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。

当指DNA片段时，术语“可操作连接”表示该片段被连接在一起以便它们所起作用与它们原预期目的一致，如转录起始于启动子并通过编码片段直到终止子。

术语“多核苷酸”表示从5’到3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可分离自天然来源、体外合成或制备自天然和合成分子的联合体。

术语“多核苷酸分子的互补物”是指与对比序列相比具有互补碱基序列并反向定向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。

术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。

术语“启动子”表示含有一部分基因的DNA序列，所述DNA序列用于结合RNA聚合酶并起始转录。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5’非编码区。

术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为更大多肽的一个组分，介导该更大的多肽穿过合成它的细胞的分泌路径。在通过分泌路径的时候，该更大的肽通常被裂解去除了该分泌肽。

多核苷酸：

在本发明的优选实施方式中，本发明的分离多核苷酸在至少是中度严格条件下可与SEQ ID NO：1的相似大小区域或其互补序列杂交。

具体地说，本发明的多核苷酸在至少是中度严格的条件下，优选如下详述的高度严格条件下可与下述变性双链DNA探针杂交：包含SEQ IDNO：1中所示的全长序列或包含SEQ ID NO：1的141-806位中所示的序列的探针，或者含SEQ ID NO：1且长度至少为约100个碱基对的亚序列的任何探针。测定中度或高度严格条件下核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包括将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5 x SSC(氯化钠/柠檬酸钾，Sambrook等，1989)中10分钟，并于5 x SSC、5 x Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％ SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含浓度为10ng/ml的随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132：6-13)、³²P-dCTP-标记的(比活性高于1 x 10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中约45℃下杂交12小时。滤膜随后在2 x SSC、0.5％ SDS中洗涤两次，每次30分钟，洗涤温度为至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中/高度严格条件)，还更优选至少70℃(高度严格条件)，更优选至少75℃(极高严格条件)。

用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交上的分子。

如前面所提到的，这些分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知的方法从基因库或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。

随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码具有木葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。

本发明进一步提供了来自不同真菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。

将由本发明的畸枝霉属木葡聚糖酶的克隆提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆具有木葡聚糖酶活性的多肽的种同系物。例如，DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型获得的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开畸枝霉属木葡聚糖酶DNA和多肽序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴定DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具有木葡聚糖酶活性的多肽的DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按上述序列设计的探针进行探测，或用基于这些序列的一套或多套简并探针进行探测。DNA序列也可采用聚合酶链反应或PCR(Mullis，US 4,683,202)，用设计自上述序列的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对木葡聚糖酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测感兴趣的DNA的表达，该木葡聚糖酶克隆自Malbranchea cinnamomea、CBS 115.68、MUCL 11291、CBS 343.55、MUCL 9500、UAMH 3827、CBS 423.54、CBS 960.72或UAMH 2485，经过表达和纯化；或者可通过涉及有木葡聚糖酶活性的多肽的活性测定检测感兴趣的DNA的表达。

多肽：

SEQ ID NO：2中氨基酸第29-250位的氨基酸序列被认为是成熟木葡聚糖酶，所述N-端序列从SEQ ID NO：2的第29位开始。

本发明还提供了与SEQ ID NO：2中第1-250位或第29-250位氨基酸的多肽及其种同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的木葡聚糖酶多肽。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO：2中第1-250位或第29-250位氨基酸或其直向同系物或共生同系物中所示序列序列同源性达70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，并且还更优选至少90％。这些多肽将更优选与SEQ ID NO：2中第1-250位或第29-250位氨基酸或其直向同系物或共生同系物中所示序列的同源性达至少95％，或者最优选98％或更多。

序列相同性百分率是用常规方法，通过本领域已知的计算机程序进行测定的，诸如GCG程序包(Wisconsin程序包程序指南Program Manualfor the Wisconsin Package)，版本10.0，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，GAP与以下设置一起用于多肽序列比较：GAP产生罚分为8并且GAP延伸罚分为2。

来自Malbranchea cinnamomea(SEQ ID NO：2)的XYG1011-编码的家族12木葡聚糖酶前体的推测氨基酸序列与7个真菌家族12酶的选择显示49.1-66.2％的序列相似性，和43.9-61.2％序列相同性。这些序列采用缺口产生罚分为8且缺口延伸罚分为2的GCG Wisconsin软件包，第10.0版，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)(GCG)，Madison，Wisconsin的GAP程序进行对比：

	Malbranchea cinnamomea
	Malbranchea cinnamomea	Tiasporella phaseolina，w68593	66.2％相似性61.2％相同性
棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，o94218	65.4％相似性58.7％相同性	Tiasporella phaseolina，w68593	66.2％相似性61.2％相同性
棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，o94218	65.4％相似性58.7％相同性	Emericella desertoru，y06366	57.3％相似性52.4％相同性
玫瑰色胶霉(Gliocladium roseum)，y06362	58.9％相似性54.5％相同性	Emericella desertoru，y06366	57.3％相似性52.4％相同性
玫瑰色胶霉(Gliocladium roseum)，y06362	58.9％相似性54.5％相同性	爪哇镰孢(Fusarium javanicum)，y06359	61.7％相似性55.0％相同性
Myceliophthora thermophila，w23540	50.0％相似性46.7％相同性	爪哇镰孢(Fusarium javanicum)，y06359	61.7％相似性55.0％相同性
Myceliophthora thermophila，w23540	50.0％相似性46.7％相同性	Trichoderma reesei，y06330	49.1％相似性43.9％相同性

基本同源的蛋白质和多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。这些改变优选为影响较小的改变，即保守氨基酸的取代(见表2)及其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠或活性的取代；小的缺失，通常是1-约30个氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯化的小延伸(亲和标记)，如聚组氨酸序列段、蛋白A(Nilsson等，EMBOJ.4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法(Methods Enzymol.)198：3，1991。通常参见，Ford等人，蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107，1991，在此引用作为参考。编码亲和标记的DNA可从产品供应商处购买到(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。

然而，即便上述优选的变化是影响较小的改变，这些改变也可以是影响较大的变化如将长达300个氨基酸或更多的较长多肽作为氨基或羧基端延伸融合到具有木葡聚糖酶活性的本发明多肽上。

表1

保守氨基酸的取代

碱性氨基酸：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸：谷氨酸

天冬氨酸

极性氨基酸：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性氨基酸：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族氨基酸：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小氨基酸：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除了这20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，和/或在它们的侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买获得，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。

本发明的木葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按照本领域已知步骤进行鉴定，如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)244：1081-1085，1989)。在后一技术中，在分子中的每个残基位置处引入单个丙氨酸突变，并检测所产生的突变分子的生物活性(即木葡聚糖酶活性)以鉴定对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：4699-4708，1996。酶的活性位点或其它生物学相互作用也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记之类技术测定的结构的物理分析连同假定接触位点氨基酸的突变进行测定。参阅，例如，de Vos等人，科学(Science) 255：306-312，1992；Smith等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.309：59-64，1992。必需氨基酸的位置也可从与涉及本发明多肽的多肽的同源性分析中推断。

可用已知的诱变、重组和/或重排方法及随后的相关筛选步骤进行多个氨基酸取代和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科学(Science)241：53-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国立科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：2152-2156，1989)、WO 95/17413或WO 95/22625所公开的技术。简要地说，这些作者公开了用于使多肽中两个或多个位置同时随机化，或进行不同突变的重组/改组(WO95/17413、WO 95/22625)，随后从功能上选择多肽，然后将诱变多肽测序以测定每个位置可允许取代的范围的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学(Biochem.)30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利US 5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和定位诱变(Derbyshire等，基因(Gene)46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。

上面公开的诱变/改组方法可与大容量、自动筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代设备迅速测序。这些方法可快速测定感兴趣的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。

利用上述方法，本领域普通技术人员能鉴定和/或制备与本发明畸枝霉属木葡聚糖酶的氨基酸序列基本同源并保留野生型蛋白质的木葡聚糖酶活性的各种多肽。

除含催化结构域的酶核心之外，本发明的木葡聚糖酶还可以包含纤维素结合结构域(CBD)，该酶的纤维素结合结构域和酶核心(催化活性结构域)可操作连接。纤维素结合结构域(CBD)可作为所编码之酶的内在部分存在，或者可将另一来源的CBD引入木葡聚糖酶中，从而产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等人的″可溶性碳水化合物的酶降解(Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates)″中的″纤维素-结合结构域：分类和性质(Cellulose-Binding Domains：Classification and Properties)″，John N.Saddler和Michael H.Penner(编辑)，ACS专题论丛(ACSSymposium Series)，No.618，1996的定义理解。这一定义将120种以上的纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶之类的多种酶中有CBD。在藻类如红藻Porphyra purpurea中也已找到了作为非水解性多糖结合蛋白质的CBD，参阅Tomme等人，出处同前。然而，大部分CBD是来自纤维素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。参阅如WO 90/00609和WO 95/16782，本领域已知有酶杂合体的形式，通过将含有纤维素结合结构域的的编码DNA至少一个片段、及通过或不通过连接子与之相连的木葡聚糖酶编码DNA序列的DNA构建体转化到宿主细胞中，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用以下公式描述：

CBD-MR-X

其中CBD是相应于至少为纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(连接子)，可以是一个键，或一个短的连接基团，优选约2-约100个碳原子长的，更优选2-40个碳原子长的；或者优选约2-约100氨基酸长的，更优选2-40个氨基酸长的；而X是本发明多核苷酸分子所编码多肽的N-末端或C-末端区域。

木葡聚糖底物

除了上述关于木葡聚糖的说明之外，还应提到来自Megazyme，爱尔兰提供的罗望子树种子的木葡聚糖具有复杂的分支结构，含比率为45:36:16:3的葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖。因此，可以肯定地认为对这一木葡聚糖显示催化活性的酶对不同来源(被子植物或裸子植物)的其它木葡聚糖结构也有催化活性。

洗涤工业中的用途

在洗涤和穿着过程中，染色织物或服装上的染料通常会从织物上溢出，这使得织物看起来比较陈旧和褪色。除去织物表面上的纤维可部分恢复织物的原色和外观。本文所用的术语“颜色澄清”是指通过多次洗涤循环而部分恢复织物或服装的原色。

术语“去小球”是指除去织物表面上的小球。

术语“浸泡液”是指可在进行常规洗涤过程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗涤或洗衣过程中常规使用的一种或多种成分。

术语“洗涤液”是指在其中洗涤衣物的水溶液，即，这种衣物洗涤通常是手工进行或在洗衣机中进行的化学和机械的混合作用。洗涤液通常是粉状或液态洗涤剂组合物的水溶液。

术语“漂洗液”是指习惯上在衣物洗涤之后立即泡入或在其中处理以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗涤剂溶液)的水溶液。漂洗液中可含有织物调理或软化组合物。

