ES2375054T3 - Nueva variante de celulasa cbh1 de hypocrea jecorina. - Google Patents

Abstract

Variante de celulasa CBH I, en la que dicha variante comprende una sustitución en la posición correspondiente al residuo P227(L/T/A) en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2), en la que dicha variante de celulasa CBH I tiene una mayor temperatura de fusión.

Description

Nueva variante de celulasa CBH1 de Hypocrea jecorina

REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional US No. 60/404,063, presentada el 16 de agosto de (Expediente del agente No. GC772P), de la Solicitud Provisional US No. 60/458,853 presentada el 27 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC772-2P), de la Solicitud Provisional US No 60/458,368 presentada el 21 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC793P) y de la Solicitud Provisional US No 60/458,696 presentada el 27 de marzo de 2003 (expediente del agente No. GC793-2P).

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LOS DERECHOS DE LAS INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO APOYADO FEDERALMENTE

[0002] Partes de este trabajo obtuvieron fondos por el subcontrato No. ZCO-0-30017-01 con la National Renewable Energy Laboratory bajo el Contrato Principal No. DE-AC36-99GO10337 con el Departamento de energía de los Estados Unidos. Por consiguiente, el Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0003] La presente invención se refiere a enzimas de celobiohidrolasas variantes y secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa. La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, y células huésped que comprenden las secuencias de ácido nucleico, así como métodos para producir polipéptidos CBH variantes recombinantes.

REFERENCIAS

[0004]

1.

Sheehan y Himmel Biotechnology Progress 15, pp 817-827 (1999)

2.

Mattl Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9-11 (1993)

3.

Tuula T. Teeri Trends In Biotechnology 15, pp 160-167 (1997)

4.

T.T. Teeri et al. Spec. Publ.- R. Soc. Chem., 246 (Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering), pp 302-308. (1999)

5.

PDB reference 20VW: Sulzenbacher, G., Schulein, M., Davies, G. J. Biochemistry 36 pp. 5902 (1997) PDB reference 1A39: Davies, G. J., Ducros, V., Lewis, R. J., Borchert, T. V., Schuleln, M. Journal of Biotechnology 57 pp. 91 (1997)

7.

PDB reference 6CEL: Divne, C., Stahlberg, J., Teerl, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 275 pp. 309 (1998)

8.

PDB reference 1 EG1: Kleywegt, G. J., Zou, J. Y., Divne, C., Davies, G. J., Sinning, I., Stahlberg, J., Reinikainen, T., Srisodsuk, M., Teeri, T. T., Jones, T. A. Journal of Molecular Biology 272 pp. 383 (1997)

9.

PDB reference 1 DY4 (8CEL): J. Stahlberg, H. Henriksson, C. Divne, R. Isaksson, G. Pettersson, G. Johansson,

T. A. Jones

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0005] La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes producidos mediante fotosíntesis. Pueden degradarse y utilizarse como fuente de energía por parte de numerosos microorganismos, incluidos bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrólisis de los sustratos poliméricos de azúcares monoméricas (Aro et al., J. Biol. Chem., vol. 276, no. 26, pp. 24309-24314, Junio 29, 2001)). Como los límites de los recursos no renovables se acercan, el potencial de la celulosa para convertirse en un importante recurso de energía renovable es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos, es una estrategia para superar la escasez de alimentos, forrajes y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. vol. 14, pp. 365-414, 1997).

[0006] Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1,4-glucano y beta-D glucosídicos), dando lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Las celulasas han sido tradicionalmente divididas en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta] -D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles et al., TIBTECH 5, 255-261, 1987; Shulein, Methods Enzymol., 160, 125, pp. 234-243, 1988). Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila Mycota, 303-319, 1995). De este modo, la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasas es necesaria para la solubilización eficiente de la celulosa cristalina (Suumakki, et al. Cellulose 7:189-209, 2000). La beta-glucosidasa actúa para liberar a unidades

de D-glucosa a partir de celobiosa, celooligosacáridos, y otros glucósidos (freer, J. Biol. Chem. vol. 268, no. 13, pp. 9337-9342, 1993).

[0007] Se sabe que las celulasas son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasas completo capaces de degradar las formas cristalinas de la celulosa, de manera que las celulasas se producen fácilmente en grandes cantidades a través de la fermentación. Los hongos filamentosos desempeñan un papel especial, ya que muchas levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar la celulosa. Ver, por ejemplo, Aro et al., 2001; Aubert et al., 1988; Wood et al., Methods In Enzymology, vol. 160, no. 9, pp. 87-116, 1988, y Coughlan, et al., "Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems" Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 11-30 1988.

[0008] Las clasificaciones de la celulasa fúngica de CBH, EG y BG pueden ampliarse para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH, EG y BG de una variedad de fuentes fúngicas, incluyendo Trichoderma reesei, que contiene genes conocidos para 2 CBHS, es decir, CBH I y CBH II, por lo menos 8 EGs, es decir, EG I, EG II, EG III, EGIV, EGV, EGVI, EGVII y EGVIII, y por lo menos 5 BGs, es decir, BG1, BG2, BG3, BG4 y BG5.

[0009] Con el fin de convertir eficientemente la celulosa cristalina en glucosa es necesario el sistema de celulasas completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina ((Filho et al., Can. J. Microbiol. 42:1-5, 1996). Se ha observado una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa de distintas clasificaciones. En particular, las celulasas tipo EG y las celulasas tipo CBH interaccionan de manera sinérgica para degradar más eficientemente la celulosa. Ver, por ejemplo. Wood, Biochemical Society Transactions, 611th Meeting, Galway, vol, 13, pp. 407-410, 1985.

[0010] Las celulasas se conocen en la técnica por ser útiles en el tratamiento de tejidos con el fin de mejorar la capacidad de limpieza de las composiciones de detergente, por su uso como un agente suavizante, para mejorar el tacto y la apariencia de los tejidos de algodón y similares (Kumar et al., Textile Chemist and Colorist, 29:37-42, 1997).

[0011] Se han descrito composiciones de detergente que contienen celulasa con un mejor rendimiento de limpieza (patente US 4.435.307; solicitudes GB 2.095.275 y 2.094.826) y para su uso en el tratamiento de la tela para mejorar el tacto y la apariencia del tejido (patentes US 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757; solicitud GB 1.358.599; The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, vol. 24, pp. 54-61, 1986).

