CN106544332B

CN106544332B - 一种内切葡聚糖酶及其应用

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Publication number: CN106544332B
Application number: CN201510482889.6A
Authority: CN
Inventors: 王华明; 杨家兴
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: CN106544332A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种来源于粉红粘帚霉的新型内切葡聚糖酶。本发明构建的重组菌株黑曲霉G1‑245能高效重组表达所述新型内切葡聚糖酶，其发酵上清液酶活约为400U/mL，蛋白表达量约为0.99mg/mL。所述新型内切葡聚糖酶的最适pH在5.0左右，最适作用温度为50℃。本发明所述内切葡聚糖酶能大大促进木质纤维素的降解，能使木质纤维素原料的糖化率提高约10%，取得意料不到的技术效果。

Description

一种内切葡聚糖酶及其应用

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶及其应用。

背景技术

纤维素酶是一种复合酶，主要由以下三种酶组成：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶。其中，内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4）是纤维素酶系最主要的成分。内切葡聚糖酶能够高效水解纤维素的内在糖苷键，将直链纤维素内部切断，分解为纤维二糖和纤维寡糖. 纤维素通过3种不同但又互补的酶协同作用，最终降解为葡萄糖。分解为纤维二糖和纤维寡糖，纤维素通过三种不同但又互补的酶协同作用。最终降解为葡萄糖。

内切葡聚糖酶在增加果汁得率、啤酒过滤及原油开采方面起着重要作用，并能增强纤维素质地服装的整体质量如亮度、平滑度等方面。另外，内切葡聚糖酶是木质纤维素底物粘度快速降低的关键酶。

内切葡聚糖酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生内切葡聚糖酶。一般用于工业生产的内切葡聚糖酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。而不同来源的内切葡聚糖酶具有不同的酶学性质，可在不同的工业领域发挥各自的功效。因此，筛选新型的内切葡聚糖酶就具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）的新型内切葡聚糖酶及其应用。本发明将来源于粉红粘帚霉菌的内切葡聚糖酶基因转化到黑曲霉宿主菌中，构建得到高效表达该酶的基因工程菌株，从而为该酶的广泛应用奠定了基础。

本发明一方面提供了一种内切葡聚糖酶，其特征在于：

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO：1的内切葡聚糖酶；

2）在1）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1）中内切葡聚糖酶活性的酶。

上述的内切葡聚糖酶是从粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）中分离的。

本发明另一方面提供了编码上述内切葡聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQID NO: 2。

本发明提供了一种表达载体，其包含上述编码内切葡聚糖酶的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述内切葡聚糖酶基因的表达载体。

上述表达宿主细胞为黑曲霉（Aspergillus niger）。

本发明还涉及上述内切葡聚糖酶在木质纤维素降解中的应用。

本发明构建的重组菌株黑曲霉G1-245能高效重组表达所述新型内切葡聚糖酶，其发酵上清液酶活约为400U/mL，蛋白表达量约为0.99mg/mL。所述新型内切葡聚糖酶的最适pH在5.0左右，最适作用温度为50℃。本发明所述内切葡聚糖酶能大大促进木质纤维素的降解，能使木质纤维素原料的糖化率提高约10%，取得意料不到的技术效果。

附图说明：

图1：重组表达载体pGm-245示意图；

图2：黑曲霉菌株发酵上清液SDS-PAEG电泳图，其中泳道1为宿主菌黑曲霉G1发酵上清液，泳道2为重组菌黑曲霉G1-245发酵上清液；箭头所指50.28KD处的蛋白条带即为本发明所述新型内切葡聚糖酶；

图3：内切葡聚糖酶活性随pH变化曲线；

图4：内切葡聚糖酶活性随温度变化曲线。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。下面结合实施例对本发明的方法做进一步说明。

实施例1：内切葡聚糖酶基因的克隆

以粉红粘帚霉全基因组DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因，其中PCR过程所用到的引物分别为：