可用本发明方法处理的衣物可以是常规的可洗涤的衣物。优选衣物的主要部分是由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖的纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝、苎麻、大麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、lyocell)。

洗涤剂的公开内容和实施例

表面活性剂体系

本发明的洗涤剂组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可以选自非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂和/或阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂和/或半极性表面活性剂。

表面活性剂一般以0.1％-60％(重量)的量存在。

优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分相容。在液体或凝胶组合物中，最优选以这样的方式配制表面活性剂，致使它促进或至少是不降低这些组合物中的任何酶的稳定性。

根据本发明使用的优选体系包括本文中所述的作为表面活性剂的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。

烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，聚氧乙烯缩合物是优选的。这些化合物包括具有含约6-约14个碳原子，优选约8-约14个碳原子直链或支链构型之烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中，环氧乙烷存在的量等于每摩尔烷基酚约2-约25摩尔，更优选约3-约15摩尔。这类市售的非离子表面活性剂包括：由GAF Corporation销售的Igepal^TM CO-630；和均由Rohm & Haas Company销售的Triton^TM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。

伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物适合用作本发明的非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲的，并且通常含有约8-约22个碳原子。优选的是具有含约8-约20个碳原子，更优选约10-约18个碳原子烷基的醇与每摩尔醇约2-约10摩尔环氧乙烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-约7摩尔的环氧乙烷，最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性剂的例子包括：由Union Carbide Corporation销售的Tergitol^TM 15-S-9(C₁₁-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和Tergitol^TM 24-L-6NMW(C₁₂-C₁₄伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和由Shell Chemical Company销售的Neodol^TM 45-9(C₁₄-C₁₅直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 23-3(C₁₂-C₁₃直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 45-7(C₁₄-C₁₅直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、Neodol^TM 45-5(C₁₄-C₁₅直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；由Procter & Gamble Company销售的Kyro^TM EOB(C₁₃-C₁₅醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的GenapolLA050(C₁₂-C₁₄醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的优选范围是8-11，最优选8-10。

也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在US4,565,647中公开的烷基多糖，具有含约6-约30，优选约10-约16个碳原子的疏水基团，和含约1.3-约10，优选约1.3-约3，最优选约1.3-约2.7糖单元的亲水基团的多糖，如多糖苷。可以使用任何含有5或6个碳原子的还原糖，如葡萄糖、半乳糖并且可以将半乳糖基部分用葡萄糖基部分代替(任选地，在2-、3-、4-等位连接疏水基团从而得到对应于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如附加糖单元的1位和前一糖单元的2-、3-、4-，和/或6-位之间。

优选的烷基多糖苷具有下式：

R²O(C_nH_2nO)_t(糖基)_x

其中R²选自：烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、及其混合物，其中烷基含有约10-约18，优选约12-约14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-约10，优选约1.3-约3，最优选约1.3-约2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物，先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元在其1-位置与前面的糖基单元2-、3-、4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。

环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分的分子量优选为约1500-约1800并显示出水不溶性。将聚氧乙烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量为该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质。这类化合物的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Pluronic^TM表面活性剂。

也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量一般是约2500-约3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合产物含有约40％-约80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5,000-约11,000。这类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的Tetronic^TM化合物。

优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是：烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-约25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖、及其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C₈-C₁₄烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C₈-C₁₈(优选平均为C₁₀)醇乙氧基化物、和其混合物。

非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂：

其中R¹是H、或R¹是C_1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混合物，R²是C_5-31烃基，Z是具有直链烃基、至少3个羟基直接连接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R¹是甲基，R²是直链C_11-15烷基或C_16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基、或其混合物，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖衍生的。

非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活性剂。其例子是式RO(A)_mSO₃M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C₁₀-C₂₄烷基或具有C₁₀-C₂₄烷基部分的羟基烷基，优选C₁₂-C₂₀烷基或羟基烷基。更优选C1₂-C₁₈烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，一般为约0.5-约6，更优选约0.5-约3，并且M是H或阳离子，该阳离子可以是：例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代铵阳离子的具体例子包括：甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活性剂是：C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(1.0)M)、C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(2.25)M)、和C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(3.0)M)、和C₁₂-C₁₈烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸盐(C₁₂-C₁₈E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。

适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society″，52(1975)，pp.323-329”用气态SO₃磺化的C₈-C₂₀羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的原料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天然脂类物质。

优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：

其中R³是C₈-C₂₀烃基，优选烷基，或其组合，R⁴是C₁-C₆烃基，优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸盐形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R³是C₁₀-C₁₆烷基，R⁴是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中R³是C₁₀-C₁₆烷基。

其它合适的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐表面活性剂，它们是式ROSO₃M的水溶性盐或酸，其中R优选是C₁₀-C₂₄烃基，优选具有C₁₀-C₂₀烷基部分的烷基或烃基烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或烃基烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)、或铵或取代铵(例如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子，和季铵阳离子例如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合物衍生的季铵阳离子，等等)。一般地，对于较低的洗涤温度(例如低于约50℃)，C₁₂-C₁₆烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例如高于约50℃)，C₁₆-C₁₈烷基链是优选的。

其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。它们可以包括：皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C₈-C₂₂伯或仲烷烃磺酸盐、C₈-C₂₄烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧酸(例如，如在英国专利GB 1,082,179说明书中所述的)、C₈-C₂₄烷基聚二醇醚硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和不饱和C₁₂-C₁₈单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C₆-C₁₂二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐如烷基多葡糖苷(下面所述的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH₂CH₂O)_k-CH₂COO^-M⁺的盐，其中R是C₈-C₂₂烷基，k是1-10的整数，并且M是形成水溶性盐的阳离子。树脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香酸、氢化松香酸，以及存在于或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。

烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。

其它例子描述于“表面活性剂和洗涤剂(Surface Active Agents andDetergents)”(Vol.I和II，Schwartz、Perrry和Berch)中。各种这样的表面活性剂也一般性地公开在US 3,929,678中(第23栏58行-第29栏23行，该文献引入本文作为参考)。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约1％-约40％，优选约3％-约20％(重量)的上述阴离子表面活性剂。

本发明的洗衣洗涤剂组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和半极性表面活性剂，以及上文中未叙及的非离子和/或阴离子表面活性剂。

适用于本发明洗衣洗涤剂组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活性剂：

[R²(OR³)_y][R⁴(OR³)_y]₂R⁵N⁺X^-

其中R²是在烷基链中具有约8-约18个碳原子的烷基或烷基苄基，每个R³选自：-CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂CH(CH₂OH)-、-CH₂CH₂CH₂-、和其混合物；每个R⁴选自：C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、由两个R⁴基团连接在一起形成的苄基环结构、-CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH(其中R⁶是己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时是氢)；R⁵与R⁴所述相同或是烷基链，其中R²+R⁵的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10，且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。

非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中有用的水溶性季铵盐化合物：

R₁R₂R₃R₄N⁺X^- (i)

其中R₁是C₈-C₁₆烷基，每个R₆、R₂和R₄各自独立地是C₁-C₄烷基、C₁-C₄羟基烷基、苄基和-(C₂H₄O)_xH(其中x的值是2-5)，X是阴离子。R₂、R₃或R₄中不多于1个是苄基。

R₁的优选烷基链长度是C₁₂-C₁₅，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生的时，尤为如此。

用于R₂、R₃和R₄的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以选自：卤素离子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根离子。

用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是：

氯化或溴化椰油基三甲基铵；

氯化或溴化椰油基二羟基乙基铵；

氯化癸基三乙基铵；

氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化C_12-15二甲基羟基乙基铵；

氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；

甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；

氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)₄铵；

胆碱酯(式(i)的化合物，其中R₁是

二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。

其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US 4,228,044和EP000 224中。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2％-约25％，优选约1％-约8％重量的上述阳离子表面活性剂。

两性表面活性剂也适用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代基含有至少约8个碳原子，一般约8-约18个碳原子，并且至少一个脂族取代基含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。见US3,929,678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有0.2％-约15％，优选约1％-约10％重量的上述两性表面活性剂。

两性离子表面活性剂也适用于洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，杂环仲或叔胺的脂族衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。参见US 3,929,678(第19栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有0.2％-约15％，优选约1％-约10％重量的上述两性离子表面活性剂。

半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它们包括：含有1个约10-约18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基和羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10-约18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-约18个碳原子的烷基部分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的部分的水溶性亚砜。

半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：

其中R³是含有约8-约22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基，或其混合物；R⁴是含有约2-约3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x是0-约3；并且每个R⁵是含有约1-约3个碳原子的烷基或羟基烷基，或含有约1-约3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R⁵基团可以彼此连接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。

特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C₁₀-C₁₈烷基二甲基胺和氧化C₈-C₁₂烷氧基乙基二羟基乙基胺。

当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有0.2％-约15％，优选约1％-约10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。

助洗剂体系

本发明的组合物还可以含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸的材料、金属离子螯合剂例如氨基多膦酸盐，特别是乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。

合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合硅铝酸盐材料，更具体地说是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。

另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na₂Si₂O₅)组成的结晶层状硅酸盐。

合适的含有1个羧基的多羧酸盐包括：乳酸、乙醇酸和其醚衍生物，如在比利时专利831,368、821,369和821,370中所公开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括：琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国专利2,446,686和2,446,487以及US 3,935,257中所述的醚羧酸盐，和在比利时专利840,623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧基的多羧酸盐具体地包括水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利GB 1,379,241中所述的羧基甲氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳羟琥珀酸盐(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利1,387,447中所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐。

含有4个羧基的多羧酸盐包括：在英国专利1,261,829中公开的氧联二琥珀酸盐、含有磺基取代基的1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐包括：在英国专利1,398,421和1,398,422以及US 3,936,448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专利1,082,179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利1,439,000中公开了含有膦基取代基的多羧酸盐。

脂环和杂环多羧酸盐包括：烷戊烷-顺，顺-顺-四羧酸盐、环戊二烯戊羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢-呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢-呋喃-顺，二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括：苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和在英国专利1,425,343中公开的苯二甲酸衍生物。

在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。

用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸盐螯合剂如柠檬酸。

包括在本发明洗涤剂组合物中的合适的螯合剂包括：乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS钠盐的例子包括Na₂EDDS和Na₄EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例子包括MgEDDS和Mg₂EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中的。

优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A和水溶性羧酸盐螯合剂如柠檬酸的混合物。

可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材料包括：无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。

其它合适的水溶性有机盐是均聚和共聚的酸或其盐，其中该聚羧酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。

这类聚合物公开于GB-A-1,596,756中。这样的盐的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有20,000-70,000，特别是约40,000的分子量。

