BR112020023198A2 - processo para produção de um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para produção de um polipeptídeo por cultivo de um microrganismo de fungo filamentoso em biomassa contendo sacarose, em que a sacarose é primeiramente hidrolisada em condições ácidas para melhorar o crescimento global do microrganismo, o que também melhora o rendimento de enzima.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO". Campo

[0001] A presente invenção refere-se a um processo para produção de um polipeptídeo por cultivo de um microrganismo em biomassa contendo sacarose.

[0002] Nos últimos anos, leveduras e fungos têm se tornado opções atraentes para a expressão de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas, pois podem ser facilmente cultivados em larga escala em meios simples, o que permite baixos custos de produção.

[0003] Em particular, fungos filamentosos como Aspergillus e Trichoderma foram desenvolvidos como plataformas de expressão para triagem (screening) e produção. Sua capacidade de expressar enzimas nativas e heterólogas em níveis elevados, torna-os adequados para a produção de enzimas em grande escala.

[0004] Embora um número considerável de pesquisas tenha sido realizado sobre enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas e sua produção por fungos filamentosos, o alto custo das enzimas ainda restringe seu uso e comercialização em setores como o da bioenergia. Avanços na biotecnologia, como triagem e descoberta de novos microrganismos e enzimas, poderiam reduzir os custos de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. No entanto, além da otimização das próprias enzimas, a otimização do projeto de processo é uma ferramenta crucial para reduzir os custos gerais da produção de enzimas. Por exemplo, fontes comercialmente mais baratas de carboidratos e condições de fermentação modificadas poderiam levar a uma produção mais econômica de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. Por razões econômicas, é portanto, desejável incluir configurações de processo novas e inovadoras destinadas a reduzir os custos gerais de produção.

Sumário

[0005] Um objetivo da invenção é fornecer um processo de produção melhorado para enzimas, como enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. Em particular, o objetivo da invenção é fornecer um processo de produção melhorado de enzimas por fungos. Otimização e melhoria se baseiam no cultivo de um fungo usando uma biomassa contendo sacarose, mais em particular usando uma biomassa contendo sacarose tratada. Descrição detalhada

[0006] Ao longo do presente relatório e das reivindicações anexas, as palavras "compreendem" e "incluem" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras se destinam a transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente citados, onde o contexto permitir. Os artigos "um" e "uma" são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (ou seja, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais de um elemento. O termo "enzima", conforme usado neste documento, significa uma ou mais enzimas.

[0007] É aqui descrito um processo para a produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica por cultivo de um fungo filamentoso em condições que permitem a expressão da enzima, em que o processo compreende as etapas de (i) tratar uma biomassa contendo sacarose a uma temperatura de 50ºC a 180ºC e um pH de 1 a 5 por 0,5 a 90 minutos para produzir uma biomassa tratada, (ii) cultivar o fungo filamentoso usando a biomassa tratada como substrato em condições que levam à produção da enzima, e (iii) opcionalmente, recuperar o enzima. Em uma modalidade, "tratar uma biomassa contendo sacarose" pode ser interpretado como "incubar uma biomassa contendo sacarose".

[0008] Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é tratada a uma temperatura de 50ºC a 180ºC, de 55ºC a 175ºC, de 60ºC a 170ºC, de 65ºC a 165ºC, de 70ºC a 160ºC, de 75ºC a 155ºC, de 80ºC a 150ºC, de 85ºC a 145ºC, de 90ºC a 140ºC. Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é tratada a um pH de 1 a 5, um pH de 1,5 a 4,5, um pH de 2,0 a 4,0, um pH de 2,5 a 3,5. Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é tratada por 0,5 a 90 minutos, por 1 a 75 minutos, por 2 a 60 minutos, por 3 a 45 minutos, por 4 a 40 minutos, por 5 a 35 minutos, por 6 a 30 minutos. Qualquer uma das modalidades acima pode ser combinada nos processos aqui descritos.

[0009] Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é tratada com um ácido. Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é tratada com um ácido em combinação com qualquer uma das modalidades anteriores. Em uma modalidade, o ácido é selecionado no grupo que consiste em ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido nítrico e ácido cítrico.

[0010] Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose compreende de 10% - 80% de sacarose em peso seco, compreende de 20% - 70% de sacarose em peso seco, compreende de 30% - 60% de sacarose em peso seco, compreende de 40% - 50 % de sacarose em peso seco. Em uma modalidade, a biomassa contendo sacarose é selecionada no grupo que consiste em cana-de-açúcar, beterraba sacarina, melaço de cana, melaço de beterraba e sorgo doce.

[0011] Conforme descrito acima, o fungo filamentoso é cultivado usando a biomassa tratada como substrato em condições favoráveis à produção da enzima. "Propício para a produção da enzima", tal como aqui utilizado, significa um meio de crescimento e produção adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos,

uma temperatura adequada para crescimento e produção na faixa de 20°C a 60°C, um pH adequado para crescimento e produção na faixa de 3 a 6, um tempo de cultivo de 3 semanas ou menos.

[0012] O processo de produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica, conforme descrito neste documento, pode ser precedido por um processo de propagação do fungo filamentoso. A propagação pode incluir várias etapas em frascos de agitação, recipientes pequenos e recipientes grandes.

[0013] Em uma modalidade, o(s) recipiente(s) usado(s) no processo para produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica, conforme descrito neste documento, tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3. Em geral, o(s) recipiente(s) serão menores que 1000 m3.

[0014] Em uma modalidade, o fungo filamentoso é cultivado em uma cultura em batelada alimentada, uma cultura em batelada, uma cultura contínua ou qualquer combinação das mesmas. De preferência, o fungo é cultivado em uma cultura em batelada alimentada. Um especialista na técnica está bem ciente dos vários modos de cultivo e suas condições.

[0015] Em uma modalidade, a cultura é conduzida em condições aeróbicas. Uma pessoa versada na técnica está bem ciente dos projetos de fermentadores para cultivo aeróbico, como por exemplo tanques agitados e colunas de bolhas.

[0016] Em uma modalidade, a enzima é recuperada. A recuperação pode ocorrer durante e/ou após a expressão da enzima. Métodos para recuperar enzimas do fungo, do meio de cultura ou de ambos são conhecidos do especialista na técnica e incluem, mas não estão limitados a, remoção de biomassa, ultrafiltração e cromatografia.

[0017] Em outra modalidade, a enzima não é recuperada e faz parte de um caldo de fermentação integral. Em uma modalidade, a enzima está na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo. Um caldo de fermentação integral pode ser preparado cultivando fungos não recombinantes e/ou recombinantes. Em uma modalidade, o fungo é um fungo recombinante contendo um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo. Em uma modalidade, o fungo é um fungo recombinante contendo um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo, em que um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. Em uma modalidade, o fungo é um fungo não recombinante contendo um ou mais genes que são homólogos ao fungo. Em uma modalidade, o fungo é um fungo não recombinante contendo um ou mais genes que são homólogos ao fungo, em que o um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar o substrato celulósico. O caldo de fermentação integral pode incluir qualquer uma das enzimas ou qualquer combinação das mesmas.

[0018] De preferência, as células são mortas no caldo de fermentação integral. O caldo de fermentação integral pode conter ácido(s) orgânico(s) (usados para matar as células), células mortas e/ou restos de células e meio de cultura.

[0019] O fungo pode ser alterado para melhorar ou produzir as enzimas. Por exemplo, o fungo pode ser mutado por procedimentos clássicos de melhoria de cepas ou por técnicas de DNA recombinante. Portanto, os fungos aqui mencionados podem ser usados como tais para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir enzimas alteradas que podem incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases, ou seja, enzimas que não são produzidas originalmente por esse fungo.

De preferência, um fungo, mais preferivelmente um fungo filamentoso, é usado para produzir as enzimas.

As enzimas produzidas pelo fungo de acordo com os processos aqui descritos são preferivelmente enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas.

Vantajosamente, um fungo filamentoso termofílico ou termotolerante é usado.

Opcionalmente, é usado um indutor adicional que induz a expressão das enzimas pelo fungo.

Geralmente, os fungos são cultivados em um meio de cultura de células adequado para produção da enzima de interesse.

A enzima pode ser uma enzima capaz de hidrolisar um substrato celulósico.

Meios de cultura adequados são conhecidos na técnica.

O caldo de fermentação integral pode ser preparado cultivando os fungos até a fase estacionária e mantendo os fungos em condições de carbono limitantes por um período de tempo suficiente para expressar a enzima.

Uma vez que a enzima de interesse é secretada pelos fungos no meio de fermentação, o caldo de fermentação integral pode ser usado.

O caldo de fermentação integral pode conter fungos.

Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral inclui o conteúdo não fracionado dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação.

Tipicamente, o caldo de fermentação integral inclui o meio de cultura gasto e os restos celulares presentes após o fungo crescer até a saturação, incubado em condições de limitação de carbono para permitir a síntese de proteínas.

Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral inclui o meio de cultura de células exausto, enzimas extracelulares e fungos.

Em algumas modalidades, os fungos presentes no caldo de fermentação integral podem ser lisados, permeabilizados ou mortos usando métodos conhecidos na técnica para produzir um caldo de fermentação integral com células mortas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral é um caldo de fermentação integral de células mortas, em que o caldo de fermentação integral contendo as células do fungo estão lisadas ou mortas. Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos por tratamento químico e/ou de pH para gerar o caldo integral de células mortas de uma fermentação dos fungos. Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos por tratamento químico e/ou de pH e ajuste do pH da mistura de fermentação de células mortas a um pH adequado. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral inclui um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um sal do mesmo e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e / ou um sal do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo ou qualquer combinação dos mesmos e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal destes, ou qualquer combinação destes.