正向引物5′- CGTGCTTAAGAACATGCTCTCTCTTGTTGCTCTC -3′

反向引物5′- TGCTCTAGATTAGAGACCAGTCGTGGAGC -3′

其中下划线处分别表示AflⅡ、XbaI两种限制酶切位点。

PCR扩增条件为：98℃ 30S；98℃ 10s，72℃ 42s ，30个循环；72℃ 10min，所用的DNA聚合酶为Phusion DNA聚合酶；凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

用AflⅡ和XbaI两种限制性内切酶分别对PCR产物以及载体pGm进行酶切。运用胶纯化试剂盒对这两种酶切产物进行纯化并用T₄DNA连接酶连接上述两种酶切产物，构建成重组表达载体pGm-245（图1）。将连接后的产物转化大肠杆菌DH₅α，用氨苄青霉素进行筛选。

为确保正确，申请人对若干个转化子进行菌落PCR并进行测序。测序结果显示，上述获得的PCR产物的基因序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经NCBIBlast比对发现，SEQ ID NO:1与来源于Acremonium chrysogenum的内切葡聚糖酶序列相似性最高，为65％。从而说明本发明克隆得到一个新的内切葡聚糖酶等位基因。

使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中提取重组表达载体pGm-245。

实施例2：重组质粒转化宿主菌黑曲霉G1及验证

吸取宿主菌黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板中心（9 cm培养皿），待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200 mL CMA液体培养基中，在30℃、200 rpm的条件培养14~16 h。

用无菌的12层纱布收集菌体，并用solutionA冲洗，在无菌条件下用棉签将其转移到40ml的裂解液中，在30℃、200 rpm条件下裂解两个小时，用显微镜观察原生质体的形成情况。

用无菌的Miracloth滤布过滤上述裂解液；用50ml无菌离心管收集原生质体并用solutionB定容至45ml/管；在4000rpm条件下离心5min，弃去上清；用20ml solutionB再清洗沉淀两次；将沉淀重悬浮于10mL solution B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心，并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量solutionB重悬沉淀，使得原生质体数目在1×10⁷ 个/mL左右。

在冰上向预先冷却的15ml离心管中加入100μL上述原生质体、10μL重组载体pGm-245、12.5μL solutionC，冰浴20min。与此同时将预先配制好的上层试管MMSA融化并置于55℃水浴中。

取出冰浴中的15ml离心管，向其中加入1ml solutionC、2ml solutionB并混匀后作为混合液。

向3个融化的上层MMSA试管中的每一个中加入1ml上述混合液混匀并立即倒于MMSA平板中，将平板在30℃培养箱中培养7-10d直到长出转化子为止。

将长出的转化子菌株接入到二次筛选培养基中培养直至长出黑色菌落。利用基因组提取试剂盒提取菌落的基因组DNA，并用上述PCR反应条件进行PCR扩增。通过胶回收与测序验证，验证结果正确的菌株即为阳性转化子。将其中一个阳性转化子命名为黑曲霉G1-245（Aspergillus niger G1-245）。

solutionA：2.5 mL 1M K₂HPO₄，2.5 mL 1M KH₂PO₄，48.156 g MgSO₄，加入dlH₂O至终体积500 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

solutionB：5 mL 1M Tris (pH 7.5)，2.77 g CaCl₂，109.32 g 山梨醇，加入dlH₂O至终体积500 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

solutionC：250 g PEG 4000，2.77 g CaCl₂，5 mL 1M Tris (pH 7.5)，加入dlH₂O至终体积500 mL，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

裂解液：将0.6 g 裂解酶 (Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma)溶解于40 mL solutionA中，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

MMSA平板：0.59 g乙酰胺(Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma)，0.52 g KCl，1.52 gKH₂PO₄，218.5 g 山梨醇，1 ml微量元素(见下)，20 g琼脂，加入dlH₂O至终体积972.5 mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20%MgSO₄。