洗涤助洗剂盐的含量通常为组合物重量的5％-80％。用于液体洗涤剂的助洗剂的优选含量是5％-30％。

酶

除了本发明的酶制剂外，优选洗涤剂组合物还含有提供清洗性能和/或织物护理益处的其它酶。

这样的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。

蛋白酶：可以使用任何适用于碱性溶液的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化学或基因改性突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，尤其是从芽孢杆菌衍生的那些酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢属蛋白酶。

优选的市售蛋白酶包括：由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase销售的那些酶，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect和Purafect OXP销售的那些酶，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase销售的那些酶。按组合物重量计，可以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将蛋白酶掺入到本发明的组合物中。

脂肪酶：可以使用任何适用于碱性溶液的脂肪酶。合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些酶。包括化学或基因工程改性的突变体。

有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP 258 068和EP 305 216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP 238 023中的，假丝酵母属脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP 214 761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假单胞菌属脂肪酶例如描述于EP 218 272中的产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331 376中的洋葱假单胞菌脂肪酶、例如公开于GB1,372,034中的司徒茨氏假单胞菌脂肪酶、荧光假单胞菌脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica etBiophysica acta 1131,253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)。

此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等(1991)在“基因(Gene)”103，61-67中描述的沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志(J.Biochem.)，106，383-388)，和各种根霉属脂肪酶例如德列马根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，基因(Gene)，109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科学.生物技术.生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)，56，716-719)和米根霉脂肪酶。

其它类型的脂类分解酶，如角质酶也是有用的，例如WO 88/09367中所述来自门多萨假单胞菌的角质酶，来自Fusarium solani pisi的角质酶(如WO 90/09446所述)。

特别合适的脂肪酶是下面这些脂肪酶：例如M1 Lipase^TM、Luma fast^TM和Lipomax^TM(Genencor)、Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novo NordiskA/S)，和Lipase P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。

按组合物重量计，一般以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将脂肪酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

淀粉酶：可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合适的淀粉酶包括细菌和真菌来源的那些酶。包括化学或基因工程改性的突变体。淀粉酶包括：例如，在GB 1,296,839中详细描述的从地衣芽孢杆菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(从Novo Nordisk A/S得到)和Rapidase^TM和MaxamylP^TM(从Genencor得到)。

按组合物重量计，一般以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将淀粉酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

纤维素酶：可以使用适用于碱性溶液的任何纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的那些酶。包括化学或基因工程改性的突变体。合适的纤维素酶公开于US 4,435,307(其中公开了从Humicola insolens生产的真菌纤维素酶)，WO 96/34108和WO 96/34092(其中公开了来自芽孢杆菌的细菌嗜碱性纤维素酶(BCE 103))，WO 94/21801、US 5,475,101和US 5,419,778(其中公开了木霉的EG III纤维素酶)中。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于欧洲专利申请0 495 257中的纤维素酶。市售的纤维素酶包括从一株Humicola insolens生产的Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novo Nordisk A/S)、KAC-500(B)^TM(KaoCorporat ion)，以及Puradax^TM(GenencorInternational)。

按组合物重量计，一般以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将纤维素酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)一起使用。氧化酶与氧一起使用。两种类型的酶均用于“溶液漂白”，即在洗涤液中一起洗涤，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增强剂一起洗涤所述织物时，防止纺织品染料从染色织物转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些酶。包括化学或基因工程改性的突变体。

按组合物重量计，一般以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将过氧化物酶和/或氧化酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

在本文中包括上述酶的混合物，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶的混合物。

按组合物重量计，一般以0.00001％-2％，优选0.0001％-1％，更优选0.001％-0.5％，最优选0.01％-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶或掺入到洗涤剂组合物中其它任何酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。

漂白剂

可以包括在本发明洗涤剂组合物中的附加的任选洗涤剂组分包括漂白剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选的漂白剂，可包括一种或多种漂白活化剂。当存在氧时，漂白化合物其存在量一般是约1％-约25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是任选加入的组分。

用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤剂组合物中有用的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。

适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。

一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂及其盐。这类试剂的合适的例子包括：单过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间氯过苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸的镁盐。主要的漂白剂公开于US4,483,781、US 740,446、EP 0 133 354和US 4,412,934中。非常优选的漂白剂也包括如在US 4,634,551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧已酸。

另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯代和N-溴代烷烃磺胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10％、优选1-5％的量加入。

可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是：例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，描述于US4,412,934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；将它们过水解后能形成过氧酸作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些漂白活化剂：C₈(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐、C₉(6-壬酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐和C₁₀(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐或其混合物。还合适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请91870207.7所公开的。

可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN08/136,626中。

通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的酶体系(即酶及其底物)，也可以产生过氧化氢。这样的酶体系公开于欧洲专利申请EP 0 537 381中。

除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文中使用。特别感兴趣的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上。当存在氧时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述于US4,033,718中。洗涤剂组合物一般含有约0.025％-约1.25％重量的磺化锌酞菁。

漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在″有效用于低温漂白的锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperaturebleaching)″，自然(Nature)369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。

抑泡剂

另一任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以用烷基化聚硅氧烷材料来表示，而硅石一般以细分散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地是可释放地掺入到水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多种其它组分上来使用。

优选的硅氧烷抑泡剂公开于US 3,933,672中。其它特别有用的抑泡剂是德国专利申请DTOS 2,646,126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特别优选的泡沫控制剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12 R购得的2-丁基-辛醇。

这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EP 0 593 841中。

特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例如Aerosil^R。

按组合物重量计，通常以0.001％-2％，优选0.01％-1％的量使用上述抑泡剂。

其它组分

可以在洗涤剂组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除去剂、荧光漂白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包封或未包封的香料。

特别合适的包封材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性胶囊，如GB 1,464,616中所述的。

其它合适的水溶性包封材料包括从取代的二羧酸的未凝胶化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US 3,455,838中所述的。这些酸酯糊精优选是从诸如糯性玉米、糯性高粱、西米、木薯和马铃薯的淀粉制备的。所述的包封材料的合适例子包括由National Starch制造的N-Lok。该N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过加上单官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。

适合于本文中的防再沉淀剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中马来酸酐至少构成共聚物的20％摩尔。按组合物重量计，这些材料通常以组合物重量的0.5％-10％，更优选0.75％-8％，最优选1％-6％的量使用。

优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是：4，4’-双-(2-双乙醇氨基-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2：2’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基-二苯乙烯-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2：2’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-均三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠、2(二苯乙烯基-4”-(萘并-1’，2’：4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯钠。

其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000，更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些聚乙二醇。以0.20％-5％重量，更优选0.25％-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度维持性、织物灰分沉积和对粘土、蛋白质性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。

在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单元以各种形式排列的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例子公开于US 4,116,885和4,711,730以及EP 0 272 033中。根据EP 0 272 033特别优选的聚合物具有下式：

(CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75

其中PEG是-(OC₂H₄)O-，PO是(OC₃H₆O)，T是(pOOC₆H₄CO)。

还非常有用的是作为二甲基对苯二甲酸酯、二甲基磺基间苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，该端基主要由磺基苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯。目的是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，本文中大多数的所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组成，其“次要”由这种物质组成。

本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％重量的1，2-丙二醇、约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚酯和其制备方法详述于EP 311 342中。

柔软剂

可以将织物柔软剂加入到本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些试剂在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898和US 5,019,292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A-1514276和EP0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C₁₂-C₁₄季铵盐的混合物(公开于EP-B-0026528中)，和如在EP0242919中所公开的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用的有机组分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP0299575和0313146中所公开的。

绿土粘土的含量一般在5％-15％重量的范围，更优选8％-12％重量，作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5％-5％重量，一般以1％-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺材料，而以0.1％-2％重量，一般以0.15％-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入它们可能更方便，但是一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上，或者作为熔融液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上。

聚合染料转移抑制剂

本发明的洗涤剂组合物还包括0.001％-10％，优选0.01％-2％，更优选0.05％-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚合染料转移抑制剂加入到洗涤剂组合物中以便抑制染料从有色织物转移到与其一起洗涤的织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前，这些聚合物会络合或吸附从染色织物洗涤下来的褪色染料。

特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。

加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。

本发明的洗涤剂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。

可以按例如US 4,106,991和4,661,452(两者均是Novo Industri A/S的专利)中所公开的方法生产无尘的颗粒，并且该颗粒可以任选地用本领域已知的方法涂层。蜡质涂层材料的例子是平均分子量为1000-20000的聚(氧乙烯)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三-甘油酯。在GB 1483591中给出了适合于流化床技术涂敷的成膜涂层材料的例子。

本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l；在这种情况下，本发明的粒状洗涤剂组合物将含有比常规颗粒洗涤剂更少量的“无机填料盐”；一般的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，一般是硫酸钠；“致密”的洗涤剂一般包括不多于10％的填料盐。本发明的液体组合物也可以是“浓缩形式”的，在这种情况下，本发明的液体洗涤剂组合物将比常规的液体洗涤剂含有较低量的水。按组合物重量计，浓缩的液体洗涤剂的水含量一般低于30％，更优选低于20％，最优选低于10％。

例如，可以将本发明的组合物配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于脏织物预处理的组合物，加入织物柔软剂的漂洗组合物，和用于普通家庭硬表面清洗操作和洗碗碟操作的组合物。

下面的实例旨在举例说明本发明的组合物，而不对本发明范围作任何限制。

在洗涤剂组合物中，缩写组分符号具有下面的意义：

LAS ：直链C₁₂烷基苯磺酸钠

TAS ：牛脂烷基硫酸钠

XYAS ： C_1X-C_1Y烷基硫酸钠

SS ：式2-丁基辛酸的仲皂表面活性剂

25EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C₁₂-C₁₅

的直链伯醇

45EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C₁₄-C₁₅

的直链伯醇

XYEZS ：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C_1X-C_1Y

烷基硫酸钠

非离子：由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404销售

的、平均乙氧基化程度为3.8和平均丙氧基化

程度为4.5的C₁₃-C₁₅混合乙氧基化/丙氧基化

脂肪醇

CFAA ： C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TFAA ： C₁₆-C₁₈烷基N-甲基葡糖酰胺

硅酸盐：无定形硅酸钠(SiO₂:Na₂O比＝2.0)

NaSKS-6 ：式d-Na₂Si₂O₅的结晶层状硅酸盐

碳酸盐：无水碳酸钠

磷酸盐：三磷酸钠

MA/AA ： 1:4的马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约

80,000

聚丙烯酸酯： BASF GmbH以商品名PA30销售的平均分子量

为约8,000的聚丙烯酸酯均聚物

沸石A ： Na₁₂(AlO₂SiO₂)_12·27H₂O的水合硅铝酸钠，主要

粒径为1-10微米

柠檬酸盐：柠檬酸三钠二水合物

柠檬酸：柠檬酸

过硼酸盐：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为

NaBO_2·H₂O₂

PB4 ：无水过硼酸钠四水合物

过碳酸盐：经验式为2Na₂CO_3·3H₂O₂的无水过碳酸钠漂白

剂

TAED ：四乙酰基乙二胺

CMC ：羧甲基纤维素钠

DETPMP ：由Monsanto以商品名Dequest 2060销售的二

乙三胺五(亚甲基膦酸)