[0020] O termo "caldo de fermentação integral", tal como aqui utilizado, refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre nenhuma ou mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, caldos de fermentação integrais são produzidos quando as culturas microbianas são cultivadas até a saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção no meio de cultura de células. Tipicamente, o caldo de fermentação integral não é fracionado e compreende meio de cultura de células gasto, polipeptídeos extracelulares e células microbianas, de preferência não viáveis.

[0021] Se necessário, o caldo de fermentação integral pode ser fracionado e um ou mais dos conteúdos fracionados podem ser usados. Por exemplo, as células mortas e / ou fragmentos celulares podem ser removidos de um caldo de fermentação integral para fornecer uma composição que esteja livre desses componentes.

[0022] O caldo de fermentação integral pode compreender ainda um conservante e/ou agente antimicrobiano. Esses conservantes e/ou agentes são conhecidos na técnica.

[0023] O caldo de fermentação integral, conforme descrito neste documento, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, como células mortas, restos de células, componentes de meios de cultura e/ou enzima(s) insolúvel(l)(is). Em algumas modalidades, componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer um caldo de fermentação integral clarificado.

[0024] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com uma ou mais enzimas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com uma ou mais atividades enzimáticas que não são expressas endogenamente, ou expressas em um nível relativamente baixo pelos fungos, para melhorar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, em açúcares fermentáveis, como glicose ou xilose. A(s) enzima(s) suplementar(es) pode(m) ser adicionada(s) como suplemento ao caldo de fermentação integral e a(s) enzima(s) pode(m) ser um componente de um caldo de fermentação integral separado, ou podem ser purificadas, ou minimamente recuperadas e/ou purificadas.

[0025] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com pelo menos outro caldo de fermentação integral. O outro caldo de fermentação integral pode ser derivado do mesmo tipo de fungo ou de outro tipo de fungo.

[0026] Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternativamente, o caldo de fermentação integral pode consistir em uma mistura de um caldo de fermentação integral de um fungo não recombinante com um fungo recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas. Alternativamente, o caldo de fermentação integral pode consistir em uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo não recombinante com um fungo recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral consiste em um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo que superexpressa beta-glucosidase. Alternativamente, o caldo de fermentação integral pode consistir em uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo não recombinante e um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo recombinante que superexpressa uma beta-glucosidase.

[0027] Em uma modalidade o fungo filamentoso é selecionado do grupo de gêneros consistindo em Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix,

Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma e Trichophyton. Emu ma modalidade preferida o fungo filamentoso pertence ao gênero Rasamsonia, Penicillium, Trichoderma ou Aspergillus.

[0028] "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (definidas por Hawksworth et al., In, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi (Dicionário de Fungos de Bisby), 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Várias cepas de fungos filamentosos são prontamente acessíveis ao público em uma série de coleções de cultura, como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Coleção alemã de microorganismos e culturas celulares) GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (Escritório Central para cultura de fungos) (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Exemplos dessas cepas incluem Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS

455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 e derivados dos mesmos.

[0029] Rasamsonia é um novo gênero compreendendo espécies termotolerantes e termofílicas de Talaromyces e Geosmithia (J.

Houbraken et al., vida supra). Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al. propuseram transferir as espécies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora para Rasamsonia gen. nov. Fungos preferidos são Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus e Thermoascus aurantiacus, com Rasamsonia emersonii sendo o mais preferido. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados aqui intercambiavelmente.

[0030] Em uma modalidade, a enzima produzida pelos processos conforme descrito neste documento tem atividade de degradação de material de carboidrato e/ou de hidrólise de carboidrato. Em outras palavras, a enzima que é produzida pelo fungo tem atividade de degradação de material de carboidrato e / ou de hidrólise de carboidrato. Em outras palavras, a enzima é uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica.

[0031] Em uma modalidade, a enzima é nativa do fungo. Em outra modalidade, a enzima é heteróloga para o fungo. O termo "heterólogo", conforme aqui utilizado, refere-se a uma enzima que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Pode ser uma variante de uma enzima nativa, mas também pode ser uma enzima de outra espécie. Por exemplo, uma enzima de Rasamsonia, quando expressa por Aspergillus, é considerada heteróloga. Uma enzima de Rasamsonia emersonii, quando expressa por Rasamsonia byssochlamydoides, também é considerada heteróloga. Uma enzima de uma cepa Rasamsonia emersonii específica quando expressa por outra cepa Rasamsonia emersonii é, entretanto, considerada nativa. Quando um gene sintético é introduzido em uma cepa e esse gene codifica uma enzima que é idêntica à enzima nativa encontrada na cepa, a enzima codificada pelo gene sintético também é considerada nativa.

[0032] Em uma modalidade, o fungo está superexpressando a enzima. O fungo pode compreender mais de uma cópia de um polinucleotídeo que codifica a enzima nativa ou heteróloga. Normalmente, a enzima é uma celulase, hemicelulase e/ou pectinase.

[0033] Em uma modalidade, o fungo também pode produzir duas ou mais, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou até mais enzimas. Algumas enzimas podem ser nativas, enquanto outras são heterólogas. Em uma modalidade, o fungo produz pelo menos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter as mesmas atividades ou atividades diferentes. O fungo pode produzir uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de uma fonte diferente do fungo. Em outra modalidade, após produção pelo fungo, a enzima produzida pode ser combinada com uma ou mais outras enzimas. A combinação de enzimas pode então, por exemplo, ser usada em um processo para a produção de um produto de açúcar a partir de um material de carboidrato ou em um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material de carboidrato, conforme descrito neste documento.

[0034] Em uma modalidade, a enzima é selecionada do grupo que consiste em uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase, uma beta- glucosidase, uma beta-xilosidase, uma endoxilanase, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e qualquer combinação dos mesmos.

[0035] Tal como aqui utilizado, uma beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de resíduos β-D-glicose terminais não redutores com liberação de β-D- glicose. Esse polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-

D-glucosídeos e também pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: um β-D-galactosídeo, um α-L-arabinosídeo, um β-D-xilosídeo ou um β- D -fucosídeo. Esta enzima também pode ser referida como amigdalase, β-D-glucosídeo gluco-hidrolase, celobiase ou gentobiase.

[0036] Em uma modalidade, uma composição de enzima como aqui descrita compreende uma beta-glucosidase de Aspergillus, como Aspergillus oryzae, como a divulgada em WO 02/095014 ou a proteína de fusão com atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, como a divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, como uma divulgada em WO 2012/044915, como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 para numeração), ou Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ou Aspergillus kawachi. Em outra modalidade, a beta- glucosidase é derivada de Penicillium, como de Penicillium brasilianum divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2007/019442, ou de Trichoderma, tal como de Trichoderma reesei, como as descritas em US 6.022.725, US 6.982.159, US 7.045.332, US 7.005.289, US 2006/0258554, US 2004/0102619. Em uma modalidade, mesmo uma beta-glucosidase bacteriana pode ser usada. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ou Trichophaea saccata (WO 2007/019442). Em uma modalidade preferida, a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000886).

[0037] Tal como aqui utilizado, endoglucanases são enzimas que são capazes de catalisar a endo-hidrólise das ligações 1,4-β-D- glicosídicas em celulose, liquenina ou β-D-glucanos de cereais. Elas pertencem a EC 3.2.1.4 e também podem ser capazes de hidrolisar ligações 1,4 em β-D-glucanos também contendo ligações 1,3. Endoglucanases também podem ser referidas como celulases, avicelases, β-1,4-endoglucano hidrolases, β-1,4-glucanases, carboximetilcelulases, celudextrinases, endo-1,4-β-D-glucanases, endo-1,4 -β-D-glucano-hidrolases ou endo-1,4-β-glucanases.

[0038] Em uma modalidade, a endoglucanase compreende uma endoglucanase GH5 e / ou uma endoglucanase GH7. Isso significa que pelo menos uma das endoglucanases na composição enzimática é uma endoglucanase GH5 ou uma endoglucanase GH7. No caso de haver mais endoglucanases na composição enzimática, essas endoglucanases podem ser endoglucanases GH5, endoglucanases GH7 ou uma combinação de endoglucanases GH5 e endoglucanases GH7. Em uma modalidade preferida, a endoglucanase inclui uma endoglucanase GH5.

[0039] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende uma endoglucanase de Trichoderma, como Trichoderma reesei; de Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; de Aspergillus, como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii; de Erwinia, como Erwinia carotovara; de Fusarium, como Fusarium oxysporum; de Thielavia, como Thielavia terrestris; de Humicola, como Humicola grisea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Melanocarpus, como Melanocarpus albomyces; deNeurospora, como Neurospora crassa; de Myceliophthora, como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhinum, como Cladorrhinum foecundissimum; e/ou de Chrysosporium, como uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade preferida a endoglucanase é de Rasamsonia, como uma cepa de Rasamsonia emersonii (ver WO 01/70998). Em uma modalidade, mesmo uma endoglucanase bacteriana pode ser usada incluindo, mas não se limitando a, endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (ver WO

91/05039; WO 93/15186; US 5,275,944; WO 96/02551; US 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (ver WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (ver WO 05/093050).

[0040] Conforme usado aqui, uma celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glicosídicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose das extremidades das cadeias. Esta enzima também pode ser referida como celulase 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β-celobio- hidrolase, 1,4-β-D-glucano celobio-hidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D- glucanase, exocelobio-hidrolase ou exoglucanase.