[0012] Por lo tanto, las celulasas producidas en hongos y bacterias han recibido una atención considerable. En particular, la fermentación de la Trichoderma spp. (por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma reesei) se ha demostrado que produce un sistema completo de celulasas capaces de degradar formas cristalinas de la celulosa.

[0013] WO01/04284 describe que las tres variantes de CBH I N45A, N270A y N384A presentan niveles reducidos de glicosilación.

[0014] Gross et al., 2002, Biophysical J., vol. 82, no. 1, parte 2, página 459a describe el cambio de propiedades de CBH I de Tricoderma reesei por mutaciones de un único aminoácido.

[0015] Aunque las composiciones de celulasa se han descrito previamente, aún existe la necesidad de nuevas y mejoradas composiciones de celulasas para utilizar en detergentes del hogar, composiciones para el lavado a la piedra o detergentes de lavandería, etc. Las celulasas que muestran un mejor rendimiento son de particular interés.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0016] La presente invención proporciona una proteína celulasa aislada, identificada aquí como una variante de CBH I, y ácidos nucleicos que codifican una variante de CBH I.

[0017] Se describe aquí una variante de celulasa CBH I, donde dicha variante comprende una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más de los residuos S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S278, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, y P491 en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2). En un primer aspecto, la invención comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa, cuyo polipéptido es una variante de la glicosil hidrolasa de la familia 7, y donde dicho ácido nucleico codifica una sustitución en un residuo que es sensible a la tensión térmica en el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico, donde dicha variante de celobiohidrolasa deriva de celobiohidrolasa de H. jecorina. En un segundo aspecto, la invención comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que

tiene actividad de celobiohidrolasa, cuyo polipéptido es una variante de la glicosil hidrolasa de la familia 7, y donde dicho ácido nucleico codifica una sustitución en un residuo que presenta efectos en la procesabilidad de la enzima en el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico, donde dicha variante de celobiohidrolasa deriva de celobiohidrolasa de H. jecorina. En un tercer aspecto, la invención comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, cuyo polipéptido es una variante de la glicosil hidrolasa de la familia 7, y donde dicho ácido nucleico codifica una sustitución en un residuo que presenta efectos en la inhibición de producto en el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico, donde dicha variante de celobiohidrolasa deriva de celobiohidrolasa de H. jecorina.

[0018] En una realización, la presente invención está dirigida a una variante de CBH I de celulasa que comprende una sustitución en una posición que corresponde al residuo P227(L/T/A). En CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2). En un aspecto de esta realización, la variante de CBHI de celulasa comprende además una deleción en una posición correspondiente a T445 en CBHI de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2). En un segundo aspecto de esta realización, la variante de CBHI de celulasa comprende además la deleción de residuos correspondientes a los residuos 382-393 en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2).

[0019] En otra realización, la invención se dirige a una variante de CBH I que consiste esencialmente en las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

i. P227L/E325K/Q487L;

ii. P227T/T484S/F352L;

iii. S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;

iv.

T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;

v.

S8P/N49S/A68T/A112E/P227L;

vi. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L;

vii. G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P;

viii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T298P;

ix.

G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;

x.

G22D/N49S/A68T/N 103IA112E/P227L/S278P/T296P;

xi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2 96P;

xii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R;

xiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T2 96P/N301R

xiv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N 301R;

xv. S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N 301R;

xvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;

xvii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;

xviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T4 62I;

xix. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;

xx. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;

xxi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25 5P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;

xxii. S8P/T41I/N49S/A6ST/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S2 78P/T296P/N301R/E325/V403D/S411F/ T462I;

xxiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T25 5P/S278P/T296P/N301R/E325K/ V403D/S411F/T462I;

en CBHI de Hypocrea jecorina (SEC ID NO:2).

[0020] En otra realización, la invención se dirige a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de CBH I. En otro aspecto, existe una construcción que comprende el ácido nucleico de codificación de la variante de CBH I unida operativamente a una secuencia reguladora.

[0021] En otra realización, la invención se dirige a una célula huésped transformada con el vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de CBH I.

[0022] En otra realización, la invención se dirige a un método de producción de una variante de CBHI que comprende las etapas de:

(a)

cultivar una célula huésped transformada con el vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de CBH I en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones adecuadas para producir una variante de CBH I;

(b)

obtener dicha variante de CBH I producida.

[0023] En otra realización la invención se dirige a una composición de detergente que comprende un tensoactivo y una variante de CBH I. En un aspecto de esta realización, el detergente es un detergente de lavandería. En un segundo aspecto de esta realización, el detergente es un detergente para platos. En un tercer aspecto de esta invención, la variante de CBH I de celulasa se utiliza en el tratamiento de un tejido que contiene celulosa, en

particular, en el lavado a la piedra o tejanos teñidos con índigo.

[0024] En otra realización, la invención se dirige a un aditivo alimentario que comprende una variante de CBH I.

[0025] En otra realización, la invención se dirige un método de tratamiento de pulpa de madera que comprende poner en contacto la pulpa de madera con la variante de CBH I.

[0026] En otra realización la invención se dirige a un método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con una variante de CBHI.

[0027] En una realización, la celulasa deriva de un hongo, bacteria o Actinomiceto. En otro aspecto, la celulasa deriva de un hongo. En una realización más preferida, el hongo es hongo filamentoso. Se prefiere que el hongo filamentoso pertenezca a Euascomiceto, en particular, Aspergillus spp., Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., o Penicillium spp. En una aspecto adicional de esta realización, la celulasa es una celobiohidrolasa.

[0028] Otros objetos, característica y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, a se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones en el alcance de la invención serán evidentes para un experto en la materia a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0029] La figura 1 es la secuencia de ácido nucleico (línea inferior; SEC ID NO: 1) y de aminoácidos (línea superior; SEC ID NO: 2) de Cel7A (CBH I) de tipo salvaje de H. jecorina.

[0030] La figura 2 es la estructura 3D de CBH I de H. jecorina.

[0031] La figura 3 muestra la alineación de aminoácidos de los miembros de la familia de Cel7 para los que estaban disponibles las estructuras cristalinas. Las secuencias son: 2OVW - Fusarium oxysporum Cel7B, 1A39 - Humicola insolens Cel7B, 6CEL – Hypocrea jecorina Cel7A, 1 EG1 -Hypocrea jecorina Cel7B.

