CN1240478A - 一种新的内切葡聚糖酶 - Google Patents

Abstract

一种酶制剂,其中包含在温度85℃以上时具有最佳酶活性的一种内切－1,4－β－葡聚糖酶,它是属于革兰氏阳性细菌门的菌株(例如网球菌DSM6262菌株)的内源酶,或者在70℃,pH10时该酶显示的对羧甲基纤维素(CMC测定)的相对活性是在70℃,最适pH时的50%以上;一种DNA构建体,它含有编码内切－1,4－β－葡聚糖酶的一段DNA序列;该酶可以应用于例如纺织工业中,以提高纤维素纤维或织物的品质,或使其具有粗斜纹棉布的石洗外观;或者用于工业清洁程序;或者用于热压聚合物材料;或者用于将生物量转化成糖;或者用于生产乙醇;或者用于预消化例如饲料生产中所用的谷物;或者用于生产速溶咖啡或相似的提取过程。

Description

一种新的内切葡聚糖酶

发明领域

本发明涉及一种在高温时有纤维素分解活性的酶，特别是内切葡聚糖酶；编码有纤维素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供编码这种酶的基因的方法；生产这种酶的方法；一种含有具纤维素分解活性的酶的酶组合物；以及该酶和酶组合物的多种工业应用。

发明背景

纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素分解过程的酶。天然纤维素的水解中，众所周知有三类主要的纤维素酶参与这一过程，即纤维素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21).

特别是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成一组用于上述工业用途的引人注意的水解酶。内切葡聚糖酶催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中1，4-β-D-葡糖苷键的内切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纤维素部分的其他植物原料的β-1，4键的内切水解。其权威命名是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本说明书使用简称内切葡聚糖酶。可以参考T.M.Enveri，“微生物纤维素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶类与生物技术，应用科学出版社，183-224页(1983)；酶学方法(1988)160卷，200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T.编)；Beguin，P.“纤维素降解的分子生物学”，微生物学年度综述(1990)，44卷，219-248页；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纤维素的生物降解”，FEMS微生物学综述13(1994)25-58页；Henrissat，B.“纤维素酶及它们与纤维素的相互作用”，纤维素(1994)，1卷，169-196页。

纤维素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌，也能由植物合成。特别是已鉴定到具有各种特性的内切葡聚糖酶。许多细菌内切葡聚糖酶已被描述(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化学杂志293：781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志139：187-194)。

梭菌亚门是一组多样化的厌氧细菌，包含生理学上非常不同的各属。以前，梭菌属被认为是包括所有内生芽孢厌氧细菌的一个属。但分子分类学手段例如16S rDNA测序的应用揭示这组微生物的不同远超过了属以上分类位置。而且，多个不产芽孢的厌氧菌属被分类到梭菌中，因此梭菌是作为一个更上位的分类组，即一个亚门。这与这些生物的高度不同的生活环境一致。梭菌亚门，例如，包含最适生长温度范围极宽的多个种类。

网球菌属包含系统发生上位于梭菌亚门内的极端嗜热厌氧细菌。网球菌是梭菌亚门中最嗜热的微生物之一。在16S rDNA系统发生树中，网球菌属与其他嗜热菌属例如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)和共养单胞菌属有最近的亲源关系。但是网球菌属形成了一个远的分支，证明网球菌应该被看作一个独立的属。

网球菌B1菌株分离自一个浆质冷却池(即一个人造嗜热环境)的污泥和纸浆样品中。关于该微生物的木聚糖酶的最适温度(大约90℃)已有描述。已针对该木聚糖酶的产量进行了研究，以使发酵最优化。网球菌属的菌种产生内切葡聚糖酶未有报导。梭菌门中已有描述产纤维素酶的一些种中有几个是嗜热的。少数例子中测定过内切葡聚糖酶的热稳定性，研究最多的种之一是热纤维梭菌，已证明它的酶在80℃仍稳定。解纤维热厌氧杆菌(Thermoanaerobactercellulyticus)产生至少两种80℃稳定的内切葡聚糖酶。

可以参考：Hudson等(1991)一株极端嗜热菌的纤维素酶活性，应用微生物学与生物技术35：270-273；Mathrani和Ahring(1991)来自来自人工嗜热环境的严格降解木聚糖的网球菌的分离和鉴定，微生物学文献157：13-17；Adamsen等(1995)，连续培养网球菌B1生产胞外木聚糖酶的优化，应用微生物学与生物技术44：327-332；Maidak等(1994)，核糖体数据库计划，核酸研究22：3485-3487；Honda等(1987)编码耐热β-葡聚糖酶的解纤维热厌氧杆菌基因在E.coli中的克隆和表达，应用微生物学与生物技术25：480-483；Honda等(1988)，从一株嗜热厌氧菌分离一种新纤维素酶基因及其在E.coli中的表达，应用微生物学与生物技术29：264-268。

纤维素分解酶一个重要的工业用途是处理纤维素纺织品或织物，例如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物的成分，用于新织物的生物抛光(衣物整理)，及获得含纤维素织物(特别是粗斜纹棉布)的“石洗”外观，这些处理过程的某些方法已被提及，例如，在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中。纤维素分解酶另一个重要的工业用途是用于处理纸浆，如用于改善排水或回收纸张的除墨。

人们还知道，纤维素酶可以含有或不含有纤维素结合结构域(CBD)。CBD能够增强酶与含纤维素的纤维的结合，并提高酶催化活性部位的功效。

需要提供经济可行的纤维素酶制剂，可以用在那些希望纤维素酶(优选是内切葡聚糖酶)在高温保持活性的应用。

本发明的目的是提供新的酶组合物或重组酶，它们在高温条件下具有显著的纤维素分解酶活性，并且在工业应用中，如纸浆加工，纺织品处理，洗衣过程，提取过程或动物饲养中，其性能有所改进。

发明概述

本发明人已经成功克隆和鉴定了一种来自网球菌属的DNA序列，它编码的酶在极高温度下，很宽的pH范围内具有纤维素分解活性，从而有可能用它制备具有所期望特性的单组分纤维素分解酶组合物。

因此，本发明第一方面涉及具有内切葡聚糖酶活性的酶制剂，它在85℃以上，优选90℃以上，更优选95℃以上，特别是100℃以上具有最佳活性。

本发明第二方面涉及一种酶制剂，相对于在70℃和最适pH时的活性，它对羧甲基纤维素(CMC)的内切葡聚糖酶活性在70℃和pH 10时高于50％，优选高于55％，更优选高于60％，更优选高于65％，特别是高于70％。

本发明第三方面涉及一种DNA构建体，其中含有的DNA序列编码有内切葡聚糖酶活性的酶，其最佳活性在85℃以上，优选90℃以上，更优选100℃以上，该DNA序列包含

a)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或

b)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列的相似物，它

i)与可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应的DNA序列同源，优选至少60％同源，或

ii)和可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应的DNA序列可杂交的相同寡核苷酸探针能够杂交，或者

iii)编码一种多肽，该多肽与包含对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列的DNA序列编码的多肽同源，优选至少60％同源，或者

iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的内切葡聚糖酶的抗体具有免疫反应性，所述内切葡聚糖酶是由对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列编码的。

发明的第四、五、六方面是提供带有本发明克隆DNA序列的表达载体；含有克隆DNA序列或表达载体的细胞以及生产显示纤维素分解活性的酶的方法，该方法包括在允许酶产生的条件下培养细胞，和从培养物中回收酶。

本发明另一方面提供一种有纤维素分解活性的分离酶，其特征在于(i)不含同源杂质，并且(ii)该酶由上述方法产生。

本发明进一步涉及有纤维素分解活性的分离酶，优选是一种内切葡聚糖酶，其由本发明的DNA构建体编码。

另外，本发明涉及这种酶或酶制剂在工业应用中的用途，如在纺织业中用于改善纤维素纤维或织物的特性或者提供粗斜纹棉布的石洗外观；或者用于工业清洁程序；或者用在热压聚合物材料中；或者用于生物量转化成糖的过程中；或者用于生产乙醇；或者用于预消化饲料生产中所用的谷物；或者用于生产速溶咖啡或类似的提取过程。

