CN104388406B - 一种内切木葡聚糖酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质RCOPoXEG12A及其作为内切木葡聚糖酶的应用。本发明提供RCOPoXEG12A蛋白质在作为内切木葡聚糖酶中的应用；所述RCOPoXEG12A蛋白质为由序列表中序列8氨基酸残基组成的蛋白质。本发明的实验证明，本发明从草酸青霉(Penicillium oxalicum)EU2106的基因组序列中获得了一个编码内切木葡聚糖酶的基因PoXEG12A，进行巴氏毕赤酵母密码子优化之后，可在宿主细胞中表达以生产内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A。

Description

一种内切木葡聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种内切木葡聚糖酶及其应用，具体涉及RCOPoXEG12A蛋白质及其作为内切木葡聚糖酶的应用。

背景技术

在自然界中，木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素和半纤维素分别是地球上含量第一和第二大的生物质资源。

植物细胞壁是天然的木质纤维素复合材料，含有大量的纤维素、半纤维素和木质素，是大自然中主要的纤维素和半纤维素资源。研究者致力于将木质纤维素中纤维素和半纤维素降解用于生产第二代燃料乙醇(Naik SN,Goud VV,Rout PK,DalaiAK.2010.Production of first and second generation biofuels:A comprehensivereview.Renewable and Sustainable Energy Reviews,14:578-597)。在植物细胞壁中，纤维素被包裹在木质素和半纤维素基质中，使得纤维素酶难以接触导致难以降解纤维素。如果采取措施将木质素去除和将半纤维素降解使纤维素暴露出来，就可以促进纤维素被纤维素酶水解(Fry SC.1989.The structure and functions of xyloglucan.Journal ofExperimental Botany,40:1-11)。

木葡聚糖是一种半纤维素，存在于高等植物的初生细胞壁、胞间层、胶质层中，并且是植物初生细胞壁中的主要组成成分之一。在高等植物的初生细胞壁中，木葡聚糖占据了其干重质量的20-25％(Fry SC.1989.The structure and functions ofxyloglucan.Journal of Experimental Botany,40:1-11)。木葡聚糖交叉结合结晶纤维素，在增加细胞壁结构稳定性的同时也阻碍了纤维素酶对纤维素的降解(Hayashi T，KaidaR.2011.Functions of xyloglucan in plant cells.Molecular Plant,4:17-24；RoseJKC,Bennett AB.1999.Cooperative disassembly of the cellulose-xyloglucannetwork of plant cell walls:parallels between cell expansion and fruitripening.Trends in Plant Science,4:176-183)。植物细胞壁中的木葡聚糖含量越少，纤维素就被包裹得越不严密，就更易于被纤维素酶降解(Hayashi T,Kaida R,Kaku T,BabaK.2010.Loosening xyloglucan prevents tensile stress in tree stem bending butaccelerates the enzymatic degradation of cellulose.Russian Journal of PlantPhysiology,57:316-320)。

木葡聚糖仅有一条主链,其主链上含有多种短侧链。自然存在的木葡聚糖的分子量可高达300kDa(Talbott LD,Ray PM.1992.Molecular size and separabilityfeatures of pea cell wall polysaccharides:implications for models of primarywall structure.Plant Physiology,98:357-368)。木葡聚糖的主链由葡萄糖(glucose，G)通过β-1,4糖苷键连接而成，同一个木葡聚糖分子中可能含有多种侧链，侧链由木糖(xylose，X)、半乳糖(galactose，L)、阿拉伯糖(arabinose，A)、岩藻糖(fucose，F)之中的一种或几种组成。由于木葡聚糖的侧链较为复杂，为了便于辨识，一般采用Fry等提出的系统命名法来表述(Fry SC,York WS,Albersheim P,Darvill A,Hayashi T.1993.Anunambiguous nomenclature for xyloglucan-derived oligosaccharides.PhysiologiaPlantarum,89:1-3)。在该系统命名法中，木葡聚糖主链上不含侧链的葡萄糖残基简写为“G”；常见的有五种侧链，分别为：1、主链上的葡萄糖连接一个木糖分子，主链上的葡萄糖残基连同木糖残基构成的化合物结构为G-X，简写为“X”；2、主链上的葡萄糖依次连接一个木糖分子和一个半乳糖分子(York WS,Harvey LK,Guillen R,Albersheim P,DarvillAG.1993.Structural analysis of tamarind seed xyloglucan oligosaccharidesusingβ-galactosidase digestion and spectroscopic methods.CarbohydrateResearch,248:285-301)，主链上的葡萄糖残基连同木糖、半乳糖残基构成的化合物结构为G-X-L，简写为“L”；3、主链上的葡萄糖两侧分别连接一个木糖分子和一个阿拉伯糖分子，主链上的葡萄糖残基连同分别处于两侧的木糖、阿拉伯糖残基一起构成的化合物结构为A-G-X，简写为“A”(Fry SC,York WS,Albersheim P,Darvill A,Hayashi T.1993.Anunambiguous nomenclature for xyloglucan-derived oligosaccharides.PhysiologiaPlantarum，89:1-3)；4、主链上的葡萄糖依次连接一个木糖分子和一个阿拉伯糖分子(Vincken JP,York WS,Beldman C,Voragen AGJ.1997.Two general branching patternsof xyloglucan,XXXG and XXGG.Plant Physiology,114:9-13)，主链上的葡萄糖残基连同木糖、阿拉伯糖残基一起构成的化合物结构为G-X-A，简写为“S”；5、主链上的葡萄糖依次连接一个木糖分子、一个半乳糖分子和一个岩藻糖分子(Vincken JP,Beldman G,NiessenWMA,Voragen AGJ.1996.Degradation of apple fruit xyloglucan byendoglucanase.Carbohydrate Polymers,29:75-85)，主链上的葡萄糖残基连同木糖、半乳糖、岩藻糖残基一起构成的化合物结构为G-X-L-F，简写为“F”。侧链具有改变木葡聚糖物理性能的特性。

木葡聚糖酶是能将木葡聚糖转化成低聚木葡聚糖的一系列酶的总称，主要有五种，分别为：1、内切木葡聚糖酶(EC 3.2.1.151,endo-xyloglucanase，或称为xyloglucan-specific endo-β-D-1,4-glucanase，简称为XEG)；2、外切木葡聚糖酶(EC 3.2.1.155,exo-xyloglucanase)；3、木葡聚糖内切转糖苷酶(EC 2.4.1.207,xyloglucanendotransglycosylase)；4、寡木葡聚糖β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.120，oligoxyloglucanβ-glycosidase)；5、寡木葡聚糖还原端特异性的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.150,oligoxyloglucan reducing-end-specific cellobiohydrolase)。

内切木葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)作用于木葡聚糖内部，随机水解木葡聚糖主链上连接葡萄糖残基之间的β-1,4糖苷键，产生短的木葡聚糖链(Song S,Tang YB,Yang S,YanSQ,Zhou P,Jiang ZQ.2013.Characterization of two novel family 12xyloglucanasesfrom the thermophilic Rhizomucor miehei.Applied Microbiology andBiotechnology,97:10013-10024)。内切木葡聚糖酶主要分布在糖苷水解酶家族5，12，16，44和74，这些酶有不同的结构和作用机制，但是都偏好以木葡聚糖作为底物，对木葡聚糖的特异性酶活力是对其它底物的特异性酶活力的10倍以上，甚至检测不到对其它底物有酶活力(Grishutin SG,Gusakov AV,Markov AV,Ustinov BB,Semenova MV,SinitsynAP.2004.Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degradingenzymes.Biochimica et Biophysica Acta,1674:268-281)。

外切木葡聚糖酶(EC 3.2.1.155)由外向内水解木葡聚糖，每次释放出主链上的含四个葡萄糖单位的寡糖，但具体从非还原性末端还是还原性末端进行水解仍未被研究清楚(Grishutin SG,Gusakov AV,Markov AV,Ustinov BB,Semenova MV,SinitsynAP.2004.Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degradingenzymes.Biochimica et Biophysica Acta,1674:268-281)。