MMSA上层琼脂试管：0.59 g乙酰胺(Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma)，0.52 g KCl，1.52 g KH₂PO₄，218.5 g 山梨醇，1 ml微量元素(见下)，10 g低熔点琼脂糖，加入dlH₂O至终体积972.5 mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20% MgSO₄，之后立即分装于无菌试管中，每管10 mL。

微量元素：在250 mL dlH₂O中加入1 g FeSO₄·7H₂O，8.8 g ZnSO₄·₇H₂O，0.4 gCuSO₄·5H₂O，0.15 g MnSO₄·4H₂O，0.1 g Na₂B₄O₇·10H₂O，50 mg (NH₄)₆ Mo₇O₂₄·4H₂O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH₂O定容至1 L，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

CMA平板：20 g葡萄糖，20 g麦芽浸出物，1 g蛋白胨，15 g琼脂，加入dlH₂O至终体积1000 mL，高压蒸气灭菌。

CMA液体培养基：20 g葡萄糖，20 g麦芽浸出物，1 g蛋白胨，加入dlH₂O至终体积1000 mL，高压蒸气灭菌。

二筛培养基：0.59 g乙酰胺(Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma)，0.52 g KCl，1.52 gKH₂PO₄，1 ml微量元素(见下)，20 g琼脂，加入dlH₂O至终体积972.5 mL，高压蒸汽灭菌后加入用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌的25 mL 40%葡萄糖和2.5 mL 20% MgSO₄。

实施例3：阳性转化子菌株的发酵验证

将实施例2获得的黑曲霉G1-245接种于20ml TSB发酵培养基中，30℃，200 rpm的条件下培养5 d；将所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在10000 rpm条件下离心10 min，收集上清液，进行12% SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图2所示，箭头所指50.28KD处的蛋白条带即为重组表达的内切葡聚糖酶，与该酶的理论分子量大小一致。从而进一步表明，本发明构建的工程菌株黑曲霉G1-245能有效表达粉红粘帚霉的内切葡聚糖酶基因。

TSB发酵培养基：12 g NaNO₃，0.5 g KCl，1.5 g KH₂PO₄，2.05 g MgSO₄·7H₂O，3.5g NaH₂PO₄·H₂O，45 g胰蛋白大豆肉汤，70 g柠檬酸钠，1 g吐温80，1 mL 微量元素(见下)，加入dlH₂O至终体积700 mL，高压蒸气灭菌后加入300 mL用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌的40%麦芽糖。

实施例4：内切葡聚糖酶活测定

（一）酶活测定的方法

1. 原理

纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。

2.酶活定义

在50℃，pH为4.80条件下（中性为pH6.0），每分钟从浓度为5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1nmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU），还原糖以葡萄糖等量。

3. 试剂和溶液

3.1 试剂：

柠檬酸 C6H8O7·H2O

柠檬酸三钠 Na3C6H5·2H2O

酒石酸钾钠 KOCO(CHOH)2COONa·4H2O

3，5－二硝基水杨酸C7H4N2O7

氢氧化钠 NaOH

苯酚 C6H5OH

无水亚硫酸钠Na2SO3

二水磷酸氢二钠Na2HPO4•2H2O

3.2 溶液配制：

（1）0.05M酸性缓冲液（pH4.8）

称取二水合柠檬酸三钠9.1874g，一水合柠檬酸3.9374g，溶解，定容至1L，用精密pH计测定其pH值，必要时用3M的盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值为4.80。摇匀，标记为0.05M酸性缓冲液，同时标记pH4.80、配制日期，在4℃下保存。

（2）0.1M中性缓冲液（pH6.0）

分别称取一水磷酸二氢钠12.10g和二水磷酸氢二钠2.189g，将其溶解在1L水中。调解溶液的pH到6.0±0.05，室温保存一个月。

（3）200g/L NaOH溶液:加200g的NaOH,用水溶解定容到1000ml。

（4）10mg/ml CMC溶液：

精密称取CMC（Sigma C－5678）1.0000g缓慢加入到80ml 缓冲液中（酸性6.2.2、中性6.2.3），磁力搅拌至完全溶解（室温下2h左右），用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值至4.80或6.0，再用相应pH的缓冲液定容至100ml。标记为10mg/ml CMC溶液，同时标记pH及配制日期。4℃条件下保存，有效期7天。