[0032] La figura 4 ilustra las estructuras cristalinas de los dominios catalíticos de estos cuatro homólogos de Cel7 alineados y sobrepuestos tal como se describen aquí.

[0033] La figura 5 A-M es la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos deducida para ocho mutaciones individuales de residuos y cinco variantes de mutaciones múltiples.

[0034] La figura 6 A-D es la secuencia de ácido nucleico para pTrex2.

[0035] La figura 7 A & B representa la construcción del plásmido de expresión pTEX.

[0036] La figura 8 A-J es el alineamiento de aminoácidos de los 42 miembros de la familia de Cel7.

[0037] La figura 9A es una representación de los perfiles térmicos del tipo salvaje y las ocho variantes de residuos individuales. La figura 9B es una representación de los perfiles térmicos del tipo salvaje y cinco variantes. La leyenda para la figura 9B: Cel7A = CBH I de H. jecorina de tipo salvaje; N301 K = variante N301 K; 334 = variante P227L; 340 = variante S8P/N49S/A68T/S113N; 350 = variante S8P/N49S/A68T/S113N/P227L; y 363 = variante S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P.

[0038] La figura 10 es el vector pRAX1. Este vector se basa en el plásmido pGAPT2 a excepción de que se insertó fragmento Hindi de 5259 pb de la secuencia AMA1 del fragmento de ADN genómico de Aspergillus nidulans (Molecular Microbiology 1996 19:565-574). Las bases 1 a 1134 contienen el gen promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger. Las bases 3098 a 3356 y 4950 a 4971 contiene el terminador de glucoamilasa de Aspergillus niger. El gen pyrG de Aspergillus nidulans se insertó de 3357 a 4949 como marcador para la transformación fúngica. Existe un sitio de clonación múltiple (MCS) en el que se pueden insertar genes.

[0039] La figura 11 es el esqueleto del vector pRAXdes2. Este vector se basa en vector plasmídico pRAX1. Se ha insertado un cassette Gateway en el vector pRAX1 (indicado por la flecha en el interior del plásmido circular). Este cassette contiene las secuencias de recombinación attR1 y attR2 y los marcadores de selección catH y ccdB. El vector se ha realizado según el manual proporcionado en Gateway™ Cloning Technology: versión 1 páginas 34-38 y sólo se puede replicar en E. coli DB3.1 de Invitrogen; en otros huéspedes de E. coli, el gen de ccdB es letal. En primer lugar, se realiza un fragmento de PCR con cebadores que contienen secuencias de recombinación attB1/2. Este fragmento se recombina con pDONR201 (disponible comercialmente de invitrogen); el vector contiene secuencias de recombinación attP1/2 con catH y ccdB entre los sitios de recombinación. Las enzimas de BP clonasa

de Invitrogen se utilizan para recombinar el fragmento de PCR en el denominado vector ENTRY, los clones con el fragmento de PCR insertado se pueden seleccionar a kanamicina 50 μg/ml porque los clones que expresan ccdB no sobreviven. Ahora las secuencias att están alteradas y se denominan attL1 y attL2. La segunda etapa es para recombinar este clon con el vector pRAXdes2 (que contiene catH y ccdB attR1 y attR2 entre los sitios de recombinación). Las enzimas de LR clonasa de invitrogen se utilizan para recombinar el inserto del vector ENTRY en el vector de destino. Sólo los vectores pRAXCBH1 se seleccionan utilizando ampicilina 100 μg/ml porque ccdB es letal y el vector ENTRY es sensible a ampicilina. Mediante este método, se prepara ahora el vector de expresión y se puede utilizar para transformar A. niger.

[0040] La figura 12 proporciona una ilustración del vector pRAXdes2cbh1 que se utilizó para la expresión de los ácidos nucleicos que codifican las variantes de CBH1 en Aspergillus. Un ácido nucleico que codifica un homólogo o variante de enzima de CBH1 se clonó en el vector mediante recombinación homóloga de las secuencias att.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0041] La invención se describirá a continuación en detalle a modo de referencia utilizando sólo las siguientes definiciones y ejemplos.

[0042] A menos que se defina lo contrario aquí, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que lo que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto en la material un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la invención. Aunque se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí en la práctica o análisis de la presente invención, se describen los métodos y material preferidos. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos s escriben de izquierda a derecha en orientación 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxilo, respectivamente. Los profesionales se pueden dirigir particularmente a Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Second Edition), Cold Spring Harbor Press. Plainview, N.Y., 1989, y Ausubel FM et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993, para definiciones y términos de la técnica. Debe entenderse que la presente invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que pueden variar.

[0043] Los encabezamientos proporcionados aquí no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invención que se pueden tener por referencia a la memoria en general. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente en referencia a la memoria en general.

I. DEFINICIONES

[0044] El término "polipéptido" como se usa aquí se refiere a un compuesto formado por una sola cadena de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. El término "proteína" como se utiliza aquí puede ser sinónimo del término "polipéptido" o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos.

[0045] "Variante" significa una proteína que deriva de una proteína precursora (por ejemplo, la proteína nativa) mediante la adición de uno o más aminoácidos a cualquiera de los extremos C-terminal o N-terminal o a ambos, sustitución de uno o más aminoácidos en uno o un conjunto de sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, o la deleción de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos o en ambos extremos de la proteína o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La preparación de una variante de enzima se consigue preferiblemente mediante la modificación de una secuencia de ADN que codifica la proteína nativa, la transformación de esa secuencia de ADN en un huésped adecuado, y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar la enzima derivativa. La enzima de CBHI variante de la invención incluye péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos alteradas en comparación con una secuencia de aminoácidos de enzima precursora, pero que puede tener propiedades alteradas en algún aspecto específico. Por ejemplo, una enzima de CBH variante puede tener un pH óptimo incrementado o una temperatura incrementada o estabilidad oxidativa, pero mantendrá su actividad celulolítica característica. Se contempla que las variantes según la presente invención pueden derivar de un fragmento de ADN que codifica una enzima CBH variante de celulasa donde se mantiene la actividad funcional del derivado de celulasa expresado. Por ejemplo, un fragmento de ADN que codifica una celulasa puede incluir además una secuencia de ADN o una parte de la misma que codifica una bisagra o enlazador unido a una secuencia de ADN de celulasa en cualquier extremo 5’ o 3’ donde se mantiene la actividad funcional del dominio de celulasa codificado.