木葡聚糖内切转糖苷酶(EC 2.4.1.207)通过催化木葡聚糖的内部断裂，将产生的木葡聚糖片段转移到其它木葡聚糖分子或低聚木葡聚糖分子的非还原端来完成断裂和重新连接木葡聚糖的作用(Fry SC,Smith RC,Renwick KF,Martin DJ,Hodge SK,etal.1992.Xyloglucan endotransglycosylase,a new wall-loosening enzyme activityfrom plants.Biochemical Journal,282:821-828；Nishitani K,Tominaga R.1992.Endo-xyloglucan transferase,a novel class of glycosyltransferase that catalysestransfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucanmolecule.Journal of Biological Chemistry，267：21058-21064)。

寡木葡聚糖β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.120)从木葡聚糖的非还原性末端由外向内依次进行水解，这种酶的底物特异性要求木葡聚糖非还原性末端的第一个葡萄糖残基上侧链为1个木糖(即结构为G-X，简写为X)，当为其它侧链时则不能水解(Kato Y,MatsushitaJ,Kubodera T,Matsuda K.1985.A novel enzyme producing isoprimeverose fromoligoxyloglucans of Aspergillus oryzae.Journal of Biochemistry,97:801-810)。

寡木葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.150)从木葡聚糖的还原性末端由外向内依次以主链上的两个葡萄糖残基为单位进行水解，但对底物的结构要求较高，要求还原性末端的第一个葡萄糖残基上没有侧链(即结构为G，简写为G)，同时第二个葡萄糖残基上有一个木糖侧链(即结构为G-X，简写为X)，并且第三个葡萄糖残基上最好有一个木糖侧链(即结构为G-X，简写为X)，当符合这三个条件中的前两个时，仅可进行一次水解；当这三个条件都符合时，水解可连续进行(Yaoi K,Mitsuishi Y.2002.Purification,characterization,cloning,and expression of a novel xyloglucan-specificglycosidase,oligoxyloglucan reducing end-specific cellobiohydrolase.TheJournal of Biological Chemistry,277:48276-48281)。

木葡聚糖酶的来源很广，其中微生物是木葡聚糖酶最主要的来源。迄今已有报道产木葡聚糖酶的微生物有地霉属(Geotrichum)(Yaoi K,MitsuishiY.2004.Purification,characterization,cDNA cloning,and expression of axyloglucan endoglucanase from Geotrichum sp.M128.FEBS Letters,560:45-50)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(Yaoi K,Nakai T,Kameda Y,Hiyoshi A,MitsuishiY.2005.Cloning and characterization of two xyloglucanases from Paenibacillussp.strain KM21.Applied and Environmental Microbiology,71:7670-7678)、曲霉属(Aspergillus)(Hakamada Y,Arata S,Ohashi S.2011.Purification andcharacterization of a xyloglucan-specific glycosyl hydrolase from Aspergillusoryzae RIB40.Journal of Applied Glycoscience,58：47-51)、里氏木霉(Trichodermareesei)(Grishutin SG,Gusakov AV,Markov AV,Ustinov BB,Semenova MV,SinitsynAP.2004.Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degradingenzymes.Biochimica et Biophysica Acta,1674:268-281)、高温单孢菌属(Thermomonospora)(Pol D,Menon V,Rao M.2012.Biochemical characterization of anovel thermostable xyloglucanase from an alkalothermophilic Thermomonosporasp.Extremophiles,16:135-146)和青霉属(Penicillium)(Sinitsyna OA,Fedorova EA,Pravilnikov AG,Rozhkova AM,Skomarovsky AA,Matys VY,Bubnova TM,Okunev ON,Vinetsky YP,Sinitsyn AP.2010.Isolation and properties of xyloglucanases ofPenicillium sp.Biochemistry(Moscow),75：41-49)等等。其中以曲霉属的菌株最多，例如日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Grishutin SG,Gusakov AV.Markov AV,Ustinov BB,Semenova MV,Sinitsyn AP.2004.Specificxyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes.Biochimicaet Biophysica Acta,1674:268-281)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Pauly M,Andersen LN,Kauppinen S,Kofod LV,York WS,Albersheim P,Darvill A.1999.Axyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus:expression cloning in yeast,purification and characterization of therecombinant enzyme.Glycobiology,9:93-100)。

在植物中，已发现旱金莲属(Nasturtium)(Mark P,Baumann MJ,JM,GullfotF,Michel G,KallasTeeri TT,Brumer H,Czjzek M.2009.Analysis of nasturtiumTmNXG1complexes by crystallography and molecular dynamics provides detailedinsight into substrate recognition by family GH16xyloglucan endo-transglycosylases and endo-hydrolases.Proteins,75:820-836)和白杨(Populustremula x tremuloides)(Johansson P,Brumer H,Baumann MJ,KallasHenriksson H,Denman SE,Teeri TT,Jones TA.2004.Crystal structures of a poplar xyloglucanendotransglycosylase reveal details of transglycosylation acceptorbinding.The Plant Cell,16:874-886)产生木葡聚糖酶；另外，也发现水生无脊椎动物可产生木葡聚糖酶(Niiyama T,Toyohara H.2011.Widespread distribution of cellulaseand hemicellulase activities among aquatic invertebrates.Fisheries Science,77:649-655)。

目前国际上对木葡聚糖酶进行研究，主要的目的是用于去除包裹着纤维素的木葡聚糖，使得纤维素酶更容易接触纤维素并降解纤维素释放出葡萄糖，再利用酵母菌将葡萄糖转化成为乙醇(Naik SN,Goud VV,Rout PK,Dalai AK.2010.Production of first andsecond generation biofuels:A comprehensive review.Renewable and SustainableEnergy Reviews,14:578-597；Fry SC.1989.The structure and functions ofxyloglucan.Journal of Experimental Botany,40:1-11；Rose JKC,BennettAB.1999.Cooperative disassembly of the cellulose-xyloglucan network of plantcell walls:parallels between cell expansion and fruit ripening.Trends inPlant Science,4:176-183；Hayashi T,Kaida R,Kaku T,Baba K.2010.Looseningxyloglucan prevents tensile stress in tree stem bending but accelerates theenzymatic degradation of cellulose.Russian Journal of Plant Physiology,57:316-320)。同时，木葡聚糖酶可以与β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase，EC 3.2.1.23)(Crombie HJ,Chengappa S,Hellyer A,Reid JSG.1998.A xyloglucan oligosaccharide-active,transglycosylatingβ-D-glucosidase from the cotyledons of nasturtium(Tropaeolum majus L)seedlings-purification,properties and characterization ofa cDNA clone.The Plant Journal,15:27-38)、α-木糖苷酶(α-D-xylosidase，EC3.2.1.117)(Larsbrink J,Izumi A,Ibatullin F,Nakhai A,Gilbert HJ,Davies GJ,Brumer H.2011.Structural and enzymatic characterisation of a glycosidehydrolase family 31α-xylosidase from Cellvibrio japonicus involved inxyloglucan saccharification.Biochem J,436:567-580)、α-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase，EC 3.2.1.51)(de la Torre F,Sampedro J,Zarra I,RevillaG.2002.AtFXG1,an Arabidopsis gene encodingα-L-fucosidase active againstfucosylated xyloglucan oligosaccharides.Plant Physiology,128:247-255)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(non-reducing end α-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55)(Sims IM,Munro SLA,Currie G,Craik D,Bacic A.1996.Structural characterisation ofxyloglucan secreted by suspension-cultured cells of Nicotianaplumbaginifolia.Carbohydrate Research,293:147-172)一起协同将木葡聚糖彻底降解释放出葡萄糖、木糖、岩藻糖和阿拉伯糖，这些单糖也能够被发酵微生物发酵转化为乙醇(B,Karhumaa K,Fonseca C,Spencer-Martins I,Gorwa-GrauslundMF.2007.Towards industrial pentose-fermenting yeast strains.AppliedMicrobiology and Biotechnology,74:937-953)。

在木葡聚糖和纤维素的降解及葡萄糖的转化过程中使用的工艺是同步糖化发酵工艺，需要在酸性pH 5.0下进行(K,Bura R,Lesnicki G,Saddler J,ZacchiG.2007.A comparison between simultaneous saccharification and fermentationand separate hydrolysis and fermentation using steam-pretreated cornstover.Process Biochemistry,42:834-839)，所以对酸性、酸稳定的内切木葡聚糖酶的研究，对于高效地降解木质纤维素以生产燃料乙醇具有重要意义。但是目前报道的内切木葡聚糖酶都不能同时具备“最适作用pH值为酸性”和“在酸性pH下稳定”的酶学特性，例如：