[0041] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende uma celobio-hidrolase I de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como Cel7A CBH I divulgada em SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 6 em WO 2014/130812 ; de Trichoderma, como Trichoderma reesei; de Chaetomium, como Chaetomium thermophilum; de Talaromyces, como Talaromyces leycettanus ou de Penicillium, como Penicillium emersonii. Em uma concretização preferida, a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase I de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/122141).

[0042] Em uma modalidade, uma composição enzimática como aqui descrita compreende uma celobio-hidrolase II de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como aquela em SEQ ID NO: 7 em WO 2014/130812 ou de Trichoderma, como Trichoderma reesei, ou de Talaromyces, como Talaromyces leycettanus, ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como celobio-hidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris. Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma celobio-hidrolase II de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2011/098580).

[0043] Conforme usado aqui, monoxigenases líticas de polissacarídeos são enzimas que foram recentemente classificadas por CAZy na família AA9 (Auxiliary Activity Family 9 -Família de Atividade Auxiliar 9) ou família AA10 (Família de Atividade Auxiliar 10). Portanto, existem monoxigenases líticas de polissacarídeos AA9 e monoxigenases líticas de polissacarídeos AA10. As monoxigenases líticas de polissacarídeos são capazes de abrir uma estrutura cristalina de glucano e aumentar a ação das celulases sobre substratos de lignocelulose. São enzimas que aumentam a atividade celulolítica. Monoxigenases líticas de polissacarídeos também podem afetar os celo-oligossacarídeos. De acordo com a literatura mais recente, (ver Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, p. 2632- 2642), proteínas denominadas GH61 (glicosídeo hidrolase família 61 ou às vezes referidas como EGIV) são monoxigenases líticas de polissacarídeos. GH61 foi originalmente classificada como endoglucanase com base na medição da atividade de endo-1,4-β-d- glucanase muito fraca em um membro da família, mas foi recentemente reclassificada por CAZy na família AA9. CBM33 (módulo de ligação a carboidratos da família 33) também é uma monoxigenase lítica de polissacarídeo (ver Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). CAZy reclassificou recentemente CBM33 na família AA10.

[0044] Em uma modalidade, a monoxigenase lítica de polissacarídeo compreende uma monoxigenase lítica de polissacarídeo AA9. Isto significa que pelo menos uma das monoxigenases líticas de polissacarídeo na composição enzimática e/ou pelo menos uma das monoxigenases líticas de polissacarídeo adicionais é uma monoxigenase lítica de polissacarídeo AA9. Em uma modalidade, todas as monoxigenases líticas de polissacarídeo na composição enzimática e/ou todas as monoxigenases líticas de polissacarídeo adicionais são monoxigenases líticas de polissacarídeo AA9.

[0045] Em uma modalidade, a composição de enzima compreende uma monoxigenase lítica de polissacarídeo de Thermoascus, como Thermoascus aurantiacus, como o descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1 em WO2014/130812 e em WO 2010/065830; ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como a descrita em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 4 em WO2014/130812 e em WO 2008/148131 e WO 2011/035027; ou de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, tal como o descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 em WO2014/130812; ou de Penicillium, como Penicillium emersonii, como o divulgado como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 2 em WO2014/130812. Outras monoxigenases líticas de polissacarídeos adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Trichoderma reesei (ver WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (ver WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/005867), Thermoascus sp. (ver WO 2011/039319) e Thermoascus crustaceous (ver WO 2011/041504). Outras enzimas celulolíticas que podem estar compreendidas na composição enzimática são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2,007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5 457 046, US 5 648 263, e US 5 686 593, para citar apenas algumas. Em uma modalidade preferida, a monoxigenase lítica de polissacarídeo é de Rasamsonia, por exemplo, de Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000892).

[0046] Conforme usado aqui, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosídicas em xilanos. Esta enzima também pode ser referida como endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D-xilano-hidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar ligações 1,4 xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.

[0047] Em uma modalidade, a endoxilanase compreende uma xilanase GH10. Isso significa que pelo menos uma das endoxilanases na composição enzimática é uma xilanase GH10. Em uma modalidade, todas as endoxilanases na composição enzimática são xilanases GH10.

[0048] Em uma modalidade, uma composição de enzima como aqui descrita compreende uma endoxilanase de Aspergillus aculeatus (ver WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (ver WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/041405), Penicillium sp (ver WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/079210), Talaromyces leycettanus, Thermobifida fusca ou Trichophaea saccata GH10 (ver WO 2011/057083). Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma endoxilanase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 02/24926).

[0049] Tal como aqui utilizado, beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) são polipeptídeos que são capazes de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D- xilanos, para remover sucessivos resíduos de D-xilose dos terminais não redutores. Beta-xilosidases também podem hidrolisar xilobiose. Beta-xilosidase também pode ser referida como xilano 1,4-β- xilosidase, 1,4-β-D-xilano xilo-hidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

[0050] Em uma modalidade, a beta-xilosidase compreende uma GH3 beta-xilosidase. Isso significa que pelo menos uma das beta- xilosidases na composição da enzima é uma GH3 beta-xilosidase. Em uma modalidade, todas as beta-xilosidases na composição enzimática são GH3 beta-xilosidases.

[0051] Em uma modalidade, uma composição de enzima como aqui descrita compreende uma beta-xilosidase de Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferida, a composição enzimática compreende uma beta-xilosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2014/118360).

[0052] Em uma modalidade, a enzima aqui descrita também pode incluir uma ou mais das enzimas mencionadas abaixo.

[0053] Tal como aqui utilizado, uma β- (1,3)(1,4) -glucanase (EC

3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glicosídicas em β-D -glucanos contendo ligações 1,3 e 1,4. Esse polipeptídeo pode atuar sobre liquenina e β-D-glucanos de cereais, mas não sobre β-D-glucanos contendo apenas ligações 1,3 ou 1,4. Esta enzima também pode ser referida como liqueninase, 1,3- 1,4-β-D-glucano 4-glucanohidrolase, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou ligação mista β- glucanase. Uma alternativa a este tipo de enzima é EC 3.2.1.6, que é descrita como endo-1,3(4)- beta-glucanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3 ou 1,4 em beta-D-glucanase quando o resíduo de glicose cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada é ele próprio substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3(4) glucano-hidrolase. Substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glucanos de cereais.

[0054] Tal como aqui utilizado, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) - e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase. Exemplos de arabinofuranosidases que podem estar presentes na composição enzimática incluem, mas não estão limitadas a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (ver WO 2006/114094).

[0055] Tal como aqui utilizado, uma α-D-glucuronidase (EC

3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima também pode ser referida como alfa- glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Estas enzimas podem também hidrolisar o ácido glucurônico 4-O-metilado, que também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC

3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosila. Exemplos de alfa- glucuronidases que podem estar contidas na composição enzimática incluem, mas não estão limitadas a, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (ver WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (ver WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.

[0056] Tal como aqui utilizado, uma acetil-xilano esterase (EC

3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila ou acetato de p- nitrofenila, mas, tipicamente, não de triacetilglicerol. Esse polipeptídeo normalmente não atua sobre manana ou pectina acetiladas. Exemplos de acetilxilano esterases que podem estar contidas na composição de enzima incluem, mas não estão limitadas a, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (ver WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (ver WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (ver WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/042846). Em uma modalidade preferida, a composição de enzima compreende uma acetil xilano esterase de Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/000888).

[0057] Conforme usado aqui, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H2O = ferulado + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode tipicamente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) de um açúcar esterificado, que geralmente é arabinose em substratos "naturais". Acetato de p-nitrofenol e ferulato de metila são, tipicamente, substratos mais pobres. Esta enzima também pode ser referida como cinamoil éster hidrolase, ácido ferúlico esterase ou hidroxicinamoil esterase. Também pode ser referida como uma enzima acessória hemicelulase, uma vez que pode ajudar xilanases e pectinases a quebrar hemicelulose e pectina da parede celular vegetal. Exemplos de feruloil esterases (esterases de ácido ferúlico) que podem estar contidas na composição de enzima incluem, mas não estão limitados a, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (ver WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[0058] Tal como aqui utilizado, uma cumaroil esterase (EC

3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Esta enzima também pode ser referida como trans-4- cumaroil esterase, trans-p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou ácido p-cumárico esterase. Esta enzima também se enquadra na EC

3.1.1.73, então também pode ser referida como feruloil esterase.

[0059] Tal como aqui utilizado, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose terminais não redutores em α-D- galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Esse polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar α-D-fucosídeos. Esta enzima também pode ser referida como melibiase.

[0060] Tal como aqui utilizado, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de resíduos β-D-galactose não redutores terminais em β-D-galactosídeos. Esse polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar α-L- arabinosídeos. Esta enzima também pode ser referida como exo- (1-> 4) -β-D-galactanase ou lactase.

[0061] Tal como aqui utilizado, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D-manosídicas em mananas, galactomananas e glucomananas. Esta enzima também pode ser referida como manan endo-1,4-β-manosidase ou endo-1,4-mananase.

[0062] Tal como aqui utilizado, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos β-D-manose terminais não redutores em β-D-manosídeos. Esta enzima também pode ser referida como mananase ou manase.

[0063] Conforme usado aqui, uma endo-poligalacturonase (EC

3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-α-D-galactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos. Esta enzima também pode ser referida como poligalacturonase pectina despolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-α-1,4-galacturonídeo glicano-hidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli(1,4-α-D- galacturonida) glicano-hidrolase.

[0064] Como usado aqui, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, pectina desmetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectil-hidrolase.

[0065] Tal como aqui utilizado, uma endo-galactanase (EC

3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endo-hidrólise de ligações 1,4-β-D-galactosídicas em arabinogalactanos. A enzima também pode ser conhecida como arabinogalactan endo-1,4-β- galactosidase, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactan 4-β-D-galactano-hidrolase.