本发明还涉及含有纤维素酶编码DNA序列之大肠杆菌菌株DSM11201的一种分离的基本纯的生物学培养物，或所述大肠杆菌菌株的任何突变体。发明详述

本文中，术语“20种天然存在的氨基酸残基”表示常见于蛋白质中的20种氨基酸残基，惯称丙氨酸(Ala或A)，缬氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。

本发明的酶和酶制剂在宽范围pH都有活性，优选在大约pH4-11有活性，更优选约在大约5.5--10之间有活性。

在一个优选的实施方案中，本发明的酶或酶制剂来自革兰氏阳性细菌门的一个菌株或者是其内源酶，更优选梭菌亚门的菌株，还要更优选属于网球菌属的菌株，特别是网球菌DSM6262。

本文中，表达术语“克隆DNA序列”，无论是部分还是完整的，均是指用基因工程中的标准克隆步骤，将一段DNA从它的天然位置重新放置于不同的位点，在该处它将被复制，由此克隆的DNA序列。克隆过程包括切除和分离目标DNA片段，将该段DNA插入载体分子以及将重组载体引入细胞，在细胞内复制出多拷贝或多克隆的该DNA片段。

本发明的“克隆DNA序列”也可称为“DNA构建体”或“分离DNA序列”。

DNA序列可以是基因组、cDNA或合成来源的，或者是它们的任意组合。

克隆到大肠杆菌DSM11201中质粒pSJ1678上的DNA序列的纤维素酶编码部分和/或本发明的相似DNA序列可以从能产生有纤维素酶(优选内切葡聚糖酶)活性的酶的网球菌属菌株克隆得到，优选网球菌DSM6262菌株，或者可从以下进一步描述的另一种或相关微生物中克隆得到。

或者，相似序列可以依据从大肠杆菌DSM11201中质粒得到的DNA序列构建而成，例如是其亚序列，和/或通过导入核苷酸取代而获得，这种取代不会使该DNA序列编码的纤维素酶氨基酸序列不同，但与用于生产该酶的宿主微生物的密码子用法一致，或者这种核苷酸取代可以使得产生不同氨基酸序列(即本发明纤维素酶的变体)。

进行核苷酸取代时，优选氨基酸的变化影响较小，即是不会显著影响蛋白质折叠或酶活性的保守性氨基酸取代，小片段删除，通常是1到30个氨基酸长；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，不超过大约20-25个残基的小连接肽，或者有助于纯化的小段延伸，如一段多组氨酸，抗原决定簇或结合结构域。

保守性氨基酸取代的例子有碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)各组内的取代。核苷酸取代的综述可见如Ford等，(1991)，蛋白质表达和纯化，2，95-107。

对于本领域技术人员，很显然可以在分子功能的关键区域之外进行这些取代，仍能得到活性多肽。对本发明克隆DNA序列编码的多肽的活性所必需，因此最好不做取代的氨基酸，可以用本领域的已知技术，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变确定(参见例如Cunningham和Wells，(1989)，科学244：1081-1085)。后一种技术中将突变引入分子内的每一个残基处，检测产生的突变分子的生物学(即纤维素分解)活性，以便鉴定出该分子活性所必需的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过分析晶体结构确定，如通过核磁共振、结晶学或光亲和标记等技术确定(参见例如de Vos等，(1992)，科学255：306-312；Smith等，(1992)，分子生物学杂志224：899-904；Wlodaver等，(1992)，FEBS快报309：59-64)。

本发明DNA构建体的DNA序列所编码的内切葡聚糖酶可以包含一个作为编码酶的内在部分的纤维素结合结构域(CBD)，或者可以向内切葡聚糖酶引入其他来源的CBD，形成酶杂合体。本文中，术语“纤维素结合结构域”应按“不溶性碳水化合物的酶解”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS研讨会系列，No.618，1996中PeterTomme等“纤维素结合结构域：分类和特性”定义的理解。该定义将120多种纤维素结合结构域分成10族(I-X)，并表明CBD在多种酶如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶中都有发现。CBD还被发现存在于藻类，如红藻Porphyrapurpurea中，这是一种非水解性的多糖结合蛋白质，参见Tomme等，(出处同前)。但大多数CBD来自纤维素酶、木聚糖酶，CBD位于蛋白质的N和C末端或者在内部。酶杂合体是本领域已知的，参见如WO90/00609和WO95/16782，可以通过将DNA构建体转化至宿主细胞中制备，其中所述构建体含有至少一个编码纤维素结合结构域的DNA片段，带有或不带有接头而连接到编码内切葡聚糖酶的DNA序列上，并培养宿主细胞以表达融合基因。酶杂合体可以用下列通式描述：

CBD-MR-X

其中CBD是至少对应于纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(接头)，可以是一个键，或者是一个短连接基团，优选约2到100个碳原子，更优选2到40个碳原子；或者优选是约2到100个氨基酸，更优选2到40个氨基酸；X是本发明DNA序列所编码的多肽的N-末端或C-末端区域。

本发明的DNA序列可以用如Sambrook等((1989)，分子克隆：实验指南Cold Spring Harbor Lab.Cold Spring Harbor，NY)描述的标准方法，从大肠杆菌DSM11201菌株克隆得到。

本发明的DNA序列也可以用包含下述的任何一般方法克隆得到，

—在合适的载体中克隆来自预期产生所需内切葡聚糖酶的任何微生物(例如网球菌)的DNA文库，

—用所述载体转化合适的宿主细胞，

—在合适的条件下培养宿主细胞，以表达由DNA文库中的克隆编码的任何目标酶，

—通过测定这些克隆产生的酶的任何纤维素分解活性，筛选阳性克隆，以及

—从这些克隆中分离编码该酶的DNA。

或者，可以依照众所周知的步骤，通过利用依据可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列制备的合成寡核苷酸探针。方便地从合适的来源(例如以下提到的微生物)克隆得到编码本发明纤维素酶的DNA。

DNA序列的同源性

上述DNA序列的同源性定义为两个序列间的相同程度，表明第一个序列来自第二个的派生关系。同源性可以利用本领域已知的计算机程序，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物学杂志48：443-453)合适地确定。利用如下设置的GAP程序进行DNA序列比较：GAP产生罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3，该(部分)DNA序列显示与对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列有至少60％相同，优选至少75％，更优选至少80％，，更优选至少90％，更优选至少95％，还要更优选至少97％相同。

杂交

上面所提到的杂交是指相似(部分)DNA序列与对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的寡核苷酸探针，在如下所述的某些特定条件下能发生杂交。

用于确定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列间杂交情况的适宜条件包括：将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤膜预先在5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中浸泡10分钟，在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)，5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml超声变性的鲑精DNA(Sambrook等，1989)中对膜进行预杂交，然后在含有随机引发的(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)分析生物化学132：6-13)、³²P-dCTP标记(比活＞1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中于大约45℃杂交12小时。膜在2×SSC，0.5％SDS中洗涤30分钟两次，优选洗涤温度不超过55℃，更优选不超过60℃，更优选不超过65℃，还要更优选不超过70℃，特别是不超过75℃。

用X-光胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。

氨基酸序列的同源性

上面提到的多肽同源性定义为两个序列间的相同程度，表明第一个序列来自第二个的派生关系。同源性可以利用本领域已知的计算机程序，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物学杂志48：443-453)合适地确定。利用如下设置的GAP程序进行多肽序列比较：GAP产生罚分为3.0，GAP延伸罚分为0.1，由相似(部分)DNA序列编码的多肽显示与可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分编码的多肽，相同程度为至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，特别是至少97％。