来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株KSM510的1个内切木葡聚糖酶XEG的pH稳定范围是pH 3.0-3.8，但稳定范围很狭窄，而且没有报道其最适作用pH值(Pauly M,Andersen LN,Kauppinen S,Kofod LV,York WS,Albersheim P,Darvill A.1999.Axyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus：expression cloning in yeast,purification and characterization of therecombinant enzyme.Glycobiology,9:93-100)。

来自黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CBS120.49的1个内切木葡聚糖酶EglC的最适作用pH值是pH 4.5，但是没有报道其pH稳定性(Hasper AA,Dekkers E,van Mil M,vander Vondervoort PJI,der Graaff LH.2002.EglC,a new endoglucanase fromAspergillus niger with major activity towards xyloglucan.Applied andEnvironmental Microbiology,68:1556-1560)。

来自黑曲霉(Aspergillus niger)的另1个内切木葡聚糖酶AnXEG12A的最适作用pH值是pH 4.5，但是也没有报道其pH稳定性(Master ER,Zheng Y,Storms R,Tsang A,Powlowski J.2008.A xyloglucan-specific family 12glycosyl hydrolase fromAspergillus niger:recombinant expression,purification andcharacterization.Biochemistry Journal,411:161-170)。

来自雪白曲霉(Aspergillus niveus)菌株A773的1个内切木葡聚糖酶XegA的最适作用pH值是pH 6.0，没有报道其pH稳定性(Damásio ARL,Ribeiro LFC,Ribeiro LF,Furtado GP,Segato F,Almeida FBR,Crivellari AC,Buckeridge MS,Souza TACB,Murakami MT,Ward RJ,Prade RA,Polizeli MLTM.2012.Functional characterizationand oligomerization of a recombinant xyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase(GH12)from Aspergillus niveus.Biochimica et Biophysica Acta-Proteins Proteom,1824:461-467)。

来自地霉属(Geotrichum sp.)菌株M128的1个内切木葡聚糖酶XEG的最适作用pH值是pH 5.5，其pH稳定范围为pH 5.5-8.5(Yaoi K,Mitsuishi Y.2004.Purification,characterization,cDNA cloning,and expression of a xyloglucan endoglucanasefrom Geotrichum sp.M128.FEBS Letters,560:45-50)。

来自类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)菌株KM21的两个内切木葡聚糖酶之中的XEG5的最适作用pH值是pH 5.5-6.5，其pH稳定范围为pH 5.0-8.0；XEG74的最适作用pH值是pH 6.0-6.5，其pH稳定范围为pH 5.0-7.5(Yaoi K,Nakai T,Kameda Y,Hiyoshi A,Mitsuishi Y.2005.Cloning and characterization of two xyloglucanases fromPaenibacillus sp.strain KM21.Applied and Environmental Microbiology,71:7670-7678)。

来自变灰青霉(Penicillium canescens)菌株PCA10的1个内切木葡聚糖酶XGA的最适作用pH值是pH 4.0，但没有报道其pH稳定性；来自疣状青霉(Penicilliumverruculosum)菌株B221-151的两个内切木葡聚糖酶，其中XG25的最适作用pH值是pH 4.6，但没有报道其pH稳定性；XG70的最适作用pH值是pH 4.7，但也没有报道其pH稳定性(Sinitsyna OA,Fedorova EA,Pravilnikov AG,Rozhkova AM,Skomarovsky AA,Matys VY,Bubnova TM,Okunev ON,Vinetsky YP,Sinitsyn AP.2010.Isolation and properties ofxyloglucanases of Penicillium sp..Biochemistry(Moscow),75:41-49)。

来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)菌株CAU432的两个内切木葡聚糖酶之中的RmXEG12A的最适作用pH值为pH 6.5，其只在pH 7.5下稳定；而另一个内切木葡聚糖酶RmXEG12B的最适作用pH为pH 5.0，但其只在pH 5.0下稳定(Song S,Tang YB,Yang SQ,YanQJ，Zhou P，Jiang ZQ.2013.Characterization of two novel family 12xyloglucanasesfrom the thermophilic Rhizomucor miehei.Applied Microbiology andBiotechnology,97:10013-10024)。

来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株A3(2)的1个内切木葡聚糖酶Sco6545的最适作用pH值为pH 6.0，没有报道其pH稳定范围(Enkhbaatar B,Temuujin U,Lim JH,Chi WJ,Chang YK,Honga SK.2012.Identification and characterization of axyloglucan-specific family 74glycosyl hydrolase from Streptomyces coelicolorA3(2).Applied and Environmental Microbiology,78：607-611)。

由此可见，迄今报道的内切木葡聚糖酶的最适作用pH值大部分为弱酸性或接近中性，而且在酸性环境下的稳定性较差，这三个缺点限制了它们的应用前景。因为内切木葡聚糖酶在对木葡聚糖的水解过程中起非常重要的作用，所以对酸性、酸稳定的内切木葡聚糖酶的研究，对于高效降解木质纤维素以生产燃料乙醇具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下1)-3)中任一蛋白质：1)由序列表中序列8所示的氨基酸残基组成的蛋白质，或由序列表中序列8自N末端第9-239位氨基酸残基组成的蛋白质；

2)由序列表中序列4自N末端第21-251位氨基酸残基组成的蛋白质；

3)将1)或2)的氨基酸序列残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

序列4中的第1-20位氨基酸残基是信号肽序列，在蛋白质被分泌到细胞外的时候是会被切掉的。

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列7所示的核苷酸或序列表中序列7自5’末端第25-717位核苷酸；

2)编码区为序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸或序列表中序列6自5’末端第9-701位核苷酸；

3)编码区为序列表中序列5所示的核苷酸；

4)在严格条件下与1)或2)或3)杂交且编码与上述蛋白质具有相同功能的DNA分子；

5)与1)或2)或3)具有90％以上同源性且编码与上述蛋白质具有相同功能的DNA分子。

含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。

上述表达载体为在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的载体，如pPIC9、pPIC3、pA0804、pA0815、pHIL-D1、pPSC3K或pPIC9K。在本发明的实施例中，所使用的表达载体为pPIC9K；本发明的重组载体具体为在pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间插入序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸得到的重组载体pPIC9K-RCOPoXEG12A。

上述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌和植物细胞等，优选为酵母菌；所述酵母菌具体可为巴氏毕赤酵母。在本发明的实施例中，宿主菌均为毕赤酵母，优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(可购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(可购自美国Invitrogen公司)。

上述的蛋白质作为内切木葡聚糖酶的应用也是本发明保护的范围。

上述的DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备内切木葡聚糖酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备内切木葡聚糖酶的方法。

本发明提供的方法，为在甲醇诱导下发酵上述的重组菌，即得到内切木葡聚糖酶。

上述方法中，所述甲醇在发酵体系中的体积百分含量为1-1.5％。

所述发酵具体为将重组菌在BMMY培养基中在28℃下、250rpm振荡培养；且每12小时向培养物中加入甲醇，前24小时加入甲醇至终浓度1％(体积百分含量)，24小时以后加入甲醇至终浓度1.5％(体积百分含量)；振荡培养48小时，离心去除菌体后，得到内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的粗酶液。

上述的蛋白质在降解木葡聚糖中的应用；所述降解所需的pH值具体为4.5-5.5。

本发明的实验证明，本发明从草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株EU2106的基因组序列中发现了一个编码内切木葡聚糖酶的基因PoXEG12A，进行巴氏毕赤酵母密码子优化，可在宿主细胞中表达该基因以生产内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A，用于降解木葡聚糖。对该内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A进行酶活力相关检测，其酶促反应的最适pH为pH 5.0、最适温度为60℃；在最适pH和最适温度下，该酶对底物木葡聚糖的比酶活力为172U/mg；而且5mMol/L的Fe²⁺可以把内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的活性提高20％，达到206U/mg。该酶在pH 3.5-7.0下稳定。

本发明的内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A作为内切木葡聚糖酶，同时具有“最适作用pH值为强酸性”和“在强酸性pH值下稳定”的特性，这个特性是已被报道的内切木葡聚糖酶所不具备的，同时，这个特性可使得RCOPoXEG12A在用含有木葡聚糖的纤维素原料生产燃料乙醇的工业生产中具有应用潜力。