[0066] Tal como aqui utilizado, uma pectina acetil esterase é definida aqui como qualquer enzima que tem uma atividade de acetil esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de resíduos GalUA de pectina.

[0067] Tal como aqui utilizado, uma endo-pectina liase (EC

4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa do éster metílico de (1 4) -α-D-galacturonano para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-6-O-metil -α-D-galact-4- enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo- pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1 4) -6-O- metil-α-D-galacturonano liase.

[0068] Tal como aqui utilizado, uma pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de (1 4) - α-D-galacturonano para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-α- D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida por transeliminase poligalacturônica, ácido péctico transeliminase, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeliminase, ácido péctico liase, liase péctica, ácido α-1,4-D-endopoligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase (PGA liase), PPase-N, ácido endo-α-1,4-poligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase, pectina trans-eliminase, ácido poligalacturônico trans-eliminase ou (1 4)-α-D-galacturonano liase.

[0069] Tal como aqui utilizado, uma alfa ramnosidase (EC

3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de catalisar a hidrólise de resíduos terminais não redutores de α-L-ramnose em α-L- ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Esta enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L- ramnosidase N ou α-L-ramnosídeo ramnohidrolase.

[0070] Tal como aqui utilizado, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrolisar o ácido péctico da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como exo-poli-α-galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[0071] Tal como aqui utilizado, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-α-D-galacturonídeo)n + H2O = (1,4-α-D-galacturonídeo)n-1 + D-galacturonato. A enzima também pode ser conhecida como galacturano 1,4-α-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-D-

galacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli (1,4-α- D-galacturonídeo) galacturono-hidrolase.

[0072] Tal como aqui utilizado, exopoligalacturonato liase (EC

4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminativa de 4-(4-desóxi-α-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato a partir da extremidade redutora de pectato, isto é pectina desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, ácido exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalacturônico-trans-eliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou extremidade redutora de (14)-α-D- galacturonano- dissacarídeo-liase.

[0073] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre ácido galactosilurônico e ramnopiranosila de uma forma endo em estruturas estritamente alternadas de ramnogalacturonano, consistindo no dissacarídeo [(1,2-alfa-L-ramnoil-ácido (1,4)-alfa-galactosilurônico].

[0074] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptídeo que é capaz de clivar ligações α-L-Rhap-(14)- α-D-GalpA de modo endo em ramnogalacturonano por eliminação beta.

[0075] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da espinha dorsal de resíduos alternados de ramnose e ácido galacturônico em ramnogalacturonano.

[0076] Tal como aqui utilizado, ramnogalacturonano galacturono- hidrolase é qualquer polipeptídeo que seja capaz de hidrolisar ácido galacturônico a partir da extremidade não redutora de estruturas ramnogalacturonano estritamente alternadas de modo exo.

[0077] Tal como aqui utilizado, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que atua no xilogalacturonano por clivagem da espinha dorsal do ácido galacturônico substituído com β-xilose de modo endo. Esta enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonano hidrolase.

[0078] Tal como aqui utilizado, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que seja capaz de atuar sobre α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2) e/ou (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima também pode ser referida como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.

[0079] Como usado aqui, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar endo-hidrólise de ligações 1,5-α-arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabinase, arabinano endo- 1,5-α-L-arabinosidase, endo-1,5-α-L-arabinanase, endo-α-1,5- arabanase; endo-arabanase ou 1,5-α-L-arabinan 1,5-α-L-arabinano- hidrolase.

[0080] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções, como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4 e são adequadas para uso nos processos descritos neste documento. Alguns tipos específicos de proteases incluem cisteína proteases, incluindo pepsina, papaína e serina proteases, incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.

[0081] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídios, ácidos graxos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis e semelhantes. Em plantas, lipídios são usados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção por patógenos. Esses lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.

[0082] Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou quebrar a estrutura de polímeros de lignina. Enzimas que podem quebrar lignina incluem lignina peroxidases, manganês peroxidases, lacases e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica conhecidas por despolimerizar ou de outra forma quebrar polímeros de lignina. Também estão incluídas enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (principalmente arabinose) e lignina. Ligninases incluem, mas não estão limitadas ao seguinte grupo de enzimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês peroxidases (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).

[0083] “Hexosiltransferase” (2.4.1-) inclui enzimas que são capazes de catalisar uma reação de transferase, mas que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou produtos de degradação da celulose. Um exemplo de hexosiltransferase que pode ser usado é uma ß-glucanosiltransferase. Tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3) (1,4)glucano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.

[0084] “Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucuronosídeo, por exemplo, β-glucuronosídeo para produzir um álcool. Muitas glucuronidases foram caracterizadas e podem ser adequadas para uso, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil- dissulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β- glucuronidase (3.2 .1.128) ou α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[0085] As expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento das células vegetais. As expansinas têm sido propostas para romper as ligações de hidrogênio entre a celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Dessa forma, acredita-se que elas permitam o deslizamento das fibras de celulose e o alargamento da parede celular. A swollenina, uma proteína semelhante à expansina, contém um domínio da família 1 de módulo de ligação a carboidratos N-terminal (CBD) e um domínio semelhante à expansina C-terminal. Conforme descrito neste documento, uma proteína semelhante à expansina ou proteína semelhante à swollenina pode compreender um ou ambos desses domínios e/ou pode romper a estrutura das paredes celulares (como romper a estrutura de celulose), opcionalmente sem produzir quantidades detectáveis de açúcares redutores.

[0086] Uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cip1 ou cip2 ou genes semelhantes (ver Foreman et al., J. Biol. Chem. 278 (34), 31988-31997, 2003), uma proteína de integração de celulose/celulossoma, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cipA ou cipC, ou uma proteína escafoldina ou proteína semelhante à escafoldina. Proteínas escafoldinas e proteínas de integração à celulose são subunidades de integração multifuncionais que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multienzimático. Isso é conseguido pela interação de duas classes complementares de domínio, ou seja, um domínio de coesão na proteína escafoldina e um domínio de ancoragem em cada unidade enzimática. A subunidade escafoldina também carrega um módulo de ligação à celulose (CBM) que medeia a ligação do celulossoma ao seu substrato. Uma proteína escafoldina ou proteína de integração à celulose pode compreender um ou ambos os domínios.

[0087] Uma catalase; o termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: peróxido de hidrogênio oxidoredutase (EC 1.11.1.6 ou EC

1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogênio em oxigênio e duas moléculas de água. A atividade da catalase pode ser determinada monitorando a degradação do peróxido de hidrogênio a 240 nm com base na seguinte reação: 2H2O2 → 2H2O + O2. A reação é realizada em fosfato 50 mM pH 7,0 a 25°C com 10,3 mM de substrato (H2O2) e aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. A absorvância é monitorada espectrofotometricamente em 16-24 segundos, o que deve corresponder a uma redução da absorvância de 0,45 para 0,4. Uma unidade de atividade da catalase pode ser expressa como um micromol de H2O2 degradado por minuto a pH 7,0 e 25°C.

[0088] O termo "amilase", tal como aqui utilizado, significa enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,4-glicosídicas em amido, tanto em amilose quanto em amilopectina, como alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta- amilase (EC 3.2.1.2) , glucano 1,4-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.3), glucano 1,4-alfa-maltotetrao-hidrolase (EC 3.2.1.60), glucano 1,4-alfa- malto-hexaosidase (EC 3.2.1.98), glucano 1,4 -alfa-maltotrio-hidrolase (EC 3.2.1.116) e glucano 1,4-alfa-malto-hidrolase (EC 3.2.1.133), e enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,6-glicosídicas, sendo os pontos de ramificação na amilopectina, como pululanase (EC 3.2.1.41) e dextrinase-limite (EC 3.2.1.142).

[0089] As enzimas produzidas pelo fungo podem incluir um membro de cada uma das classes de enzimas mencionadas acima, vários membros de uma classe de enzimas ou qualquer combinação dessas classes de enzimas ou proteínas auxiliares (ou seja, aquelas proteínas mencionadas neste documento que não têm atividade enzimática per se , mas ainda assim ajudam na degradação da biomassa).

[0090] No processo de produção de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, conforme descrito neste documento, e no processo de produção de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato, como descrito neste documento, as enzimas descritas acima podem ser fornecidas concomitantemente (ou seja, em uma única composição de polipeptídeos) ou separadamente ou sequencialmente.

[0091] Aqui também é descrito um processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, o referido processo compreendendo as etapas de (a) produzir uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica cultivando um fungo filamentoso em condições que permitam a expressão da enzima, em que o processo compreende as etapas de (i) tratar uma biomassa contendo sacarose a uma temperatura de 50ºC a 180ºC e um pH de 1 a 5 por 0,5 a 90 minutos para produzir uma biomassa tratada, (ii) cultivar o fungo filamentoso usando a biomassa tratada como substrato em condições que conduzem à produção da enzima, e (iii) opcionalmente, recuperar a enzima, (b) hidrolisar enzimaticamente o material de carboidrato com a enzima para obter o produto de açúcar, e (c) opcionalmente, recuperar o produto de açúcar. Todas as características e modalidades descritas acima para o processo de produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica por cultivo de um fungo filamentoso em condições que permitem a expressão da enzima também se aplicam ao processo de produção de um produto de açúcar a partir de um material de carboidrato.

