CN104726433A - 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸，具体地涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于制备和使用所述多肽的方法。

Description

具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
本发明申请是基于申请日为2006年8月4日，申请号为200680037147.1(国际申请号为PCT/US2006/030719)、名称为“具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。
相关领域描述
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将纤维素原料转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的愿望，和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。由于通过多种酵母将葡萄糖而非纤维二糖容易地发酵成乙醇，在水解结束时剩余的任何纤维二糖代表着乙醇产率的损失。更重要的是，纤维二糖是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的强抑制剂。水解期间纤维二糖的积累对于乙醇生产不合需要的。
纤维二糖的积累已经成为酶水解中的主要问题，因为产生纤维素酶的微生物几乎不产生β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶的低含量导致将纤维二糖水解成葡萄糖的能力不足。已经将几种方法用于在将纤维素转化成葡萄糖时增加β-葡糖苷酶的量。
一种方法是使用几乎不产生纤维素酶的微生物产生β-葡糖苷酶，并且对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶外源添加β-葡糖苷酶以增强水解。然而，需要的量对于乙醇操作的商业生物量成本太高。
第二种方法是在用酵母发酵葡萄糖的同时进行纤维素水解。这种方法被称为同时糖化和发酵(SSF)。在SSF系统中，葡萄糖的发酵将葡萄糖从溶液中去除。然而，SSF系统在商业上尚不可行，因为用于酵母的28℃的操作温度相对于要求的50℃条件而言太低。
第三种克服β-葡糖苷酶不足的方法是在宿主中过量表达β-葡糖苷酶，由此增加β-葡糖苷酶的产率。
本领域中有利的是提供新的具有改进性质的β-葡糖苷酶，用于将纤维素材料转化成单糖、二糖和多糖。
本发明的目的是提供新的具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。
发明概述
本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由在至少中严紧条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；
(c)包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A的多肽；和
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失和/或插入的变体。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽，所述多核苷酸选自下组：
(a)多核苷酸，其编码的多肽包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％同一性的氨基酸序列；
(b)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％同一性；和
(c)多核苷酸，其在至少中严紧条件下与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和
(d)多核苷酸，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A。
在优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。在另一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，和产生具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法。
本发明还涉及植物，其包含编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸。
本发明还涉及在将纤维素材料转化成葡萄糖或其它物质时，使用具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法。
本发明还涉及洗涤剂组合物，其包含具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-19或由SEQ ID NO:2的氨基酸1-19组成；涉及编码前肽(propeptide)的分离的多核苷酸，所述前肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-36或由SEQ ID NO:2的氨基酸20-36组成；并且涉及编码前原肽(prepropeptide)的分离的多核苷酸，所述前原肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-36或由SEQ IDNO:2的氨基酸1-36组成。
本发明进一步涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中将所述基因与编码信号肽的第一核苷酸序列和编码前肽的第二核苷酸序列中的一个或两个可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-19或由SEQ IDNO:2的氨基酸1-19组成，所述前肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-36或由SEQ ID NO:1的氨基酸20-36组成，其中所述基因对于第一和第二核苷酸序列是外源的。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组：
(a)多肽，其包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％同一性的氨基酸序列；
(b)多肽，其由在至少中严紧条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；
(c)多肽，其包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A；和
(d)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ IDNO:2的成熟多肽。
2.项1的多肽，其包含与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％同一性的氨基酸序列。
3.项1的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ IDNO:2的氨基酸序列组成；或包含其具有β-葡糖苷酶活性的片段或由其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。
4.项3的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。
5.项1的多肽，所述多肽由在优选至少中严紧条件，更优选至少中-高严紧条件，并且最优选至少高严紧条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链。
6.项1-5中任一项的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。
7.项1-5中任一项的多肽，其中所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
8.项1的多肽，其中所述多肽是变体，所述变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。
9.项1的多肽，所述多肽由质粒pKKAB中包含的多核苷酸编码，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30860中。
10.项1的多肽，其包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A。
11.分离的多核苷酸，其包含编码项1-10中任一项的多肽的核苷酸序列。
12.核酸构建体，其包含项11的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。
13.重组表达载体，其包含项12的核酸构建体。
14.重组宿主细胞，其包含项12的核酸构建体。
15.用于产生项1-10中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
16.用于产生项1-10中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。
17.用于产生亲本细胞突变体的方法，所述方法包括破坏或缺失编码项1-10中任一项的多肽的核苷酸序列，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。
18.通过项17的方法产生的突变细胞。
19.项18的突变细胞，所述突变细胞还包含编码天然或异源蛋白质的基因。
20.用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有益于蛋白质产生的条件下培养项19的突变细胞；和(b)回收所述蛋白质。
21.通过以下方法获得的分离的多核苷酸：(a)在优选至少中严紧条件，更优选至少中-高严紧条件，并且最优选至少高严紧条件下将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交多核苷酸，所述多核苷酸编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
22.项21的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
23.核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因与编码信号肽的第一核苷酸序列和编码前肽的第二核苷酸序列中的一个或两个可操作地连接，所述第一核苷酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753组成，第二核苷酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753组成，其中所述基因对于第一和第二核苷酸序列是外源的。
24.重组表达载体，其包含项23的核酸构建体。
25.重组宿主细胞，其包含项23的核酸构建体。
26.用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有益于蛋白质产生的条件下培养项25的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。
27.用于产生项1-10中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。
28.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经使用多核苷酸转化，所述多核苷酸编码项1-10中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
29.洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含项1-10中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽和表面活性剂。
30.用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在有效量的项1-10中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一种或多种纤维素分解蛋白处理所述纤维素材料。
31.项30的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：纤维素酶、内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。
32.项30或31的方法，还包括用有效量的选自下组的一种或多种酶处理纤维素材料：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或它们的混合物。
33.项30-32中任一项的方法，其中所述方法是预处理方法、同时糖化和发酵方法(SSF)中的步骤或混合水解和发酵方法(HHF)中的步骤。
34.项30-34中任一项的方法，还包括回收降解的纤维素材料。
35.项34的方法，其中所述降解的纤维素材料是糖。
36.项30-35中任一项的方法，其中所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽和/或纤维素分解蛋白是含有或不含细胞的发酵液形式。
37.用于产生物质的方法，其包括：
(a)在有效量的项1-10中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一种或多种纤维素分解蛋白糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物来发酵步骤(a)中糖化的纤维素材料；和
(c)从发酵回收所述物质。
38.项37的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：纤维素酶、内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。
39.项37或38的方法，还包括用有效量的选自下组的一种或多种酶处理纤维素材料：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或它们的混合物。
40.项37-39中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时地进行。
41.项37-40中任一项的方法，其中所述物质是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。
42.项37-41中任一项的方法，其中所述具有β-葡糖苷酶活性的多肽和/或纤维素分解蛋白是含有或不含细胞的发酵液的形式。
附图简述
图1A和1B显示巴西青霉(Penicillium brasilianum)菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs:1和2)。
图2显示pCR2.1GH3A的限制图谱。
图3显示pKKAB的限制图谱。
图4显示pKBK01的限制图谱。
图5显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同pH值的相对活性作为温度的函数。
图6显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同温度的相对活性作为pH的函数。
图7显示在不同的温度和pH温育24小时之后，Novozym 188的残余活性。
图8显示在不同的温度和pH温育24小时之后，巴西青霉菌株IBT 20888β-葡糖苷酶的残余活性。
图9显示在不同的4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖浓度下，巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的初始反应速率。
图10显示在不同的纤维二糖浓度下，巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的初始反应速率。
定义
β-葡糖苷酶活性：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并且释放β-D-葡萄糖。纤维二糖酶(cellobiase)与β-葡糖苷酶同义。就本发明而言，在25℃使用1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷作为底物在50mM柠檬酸钠pH 4.8中测定β-葡糖苷酶活性。将一单位的β-葡糖苷酶活性定义为在25℃、pH 4.8，每分钟产生1.0微摩尔的4-硝基酚。
本发明的多肽具有的β-葡糖苷酶活性是由SEQ ID NO:2的氨基酸37-878所示氨基酸序列组成的多肽的β-葡糖苷酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。
家族3糖苷水解酶或家族GH3：术语“家族3糖苷水解酶”或“家族GH3”或“Cel3”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification ofglycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,和Henrissat,和Bairoch,1996,Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族3的多肽。
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多肽。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然地或重组地结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。