附图说明

图1为草酸青霉EU2106的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图

图2为草酸青霉EU2106基因组中含有一个假定内切木葡聚糖酶全长基因的一段核苷酸序列的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图3为草酸青霉EU2106基因组的一个假定内切木葡聚糖酶全长基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图4为草酸青霉EU2106的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图

图5为草酸青霉EU2106的一个假定内切木葡聚糖酶的cDNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图6为草酸青霉EU2106的一个假定内切木葡聚糖酶的成熟蛋白质的编码区序列优化密码子以后的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图7为重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的构建

图8为载体pPIC9K和重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A分别进行SalⅠ酶切线性化产物的琼脂糖凝胶电泳图

图9为重组巴氏毕赤酵母菌株GHP9K13202的菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

图10为纯化的重组内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的SDS-PAGE分析

图11为纯化的重组内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A水解木葡聚糖的产物的MALDI-TOF-MS图谱

图12为内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的最适作用pH曲线

图13为内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的最适作用温度曲线

图14为内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的pH耐受性曲线

图15为内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的温度耐受性曲线

图16为内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的酶反应动力学常数Km和Vmax的测定

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分比(％)，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值或平均值±标准偏差。以下实施例中的转速，均为在半径为4.5-5.5cm的离心半径下的转速。

1、菌株、载体、限制性内切酶、抗生素和试剂盒

草酸青霉EU2106为本实验室筛选得到的高产纤维素酶菌株，已保存于中国普通微生物菌种保存中心，保藏号为CGMCC No.6471，并记载在一项已获授权的发明专利中(冯家勋，农清栋，刘君梁，等。一株青霉突变株及其在制备纤维素酶中的应用。专利号：ZL201210395227.1，公开号为CN102876590A)。巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115购自Invitrogen公司(California,USA)，产品目录号为C18100。表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司(California,USA)，产品目录号为V17520。限制性内切酶EcoRⅠ(产品目录号为1040B)，NotⅠ(产品目录号为1166B)和SalⅠ(产品目录号为1080B)购自TaKaRa公司(辽宁，中国)。遗传霉素(简称G418)购自Solarbio公司(北京，中国)，产品目录号为G8161-1000。PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa公司(辽宁，中国)，产品目录号为R045A。2×Easy TaqSuper Mix试剂盒(产品目录号为AS111-02)和T载体克隆试剂盒(pEASY-Blunt CloningKit)(产品目录号为CB101)购自全式金公司(北京，中国)。DNA纯化回收试剂盒购自天根公司(北京，中国)，产品目录号为DP214-03。Trizol试剂盒购自Invitrogen公司(California,USA)，产品目录号为10296-010。mRNA反转录试剂盒购自TaKaRa公司(辽宁，中国)，产品目录号为6210A。基因组DNA快速抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中国)，产品目录号为SK8230。BCA试剂盒购自Pierce公司(Rockford,USA)，产品目录号为23225。Ni-NTA agrose填料购自QIAGEN公司(Hilden,Germany)，产品目录号为30210。

2、多糖

罗望子木葡聚糖(产品目录号为P-XYGLN)和地衣多糖(产品目录号为P-LICHN)购自Magazyme公司；大麦葡聚糖(产品目录号为G6513)、甲基纤维素(产品目录号为M0512)、羧甲基纤维素钠(产品目录号为C-5678)、Avicel(产品目录号为11365)、桦树木聚糖(产品目录号为X0502)、山毛榉木聚糖(产品目录号为X4252)、海带多糖(产品目录号为L9634)、半乳聚糖(产品目录号为A9788)购自Sigma公司。

3、培养基

(1)真菌培养用培养基

固态培养基平板采用马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)，购自北京陆桥技术有限责任公司，目录号为CM123，配制方法依照公司说明书进行。110-115℃灭菌20分钟后备用。

提取DNA和RNA所用真菌液态培养基每升含有：Avicel 30g,麦麸(粉碎且通过80目筛)20g,KH₂PO₄4g,(NH₄)₂SO₄2.8g,CaCl₂0.6g,MgSO₄·7H₂O 0.6g,FeSO₄·7H₂O 5×10^-7g,MnSO₄1.6×10^-7g,ZnSO₄1.4×10^-7g,CoCl₂2×10^-7g,pH 5.0。121℃灭菌20分钟。

(2)酵母用培养基

液体培养基配方及配制方法如下(如果配制固体培养基，则需加入3％琼脂粉)：

配制培养基所需母液和缓冲液的配制：10×葡萄糖为10％葡萄糖；1M磷酸钾缓冲液(K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，pH 6.0)的配制方法为：132mL 1M K₂HPO₄溶液与868mL 1M KH₂PO₄溶液混合，用磷酸或氢氧化钾调节pH至6.0；10×YNB(即13.4％YNB)的配制方法为：100mL水中加入13.4g无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base without amino acids，简写为YNB。购自Solarbio，厂家地址为中国北京，产品目录号为Y8040)。500×生物素(即0.002％生物素)的配制方法为：100mL水中加入20mg生物素。10×YNB、500×生物素需单独配制并过滤除菌并4℃保存。

BMMY培养基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，100mL 1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)，100mL 10×YNB，2mL 500×生物素，8mL甲醇。BMMY培养基的配制方法为先将20g胰蛋白胨和10g酵母提取物溶于700mL去离子水并在121℃蒸汽灭菌20分钟，其它成分单独配制且用0.45μm滤膜过滤除菌后于使用前添加。

YPD培养基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，pH值自然。115℃蒸汽灭菌20分钟。

YPG培养基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油20g，pH值自然。121℃蒸汽灭菌20分钟。

MD液体每升含有：10×YNB 100mL，10×葡萄糖100mL，500×生物素2mL，pH值自然。115℃蒸汽灭菌20分钟。

4、内切木葡聚糖酶酶活力的测定

以罗望子木葡聚糖为底物测定内切木葡聚糖酶的活力，参照Pol等所描述的方法并进行了一些修改(Pol D,Menon V,Rao M.2012.Biochemical characterization of anovel thermostable xyloglucanase from an alkalothermophilic Thermomonosporasp..Extremophiles,16:135-146)，具体操作如下：

(1)、葡萄糖标准曲线的制作

用去离子水配制1g/L的葡萄糖标准溶液，用该标准溶液和去离子水在1.5ml离心管中配制6个500μL不同浓度的葡萄糖溶液，分别为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L和0.6g/L。每个样品浓度分别设三个重复，在所有样品中加入2倍体积的DNS试剂，混匀，沸水中煮5分钟，冷却至室温，12000rpm离心1分钟，每个样品分别取200μL上清液加入到96孔酶标板中，在波长540nm下测定样品的吸光值。以葡萄糖浓度为横轴(X轴)，以光吸收值为纵轴(Y轴)作散点图，添加趋势线得到标准曲线为y＝0.004x-0.0342(相关系数R²＝0.9994)。

(2)、酶活力的测定

酶活力的测定设置反应组和对照组。

反应组为在2mL的离心管中加入450μL含0.5％罗望子木葡聚糖的缓冲液(具体的pH值可依据不同的实验需要来设定)，在设定温度的水浴锅中保温5分钟后(温度可依据不同的实验需要来设定)，加入50μL酶液并快速混匀。保温反应一段时间后加入1mL的DNS试剂终止反应并沸水浴5分钟显色。冷却至室温后，取200μL反应液加入到96孔酶标板中，用酶标仪于540nm处测定光吸收值。

对照组为将酶液沸水浴5分钟灭活，该灭活酶液按上述反应组同样操作进行反应作为对照，同样用酶标仪于540nm处测定光吸收值。

将反应组的光吸收值减去对照组的光吸收值，得到差值，将差值代入葡萄糖标准曲线计算得出反应体系中含有还原糖的量，计算出酶活力。

内切木葡聚糖酶活力单位(U)的定义：在设定的测定条件下，每分钟水解木葡聚糖释放出1μmol还原糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

蛋白质含量的测定使用BCA法(Smith PK,Krohn RI,Hermanson GT,Mallia AK,Gartner FH,Provenzano MD,Fujimoto EK,Goeke NM,Olson BJ,KlenkDC.1985.Measurement of protein using bicinchoninic acid.AnalyticalBiochemistry,150:76-85)。