[0092] Em geral, na hidrólise enzimática, várias enzimas são usadas, isto é, várias enzimas com diferentes atividades celulolíticas são usadas. Estas enzimas podem ser qualquer uma das enzimas descritas acima ou qualquer combinação das mesmas. Podem ser produzidas pelo processo de produção de enzimas conforme descrito neste documento. O fungo pode produzir apenas uma dessas enzimas, mas também mais de uma, ou seja, duas, três, quatro ou até mais enzimas. Se nem todas as enzimas necessárias para a hidrólise enzimática forem produzidas pelo fungo, as enzimas restantes podem ser adicionadas após o cultivo. Elas também podem ser adicionados ao material de carboidrato durante a hidrólise enzimática.

[0093] Em uma modalidade, o material de carboidrato é material celulósico, em particular material lignocelulósico. Em uma modalidade, o material de carboidrato é submetido a pelo menos uma separação sólido/líquido antes ou durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o material de carboidrato é submetido a pré-tratamento e pelo menos uma separação sólido/líquido antes ou durante a hidrólise enzimática. Os métodos e condições da separação sólido/líquido dependerão do tipo de material de carboidrato usado e estão bem dentro do escopo do especialista na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, centrifugação, separação ciclônica, filtração, decantação, peneiração e sedimentação. Durante a separação sólido/líquido, podem ser usados meios e/ou auxiliares para melhorar a separação.

[0094] Em uma modalidade alternativa, quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas (conforme descrito em mais detalhes abaixo), o produto da etapa de liquefação pode ser usado na cultura do fungo. Isso pode ser feito com ou sem adição de material de carboidrato hidrolisado enzimaticamente. Naturalmente, também toda e qualquer combinação de parte do material de carboidrato hidrolisado enzimaticamente, parte do material de carboidrato pré-tratado, produto da etapa de liquefação e carbono externo e fonte de nutrientes podem ser usados na cultura do fungo.

[0095] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática compreende pelo menos uma etapa de liquefação em que o material de carboidrato e/ou o material de carboidrato pré-tratado é hidrolisado em pelo menos um primeiro recipiente e uma etapa de sacarificação em que o material liquefeito é hidrolisado no pelo menos primeiro recipiente e/ou em pelo menos um segundo recipiente. A sacarificação pode ser feita no mesmo recipiente que a liquefação (ou seja, no pelo menos primeiro recipiente), e também pode ser feita em um recipiente separado (ou seja, em pelo menos um segundo recipiente). Assim, na hidrólise enzimática, a liquefação e a sacarificação podem ser combinadas. Alternativamente, a liquefação e a sacarificação podem ser etapas separadas. Em uma modalidade, há uma separação sólido / líquido entre a liquefação e a sacarificação.

[0096] A hidrólise enzimática pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Isso também é válido quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação. A etapa de liquefação pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo e/ou a etapa de sacarificação pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Exemplos de recipientes a serem usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, recipientes agitados de batelada alimentada, recipientes agitados de batelada, recipientes agitados de fluxo contínuo com ultrafiltração e reatores de coluna de fluxo contínuo do tipo escoamento pistonado. A agitação pode ser feita por um ou mais impulsores, bombas e/ou misturadores estáticos.

[0097] Em uma modalidade, o material de carboidrato e/ou o material de carboidrato pré-tratado pode ser adicionado a um ou mais recipientes usados para a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, as enzimas utilizadas na hidrólise enzimática já estão presentes no um ou mais recipientes antes de o material de carboidrato e/ou o material lignocelulósico pré-tratado ser adicionado. Em outra modalidade, as enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas ao um ou mais recipientes. Em uma modalidade, o material de carboidrato e/ou o material de carboidrato pré-tratado já está presente em um ou mais recipientes antes das enzimas usadas na hidrólise enzimática serem adicionadas. Em uma modalidade, ambos os materiais, material de carboidrato e/ou material de carboidrato pré-tratado e as enzimas usadas na hidrólise enzimática são adicionados simultaneamente a um ou mais recipientes. As enzimas utilizadas na hidrólise enzimática podem ser uma composição aquosa. Este parágrafo também é válido quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação.

[0098] Em uma modalidade, o tempo total de hidrólise enzimática é de 10 a 300 horas, 20 a 250 horas, preferivelmente 30 a 200 horas, mais preferivelmente 40 a 150 horas.

[0099] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é feita a uma temperatura de 40ºC a 90ºC, de 45ºC a 80ºC, de 50ºC a 70ºC, de 55ºC a 65ºC.

[00100] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é realizada até 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 95% ou mais do açúcar disponível no material lignocelulósico ser liberado.

[00101] Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado durante pelo menos uma parte da hidrólise enzimática. O oxigênio pode ser adicionado de forma contínua ou descontínua durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado uma ou mais vezes durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, oxigênio pode ser adicionado antes da hidrólise enzimática, durante a adição de material de carboidrato a um recipiente usado para hidrólise enzimática, durante a adição de enzima a um recipiente usado para hidrólise enzimática, durante uma parte da hidrólise enzimática, durante toda a hidrólise enzimática ou qualquer combinação das mesmas. Oxigênio é adicionado a um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática.

[00102] O oxigênio pode ser adicionado de várias formas. Por exemplo, o oxigênio pode ser adicionado como gás oxigênio, gás enriquecido com oxigênio, como ar enriquecido com oxigênio, ou ar. Exemplos de como adicionar oxigênio incluem, mas não estão limitados a, adição de oxigênio por meio de borbulhamento, sopro, eletrólise, adição química de oxigênio, preenchimento de um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática a partir do topo (mergulhando o hidrolisado no tanque e, consequentemente, introduzindo oxigênio no hidrolisado) e adição de oxigênio ao espaço superior do(s) referido(s) um ou mais recipientes. Quando o oxigênio é adicionado ao espaço superior do(s) recipiente(s), pode ser fornecido oxigênio suficiente para a reação de hidrólise. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionada ao(s) recipiente(s) pode ser controlada e/ou variada. Restrição do oxigênio fornecido é possível adicionando oxigênio apenas durante parte do tempo da hidrólise no(s) referido(s) recipiente(s). Outra opção é adicionar oxigênio em baixa concentração, por exemplo, usando uma mistura de ar e ar reciclado (ar saindo do recipiente) ou “diluindo” o ar com um gás inerte. O aumento da quantidade de oxigênio adicionado pode ser alcançado pela adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo da hidrólise, adicionando o oxigênio em uma concentração mais alta ou adicionando mais ar. Outra forma de controlar a concentração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. Oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, soprado, no conteúdo do recipiente de hidrólise líquida de material de carboidrato. Ele também pode ser soprado no espaço superior do contêiner.

[00103] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado a um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática antes e/ou durante e/ou após a adição do material de carboidrato e/ou d material de carboidrato pré-tratado aos referidos um ou mais recipientes. O oxigênio pode ser introduzido junto com o material de carboidrato e/ou o material de carboidrato pré-tratado que entra no(s) recipiente(s) de hidrólise. O oxigênio pode ser introduzido no fluxo de material que entrará no(s) recipiente(s) ou com parte do conteúdo do(s) recipiente(s) que passa por um loop externa do(s) recipiente(s).

[00104] Em uma modalidade, o(s) recipiente(s) utilizado(s) na hidrólise enzimática têm um volume de pelo menos 1 m3. Preferivelmente, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3, pelo menos 2000 m3, pelo menos 2500 m3. Em geral, o(s) recipiente(es) serão menores que 3000 m3 ou 5000 m3. Em uma modalidade, a hidrólise enzimática do material de carboidrato é feita em um recipiente com um volume de 10 a 5000 m3.

[00105] No caso de serem utilizados vários recipientes na hidrólise enzimática, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente. No caso de a hidrólise enzimática incluir uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas, o(s) recipiente(s) usado(s) para a etapa de liquefação e o(s) recipiente(s)

usados para a etapa de sacarificação podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[00106] Em uma modalidade, hidrólise enzimática e fermentação podem ser etapas separadas, mas também podem ser combinadas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, hidrólise e fermentação separadas (separate hydrolysis and fermentation - SHF), sacarificação e fermentação simultâneas (simultaneous saccharification and fermentation - SSF), sacarificação e co-fermentação simultâneas (simultaneous saccharification and co-fermentation - SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (hybrid hydrolysis and fermentation - HHF), hidrólise e co-fermentação separadas (separate hydrolysis and co- fermentation - SHCF), hidrólise e co-fermentação híbridas (hybrid hydrolysis and co-fermentation HHCF), e conversão microbiana direta (direct microbial conversion - DMC), às vezes também chamada de bioprocessamento consolidado (consolidated bioprocessing - CBP).

[00107] Em uma modalidade, o material de carboidrato é material celulósico, em particular material lignocelulósico. O material de carboidrato adequado para uso nos processos conforme descrito neste documento inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem, como biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, entulhos de construção e demolição, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de quintal. Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, cana-de-açúcar, palha de cana-de-açúcar, bagaço de cana-de-açúcar, gramínea "switchgrass"(Panicum virgatum), Miscanthus, cana-de- açúcar, milho, resíduos de espigas de milho (corn stover), palha de milho, espigas de milho, fibra de milho, grãos de milho , caules de canola, caules de soja, sorgo doce, produtos e subprodutos da moagem de grãos como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moagem a seco), muitas vezes chamados de "farelo ou fibra",

grãos secos de destilaria, bem como resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de jardim. A biomassa também pode ser, mas não está limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel e resíduos de polpa de celulose e papel. "Biomassa agrícola" inclui ramos, arbustos, canas, milho e cascas de milho, culturas energéticas, florestas, frutas, flores, grãos, gramíneas, culturas herbáceas, folhas, cascas, agulhas, troncos, raízes, mudas, culturas lenhosas de rotação curta, arbustos , gramíneas "switchgrass"(Panicum virgatum), árvores, vegetais, cascas de frutas, vinhas, polpa de beterraba sacarina, sêmeas de trigo, cascas de aveia e madeiras duras e macias (não incluindo madeiras com materiais nocivos). Além disso, a biomassa agrícola inclui resíduos orgânicos gerados a partir de processos agrícolas, incluindo atividades agrícolas e florestais, especificamente incluindo resíduos de madeira florestal. Biomassa agrícola pode ser qualquer uma das acima mencionadas individualmente ou em qualquer combinação ou mistura das mesmas. A enzima usada no processo conforme descrito neste documento pode hidrolisar material de carboidrato de forma extremamente eficaz, por exemplo resíduos de espigas de milho, palha de trigo, palha de cana, fibra de milho e / ou bagaço de cana-de-açúcar, que pode então ser posteriormente convertido em um produto, como etanol, biogás, butanol, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de ração animal, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria-prima química. Além disso, produtos intermediários de um processo após hidrólise, por exemplo, ácido láctico como intermediário na produção de biogás, podem ser usados como bloco de construção para outros materiais.