本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然地或重组地结合的其它多肽材料。这能够通过以下方法实现，例如，通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有β-葡糖苷酶活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文定义为编码具有β-葡糖苷酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度用FASTA程序包3.4版本使用默认参数测定(Pearson和D.J.Lipman,1988,PNAS 85:2444,和Pearson,1990,Methods in Enzymology 183:63)。将得自程序包的Smith-Waterman算法(Waterman等,1976,Adv.Math.20:367)的配对比对用于百分比同一性的测定。默认参数包括缺口开启罚分(gap open penalty)-12，缺口延伸罚分(gap extension penalty)-2和BLOSUM50比较矩阵。
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80:726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)来测定，使用同一性表和以下多重比对参数：缺口罚分(gappenalty)10和缺口长度罚分(gap length penalty)10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。
多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO:2中成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有β-葡糖苷酶活性。优选地，片段含有至少720个氨基酸残基，更优选至少760个氨基酸残基，并且最优选至少800个氨基酸残基。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO:1的5’和/或3’端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亚序列编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽片段。优选地，亚序列含有至少2160个核苷酸，更优选至少2280个核苷酸，并且最优选至少2400个核苷酸。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指，如通过琼脂糖电泳测定的，其为至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯的多核苷酸。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然地或重组地结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然地或重组地结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各种调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的合适位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这种多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个氨基酸侧链的置换。
人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有β-葡糖苷酶活性的多肽，所述多肽由表达修饰的核苷酸序列的生物产生，所述修饰的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的修饰的核苷酸序列；或其同源序列。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其同源序列来获得。
发明详述
具有β-葡糖苷酶活性的多肽
在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、97％、98％或99％的同一性程度，所述多肽具有β-葡糖苷酶活性(下文中的“同源多肽”)。在优选的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸37至878，或其等位变体；或其具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另外的优选方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体组成；或由其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸37至878或其等位变体组成；或由其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。在另外的优选方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸37至878组成。
在第二个方面，本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少非常低严紧条件下，优选至少低严紧条件下，更优选至少中严紧条件下，更优选至少中-高严紧条件下，甚至更优选至少高严紧条件下，并且最优选至少非常高严紧条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽片段。在优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是至少600个核苷酸，至少优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。
因而，可从由这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物的基因组DNA或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，优选将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在至少非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、SEQ ID NO:1中包含的cDNA序列、它的互补链或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另外的优选方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。在另外的优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另外的优选方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。在另外的优选方面，核酸探针是SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列。在另外的优选方面，核酸探针是质粒pKKAB中包含的成熟多肽编码序列，所述质粒包含在大肠杆菌NRRL B-30860中。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并且最优选至少在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48:1390)得出的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度下洗涤两次，每次15分钟。
在第三个方面，本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，所述多肽包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A。
在第四个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含保守取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽；或其同源序列。优选氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。
可供选择的是，氨基酸改变具有使多肽的物理化学性质改变的性质。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，β-葡糖苷酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
SEQ ID NO:2的成熟多肽例如SEQ ID NO:2的氨基酸37至878的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。
具有β-葡糖苷酶活性的多肽的来源
本发明的具有β-葡糖苷酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。
本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如具有β-葡糖苷酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽例如具有β-葡糖苷酶活性的大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或尿枝原体属(Ureaplasma)多肽。
在优选的方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另外的优选方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另外的优选方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
本发明的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽例如具有β-葡糖苷酶活性的念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选丝状真菌多肽例如具有β-葡糖苷酶活性的枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)多肽。
在优选的方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另外的优选方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、Thielavia achromatica、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、Thielavia terricola、Thielavia thermophila、Thielavia variospora或Thielavia wareingii多肽。
在另外的优选方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉、沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)、胶囊青霉(Penicillium capsulatum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Penicillium citreonigrum、桔青霉(Penicilliumcitrinum)、棒束青霉(Penicilliumclaviforme)、顶青霉(Penicillium corylophilum)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、指状青霉(Penicillium digitatum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、平滑青霉(Penicillium glabrum)、粒状青霉(Penicillium granulatum)、灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)、岛青霉(Penicillium islandicum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、铅色青霉(Penicillium lividum)、大孢青霉(Penicillium megasporum)、梅林青霉(Penicillium melinii)、特异青霉(Penicillium notatum)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、软毛青霉(Penicilliumpuberulum)、变紫青霉(Penicillium purpurescens)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、娄地青霉(Penicillium roquefortii)、褶皱青霉(Penicilliumrugulosum)、小刺青霉(Penicillium spinulosum)、瓦克曼青霉(Penicilliumwaksmanii)或青霉属菌种(Penicillium sp.)多肽。
在更优选的方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽。在最优选的方面，所述多肽是具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉IBT 20888多肽，例如，SEQ ID NO:2的多肽或其成熟多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的同一性。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。
切割位点的实例包括但不限于：编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology 13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology 9:378-381)；由因子Xa蛋白酶在精氨酸残基之后切割的Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点(Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；由肠激酶在赖氨酸之后切割的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点(Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987)；由Genenase I切割的His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点(Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248)；由凝血酶在Arg之后切割的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点(Stevens,2003,Drug DiscoveryWorld 4:35-48)；由TEV蛋白酶在Gln之后切割的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点(Stevens,2003，见上)；和由人鼻病毒3C蛋白酶的遗传工程形式在Gln之后切割的Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点(Stevens,2003，见上)。
多核苷酸
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明的具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。
在优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或由其组成。在另外的优选方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-30860中所含质粒pKKAB中的序列，或由该序列其组成。在另外的优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码区或由其组成。在另外的优选方面，核苷酸序列包含SEQ IDNO:1的核苷酸171至2753或由其组成。在另外的优选方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-30860中所含质粒pKKAB中包含的成熟多肽编码区或由其组成。本发明还包含编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列，所述亚序列编码具有β-葡糖苷酶活性的SEQ ID NO:2的片段。
本发明还涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列或由该核苷酸组成，其中所述多肽包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A。
本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ IDNO:2的成熟多肽。在优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从青霉属的菌株，或从其它或相关的生物克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
本发明还涉及包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少96％、97％、98％或99％同一性的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。在优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO:1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述核苷酸取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物的密码子选择；或者所述核苷酸取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression and Purification 2:95-107。