免疫交叉反应性

用于测定免疫交叉反应性的抗体可以利用提纯的纤维素分解酶制备。更具体地说，抗本发明内切葡聚糖酶的抗血清可以通过免疫兔子(或其他啮齿类动物)得到，步骤参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南，Blackwell科学出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(尤其是27-31页)。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐析((NH₄)₂SO₄)，然后透析，并在如DEAE-Sephadex上进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。

菌种

以下使用的分类系统与Maidak等，1996(核糖体数据库计划，核酸研究24：82-85)一致。

本发明中所使用的与某个特定来源联系的术语“得自”或“可得自”，表示该酶由或可以由这个来源菌株或者插入了来自这个特定来源的基因的细胞产生。

目前估计本发明的纤维素酶可以得自细菌，特别是革兰氏阳性细菌，优选梭菌亚门，特别是网球菌属的菌株。

在一个优选实施方案中，本发明的纤维素酶得自网球菌DSM6262菌株。目前期望编码与本发明的酶同源的酶的DNA序列可以得自其他细菌菌株，特别是网球菌属的菌株。

能够从中得到本发明纤维素酶的网球菌菌株的分离培养物可以从德意志微生物保藏中心，以DSM6262公开得到。

另外，含有编码本发明内切葡聚糖酶的DNA序列的质粒pSJ1678已经转化到一个大肠杆菌菌株中，发明人依照布达佩斯条约国际承认用于专利程序的微生物保藏规定，于1996年10月11日将该菌株保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，FederalRepublic of Germany，保藏号DSM11201。

重组表达载体

含有编码本发明所述酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体的复制过程，例如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，它会部分或全部整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的染色体一起复制。

载体优选是一种表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操纵地连接了DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的成分。术语“可操纵地连接”表明各片段的排列方式使其功能与它们的预期用途一致，例如，使转录在启动子内起始并持续在编码酶的DNA序列进行。

启动子可以是在所选宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。

适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因的启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子，或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子，或者噬菌体λP_R或P_L启动子，或大肠杆菌lac，trp或tac启动子。

在必要时，编码本发明酶的DNA序列也可以可操纵地连接合适的终止子。

本发明的重组载体还可以再含有使载体能在所选宿主细胞中复制的DNA序列。

载体也可以含有一个选择性标记，例如，一个其产物可补偿宿主细胞缺陷的基因，或者编码抗例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素的基因，或者重金属或除草剂的抗性基因。

为了使本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供一个分泌信号序列(也称为前导序列，前体序列或前序列)。分泌信号序列以正确阅读框加接在编码酶的DNA序列中。分泌信号序列通常置于在编码酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情况下就与该酶相关联的或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。

将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列分别连接，或者通过合适的PCR扩增方案组合这些序列，并将它们插入含有复制或整合必需信息的合适载体中的步骤，是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等，出处同前)。

宿主细胞

导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以是该选定宿主细胞的同源或异源序列。如果是宿主细胞的同源序列，即宿主细胞天然产生的，一般将它可操纵连接另外的启动子序列，或者，如果可行，连接另外的分泌信号序列和/或终止子序列，而不是其天然的状态。术语“同源”意指包括编码所选宿主细胞内源的酶的DNA序列。术语“异源”意指包括天然情况下宿主细胞不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以是来源于另一种微生物，或者是合成序列。

本发明DNA构建体或者重组载体导入的宿主细胞可以是能够表达所述酶的任何细胞，包括细菌，酵母，真菌和高等真核细胞。优选的宿主细胞包括原核、古细菌和丝状真菌细胞。

经过培养能产生本发明酶的真菌宿主细胞的例子是丝状真菌的细胞，如属于曲霉属、镰孢属和木霉属中任何一个的菌株，更特指任何属于黑曲霉，米曲霉，禾谷镰孢和Trichoderma reesei等种的菌株。

经过培养能产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属的菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属的菌株，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。细菌的转化可以通过原生质体转化、电穿孔、接合或用感受态细胞依照已知方式进行(参见Sambrook等，出处同前)。

当在细菌如大肠杆菌中进行表达时，酶可以保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或者可以被细菌分泌序列引导到周质空间。前一种情况下，裂解细胞，收集颗粒，变性，随后稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，可以在例如超声破碎或渗透压休克破碎细胞以释放周质空间成分后，再回收酶，从而由周质空间收集酶。

当在如芽孢杆菌或链霉菌菌株等革兰氏阳性细菌中表达酶时，酶可以保留在细胞质中，或者被细菌分泌序列引导到胞外培养基中。后一种情况下，酶可以按以下描述由培养基回收。

生产纤维素分解酶的方法

本发明提供一种生产本发明的分离酶的方法，其中，在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。

如本文中的定义，一种分离的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如经SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，最最优选约95％纯。

术语“分离多肽”也可称为“纯化多肽”。

当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。

由此，有可能制备很纯或单组分的纤维素分解组合物，其特征在于不含同源杂质。

本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如本发明酶之外的多肽)。

本发明的同源宿主细胞可以是网球菌菌株。

用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适于所选宿主细胞生长的任何常规培养基。表达的纤维素分解酶可以方便地分泌到培养基中，并可以通过熟知的程序从中回收，包括通过离心或过滤将细胞从培养基中分离出来，用盐(例如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，随后进行如离子交换层析、亲和层析等层析技术。

酶组合物

更进一步，本发明涉及含有上述是纤维素分解活性的酶的酶组合物。

本发明的酶组合物，除包含本发明的纤维素酶之外，还可以含有一或多种其它酶类，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纤维素酶或内切葡聚糖酶组分，壳多糖酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶、蛋白酶或淀粉酶。

酶组合物可以依照本领域已知方法制备，可以是液态或干性组合物形式。例如，酶组合物可以是颗粒或微粒形式。包含在组合物中的酶可以用本领域已知方法稳定化。

耐热纤维素酶在许多工业和应用领域都有潜在的用途。以下给出了本发明酶组合物的优选用途的例子。本发明酶组合物的剂量和它的其它使用条件可以依据本领域已知方法测定。

依照本发明的酶组合物可以用于下列目的中的至少一种。

用途

在纺织工业中，纤维素酶被用来处理棉花和其他纤维素材料，以达到对纤维的表面处理，从而使得到的纺织品性质改变，如减少起球倾向，去除绒毛，软化织物，改善手感或视觉效果。特别是纤维素酶被用于给粗斜纹棉布带来石洗外观。高温使用纤维素酶就可能使得粗斜纹棉布和非粗斜纹棉布的棉/纤维素织物产生新的外观。耐热纤维素酶可以用于在以前不可能进行的织物高温处理中，这样有可能在80℃以上或在液体比率极低的蒸气条件下进行纤维素酶洗涤，因此有能力提供新外观。

在工业清洗过程中，当要去除的杂物是纤维素物质时，使用耐热纤维素酶能够使清洗过程更容易。实例是在食品/饲料工业中清洗超滤膜、管道等。

将热稳定性纤维素酶与纤维素填充剂一起添加至热压塑料和聚合物材料中，将使这些材料在自然界有更高的可降解性。

木质纤维素材料构成了农业和林业废物、以及在城市垃圾中占主要的废纸的一个大的组成部分。这种废物通常是被烧掉，从能量角度来看，这是对资源的极大浪费。已经进行了大量工作，目的在于发展一种高效、经济的方法，可以用于将这些生物材料转化为糖，而糖可用来发酵生产诸如乙醇，以作为燃料。已提出的用于将木质纤维素转化成糖的处理方法包括使用纤维素酶，但是所需的剂量极高，使得出于经济考虑，在大规模工业生产中应用是不现实的。使用具有液化特性的耐热纤维素酶令这种生物转化过程更现实。高温下的处理能打开许多植物材料的细胞壁结构，使纤维素更易受到酶的攻击。