PVP ：聚乙烯吡咯烷酮聚合物

EDDS ：钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异

构体

抑泡剂： 25％熔点为50℃的石蜡，17％的疏水性二氧化

硅，58％的石蜡油

颗粒抑泡剂：颗粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬脂

醇，70％的淀粉

硫酸盐：无水硫酸钠

HMWPEO ：高分子量聚氧乙烯

TAE25 ：牛脂醇乙氧基化物(25)

洗涤剂实施例I

可以按如下所示制备本发明粒状织物清洗组合物：

线性C₁₂烷基苯磺酸钠 6.5

硫酸钠 15.0

沸石A 26.0

次氨基三醋酸钠 5.0

本发明的酶 0.1

PVP 0.5

TAED 3.0

硼酸 4.0

过硼酸盐 18.0

苯酚磺酸盐 0.1

次要组分至100

洗涤剂实施例II

可以按如下所示制备本发明的致密粒状织物清洗组合物(密度800g/l)：

45AS 8.0

25E3S 2.0

25E5 3.0

25E3 3.0

TFAA 2.5

沸石A 17.0

NaSKS-6 12.0

柠檬酸 3.0

碳酸盐 7.0

MA/AA 5.0

CMC 0.4

本发明的酶 0.1

TAED 6.0

过碳酸盐 22.0

EDDS 0.3

粒状抑泡剂 3.5

水/次要组分至100％

洗涤剂实施例III

按如下所示制备在洗涤彩色织物中特别有用的本发明粒状织物清洗组合物：

LAS 10.7 -

TAS 2.4 -

TFAA - 4.0

45AS 3.1 10.0

45E7 4.0 -

25E3S - 3.0

68E1l 1.8 -

25E5 - 8.0

柠檬酸盐 15.0 7.0

碳酸盐 - 10

柠檬酸 2.5 3.0

沸石A 32.1 25.0

NaSKS-6 - 9.0

MA/AA 5.0 5.0

DETPMP 0.2 0.8

本发明的酶 0.10 0.05

硅酸盐 2.5 -

硫酸盐 5.2 3.0

PVP 0.5 -

聚(4-乙烯基吡 - 0.2

啶)-N-氧化物/乙烯

基咪唑和乙烯基吡

咯烷酮的共聚物

过硼酸盐 1.0 -

苯酚磺酸盐 0.2 -

水/次要组分至100％

洗涤剂实施例IV

可以按照如下所示制备本发明具有“通过洗涤进行软化”的能力的粒状织物清洗组合物：

45AS - 10.0

LAS 7.6 -

68AS 1.3 -

45E7 4.0 -

25E3 - 5.0

氯化椰油烷基二甲 1.4 1.0

基羟乙基铵

柠檬酸盐 5.0 3.0

Na-SKS-6 - 11.0

沸石A 15.0 15.0

MA/AA 4.0 4.0

DETPMP 0.4 0.4

过硼酸盐 15.0 -

过碳酸盐 - 15.0

TAED 5.0 5.0

绿土粘土 10.0 10.0

HMWPEO - 0.1

本发明的酶 0.10 0.05

硅酸盐 3.0 5.0

碳酸盐 10.0 10.0

粒状抑泡剂 1.0 4.0

CMC 0.2 0.1

水/次要组分至100％

洗涤剂实施例V

可以按照如下制备本发明的重垢液体织物清洗组合物：

I II

酸形式的LAS - 25.0

柠檬酸 5.0 2.0

酸形式的25AS 8.0 -

酸形式的25AE2S 3.0 -

25AE7 8.0 -

CFAA 5 -

DETPMP 1.0 1.0

脂肪酸 8 -

油酸 - 1.0

乙醇 4.0 6.0

丙二醇 2.0 6.0

本发明的酶 0.10 0.05

氯化椰油烷基二甲 - 3.0

基羟乙基铵

绿土粘土 - 5.0

PVP 2.0 -

水/次要组分至100％

在纺织业和纤维素纤维加工业中的用途

本文中，术语“纤维素材料”意旨由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自木浆)或其混合物制成的纤维、已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是绵或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维、聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，大麻，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。

本发明的制备可用于纤维素纤维加工业中，以预处理或浸解处理大麻、亚麻或亚麻布的纤维。

纺织业中，将纤维素材料例如棉纤维处理成适于制衣的材料的方法包括几个步骤：将纤维纺成纱线，将纱线编织成机织织物或针织织物以及后续的准备、染色和整理操作。机织织物是通过在一系列经线之间编织纬线来构造的；纱线可以是两种不同的类型。针织织物是由一根连续长的纱线形成连锁线圈网而构造的。纤维素纤维也可用于非机织织物。

准备工序使纺织品在染色操作中能够产生合适的反应。准备工序中的各小步骤包括脱浆(对于机织产品)、精炼和漂白。工业上也采用精炼/漂白合并的一步加工法。尽管准备工序通常是在织物水平进行的；然而，也可以在纤维或纱线阶段进行精炼、漂白和染色操作。

对于平幅或绳状的形式，处理过程可以通过处理液流间歇或连续地同织物接触。连续操作通常使用饱和器，在这里，以每份重量的织物大约等量的化学品，将化学品施加到织物上，接着是通过发生化学反应的加热了的停留室。然后洗涤区为织物在下面的处理步骤做准备。间歇操作通常在一个处理浴中进行，在这里织物与大约相当于其重量8-15倍的化学品浴进行接触。经过一段时间的反应后，排出化学品，水洗织物并施加下一种化学品。不连续的浸轧-堆放处理工序包括一个饱和器，在此处，以每份重量的织物大约等重量的化学品浴，对织物进行处理，接着停留一段时间，其中对于冷浸轧-堆放处理工序，该停留时间可以进行一天或多天。

机织产品是纺织织物结构的主要形式。机织过程需要对经线“上浆”以使其免受摩擦。由于可靠性和成本，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯酸的粘合剂是使用的上浆化学物的典型实例。浆料必需在机织过程之后作为制备机织产品的第一步除掉。将上了浆的绳状或平幅形式的织物同含有退浆剂的处理液体接触。使用的退浆剂取决于要除掉的浆料的类型。对于PVA浆料，常常采用热水或者氧化型处理方法。对棉织物最通用的上浆剂是基于淀粉的上浆剂。因此最经常的是，机织棉织物通过热水、水解淀粉的α-淀粉酶和润湿剂或表面活性剂的混合物退浆。使纤维素材料在退浆化学品中保持足够长的“持续阶段”以完成退浆。持续阶段取决于处理方案的类型和温度，可以在15分钟到2小时，或者有时候可达数日。通常，在饱和器浴中使用退浆化学物，该饱和器浴通常大约15℃-55℃。然后将织物放置在例如能提供足够热量、通常为大约55℃-约100℃的J型箱之类设备中，以提高退浆剂的活性。在持续阶段结束之后，将化学品、包括除下来的浆料从织物上洗掉。

为了确保有高白度或良好的可湿性以及染色性，浆料化学物和使用的其它化学物必需完全去掉。通常认为，有效的退浆对于下面的准备工序-精炼和漂白是至关重要的。

精炼工序将棉中天然存在的大量非纤维素化合物去掉。除了天然的非纤维素杂质之外，精炼可以去掉污垢、污渍以及制备过程中引入的残留物，例如纺丝、络筒或浆纱润滑剂。精炼工序使用氢氧化钠或相关的苛性剂，例如碳酸钠、氢氧化钾或它们的混合物。通常，该工序中加入一种碱性稳定的表面活性剂，以提高疏水性化合物的溶解性，和/或防止它们再沉积到织物上。该工序通常在80-100℃的高温下，使用精炼剂的强碱性溶液例如pH13-14。由于化学品处理的非特异性性能，化学品不但处理杂质而且处理纤维素本身，导致织物强度或其它理想织物性能受到损害。纤维素织物的柔软性是残留的天然棉蜡的函数。高温强碱性精炼方法的非特异性性能不能区别所需的天然棉润滑剂和制备中加入的润滑剂。并且，由于来自于这些方法的高碱性废水，常规的精炼方法会产生环境问题。精炼阶段为织物在漂白中能达到最佳响应做准备。不恰当地精炼的织物将在后续的漂白阶段中需要更高含量的漂白化学品。

漂白工序将天然棉色素脱色，并且去掉在轧花、梳棉或精炼中没有完全去掉的任何残留天然木质棉杂质组分。目前使用的主要方法是碱性过氧化氢漂白。许多情况下，尤其是不需要非常高的白度时，可以将漂白与精炼结合起来。

预计可以将本发明的木葡聚糖酶或者木葡聚糖酶制剂与其它一些酶活性结合起来，在大约50-80℃的温度，大约pH7-11的环境中，进行精炼处理步骤，这样可代替或者补充高苛化剂的作用。

材料和方法

菌株：

Malbranchea cinnamomea，CBS960.72

Malbranchea cinnamomea，CBS343.55

Malbranchea cinnamomea，UAMH2485

这些菌株都是公众从以下公认的培养物保藏中心可以获得的菌株：

CBS-

Centraalbureau voor Schimmelcultures

Oosterstraat 1

Postbus 273

NL-3740 AG Baarn

荷兰

UAMH-

University of Alberta Microfungus Collection &

Herbarium

Devonian Botanic Garden

Edmonton，AB，加拿大T6G 2E1

培养基：

YG：酵母-葡萄糖琼脂

5.0g Difco粉末化酵母浸膏，10.0g葡萄糖，20.0g琼脂，1000ml自来水。121℃下高压灭菌15-20分钟。

培养基A/瓶：

30g小麦麸皮，45ml的以下溶液：4g酵母浸膏、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO_4·7H₂O、15g葡萄糖，1000ml自来水。121℃下高压灭菌30分钟。

培养基B(50ml/瓶)：

30g大豆粉、15g麦芽糖、5g蛋白胨、1000ml H₂O、1g橄榄油(2滴/瓶)。每500ml带2挡板的锥形瓶中分装50ml。121℃下高压灭菌30分钟。

发酵步骤：

在45℃下在暗处将这些真菌菌株于YG琼脂平皿(4.5cm直径)上培养3天并用于接种摇瓶。将具有完全生长的培养物的这些平皿在4℃下贮藏直到使用。

为了产生酶，将带有与上面平皿上的完全生长的真菌培养物的4-6块琼脂块用于接种一具有培养基B的摇瓶并在45℃、160rpm下生长12-24小时，将其用于接种具有培养基A的摇瓶以获得足够的培养液。