[00108] Em uma modalidade, o material de carboidrato é pré-tratado antes e/ou durante a hidrólise enzimática. Métodos de pré-tratamento são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, calor, modificação mecânica, química, modificação biológica e qualquer combinação dos mesmos. O pré-tratamento é tipicamente realizado para aumentar a acessibilidade do material de carboidrato à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, no material de carboidrato. Em uma modalidade, o pré-tratamento compreende tratar o material de carboidrato com explosão de vapor, tratamento de água quente ou tratamento com ácido ou base diluída. Exemplos de métodos de pré- tratamento incluem, mas não se limitam a, tratamento com vapor (por exemplo, tratamento a 100-260ºC, a uma pressão de 7-45 bar, em pH neutro, por 1-10 minutos), tratamento com ácido diluído (por exemplo, tratamento com 0,1 a 5 % H2SO4 e/ou SO2 e/ou HNO3 e/ou HCl, na presença ou na ausência de vapor, a 120-200ºC, a uma pressão de 2- 15 bar, em pH ácido, por 2-30 minutos), tratamento com organosolv (por exemplo, tratamento com H2SO4 1 - 1,5% na presença de solvente orgânico e vapor, a 160-200ºC, a uma pressão de 7 a 30 bar, em pH ácido, por 30 a 60 minutos), tratamento com cal (por exemplo, tratamento com 0,1 - 2% NaOH / Ca (OH) 2 na presença de água/vapor a 60-160ºC, a uma pressão de 1-10 bar, em pH alcalino, por 60-4800 minutos), tratamento ARP (por exemplo, tratamento com 5 -15 % NH3, a 150-180ºC, a uma pressão de 9 a 17 bar, em pH alcalino, por 10-90 minutos), tratamento AFEX (por exemplo, tratamento com > 15% de NH3, a 60-140ºC, a uma pressão de 8 -20 bar, em pH alcalino, por 5-30 minutos).

[00109] O material de carboidrato pode ser lavado. Em uma modalidade, o material de carboidrato pode ser lavado antes e/ou após o pré-tratamento. A etapa de lavagem pode ser realizada antes e/ou após a separação sólido/líquido do material de carboidrato e/ou do material de carboidrato pré-tratado. Se realizada após a separação sólido/líquido, a fração sólida obtida após a separação sólido/líquido pode ser lavada. A etapa de lavagem pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem atuar como inibidores para a etapa de fermentação e/ou hidrólise. A etapa de lavagem pode ser conduzida de maneira conhecida pelo especialista. Além da lavagem, existem outros métodos de destoxificação. O material de carboidrato pré-tratado também pode ser destoxificado por qualquer (ou qualquer combinação) destes métodos que incluem, mas não estão limitados a, separação sólido/líquido, evaporação a vácuo, extração, adsorção, neutralização, overliming, adição de agentes redutores, adição de enzimas destoxificantes como lacases ou peroxidases, adição de microorganismos capazes de destoxificar hidrolisados.

[00110] O pH durante a hidrólise enzimática pode ser escolhido pelo especialista. Em uma modalidade, o pH durante a hidrólise pode ser de 3,0 a 6,4. Significativamente, um processo da invenção pode ser realizado usando altos níveis de matéria seca (do material de carboidrato) na reação de hidrólise. Em uma modalidade, o teor de matéria seca do material de carboidrato na hidrólise enzimática é de 10% - 40% (p/p), 11% - 35% (p/p), 12% - 30% (p/p), 13% - 29% (p/p), 14% - 28% (p/p), 15% - 27% (p/p), 16% - 26% (p/p), 17% - 25% (p/p).

[00111] Aqui também é descrito um processo para preparação de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato, cujo processo compreende as etapas de (a) produzir uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica cultivando um fungo filamentoso em condições que permitam a expressão da enzima, em que o processo compreende as etapas de (i) tratar uma biomassa contendo sacarose a uma temperatura de 50ºC a 180ºC e um pH de 1 a 5 por 0,5 a 90 minutos para produzir uma biomassa tratada, (ii) cultivar o fungo filamentoso usando a biomassa tratada como substrato em condições que conduzem à produção da enzima, e (iii) opcionalmente, recuperar a enzima, (b) hidrolisar enzimaticamente o material de carboidrato com a enzima para obter o produto de açúcar, (c) fermentar o produto de açúcar para produzir o produto de fermentação, e, opcionalmente, recuperar o produto de fermentação. Todas as características e modalidades descritas acima para o processo de produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica por cultivo de um fungo filamentoso em condições que permitam a expressão da enzima e todas as características e modalidades descritas acima para o processo de produção de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato também se aplicam ao processo de produção de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato. Em uma modalidade, a fermentação é feita por uma levedura.

[00112] Em uma modalidade, o(s) recipiente(s) usado(s) na etapa (c) tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3, pelo menos 2000 m3, pelo menos 2500 m3, pelo menos 3000 m3, pelo menos 3500 m3, pelo menos 4000 m3, pelo menos 4500 m3. Em geral, o(s) recipiente(s) serão menores que 5000 m3.

[00113] Em uma modalidade, a etapa de fermentação é realizada em um ou mais recipientes. A fermentação pode ser feita no (s) mesmo (s) recipiente (s) em que a hidrólise enzimática é realizada.

[00114] Em uma modalidade, a fermentação é uma etapa na qual um microrganismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo açúcar (es), por exemplo, glicose, L- arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo ou polímero de carboidrato compreendendo unidades de L-arabinose, xilose ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano e semelhantes. Para liberação de unidades de xilose ou glicose a partir de tais carboidratos, carboidrases apropriadas (tais como xilanases, glucanases, amilases e semelhantes) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional da utilização de fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que isso permite manter uma concentração (mai)s baixa de glicose livre durante a fermentação, por exemplo usando quantidades limitantes de taxa de carboidrases. Isso, por sua vez, evitará a repressão dos sistemas necessários para o metabolismo e o transporte de açúcares não-glicose, como a xilose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) como a glicose, de preferência simultaneamente, caso em que, preferivelmente, é utilizada uma célula hospedeira modificada que é insensível à repressão da glicose para prevenir o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá ainda o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. Composições de meios de fermentação para crescimento de microrganismos, como leveduras ou fungos filamentosos, são bem conhecidas na técnica.

[00115] O tempo de fermentação pode ser menor do que na fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática ainda tem que participar durante a fermentação. Em uma modalidade, o tempo de fermentação é de 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/l de glicose e outros açúcares correspondentes a partir do material lignocelulósico (por exemplo, 50 g/l de xilose, 35 g/l de L-arabinose e 10 g/l de galactose). Para composições de açúcar mais diluídas, o tempo de fermentação pode ser reduzido correspondentemente. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de etanol fica entre 10 e 50 horas para etanol feito de açúcares C6 e entre 20 e 100 horas para etanol feito de açúcares C5. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de ácido succínico fica entre 20 e 70 horas.

[00116] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbica ou anaeróbica. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferivelmente 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e onde as moléculas orgânicas atuam como doadoras e aceptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, NADH produzido na glicólise e formação de biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema, muitos microrganismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétron e hidrogênio, regenerando assim o NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbica preferido, piruvato é usado como um aceptor de elétron (e de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação, como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético,

ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina. Em uma modalidade preferida, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso, pois é mais barato do que processos aeróbicos: menos equipamento especial é necessário. Além disso, espera-se que processos anaeróbicos proporcionem um maior rendimento do produto do que processos aeróbicos. Em condições aeróbicas, geralmente o rendimento de biomassa é maior do que em condições anaeróbicas. Como consequência, geralmente em condições aeróbicas, o rendimento esperado do produto é menor do que em condições anaeróbicas.

[00117] Em outra modalidade, o processo de fermentação é realizado sob condições limitadas de oxigênio. Mais preferivelmente, o processo de fermentação é aeróbico e em condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação com limitação de oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, bem como pelas propriedades reais de mistura / transferência de massa do equipamento de fermentação usado. De preferência, em um processo sob condições de oxigênio limitado, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferivelmente de pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente de pelo menos 7 mmol/L/h.