对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells,1989,见上文)来鉴定。在后一的技术中，将突变引入到分子中的每个正电残基处，并且测试所得突变分子的β-葡糖苷酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等,1992,见上文；Smith等,1992,见上文；Wlodaver等,1992,见上文)。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在至少非常低严紧条件下，优选至少低严紧条件，更优选至少中等严紧条件，更优选至少中-高严紧条件，甚至更优选至少高严紧条件，并且最优选至少非常高的严紧条件下，与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等,1989,见上文)，如本文所定义的。在优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得：(a)在至少非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下序列杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可为理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins fromrecombinant bacteria"in Scientific American,1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中有所描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相联的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列中的5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码区。异源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者，异源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码区可在本发明中使用。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。
在优选的方面，信号肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至19。在另外的优选方面，信号肽编码区是SEQ ID NO:1的核苷酸6至62，其编码SEQ ID NO:2的氨基酸1至19。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等,1992,见上文，描述。
调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转变成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。
在优选的方面，前肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至36。在另外的优选方面，前肽编码区是SEQ ID NO:1的核苷酸63至170，或其cDNA序列，所述前肽编码区编码SEQ ID NO:2的氨基酸20至36。
当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(orotidine-5’-phosphate decarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为使质粒或载体能够体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括与多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，并因而含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的分离的多核苷酸，将其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例如，真核生物。
有用的但细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属或海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属或尿枝原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实践中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
在优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另外的更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另外的更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另外的更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实践中有用的链球菌属细胞包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种。
在另外的优选方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实践中有用的链霉菌属细胞包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌。
在另外的优选方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另外的优选方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-2070)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，本领域已知的任何方法可以用于将DNA引入宿主细胞。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另外更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另外的最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另外最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,In Abelson,J.N.和Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journalof Bacteriology 153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:1920。
产生方法
本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是青霉属的细胞，更优选地是巴西青霉，并且最优选地是巴西青霉IBT 20888。
本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQID NO:1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成的多肽，和(b)回收所述多肽。在优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收多肽，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)。
植物
本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，将其用编码本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyma)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。
表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并将所得的修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞。
表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所必需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant andCell Physiology 39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plantand Cell Physiology 39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26:85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and general genetics 248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源应用的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)和/或重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，将其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其它的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA包覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant Journal 2:275-281；Shimamoto,1994,Current OpinionBiotechnology 5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法，是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology 21:415-428所描述。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，其包含编码本发明具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。
去除或减少β-葡糖苷酶活性
本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。
可以使用本领域熟知的方法，例如插入、破坏、取代或缺失，通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所必需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时孵育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。
通过引入、取代或去除基因中的一个或多个核苷酸或其转录或翻译所必需的调节元件，可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下文所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方法的实例是基于基因取代、基因缺失或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化体。在特别优选的方面，用选择性标记如本文所述的那些来破坏所述核苷酸序列。
或者，可使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变细胞产生更少的多肽或不产生多肽。
这样生成的多肽缺陷性突变细胞作为表达同源和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生同源或异源多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰而将天然序列改变的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术操作宿主细胞的结果将表达在量上改变的天然蛋白。
在进一步的方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及感兴趣的蛋白产物的细胞，来产生基本上无β-葡糖苷酶活性的蛋白产物的方法：在发酵之前、之中，或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制β-葡糖苷酶活性的物质(agent)，从发酵液中回收感兴趣的产物，和任选地将回收的产物进行进一步纯化。
在进一步的方面，本发明涉及如下生产基本上无β-葡糖苷酶活性的蛋白产物的方法：在允许所述产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以基本上减少β-葡糖苷酶活性，和从培养液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与β-葡糖苷酶抑制剂处理组合使用。
依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的β-葡糖苷酶活性。可使用此方法获得β-葡糖苷酶活性的完全去除。
组合的pH和温度处理优选在9-10的pH和至少65℃的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常10至30分钟是足够的。
用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
用于产生基本上无β-葡糖苷酶产物的本发明的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。β-葡糖苷酶缺陷性细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质例如激素、生长因子、受体等。
可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加修饰，或通过其它这样的修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。
在进一步的方面，本发明涉及基本上无β-葡糖苷酶活性的蛋白产物，其通过本发明的方法产生。
组合物
本发明还涉及包含本发明分离的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的β-葡糖苷酶活性，以例如至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。
所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以将包括于所述组合物中的多肽依照本领域内已知方法稳定。
以下提供的实施例是本发明多肽组合物的优选用途。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法决定。
用途
本发明还涉及使用具有β-葡糖苷酶活性的多肽或其组合物的方法，如下所述。
将生物质降解为单糖、二糖和多糖
本发明还涉及用于降解和转化纤维素材料的方法，包括：在有效量的具有β-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一种或多种纤维素分解蛋白处理所述纤维素材料。
本发明的多肽和宿主细胞，如本文所述，可用于从生物质产生作为化学或发酵原料的单糖、二糖和多糖，用于乙醇、塑料或其它产物或中间物的产生。具有β-葡糖苷酶活性的多肽可以是去除或不去除细胞的粗发酵液形式，或是半纯化或纯化的酶制备物形式。β-葡糖苷酶蛋白还可以是单成分制备物、多成分蛋白制备物，或多成分和单成分蛋白制备物的组合。或者，本发明的宿主细胞可以在使用生物质的发酵方法中用作具有β-葡糖苷酶活性的多肽的来源。宿主细胞还可含有天然的或异源的基因，所述基因编码纤维素分解蛋白以及其它在生物质加工中有用的酶。具体而言，本发明的多肽和宿主细胞可用于通过部分或完全降解纤维素或半纤维素来增加加工残余物(干燥的酒糟、来自酿造的酒糟(spent grains from brewing)、甘蔗渣等)的价值。
生物质可以包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(参见，例如Wiselogel等,1995,in Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversionof Lignocellulosics,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper,managing editor,Volume 65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。
生物质初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过聚合木质素共价交联至半纤维素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要作为平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