[0046] "Residuos equivalentes" también se pueden definir determinando la homología al nivel de estructura terciaria para una celulasa terciaria cuya estructura terciaria se ha determinado mediante cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido particular de una celulasa y CBH de Hypocrea jecorina (N en N, CA en CA, C en C y O en O) están en 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se consigue después de haber orientado el mejor modelo y posicionado hasta proporcionar el máximo solapamiento de

coordinadas atómicas de átomos de proteína que no son hidrógeno de la celulasa en cuestión con respecto a la CBHI de H. jecorina. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que produce el factor R más bajo para los datos de difracción experimental a la máxima resolución disponible.

[0047] Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de CBH I de H. jecorina CBH I se definen como aquellos aminoácidos de una celulasa que pueden adoptar una conformación, de manera que alteran, modifican o contribuyen a la estructura de la proteína, la unión a sustrato o catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico de la CBH I de H. jecorina. Además, son residuos de la celulasa (para los que se ha obtenido una estructura terciaria mediante cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga siempre que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo determinado pueden no satisfacer el criterio de equivalencia en base a la ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de por los menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo se encuentran en 0,13 nm de los correspondientes átomos de la cadena lateral de CBH de H. jecorina. La estructura cristalina de CBH I de H. jecorina se muestra en la figura 2.

[0048] El término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ARN, ADN y ADNc. Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína dada, tal como CBH I. La presente invención contempla todas las posibles variantes de secuencias de nucleótidos, que codifiquen CBH I, todos ellas siendo posibles debido a la degeneración del código genético.

[0049] Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" tiene una parte de la secuencia que no es nativa con respecto a la célula en la que se expresa. Heteróloga, con respecto a una secuencia de control se refiere a una secuencia de control (es decir promotor o potenciador), que no funciona en la naturaleza para regular el mismo gen cuya expresión esta regulando actualmente. En general, las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas no son endógenas a la célula o parte del genoma en el que están presentes, y se han añadido a la célula, mediante infección, transfección, transformación, microinyección, electroporación, o similar. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de ADN que es la misma o diferente de una combinación secuencia de control/secuencia codificante del ADN encontrado en la célula de origen.

[0050] Tal como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una construcción de un ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar los fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están comercialmente disponibles. La selección de los vectores de expresión adecuada está dentro del conocimiento de los expertos en la materia.

[0051] En consecuencia, un "cassette de expresión" o "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico generada de forma recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El cassette de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plastidios, virus, o un fragmento de ácido nucleico. Normalmente, la parte de cassette de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico a transcribir y un promotor.

[0052] Tal como se usa aquí, el término "plásmido" se refiere a una construcción de ADN de doble cadena (ds) circular que se usa como vector de clonación, y que forma un elemento genético auto-replicante extracromosómico en muchas bacterias y algunos eucariotas.

[0053] Tal como se usa aquí, el término "secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de la expresión en las células y donde la expresión del marcador seleccionable confiere a las células que contienen el gen expresado la capacidad de crecer en la presencia de un correspondiente agente selectivo, o bajo condiciones de crecimiento selectivo correspondientes.

[0054] Tal como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de un gen en dirección 3’. El promotor generalmente será adecuado para la célula huésped en la que se expresa el gen diana. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y de traducción (también llamadas "secuencias de control") son necesarios para expresar un gen determinado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y translación incluyen, pero no están limitadas a, las secuencias de promotor, los sitios de unión a ribosoma, secuencias de inicio y de detención de la transcripción, secuencias de inicio y de detención de traducción y secuencias potenciadoras o activadoras.

[0055] "Gen quimérico" o "construcción de ácido nucleico heteróloga", tal como se define aquí, se refiere a un gen no nativo (es decir, uno que se ha introducido en un huésped) que puede estar compuesto de partes de genes diferentes, incluidos elementos reguladores. Una construcción de un gen quimérico para la transformación de una célula huésped está normalmente compuesta de una región reguladora de la transcripción (promotor) unida operativamente a una secuencia de codificación de proteínas heterólogas, o, en un gen quimérico marcador seleccionable, a un gen marcador de selección que codifica una proteína que confiere resistencia a los antibióticos a las células transformadas. Un gen quimérico típico de la presente invención, para transformación en una célula huésped, incluye una región reguladora de la transcripción que es constitutiva o inducible, una secuencia de codificación de proteína, y una secuencia de terminación. Una construcción de gen quimérico puede incluir también una segunda secuencia de ADN que codifica un péptido señal si se desea la secreción de la proteína diana.

[0056] Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica una secuencia líder de secreción está unido operativamente a un ADN para un polipéptido si éste se expresa como un preproteína que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la de secuencia, o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia de codificación si se coloca con el fin de facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN unidas son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder de secreción, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se realiza por ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan adaptadores de oligonucleótidos sintéticos, enlaces o cebadores para PCR de acuerdo con la práctica convencional.

[0057] Tal como se usa aquí, el término "gen", indica el segmento de ADN que participa en la producción de una cadena de polipéptidos, que puede o no incluir las regiones anterior y posterior a la región de codificación, por ejemplo secuencias 5' no traducidas (5' UTR) o secuencias "líder" y secuencias 3' UTR o secuencias "trailer", así como secuencias que intervienen (intrones) entre los segmentos de codificación individuales (exones).

[0058] En general, las moléculas de ácido nucleico que codifican la variante de CBHI se hibridarán, bajo condiciones de moderada a alta rigurosidad a la secuencia de tipo salvaje proporcionada aquí como SEC ID NO: 1. Sin embargo, en algunos casos se emplea una secuencia de nucleótidos que codifica CBH I que posee un uso de codón sustancialmente diferente, mientras que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica CBH I tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Por ejemplo, la secuencia de codificación puede ser modificada para facilitar la expresión más rápida de CBH I en un sistema particular de expresión procariota o eucariota, según la frecuencia con que un codón particular es utilizado por el huésped. Te’o, et al. (FEMS Microbiology Letters 190:13-19, 2000), por ejemplo, describe la optimización de genes para la expresión en hongos filamentosos.