将约1ml上面培养的培养液用于接种具有培养基A的每一烧瓶。这些接种的烧瓶在45℃和静止条件下培养4天。

酶活性测定和纯化用的样品制备：

向培养基A中具有麸皮和完全生长的培养物的每一烧瓶中加入150ml自来水并用无菌玻璃棒均质。通过将烧瓶在4℃下静置2小时萃取酶萃取液。所述培养液然后在8000rpm和4℃下离心30分钟并收集上清液，测定其纤维素酶、β-葡聚糖酶和木葡聚糖酶活性。

酶活性测定

琼脂糖平皿测定：

琼脂糖平皿分别含有1％琼脂糖的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH3、pH7和pH10，0.1％ AZCL-木葡聚糖，0.1％ AZCL-HE-纤维素和0.1％ AZCL-β-葡聚糖(Megazyme，澳大利亚)；将20μl样品加到琼脂糖平皿中的d＝4mm的孔中，在45℃下培养12-16小时。通过蓝孔环鉴定酶活性。

微量滴定板试验：

将0.2％该蓝色底物AZCL-底物(AZCL-木葡聚糖、AZCL-HE-纤维素、AZCL-β-葡聚糖)的溶液通过搅拌悬浮于0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH3-6)或Borax/NaH₂PO₄缓冲液(pH7-9)或甘氨酸缓冲液(pH9-11)中。溶液在搅拌状态下分装至微量滴定板(每个孔中加80μl)，加入20μm酶样品，并在Eppendorf Thermomixer中于50℃和800rpm下将它们培养1小时。将变性的酶样品(100℃下沸腾20分钟)用作空白。培养之后在4℃下通过3000rpm离心5分钟将有色溶液从固体中分离出来。将60μl上清液转移到微量滴定板中并在595nm下通过BioRad MicroplateReader测定其吸光度。

Eppendorf管测定：

将0.2％该蓝色底物AZCL-底物(AZCL-木葡聚糖、AZCL-HE-纤维素、AZCL-β-葡聚糖)的溶液通过搅拌悬浮于0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH3-6)或Borax/NaH₂PO₄缓冲液(pH7-9)或甘氨酸缓冲液(pH9-11)中。溶液在搅拌状态下分装至1.5ml Eppendorf管(每个中加900μl)，加入100μm酶样品，并在水浴中于50℃下将它们温育10-60分钟。将变性的酶样品(100℃下沸腾20分钟)用作空白。培养之后在4℃下通过5000rpm离心10分钟将有色溶液从固体中分离出来。将200μl上清液转移到微量滴定板中并在595nm下通过BioRad Microplate Reader测定其吸光度。

等电聚焦：

等电聚焦是按照制造商的说明书在pH3.5-9.5的预制安福灵(Ampholine)PAG板(Pharmacia，瑞典)中进行的。样品使用三份，并在电泳之后将胶分成三半。将缓冲液pH9中含1％琼脂糖和0.4％ AZCL-木葡聚糖、或0.4％ AZCL-HE-纤维素、或0.4％ AZCL-β-1，4-葡聚糖的覆盖层倒到每一块胶上，在45℃下温育12-16小时。通过蓝色带鉴定酶活性和酶蛋白质的pI。

普通分子生物学方法：

除非另有说明，所有DNA操作和转化都是使用分子生物学的标准方法完成的(Sambrook等人(1989)分子克隆(Molecular cloning)：实验室手册(A laboratory manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor lab.)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY；Ausubel，F.M.等人(编辑)″分子生物学的流行协议(Current protocols in Molecular Biology)″.JohnWiley和Sons，1995。按照制造商的说明书使用供DNA操作的酶(如限制性内切核酸酶、连接酶等可从New England Biolabs，Inc.获得)。

质粒

pYES 2.0(Invitrogen，USA)

pMT2188

表达质粒pMT 2188的构建

米曲霉表达质粒pCaHj 483(WO 98/00529)由一表达盒组成，该盒基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子以及与该启动子融合的构巢曲霉三糖磷酸酯异构酶未翻译的前导序列(Pna2/tpi)和该黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。在该质粒上还有来自能够在乙酰胺作为唯一氮源上生长的构巢曲霉的曲霉属选择标记amdS。将这些元件克隆到大肠杆菌载体pUC19中。按照以下方式将在大肠杆菌中能够选择该质粒的氨苄青霉素抗性标记用能够补充大肠杆菌中的pyrF突变的酿酒酵母的URA3标记替换：

该pUC19的复制起始点用以下引物从pCaHj483经PCR扩增：142779：TTG AAT TGA AAA TAG ATT GAT TTA AAA CTT C142780：TTG CAT GCG TAA TCA TGG TCA TAG C引物142780在PCR片段中引入了Bbu I位点。

按照制造商的说明书将膨胀PCR体系(Roche MolecularBiochemicals，Basel，Switserland)用于扩增，接着进行PCR扩增。

使用以下引物将URA3基因由常规啤酒糖酵母克隆载体pYES2(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca，USA)扩增：140288：TTG AAT TCA TGG GTA ATA ACT GAT AT142778：AAA TCA ATC TAT TTT CAA TTC AAT TCA TCA TT引物140288在PCR片段中引入EcoR I位点。

通过将这两个PCR片段混合并用引物142780和140288利用其剪接通过重叠法(Horton等人(1989)基因(Gene)，77，6168)扩增来将它们融合。

所得片段用EcoR I和Bbu I消化并连接到用相同酶消化的pCaHj483的最大片段上。连接混合物用于转化pyrF大肠杆菌菌株DB6507(ATCC35673)，该大肠杆菌菌株是通过Mandel和Higa的方法(Mandel，M.和A.Higa(1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)45,154)使之感受态的。转化体在补充有1g/l酪蛋氨基酸、500μg/l硫胺和10mg/l卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook等人(1989)分子可隆(Molecular cloning)，实验室手册(a laboratory manual)，第二版，冷泉港实验室出版社)上进行选择。

来自这种转化体的质粒被称为pCaHj 527。该质粒的构建描绘在图xxx中。存在于pCaHj527上的Pna2/tpi启动子通过一简单的PCR方案经受定点诱变。使用诱变引物141223将核苷酸134-144从GTACTAAAACC改变为CCGTTAAATTT：

141223：GGA TGC TGT TGA CTC CGG AAATTT AAC GGT TTG GTC TTG

CAT CCC

使用诱变引物141222将核苷酸423-436从ATGCAATTTAAACT改变为CGGCAATTTAACGG：

141222：GGT ATT GTC CTG CAG ACG GCA ATT TAA CGG CTT CTG CGA

ATC GC

所得质粒被称为pMT 2188。

生长条件

将Malbranchea cinnamomea菌株在500ml摇瓶中在含30g小麦麸皮和45ml以下溶液的培养基上培养：4g酵母浸膏、1g KH₂PO₄、0.5gMgSO_4·7H₂O、15g葡萄糖、1000ml自来水(121℃下高压灭菌30分钟)，并在生长3天后收获真菌菌丝体。收获的菌丝体立即在液氮中冷冻并在-80℃贮藏。

由Malbranchea cinnamomea构建EcoRI/NotI-定向的cDNA文库

通过用硫氰酸胍萃取然后通过5.7M CsCl垫层(Chirgwin等人，1979，生物化学(Biochemistry)18：5294-5299)超速离心通过以下改变制备总RNA。将冷冻的菌丝体在液氮中用研钵和捣棒粉碎成细粉，接着在预冷的咖啡磨中进行粉碎，并且立即悬浮于5体积的RNA萃取缓冲液(4M硫氰酸胍，0.5％月桂基肌氨酸钠，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.1Mβ-巯基乙醇)中。混合物在室温下搅拌30分钟并离心分离(10000rpm下20分钟，Beckman)，从而使细胞碎片沉淀。收集上清液，小心地在5.7M CsCl垫层(5.7M CsCl，10mM EDTA，pH7.5，0.1％ DEPC；使用前经过高压灭菌)上铺层，每12.0ml CsCl垫层使用26.5ml上清液，并且离心分离得到总RNA(Beckman，SW 28转子，25000rpm，室温，24小时)。离心之后小心地除去上清液并将含RNA沉淀物的管底切去并用70％乙醇冲洗。将该总RNA沉淀物转移到一Eppendorf管中，悬浮于500μl的TE中，pH7.6(如果困难的话，不时地在65℃下加热5分钟)，萃取苯酚，并用乙醇在-20℃下沉淀12小时(2.5体积的乙醇，0.1体积的3M醋酸钠pH5.2)。该RNA通过离心分离收集，在70％乙醇中洗涤，并悬浮于最小体积的DEPC中。通过测定OD_260/280确定该RNA浓度。

通过低聚(dT)-纤维素亲和层析分离该聚(A)⁺RNA(Aviv & Leder，1972，美国国立科学院学报(Proceedings of the National Academy ofScience USA)69：1408-1412)。将总共0.2g的低聚(dT)纤维素(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)在10ml的1x的柱加样缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6，0.5M NaCl，1mM EDTA，0.1％ SDS)中预膨胀，加载到一DEPC-处理过的填塞的塑料柱(Poly PrepChromatography Column，BioRad，Hercules，CA)上，并用20ml的1 x加样缓冲液平衡。该总RNA(1-2mg)在65℃下加热8分钟，在冰上骤冷5分钟，并且在RNA样品中加入1体积的2x柱加样缓冲液之后将该RNA样品加样到柱上。收集洗脱液并通过每次加样之前如上所述加热样品并在冰上骤冷后再加样2-3次。该低聚(dT)柱用10体积的1x加样缓冲液冲洗，然后用3体积的介质盐缓冲液(20mM Tris-Cl，pH 7.6，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.1％ SDS)冲洗，接着用3体积预热到65℃的洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，pH7.6，1mM EDTA，0.05％ SDS)洗脱该聚(A)⁺RNA，收集500μl分部收集液。读取每一分部收集液的OD₂₆₀，并将含该mRNA的分部收集液汇集并在-20℃下经乙醇沉淀12小时。离心收集该聚(A)⁺RNA，再悬浮于DEPC-DIW中并以5-10μg等分液贮藏在-80℃下。

由5μg的Malbranchea cinnamomea聚(A)⁺RNA通过RNase H法(Gubler和Hoffman 1983，出处同上；Sambrook等人，1989，出处同上)利用发夹修饰合成双链cDNA。将该聚(A)⁺RNA(5μg于5μl的DEPC-处理过的水中)在预硅烷化的、无RNase的Eppendorf管中于70℃下加热8分钟，在冰上骤冷，并以最终体积50μl与逆转录酶缓冲液(50mM Tris-ClpH8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT)混合，该逆转录酶缓冲液含有1mM的dATP、dGTP和dTTP，和0.5mM的5-甲基-dCTP，40个单位的人胎盘核糖核酸酶抑制剂，4.81μg的低聚(dT)₁₈-NotI引物(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)和1000个单位的SuperScript II逆转录酶(Gibco-BRL，美国)。