在本发明的方法中，纤维素分解蛋白可以是将纤维素材料加工成葡萄糖中，或将半纤维素材料加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，它们的聚合物或如下所述源自它们的产物中涉及的任何蛋白。如上所述，本发明的宿主细胞可以用作具有β-葡糖苷酶的多肽的来源，和作为天然或异源纤维素分解蛋白以及在生物质加工中有用的其它酶的来源。纤维素分解蛋白还可以是单成分制备物，例如，纤维素；多成分制备物，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶；或多成分和单成分蛋白制备物的组合。在酸性、中性或碱性中任一种的pH范围内，纤维素分解蛋白可具有活性，即，水解纤维素。
纤维素分解蛋白可以是真菌或细菌来源，其可以从微生物中获得或分离并且纯化，所述微生物已知能够产生纤维素分解酶，例如，芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、鬼伞属、梭孢壳属、镰孢属、毁丝霉属、枝顶孢霉属、头孢属(Cephalosporium)、柱顶孢属(Scytalidium)、青霉属或曲霉属的菌种(参见，例如，EP 458162)，特别是由选自以下菌种的菌株产生的那些：特异腐质霉(重新归类为Scytalidium thermophilum，参见例如，美国专利No.4,435,307)、灰盖鬼伞、尖镰孢、嗜热毁丝霉、巨多孔菌(Meripilus giganteus)、土生梭孢霉、枝顶孢霉属菌种(Acremonium sp.)、Acremonium persicinum、Acremonium acremonium、Acremonium brachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremonium obclavatum、Acremonium pinkertoniae、红灰枝顶孢霉(Acremonium roseogriseum)、Acremonium incoloratum和Acremoniumfuratum；优选地选自以下菌种：特异腐质霉DSM 1800、尖镰孢DSM 2672、嗜热毁丝霉CBS 117.65、头孢属菌种(Cephalosporium sp.)RYM-202、枝顶孢霉属菌种CBS 478.94、枝顶孢霉属菌种CBS 265.95、Acremonium persicinumCBS 169.65、Acremonium acremonium AHU 9519、头孢属菌种CBS 535.71、Acremonium brachypenium CBS 866.73、Acremonium dichromosporum CBS683.73、Acremonium obclavatum CBS 311.74、Acremonium pinkertoniae CBS157.70、红灰枝顶孢霉CBS 134.56、Acremonium incoloratum CBS 146.62和Acremonium furatum CBS 299.70H。纤维素分解蛋白还可以获得自木霉属(特别是绿色木霉、里氏木霉和康宁木霉)、嗜碱的芽孢杆菌属(alkalophilic Bacillus)(参见，例如，美国专利No.3,844,890和EP 458162)和链霉菌属(参见，例如，EP 458162)。包括化学修饰的或蛋白质工程的变体。
特别适合的纤维素分解蛋白是碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是EP 495,257、EP 531,372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP531,315、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254、美国专利No.5,776,757、WO 89/09259、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
在本发明的方法中使用的纤维素分解蛋白可以使用本领域已知的方法，通过在含有合适的碳源和氮源和无机盐的营养培养基上发酵上述微生物菌株产生(参见，例如，Bennett,J.W.和LaSure,L.(eds.),More Gene Manipulations inFungi,Academic Press,CA,1991)。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。适合于培养和纤维素分解蛋白产生的温度范围和其它条件是本领域已知的(参见，例如，Bailey,J.E.,和Ollis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。
发酵可以是任何培养细胞而致使纤维素分解蛋白的表达或分离的方法。因此，发酵可以被理解为包括在合适培养基中和允许表达或分离纤维素分解蛋白的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。
通过上述方法产生得到的纤维素分解蛋白可以通过常规方法从发酵培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、喷雾干燥、蒸发或沉淀。其后可将回收的蛋白通过多种层析方法进一步纯化，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
纤维素分解蛋白可能水解或总是水解羧甲基纤维素(CMC)，从而减少温育混合物的粘度。产生的粘度的减少可以通过振动粘度计测定(例如，来自Sofraser,France的MIVI 3000)。依照纤维素酶粘度单位(Cellulase Vicosity Unit；CEVU)测量的纤维素酶活性测定，通过测量样品减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来定量样品中存在的催化活性的量。所述测定在适合于纤维素分解蛋白和底物的温度和pH进行。对于CelluclastTM(Novozymes A/S,Denmark)，所述测定在40℃在0.1M磷酸pH 9.0缓冲液中进行30分钟，使用CMC作为底物(33.3g/L羧甲基纤维素Hercules 7LFD)和大约3.3-4.2CEVU/ml的酶浓度。相对于公告的酶标准例如CELLUZYMETM Standard 17-1194(从Novozymes A/S,Denmark获得)计算CEVU活性。
适合在本发明中使用的纤维素分解制备物的实例包括，例如，CELLUCLASTTM(可从Novozymes A/S获得)和NOVOZYMTM188(可从Novozymes A/S获得)。其它可以使用的商业上能够获得的包含纤维素酶的制备物包括CELLUZYMETM、CEREFLOTM和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，LAMINEXTM和SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，和ROHAMENTTM7069W(GmbH)。将纤维素酶以大约0.001％至大约5.0％的固体重量，更优选大约0.025％至大约4.0％的固体重量，和最优选大约0.005％至大约2.0％的固体重量的有效量添加。
如上所述，在本发明的方法中使用的纤维素分解蛋白可以是单成分制备物，即，基本上无其它纤维素分解成分的一种成分。所述单一成分可以是重组成分，即，通过克隆编码单一成分的DNA序列，其后用所述DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见，例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。单成分纤维素分解蛋白的其它实例包括但不限于JP-07203960-A和WO-9206209中公开的那些。宿主优选是异源宿主(酶对于宿主是异源的)，但是在特定条件下宿主也可以是同源宿主(酶对于宿主是天然的)。单成分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液纯化这种蛋白来制备。
在本发明方法的实践中有用的单成分纤维素分解蛋白的实例包括但不限于内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和在降解纤维素生物质中有用的其它酶。
术语“内切葡聚糖酶”在本文定义为内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物、地衣淀粉、与β-1,3葡聚糖混合的β-1,4键例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其它含有纤维素成分的植物材料中1,4-β-D-糖苷键的内水解(endohydrolysis)。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)水解来测定内切葡聚糖酶活性。将一单位的内切葡聚糖酶活性定义为在50℃、pH 4.8每分钟产生1.0微摩尔还原糖。
术语“纤维二糖水解酶”在本文定义为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原端释放纤维二糖。就本发明而言，根据由Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279和由Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters 187:283-288描述的方法测定纤维二糖水解酶活性。
将本发明的多肽与纤维素分解蛋白结合使用，以将生物质底物的纤维素和/或半纤维素成分降解成糖，如上所述(参见，例如，Brigham等,1995,inHandbook on Bioethanol(Charles E.Wyman,editor),pp.119-141,Taylor&Francis,Washington D.C.；Lee,1997,Journal of Biotechnology 56:1-24)。本发明的方法可进一步包括使用本领域常规的方法回收降解的纤维素材料。
具有β-葡糖苷酶活性的多肽和纤维素分解蛋白的最优量依赖于几种因素，所述因素包括但不限于纤维素分解蛋白成分的混合物、纤维素底物、纤维素底物的浓度、纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和发酵生物的内含物(例如，用于同时糖化和发酵的酵母)。术语“纤维素分解蛋白”在本文定义为在测试条件下能够水解或转化或降解纤维素的蛋白质或蛋白质的混合物。它们的量通常通过普通测定法例如BCA(二金鸡宁酸(bicinchoninic acid)，P.K.Smith等,1985,Anal.Biochem.150:76)测量，并且优选添加的量与被水解的生物质的量成比例。
在优选的方面，每克的纤维素材料具有β-葡糖苷酶活性的多肽的量是每克的纤维素材料大约0.01至大约2.0mg，优选大约0.025至大约1.5mg，更优选大约0.05至大约1.25mg，更优选大约0.075至大约1.25mg，更优选大约0.1至大约1.25mg，甚至更优选大约0.15至大约1.25mg，并且最优选大约0.25至大约1.0mg具有β-葡糖苷酶活性的多肽。
在另外的优选方面，每克的纤维素材料纤维素分解蛋白的量是每克的纤维素材料大约0.5至50mg，优选大约0.5至40mg，更优选大约0.5至25mg，更优选大约0.75至20mg，更优选大约0.75至15mg，甚至更优选大约0.5至10mg，并且最优选大约2.5至10mg纤维素分解蛋白。
本发明的方法可以用于将纤维素材料加工成许多有用的物质，例如，有机产品、化学品和燃料。除乙醇之外，能够从纤维素产生的某些日用和专用化学品包括木糖、丙酮、乙酸、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如，乳酸)、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糖醛、聚羟链烷酸酯/盐(polyhydroxyalkanoate)、顺，顺-己二烯二酸和动物饲料(Lynd,L.R.,Wyman,C.E.和Gerngross,T.U.,1999,Biocommodity Engineering,Biotechnol.Prog.,15:777-793；Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；和Ryu,D.D.Y.和Mandels,M.,1980,Cellulases:biosynthesis andapplications,Enz.Microb.Technol.,2:91-102)。在从可发酵的糖合成多种有机产物之上延伸出潜在副产(potential coproduction)的益处。在生物加工之后剩余的富含木质素的残余物能够转化成木质素衍生的化学品，或用于动力产生。
本领域的技术人员将充分理解依照本发明的方法加工纤维素材料的常规方法。本发明的方法可以使用依照本发明设定来运转的任何常规生物质加工设备进行。
这种设备可包括间歇搅拌反应器(batch-stirred reactor)、带有超滤的连续流动搅拌反应器(continuous flow stirred reactor with ultrafiltration)、连续活塞式流动柱反应器(continuous plug-flow column reactor)(Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematicalmodel for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(attrition reactor)(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of wastecellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)或带有电磁场引发的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulosehydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced byelectromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。
常规方法包括但不限于糖化、发酵、独立水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共同发酵(simultaneous saccharification andcofermentation；SSCF)、混合水解和发酵(hybrid hydrolysis and fermentation；HHF)和直接微生物转化(DMC)。
SHF使用独立的加工步骤，首先将纤维素酶水解成葡萄糖，其后将葡萄糖发酵成乙醇。在SSF中，将纤维素的酶水解和葡萄糖发酵成乙醇组合在一步中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,in Handbookon Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共同发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategicperspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF包括在相同反应器中，但是在不同的温度进行的两个独立步骤，即，高温酶糖化和之后在发酵菌株能够耐受的低温的SSF。DMC将所有三个过程(纤维素酶产生、纤维素水解和发酵)结合在一步中(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66:506-577)。
“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。胶方法包括但不限于，用以产生发酵产物的发酵方法，所述产物包括醇(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵方法还包括在消耗性醇工业(consumable alcohol industry)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如，发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的发酵方法。
本发明进一步涉及用于产生物质的方法，所述物质包括：(a)在有效量的具有β-葡糖苷酶活性的多肽存在下，用有效量的一种或多种纤维素分解蛋白糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)中的糖化纤维素材料；和(c)从发酵中回收所述物质。具有β-葡糖苷酶活性的多肽可以是含有或不含细胞的粗发酵液形式，或是半纯化或纯化的酶制备物形式。β-葡糖苷酶蛋白可以是单成分制备物、多成分蛋白制备物，或多成分和单成分蛋白制备物的组合。
所述物质可以是任何源自发酵的物质。在优选的方面，所述物质是醇。应该理解的是，术语“醇”包括含有一个或多个羟基部分的物质。在更优选的方面，醇是阿拉伯糖醇。在另外的更优选的方面，醇是丁醇。在另外的更优选的方面，醇是乙醇。在另外的更优选的方面，醇是甘油。在另外的更优选的方面，醇是甲醇。在另外的更优选的方面，醇是1,3-丙二醇。在另外的更优选的方面，醇是山梨糖醇。在另外的更优选的方面，醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,The biotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processes for fermentative production ofxylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry 30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journalof Microbiology and Biotechnology 19(6):595-603。