[0059] Una secuencia de ácido nucleico se considera "selectivamente hibridable" a una secuencia de ácido nucleico de referencia, si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí bajo condiciones de hibridación y de lavado de rigor moderado a alto. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión a ácidos nucleicos o de la sonda. Por ejemplo, "un rigor máximo" normalmente se produce alrededor de Tf-5°C (5° por debajo de la Tf de la sonda), "alto rigor", aproximadamente a 5-10° por debajo de la Tf; "rigo r intermedio", aproximadamente a 10-20° por debajo de la Tf de la sonda, y "rigor bajo", aproximadamente a 20-25° por debajo de la Tf. Funcionalmente, las condiciones de rigor máximo se pueden utilizar para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación, mientras que las condiciones de rigor alto se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente el 80% o más de identidad de secuencia con la sonda.

[0060] Las condiciones de hibridación de rigor moderado y alto son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, capítulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M., et al., 1993, incorporados expresamente por referencia en la presente). Un ejemplo de las condiciones de rigor alto incluye hibridación a aproximadamente 42°C en formamida al 50%, 5X SSC, 5X solución Denhardt, SDS al 0,5% y 100 µg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de un lavado en dos veces en 2X SSC y SDS al 0,5% a temperatura ambiente y dos veces más en 0,1X SSC y SDS al 0,5% a 42°C.

[0061] Tal como se usa aquí, "recombinante" hace referencia a una célula o un vector, que ha sido modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan en absoluto como consecuencia de intervención humana deliberada.

[0062] Tal como se usa aquí, los términos "transformada", "establemente transformada" o "transgénicas", con referencia a una célula significa que la célula tiene una secuencia de ácidos nucleicos no-nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

[0063] Tal como se usa aquí, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un polipéptido se produce sobre la base de la secuencia del ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

[0064] El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección" o "transformación" o "transducción", e incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo, o expresarse de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

[0065] Se deduce que el término “expresión de CBHI) se refiere a la transcripción y traducción del gen cbh I, cuyos productos incluyen precursores de ARNm, ARNm, polipéptido, polipéptidos procesados de manera posttraduccional, y sus derivados, incluyendo CBH I de especies relacionadas, tales como Trichoderma koningii, Hypocrea jecorina (también conocida como Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride) y Hypocrea schweinitzii. A modo de ejemplo, los ensayos para la expresión de CBH I incluyen transferencia Western para proteína CBH I, análisis de transferencia Northern y ensayos de reacción en cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) para ARNm de CBH I, y ensayos de actividad de endoglucanasa tal como se describe en Schoemaker S.P. y Brown R.D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978, 523:133-146) y Schulein (Methods Enzymol., 160, 25, pp. 234-243, 1988).

[0066] El término "empalme alternativo" se refiere al proceso mediante con el cual se generan múltiples isoformas del polipéptido a partir de un solo gen, e implica el empalme de exones no consecutivos juntos durante el procesamiento de algunos, pero no todos, los transcritos de los genes. Así, un exón particular puede conectarse a uno cualquiera de varios exones alternativos para formar ARN mensajero. Los ARNm empalmados alternativamente producen polipéptidos ("variantes de empalme") en los que algunas partes son comunes, mientras que otras partes son diferentes.

[0067] El término "secuencia de señal" se refiere a una secuencia de aminoácidos en la parte N terminal de una proteína que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal que se separa durante el proceso de secreción

[0068] Mediante el término "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o la transcripción o la transcripción y la traducción (expresión) de la construcción de expresión. Las células huésped para su uso en la presente invención pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, planta, insecto, anfibio, o células de mamífero. En general, las células huésped son hongos filamentosos.

[0069] El término "hongos filamentosos" significa cualquiera y todos los hongos filamentosos reconocidos por los expertos en la materia. Un hongo preferido se selecciona del grupo formado por Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora, o formas sexuales alternativas de los mismos, tales como Emericella, Hypocrea. Se ha demostrado ahora que el hongo industrial asexual Trichoderma reesei es un derivado clonal del ascomiceto Hypocrea jecorina. Véase Kuhls et al., PNAS (1996) 93:7755-7760.

[0070] El término "celooligosacárido" se refiere a grupos de oligosacáridos que contienen 2-8 unidades de glucosa y tienen enlaces �-1,4, por ejemplo, celobiosa.

[0071] El término "celulasa" se refiere a una categoría de enzimas capaces de hidrolizar polímeros de celulosa para acortar oligómeros de celooligosacáridos, celobiosa y/o glucosa. Numerosos ejemplos de celulasas, tal como exoglucanasas, exocelobiohidrolasas, endoglucanasas, y glucosidasas se han obtenido a partir de organismos celulolíticos, incluyendo particularmente hongos, plantas y bacterias.

[0072] CBH I de Hypocrea jecorina es un miembro de la Familia 7 de Glicosil Hidrolasa (por tanto Cel 7) y, específicamente, fue el primer miembro de esa familia identificado en Hypocrea jecorina (por tanto Cel 7A). La Familia 7 de Glicosil Hidrolasa contiene tanto Endoglucanasas como Celobiohidrolasas/exoglucanasas, y esa CBH I es del último. De este modo, los términos CBH I, proteína de tipo CBH I y celobiohidrolasas Cel 7 se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.

[0073] El término "dominio de unión a celulosa", tal como se usa aquí, se refiere a la parte de la secuencia de aminoácidos de una celulasa o de una región de la enzima que interviene en la actividad de unión a celulosa de una celulasa o derivada de la misma. Los dominios de unión a celulosa generalmente funcionan mediante la unión no covalente de la celulasa a la celulosa, un derivado de la celulosa u otro polisacárido equivalente del mismo. Los dominios de unión a celulosa permiten o facilitan la hidrólisis de las fibras de celulosa por la región del núcleo catalítico estructuralmente distinto, y habitualmente funcionan independientes del núcleo catalítico. Así, un dominio de unión a celulosa no tendrá la actividad hidrolítica significativa atribuible a un núcleo catalítico. En otras palabras, un dominio de unión a celulosa es un elemento estructural de la estructura terciaria de la proteína enzimática de celulasa que es distinto del elemento estructural que posee la actividad catalítica. El dominio de unión a celulosa y el

módulo de unión a celulosa se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.