通过在45℃下将该反应混合物温育1小时合成第一链cDNA。合成之后，按照制造商的说明书将该mRNA：cDNA杂合体混合物通过PharmaciaMicroSpin S-400HR旋转柱凝胶过滤。

凝胶过滤之后，将该杂合体稀释于250μl第二链缓冲液(20mMTris-Cl pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，0.16mMβNAD⁺)中，该缓冲液含有200μM的每一dNTP、60个单位的大肠杆菌DNA聚合酶I(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、5.25个单位的RNase H和15个单位的大肠杆菌DNA连接酶。通过在16℃下将反应管温育2小时并在25℃下再温育15分钟进行第二链cDNA的合成。加入EDTA至最终浓度20mM使反应停止接着通过氯仿萃取。

通过加入2体积的96％乙醇和0.2体积的10M醋酸铵将该双链cDNA在-20℃下经过乙醇沉淀，离心回收，在70％乙醇中洗涤，干燥(SpeedVac)，并再次悬浮于30μl的绿豆核酸酶缓冲液(30mM醋酸钠pH4.6，300mMNaCl，1mM ZnSO₄，0.35mM二硫苏糖醇，2％甘油)中，该缓冲液含有25个单位的绿豆核酸酶。该单链发夹DNA通过以下步骤进行修剪：将反应物在30℃下温育30分钟，接着加入70μl的10mM Tris-Cl，pH7.5、1mM EDTA，苯酚萃取，和用2体积的96％乙醇以及0.1体积3M醋酸钠pH5.2冰浴30分钟进行乙醇沉淀。

通过离心(20,000rpm，30分钟)回收这些双链cDNA，并用T4DNA聚合酶于30μl的T4DNA聚合酶缓冲液(20mM Tris-乙酸盐，pH7.9，10mM乙酸镁，50mM乙酸钾，1mM二硫苏糖醇)中通过在+16℃下将反应混合物温育1小时将其平端化，该缓冲液含有0.5mM的每一dNTP和5个单位的T4DNA聚合酶。通过加入EDTA至最终浓度为20mM来终止反应，接着苯酚和氯仿萃取并通过加入2体积的96％乙醇和0.1体积的3M醋酸钠pH5.2在-20℃下经乙醇沉淀12小时。

补平反应之后，如上所述离心回收这些cDNA，在70％乙醇中洗涤并将该DNA沉淀在SpeedVac中干燥。通过将该反应混合物在16℃下温育12小时将该cDNA沉淀再次悬浮于25μl的连接缓冲液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇，0.5mM ATP)中，该缓冲液含2μgEcoRI衔接子(0.2μg/μl，Pharmacia，Uppsala，瑞典)和20个单位的T4连接酶。通过在65℃下加热20分钟，然后在冰上放置5分钟将反应停止。适应的cDNA用NotI通过加入20μl高压灭菌水、5μl的10x NotI限制酶缓冲液和50个单位的NotI进行消化，接着在37℃下温育3小时。通过在65℃下加热15分钟来将反应停止。这些cDNA在1x TBE(在高压灭菌水中)中通过琼脂糖凝胶电泳被按大小分离在0.8％ SeaPlaque GTG低熔融温度的琼脂糖凝胶(FMC，Rockland，ME)上，从而将未连接的衔接子和小cDNA分离。将该凝胶在15V下跑胶12小时，并通过切断较低部分的琼脂糖凝胶以0.7kb为一个截断将该cDNA按大小选择。然后将一1.5％琼脂糖凝胶倒在含该cDNA的凝胶的前面，并通过向后跑胶直到在凝胶上出现压缩的带来将双链cDNA浓缩。将含cDNA的凝胶块从凝胶处切下并用GFX胶带纯化试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)按照如下方法从凝胶萃取cDNA。将经过修剪的凝胶片在2ml Biopure Eppendorf管中称重，然后每10mg凝胶片加入10ml捕获缓冲液(Capture Buffer)，通过在60℃下温育10分钟将该凝胶片溶解，直到琼脂糖完全溶解，管底样品通过简单离心。将熔融的样品转移到放置在收集管中的GFX旋转柱中，25℃下温育1分钟，然后在微量离心机中全速旋转30秒钟。排放掉溢流物，柱用500μl洗涤缓冲液冲洗，接着全速离心30秒钟。取出收集管，并将该柱放在一1.5ml Eppendorf管中，接着向柱中心加入50μl的TE pH7.5以洗脱cDNA，在25℃下温育1分钟，最后以最大速度离心1分钟。洗脱的cDNA在-20℃下贮藏直到文库构建。

用于制备含EcoRI-NotI插入物的pYES2.0cDNA克隆的质粒DNA，通过使用QIAGEN Tip-100按照制造商的说明书来进行纯化(QIAGEN，Valencia，CA)。总共10μg纯化的质粒DNA用NotI和EcoRI在总体积60μl中通过加入6μl EcoRI用的10x NEBuffer(New England Biolabs，Beverly，MA)、40个单位的NotI和20个单位的EcoRI，接着在37℃下温育6小时消化至完全。通过在65℃下加热样品20分钟使反应停止。消化的质粒DNA用苯酚-氯仿萃取一次，然后用氯仿萃取一次，接着在-20℃下通过加入2体积的96％乙醇和0.1体积的3M醋酸钠pH5.2经过乙醇沉淀。沉淀的DNA再次悬浮于25μl的1x TE pH7.5中，加载到1x TBE中的0.8％ SeaKem琼脂糖凝胶上，并以60V在该凝胶上跑胶3小时。消化的载体从凝胶上切下来，用GFX胶带纯化试剂盒(Amersham-PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)按照制造商的说明书从凝胶中萃取DNA。通过OD_260/280测定DNA浓度之后，将洗脱的载体在-20℃下贮藏直到文库构建。

为了建立cDNA文库的最佳连接条件，在10μl连接缓冲液(30mMTris-Cl pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM ATP)中进行4个测试连接反应，所述缓冲液含7μl双链cDNA(大致相当于1/10的cDNA样品的总体积)、2个单位的T4连接酶和分别为25ng、50ng和75ng的EcoRI-NotI裂解的pYES2.0载体(Invitrogen)。所述载体背景对照连接反应含有75ng的EcoRI-NotI裂解的pYES.0载体，没有cDNA。这些连接反应是通过在16℃下温育12小时，在65℃下加热20分钟进行的，然后向每只管中加入10μl高压灭菌水。将1μl的连接混合物电穿孔(200W，2.5kV，25mF)至40μl电感受态大肠杆菌DH10B细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中。加入1ml SOC到每一转化混合物中之后，将这些细胞在37℃下培养1小时，将来自每一电穿孔的50μl和5μl平铺在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上并在37℃下培养12小时。使用这些最佳条件，在大肠杆菌中构建含有2 x 10⁷独立菌落形成单元的Malbranchea cinnamomea cDNA文库，载体背景约为1％。将该cDNA文库以(1)个体库(25,000c.f.u./库)于20％甘油中在-80℃下贮藏；(2)相同库的细胞沉淀在-20℃下贮藏；(3)个体库的Qiagen纯化质粒DNA在-20℃下贮藏(Qiagen Tip 100)；和(4)定向的双链cDNA在-20℃下贮藏。

使用聚合酶链反应(PCR)产生家族12木葡聚糖酶的cDNA探针

使用200pmol的含简并脱氧肌苷的低聚核苷酸有义引物(相当于纯木葡聚糖酶的NH₂-端的肽(5’-GA(C/T)TT(C/T)TG(C/T)GGI CA(A/G)TGGGA-3’))和200pmol的反义引物(相当于从纯木葡聚糖酶测定的内部氨基酸序列的肽(5’-TGI(C/G)(A/T)(C/T)TG(A/G)TCC ATI CC(C/T)TG(C/T)TC-3’))、PTC-200 Peltier Thermal cycler(MJ Research，USA)和2.5个单位的AmpliTaq Gold聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，将约20纳克的来自Malbranchea cinnamomea的定向双链cDNA进行PCR扩增。通过以下步骤进行聚合酶链反应：在94℃下通过10分钟的变性步骤始动该PCR，然后采用以下循环方式进行40次循环的PCR：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟。扩增产物通过在2％琼脂糖凝胶中进行电泳来分析，接着使用GFX胶带纯化试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)按照制造商的说明书从凝胶中萃取一约0.6kb PCR片段。纯化的PCR片段使用300ng GFX-纯化模板、Taq脱氧末端环状测序试剂盒(Perkin Elmer，USA)、荧光标记的终止子和5pmol含简并脱氧肌苷的低聚核苷酸引物(5’-ACI GA(C/T)ATI CA(A/G)AA(C/T)GA(A/G)GA(A/G)(C/T)TI TGG-3’)直接通过双脱氧链终止法测序(Sanger，F.、Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)美国国立科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)74，5463-5467)。根据Devereux等人，1984(Devereux，J.、Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)核酸反应(NucleicAcids Res.)12，387-395)分析这些序列数据。

筛选cDNA文库

将30000个来自在pYES 2.0中构建的Malbranchea cinnamomea cDNA文库的菌落形成单元在大肠杆菌中使用随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)132，6-13)³²P-标记的(>1 x 10⁹cpm/μg)木葡聚糖用的PCR产物作为探针通过菌落杂交法进行筛选(Sambrook等人(1989)分子克隆(Molecular cloning)：实验手册(A laboratory manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。在以下条件下进行该杂交：在2 x SSC(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)、5 x Denhardt溶液(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA中于65℃下保持20小时，接着在5 x SSC中于25℃下洗涤(2 x 15分钟)，在2 x SSC、0.5％SDS中于65℃下洗涤(30分钟)、在0.2 x SSC、0.5％SDS中于65℃下洗涤(30分钟)并最终在5 x SSC中于25℃下洗涤(2 x 15分钟)。筛选该Malbrancheacinnamomea cDNA文库获得4个强杂交的克隆，经过以下步骤进一步分析：用pYES正向和反向多接头引物对cDNA末端测序(Invitrogen，USA)，并测定两条链的最长木葡聚糖酶cDNA的核苷酸序列(命名为pClXYG1011)。

核苷酸序列分析

使用500ng Qiagen纯化模板(Qiagen，USA)、Taq脱氧端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)、荧光标记的终止子和5pmol或者pYES2.0多接头引物(Invitrogen，USA)或者合成低聚核苷酸引物，从两条链通过双脱氧链终止法测定全长Malbranchea cinnamomea木葡聚糖酶cDNA克隆pClXYG1011的核苷酸序列(Sanger，F.、Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)美国国立科学院学报74，5463-5467)，获得所附的序列SEQ IDNO：1和所附的SEQ ID NO：2所示的家族12木葡聚糖酶前体的推测氨基酸序列。按照Devereux等人，1984分析这些序列数据(Devereux，J.、Haeberli，P.和Smithies，0.(1984)核酸反应(Nucleic Acids Res.)12，387-395)。