在另外的优选方面，所述物质是有机酸。在另外的更优选的方面，有机酸是乙酸。在另外的更优选的方面，有机酸是丙酮酸。在另外的更优选的方面，有机酸是己二酸。在另外的更优选的方面，有机酸是抗坏血酸。在另外的更优选的方面，有机酸是柠檬酸。在另外的更优选的方面，有机酸是2,5-二酮-D-葡萄糖酸。在另外的更优选的方面，有机酸是乙酸。在另外的更优选的方面，有机酸是反丁烯二酸。在另外的更优选的方面，有机酸是葡糖二酸。在另外的更优选的方面，有机酸是葡萄糖酸。在另外的更优选的方面，有机酸是葡糖醛酸。在另外的更优选的方面，有机酸是戊二酸。在另外的优选方面，有机酸是3-羟基丙酸。在另外的更优选的方面，有机酸是衣康酸。在另外的更优选的方面，有机酸是乳酸。在另外的更优选的方面，有机酸是苹果酸。在另外的更优选的方面，有机酸是丙二酸。在另外的更优选的方面，有机酸是草酸。在另外的更优选的方面，有机酸是丙酸。在另外的更优选的方面，有机酸是琥珀酸。在另外的更优选的方面，有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production fromcellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另外的优选方面，所述物质是酮。应该理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮部分的物质。在另外的更优选的方面，酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003，见上文。
在另外的优选方面，所述物质是氨基酸。在另外的更优选的方面，有机酸是天冬氨酸。在另外的更优选的方面，氨基酸是谷氨酸。在另外的更优选的方面，氨基酸是甘氨酸。在另外的更优选的方面，氨基酸是赖氨酸。在另外的更优选的方面，氨基酸是丝氨酸。在另外的更优选的方面，氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empirical modeling ofbatch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbialbiopolymers,Biotechnology and Bioengineering 87(4):501-515。
在另外的优选方面，所述物质是气体。在另外的更优选的方面，气体是甲烷。在另外的更优选的方面，气体是H2。在另外的更优选的方面，气体是CO2。在另外的更优选的方面，气体是CO。参见，例如，Kataoka,N.,A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production by continuous culturesystem of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water Science and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.in Biomass and Bioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review。
物质从纤维素材料的产生通常需要四个主要步骤。这四个步骤是预处理、酶水解、发酵和回收。下文示例的是用于产生乙醇的方法，但是应理解的是可将类似的方法用于产生其它物质，例如，上述的物质。
预处理。在预处理或预水解步骤中，加热纤维素材料以分解木质素和糖结构，水解大多数半纤维素，并且使纤维素级分易于被纤维素分解酶接近。直接用蒸汽进行加热，或在浆中进行加热，还可在所述浆中向材料添加催化剂以加速反应。催化剂包括强酸，例如硫酸和SO2，或碱，例如氢氧化钠。预处理步骤的目的是促进酶和微生物的渗透。还可对纤维素生物质进行水热蒸汽喷发预处理(hydrothermal steam explosion pre-treatment)(参见美国专利Application No.20020164730)。
糖化。在酶水解步骤中(也称糖化)，将如本文所述的酶添加至预处理的材料以将纤维素级分转化成葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在搅拌釜式反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。糖化步骤可持续多至200小时。糖化可以在大约30℃至大约65℃，特别是大约50℃的温度，和大约4至大约5的pH，特别是大约pH 4.5进行。为了产生酵母能够代谢的葡萄糖，水解通常在具有β-葡糖苷酶活性的多肽存在下进行。
发酵。在发酵步骤中，通过发酵生物如酵母将预处理和酶水解步骤后从纤维素材料释放的糖发酵成乙醇。发酵还可与酶水解在相同的容器中同时进行，也在受控的pH、温度和混合条件下。当糖化和发酵在相同的容器中同时进行时，通常将该方法称为同时糖化和发酵或SSF。
可以将任何合适的纤维素底物或原料使用在本发明的发酵方法中。底物通常基于期望的发酵产物选择，即，基于从发酵获得的物质选择，并且使用的方法是本领域熟知的。适合于在本发明的方法中使用的底物的实例包括含有纤维素的材料，例如木材或植物残余物或低分子糖DP1-3，其获得自能够由发酵微生物代谢的经过加工的纤维素材料，并且所述底物可以通过直接添加至发酵培养基来供应。
术语“发酵培养基”应理解为意指在添加发酵微生物之前的培养基，例如，从糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适合于在期望的发酵方法中使用的任何微生物。根据本发明合适的发酵微生物能够将糖发酵，即直接地或间接地转化成期望的发酵产物，所述糖例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖。发酵微生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属亚种(Saccharomyces spp.)的菌株，并且具体而言为酿酒酵母。商业上能够获得的酵母包括，例如，Red/TM/Lesaffre Ethanol Red(可从Red Star/Lesaffre,USA获得)FALI(可从Burns Philp Food Inc.,USA的分公司Fleischmann’sYeast获得)、SUPERSTART(可从Alltech获得)、GERT STRAND(可从GertStrand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
在优选的方面，酵母是酵母属亚种。在更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另外的更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另外的更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另外的优选方面，酵母是克鲁维酵母属亚种(Kluyveromyces spp)。在另外的更优选的方面，酵母是马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另外的更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。在另外的优选方面,酵母是念珠菌属亚种(Candida spp)。在另外的更优选的方面，酵母是假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)。在另外的更优选的方面，酵母是Candida brassicae。在另外的优选方面,酵母是Clavispora spp。在另外的更优选的方面，酵母是Clavispora lusitaniae。在另外的更优选的方面，酵母是Clavispora opuntiae。在另外的优选方面，酵母是管囊酵母属亚种(Pachysolen spp)。在另外的更优选的方面，酵母是管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另外的优选方面,酵母是酒香酵母属亚种(Bretannomyces spp)。在另外的更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production andUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。
能够有效地将葡萄糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，Zymomonas mobilis和Clostridium thermocellum(Philippidis,1996，见上文)。
本领域熟知的是上述生物还能够用以产生其它物质，如本文所述。
酿酒酵母中异源基因的克隆(Chen,Z.,Ho,N.W.Y.,1993,Cloning andimproving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene inSaccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho,N.W.Y.,Chen,Z,Brainard,A.P.,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859)，或细菌中例如大肠杆菌(Beall,D.S.,Ohta,K.,Ingram,L.O.,1991,Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars byrecombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303)、催产克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(Ingram,L.O.,Gomes,P.F.,Lai,X.,Moniruzzaman,M.,Wood,B.E.,Yomano,L.P.,York,S.W.,1998,Metabolic engineering of bacteriafor ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214)和Zymomonas mobilis(Zhang,M.,Eddy,C.,Deanda,K.,Finkelstein,M.,和Picataggio,S.,1995,Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenicZymomonas mobilis,Science 267:240-243；Deanda,K.,Zhang,M.,Eddy,C.,和Picataggio,S.,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)中异源基因的克隆致使能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共同发酵)的生物体的构建。
通常将酵母或其它微生物添加至降解的纤维素或水解产物，并且将发酵持续进行大约24小时至大约96小时，例如大约35至大约60小时。温度通常在大约26℃至大约40℃，具体而言在大约32℃，并且在大约pH 3至大约pH 6，具体而言大约pH 4-5。
在优选的方面，将酵母或其它微生物添加至降解的纤维素或水解产物，并且将发酵持续进行大约24至大约96小时，例如通常为35-60小时。在优选的方面，温度通常在大约26至大约40℃，具体而言为大约32℃，并且pH通常在大约pH 3至大约pH 6，优选为大约pH 4-5。优选地将酵母或其它微生物以大约105至1012，优选为大约107至1010，特别是大约5x107活菌计数每ml发酵液的量应用。在乙醇产生阶段期间，酵母细胞计数应该优选在大约107至1010，特别是大约2x 108。使用酵母用于发酵的进一步指导可参见例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,NottinghamUniversity Press,United Kingdom 1999)，将其作为参考并入本文。
本领域中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保持阶段(holding stage)，意味着共同添加酵母和酶。
对于乙醇产生，在发酵之后蒸馏醪液以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用中性酒精(potableneutral spirits)，或工业乙醇。
可以将发酵刺激物与本文所述的任何酶方法组合使用，以进一步改进发酵方法，具体而言，改进发酵微生物的性能，例如，速率增加和乙醇产率。“发酵刺激物”指发酵微生物生长的刺激物，所述发酵微生物具体而言是酵母。优选的生长发酵刺激物包括维生素和矿物。维生素的实例包括多种维生素(multivitamin)、生物素、泛酸(pantothenate)、烟酸、中肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，将其作为参考并入本文。矿物的实例包括能够提供营养的矿物和矿物盐，例如P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
回收。将醇从发酵的纤维素材料分离并且通过常规的蒸馏方法纯化。能够获得纯度高至96体积％乙醇的乙醇，其能够用作例如燃料乙醇，饮用乙醇，即可饮用中性酒精，或工业乙醇。
对于其它物质，可以使用本领域已知的任何方法，包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、蒸馏或提取。
在本发明的方法中，可向纤维素分解蛋白和β-葡糖苷酶多肽补充一种或多种额外的酶活性以改进纤维素材料的降解。优选的额外的酶是半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或它们的混合物。
在本发明的方法中，可以将额外的酶在发酵之前或发酵期间添加，包括在发酵微生物的增殖期间或之后。
本文引用的酶可以源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源。术语“获得”在本文的意思是所述酶可从天然产生该酶作为天然酶的微生物中分离。术语“获得”在本文中还意指所述酶可在宿主生物中以重组方法产生，其中所述以重组方法产生的酶对于该宿主生物是天然的或异源的或具有修饰的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代了一个或多个氨基酸，即，以重组方法产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段或是由本领域已知的核酸改组方法产生的酶。在天然酶的含义内包括天然变体，在异源酶的含义内包括以重组方法获得的变体，例如通过定位诱变或改组获得的变体。
所述酶还可以是纯化的。术语“纯化的”用于本文涵盖不含其它成分的酶，所述其它成分来自所述酶源自的生物。术语“纯化的”还涵盖下述酶，所述酶不含来自获得该酶的天然生物的成分。所述酶可以是纯化的，仅存在小量的其它蛋白质。表述“其它蛋白质”具体涉及其它酶。术语“纯化的”用于本文还指去除存在于本发明酶来源的细胞中的其它成分，特别是其它蛋白质，并且最特别是其它酶。酶可以是“基本上纯的”，即，不含来自产生该酶的生物的其它成分，所述生物即，例如，用于以重组方法产生酶的宿主生物。在优选的方面，酶是至少75％(重量/重量)，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，甚至更优选至少98％，或最优选至少99％纯。
本发明中使用的酶可以是任何适合于在本文所述的方法中使用的形式，例如，含有或不含细胞的粗发酵液，干燥粉末或颗粒，无粉尘(non-dusting)颗粒，液体，稳定化的液体或保护酶(protected enzyme)。颗粒可以例如像美国专利Nos.4,106,991和4,661,452中公开的来产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法来包覆。液体酶制备物可以例如根据已经确定的方法通过添加稳定剂来稳定，所述稳定剂例如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有机酸。保护酶可以根据EP 238,216中公开的方法来制备。
洗涤剂(detergent)组合物
可以将本发明的具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽添加至洗涤剂组合物，并且因此成为所述洗涤剂组合物的成分。
可以将本发明的洗涤剂组合物例如配制为手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和添加了漂洗剂的织物柔软剂组合物，或将其配制为用于通常家庭硬表面清理操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗的洗碟(dishwashing)操作。
在具体的方面，本发明提供包含本发明的具有β-葡糖苷酶的多肽的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一个或多个其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或过氧化物酶。
通常选择的酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶成分应该以有效量存在。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。其中包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)和镰孢属蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中描述。
有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的商业上能够获得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM和KannaseTM(Novozymes A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自如下的脂肪酶：腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))，例如，来自疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))如EP 258 068和EP 305 216中所述，或来自特异腐质霉如WO 96/13580中所述，假单胞菌属脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois等,1993,Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)的脂肪酶。