由各种谷物生产乙醇的工业化生产中，传统的加工过程包括在大约80-100℃用α-淀粉酶进行液化。在这个步骤加入纤维素酶将提高可发酵糖的产量。纤维素的预液化也使得在随后的程序中使用常规纤维素酶变得现实，因为此时水解速率比未预液化时要更高。

饲料生产中谷物、黑麦、大麦、玉米等的预消化是耐热纤维素酶的另一个潜在用途，这样是为了提高饲料在动物体内的消化性。

生产速溶咖啡时，咖啡的提取是在85-150℃下，在一套渗透柱中进行的。水由最浓缩的室逆流到刚装入的有新鲜咖啡的室。含有新鲜咖啡的室的操作温度接近100℃。在这里加入嗜热纤维素酶将提高柱性能，因为细胞壁被打开后可溶物质更容易释放。

在从天然植物资源中提取油或香料/调味化合物的其它传统高温方法中加入纤维素酶象咖啡提取一样，能提高生产能力或产量。实例是提取棕榈油或棕榈果油，这就是一个液态高温过程。

材料和方法

保藏微生物：

网球菌DSM6262，其含有本发明纤维素酶编码DNA序列。

大肠杆菌DSM11201，其含有在克隆载体pSJ1678中包含本发明纤维素酶编码DNA序列的质粒。

其它菌株：

大肠杆菌菌株：制备用于电穿孔的大肠杆菌SJ2细胞(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C(1990)，编码来源于短芽孢杆菌的一种外切酶：α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB基因的克隆，细菌学杂志，172，4315-4321)，交使用BIO-RAD的Gene Pulser^TM基因脉冲电穿孔仪，依照厂商说明，进行电穿孔转化。

质粒：

pSJ1678如本文中引作参考文献的国际申请公开WO94/19454所公开的。

普通分子生物学方法：

DNA操作和转化用标准的分子生物学方法进行(Sambrook，1989，分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor lab.Cold Spring HarborNY；Ausubel，F.M.等(编)“现代分子生物学规程”，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Wiley和Sons，1990)。

DNA操作使用的酶依照厂商的说明使用。

编码本发明纤维素分解酶的DNA序列的分离：

编码本发明内切葡聚糖酶的DNA序列，可以从保藏微生物大肠杆菌DSM11201，通过用本领域已知方法(Sambrook，1989，分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor NY)提取质粒DNA获得。

内切葡聚糖酶基因的克隆

基因组DNA制备：

网球菌DSM6262菌株在1L玻璃瓶中，用下述培养基，在70℃增殖两天。

DSM6262菌株的严格厌氧培养基组成：

1.0g NH₄Cl，0.1g NaCl，0.1g MgCl₂，0.05g CaCl₂，0.4gK₂HPO₄·3H₂O，0.75g酵母提取物，4.0g山毛榉木聚糖(Lenzing)，0.5mg Resazurin，1.0ml微量金属元素^#，1.0ml维生素溶液，3.0gNaHCO₃，加H₂O至1升。

^#微量金属溶液：

2.0g FeCl₂.4H₂O，0.05g ZnCl₂，0.05g MnCl₂，0.05g AlCl₃，0.05g NiCl₂，0.1g Na₂SeO₃·5H₂O，0.05g H₃BO₃，0.03g CuCl₂，0.05g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.05g CoCl₂·6H₂O，0.5g EDTA，1.0ml浓盐酸，加H₂O至1升。

在N₂/CO₂(4∶1)气体中，每瓶分装10ml。用不透氧气的橡胶塞塞住，140℃高压灭菌20分钟。在无菌厌氧注射接种之前，现加入0.1ml经过滤除菌的厌氧DSM维生素溶液#141和0.2ml 2.5g/lNa₂S·9H₂O高压灭菌储液。

收获细胞，用Pitcher等所述方法分离基因组DNA(Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.(1989)。用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA。应用微生物学快报8：151-156)。

基因组文库的构建：

用限制酶Sau3A部分消化基因组DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级分离。电泳分离出2到7kb大小的片段，将它们转到DEAE-纤维素膜(Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.(1981)，从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶回收DNA片段的一种可靠方法，分析生物化学112，295-298)上。

将分离的DNA片段连接到经BamHI消化的pSJ1678质粒DNA上，用连接反应混合物转化大肠杆菌SJ2。

将细胞铺在含有0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，France)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，达到500-1000菌落形成单位/板，37℃培养过夜。

通过活性鉴定阳性克隆

培养后，将克隆影印到一套LB+CAM琼脂平板上，继续在37℃培养约20小时。向影印平板倾注于适当缓冲液pH7中的含有0.1％CMC，1％HSB琼脂糖的顶层，65℃培养约20小时。用0.1％刚果红(CongoRed)(SIGMA，USA)水溶液染色，然后在2M NaCl中洗，鉴定出内切葡聚糖酶阳性克隆。浅黄色环出现的位置即为内切葡聚糖酶阳性克隆。

来自酶阳性克隆的细胞在琼脂板上扩展以形成单菌落，从每一个鉴定到的产内切葡聚糖酶克隆都挑选出一个产酶单菌落。

阳性克隆的鉴定

从划线平板得到内切葡聚糖酶阳性克隆的单菌落，提取质粒。表现型通过再转化大肠杆菌SJ2确定，质粒通过限制酶切鉴定。

培养基

TY和LB琼脂(如Ausubel F.M.等，(编辑)“现代分子生物学手册”John Wiley和Sons，1995)。

杂交条件(用于评价本发明DNA构建体的特性ii))：

确定核酸探针和同源DNA或RNA序列间杂交情况的合适检测条件包括：将含有要杂交的DNA片段或RNA的滤膜预先在5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中浸泡10分钟，滤膜在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)，5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)，0.55％SDS和超声变性的100μg/ml鲑精DNA(Sambrook等，1989)中预杂交，然后在含有随机引发(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)Anal.Biochem.132：6-13)的³²P-dCTP标记(比活＞1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中于约45℃杂交12小时。然后将膜在2×SSC，0.5％SDS中洗涤30分钟两次，洗涤温度优选不超过55℃，更优选不超过60℃，更优选不超过65℃，还要更优选不超过70℃，特别是不超过75℃。

用于杂交的核苷酸探针是可得自大肠杆菌DSM11201中质粒的DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分。

免疫交叉反应性

用于检测免疫交叉反应性的抗体可以利用纯化的内切葡聚糖酶制备。更具体地说，抗本发明内切葡聚糖酶的抗血清可以通过免疫兔子(或其他啮齿类动物)得到，步骤参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南，Blackwell科学出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(尤其是27-31页)。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐析((NH₄)₂SO₄)，然后透析和如在DEAE-Sephadex进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社1967，655-706页)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。

以下非限制性实施例用于阐明本发明。

实施例1

来源于网球菌DSM6262的内切葡聚糖酶的克隆和表达

如“材料和方法”的描述，在大肠杆菌中构建并筛选了来源于网球菌DSM6262的一个文库。分离到的一个阳性转化子是DSM11201，它带有质粒pSJ1678，其中含有编码本发明纤维素分解酶的DNA序列。

对分离到的大肠杆菌克隆同时在含有0.1％AZCL β-葡聚糖，AZCL木糖葡聚糖(xyloglucan)，AZCL HE纤维素，AZCL木聚糖，AZCLcurdlan或AZCL半乳甘露聚糖的LB+CAM琼脂平板上进行测试。平板在37℃培养约48小时，然后在65℃培养。酶活性通过菌落周围的兰色环鉴定。发现该克隆在AZCL β-葡聚糖，AZCL木糖葡聚糖和AZCL HE纤维素上为阳性。由大肠杆菌克隆DSM11201制备酶溶液