[00118] O processo de fermentação é executado preferivelmente a uma temperatura que é ideal para a célula modificada. Assim, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura inferior a 42ºC, de preferência 38ºC ou inferior. Para leveduras ou células hospedeiras de fungos filamentosos, o processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura inferior a 35, 33, 30 ou 28ºC e a uma temperatura superior a 20, 22 ou 25ºC. Em uma modalidade, a etapa de fermentação de álcool e a etapa de fermentação de ácido orgânico são realizadas entre 25ºC e 35ºC

[00119] Em uma modalidade, as fermentações são realizadas com um microrganismo de fermentação, por exemplo uma levedura. Em uma modalidade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo, etanol) de açúcares C5 são realizadas com um microrganismo de fermentação C5. Em uma modalidade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo, etanol) de açúcares C6 são realizadas com um microrganismo de fermentação C5 ou um microrganismo de fermentação C6 comercial. Leveduras comercialmente disponíveis adequadas para a produção de etanol incluem, mas não estão limitadas a, BIOFERM™ AFT e XR (NABC — North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Fleischmann's Yeast, EUA), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia) e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EUA).

[00120] Em uma modalidade, o microrganismo produtor de álcool é um microrganismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5. De preferência, também é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6. Em uma modalidade, o pedido descreve um processo para preparação de etanol a partir de material de carboidrato, compreendendo as etapas de (a) realização de um processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato como descrito acima, (b) fermentação do produto de açúcar para produzir etanol; e (c) opcionalmente, recuperação do etanol. A fermentação pode ser feita com um microrganismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5, por exemplo, uma levedura.

[00121] Os microrganismos produtores de álcool podem ser um organismo procariótico ou eucariótico. O microrganismo usado no processo pode ser um microrganismo geneticamente modificado. Exemplos de organismos produtores de álcool adequados são leveduras, por exemplo Saccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus ou Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, por exemplo, Issatchenkia orientalis, Pichia, por exemplo Pichia stipites ou Pichia pastoris, Kluyveromyces, por exemplo, Kluyveromyces fagilis, Candida, por exemplo, Candida pseudotropicalis ou Candida acidothermophilum, Pachysolen, por exemplo, Pachysolen tannophilus ou bactériaa, por exemplo, Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostridium, por exemplo, Clostridium phytofermentans, Escherichia, por exemplo, E. coli, Klebsiella, por exemplo, Klebsiella oxytoca. Em uma modalidade, o microrganismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, utilizada nos processos de acordo com a presente invenção, é capaz de converter açúcares hexose (C6) e açúcares pentose (C5). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de acordo com a presente invenção, pode fermentar anaerobicamente pelo menos um açúcar C6 e pelo menos um açúcar C5. Por exemplo, a levedura é capaz de usar L-arabinose e xilose além de glicose anaerobicamente. Em uma modalidade, a levedura é capaz de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo em etanol. Organismos, por exemplo, cepas de Saccharomyces cerevisiae,

capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos por modificação de uma levedura hospedeira introduzindo os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloglioxalato) e araD (L-ribulose-5-P4 -epimerase) de a partir de uma fonte adequada. Esses genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira para que ela seja capaz de usar arabinose. Essa abordagem é fornecida e descrita em WO2003/095627. Os genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são divulgados em WO2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são divulgados em EP1499708. Em outra modalidade, os genes araA, araB e araD podem ser derivados de pelo menos um dos gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um dentre Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e/ou Gramella forsetii, conforme divulgado em WO 2009011591. Em uma modalidade, a levedura também pode compreender uma ou mais cópias do gene da xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias da xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase.

[00122] A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir que a levedura fermente a xilose. Exemplos de modificações genéticas são a introdução de um ou mais genes xylA, gene XYL1 e gene XYL2 e/ou gene XKS1; deleção do gene da aldose redutase (GRE3); superexpressão dos genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via da pentose fosfato na célula. Exemplos de leveduras geneticamente modificadas são descritos em EP1468093 e / ou WO2006/009434.

[00123] Um exemplo de uma levedura comercial adequada é RN1016 que é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que fermenta xilose e glicose da DSM, Holanda.

[00124] Em uma modalidade, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já foi definido anteriormente neste documento. Em outra modalidade preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em outra modalidade preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é em condições de oxigênio limitado, mais preferivelmente aeróbico e em condições de oxigênio limitado. As condições limitadas em oxigênio já foram definidas anteriormente neste documento.

[00125] Alternativamente, para os processos de fermentação descritos acima, pelo menos duas células distintas podem ser usadas, o que significa que este processo é um processo de co-fermentação. Todas as modalidades preferidas dos processos de fermentação, conforme descrito acima, também são modalidades preferidas deste processo de co-fermentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições limitadas em oxigênio, temperatura na qual o processo está sendo realizado, produtividade do etanol, rendimento do etanol).

[00126] Produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos da invenção podem ser qualquer substância derivada da fermentação. Eles incluem, mas não estão limitados a, álcool (como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); ácido orgânico (como ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto- D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, glutárico ácido, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (como acetona); aminoácidos ( como ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, triptofano e treonina); alcanos (como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), cicloalcanos (como ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano e ciclo-octano), alcenos (como penteno, hexeno, hepteno e octeno); e gases (como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser uma proteína, uma vitamina, um produto farmacêutico, um suplemento de ração animal, um produto químico especial, uma matéria-prima química, um plástico, um solvente, etileno, uma enzima, como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase. Em uma modalidade preferida, um álcool é preparado nos processos de fermentação conforme descrito neste documento. Em uma modalidade preferida, etanol é preparado nos processos de fermentação conforme aqui descrito.

[00127] Os processos descritos neste documento podem compreender a recuperação de todos os tipos de produtos feitos durante os processos, incluindo produtos de fermentação, como etanol. Um produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação de forma conhecida pelo especialista. Exemplos de técnicas de recuperação incluem, mas não estão limitadas a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Para cada produto de fermentação, o especialista será assim capaz de selecionar uma técnica de separação adequada. Por exemplo, etanol pode ser separado de um caldo de fermentação de levedura por destilação, por exemplo, destilação a vapor / destilação a vácuo de maneira convencional.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00128] Crescimento microbiano de um fungo filamentoso em sacarose e sacarose hidrolisada

[00129] Uma cepa de Rasamsonia foi cultivada em um frasco de pré-cultura (300 ml) por 3 dias a 45°C e 200 rpm. O meio utilizado para o cultivo compreendeu extrato de levedura em pó (20 g/l), dextrose (22 g/l) e hidrato de MES (20 g/l). No final do tempo de cultivo, toda a dextrose foi consumida. Subsequentemente, 1 ml do conteúdo do frasco de pré-cultura agitado foi transferido para cada um dos dois frascos agitados no experimento abaixo.

[00130] A cepa Rasamsonia foi cultivada em dois frascos de agitação (50 ml) por 4 dias a 45°C e 300 rpm em um meio sem dextrose como fonte de carbono. A fonte de carbono usada durante o cultivo foi adicionada separadamente aos frascos de agitação. Ao primeiro frasco de agitação, foram adicionados 5 ml de uma solução de sacarose 3,8% (p/p) e ao segundo frasco de agitação foram adicionados 5 ml de uma solução de sacarose hidrolisada a 3,8% (p/p). As adições foram feitas no início da fase do frasco de agitação.

[00131] A solução de sacarose hidrolisada foi preparada tratando a solução de sacarose 3,8% (p/p) durante 20 minutos a uma temperatura de 121°C e um pH de 3. O pH da solução de sacarose 3,8% (p/p) foi levado a pH 3 usando ácido fosfórico.

[00132] Para medir o crescimento da cepa de Rasamsonia sobre o substrato de sacarose ou substrato de sacarose hidrolisado, a transferência cumulativa de oxigênio durante o cultivo foi medida pelo equipamento “Ramos da Kühner”. A transferência cumulativa de oxigênio após 65 horas de cultivo é mostrada na Tabela 1. O oxigênio cumulativo transferido pela cepa de Rasamsonia cultivada no frasco agitado com sacarose hidrolisada foi cerca de 14 vezes maior do que no frasco agitado com sacarose não tratada.

[00133] Uma taxa de transferência de oxigênio cumulativa aumentada reflete o aumento da formação de biomassa e o aumento da formação de biomassa leva ao aumento da produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. Exemplo 2

[00134] Crescimento microbiano de um fungo filamentoso em sacarose e sacarose hidrolisada

[00135] Uma cepa de Rasamsonia (cepa TEC-210 como descrito em WO 2011/000949) foi cultivada em frascos de agitação (300 ml) por 3 dias a 45°C e 200 rpm. Durante este cultivo, tanto biomassa é formada quanto proteínas são produzidas. O meio de cultivo foi baseado em fonte de carbono (20 g/kg), extrato de levedura (20 g/kg), hidrato de MES (20 g/kg) e celulose (1,5 g/kg). A fonte de carbono (sacarose) foi adicionada separadamente ao frasco de agitação. O pH no início do cultivo era de cerca de 5,2. A um frasco de agitação foram adicionados 100 ml de solução de sacarose a 6,0% ( /p) e a um frasco de agitação foram adicionados 100 ml de solução de sacarose hidrolisada a 6,0% (p/p).

[00136] A solução de sacarose hidrolisada foi preparada por pré- tratamento da solução de sacarose a 6,0% (p / p). O pH da solução de sacarose foi diminuído para 3 com ácido clorídrico e em seguida a solução de sacarose foi incubada por 20 minutos a 121 ° C.

[00137] No final do cultivo, produção de proteína, formação de biomassa e concentração de sacarose foram medidas nos frascos de agitação (ver Tabela 2). A formação de biomassa foi determinada medindo o peso seco do caldo, a produção de proteína foi determinada pelo teste de Biureto e a concentração de sacarose foi determinada por HPLC-RI. Os métodos são descritos em mais detalhes abaixo.