酶比活力定义：在设定的测定条件下，每mg蛋白质所具有的酶活力(U/mg)。

实施例1、内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的编码基因RCOPoXEG12A的获得

(1)、草酸青霉EU2106基因组DNA的提取

草酸青霉EU2106孢子悬浮液的制备为：将草酸青霉EU2106的孢子液接种到PDA平板上，28℃静置培养5天后，取新鲜孢子置于无菌超纯水中制备孢子悬浮液，借助于显微镜放大400倍来计数，将孢子悬浮液的浓度调整为1×10⁸个/mL。

草酸青霉EU2106液态培养为：使用前述真菌液态培养基，500mL规格的三角瓶中装液量为100mL，121℃灭菌20分钟后可用。将1mL孢子悬浮液加入其中，置于28℃、180rpm摇床培养2天后，生长的菌丝体可用于提取基因组DNA和RNA。

使用基因组DNA快速抽提试剂盒提取草酸青霉EU2106的基因组DNA，按照产品使用说明书进行。将提取所得的DNA溶液进行浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。图1中的泳道1为λ噬菌体DNA用DNA限制性内切酶HindⅢ进行完全酶切之后得到的产物，含有7个DNA片段，从大到小分别为23.13、9.416、6.557、4.361、2.322、2.027和0.564kb；泳道2为草酸青霉EU2106的基因组DNA。电泳结果表明已经成功提取得到草酸青霉EU2106的基因组DNA。

(2)、基因PoXEG12A的获得

设计一对引物，上游引物为5’-GACTCATATTCCATCCACTACCTGG-3’，下游引物为5’-CACTCGCACGAATAAACCCATCCTCC-3’，以提取得到的草酸青霉EU2106基因组DNA作为模板，使用PrimeSTAR试剂盒进行PCR扩增，反应体系如下：

PCR反应程序如下：

这5个步骤的具体实施先后顺序为依次从①至⑤，具体为步骤①仅运行1次，步骤②、③和④依次进行一次构成一个循环，持续30个循环之后进入步骤⑤，步骤⑤仅运行1次。在本专利的所有PCR扩增实验中，如果没有特别提及，则为使用此反应体系和反应程序。

将PCR得到的产物进行浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。图2中的泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为草酸青霉EU2106基因组中含有一个假定内切木葡聚糖酶全长基因的一段核苷酸序列的PCR产物。电泳结果表明成功得到一段长度约为1kb的基因组DNA。将该段基因组DNA所在的凝胶切下，使用DNA纯化回收试剂盒进行回收，回收所得产物使用T载体克隆试剂盒连接至T载体上并转化至大肠杆菌中。使用2×Easy Taq Super Mix试剂盒和T载体通用上游引物5’-TGTAAAACGACGTCCAGT-3’及下游引物5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’进行菌落PCR，将含有重组质粒的阳性大肠杆菌送去测序，得到该段基因组DNA的序列为序列表中的序列1，序列1长度为1028bp。

经过用ORF finder分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)，在序列1中共发现8个开放阅读框(open reading frame，ORF)，分别是ORF1：核苷酸3-173(共171个核苷酸)、ORF2：核苷酸73-432(共360个核苷酸)、ORF3：核苷酸258-566(共309个核苷酸)、ORF4：核苷酸451-804(共354个核苷酸)、ORF5：核苷酸558-995(共438个核苷酸)、ORF6：核苷酸629-757(共129个核苷酸)。以ORF2的起始序列设计上游引物5’-ATGAAGTCGTTCACACCACT-3’，以ORF5的3’端序列设计下游引物5’-TCAAACAACAGCCACGGAGTAAG-3’，以草酸青霉EU2106基因组DNA为模板，成功扩增得到一条约0.95kb的DNA片段(如图3所示，泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为草酸青霉EU2106基因组的一个假定内切木葡聚糖酶基因的核苷酸序列的PCR产物)，其序列为序列表中的序列2。序列2包含于序列1之中，为序列1的从5’端起第73-995位核苷酸，长度为923bp。

使用Trizol试剂盒提取草酸青霉EU2106的总RNA，提取方法按照说明书进行，提取得到的RNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图4所示，成功提取得到草酸青霉EU2106的总RNA。使用反转录试剂盒，按照说明书上所述的操作方法将其中的mRNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用上游引物5’-ATGAAGTCGTTCACACCACT-3’和下游引物5’-TCAAACAACAGCCACGGAGTAAG-3’进行PCR扩增，成功扩增得到一条约0.75kb的DNA片段(如图5所示，泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为草酸青霉EU2106的一个假定内切木葡聚糖酶的cDNA的PCR产物)，其序列为序列表中的序列3，长度为756bp。

将序列2和序列3进行比对分析，发现从基因组中所得到的序列2中含有两个外显子和一个内含子。序列2中的第1-3个核苷酸ATG为起始密码子，第1-356个核苷酸为第一个外显子，第357-523个核苷酸为内含子，第524-920个核苷酸为第二个外显子，第921-923个核苷酸为终止密码子。序列3中的第1-3个核苷酸ATG为起始密码子；第1-753个核苷酸为序列2中的两个外显子依次相接而成的编码区，编码含251个氨基酸的多肽，该多肽序列为序列表中的序列4；第754-756个核苷酸为终止密码子。

使用SMART软件对序列4进行分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，结果表明其第1-20个氨基酸为信号肽(由序列3中的第1-60位核苷酸编码)，第21-251个氨基酸所构成的多肽(由序列3中的第61-753位核苷酸编码)为一个糖苷水解酶家族12的假定内切木葡聚糖酶。由于信号肽在蛋白质被分泌到细胞外的过程中会被切除，成熟蛋白质不含有信号肽序列，于是将序列3的第61-753个核苷酸命名为基因PoXEG12A，编码的多肽命名为PoXEG12A，其氨基酸序列为序列表中序列4的第21-251位氨基酸。

(3)、基因PoXEG12A的密码子优化

同一个氨基酸可以由不同的三联体密码子来编码，这些编码同一个氨基酸的密码子被称为“同义密码子”。对于大多数物种来说，编码某个特定氨基酸时都偏好于使用编码这个氨基酸的“同义密码子”之中的某一个，这种现象被称为“密码子的偏好性”，而这个被偏好用于编码这个氨基酸的密码子则被称为该物种的“偏好密码子”，其它非偏好密码子被称为“稀有密码子”。例如“GCA”、“GCT”、“GCG”、“GCC”这四个密码子都可以编码丙氨酸，但由于巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)这个物种偏好于使用“GCT”来编码丙氨酸，则巴氏毕赤酵母用来编码丙氨酸的“偏好密码子”为“GCT”，“稀有密码子”为“GCA”、“GCG”和“GCC”。

当将基因在宿主菌中重组表达时，根据“密码子的偏好性”现象，在不改变基因编码的蛋白质序列的前提下，依据宿主菌的密码子偏好性，将基因中的“稀有密码子”替换为宿主菌的“偏好密码子”则有利于获得更大量的表达产物，这个过程被称为“密码子优化”(Fuhrmann M,Hausherr A,Ferbitz L,T,Heitzer M，Hegemann P.2004.Monitoringdynamic expression of nuclear genes in Chlamydomonas reinhardtii.PlantMolecular Biology，55:869-881)。在GCUA网站(http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html)上对基因PoXEG12A的密码子进行在线分析，发现以巴氏毕赤酵母为表达宿主时有多个密码子不是巴氏毕赤酵母最常用的偏好密码子，于是将基因PoXEG12A进行密码子优化。优化后所得的序列为序列表中序列5的第1-693位核苷酸，仍然编码序列表中序列4的第21-251位氨基酸。将优化后所得的核苷酸序列命名为基因COPoXEG12A(CO为英文单词codonoptimized的首字母，意思为“经过密码子优化后所得到的”)。将基因COPoXEG12A交由上海捷瑞生物公司进行人工合成，合成之后使用含有限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点的上游引物5’-CGGAATTCGCTGCTGTTCCAGCTACT-3’和含有限制性内切酶NotⅠ酶切位点的下游引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGATGGTGGTGGTGAACAACAGCAAC-3’进行PCR。

PCR产物的电泳结果如图6所示。泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为基因COPoXEG12A的PCR产物，长度为738bp。经过测序，该PCR产物具有序列表中序列6所示的核苷酸。序列6中从5’端起第1-2个核苷酸为限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点的保护碱基；第3-8个核苷酸为限制性内切酶EcoRⅠ的酶切位点，第9-701个核苷酸为基因COPoXEG12A，第702-719个核苷酸为6个组氨酸的编码序列，第720-722个核苷酸为终止密码子，第723-730个核苷酸为限制性内切酶NotⅠ的酶切位点，第731-738个核苷酸为限制性内切酶NotⅠ的酶切位点的保护碱基。