（5）10mg/ml标准葡萄糖溶液：

精密称取无水葡萄糖1.0000g置80ml蒸馏水中搅拌溶解，待完全溶解后定容至100ml。标记为10mg/ml的标准葡萄糖溶液，同时标记配制日期，4℃条件下保存。

（6）DNS试剂的配制

称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g，加水500 ml，搅拌5 s，水浴至45℃。然后逐步加入100 ml氢氧化钠溶液（6.2.3），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45℃水浴加热，同时补加水300 ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。

4. 分析步骤

4.1 标准曲线的绘制

试管号	0	1	2	3	4	5	6	7
									缓冲液加入量（ul）	1000	990	985	980	975	970	965	960
葡萄糖标准液加入量（ul）	0	10	15	20	25	30	35	40
									葡萄糖含量（ug）	0	100	150	200	250	300	350	400

取8支试管按下表加入相关试液后再加入1.5mlDNS试剂，充分摇匀，置沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml，用0号试管试液作为对照，在540nm波长下测其它各试管试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以(葡萄糖含量/100)为横坐标绘制标准曲线。

4.2 待测酶液的制备：

液体酶：用缓冲液稀释原酶液，控制反应后吸光度在0.25-0.3之间。

4.3 酶活力测定：

（1）取三支试管各加入0.5ml CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。

（2）在第一、二试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。

（3）反应完后在三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5ml的待测酶液。

（4）取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。

（5）迅速冷却之室温，用水定到5.0ml。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25~0.30之间为宜。若不在此范围，需改变稀释倍数重测。

（6）待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。

5. 酶活力的计算：

酶活力（IU/ml或IU/g）＝（葡萄糖等量值/180/15/0.5）×n

式中：180――葡萄糖从微克换算成微摩尔

15 ――待测液与底物的反应时间

0.5 ――加入反应的待测酶液量

n ―― 酶样的稀释倍数

6. 允许分析结果可以接受标准：

6.1 允许总分析误差范围，两次取样并检测结果相对误差小于10％。

6.2 水平控制检测酶活力与标准活力相对误差小于10％。

6.3 标准曲线至少由5个点组成。

（二）酶活测定结果

依照上述方法分别对宿主菌黑曲霉G1和重组菌黑曲霉G1-245的发酵上清液进行酶活测定，结果显示，宿主菌黑曲霉G1发酵上清液酶活约为88U/mL, 蛋白表达量约为0.38mg/mL，而黑曲霉G1-245发酵上清液酶活约为400U/mL，蛋白表达量约为0.99mg/mL。从而说明本发明构建得到的黑曲霉G1-245能高效重组表达所述新型内切葡聚糖酶。

实施例5：酶学性质分析

1、最适作用pH分析

采用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，对上述黑曲霉G1-245发酵上清液进行稀释，在37℃条件下分别测定其内切葡聚糖酶活性，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明所述新型内切葡聚糖酶的最适pH在5.0左右。

2、最适作用温度分析

分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，pH5.0条件下测定上述黑曲霉G1-245发酵上清液的内切葡聚糖酶活性，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，本发明所述新型内切葡聚糖酶的最适作用温度为50℃。

实施例6：内切葡聚糖酶在木质纤维素糖化中的应用

1、称取2g绝干的木质纤维素底物（所述底物为脱除了半纤维素和木质素的玉米芯渣，其葡萄糖含量为900mg/g），按照固液比为1：10（m/v）添加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH为4.5~5.5；