[0074] Tal como se usa aquí, el término "tensoactivo" se refiere a cualquier compuesto generalmente reconocido en la técnica por tener cualidades activas de superficie. Así, por ejemplo, los tensoactivos comprenden tensoactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos, tales como los que se encuentran habitualmente en detergentes. Los tensoactivos aniónicos incluyen alquilbenzenosulfonatos lineales o ramificados, sulfatos de éter de alquilo o alquenilo que tienen grupos alquilo lineales o ramificados o grupos alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos y alcanosulfonatos. Los tensoactivos anfolíticos incluyen sulfonatos de sal de amonio cuaternario, y tensoactivos anfolíticos de tipo betaína. Estos tensoactivos amfolíticos tienen tanto grupos de carga positiva como negativa en la misma molécula. Los tensoactivos no iónicos pueden comprender éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de ácidos grasos superiores o aductos de óxido de alquileno de las mismas, monoésteres de glicerina de ácidos grasos, y similares.

[0075] Tal como se usa aquí, el término "tejido que contiene celulosa" se refiere a cualquier tejido cosido o no cosido, hilos o fibras de algodón o no de algodón que contienen celulosa o mezclas de celulosa que contienen o no algodón, incluyendo celulósicos naturales y celulósicos artificiales (tal como yute, lino, ramio, rayón, y liocel).

[0076] Tal como se usa aquí, el término "tejido que contiene algodón" se refiere a tejidos cosidos o no cosidos, hilos

o fibras de algodón puro o mezclas de algodón incluyendo algodón en tejidos tejidos de algodón, tricotados de algodón, vaqueros de algodón, hilos de algodón, algodón en bruto y similares.

[0077] Tal como se usa aquí, el término "composición para lavado a la piedra" se refiere a una formulación para uso en tejidos que contienen celulosa para el lavado a la piedra. Las composiciones para lavado a la piedra se utilizan para modificar los tejidos que contienen celulosa antes de su venta, es decir, durante el proceso de fabricación. Por el contrario, las composiciones detergentes están pensadas para la limpieza de la ropa sucia y no se utilizan durante el proceso de fabricación.

[0078] Tal como se usa aquí, el término "composición detergente" se refiere a una mezcla que está destinada para su uso en un medio de lavado para el lavado de tejidos sucios que contienen celulosa. En el contexto de la presente invención, dichas composiciones pueden incluir, además de celulasas y tensoactivos, enzimas hidrolíticas adicionales, agentes de relleno, agentes blanqueadores, activadores de blanqueo, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores de aglomeración, agentes de enmascaramiento, activadores de celulasas, antioxidantes y solubilizantes.

[0079] Tal como se usa aquí, el término "reducción o eliminación de la expresión del gen cbh1" significa que el cbh1 gen ha sido eliminado del genoma y, por tanto no puede ser expresado por el microorganismo huésped recombinante, o que el gen cbh1 ha sido modificado de tal manera que una enzima CBH 1 funcional no es producida por el microorganismo huésped.

[0080] El término “variante del gen cbh1” o “variante de CBH1” significa, respectivamente, que la secuencia de ácido nucleico del gen cbh1 de H. jecorina ha sido alterado mediante la eliminación, adición y/o manipulación de la secuencia codificante o la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada ha sido modificada en concordancia con la invención aquí descrita.

[0081] Tal como se usa aquí, el término "purificar" generalmente se refiere a someter a los ácidos nucleicos o las proteínas transgénicas a purificación bioquímica y/o a cromatografía en columna.

[0082] Tal como se usa aquí, los términos "activo" y "biológicamente activo" se refieren a una actividad biológica asociada a una determinada proteína y se utilizan indistintamente en el presente documento. Por ejemplo, la actividad enzimática asociada con una proteasa es la proteólisis y, de este modo, una proteasa activa tiene actividad proteolítica. Se deduce que la actividad biológica de una proteína determinada se refiere a cualquier actividad biológica que suele atribuirse a esa proteína por parte de los expertos en la materia.

[0083] Tal como se usa aquí, el término "enriquecida" significa que CBH se encuentra en una concentración que es mayor en relación a la concentración de CBH encontrada en un tipo salvaje, o en la composición de celulasa fúngica que se produce de manera natural. Los términos enriquecida, elevada y aumentada pueden utilizarse indistintamente en el presente documento.

[0084] Una composición de celulasa fúngica de tipo salvaje es una producida por una fuente fúngica de origen natural y que comprende uno o más componentes BGL, CBH y EG, donde cada uno de estos componentes se encuentra en la proporción producida por la fuente fúngica. Así, una composición de CBH enriquecida tendría CBH en una proporción alterada, donde la proporción de CBH con respecto a otros componentes de celulasa (es decir, EGs, beta-glucosidasas y otras endoglucanasas) es elevada. Esta proporción puede incrementarse ya sea aumentando CBH o disminuyendo (o eliminando) por lo menos uno de los otros componentes mediante cualquier medio conocido en la técnica.

[0085] De este modo, como ilustración, un sistema de celulasas de origen natural puede ser purificado en componentes sustancialmente puros mediante técnicas de separación reconocidas publicadas en la literatura, incluyendo cromatografía de intercambio iónico con un pH adecuado, cromatografía de afinidad, exclusión de tamaño y similares. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico (generalmente cromatografía de intercambio aniónico), es posible separar los componentes de celulasa por elución con un gradiente de pH, o un gradiente de sales, o ambos, un gradiente de pH y un gradiente de sal. La CBH purificada se puede añadir a continuación a la solución enzimática dando lugar a una solución de CBH enriquecida. También es posible elevar la cantidad de CBH I producida mediante un microbio usando procedimientos de genética molecular que sobreexpresan el gen que codifica CBH, posiblemente en conjunción con la supresión de uno o más genes que codifican otras celulasas.

[0086] Las celulasas fúngicas pueden contener más de un componente CBH. Los diferentes componentes generalmente tienen diferentes puntos isoeléctricos que permiten su separación mediante cromatografía de intercambio iónico y similares. Se puede utilizar un único componente CBH, o una combinación de componentes CBH en una solución enzimática.