实施例2、蛋白质RCOPoXEG12A的功能验证

一、重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的构建

将载体pPIC9K用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，双酶切产物用DNA纯化回收试剂盒进行回收，回收产物经过琼脂糖凝胶电泳检验，得到9.3kb长的载体条带(图7A，泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ将质粒pPIC9K进行双酶切后再进行琼脂糖凝胶电泳胶回收得到的产物)。

将实施例1获得的具有序列6所示的PCR产物用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，双酶切产物用DNA纯化回收试剂盒进行回收，回收产物经过琼脂糖凝胶电泳检验，得到约0.7kb长的外源DNA条带(图7B，泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ将序列6所示的PCR产物进行双酶切后再进行琼脂糖凝胶电泳后回收得到的产物)，将该回收的DNA片段与载体pPIC9K酶切产物连接，得到重组质粒。

经过测序，该重组质粒为将序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸插入到pPIC9K载体的EcoR l和Not l的酶切位点，得到重组的核苷酸序列如序列表中序列7所示，将含有序列7所示序列的重组质粒命名为pPIC9K-RCOPoXEG12A(“R”为英文单词recombinant的首字母，意为“重组的”)。

在使用载体pPIC9K表达外源基因时，由于载体pPIC9K上自带有信号肽的编码序列，所以在重组蛋白质翻译和折叠完成之后，巴氏毕赤酵母会在细胞内切除信号肽并将成熟蛋白质分泌到细胞外。但由于切除信号肽有特定的位点，使得使用限制性内切酶EcoRⅠ克隆时，表达的分泌到细胞外的成熟重组蛋白质的N末端会额外多出8个氨基酸残基(详细的描述记载在载体pPIC9K的商品说明书上)。在核苷酸序列上，有24个核苷酸编码该8个氨基酸，序列表中序列7所示的735个核苷酸序列是编码经EcoR l和Not l酶切的序列6克隆到载体pPIC9K后在巴氏毕赤酵母中表达的分泌到细胞外的成熟重组蛋白质的编码序列，该序列被命名为RCOPoXEG12A(“R”为英文单词recombinant的首字母，意为“重组的”)，其在巴氏毕赤酵母中表达的分泌到细胞外的成熟重组蛋白质被命名为RCOPoXEG12A，具有序列8的氨基酸序列，共有245个氨基酸残基。

序列8所示蛋白质N末端第1-8个氨基酸由载体pPIC9K上的序列编码，该编码序列为序列7中第1-24个核苷酸(详细的描述记载在载体pPIC9K的商品说明书上)；序列7中第25-717位核苷酸为基因PoXEG12A进行密码子优化之后得到的基因COPoXEG12A，编码序列8所示的蛋白质中自N末端第9-239位氨基酸(其氨基酸序列与序列表中序列4的第21-251位氨基酸序列相同)；序列7中第718-735位核苷酸编码序列8中第240-245位氨基酸，为6个组氨酸构成的标签。经过在线计算(http://www.cnhupo.cn/CalMW/MyMW.asp)，重组蛋白质RCOPoXEG12A的理论分子量为26.57kDa。

二、含有质粒pPIC9K-RCOPOXEG12A的重组巴氏毕赤酵母的构建

将不携带外源基因的载体pPIC9K用限制性内切酶SalⅠ进行单酶切，得到线性化质粒如图8A所示，图8A中的泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为载体pPIC9K的SalⅠ单酶切线性化产物)。将重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A用限制性内切酶SalⅠ进行单酶切，得到线性化质粒如图8B所示(泳道1为1kb DNA ladder，含有10个DNA片段，从大到小分别为10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、3.00、2.00和1.00kb；泳道2为重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的SalⅠ单酶切线性化产物)。这两个线性化质粒都被分别用电击法转化至巴氏毕赤酵母菌株GS115中。具体操作如下：

1、巴氏毕赤酵母GS115感受态的制备

从-80℃冰箱中取出保存于20％甘油中的巴氏毕赤酵母菌株GS115，用无菌蒸馏水稀释后涂布于YPD平板上，在28℃下培养2-3天后，挑取较大的单个菌落接种到液体YPD培养基中，在28℃、250rpm的摇床中振荡培养16-20小时，此时测定菌液的OD600在1.0左右。在无菌条件下将菌液转至无菌的40mL Beckman圆底离心管中，在4℃、2500rpm下离心3分钟，菌体为沉淀，弃去上清液；用30mL冷的无菌水(用前放置4℃冰箱)重悬菌体，在4℃、2500rpm下离心3分钟，菌体为沉淀，弃去上清液；用10mL冷的1M无菌山梨醇(用前放置4℃冰箱)重悬菌体，在4℃、2500rpm下离心3分钟，菌体为沉淀，弃去上清液；重复上一步骤，利用残余的山梨醇溶液悬浮沉淀菌体，分别向1.5mL EP管中加入100μL菌体。

2、重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A和载体pPIC9K电击转化巴氏毕赤酵母GS115

用限制性内切酶SalⅠ对载体pPIC9K和重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A进行单酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化单酶切产物，得到所需要的它们的线性化产物(图8，其中图8A为线性化载体pPIC9K,图8B为线性化重组质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A)。用移液枪吸取10μl线性化的重组质粒和载体pPIC9K分别加入到100μl的巴氏毕赤酵母GS115感受态细胞中，混匀，转至冰上预冷后的2毫米间距宽的电击杯中，设置电转仪参数为：电压1500V、电容25μF、电阻200Ω、电击时间为4-10毫秒，进行电击。电击后快速倒入800μL预冷的1M山梨醇并混匀，转入无菌的EP管中，置于冰水混合物中5分钟。取100μL菌液涂在MD平板上，在28℃恒温培养箱中倒置培养3天。

3、重组巴氏毕赤酵母的筛选与鉴定

用MD液体培养基洗下MD平板上的菌落至指形瓶中，从10^-1到10^-6依次稀释6个梯度，分别取100μL各个梯度的菌液涂在G418浓度为2.5mg/mL的YPD平板上，在28℃恒温培养箱中倒置培养2-3天。

将含2.5mg/mL G418的YPD平板上较大的菌落用牙签划线在新的含2.5mg/mL G418的YPD平板上，并将牙签上剩余的细胞用来做菌体PCR，鉴定重组子。用正向引物5’AOX:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和反向引物3’AOX:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’引物进行菌体PCR。菌体PCR体系和反应条件如下：

(1)菌体PCR体系为：2×Easy Taq Super Mix 12.5μL，5’AOX(10μM)和3’AOX(10μM)均为1μL，巴氏毕赤酵母细胞适量，加ddH₂O补足体系总体积到25μL。

(2)反应条件为：95℃预变性5分钟，92℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，最后72℃延伸10分钟。

以转化载体pPIC9K得到的对照单菌落为模板进行PCR扩增，结果如图9A所示。图9A中的泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为质粒pPIC9K转化得到的重组巴氏毕赤酵母的菌体PCR产物，产物中有一条500bp长的条带，长度与载体pPIC9K的商品说明书上所述相符合(详情请看载体pPIC9K的商品说明书)，为载体上的原有序列。将该阴性重组菌株命名为GHP9K。

以转化pPIC9K-RCOPoXEG12A得到的单菌落为模板进行PCR扩增，结果如图9B所示。图9B中的泳道1为1kb DNA ladder，含有14个DNA片段，从大到小分别为10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2为质粒pPIC9K-RCOPoXEG12A转化得到的重组巴氏毕赤酵母的菌体PCR产物。最终得到一个阳性重组菌株的PCR产物中有一条1200bp的条带，长度为载体上的原有序列长度(详情请看载体pPIC9K的商品说明书)与外源DNA长度之和，将该阳性重组菌株命名为GHP9K13202。