将DSM11201接种到含有200ml Super肉汤培养基的摇瓶中作为预培养物，培养基中含有如下成分(每升)：胰蛋白胨32g，酵母提取物20g，NaCl 5g，CMC 5g，用1M NaOH调至pH7.2-7.3。121℃高压灭菌20分钟。灭菌后加入氯霉素至终浓度6mg/ml。

摇瓶在旋转摇床上以280rpm，37℃培养16小时。将1ml培养物接种到100个含有200ml Super肉汤培养基的摇瓶中，以280rpm，在37℃培养16到18小时。3000rpm离心20升大肠杆菌培养物，将菌体沉淀重新悬浮于800ml 50mM Tris-马来酸(maleat)缓冲液(pH7.0)中，细胞用Rannie High Pressure Laboratory匀浆器在800巴破碎。10000rpm离心1小时，收集澄清的上清液。

实施例2

从网球菌DSM6262克隆的内切葡聚糖酶的纯化和鉴定

将600ml大肠杆菌细胞提取物首先在70℃热处理5分钟，然后在5000rpm离心20分钟。上清液经Whatman滤纸D过滤，得到总量200ml溶液，活性为11CMCU/ml(CMCU的确定，见下文)。

溶液流过用0.05M、pH5.0的乙酸钠缓冲液平衡过的S-Sepharose柱。结合的内切葡聚糖酶用0.5M氯化钠洗脱，得到溶液总量300ml，其活性为2CMCU/ml。将溶液调至pH9.0，用20mM、pH9.0的乙醇胺缓冲液在膜截留分子量为10kD的Amicon超滤室中平衡。然后，当传导率约为250μS/cm时，将溶液装入经同样缓冲液平衡的Q-Sepharose柱中。内切葡聚糖酶会发生结合，并可以用NaCl梯度洗脱出来。由于第一次实验的传导率过高，我们只得到2ml活性为65CMCU/ml的溶液。

最后，将溶液浓缩，并上样到0.1M乙酸钠(pH6.0)中的分级柱Superdex200内，纯内切葡聚糖酶洗脱在22ml的体积内，将其用膜截留分子量为6kD的Amicon超滤室浓缩。得到1ml活性为40CMCU/ml的溶液。该样品在SDS-PAGE中显示为单一条带，分子量30kD，pI为6.5。对蛋白质进行电印迹，用Applied Biosystems model 473A测序仪测N-端序列。蛋白质测序仪依照厂商的使用说明操作，得到如下序列：

QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY-

纯内切葡聚糖酶对对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷(Sigma)，CMC，HE纤维素(Megazyme)和酸溶胀的纤维素有活性。

一个CMCU单位定义为在标准条件下，每分钟释放相当于1mmol葡萄糖的酶用量。标准条件：在70℃进行CMC检测

将酶在0.1M巴比妥酸钠缓冲液pH8.5中的0.75％CMC(7L，来自Hercules)溶液中保温20分钟。保温后，使用PHBAH(SIGMA H-988253H7704(对羟基苯甲酸酰肼))测定还原性末端基团的增加量，并利用葡萄糖标准，计算每分钟形成的相当于葡萄糖的末端基团(Lever，M.(1972)用于比色测定碳水化合物的新反应，分析生物化学，47卷，273-279页)。

内切葡聚糖酶在70℃和pH8.5下活性为137CMCU/mg og蛋白质(50CMCU/A280)。内切葡聚糖酶的温度-活性关系

在pH8.5的CMCU检测中，将内切葡聚糖酶在不同温度保温，保温20分钟后如上所述检测活性。超过90℃的保温没有做，在该温度得到的还原性糖量最高，用于计算低于该温度时的相对活性。

温度    相对活性

90℃    100％

80℃    76％

70℃    40％

60℃    26％

50℃    14％

40℃    7％pH-活性曲线

在70℃的CMCU检测中，将内切葡聚糖酶用pH 4.5到11的不同缓冲液保温，保温20分钟后测定活性。

缓冲液：pH4.5、5.0和5.5：0.1M乙酸钠

        pH6.0：0.1M Na-MES

        pH6.5、7.0和7.5：0.1M Na-MOPS

        pH8.0和8.5：0.1M EPPS

        pH9.0、9.5、10.0、10.5和11.0：0.1M甘氨酸钠

测得pH5.5到11的相对活性高于50％。对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷检测

一个PNPU单位定义为在标准条件下，每分钟从对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷释放1mmol对硝基苯酚所需的酶量。

方法：稳态动力学，直接在405nm检测黄色产物对硝基苯酚。活性用吸光度的增加衡量，曲线的线性部分用于确定斜度(AU/sec)。活性的计算使用对硝基苯酚在磷酸盐缓冲液pH7.5中的吸光度：在1cm比色杯中的吸光度，在405nm处1mM为0.018(在420nm处1mM为0.014)。

检测条件：

475ml于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的10mM对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷

25ml酶溶液

步骤：

测量用恒温控制在70℃的HP 8452A Diode Array分光光度计，在1cm厚的0.75ml比色杯中进行。

测量300秒内在405nm处的吸光度，每20秒测一次。

内切葡聚糖酶在70℃、pH7.5显示170PNPU/A280。酸溶胀的纤维素

PASC储液用冰冷丙酮和磷酸如下制备。将5克纤维素(Avice^)用水弄湿，加入150ml冰冷的85％正磷酸。混合溶液置冰浴，缓慢搅拌1小时。然后边搅拌边加入100ml冰冷丙酮。将浆液转移到带有3号耐热烧结板的Buchner滤器中，用100ml冰冷丙酮洗3次，每次洗后尽量吸干。最后，滤饼用500ml水洗两次，每次洗后尽量吸干。将PASC混入去离子水中至总量300ml，混合均匀(用Ultra Turrax匀浆仪)，并储存在冰箱中(可保存不超过1个月)。

用缓冲液进行底物平衡：将20克磷酸溶胀的纤维素PASC储液在5000rpm离心20分钟，弃上清液，沉淀重悬于30ml缓冲液中，在5000rpm离心20分钟，弃上清液，沉淀重悬于总量60g相当于底物浓度为5g纤维素/升的缓冲液中。

pH8.5检测用的缓冲液：0.1M巴比妥。

步骤：

1.稀释酶样品

酶液用与底物相同的缓冲液稀释。

2.酶反应

缓冲液中的底物在80℃预加热5分钟(2ml)。

然后加入0.5ml酶液(稀释好的)，混合5秒。在酶液之前加入终止剂得到酶空白对照。80℃保温20分钟。加入0.5ml 2％NaOH溶液终止反应，混合5秒。

将样品在5000rpm离心20分钟，将1ml上清液与0.5ml PHBAH试剂，煮沸10分钟。试管在冰水浴中冷却。

3.还原性末端基团的检测

用分光光度计测量410nm的吸光度。绘制标准葡萄糖曲线，其中使用相同缓冲液中的葡萄糖，浓度为5、10、15和25mg/l，并在煮沸前加入PHBAH试剂。释放的还原性葡萄糖当量用该标准曲线计算。

Kcat和Km的测定

酸溶胀纤维素的催化活性用上述检测方法在80℃和pH8.5的标准条件下对不同底物浓度进行测定。动力学常数用Michaelis-Menten动力学计算机程序Grafit计算。依据内切葡聚糖酶的氨基酸组成，确定出其摩尔消光系数为85630。因此得到如下数据：

Kcat＝77/秒

Km＝25克酸溶胀纤维素/升

实施例3

耐热内切葡聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达

如下所述的枯草芽孢杆菌中含有编码克隆自网球菌DSM6262的耐热内切葡聚糖酶的表达质粒，由发明人依照布达佩斯条约国际承认用于专利程序的微生物保藏规定，于1997年12月16日将该菌株保藏在Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，FederalRepublic of Germany，保藏号DSM11903。材料：