[0087] Cuando se utiliza en soluciones enzimáticas, el componente CBH homólogo o variante se añade generalmente en una cantidad suficiente para permitir el mayor índice de liberación de azúcares solubles de la biomasa. La cantidad de componente CBH1 homólogo o variante añadido depende del tipo de biomasa que se sacarifica que puede determinarse fácilmente por parte del experto en la materia. Sin embargo, cuando se utiliza, el porcentaje en peso del componente CBH1 homólogo o variante con respecto a cualquier tipo de componente EG presente en la composición de celulasa es de aproximadamente 1, preferentemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 10, preferentemente aproximadamente 15 o, preferiblemente, aproximadamente el 20 por ciento en peso a preferentemente el 25 aproximadamente, preferentemente 30 aproximadamente, preferentemente aproximadamente 35, preferentemente aproximadamente 40, preferentemente aproximadamente 45 o, preferentemente, aproximadamente el 50 por ciento en peso. Además, los intervalos preferidos pueden ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente el 15 por ciento en peso, de 0,5 a aproximadamente el 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a 20 por ciento en peso, de 1 a aproximadamente el 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 35 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 40 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 50 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 20 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 25 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a un 35 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 50 por ciento en peso.

II. ORGANISMOS HUÉSPED

[0088] Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por tener un micelio vegetativo que tiene una pared celular compuesta de quitina, glucano, quiosano, manano y otros polisacáridos complejos, con un crecimiento vegetativo por la elongación hifal y catabolismo de carbono que es obligadamente aeróbico.

[0089] En la presente invención, la célula parental de los hongos filamentosos puede ser una célula de una especie de, pero sin limitación, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum, especie Penicillium.; especie Humicola, incluyendo Humicola insolens y Humicola grises; especie Chrysosporium, incluyendo C. lucknowense; especie Gliocladium; especie Aspergillus; especie Fusarium, especie Neurospora, especie Hypocrea. Y especie Emericella. Tal como se usa aquí, el término "Trichoderma" o " especie Trichoderma" o “Trichoderma sp.” se refiere a cualquier cepa de hongos que han sido previamente clasificada como Trichoderma o está actualmente clasificada como Trichoderma.

[0090] En una realización preferida, la célula parental de los hongos filamentosos es una célula de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, o Aspergillus nidulans.

[0091] En otra realización preferida, la célula parental de los hongos filamentosos es una célula de Trichoderma reesei.

III. CELULASAS

[0092] Las celulasas se conocen en la técnica como enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1,4-glucano y beta D-glucosídicos), resultando en la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Como se

indica anteriormente, las celulasas tradicionalmente se han dividido en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas (CE 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles, et al. , TIBTECH 5, 255-261, 1987; Schulein, 1988).

[0093] Algunos hongos producen sistemas de celulasas completos que incluyen exocelobiohidrolasas o celulasas de tipo CBH, endoglucanasas o, celulasas de tipo EG y beta-glucosidasas o celulasas de tipo BG (Schulein, 1988). Sin embargo, a veces estos sistemas carecen de celulasas de tipo CBH y las celulasas bacterianas también incluyen habitualmente pocas o ninguna celulasa de tipo CBH. Además, se ha demostrado que los componentes EG y los componentes CBH interaccionan de manera sinérgica para degradar de manera más eficiente la celulosa. Ver, por ejemplo, Wood, 1985. Los diferentes componentes, es decir, las diferentes endoglucanasas y exocelobiohidrolasas en un sistema de celulasas multicomponente o completo, generalmente tienen propiedades diferentes, tales como punto isoeléctrico, peso molecular, grado de glucosilación, especificidad de sustrato y patrones de acción enzimática.

[0094] Se cree que las celulasas de tipo endoglucanasa hidrolizan las uniones internas beta-1,4-glucosídicas en regiones de baja cristalinidad de la celulosa y que las celulasas de tipo exo-celobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa a partir del extremo reductor o no reductor de la celulosa. Se deduce que la acción de los componentes de endoglucanasa pueden facilitar enormemente la acción de las exocelobiohidrolasas mediante la creación de nuevos extremos de cadena que son reconocidos mediante componentes de exo-celobiohidrolasa. Además, se ha demostrado que las celulasas de tipo beta-glucosidasa catalizan la hidrólisis de -D-glucósidos de alquilo y/o arilo, tal como -D-glucósido de metilo y glucósido de p-nitrofenilo, así como glucósidos que contienen únicamente residuos de carbohidratos, tales como celobiosa. Esto produce glucosa como el único producto para los microorganismos y reduce o elimina la celobiosa que inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas.

[0095] Las celulasas también encuentran una serie de usos en composiciones de detergente incluyendo mejorar la capacidad de limpieza, como agente suavizante y mejorar el tacto de los tejidos de algodón (Hemmpel, ITB Dyeing/Printing/Finishing 3:5-14, 1991; Tyndall, Textile Chemist and Colorist 24:23-26, 1992; Kumar et al., Textile Chemist and Colorist, 29:37-42, 1997). Aunque el mecanismo no es parte de la invención, se han atribuido propiedades suavizantes y de restauración del color de la celulasa a los componentes de endoglucanasa alcalina en composiciones de celulasas, como lo demuestran las patentes de Estados Unidos 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757, que describen que las composiciones de detergente que contienen una composición de celulasa enriquecida en un determinado componente endoglucanasa alcalina proporcionan una restauración del color y suavizan mejor las prendas de vestir tratadas en comparación con composiciones de celulasa no enriquecidas con dicho componente. Además, se ha demostrado que el uso de estos componentes de endoglucanasa alcalina en las composiciones de detergente cumple con los requisitos de pH de la composición de detergentes (por ejemplo, exhibiendo su actividad máxima en un pH alcalino de 7,5 a 10, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757).

[0096] También se ha demostrado que las composiciones de celulasa degradan tejidos que contienen algodón, resultando en una pérdida de resistencia reducida en el tejido (patente de Estados Unidos 4.822.516), contribuyendo a la resistencia al uso de composiciones de celulasas en aplicaciones comerciales de detergente. Se ha sugerido que las composiciones de celulasa que comprenden componentes de endoglucanasa presentan una pérdida de resistencia reducida para los tejidos que contienen algodón en comparación con las composiciones que comprenden un sistema completo de celulasas.