三、重组巴氏毕赤酵母中RCOPoXEG12A基因的表达和重组蛋白质RCOPoXEG12A的纯化

(一)、重组巴氏毕赤酵母中RCOPoXEG12A基因的表达

1、诱导重组巴氏毕赤酵母菌株GHP9K13202表达重组蛋白质RCOPoXEG12A

将GHP9K13202接种至5mL的液态YPG培养基中，28℃、250rpm培养12小时；再转至覆盖八层纱布的含40mL YPG的500ml三角瓶中，28℃、250rpm振荡培养16小时，此时菌液OD600达到16-18；在无菌条件下，将每瓶中的全部菌液转移至无菌40mL Beckman圆底离心管中，在4℃、2500rpm条件下离心3分钟，去上清；向每个管中倒入40mL的液态BMMY培养基，轻轻拍打管的底部，重悬菌体；再将菌液转移至无菌的覆盖六层纱布的500ml三角瓶中，继续在28℃、250rpm摇床培养，每隔12小时加入一定量的甲醇，前24小时加入甲醇至终浓度1％，24小时以后加入甲醇至终浓度1.5％；培养48小时后用无菌的50mL离心管收集菌液，12000rpm离心10分钟，收集上清液即为重组巴氏毕赤酵母GHP9K13202的培养液。

采用同样的方法诱导阴性重组巴氏毕赤酵母GHP9K为对照，得到对照培养液。

2、重组巴氏毕赤酵母发酵液木葡聚糖酶活力的测定

分别测定阳性重组巴氏毕赤酵母GHP9K13202和阴性重组巴氏毕赤酵母GHP9K培养液的木葡聚糖酶活力，结果阳性重组巴氏毕赤酵母GHP9K13202发酵液的木葡聚糖酶活力3.6U/mL，阴性重组巴氏毕赤酵母GHP9K的培养液检测不到木葡聚糖酶活力。

上述结果说明，RCOPoXEG12A基因表达的蛋白质RCOPoXEG12A具有木葡聚糖酶活力。阳性重组巴氏毕赤酵母GHP9K13202培养液离心之后得到的上清液含有木葡聚糖酶，作为粗酶液可进行木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的蛋白质纯化。

木葡聚糖酶是葡聚糖酶中的一种，由于有的葡聚糖酶可以降解多种底物，所以需要进一步区分RCOPoXEG12A到底是特异性降解木葡聚糖的木葡聚糖酶、还是其它同时兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶。

(二)、重组蛋白质RCOPoXEG12A的纯化

使用QIAGEN公司的Ni-NTA层析柱纯化重组蛋白质RCOPoXEG12A，纯化步骤如下：

(1)加入2-3mL的Ni-Agarose填料到Ni-NTA亲和层析柱中，待液体流干后，加入两倍柱体积的去离子水洗柱子；

(2)待去离子水流干后，加入一倍柱体积的10mM的咪唑平衡柱子；

(3)将填料倒入装有50mL巴氏毕赤酵母GHP9K13202发酵上清液的离心管中，于脱色摇床上快速振荡1小时；

(4)将混合液转至亲和层析柱中，让液体自然流尽；

(5)用20mM的咪唑洗涤两倍柱体积，让液体自然流尽；

(6)依次用40mM、60mM、80mM、100mM咪唑分别洗3ml，收集洗脱液；

(7)依次用250mM和300mM的咪唑(Elution buffer)分别洗涤5ml(每次加入1ml，流尽之后再加)，收集洗脱液。

将所有的收集液保存在4℃冰箱。参照Laemmli的方法用SDS-PAGE检测洗脱液中的蛋白质纯度(Laemmli UK.1970.Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature,227:680-685)，结果如图10所示。图10中的泳道1为蛋白质分子量标记。包含7条带，从上到下依次为116、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4和14.4kDa；泳道2为纯化的重组蛋白质RCOPoXEG12A。从图10可以看到，泳道2中仅有一条蛋白质条带，该条带对应的分子量约为26.6kDa，与经过在线计算(http://www.cnhupo.cn/CalMW/MyMW.asp)得到的重组蛋白质RCOPoXEG12A的理论分子量26.57kDa相符合，表明依照上述方法成功纯化得到了重组蛋白质RCOPoXEG12A。

四、纯化的重组蛋白质RCOPoXEG12A的酶学特性

1、重组蛋白质RCOPoXEG12A的底物特异性检测

由于有的葡聚糖酶可以降解多种底物，为了区分RCOPoXEG12A到底是对木葡聚糖有高特异性的木葡聚糖酶、还是其它同时兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶，就必须检测该酶的底物特异性。分别配置0.5％的木葡聚糖，大麦葡聚糖，地衣多糖，甲基纤维素，羧甲基纤维素，Avicel，桦树木聚糖，山毛榉木聚糖，海带多糖和半乳聚糖，在最适作用条件下(pH5.0,60℃)测定重组蛋白质RCOPoXEG12A对不同底物的酶活力。结果见表1，RCOPoXEG12A只对木葡聚糖有酶解作用(RCOPoXEG12A对木葡聚糖的比活力达到172U/mg)，证实RCOPoXEG12A为对木葡聚糖有高特异性的木葡聚糖酶，而不是其它同时兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶。

表1.重组蛋白质RCOPoXEG12A的底物特异性检测

2、重组蛋白质RCOPoXEG12A水解木葡聚糖的产物的鉴定与分析

在5个无菌的2mL离心管中，分别加入450μL含0.5％木葡聚糖的0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)和50μL上述纯化制备的重组蛋白质RCOPoXEG12A，酶的添加量为3U/g底物，置于45℃水浴锅中反应8小时，沸水煮5分钟灭活重组蛋白质RCOPoXEG12A，冷却后将降解产物交由上海微谱化工技术服务有限公司做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(英文全称为Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry，简称为MALDI-TOF-MS)分析，结果见图11。

在图11中，横轴“Mass(m/z)”中的“Mass”是指分子量，括号中的“m/z”全称为“mass-to-charge ratio”，翻译为“质荷比”，“质荷比”意为相对分子质量与电荷的比值。由于在MALDI-TOF-MS中，每个产物分子都是与一个钠离子形成加合物，所以产物的质荷比等于“(产物的相对分子质量+钠离子的相对分子质量)/钠离子所带的电荷数”。由于钠离子只带1个正电荷，所以实际上测定产物得到的质荷比等于“产物的相对分子质量+钠的相对分子质量”。产物的表现形式为与横轴垂直的狭窄的正向峰，每个峰的出峰位置对应于横轴“Mass(m/z)”中的某一个特定的质荷比数值，这个特定的质荷比数值已经被仪器在每个峰的顶点处自动标记出来了。依照这个质荷比数值和木葡聚糖的分子结构组成的特点，再对照已经发表的论文中的介绍，就可以判断出哪个峰对应于哪个产物。即使某个峰在已经发表的论文中并没有分析得出对应于哪个产物，但只要依照这个质荷比数值和木葡聚糖的分子结构特点，再结合各个参与组成木葡聚糖的单糖的分子量，就可以计算得出这个峰是由哪几个单糖、每个单糖各自有多少个来构成的。纵轴“％Intensity”表示峰的强度，是以最高的峰的强度设定为100％，其它峰的强度折算为相对强度。每个产物的相对含量都是不同的，它们的相对含量表现在峰的高度差异上。