菌株

大肠杆菌SJ2(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)编码来源于短芽孢杆菌的一种外切酶：α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB基因的克隆，细菌学杂志，172，4315-4321)，制备电感受态细胞，使用厂商推荐的BIO-RADGenePulser^TM进行转化。

枯草芽孢杆菌A164。这个菌珠是枯草芽孢杆菌ATCC6051a的衍生物，它不能产生芽孢，并且apr和npr基因已被破坏。破坏方法基本如所述进行(A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌，美国微生物学会，618页)。制备感受态细胞，如Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.((1975)在枯草芽孢杆菌溶源菌株中的转化和转染：在感受态细胞中选择性诱导原噬菌体的证据。细菌学杂志，121：296-304)描述进行转化。

质粒

pUB110：质粒描述于McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.Sueoka，N.，pUB110的核苷酸序列：与复制和它的调控相关的一些突出特性，质粒15(2)，93-103(1986)和(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.Sueoka，N.，更正，修改的pUB110核苷酸序列和功能图谱，质粒17(1)，83-85(1987)。

pMUTIN-4-MCS：该质粒可从Laboratories de GenetiqueMicrobienne，Institut National de la RechercheAgronomique，78352 Jouy en Josas-CEDEX，France获得。

培养基

LB琼脂(如Ausubel，F.M.等(编辑)“现代分子生物学手册”，JohnWileySons，1995描述)。

LBPG是补充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾(pH7.0)的LB琼脂。

AZCL-HE-纤维素加入LBPG琼脂至1％。AZCL-HE-纤维素来自Megazyme，Australia。

BPX培养基在以WO91/09129公开的国际申请中有描述。

方法：

质粒的构建和克隆的建立基本如下进行：

pMUTIN4MCS是一个大肠杆菌质粒，它带有一个杂合启动子SPAC(Yansura等(1984)，用E.coli lac抑制子和操纵子控制枯草芽孢杆菌中的基因表达，PNAS，181卷，439-443页)和处于该启动子转录调控下的lacZ基因。并且该质粒含有在芽孢杆菌penP启动子调控下的lacI基因。因此，在枯草芽孢杆菌中时，lacI将被表达，并结合SPAC启动子-操纵子中的操纵子，这就会抑制下游序列的转录。启动子与Yansura等人所用的相同，但操纵子被修饰成了完善的回文结构。正好位于启动子-操纵子区下游的一个HindIII位点，使得可以通过插入另一个基因，如本发明的内切葡聚糖酶基因，而打断lacz基因。从而可以让内切葡聚糖酶在SPAC启动子-操纵子的调控下表达。

在E.coli质粒pMUTIN4MCS中，以HindIII-SacI片段形式克隆了一个核糖体结合位点(RBS)和带有一个可用于克隆的SacII位点的信号肽。建立了如下核糖体结合位点和编码信号肽的DNA序列：

HindIII

              RBS

5′-AAGCTTGTTACACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGCTTT-

ACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCG-

      NotI     SacI

CGGCA GCGGCCGC GAGCTC-3 ′斜体书写的是编码芽孢杆菌属种信号肽的DNA序列，它与编码蛋白质成熟部分的另一DNA序列融合时，能将该蛋白质引导到芽孢杆菌细胞体外。

上述序列编码pMUTIN4MCS的HindIII位点，其后紧跟枯草芽孢杆菌RBS和编码芽孢杆菌信号肽的一段DNA序列，该DNA序列末端是一个人工引入的SacII位点，其后接着NotI和SacI限制酶切位点。通过电穿孔将质粒导入E.coli SJ2，铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养细胞过夜，获得了质粒。得到的质粒命名为pMUTIN-4-信号SacII-NotI。

耐热葡聚糖酶基因以SacII-EagI消化的PCR片段进行克隆。

用Boehringer Mannheim的HiFi Expand PCR试剂盒获得该PCR片段，反应按照厂商建议进行。从质粒pDSM11201扩增该DNA片段。耐热内切葡聚糖酶基因起初是从网球菌DSM6262克隆来的，并作为包含带有内切葡聚糖酶基因的质粒的E.coli克隆(DSM11201)保藏。

#30519

5′-CATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGC-3′

#30637

5′-CATGACACGGCCGATTATTTAAGCTCAATATCAAAATTTGAG-3′

该PCR片段和pMUTIN4-信号SacII-NotI用SacII-EagI消化，连接在一起，通过电穿孔转化E.coli SJ2，铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并在37℃培养细胞过夜。得到的SJ2中的质粒命名为pMB447A。

克隆融合了上述信号肽(在SacII-NotI/EagI位点)的内切葡聚糖酶基因后，得到下面的由SPAC启动子-操纵子转录调控的开放阅读框：ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGCATTTATACTTAAAGCACCTTCCTCAGGCGATGTCACAACTAAAAATCTTCCTCTCACCTTAGAACTCAACTTTTGGAATATTGCAAACTATGAAGGAAATACATGGATGGCATTTTATAAAGAAGAAGATACTGTTGAATATTATGCCGACATAAAAAACATAGTACTTAAGGATAAAAATTCATGGGTACATGGATATCCTGAAGTCTACTATGGGTACAAACCATGGGCTGGCCATGGGAATTCCATTGAGAAATTAGCTCTTCCTAAAAAGGTATCAGAATTTCCAGACGTTCTCTTCAATCTAAAATACAACATATGGTACGAGAAGAATCTTCCTATAAATTTTGCTATGGAAACATGGATAACAAAAGAACCCTATCAGAAAACCGTTACTTCAGGGGATATAGAGATGATGGTATGGCTATATGCTAATAGACTTTCTCCTGCAGGGCGAAAGGTAGGAGAAGTAAAAATACCTATCATCCTAAACGGTAATCAAAAAGACATTATCTGGGAAGTATATCTTTCCCCTATGAGCTGGGACTACGTGGCCTATAAATCAAAAGAAAATATTCTTCAAGGACAGGTAAAAATACCAATAAATGAATTTTTGAAACACCTAAGAACAATTTTAGCCAACAATCCAAGTAGAATAACCCCAGAGAAATTTGATCAGATGTATGTGACAGTCTGGGAAATTGGAACAGAATTTGGCGATCCATATACTACTGAGGCAAAATTTGGATGGACTTTCTCAAATTTTGATATTGAGCTTAAATAA

以及衍生的蛋白质：MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAQTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFWNIANYEGNTWMAFYKEEDTVEYYADIKNIVLKDKNSWVHGYPEVYYGYKPWAGHGNSIEKLALPKKVSEFPDVLFNLKYNIWYEKNLPINFAMETWITKEPYQKTVTSGDIEMMVWLYANRLSPAGRKVGEVKIPIILNGNQKDIIWEVYLSPMSWDYVAYKSKENILQGQVKIPINEFLKHLRTILANNPSRITPEKFDQMYVTVWEIGTEFGDPYTTEAKFGWTFSNFDIELK.