在米曲霉中的异源表达

米曲霉的转化

如Christensen等人(1988)，生物技术(Biotechnology)6，1419-1422所述转化米曲霉。

构建曲霉属表达用的木葡聚糖酶表达盒

使用标准步骤从Malbranchea cinnamomea cDNA克隆pClXYG1011中分离质粒DNA并通过限制酶分析进行分析。该XYG1011 cDNA插入片段是使用50ng pClXYG1011质粒DNA作为模板，100pmol有义引物(5’-CGGGATCCGATAGAGTCGAG-ATGAAGG-3’)，混合有100pmol反义引物(5’-CCGCTCGAGCCAA-AGAGCTAAAAAAGTTG-3’)，PTC-200 Peltier Thermalcycler(MJ Research，USA)和高保真度扩增PCR系统(Expand HighFidelity PCR System)(Roche Molecular Biochemicals，德国)按照制造商的说明书进行PCR扩增的。使用以下循环方式进行30次PCR循环：94℃下变性30秒，60℃下退火30秒，72℃下延伸2分钟。通过在1％琼脂糖凝胶中电泳分析这些扩增产物，接着使用GFX胶带纯化试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)按照制造商的说明书从该凝胶中萃取约1.0kb XYG1011 PCR片段。这些纯化的PCR片段和曲霉属表达载体pMT2188都用BamHI和XhoI进行双消化。接着按照制造商说明书将该载体用虾碱性磷酸酶(Roche，Mannheim，Germany)脱磷酸化。通过苯酚和氯仿萃取除去限制酶和磷酸酶，并使用标准步骤将PCR片段与载体连接(Sambrook等人1989)。大肠杆菌菌株DB6507(F^-，pyrF74::Tn5，supE44，lacYl，aral4，galK2，xyl5，mtl1，leuB6，proA2，hsdS20，recA13，rpsL20，thi-1，？^-)用连接混合物转化，并且通过菌落PCR筛选转化体以检测在pMT2188中在存在PCR插入片段。使用标准PCR方法用10？1体积未裂解的大肠杆菌细胞提供模板，退火温度55℃和具有以下序列的引物进行菌落PCR反应(Saiki等人，1988，科学(Science)239：487-491)：

引物1：GTTTCCAACTCAATTTACCTC

引物2：TTGCCCTCATCCCCATCCTTT

由此鉴定的表达克隆被命名为pMStr43，并且测定克隆的PCR片段的序列，以确保在扩增期间不产生误差。在849位从终止编码子的下游发现了单个C被T取代。

米曲霉的转化

常规步骤：100ml的YPD(Sherman等人，酵母菌遗传的方法(Methodsin Yeast Genetics)，冷泉港实验室，1981)被接种上米曲霉孢子并在摇动下于37℃下培养约2天。通过miracloth过滤收获菌丝体并用200ml的0.6M MgSO₄洗涤。将该菌丝体悬浮于15ml的1.2M MgSO₄和10mMNaH₂PO₄，pH5.8中，并加入1ml含120mg Novozym 234的相同缓冲液，将该混合物在37℃下缓慢搅拌培养1.5-2.5小时，直到可以在用显微镜观察的样品中见到大量原生质体。悬液通过miracloth过滤，滤液转移到无菌管中并覆盖5ml 0.6M山梨糖醇、100mM Tris-HCl，pH7.0。以100g离心15分钟并从MgSO₄垫层的上面收集原生质体。将2体积的STC(1.2M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM tris-HCl，pH7.5)加入到该原生质体悬液中并在1000g下将该混合物离心5分钟。将该原生质体沉淀再次悬浮于3ml STC并再次沉淀。重复此步骤。最后将这些原生质体再次悬浮于0.2-1ml的STC中。将100μl原生质体悬液于5μg悬浮于10μlSTC中的转化DNA混合。将该混合物在室温下静置25分钟。加入1ml 60％PEG 4000的10mM CaCl₂和10mM Tris-HCl，pH7.5并缓慢混合。混合物在室温下温育25分钟，然后以2500g旋转离心15分钟。将沉淀的原生质体再悬浮于1ml的STC中并平铺于含1.0M蔗糖用于渗透支撑这些原生质体的选择性培养基上。就pMT2188而言，具有10mM乙酰胺和67mMCsCl的基本培养基提供对amdS标记的选择性。转化体在37℃下培养4-7天之后可以区别开来。

产木葡聚糖酶米曲霉转化体的鉴定和分离

曲霉在转化之后在选择性培养基上产生的每一菌落通过将分生孢子转移到调整至pH7.5并含1％葡萄糖和10mM NaNO₃并且带有相同地含有0.1％w/v底物AZCL-木葡聚糖的薄上层(Megazyme，Bray，Ireland)的固体基本培养基上测定产生的木葡聚糖酶。分生孢子在37℃下生长过夜之后通过可见扩散蓝色天青蛋白染料检测底物的水解。按照该试验检测的结果，一个转化体产生木葡聚糖酶。

在含限制菌落大小的0.01％triton X-100的选择性培养基上经稀释划线接种分生孢子来分离该转化体。将4个由单个孢子产生的分离菌落在上述培养基上再次测定木葡聚糖酶活性，另外在30℃和200转/分钟下在10ml具有2％麦芽糖的YP培养基上培养2天(Sherman等人，酵母菌遗传方法(Methods in Yeast Genetics)，冷泉港实验室，1981)。这些培养物的上清液采用12％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶经SDS/PAGE分离(Novex，San Diego，CA，USA)并且按照制造商的说明书用考马斯亮蓝(Coumassie-blue)将蛋白质染色。将产生最大量木葡聚糖酶的曲霉分离物命名为MStrl25。

测定木葡聚糖酶单位(XGU或XyloU)：

使用来自Megazyme，爱尔兰的AZCL-木葡聚糖作为底物测定木葡聚糖酶活性。

将0.2％该蓝色底物溶液搅拌悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5中。将该溶液搅拌分装到1.5ml Eppendorf管(每支加入0.75ml)，加入50μl酶溶液并将它们在5436型Eppendorf Thermomixer中在40℃和1200rpm的混合下温育20分钟。培养之后将有色溶液通过14,000rpm下离心4分钟与固体分开并在600nm下测定上清液的吸光度。一式两份进行该测定并减去一式两份进行的本底。用于计算催化活性的600nm下的读数必需在0.2-1.5之间。

1个XyloU单位定义为在600nm下在1cm比色杯中产生0.24吸光度的酶的量。

以下实施例描述本发明。

实施例1

筛选产生碱性木葡聚糖酶的微生物

将真菌微生物Malbranchea cinnamomea，CBS 960.72、Malbrancheacinnamomea，CBS343.55和Malbranchea cinnamomea，UAMH 2485按照材料和方法部分所述方法培养。在琼脂糖平皿测定中在三个不同pH(pH3、pH7、pH10)下测定培养液的木葡聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶活性。

发现以下活性：

菌株号木葡聚糖酶纤维素酶 β-葡聚糖酶

pH3 pH7 pH10 pH3 pH7 pH10 pH pH7 pH10

CBS960.72 - ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++

CBS343.55 - ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++

UAMH2485 - ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++

实施例2

从Malbranchea cinnamomea纯化木葡聚糖酶

A.部分纯化

为了将实施例1中获得的各种培养液中的两种纤维素酶与木葡聚糖酶分离，可以通过材料和方法部分中所述的方法从培养基A(参见培养基列表)的培养液部分纯化木葡聚糖酶和纤维素酶。

通过以下方法获得约500ml每一真菌菌株的培养液：在培养基A中培养所述真菌，然后加入100ml无菌水萃取。将培养液过滤并用80％硫酸铵沉淀蛋白质。将沉淀的蛋白质沉淀物溶于约60ml pH6.0的25mMKH₂PO₄/NaOH缓冲液中。然后样品在截留分子为5kDa的MilliporeBiomax-5纤维素酶抗性膜上进行超滤(用相同缓冲液洗涤过)，直到蛋白质的导电率低于1ms/cm。将10ml的该样品施加于离子交换柱(Q-Sepharose Fast Flow，34ml)并用0.025M磷酸盐缓冲液pH6.0平衡。木葡聚糖酶和CMC酶都吸附到柱上并用1N氯化钠梯度洗脱液洗脱。将所有分部收集液收集起来并采用微量滴定板试验用0.5％ AZCL-底物分析木葡聚糖酶和纤维素酶活性。

在图1-3中分别显示了部分纯化Malbranchea cinnamomea的三种菌株的不同分部收集液中的木葡聚糖酶和纤维素酶活性：图1显示了来自菌株UAMH2485的分部收集液，图2显示了来自菌株CBS 343.55的分部收集液，图3显示了来自菌株CBS 960.72的分部收集液。从这些图可以看出，两个酶出现在不同的分部收集液中并因此轻易地将它们分离。1-3分部收集液含有最大的木葡聚糖酶活性并且它们在琼脂糖平板CMC(1％)、AZCL-HE-纤维素(0.1％)(甚至在45℃下培养过夜之后)或液体试验(0.5％AZCL-HE-纤维素，pH7和9，45℃，800rpm下持续2.5小时)都没有纤维素酶活性。

合并具有木葡聚糖酶活性的分部收集液并使用具有截留分子量为10kDa的膜浓缩。浓缩的样品用于测定pI的IEF试验和测定分子量的SDS-PAGE。测出来自Malbranchea cinnamomea的所有三个菌株的木葡聚糖酶具有相同的pI(约pH3.5)和相同的分子量(约25kDa)。而且，电印迹蛋白质谱带并测定其N-端序列部分是FCGQXDSEQSGPYIVYNNL，其中X可能是W(色氨酸)。

按材料和方法中所述方法测定三个木葡聚糖酶各自的木葡聚糖酶活性，结果如下：

菌株 XGU/ml

CBS 960.72 27.5

CBS 343.55 9.1

UAMH 2485 12.3

B.纯化

如上所述将来自培养液的木葡聚糖酶部分纯化。将具有木葡聚糖酶活性的分部收集液通过Hiprep 26/10柱脱盐，平分入塑料管(每管15ml)中并冷冻干燥。冷冻干燥过的粉末溶于2mi去离子水中；将1ml用于鉴定并将1ml进一步纯化。将该溶液稀释于25mM Tris缓冲液pH7.0中，接着在具有截留分子量为5kDa的膜的Amicon室中浓缩用于降低电导率。当电导率低于3mSi时将溶液上样到1ml用相同缓冲液平衡过的MonoQ柱上。木葡聚糖酶附着在柱上并用0.5M氯化钠梯度洗脱液洗脱。分析所有分部收集液的木葡聚糖酶活性并且2个分部收集液都含有该活性。