其它实例是例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶变体。
优选的商业上能够获得的脂肪酶包括LipolaseTM、LipexTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特殊菌株，在GB 1,296,839中有更详细的描述。
有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别在一个或多个以下位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可获得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor International Inc.)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属或木霉属菌属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,776,757和WO 89/09259。
特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的益处(color care benefits)。这种纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
商业上能够获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(Novozymes A/S)、ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属的过氧化物酶，例如，来自灰盖鬼伞及其变体，如在WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的那些。
商业上能够获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂，可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)配制成例如，颗粒、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，具体为无粉尘颗粒，液体，具体为稳定的液体，或浆。
例如，可以如美国专利Nos.4,106,991和4,661,452中所公开的产生无粉尘颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。蜡制包覆材料(waxycoating material)的实例是具有1000至20000的平均摩尔量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个的环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单酸甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例提供于GB 1483591。例如，可根据已经建立的方法通过添加多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。可以根据公开于EP 238,216中的方法来制备保护酶。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水的(non-aqueous)。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。所述表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。
当包括于此时，所述洗涤剂将通常含有大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸酯(olefinsulfonate)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐(alcohol ethoxysulfate)、仲链烷磺酸盐(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。
当包括于此时，洗涤剂将通常含有大约0.2％至大约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamide)”)。
洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增清剂(builder)或复合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、柠檬酸盐、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)例如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白体系，其可以包含H2O2源例如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可以包含过氧酸，例如，酰胺、二酰亚胺(imide)或砜类型的过氧酸。
本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂稳定，例如，多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸(4-formylphenylboronic acid)，并可例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。
洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如，织物整理剂(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、防污再沉积剂、染料、杀菌剂、光亮剂(optical brightener)、水溶助剂(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。
在洗涤剂组合物中的任何酶，特别是本发明的酶，可以按相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量添加。
本发明的酶可以额外地并入公开于WO 97/07202的洗涤剂配制物，WO97/07202在本文中作为参考文献并入。
其它用途
本发明的具有β-葡糖苷酶活性的多肽还可以与其它糖原水解酶和相关的酶组合使用，如本文所述，在纺织品的处理中作为生物抛光剂和用于减少绒毛(fuzz)、起球、纹理变形和石洗(stonewashing)(N.K.Lange,于P.Suominen,T.Reinikainen(编),Trichoderma reesei cellulases and Other Hydrolases,Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research,Helsinki,1993,pp.263-272)。此外，描述的多肽还可与其它糖原水解酶和相关的酶组合使用，如本文所述，在木材加工中用于生物制浆或剥皮(debarking)，在造纸中用于纤维改性、漂白和降低精炼能源消耗，使用在对废水循环重要的白水处理中，使用在木质纤维素纤维循环再生例如脱墨和二次纤维加工中，和使用在木材残余物利用中(S.D,Mansfield和A.R.Esteghlalian in S.D,Mansfield和J.N.Saddler(Eds.),Applications of Enzymes to Lignocellulosics,ACS SymposiumSeries 855,Washington,D.C.,2003,pp.2-29)。
信号肽和前肽
本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至19或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至19组成的信号肽。本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至36或由SEQ ID NO:2的氨基酸20至36组成的前肽。本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至36或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至36组成的前原肽。在优选的方面，信号肽由包含SEQ ID NO:1的核苷酸6至62或由SEQID NO:1的核苷酸6至62组成的多核苷酸编码。在另外的优选方面，前肽由包含SEQ ID NO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列，或由SEQ ID NO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列组成的多核苷酸编码。在另外的优选方面，前原肽由包含SEQ ID NO:1的核苷酸1至108或由SEQ ID NO:1的核苷酸1至108组成的多核苷酸编码。
本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，所述基因与第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的一个或两个可操作地连接，所述第一核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至19或由SEQ ID NO:2的氨基酸1至19组成的信号肽，其允许蛋白质分泌至培养基中，所述第二核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至36或由SEQ ID NO:2的氨基酸20至36组成的前肽，其中所述基因对于第一和第二核苷酸序列是异源的。
在优选的方面，所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸6至62或由SEQ ID NO:1的核苷酸6至62组成。在另外的优选方面，所述第二核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列，或由SEQ IDNO:1的核苷酸63至170或其cDNA序列组成。
本发明还涉及包含这些核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。
本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，包括：(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组细胞；和(b)回收所述蛋白质。
第一和第二核苷酸序列可以分别地与其它调控序列或组合地与其它调控序列一起与异源基因可操作地连接。这些其它调控序列在上文中描述。如前文所述，当信号肽区和前肽区二者均存在于蛋白质的氨基末端时，将前肽区置于紧接着蛋白质的氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。
所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并且因此包含肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含组合以形成编码产物的两种或两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一个或多个对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。
优选地，蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报道蛋白(reporter)。在更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在甚至更优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
基因可以从任何原核、真核或其它来源获得。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
材料
作为缓冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。
DNA测序
使用Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)使用染料终止剂化学(dye terminatorchemistry)(Giesecke等,1992,Journal of Virol.Methods 38:47-60)进行DNA测序。用序列特异性引物使用phred/phrap/consed(University of Washington,Seattle,WA,USA)来装配序列。
菌株
使用巴西青霉菌株IBT 20888(IBT Culture Collection of Fungi,TechnicalUniversity of Denmark,Copenhagen,Denmark)作为β-葡糖苷酶的来源。将米曲霉BECH2(WO 00/30322)用于巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的表达。
培养基和溶液
TE由10mM Tris-1mM EDTA组成。
LB培养基由如下物质组成：每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠。
LB平板由如下物质组成：每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g细菌用琼脂(Bacto Agar)。
STC由如下物质组成：1.2M山梨糖醇、10mM Tris-HCl和10mM CaCl2，pH 7.5。
PEG溶液由如下物质组成：60％PEG 4000、10mM Tris-HCl和10mMCaCl2，pH 7.5。
YPM培养基由如下物质组成：每升10g酵母提取物、20g蛋白胨和2％麦芽糖。
实施例1：从巴西青霉分离基因组DNA
根据Carlsen,1994,Ph.D.thesis,Department of Biotechnology,TheTechnical University of Denmark，使巴西青霉菌株IBT 20888的孢子在稻(rice)上增殖。用20ml的0.1％Tween 20回收孢子，并且以1×106个孢子每ml的浓度接种至500ml带挡板的摇瓶中100ml含有1％葡萄糖的Mandels和Weber培养基中(Mandels和Weber,1969,Adv.Chem.Ser.95:394–414)，所述培养基每升补充有0.25g酵母提取物和0.75g细菌用蛋白胨(Bactopeptone)。在30℃，150rpm有氧培养24小时之后收获真菌菌丝体。
通过Nalgene DS0281-5000滤器(Nalge Nunc International Corporation,Rochester,NY,USA)过滤直至干燥来收集菌丝体，并且在液氮中冷冻。将冷冻的菌丝体在干燥冰冷的研钵中研磨成粉，并且分装至螺口小管中。将粉末悬浮在总体积40ml的50mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)-NaOH pH 11缓冲液中，所述缓冲液含有0.5％十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate)和0.5mMEDTA。将悬液置于60℃ 2小时，并且周期性地通过倒置使其重悬。向悬液添加等体积的用0.1M Tris碱中和的酚:氯仿(1:1体积/体积)，并且将小管在转轮(rotating wheel)上在37℃混合2小时。在Sorvall H1000B转子中以2500rpm离心10分钟之后，将水相(上相)再次用酚:氯仿(1:1体积/体积)再提取(re-extract)，并且在15,000x g离心5分钟。将二次体取的水相添加至2.5M乙酸铵(原液10M)并且置于-20℃直至冷冻。融化之后，将提取物在冷转子中以15,000x g离心20分钟。弃去沉淀(主要为rRNA)，并且通过添加0.7体积的异丙醇使上清中的核酸沉淀。在15,000x g离心15分钟之后，用5ml 70％乙醇将沉淀洗涤三次(不重悬)，几乎彻底地风干，并溶解在1.0ml 0.1X TE中。将溶解的沉淀转移至两个1.5ml微量离心管中。通过添加乙酸铵(0.125ml)至2.0M和乙醇至63％(1.07ml)，并且在Sorvall MC 12V微量离心机(KendroLaboratory Products,Asheville,NC,USA)中以最高速离心10分钟，将沉淀溶液析出。将沉淀用70％乙醇洗涤两次，彻底风干，并溶解在500μl 0.1X TE中。
实施例2：制备基因组DNA文库
使用TOPO Shotgun Subcloning Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)构建基因组文库。简而言之，通过在10psi氮下喷雾15秒来剪切总细胞DNA，并使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液在1％琼脂糖凝胶上进行大小分级。使用MiniEluteTM Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc,Valencia,CA,USA)将迁移在3-6kb大小范围的DNA片段切除和洗脱。将洗脱的片段如上使用1％琼脂糖凝胶再次进行大小分级，并且使用MiniEluteTMGel Extraction Kit将迁移在3-6kb大小范围内的DNA片段切除并且洗脱。