为了能在枯草芽孢杆菌中增殖pMB447A，将该E.coli质粒与pUB110的衍生质粒(能在枯草芽孢杆菌中增殖的一种质粒)融合：在pUB110的NciI位点用多接头引入SacI和NotI位点，得到的插入片段有如下序列：CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG

下划线的是两个NciI位点，其间是SacI和EagI(NotI)位点。

质粒随后用SacI和EagI消化，连接到经SacI和EagI消化的pMB447A中，用连接产物转化枯草芽孢杆菌A164。建立克隆，并在LBPG-10 Kana AZCL-HE-纤维素平板上过夜生长。第二天，将平板在70℃保温5小时，蓝色环的出现指示耐热内切葡聚糖酶的阳性表达。

分析从克隆MB505分离得到的质粒DNA(DSM11903)时，显然质粒发生了重组，产生的质粒小于预料中的12.5kb大小。因此，看来质粒丢失了E.coli质粒pMUTIN4-信号SacII-NotI的大部分，得到大小约为5.5kb的一个质粒。

得到的质粒具有如下基本特点：

质粒DSM11903上编码的内切葡聚糖酶不需加入IPTG即可阳性表达，并且该质粒赋予对10μg/ml卡那霉素的抗性。

MB505在带有两个挡板的500ml摇瓶中，于100ml BPX培养基内，在37℃，300rpm培养5天。纯化和鉴定：

从带有克隆MB505的芽孢杆菌收获5000ml摇瓶培养物，将培养物加热到70℃，搅拌下保持该温度5分钟，从而热处理培养物。然后冷却，并在9000rpm离心20分钟。获得含有2.4CMCU/ml的清亮上清液4000ml。

在70℃和pH8.5测定CMCU。

将6000CMCU上样到用pH6.2的50mM Mes缓冲液平衡过的3000mlDEAE A-50 Sephadex柱中。未结合的物质共含有5700CMCU。

将未结合的物质上样到用pH9.5的20mM乙醇胺缓冲液平衡过的1000ml Q-Sepharose柱中。结合的酶用NaCl梯度洗脱下来。

部分纯化的产物用amicon超滤池浓缩，其中膜截留分子量为6KDa。

浓缩组分用40％nonopropyleneglycol配制。

获得总量为250ml，浓度为9.7CMCU/ml的浓缩液(总共2425CMCU)，用于应用实验。

免疫学方法：

利用来自网球菌的高度纯化的纤维素酶(实施例2)生产抗血清。

免疫过程用兔子在DAKO进行。每只兔子用与100μl佐剂混合的100μl纤维素酶(0.4mg蛋白质/ml)免疫。每只兔子每隔1周免疫一次，共免疫15次。收集兔血清，从血清中纯化γ球蛋白。

例如在含有25ml 1％琼脂糖凝胶(15*10cm)与50μl γ球蛋白(A280＝106.5)的Mancini平板上制备4mm的小孔，孔中加入10μl样品，在湿室中室温培养1天。

平板在0.95NaCl水中洗几次，依照标准程序用考马斯蓝染色。

从高度纯化的网球菌纤维素酶或部分纯化的MB505制剂分别得到下列直径：

高度纯化的网球菌纤维素酶：

40CMCU给出的直径为11.5mm

20CMCU给出的直径为9.5mm

10CMCU给出的直径为7mm

MB505制剂：

10CMCU给出的直径为8mm

其它族的12种纤维素酶(例如来自真菌木霉属、腐质霉属、曲霉属)在这些条件下不形成免疫沉淀。

实施例4

90℃下网球菌纤维素酶的生物抛光

实验

材料与设备

装置：Mathis Pad-steam Range，型号：PSA-HTF

织物：漂白的双罗纹针织棉织物(Test fabrics Inc.)：N.O.白色，100％棉，样式460。将织物剪成20×30cm大小的布片(每片约12.5g)。

酶：网球菌，批号MB505，9.7CMCU/ml

缓冲液：15mM磷酸盐缓冲液，pH6.0

        15mM磷酸盐缓冲液，pH8.1

轧染(padding)程序：

棉布样品在标准AATCC(美国纺织化学家和染色家学会)气候室(相对湿度65±2％和温度70±3°F)中调湿至少24小时。称取重量。

酶溶液由混合酶和缓冲液制得。调节pH，溶液中的酶活性如下表1所示。将样品浸入酶溶液中45秒以下，然后轧染。轧染后，样品称重，立即挂在Mathis蒸汽发生器中。织物上的溶液百分比以织物样品湿重增量表示，也示于表1中。表1

织物#	酶溶液(CMCU/ml)	溶液pH	湿重增量(％w/w)
				1	0	6	125
2	0	8.1	128
				3	4.8	6	130
4	4.8	8.1	131
				5	9.7	6	137
6	9.7	8.1	137

在蒸汽发生器中生物抛光：

织物样品在下列条件下在蒸汽发生器中处理：

温度：90℃

时间：90分钟

相对湿度：100％

取出所有样品，并浸在去离子水中至少5分钟。风干，然后在评估前在AATCC气候室中调湿至少24小时。

评估：

强度损失：织物强度依照ASTM D3786-87，在Mullen Bursttester model C上测量。数据是至少8次测量的平均值。

起球指数：依照ASTM D 4970-89用Matindale Pilling Tester在500转测量。目测评估织物的起球情况，分为1-5级，1级表示起球情况严重，5级表示不起球。数据是至少2次测量的平均值。

结果与结论：

结果总结如下，数据见表2和3。

1.随酶液浓度增加，起球指数增加(表3)。

2.网球菌纤维素酶在pH8.1比pH6.0有更好的起球指数(表3)。

3.在目前条件下，在pH6.0进行生物抛光，棉布强度损失较小(低于5％)，而在pH8.1没有检测到强度损失。

概括起来，用网球菌纤维素酶对棉布的生物抛光显著提高布在本研究中条件下的起球抗性。在优选的条件下，如pH约为8，可达到良好的起球抗性，同时并没有可以觉察的强度损失。

表2

织物(#)	强度损失(％)	起球指数(500转)
			1	0	1.5
2	0	2
			3	2.4	2
4	0	2.75
			5	3.5	2.5
6	0	3

表3

纤维素酶(CMCU/g)	起球指数(500转)，pH6	起球指数(500转)，pH8.1
			0	1.5	2.0
4.8	2.0	2.8
			9.7	2.5	3.0

序列表(1)一般资料：(i)申请人：

(A)姓名：Novo Nordisk A/S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880

(G)电话：45 4444 8888

(H)传真：45 4449 3256(ii)发明题目：一种新的内切葡聚糖酶(iii)序列数：2(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

         (EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：

(A)长度：867个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGAAAAAAT   CTTTACTTTC   TCTTATCCTC   ATACTTCTTC   TTATTACTCT   CTCCTTCAGT              60CAAACTCCAA   AATACAAAGA   CGCATTTATA   CTTAAAGCAC   CTTCCTCAGG   CGATGTCACA              120ACTAAAAATC   TTCCTCTCAC   CTTAGAACTC   AACTTTTGGA   ATATTGCAAA   CTATGAAGGA              180AATACATGGA   TGGCATTTTA   TAAAGAAGAA   GATACTGTTG   AATATTATGC   CGACATAAAA              240AACATAGTAC   TTAAGGATAA   AAATTCATGG   GTACATGGAT   ATCCTGAAGT   CTACTATGGG              300TACAAACCAT   GGGCTGGCCA   TGGGAATTCC   ATTGAGAAAT   TAGCTCTTCC   TAAAAAGGTA              360TCAGAATTTC   CAGACGTTCT   CTTCAATCTA   AAATACAACA   TATGGTACGA   GAAGAATCTT              420CCTATAAATT   TTGCTATGGA   AACATGGATA   ACAAAAGAAC   CCTATCAGAA   AACCGTTACT              480TCAGGGGATA   TAGAGATGAT   GGTATGGCTA   TATGCTAATA   GACTTTCTCC   TGCAGGGCGA              540AAGGTAGGAG   AAGTAAAAAT   ACCTATCATC   CTAAACGGTA   ATCAAAAAGA   CATTATCTGG              600GAAGTATATC   TTTCCCCTAT   GAGCTGGGAC   TACGTGGCCT   ATAAATCAAA   AGAAAATATT              660CTTCAAGGAC   AGGTAAAAAT   ACCAATAAAT   GAATTTTTGA   AACACCTAAG   AACAATTTTA              720GCCAACAATC   CAAGTAGAAT   AACCCCAGAG   AAATTTGATC   AGATGTATGT   GACAGTCTGG              780GAAATTGGAA   CAGAATTTGG   CGATCCATAT   ACTACTGAGG   CAAAATTTGG   ATGGACTTTC              840TCAAATTTTG   ATATTGAGCT   TAAATAA                                                        867(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：