本实验所用的来自于罗望子的木葡聚糖的构成为葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝45:34:18:3，不含岩藻糖(http://secure.megazyme.com/Xyloglucan_Tamarind)。以1条主链形式存在，其构建单位(building unit)主要为由4个葡萄糖为基础而衍生出来的木葡聚糖寡糖(four-glucose based xyloglucan oligosaccharide，简写为Glc4-based XGOs)XXXG(G₄X₃)、XXLG/XLXG(G₄X₃L₁)和XLLG(G₄X₃L₂)，少量构建单位为上述组成单位中的1个半乳糖被1个阿拉伯糖取代而得的XXAG/XAXG(G₄X₃A₁)和XALG/XLAG(G₄X₃L₂A₁)，或XXSG/XSXG(G₄X₃A₁)和XSLG/XLSG(G₄X₃L₂A₁)，更稀有的构建单位为由3个葡萄糖为基础衍生出来的木葡聚糖寡糖(three-glucose based xyloglucan oligosaccharide，简写为Glc3-basedXGOs)，这些组成单位之间随机组合连接构成了木葡聚糖长链(York WS,Harvey LK,Guillen R,Albersheim P,Darvill AG.1993.Structural analysis of tamarind seedxyloglucan oligosaccharides usingβ-galactosidase digestion and spectroscopicmethods.Carbohydrate Research,248:285-301)。对照文献(Song S,Tang YB,Yang SQ,Yan QJ，Zhou P，Jiang ZQ.2013.Characterization of two novel family12xyloglucanases from the thermophilic Rhizomucor miehei.Applied Microbiologyand Biotechnology,97:10013-10024)，可以确认图11中m/z为1085.2107的峰是XXXG(G₄X₃)，m/z为1247.2363的峰是XXLG/XLXG(G₄X₃L₁)，m/z为1409.2653的峰是XLLG(G₄X₃L₂)，这3个峰都是Glc4-based XGOs。由于质谱只能鉴定出分子量而不能鉴定出分子结构，而阿拉伯糖可以以两种方式参与构成侧链，所以不能鉴定出由葡萄糖(G)、木糖(X)和阿拉伯糖(A)各一个分子构成的结构式到底是阿拉伯糖直接与葡萄糖相连接构成结构A-G-X(简写为A)、还是与木糖相连接构成结构G-X-A(简写为S)，只能计算出各个单糖的数量。m/z分别为2291.3811、2423.3875、2585.4053和2747.4226的四个峰为主链为含2个构成罗望子木葡聚糖的重复单元的木葡聚糖寡糖，都是Glc8-based XGOs，依据其分子量、各个组成罗望子木葡聚糖的单糖的分子量、罗望子木葡聚糖的组成方式，计算出其结构式分别为G₈X₆L₁、G₈X₆L₁A₁、G₈X₆L₂A₁和G₈X₆L₃A₁；m/z为3599.4512、3761.4876和3923.4990的3个峰则为主链为含3个构成罗望子木葡聚糖的重复单元的木葡聚糖寡糖，都是Glc12-based XGOs，依据其分子量、各个组成罗望子木葡聚糖的单糖的分子量、罗望子木葡聚糖的组成方式，计算出其结构式分别为G₁₂X₉L₁A₂、G₁₂X₉L₂A₂和G₁₂X₉L₃A₂。

由于在底物特异性的实验中就已经发现了重组蛋白质RCOPoXEG12A对木葡聚糖的专一性极强(结果见表1)，确定了重组蛋白质RCOPoXEG12A是木葡聚糖酶。而图11的结果表明，重组蛋白质RCOPoXEG12A降解木葡聚糖释放出含有1个木葡聚糖的构建单位Glc4-basedXGOs、含有2个木葡聚糖的构建单位的Glc8-based XGOs和含有3个木葡聚糖的构建单位的Glc12-based XGOs，表明是以内切方式降解罗望子木葡聚糖，因此可以确定重组蛋白质RCOPoXEG12A是一个内切木葡聚糖酶(EC 3.2.1.151,endo-xyloglucanase，或称为xyloglucan-specific endoβ-D-1,4-glucanase，简称为XEG)(Grishutin SG,Gusakov AV,Markov AV,Ustinov BB,Semenova MV,Sinitsyn AP.2004.Specific xyloglucanases asa new class of polysaccharide-degrading enzymes.Biochimica et BiophysicaActa-General Subjects,1674:268-281)。

3、最适作用pH值

分别配制含0.5％罗望子木葡聚糖的pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5的缓冲液，其中pH 3.0-7.0使用0.1M的柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0-8.0使用0.1M的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH 7.0-9.0使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，pH 8.5-10.0使用0.1M的Glycine-NaOH缓冲液。在37℃下,按前述方法测定不同pH值对纯化的RCOPoXEG12A内切木葡聚糖酶活力的影响。设测定的最高酶活力为100％，其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值折算为相对酶活力；以pH值为x轴，以相对酶活力为y轴作图，结果见图12。结果表明，内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A在pH 4.5-5.5有较高酶活力，最适作用pH值为pH 5.0。

4、最适作用温度

用pH 5.0的0.1M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置0.5％的木葡聚糖溶液，按照前述测定内切木葡聚糖酶活力的方法分别测定纯化的RCOPOXEG12A在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，和70℃下的木葡聚糖酶活力。设最适温度下的酶活力为100％，其它温度下的酶活力折算为相对酶活力。以温度为x轴，相对酶活力为y轴作图，结果见图13。结果表明，内切木葡聚糖酶的RCOPoXEG12A的最适作用温度为60℃。

5、pH稳定性

将纯化的内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A进行pH稳定性检测，分别采用0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5、9.0、9.5、10.0)，参照Eckert和Schneider所描述的方法(Eckert K,Schneider E.2003.A thermoacidophilic endoglucanase(CelB)from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequence similarity toarabinofuranosidases belonging to family 51of glycoside hydrolases.EuropeanJournal of Biochemistry,270:3593-3602)，将酶保存于不同pH值的缓冲液中，于4℃放置24小时后，在pH 5.0、60℃条件下测定不同pH缓冲液中的残余酶活力。

以不做如上处理的保存酶液的酶活力为100％，不同pH值保存液的酶活力折算为相对酶活力。以pH值为x轴，相对酶活力为y轴作图，结果见图14。结果表明，在pH 3.5-7.0之间，RCOPoXEG12A的pH耐受性最好，相对酶活力均在90％以上。

6、温度耐受性

将纯化的内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A进行温度耐受性检测，分别采用不同的保存温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、和60℃)，参照Inoue等所描述的方法(Inoue T,Moriya S,Ohkuma M,Kudo T.2005.Molecular cloning and characterization of acellulase gene from a symbiotic protist of the lower termite,Coptotermesformosanus.Gene,349:67-75)，将酶在上述温度的水浴锅中保温1个小时，之后在最适pH值(pH 5.0)和最适温度(60℃)下测定酶活力。

以不做如上处理的酶液的酶活力为100％，不同温度保温后的残余酶活力折算为相对酶活力。以温度为x轴，相对酶活力为y轴作图，结果见图15。结果表明RCOPoXEG12A在低于45℃的条件下稳定。

7、RCOPoXEG12A的酶反应动力学常数Km、Vmax的测定

分别配置0.25，0.5，0.75，1，2，3,4,5,6,7,8,9,10g/L的木葡聚糖溶液，按照本研究中测定内切木葡聚糖酶活力的反应体系，在RCOPoXEG12A的最适作用条件(pH 5.0、60℃)和相同酶蛋白质浓度(0.009706μg/μL)下，测定RCOPoXEG12A以上述不同浓度木葡聚糖溶液为底物的酶活力。图16A为木葡聚糖浓度对反应速度的影响曲线，可以看出当木葡聚糖浓度从0.25g/L增加到3g/L时，酶的反应速度随底物浓度的增加而增加；当木葡聚糖浓度从3g/L增加到10g/L时，酶的反应速度除了刚开始还能有所增加之外，后来就渐渐趋于恒定。底物浓度和反应速度的双倒数图见图16B，根据双倒数作图得出的方程来计算得到RCOPoXEG12A的Km值为2.79mg/ml，Vmax为275.63U/mg。

8、金属离子、EDTA与变性剂对RCOPoXEG12A酶活性的影响

分别将一定量的一定浓度的金属离子、EDTA与变性剂加入到一定量的pH 5.0的0.5％木葡聚糖底物中，混合均匀，使金属离子、变性剂与EDTA在反应体系中的终浓度为5mM，在RCOPoXEG12A的最适作用条件(pH 5.0、60℃)下，测定RCOPoXEG12A以木葡聚糖为底物的酶活力。以不加任何添加剂的反应体系为对照，测得比酶活力为172.26±0.01U/mg，设定该酶活力为100％，计算加入添加剂金属离子、变性剂与EDTA后折算为RCOPoXEG12A的相对酶活力。结果见表2。发现Cr³⁺、Fe²⁺、Ni²⁺和DTT对RCOPoXEG12A的酶活力有增强作用。

表2.金属离子和试剂对内切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A酶活力的影响

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质：

1)由序列表中序列8所示的氨基酸残基组成的蛋白质；

2)由序列表中序列4自N末端第21-251位氨基酸残基组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

3.一种DNA分子，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列7所示的核苷酸；

2)编码区为序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸；

3)编码区为序列表中序列5所示的核苷酸。

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。

6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。

7.权利要求1所述的蛋白质作为内切木葡聚糖酶的应用。

8.权利要求2或3所述的DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备内切木葡聚糖酶中的应用。

9.一种制备内切木葡聚糖酶的方法，为在甲醇诱导下发酵权利要求6所述的重组菌，即得到内切木葡聚糖酶。

10.权利要求1所述的蛋白质在降解木葡聚糖中的应用；所述降解所需的pH值为4.5-5.5。