将洗脱的DNA片段平端化修复，并且使用虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase)(Roche Applied Science,Manheim,Germany)去磷酸化。将平端DNA片段根据制造商的说明书克隆至pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，通过电穿孔转化至电感受态大肠杆菌TOP10细胞，并且铺板至补充有每ml 100μg氨苄青霉素的LB平板。电穿孔产生了15,300个克隆。
实施例3：巴西青霉β-葡糖苷酶的纯化
将巴西青霉菌株IBT 20888培养在5升生物反应器中的4升Mandels和Weber培养基(Mandels和Weber,1969，见上文)中，所述培养基每升补充有1g酵母提取物、3g细菌用蛋白胨、30g纤维素和10g木聚糖。根据Carlsen,1994，见上文，使孢子在稻上增殖。以1×106个孢子每ml接种生物反应器。通过添加2M NH4OH或2M HCl将pH保持在5.0。将温度保持在30℃。通气是每分钟4升和300-500rpm。111小时之后，将培养终止，并且将培养液通过玻璃纤维滤器(GD 120,Advantec,Japan)过滤。
在室温在50mM柠檬酸钠pH 4.8中测量β-葡糖苷酶活性。底物是在50mM柠檬酸钠pH 4.8中的1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡糖苷。β-葡糖苷酶水解在4-硝基苯酚和葡萄糖之间的葡糖苷配基键(agluconic bond)。释放的4-硝基苯酚在碱性溶液中呈黄色，并且能够以分光光度计在405nm测定。将一国际单位的活性(U)定义为在pH 4.8、25℃每分钟释放1微摩尔4-硝基苯酚的酶量。
用SDS-PAGE测定蛋白浓度。将15μl样品添加至Eppendorf管中15μl的SDS-PAGE样品缓冲液(1.17M蔗糖、1M Tris–HCL,pH 8.5、278mM SDS、2.05mM EDTA、0.88mM Brilliant Blue G和0.2M二硫苏糖醇)，并且加热至70℃，持续10分钟。在加热之后，将稀释的样品加样至预制的4-12％Bis-Tris预制凝胶(pre-cast gel)(Invitrogen,Groningen,The Netherlands)。另外，将Mark 12蛋白标准混合物(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)加样至所述凝胶。
在Xcell SureLockTM凝胶设备(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中在200V跑胶50分钟。电泳缓冲液由标准缓冲液(1M MOPS、1M TRIS和1％SDS)的20倍稀释液制成。将0.5ml体积的Antioxidant(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)添加至上部(阴极)缓冲液槽(buffer chamber)。在电泳之后，将凝胶在染色溶液中温育60分钟，所述染色溶液由溶解于10％乙酸、40％甲醇和50％H2O中的0.1％(重量/体积)Coomassie Brilliant Blue(考马斯亮蓝)R-250组成。凝胶的脱色在10％乙酸、30％甲醇和60％H2O中进行。
在纯化之前，使用配有10kDa截留(cut-off)的PM10膜的Amicon超滤单元(Millipore,Bedford,MA,USA)将滤液浓缩并且将缓冲液交换成20mM三乙醇胺(TEA)-HCl pH 7.5。在室温使用FPLC系统进行酶纯化(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。在各纯化步骤之间，使用10kDa截留的3.5ml Microsep超滤单元(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI,USA)或Amicon超滤单元，将汇集级分中的缓冲液交换成样品缓冲液。在280nm监控β-葡糖苷酶的洗脱。
将存留物(retentate)(38.5ml)加样至填充有75ml Q Sepharose HP的XK26柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)上。用180ml样品缓冲液洗涤该柱。样品缓冲液是20mM TEA-HCl pH 7.5。用多至50％的梯度(在800ml的过程中)的含1M NaCl的20mM TEA-HCl pH 7.5将酶洗脱(The enzyme waseluted with a gradient up to 50％(over 800ml)of 20mM TEA-HCl pH 7.5with 1M NaCl)。收集10ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且汇集级分81至85。
将来自前述步骤的存留物(2.0ml)加样至Superdex 75 10/300GL柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)，使用含200mM NaCl的100mMNaCH3CO2pH 4.8作为样品缓冲液。用60ml的相同缓冲液洗脱酶。收集2ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分6至9。
使用10mM NaCH3CO2pH 4.8作为样品缓冲液，将来自Superdex 75步骤的存留物(14ml)加样至6ml RESOURCE Q柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。用30ml样品缓冲液洗涤该柱。用多至50％的梯度(在180ml的过程中)的500mM NaCH3CO2pH 4.8将酶洗脱。收集2ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分49至61。
使用10mM NaCH3CO2pH 4.8作为样品缓冲液，将来自RESOURCE Q步骤的存留物(12ml)加样至另一个6ml RESOURCE Q柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。用30ml样品缓冲液洗涤该柱。用多至50％的梯度(在300ml的过程中)的500mM NaCH3CO2pH 4.8将酶洗脱。收集2ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分63至67。
使用10mM NaCH3CO2pH 4.0作为样品缓冲液，将来自RESOURCE Q步骤的存留物(10.5ml)加样至10ml Source S柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。用31.5ml样品缓冲液洗涤该柱。用多至15％的梯度(在120ml的过程中)的1M NaCH3CO2pH 4.0，其后再用15％至100％的梯度(在90ml的过程中)的1M NaCH3CO2pH 4.0将酶洗脱。收集2ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分93至107。
使用含200mM NaCl的100mM NaCH3CO2pH 4.8作为样品缓冲液，将来自Source S步骤的存留物(2ml)加样至Superdex 200 H10/300GL柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。用50ml相同的缓冲液将酶洗脱。收集0.5ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分28至31。
使用1M(NH4)2SO4、50mM NaCH3CO2pH 4.8作为样品缓冲液，将来自Superdex 200步骤的存留物(8.0ml)加样至1ml Phenyl Sepharose HP柱(Amersham Bioscience,Uppsala,Sweden)。用17.0ml的样品缓冲液洗涤该柱。用多至100％的梯度(在70ml的过程中)的50mM NaCH3CO2pH 4.8将酶洗脱。收集0.5ml的级分，测定β-葡糖苷酶活性，并且基于比活性和纯度(SDS-PAGE)汇集级分73至78。
纯化的β-葡糖苷酶的SDS-PAGE显示仅在大约115kDa的一条带。使用IEF凝胶、pH 3-9和pIs 3.5–9.3的标准混合物(standard mix)，用PharmaciaPhastSystem进行等电聚焦。通过用于PhastGel IEF介质的银方法将凝胶染色。测定等电点为大约3.9。
实施例4：N-末端测序
将纯化的巴西青霉β-葡糖苷酶(实施例3)的100μl等分试样添加至Eppendorf管中100μl的SDS-PAGE样品缓冲液(4ml 0.5M TRIS–HCl pH 6.8，20ml 10％SDS，20ml甘油(87％)，56ml Milli Q滤过的H2O和15粒(grains)的溴酚蓝)，并且加热至95℃持续4分钟。在加热之后，将稀释样品的四个20μl等分试样分别加至预制4-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。除了四个含有样品的泳道之外，另有一个Mark 12蛋白标准混合物。
在Xcell SureLockTM凝胶设备中跑胶90分钟，初始功率为40mA，最高135V。在电泳之后，将凝胶在印迹溶液中温育5分钟，所述印迹溶液由含有6％甲醇的10mM CAPS pH 11组成。将ProBlott膜(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)在纯甲醇中润湿1分钟，之后置于印迹溶液中5分钟从而用含有6％甲醇的10mM CAPS pH 11将膜饱和。
如下在Semi Dry Blotter II装置(KemEnTec,Copenhagen,Denmark)中进行电印迹。将六张在印迹溶液中润湿的Whatman no.1纸置于印迹设备的阳极，接着是ProBlott膜、聚丙烯酰胺凝胶和六张用印迹溶液润湿的Whatman no.1纸。放置阴极使其与上层(upper stack)的Whatman no.1纸接触，由此装配印迹装置。将11.3kg的重量置于所述印迹设备顶部。在175mA的电流进行电印迹180分钟。
在电印迹之后，在溶解于60％甲醇、1％乙酸、39％H2O中的0.1％(重量/体积)Coomassie Brilliant Blue R-250中将ProBlott膜染色1分钟。ProBlott膜的脱色在40％含水甲醇中进行5分钟，之后在去离子水中清洗该膜。最后将ProBlott膜风干。
对于N-末端氨基酸测序，将两片由115kDa条带组成的ProBlott膜切下并且置于Applied Biosystems Procise Protein Sequencer(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)的印迹盒(blotting cartridge)中。根据制造商的说明书使用PVDF膜样品(Pulsed liquid PVDF)的方法运行文件(method run file)来进行N-末端测序。
通过将层析图中峰的保留时间与标准层析图中PTH-氨基酸的保留时间进行比较，从所得层析图推断N-末端氨基酸序列。
使用Procise 494HT Sequencing System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)直接测定纯化巴西青霉β-葡糖苷酶的N-末端氨基酸序列。测定的N-末端序列是Ala-Ile-Glu-Ser-Phe-Ser-Glu-Pro-Phe-Tyr-Pro-Ser-X-X-Met-Asn(SEQ ID NO:2的氨基酸37至52)。X定义为未确定的氨基酸残基。
实施例5：PCR扩增
基于纯化巴西青霉β-葡糖苷酶的N-末端氨基酸序列(实施例4)，使用CODEHOP策略(Rose等,1998,Nucleic Acids Res.26:1628-35)设计如下所示的正向引物。使用CODEHOP策略，从其它β-葡糖苷酶的数据库信息来设计如下所示的反向引物。
正向引物：
5'-GCGCTATCGAGTCTTTCTCTGARCCNTTYTA-3'(SEQ ID NO:3)
反向引物：
5'-GTCGGTCATGACGAAGCCNKGRAANCC-3'(SEQ ID NO:4)
其中R＝A或G，Y＝C或T，K＝G或T而N＝A、C、G或T
使用大约1μg的巴西青霉基因组DNA作为模板制备扩增反应物(30μl)。此外，每个反应含有以下成分：正向引物30pmol，反向引物30pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM，1X AmpliTaq聚合酶缓冲液(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)和0.5单位的AmpliTaq聚合酶(5.0U/μl，Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。将反应在Robocycler(Stratagene,La Jolla,CA,USA)中温育，程序为：96℃3分钟和72℃3分钟的1个循环；95℃0.5分钟、56℃0.5分钟和72℃1.5分钟的34个循环；72℃7分钟的1个循环；和6℃的保温循环(soak cycle)。在第一个循环中在72℃添加Taq聚合酶。
使用TAE缓冲液在2％琼脂糖凝胶(Amresco,Solon,OH,USA)上分离PCR反应产物。从凝胶上切下大约840bp的条带并且使用MiniEluteTM GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)根据制造商的说明书来纯化。其后根据制造商的说明书将纯化的PCR产物克隆到pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中以产生名为pCR2.1GH3A(图2)的载体，并且通过DNA测序分析来确认其与家族3糖基水解酶一致。
实施例6：筛选基因组文库
进行菌落转移检测(colony lift)(Maniatis等,1982,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York)，并且将DNA在80℃交联至Hybond N+膜(Amersham,Arlington Heights,IL)上2小时。使用0.2X SSC(0.03M NaCl、0.003M柠檬酸钠)、0.2％SDS将来自菌落转移检测的膜预润湿。将预润湿的滤纸(filter)置于68℃摇动水浴中的具有每张滤纸7.5ml杂交溶液(6X SSPE[0.9M NaCl、0.06M NaH2PO4和6mMEDTA]、7％SDS)的烧杯中0.5小时。使用与载体同源的如下所示引物通过PCR扩增从pCR2.1GH3A扩增实施例5中描述的PCR扩增的亚克隆产物。
5'-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTA-3'(SEQ ID NO:5)
5'-ATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGAT-3'(SEQ ID NO:6)
使用大约50ng pCR2.1GH3A作为模板制备扩增反应物(30μl)。此外，每个反应含有以下成分：每种引物50pmol，1X Taq缓冲液(New England Biolabs,Beverly,MA)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各15pmol，和0.5单位的Taq DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)。将反应在Robocycler中温育，程序为：94℃1分钟的1个循环；和94℃30秒、55℃60秒和72℃1分钟的20个循环。之后将加热块转入4℃保温循环。使用TAE缓冲液将反应产物在2.0％琼脂糖凝胶上分离，将1kb产物条带从所述凝胶上切离并且使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)根据制造商的说明书纯化。
使用Stratagene Prime-It II Kit(Stratagene,La Jolla,CA,USA)根据制造商的说明随机引物标记大约40ng。使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)从未并入的核苷酸分离放射标记的基因片段。
通过添加5.0M NaOH至终浓度0.5M使放射性探针变性，并且将所述探针以大约0.5x 106cpm每ml杂交溶液的活性添加至杂交溶液。将混合物在摇动水浴中在68℃温育10小时。温育之后，在68℃在0.2X SSC、0.2％SDS中将膜洗涤三次。其后将膜在印迹纸上干燥15分钟，卷入SaranWrapTM，并且在-80℃过夜曝露于带有增感屏的X-射线片(Kodak,Rochester,NY,USA)。
将产生与探针杂交信号的菌落接种至1ml LB培养基中，所述培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素，并且在37℃培养过夜。制备各溶液的稀释液，并且将100μl铺板至补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。选择使各产生大约40菌落每平板的阳性样品的稀释物用于二次转移检测。如上制备、杂交和探测(probe)所述转移检测物。将每个阳性平板中的两个菌落接种至3ml补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并且在37℃培养过夜。
使用Bio Robot 9600(QIAGEN Inc,Valencia,CA,USA)根据制造商的规程从每个菌落制备小量制备的(miniprep)DNA。通过EcoRI消化和琼脂糖凝胶电泳测定每个插入序列(insert)的大小。命名为AB1和AB2的两个克隆各含有大约4.5kb的插入序列。测序揭示所述克隆是同一的，并且在下文将它们称作pKKAB(图3)。
实施例7：表征编码β-葡糖苷酶的巴西青霉基因组序列
使用具有染料终止剂化学的引物步移技术(primer walking technique)(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods 38:47-60)，用Applied Biosystems Model3700Automated DNA Sequencer(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行来自pKKAB的巴西青霉β-葡糖苷酶基因的DNA测序。