(A)长度：288个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Lys Ser Leu Leu Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Ile Thr1               5                   10                  15Leu Ser Phe Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Lys Asp Ala Phe Ile Leu Lys

        20                  25                  30Ala Pro Ser Ser Gly Asp Val Thr Thr Lys Asn Leu Pro Leu Thr Leu

    35                  40                  45Glu Leu Asn Phe Trp Asn Ile Ala Asn Tyr Glu Gly Asn Thr Trp Met

50                  55                  60Ala Phe Tyr Lys Glu Glu Asp Thr Val Glu Tyr Tyr Ala Asp Ile Lys65                  70                  75                  80Asn Ile Val Leu Lys Asp Lys Asn Ser Trp Val His Gly Tyr Pro Glu

            85                  90                  95Val Tyr Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Gly His Gly Asn Ser Ile Glu

         100                105                 110Lys Leu Ala Leu Pro Lys Lys Val Ser Glu Phe Pro Asp Val Leu Phe

    115                 120                 125Asn Leu Lys Tyr Asn Ile Trp Tyr Glu Lys Asn Leu Pro Ile Asn Phe

130                 135                 140Ala Met Glu Thr Trp Ile Thr Ly5 Glu Pro Tyr Gln Lys Thr Val Thr145                 150                 155                 160Ser Gly Asp Ile Glu Met Met Val Trp Leu Tyr Ala Asn Arg Leu Ser

            165                 170                 175Pro Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Val Lys Ile Pro Ile Ile Leu Asn

        180                 185                 190Gly Asn Gln Lys Asp Ile Ile Trp Glu Val Tyr Leu Ser Pro Met Ser

     195                200                 205Trp Asp Tyr Val Ala Tyr Lys Ser Lys Glu Asn Ile Leu Gln Gly Gln

210                 215                 220Val Lys Ile Pro Ile Asn Glu Phe Leu Lys His Leu Arg Thr Ile Leu225                 230                 235                 240Ala Ash Asn Pro Ser Arg Ile Thr Pro Glu Lys Phe Asp Gln Met Tyr

            245                 250                 255Val Thr Val Trp Glu Ile Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Tyr Thr Thr

        260                 265                 270Glu Ala Lys Phe Gly Trp Thr Phe Ser Asn Phe Asp Ile Glu Leu Lys

    275                 280                 285

Claims (31)

1.一种有内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的酶制剂，它在高于85℃的温度下有最佳活性。

2.权利要求1的制剂，其中所述温度高于90℃，优选高于95℃，更优选高于100℃。

3.权利要求1或2的制剂，其中所述酶制剂可得自革兰氏阳性细菌门的一个菌株，或是它的内源酶。

4.权利要求3的制剂，其中所述菌株属于梭菌亚门。

5.权利要求4的制剂，其中所述菌株属于网球菌属，优选是网球菌DSM6262。

6.权利要求1至5中任何一项的制剂，它在约pH4到11有活性，优选在大约pH5.5-10有活性。

7.一种有内切葡聚糖酶活性的酶制剂，该酶制剂在70℃，pH10时对羧甲基纤维素(CMC测定)的相对活性是在70℃，最适pH时活性的50％以上。

8.权利要求7的制剂，其中相对活性高于55％，优选高于60％，更优选高于65％，特别是高于70％。

9.权利要求7或8的制剂，其中所述酶制剂可得自革兰氏阳性细菌门的一个菌株，或是它的内源酶。

10.权利要求9的制剂，其中所述菌株属于梭菌亚门。

11.权利要求10的制剂，其中所述菌株属于网球菌属，优选是网球菌DSM6262。

12.一种DNA构建体，它含有编码有内切葡聚糖酶活性的一种酶的一段DNA序列，该酶最佳活性在85℃以上，优选在90℃以上，更优选在100℃以上，所述DNA序列含有

a)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或

b)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列的相似物，该相似物

i)与对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列同源，优选至少60％同源，或

ii)和可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应的DNA序列可杂交的相同寡核苷酸探针能够杂交，或者

iii)编码一种多肽，该多肽与包含可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应之DNA序列的DNA序列编码的多肽同源，优选至少60％同源，或者

iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的内切葡聚糖酶产生的抗体具有免疫反应性，所述内切葡聚糖酶是由对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列编码的。

13.权利要求12的DNA构建体，其中所述DNA序列分离自基于原核微生物或真细菌，优选细菌的DNA文库，或是由它产生的。

14.权利要求13的DNA构建体，其中的DNA序列分离自基于革兰氏阳性细菌门菌株的DNA文库，或是由它产生的，优选该菌株属于梭菌亚门，特别是网球菌属菌株，尤其是网球菌DSM6262。

15.权利要求12-14中任何一项的DNA构建体，其中所述DNA序列分离自大肠杆菌DSM11201。

16.权利要求12-15中任何一项的DNA构建体，其中还含有编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列。

17.权利要求16的DNA构建体，其中还含有编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列，由该DNA构建体的DNA序列所编码的纤维素结合结构域和酶反应中心(催化活性结构域)被可操纵地连接在一起。

18.一种含有权利要求12-17中任何一项的DNA构建体的重组表达载体。

19.一种含有权利要求12-17中任何一项的DNA构建体或权利要求18的重组表达载体的细胞。

20.权利要求19的细胞，它是原核细胞，特别是细菌细胞，或者是编码具有内切葡聚糖酶活性之酶的DNA序列最初来源的内源细胞。

21.权利要求20的细胞，其中所述细胞属于芽孢杆菌的菌株，优选属于枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、液化芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌之组的菌株。

22.权利要求20的细胞，其中所述细胞属于丝状真菌的菌株，优选属于曲霉属、镰孢属和木霉属之组的菌株，更优选属于黑曲霉，米曲霉，禾谷镰孢和Trichoderma reesei等种组成之组的菌株。

23.权利要求20的细胞，其中所述细胞属于网球菌属菌株，优选网球菌DSM6262。

24.权利要求19的细胞，其中所述细胞属于酵母属的菌株，优选酿酒酵母的菌株。

25.产生有内切葡聚糖酶活性、且最佳活性在高于85℃，优选高于90℃，更优选高于100℃的酶的一种方法，该方法包括在允许该酶产生的条件下培养权利要求19-24中任何一项所述细胞，并从培养物中回收该酶。

26.一种有内切葡聚糖酶活性的分离酶，其中该酶：i)不含同源杂质，和ii)依照权利要求25的方法产生。

27.一种有内切葡聚糖酶活性、且最佳活性在高于85℃，优选高于90℃，更优选高于100℃的酶，该酶

a)由权利要求12-17中任何一项的DNA构建体编码，或

b)通过权利要求25的方法产生，或

c)是网球菌DSM6262产生的一种多肽，可以由可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分所编码，或

d)与针对纯化的内切葡聚糖酶产生的抗体有免疫反应性，该纯化的内切葡聚糖酶由对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列编码。

28.一种富含权利要求26或27的酶的酶制剂。

29.权利要求1-11和28中任何一项的酶制剂，其中还含有选自下述的一或多种酶：甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖、阿拉伯聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶、果胶甲酯酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、纤维素二糖水解酶和转谷氨酰胺酶。

30.大肠杆菌DSM11201菌株基本纯的分离的生物学培养物。

31.权利要求26或27的酶或者权利要求1-11、28和29中任何一项的酶制剂在纺织工业中，用于改善纤维素纤维或织物品性，或者使其具有粗斜纹棉布的石洗外观；或者用于工业清洁程序；或者用于热压聚合物材料；或者用于将生物量转化成糖；或者用于生产乙醇；或者用于预消化例如饲料生产中所用的谷物；或者用于生产速溶咖啡或相似提取过程的用途。