在汇集的分部收集液的SDS-PAGE上可以鉴定MW为25kDa的清晰谱带。将该蛋白质谱带进行电印迹并测定部分N-端序列并获得以下数据：FCGQXDSEQSGPYIVYNNL。该部分N-端序列与国际专利公布WO98/38288中公开的Tiasporella phaseolina XET具有同源性(63％)。

在与材料和方法中所述的木葡聚糖酶测定相同条件下温育2小时之后该具有木葡聚糖酶活性的分部收集液对AZCL HE纤维素未显示活性。

实施例3

鉴定来自Malbranchea cinnamomea，UAMH 2485、CBS 343.55和CBS 960.72的木葡聚糖酶

pH分布图：

为了测定实施例2中纯化的木葡聚糖酶的pH分布图，将0.2％蓝色底物AZCL-木葡聚糖溶液搅拌悬浮于0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH3、4、5)或pH为6的Borax/NaH₂PO₄缓冲液、pH7的MOPS、pH8的HEPES、或者pH9-11的甘氨酸缓冲液中并用于材料和方法中所述的微量滴定板分析。将80μl 0.2％ AZCL-木葡聚糖底物溶液和20μl部分纯化的木葡聚糖酶样品混合并在50℃，800rpm下在Eppendorf thermomixer中温育1小时。来自Malbranchea cinnamomea UAMH 2485、CBS 343.55和CBS 960.72的木葡聚糖酶各自的pH分布图示于下表(按照相对的木葡聚糖酶活性)：

pH UAMH 2485 CBS 343.55 CBS 960.72

4 0.28 0.26 0.44

5 0.41 0.49 0.51

6 0.69 0.72 0.72

7 1 1 1

8 0.76 0.83 0.83

9 0.74 0.81 0.81

10 0.50 0.57 0.66

11 0.43 0.51 0.61

结果显示，来自这些菌株的木葡聚糖酶具有几乎相同的pH分布图。与已知的木葡聚糖酶相比，它们具有更大的碱性活性：甚至在pH10下有50-80％相对的木葡聚糖酶活性。

温度分布图：

为了测定温度分布图，将70μl搅拌悬浮于0.1M甘氨酸缓冲液pH9中的0.2％蓝色底物AZCL-木葡聚糖溶液和30μl部分纯化的木葡聚糖酶样品混合于Eppendorf管中并在不同温度(20、30、40、50、60和70℃)下于水浴中温育40分钟。将变性的酶样品(100℃沸腾20分钟)用作空白。温育之后将有色溶液通过10000rpm、4℃下离心5分钟从固体中分离出来。将60μl上清液转移到微量滴定板中并通过BioRad MicroplateReader在595nm下测定其吸光度。

下面显示了来自菌株Malbranchea cinnamomea UAMH 2485、CBS343.55和CBS 960.72的木葡聚糖酶的温度分布图(按照相对的木葡聚糖酶活性)：

温度(℃) UAMH 2485 CBS 343.55 CBS 960.72

20 0.12 0.20 0.15

30 0.22 0.30 0.26

40 0.54 0.62 0.56

50 1 1 1

60 0.30 0.38 0.30

70 0.16 0.16 0.16

来自这三个Malbranchea cinnamomea菌株的木葡聚糖酶具有非常相似的温度分布图，它们在20-70℃有活性并在约50℃的温度下具有最佳活性。

热稳定性：

为了进行热稳定性试验，将来自实施例2的部分纯化的酶样品在40℃水浴中温育并在不同温育时间(0、0.5、1、2、3、4、5和6小时)取样，然后通过搅拌混合70μl悬浮于0.1M甘氨酸缓冲液pH9的0.2％蓝色底物AZCL-木葡聚糖溶液和30μl样品于微量滴定板上并在50℃、800rpm下于Eppendorf thermomixer中温育40分钟通过微量滴定板试验测定来自这些样品的木葡聚糖酶活性。将变性的酶样品(100℃下沸腾20分钟)用作空白。温育之后将有色溶液通过10000rpm、4℃下离心5分钟从固体中分离出来。将60μl上清液转移到微量滴定板中并通过BioRadMicroplate Reader在595nm下测定其吸光度。

下面显示了热稳定性试验的结果(按照相对的木葡聚糖酶活性)：

培养时间(小 UAMH 2485 CBS 343.55 CBA 960.72

时)

0 1 1 1

0.5 0.95 1 0.95

1 0.88 0.98 1.08

2 1 1.3 0.98

3 0.95 0.99 0.95

4 0.86 0.96 0.96

5 0.89 1 0.98

6 n.a. 1 1.01

可以看出，来自这三个Malbranchea cinnamomea菌株的酶在测定条件下非常稳定。甚至在40℃下温育6小时几乎看不出任何活性损失。

底物特异性

使用不同底物，包括木葡聚糖酶用的AZCL-木葡聚糖(罗望子)、木聚糖酶用的AZCL-木聚糖(oat spelts)、阿拉伯聚糖酶用的AZCL-脱支化-阿拉伯聚糖、甘露聚糖酶用的AZCL-半乳甘露聚糖(角豆)、纤维素酶用的AZCL-HE-纤维素、内切-1，6-α-葡聚糖酶用的AZCL-葡聚糖、内切-1，4-β-半乳聚糖酶用的AZCL-半乳聚糖(马铃薯)，测定来自这三个Malbrancheacinnamomea菌株UAMH2485、CBS 343.55和CBS 960.72的部分纯化的木葡聚糖酶的底物特异性。

发现来自这三个Malbranchea cinnamomea菌株的部分纯化的木葡聚糖酶仅呈现木葡聚糖酶活性并未呈现其它酶活性。可以得出的结论是来自这些Malbranchea cinnamomea菌株的木葡聚糖酶是木葡聚糖特异性酶。

洗涤剂相容性

在5个不同的欧洲和中国商用洗涤剂组合物中以2个剂量(2g/l和4g/l)测定如实施例2A所述来自3个Malbranchea cinnamomea菌株UAMH2485、CBS 343.55和CBS 960.72的部分纯化的木葡聚糖酶：商标是

和

的欧洲洗涤剂和商标是

、

和

的中国洗涤剂与缓冲液pH7中的木葡聚糖酶活性进行比较。

在以下洗涤剂组合物中在正常洗涤条件(40℃，20分钟温育)下也对实施例2B中所述的纯化木葡聚糖酶进行测定：

Future液，6g/l，18颗粒硬度(Grain Hardness)；

Future粉，6g/l，18颗粒硬度；US

液，2g/l，8颗粒硬度；US

粉，2g/l，8颗粒硬度；日本液体Bonus^TM，0.65g/l，8颗粒硬度；日本

粉，0.65g/l，8颗粒硬度；所有都是在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.5中的活性。

发现来自所有三个菌株的木葡聚糖酶在所有测定的商用洗涤剂和所有测定的剂量中都是全活性。

实施例4

从Malbranchea cinnamomea克隆的木葡聚糖酶的纯化和鉴定

使用米曲霉转化体Mstrl25从批号#9947获得发酵培养液(参见材料和方法)。以序列SEQ ID NO：2为基础，可以计算以下数据：MW 25kDa，pI3.9，摩尔消光系数65530。

将该发酵培养液通过Whatmann玻璃过滤器GF/D过滤。并获得总共4700ml，它具有515木单位(xylounit)/ml。

将该澄清发酵液浓缩并用一丙二醇配制用于性能评价。

使用0.1m醋酸钠缓冲液pH6.0采用superdex75柱色谱法将小样品纯化至高度同质性。该纯酶在SDS-PAGE中具有单一谱带，表观分子量为25kDa。采用DSC发现其熔融温度为74℃。纯酶的比活性为160木单位/mg蛋白质。

使用常规步骤在Danish实验室DAKO使兔血清产生抗该纯酶。

采用edman降解法发现成熟酶的N-端序列是ADFCGQXDSEQSGPYIVYNNLWN，X不能鉴定出，但是以基因序列为基础时为W。

在pH为5.5-9.0且40℃下时酶活性大于50％并且在商用粉末洗涤剂中为全活性。在35℃下在液体洗涤剂中非常稳定且半衰期大于30天。

该酶对CMC没有活性，因此它不是纤维素酶。

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序列表

<110>Novo Nordisk A/S

<120>来自畸枝霉属的木葡聚糖酶

<130>AMJ

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1109

<212>DNA

<213>Malbranchea cinnamomea

<220>

<221>CDS

<222>(57)..(809)

<220>

<221>mat_肽

<222>(141)..(806)

<400>1

<210>2

<211>250

<212>PRT

<213>Malbranchea cinnamomea

<400>2

Claims

1.一种木葡聚糖酶活性的多肽，选自以下之一：

(a)在表达SEQ ID NO：1的DNA序列的条件下通过培养含该序列的细胞产生的多肽；

(b)为SEQ ID NO：1的1-222位所示序列的多肽；或

(c)如SEQ ID NO：1的1-222位所示序列中具有一个或多个氨基酸保守取代、缺失或插入的多肽。

2.如权利要求1的多肽，它是由畸枝霉属的菌株获得。

3.一种分离的多肽，它是(i)无同源杂质，及(ii)是通过培养含有SEQ ID NO：1的141-806位的DNA序列的细胞产生的。

4.一种酶制剂，含有如权利要求1-3任一项的分离或纯化的多肽。

5.如权利要求4的酶制剂，还含有一种或多种选自以下的酶：蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸酯分解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果胶分解酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、或它们的混合物。

6.权利要求5的酶制剂，其中纤维素酶属于内切葡聚糖酶。

7.一种制备如权利要求1-3任一项权利要求的多肽的方法，该方法包括在能够产生木葡聚糖酶的条件下培养属于畸枝霉属的菌株，并从培养物中回收所述酶。

8.权利要求7的方法，其中所述菌株属于Malbranchea cinnamomea。

9.一种洗涤剂组合物，含有权利要求4-6任一项权利要求的酶制剂或权利要求1-3任一项权利要求的分离或纯化的多肽。

10.一种机器处理织物的方法，所述方法包括在机洗过程的洗涤循环中用含有权利要求4-6任一项权利要求的酶制剂或权利要求1-3任一项权利要求的分离或纯化的多肽的洗涤液处理织物。

11.权利要求4-6任一项权利要求的酶制剂或权利要求1-3任一项权利要求的分离或纯化的多肽在纺织业中用于提高纤维素纤维、纱线、机织或非机织织物性能的用途。

12.如权利要求11的用途，其中将所述酶制剂或多肽用于精炼步骤。

13.权利要求4-6任一项权利要求的酶制剂或权利要求1-3任一项权利要求的分离或纯化的多肽在纤维素纤维加工业中用于浸解选自大麻、黄麻、亚麻或亚麻布的纤维的用途。