基因组编码序列(SEQ ID NO:1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图1A和1B。2751bp的基因组编码序列(包括终止密码子)编码计算分子量为96,725Da的878个氨基酸的多肽，所述编码序列被两个57bp(85-141bp)和57bp(312-368bp)的内含子中断。基因的％G+C含量是51.9％，并且成熟蛋白编码区(SEQ ID NO:1的核苷酸171至2753)的％G+C含量是52％。使用SignalP软件程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)预测了19个残基的信号肽。基于β-葡糖苷酶的N-末端序列，残基20至36似乎组成在成熟期间以蛋白水解的方式切割的前肽区。预测的成熟蛋白含有842个氨基酸。
用FASTA程序包3.4版(Pearson和D.J.Lipman,1988,PNAS 85:2444,和Pearson,1990,Methods in Enzymology 183:63)使用默认参数进行在公开数据库中的相似序列搜索。将得自所述程序包的Smith-Waterman算法(Waterman等,1976,Adv.Math.20:367)的配对比对用于测定百分比同一性。默认参数包括缺口开启罚分-12，缺口延伸罚分-2和BLOSUM50比较矩阵。比对显示编码具有β-葡糖苷酶活性的GH3A多肽的巴西青霉基因的推定的氨基酸序列与粗糙脉孢菌假设蛋白(登录号Q7RWP2)的推定的氨基酸序列共享63.8％同一性(包括缺口)，而与Aspergillus cellulolyticus的表征的糖基水解酶家族3 β-葡糖苷酶(登录号ABB07868)共享61.8％同一性。
将含有质粒pKKAB的大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)以NRRL B-30860保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center,1815University Street,Peoria,Illinois,61604)，保藏日为2005年7月8日。
实施例8：构建米曲霉β-葡糖苷酶表达质粒
曲霉属表达质粒pJaL721(WO 03/008575)由表达盒组成，所述表达盒基于黑曲霉中性淀粉酶II启动子，其融合至构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列(NA2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在来自构巢曲霉的选择标记amdS，其允许以乙酰胺作为唯一氮源生长；和来自酿酒酵母的URA3标记，其使得pyrF缺陷的大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)能够生长。使用酿酒酵母URA3基因作为选择标记如下所述进行大肠杆菌DB6507的转化。
通过Mandel和Higa,1970,J.Mol.Biol.45:154的方法将大肠杆菌DB6507制成感受态。在固体M9培养基(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)上选择转化体，所述培养基每升补充有1g酪蛋白氨基酸(casaminoacids)、500μg硫胺素和10mg卡那霉素。
将β-葡糖苷酶基因如下所述克隆至pJaL721中。使用以下两种寡核苷酸引物通过PCR从巴西青霉扩增β-葡糖苷酶基因：
正向PCR：
5’-AATTTGATCACACCATGCAGGGTTCTACAATCTTTCTGCC-3’(SEQ ID NO:7)
反向PCR：
5’-TTAACTCGAGTTACTCCAATTGTGAGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO:8)
为了促进克隆，将限制酶位点插入各引物的5’端，其中正向引物含有BclI位点，而反向引物含有XhoI位点。
在所述PCR反应中使用AB克隆(实施例6)作为模板。反应在含有1.0单位Phusion(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)、1X Phusion缓冲液HF(FinnzymesOy,Espoo,Finland)、25ng克隆AB、dNTP每种250μM和如上所述两种引物各50pmol的50μl体积中进行。扩增在PTC-220DNA Engine Dyad PeltierThermal Cycler(MJ Research,Inc.,Waltham,MA,USA)中进行，程序为：95℃5分钟的1个循环；94℃0.5分钟、58℃0.5分钟和68℃4.0分钟的24个循环；和68℃15分钟的1个循环。使用热启动PCR技术(Chou等,1992,NucleicAcids Res.20:1717)，并且在第一循环进行1分钟之后添加Phusion聚合酶。
PCR反应产生长度为大约2700bp的单一DNA片段。将所述片段用BclI和XhoI消化，并且通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，并克隆至用BamHI和XhoI消化的pJaL721中，产生的质粒命名为pKBK01(图4)。通过DNA测序确认pKBK01中β-葡糖苷酶基因的序列。
实施例9：巴西青霉β-葡糖苷酶在米曲霉中的表达
用5μg的pKBK01如Christensen等,1988,Biotechnology 6:1419-1422所述转化米曲霉BECh2(WO 00/30322)。
将转化体在50ml试管中10ml的YPM培养基中在30℃培养4天。将全部培养液在12,100x g离心并且移出上清。使用Criterion XT Precast Gel，XTMES缓冲液中的10％Bis-Tris凝胶(BioRad Laboratories,Hercules,CA,USA)根据制造商的说明书通过SDS-PAGE分析上清。将10μl体积的上清与9μl样品缓冲液(0.125M Tris-HCl pH 6.8，20％甘油和4.6％SDS)和1μl 1M二硫苏糖醇混合，并且加热至96℃持续5分钟。在28个上清的8个中，通过SDS-PAGE在标准35kDa至150kDa的范围能够看到大约115kDa的一个条带。产生大约115kDa条带的上清还包含β-葡糖苷酶活性，如实施例3中测定。条带的强度越高，在相同上清中测量的β-葡糖苷酶活性越高。
将一个转化体命名为米曲霉KBK01。
实施例10：产生和纯化重组巴西青霉β-葡糖苷酶
在生物反应器中将米曲霉转化体KBK01在培养基中培养24小时，每升所述培养基由下述组成：60g蔗糖、10g MgSO4·H2O、10g KH2PO4、15gK2SO4、20g柠檬酸、50g酵母提取物、0.5ml痕量金属和1ml聚氧丙烯酸(pluronic acid)。所述痕量金属每升由下述组成：14.28g ZnSO4·7H2O、2.50gCuSO4·5H2O、2.5g NiCl2·6H2O、13.8g FeSO4·7H2O、8.5g MnSO4·H2O和3.0g柠檬酸。1天之后，将麦芽糖溶液进料至生物反应器，所述溶液每升由下述组成：350g 75％麦芽糖溶液、5g柠檬酸、10g酵母提取物、0.5ml痕量金属和5ml聚氧丙烯酸。5天之后终止培养。
通过离心和过滤将生物质从2.5升发酵液中去除。用去离子水使所得上清成为5升，并且在具有OS10C7210kDa膜的Filtron(Filtron,USA)上超滤。将所得1.2升体积调节至pH 8.5。
如实施例3所述测量β-葡糖苷酶活性。如实施例3所述测定蛋白质浓度。如实施例3所述进行SDS-PAGE分析。在280nm监测β-葡糖苷酶的洗脱。
将β-葡糖苷酶溶液加样至用25mM Tris pH 8.5预平衡的Q-Sepharose FastFlow柱(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)。用25mM Tris pH 8.5中0至1M的NaCl梯度(5个柱体积)洗脱β-葡糖苷酶。将含有β-葡糖苷酶的级分汇集成105ml的体积。
将来自Q-Sepharose步骤的汇集物的一部分(40ml)进一步在SephacrylS-200柱上纯化，所述柱在0.1M乙酸钠pH 6.0中预平衡。用体积为68ml的相同缓冲液洗脱β-葡糖苷酶。
从280nm的吸光度和由β-葡糖苷酶初级结构计算的消光系数测定蛋白质含量。
在纯化之后进行SDS-PAGE。将样品用等体积的2X样品缓冲液和1/5体积的1％PMSF煮沸2分钟，并且加样至Novex的4-20％Tris-甘氨酸凝胶上。将凝胶用GelCode Blue Stain Reagent染色，并且用水脱色。SDS-PAGE显示了一个大约115kDa的条带。
实施例11：表征纯化的重组巴西青霉β-葡糖苷酶
关于最适pH、最适温度、温度稳定性和底物特异性表征了实施例10中描述的纯化的重组巴西青霉β-葡糖苷酶。
最适pH和最适温度。在20℃至90℃的温度和3.0至8.0的pH值测量β-葡糖苷酶活性。在MilliQ水中稀释纯化的β-葡糖苷酶以保证测定中产生的4-硝基苯酚在标准曲线之内。底物是调节至pH 3.18、4.16、4.86、6.17的50mM柠檬酸钠中的1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷，和调节至pH 7.07和8.13的50mM碳酸钠中的1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷。将活性测量持续10分钟，并且用0.5M甘氨酸/NaOH pH 10及2mM EDTA终止反应。
图5显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同pH值的相对活性作为温度的函数。
图6显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同温度的相对活性作为pH的函数。
Novozym 188和巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的温度稳定性。在24小时期间，在温度20℃至67.5℃和pH值3至8测试巴西青霉β-葡糖苷酶和Novozym 188(Novozymes A/S,Denmark)的稳定性。将酶制备物在温育缓冲液中稀释2000倍。pH 3至pH 6的温育缓冲液包含调节至期望pH的10mM柠檬酸钠，而pH 7和pH 8的温育缓冲液包含调节至期望pH的10mM碳酸钠。在10分钟期间在室温测量残余活性。底物是调节至pH 4.80的50mM柠檬酸钠中的1mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷，并且用含有2mM EDTA的0.5M甘氨酸/NaOH pH 10终止反应。
图7显示在不同温度和pH温育24小时之后Novozym 188的残余活性(n＝2)。
图8显示在不同温度和pH温育24小时之后巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的残余活性(n＝3)。
在24小时的时间内，巴西青霉菌株IBT 20888的β-葡糖苷酶在高至60℃在pH 4至pH 6稳定。在24小时的时间内，Novozym 188在高至50℃在pH4和pH 5稳定，在高至40℃在pH 6稳定。
巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶的动力学参数。
底物是4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷。使用50mM柠檬酸钠pH 4.80中浓度为0.07-2mM的4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷来测量动力学参数。在室温测量活性2分钟，再用0.5M甘氨酸/NaOH pH 10及2mM EDTA终止反应，并且如实施例3中所述进行测量。
从四个独立的酶稀释物测定Michaelis-Menten常数km和最大反应速率。在测定动力学参数时将显示底物抑制的测量省略。从Lineweaver-Burk作图测定的参数是km＝0.077±0.021mM和Vmax＝78.2±7.2U/mg酶。使用Hanes作图测定参数产生小于1％的参数偏差。
图9显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同4-硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖浓度的初始反应速率。
底物是纤维二糖。使用50mM乙酸钠pH 4.80中浓度为0.08-10mM的纤维二糖测量动力学参数。在室温测量活性5分钟，并用0.5M甘氨酸/NaOH pH10及2mM EDTA终止反应，其后加热至65℃持续10分钟。随后用1M HCl将pH调节至pH 7.1，并且用Ecoline S+Glucose(DiaSys Diagnostics SystemsGmbH,Holzheim,Germany)测量。用非线性曲线拟合器(non-linear curve fitter)使用Marquardt-Levenberg算法(SigmaPlot 9.01,Systat Software,Inc.)来测定Michaelis-Menten参数。
测定了纤维二糖水解的Michaelis-Menten常数km和最大反应速率分别是1.58mM和28U/mg。将1单位定义为每分钟水解1微摩尔纤维二糖的酶量。
图10显示巴西青霉菌株IBT 20888 β-葡糖苷酶在不同纤维二糖浓度的初始反应速率。
生物材料的保藏
已经根据布达佩斯条约规定，将以下生物材料保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(农业研究培养物保藏中心),Northern Regional ResearchCenter,1815University Street,Peoria,Illinois,61604，并且个与以下登录号：
保藏物                登录号         保藏日期
大肠杆菌TOP10pKKAB    NRRL B-30860   2005年7月8日
该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
此处，本发明中所描述的和要求的并非是要用本文所公开的具体方面来限定范围，因为这些方面意欲作为本发明几个方面的说明。任何等价的方面意欲在本发明的范围之内。事实上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围之内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
本文引用了许多参考文献，其中公开的全部内容并入作为参考。

Claims (16)

1.具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组：
(a)多肽，其由与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成；
(b)多肽，其由在至少高严紧条件下与以下序列杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；
(c)多肽，其包含A-E-[ST]-[IV]-[KR]-G-[IM]-Q-[DS]-[ST]-G-V-[IV]-A；和
(d)变体，其包含保守取代、缺失和/或插入1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽；
其中所述多肽是青霉属(Penicillium)多肽；所述多肽优选为巴西青霉(Penicillium brasilianum)多肽；所述多肽更优选为巴西青霉IBT 20888多肽。
2.权利要求1的多肽，所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQID NO:2的成熟多肽组成；或由其具有β-葡糖苷酶活性的片段组成。
3.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸37至878。
4.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸171至2753。
5.权利要求1的多肽，所述多肽由质粒中包含的多核苷酸编码，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30860中。
6.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-5中任一项的多肽的核苷酸序列。
7.核酸构建体，其包含权利要求6的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列指导多肽在表达宿主中产生。
8.重组表达载体，其包含权利要求7的核酸构建体。
9.重组宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。
10.用于产生权利要求1-5中任一项的多肽的方法，其包括：(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。
11.用于产生亲本细胞突变体的方法，所述方法包括破坏或缺失编码权利要求1-5中任一项的多肽的核苷酸序列，其导致突变体与亲本细胞相比产生较少的所述多肽。
12.通过权利要求11的方法产生的突变细胞。
13.权利要求12的突变细胞，所述突变细胞还包含编码天然或异源蛋白质的基因。
14.用于产生蛋白质的方法，其包括：(a)在有益于蛋白质产生的条件下培养权利要求13的突变细胞；和(b)回收所述蛋白质。
15.用于产生权利要求1-5中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有益于多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。
16.转基因植物细胞，其已经使用多核苷酸转化，所述多核苷酸编码权利要求1-5中任一项的具有β-葡糖苷酶活性的多肽，所述植物细胞不属于植物品种。
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