2、向步骤1所述反应体系中分别添加下述酶制剂，其中：

对照组：添加5.2mg纤维素酶；

实验组1：添加5.2mg纤维素酶和蛋白量为0.52mg的黑曲霉宿主菌发酵酶液；

实验组2：添加5.2mg纤维素酶和蛋白量为0.52mg的黑曲霉工程菌G1-245发酵酶液；

3、将反应体系封闭放置于50℃下震荡酶解，48h后取样用生物传感分析仪测定葡萄糖含量；

4、计算底物的糖化率：糖化率(％)＝酶解后得到的葡萄糖的含量(mg/g 木质纤维素原料)÷底物总葡萄糖含量(mg/g 木质纤维素原料)×100%。

实验结果如下表所示：

	添加酶种类与酶量	葡萄糖产量	糖化率
				对照组	5.2mg纤维素酶	783 mg/g	87%
实验组1	5.2mg纤维素酶+蛋白量为0.52mg的黑曲霉G1发酵酶液	791 mg/g	87.88%
				实验组2	5.2mg纤维素酶+蛋白量为0.52mg的黑曲霉G1-245发酵酶液	870 mg/g	96.67%

从表中的数据可以看出，与对照组单独添加纤维素酶相比，实验组1同时还添加了宿主菌黑曲霉G1的发酵酶液对木质纤维素进行降解，结果显示木质纤维素原料的糖化率并未显著提高；而实验组2通过同时添加本发明所述内切葡聚糖酶（黑曲霉G1-245发酵酶液）对木质纤维素进行降解，能使木质纤维素原料的糖化率提高约10%，从而说明本发明提供的内切葡聚糖酶能大大促进木质纤维素的降解，取得意料不到的技术效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种内切葡聚糖酶及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）

<400> 1

Met Leu Ser Leu Val Ala Leu Ser Leu Ile Ser Ala Ala Ala Ala Gln

1 5 10 15

Lys Ala Gly Thr Asn Thr Ala Glu Thr His Pro Ser Leu Thr Trp Lys

20 25 30

Lys Cys Thr Gly Ala Asn Ser Cys Ser Asn Val Ser Gly Ser Ile Val

35 40 45

Ile Asp Ser Asn Trp Arg Trp Thr Asn Lys Asp Gly Thr Asn Cys Tyr

50 55 60

Asp Gly Asn Lys Trp Thr Ser Ala Cys Ser Ser Asn Glu Asp Cys Ala

65 70 75 80

Gln Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asp Tyr Ser Gly Thr Tyr Gly Ile

85 90 95

Thr Thr Ser Ser Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val Gln Glu His Ala

100 105 110

Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Leu Leu Asn Ser Glu Ser

115 120 125

Lys Tyr Glu Met Phe Asn Leu Ile Gly Asn Glu Leu Ala Phe Asp Val

130 135 140

Asp Leu Ser Thr Val Glu Cys Gly Leu Asn Ser Ala Leu Tyr Phe Val

145 150 155 160

Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Asn Asn Lys Ala

165 170 175

Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Ala Arg Asp

180 185 190

Leu Lys Tyr Ile Gly Gly Leu Ala Asn Tyr Glu Gly Trp Glu Pro Ser

195 200 205

Glu Ser Asp Glu Asn Ala Gly Val Gly Gln Arg Gly Ala Cys Cys Ala

210 215 220

Glu Ile Asp Ile Trp Glu Ser Asn Ser His Ser Phe Ala Leu Thr Pro

225 230 235 240

His Ala Cys Glu Asn Asn Asp Phe His Ile Cys Thr Ala Pro Asn Cys

245 250 255

Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala Gly Asp Cys Asp Ala Asn

260 265 270

Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Pro Asp Phe Tyr Gly

275 280 285

Ala Gly Lys Ile Val Asp Thr Ser Lys Lys Phe Thr Val Val Thr Ser

290 295 300

Phe Thr Thr Ser Gly Leu Lys Gln Phe Phe Val Gln Asp Gly Lys Arg

305 310 315 320

Ile Asp Ile Pro Ala Pro Thr His Ala Gly Leu Pro Asp Ser Ser Glu

325 330 335

Ile Asn Asp Ala Leu Cys Ser Thr Val Phe Asn Val Phe Gly Asp Tyr

340 345 350

Asp Arg Tyr Thr Glu Val Gly Gly Trp Ser Ala Ile Ser Asp Ala Leu

355 360 365

Ser Lys Pro His Val Leu Val Leu Ser Ile Trp Ala Asp Val Ser Ser

370 375 380

Pro Ala Phe Pro Tyr Gly Leu Ile Pro Tyr Ser Phe Ala Asn Ala Val

385 390 395 400

Ser Phe Phe Phe Phe Gln His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Gly