[00138] Teste de Biureto: Na reação de Biureto, um íon cobre (II) é reduzido a cobre (I), que forma um complexo com as ligações peptídicas em uma solução alcalina. Uma cor violeta indica a presença de proteínas. A intensidade da cor e, portanto, a absorção em 546 nm, é diretamente proporcional à concentração de proteína, de acordo com a lei de Beer-Lambert. A padronização foi realizada utilizando BSA (Bovine Serum Albumine - albumina de soro bovino) e o teor de proteína foi expresso em g de proteína como equivalente de BSA/L ou em mg de proteína como equivalente de BSA/ml. O teor de proteína foi calculado usando protocolos de cálculo padrão conhecidos na técnica, plotando a OD546 versus a concentração de amostras com concentração conhecida, seguido pelo cálculo da concentração das amostras desconhecidas usando a equação gerada a partir da linha de calibração.

[00139] Determinação de sacarose: Sacarose foi determinada por HPLC-RI usando uma coluna Rezex RNM-Carbohydrate Na + (Phenomenex, 300x7,8 mm, 8 µm, T = 85°C) e 3,55 g de sulfato de sódio e 2,5 g de azida de sódio em 5000 ml de água como fase móvel com 0,68 ml/min. A quantificação foi realizada usando calibração externa.

[00140] Formação de biomassa: a formação de biomassa foi determinada por análise de peso seco usando o método de filtração. Um filtro de microfibra de vidro pré-pesado (retenção de partículas: 1,6 µm) foi colocado em um funil de Büchner. Vácuo foi aplicado, e uma quantidade pré-pesada de caldo foi filtrada lentamente. Em seguida, foi realizada uma etapa de lavagem em que bastante água desmineralizada foi usada (cerca de 3x o peso do caldo aplicado). Em seguida, continuou a sucção para remover todos os vestígios de água. O filtro foi removido e transferido para um prato de pesagem de alumínio pré-pesado. Em seguida, foi seco por 24 horas a 103-105 ° C e depois disso foi resfriado em um dessecador até a temperatura ambiente e pesado.

[00141] Formação de biomassa e produção de proteína do frasco agitado em que foi usada sacarose hidrolisada como fonte de carbono foram 40% maior (biomassa) e 74% maior (proteína), respectivamente, em comparação com o frasco agitado com sacarose não tratada como fonte de carbono. Os resultados foram apoiados pelo fato de que quase toda a sacarose foi deixada no frasco de agitação com a sacarose não tratada como fonte de carbono e toda a sacarose foi convertida no frasco de agitação com sacarose hidrolisada como fonte de carbono. Exemplo 3 Crescimento microbiano de um fungo filamentoso em sacarose e sacarose hidrolisada

[00142] Uma cepa de Rasamsonia (cepa TEC-210 como descrito em WO 2011/000949) foi cultivada em frascos de agitação (300 ml) por 3 dias a 45°C e 200 rpm. Durante este cultivo, é formada biomassa e proteínas são produzidas. O meio de cultivo foi baseado em fonte de carbono (20 g/kg), extrato de levedura (20 g/kg), hidrato de MES (20 g/kg) e celulose (1,5 g/kg). A fonte de carbono (sacarose) foi adicionada separadamente ao frasco de agitação. O pH no início do cultivo era de cerca de 5,2. A dois frascos de agitação de referência foram adicionados 100 ml de solução de sacarose a 6,0% (p / p) e aos outros frascos de agitação foram adicionados100 ml de solução de sacarose hidrolisada a 6,0% (p / p).

[00143] A solução de sacarose hidrolisada foi preparada por pré- tratamento da solução de sacarose a 6,0% (p/p). Foi aplicada uma combinação de condições de pré-tratamento. Para pH, temperatura e tempos de incubação específicos, consulte as Tabelas 3 e 4. O pH da solução de sacarose foi reduzido para 5,0, 3,0 ou 1,7 usando ácido clorídrico e um eletrodo de pH calibrado. Em seguida, a solução de sacarose foi incubada por 5 minutos ou 60 minutos a 50°C, 105°C ou 180°C, colocando a solução em uma estufa incubadora.

[00144] No final do cultivo, a formação de biomassa foi medida nos frascos de agitação (ver Tabela 3). A formação de biomassa foi determinada medindo o peso seco do caldo como descrito no Exemplo

2. No final do cultivo, também foi determinada a produção de proteína (ver Tabela 4). Isso foi feito usando o teste de Biureto conforme descrito no Exemplo 2.

[00145] Formação de biomassa e produção de proteína dos frascos agitados em que foi usada sacarose hidrolisada como fonte de carbono foram 11% maior (para biomassa) e pelo menos 8% maior (para proteína), respectivamente, em comparação com a média dos frascos agitados com sacarose não tratada como fonte de carbono. Os resultados nas Tabelas 3 e 4 mostram que maior formação de biomassa e maior produção de proteína foram encontradas para várias condições de pré-tratamento diferentes. Tabela 1: Oxigênio cumulativo transferido após 65 horas de cultivo. Substrato OTR Cumulativo (em mmol/l) Sacarose 14 Sacarose hidrolisada 194 Tabela 2. Formação de biomassa e produção de proteína em sacarose e sacarose hidrolisada. Sacarose após cultivo Formação de biomassa Produção de Fonte de Carbono g/kg (peso seco em g/kg) proteína (g/kg) Sacarose 18,9 6,27 3,8 Sacarose hidrolisada 0 8,75 6,6 Tabela 3. Formação de biomassa em sacarose e sacarose hidrolisada (diferentes condições de pré-tratamento). Aumento relativo Formação de biomassa Fonte de carbono (condição de pré-tratamento) comparado à referência (peso seco em g/kg) (em %) Sacarose (média de duas referências) 3,2 100 Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 180°C / 5 min) 4,5 144

Aumento relativo Formação de biomassa Fonte de carbono (condição de pré-tratamento) comparado à referência (peso seco em g/kg) (em %) Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 180°C / 60 min) 8,0 253 Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 105°C / 5 min) 5,6 177 Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 105°C / 60 min) 10,3 328 Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 50°C / 5 min) 3,9 123 Sacarose hidrolisada (pH 1,7 / 50°C / 60 min) 4,2 135 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 180°C / 5 min) 4,0 128 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 180°C / 60 min) 9,0 285 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 105°C / 5 min) 4,7 150 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 105°C / 60 min) 3,9 124 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 50°C / 5 min) 3,6 114 Sacarose hidrolisada (pH 3,0 / 50°C / 60 min) 3,8 121 Sacarose hidrolisada (pH 5,0 / 180°C / 60 min) 3,5 111 Sacarose hidrolisada (pH 5,0 / 105°C / 60 min) 3,8 120 Sacarose hidrolisada (pH 5,0 / 50°C / 60 min) 4,0 128 Sacarose hidrolisada (pH 5,0 / 50°C / 5 min) 3,7 117

Tabela 4. Produção de proteína em sacarose e sacarose hidrolisada (diferentes condições de pré-tratamento). Aumento relativo Produção de proteína Fonte de carbono (condição de pré-tratamento) comparado à referência (g/kg) (em %) Sacarose (média de duas referências) 3,0 100 Sacarose hidrolisada (pH 1.7 / 180°C / 60 min) 5,7 194 Sacarose hidrolisada (pH 1.7 / 105°C / 60 min) 4,6 155 Sacarose hidrolisada (pH 3.0 / 180°C / 60 min) 6,3 215 Sacarose hidrolisada (pH 5.0 / 50°C / 60 min) 3,2 108

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produção de uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica por cultivo de um fungo filamentoso em condições que permitem a expressão da enzima, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) tratar uma biomassa contendo sacarose a uma temperatura de 50ºC a 180ºC e um pH de 1 a 5 por 0,5 a 90 minutos para produzir uma biomassa tratada, (ii) cultivar o fungo filamentoso usando a biomassa tratada como substrato em condições que levam à produção da enzima, e (iii) opcionalmente, recuperar a enzima.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o fungo filamentoso é selecionado do grupo de gêneros consistindo em Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma e Trichophyton.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que a biomassa contendo sacarose é tratada com um ácido.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que a biomassa contendo sacarose contém de 10% - 80% de sacarose por peso seco.

5. Processo para preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) produzir uma enzima celulolítica e/ou hemicelulolítica cultivando um fungo filamentoso em condições que permitam a expressão da enzima, em que o processo compreende as etapas de: (i) tratar uma biomassa contendo sacarose a uma temperatura de 50ºC a 180ºC e um pH de 1 a 5 por 0,5 a 90 minutos para produzir uma biomassa tratada, (ii) cultivar o fungo filamentoso usando a biomassa tratada como substrato em condições que levam à produção da enzima, e (iii) opcionalmente, recuperar a enzima, (b) hidrolisar enzimaticamente o material de carboidrato com a enzima para obter o produto de açúcar, e (c) opcionalmente, recuperar o produto de açúcar.

6. Processo para preparação de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) realizar um processo como definido na reivindicação 5, b) fermentar o produto de açúcar para produzir o produto de fermentação, e c) opcionalmente, recuperar o produto da fermentação.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato que o teor de matéria seca do material de carboidrato na hidrólise enzimática é de 10% a 40% (p/p).

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato que a enzima está na forma de um caldo de fermentação integral de um fungo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato que a enzima é selecionada do grupo que consiste em uma celobio-hidrolase, uma endoglucanase, uma beta-glucosidase, uma beta-xilosidase, uma endoxilanase, uma monoxigenase lítica de polissacarídeo e qualquer combinação dos mesmos

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato que a fermentação é feita por uma levedura.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato que a hidrólise enzimática do material de carboidrato é feita em um recipiente com um volume de 10 a 5000 m3.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato que o fungo é cultivado em uma cultura em batelada alimentada.