405 410 415

Val Trp Pro Lys Asp Ser Thr Ser Leu Gly Ala Lys Arg Gly Asp Cys

420 425 430

Pro Ala Asn Ser Gly Val Pro Ser Glu Val Ile Ala Asn Tyr Pro Asp

435 440 445

Ser Phe Val Thr Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Thr Gly Ser Thr

450 455 460

Thr Gly Leu

465

<210> 2

<211> 1404

<212> DNA

<213> 粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）

<400> 2

atgctctctc ttgttgctct ctctcttatt tctgcggctg cggcccagaa ggctggtacc 60

aacaccgccg agactcaccc ttctctcaca tggaagaagt gcacaggtgc caactcctgc 120

tccaacgtca gcggctcgat cgtcattgac tccaactggc gctggaccaa caaggacggc 180

accaactgct acgacggcaa caagtggacc agcgcttgca gcagcaacga agactgtgcc 240

cagaactgtg ctctcgaggg tgccgactac tctggaacct acggtatcac cactagcagc 300

gatgccttga ccctcaagtt tgttcaggag cacgcctacg gcaccaacat cggctcccga 360

acatacctcc tgaactctga gtccaaatac gagatgttca acctgattgg caacgagctg 420

gctttcgatg tcgatctctc aaccgttgag tgtggtctca acagtgctct ctactttgtt 480

gctatggagg aagacggtgg catggccagc taccccaaca acaaggctgg tgccaagtac 540

ggtactggtt actgtgattc gcagtgcgcc cgtgatctca agtacatcgg cggtcttgcc 600

aactatgagg gctgggagcc ttctgagagt gatgagaacg ctggtgtcgg acagcgcggt 660

gcctgctgtg ctgagatcga tatctgggag tccaactctc actcctttgc tctgaccccc 720

cacgcttgtg agaacaacga tttccacatc tgcactgctc ccaactgcgg cggtacctac 780

tccgaggacc gcttcgccgg tgactgcgac gccaacggct gtgactacaa cccataccgc 840

atgggcaacc ccgacttcta cggcgccggc aagatcgtcg acacctccaa gaagtttacg 900

gtcgtcacat ccttcaccac cagcggcctc aagcaattct tcgtccagga cggcaagcgc 960

atcgacatcc ccgcccccac ccacgccggc ctccccgaca gcagcgagat caacgacgcc 1020

ctctgcagca ccgtcttcaa cgtcttcggc gactacgacc gctacaccga ggttggcgga 1080

tggtccgcca tctccgacgc tctctccaag ccccatgttc tggtcctgtc catctgggcc 1140

gacgtaagct cccctgcttt cccatatggc cttattccgt atagttttgc taatgcagta 1200

tctttttttt tcttccagca ctacgccaac atgctctggc tcgacggtgt ctggcccaag 1260

gactccacca gcctgggtgc caagcgtggc gactgccctg ccaactccgg tgttccctcc 1320

gaggttatcg ccaactaccc cgactcgttc gtcacctggt ccaacatccg cttcggacct 1380

accggctcca cgactggtct ctaa 1404

Claims

1.一种内切葡聚糖酶，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的内切葡聚糖酶。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的内切葡聚糖酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的内切葡聚糖酶。

5.一种重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌携带有权利要求4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5的重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌为黑曲霉(Aspergillusniger)。

7.权利要求1所述的内切葡聚糖酶在木质纤维素降解中的应用。