[0097] Las celulasas también se han mostrado útiles en la degradación de biomasa de celulasa en etanol (en el que la celulosa degrada la celulosa a glucosa y levadura u otros microbios fermentan además la glucosa en etanol), en el tratamiento de pulpa mecánica (Pere et al., 1996), para su uso como aditivo alimenticio (WO 91/04673) y en la molienda en húmedo de grano.

[0098] La mayoría de CBHs y EGs tienen una estructura multidominio que consiste en un dominio de núcleo separado de un dominio de unión a celulosa (CDB) mediante un péptido de enlace (Suumakki et al., 2000). El dominio de núcleo contiene el sitio activo mientras que el CDB interacciona con la celulosa mediante la unión de la enzima al mismo (van Tilbeurgh et al., 1986; Tomme et al., Eur. J. Biochem. 170:575-581, 1988). Las CBDs son particularmente importantes en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Se ha demostrado que la capacidad de las celobiohidrolasas de degradar la celulosa cristalina disminuye claramente cuando la CDB está ausente (Linder y Teeri, J. Biotechnol. 57:15-28, 1997). Sin embargo, la función exacta y el mecanismo de acción de las CBDs siguen siendo un tema de especulación. Se ha sugerido que la CDB mejora la actividad enzimática meramente mediante el aumento de la concentración efectiva de la enzima en la superficie de celulosa (Stahlberg et al., Bio/Technol. 9:286290, 1991), y/o mediante el aflojamiento de cadenas de celulosa simples de la superficie de celulosa (Tormo et al., EMBO J. vol. 15, no. 21, pp. 5739-5751, 1996). La mayoría de estudios sobre los efectos de los dominios de celulasa en diferentes sustratos se han realizado con proteínas de núcleo de celobiohidrolasas, ya que sus proteínas de núcleo pueden producirse fácilmente mediante proteólisis limitadas con papaína (Tomme et al., 1988). Numerosas celulasas han sido descritas en la literatura científica, ejemplos de los cuales incluyen: de Trichoderma reesei: Shoemaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, que describe CBHI; Teeri, T. et al., Gene, 51:43-52, 1987, que describe CBHII. Las celulasas de especies diferentes de Trichoderma también se han descrito por

ejemplo, , Ooi et al., Nucleic Acids Research, vol. 18, no. 19, 1990, que describe la secuencia de ADNc que codifica la endoglucanasa F1-CMC producida por Aspergillus aculeatus, Kawaguchi T et al., Gene 173(2):287-8, 1996, que describe la clonación y la secuenciación de ADNc que codifica la beta-glucosidasa 1 de Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al., Curr. Genet. 27:435-439, que describe la secuencia de ADNc que codifica endoglucanasa CMCase1 de Kawachii Aspergillus IFO 4308; Saarilahti et al., Gene 90:9-14, 1990, que describe una endoglucanasa de Erwinia carotovara; Spilliaert R, et al., Eur J Biochem. 224(3):923-30, 1994, que describe la clonación y la secuenciación de bglA, que codifica una beta-glucanasa termoestable de Marinu Rhodothermus; y Halldorsdottir S et al. Appl Microbiol Biotechnol. 49 (3):277-84, 1998, que describe la clonación, la secuenciación y la sobreexpresión de un gen de Marinus Rhodothermus que codifica una celulasa termoestable de la familia 12 de glicosil hidrolasa. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de identificación y caracterización de nuevas celulasas, con propiedades mejoradas, tal como un rendimiento mejorado bajo condiciones de tensión térmica o en presencia de tensoactivos, una actividad específica aumentada, una alteración del patrón de división de sustrato y/o unnivel elevado de expresión in vitro.

[0099] El desarrollo de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que incluyen cantidades variables de celulasa de tipo CBH, de tipo EG y de tipo BG es de interés para su uso: (1) en composiciones de detergentes que presentan una capacidad de limpieza mejorada, que funcionan como un agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodón (por ejemplo, "lavado a la piedra" o "biopulido"); (2) en composiciones para degradar la pulpa de la madera u otra biomasa en azúcares (por ejemplo, para la producción de bioetanol), y/o (3) en composiciones de alimentación.

IV. BIOLOGÍA MOLECULAR

[0100] En una realización, la presente invención proporciona la expresión de genes de variantes de CBH I bajo el control de un promotor funcional en un hongo filamentoso. Por lo tanto, la presente invención se refiere a técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen métodos generales de utilización en el esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)).

A. Métodos para la identificación de genes de CBH1 homólogos.

[0101] La secuencia de ácido nucleico para la CBH 1 de H. jecorina de tipo salvaje se muestra en la figura 1. La invención, en un aspecto, comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un homólogo de CBH1 descrito aquí. El ácido nucleico puede se una molécula de ADN.

[0102] Las técnicas que se pueden utilizar para aislar secuencias de ADN que codifican CBH I son bien conocidas en el sector e incluyen, pero sin limitación, el cribado de ADNc y/o biblioteca genómica con una sonda de ADN homóloga y el cribado de la expresión con ensayos de actividad o anticuerpos contra CBH I. Cualquiera de estos métodos se pueden encontrar en Sambrook, et al. o en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. Ausubel, et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) ("Ausubel").

B. Métodos de mutación de secuencias de ácido nucleico de CBH I

[0103] En la presente invención se contempla cualquier método conocido en la técnica que pueda introducir mutaciones.

[0104] La presente invención se refiere a la expresión, purificación y/o aislamiento y la utilización de variante de CBH1. Estas enzimas se preparan preferiblemente mediante métodos recombinantes que utilizan el gen cbh de H. jecorina.

[0105] Después del aislamiento y clonación del gen cbh1 de H. jecorina, se utilizan otros métodos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida de sitio, para realizar sustituciones, adiciones o deleciones que corresponden a aminoácidos sustituidos en la variante de CBH1 expresada. De nuevo, la mutagénesis dirigida de sitio y otros métodos de incorporación de cambios de aminoácidos en proteínas expresadas a nivel de ADN se pueden encontrar en Sambrook, et al. y Ausubel, et al.

[0106] El ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de una variante de CBH1 de H. jecorina se prepara mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, la preparación por mutagénesis dirigida de sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cassette de un ADN preparado anteriormente que codifica la CBH1 de H. jecorina.

[0107] La mutagénesis dirigida de sitio es un método preferido para preparar variantes por sustitución. Esta técnica es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Carter et al. Nucleic Acids Res: 13:4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 82:488 (1987)). Brevemente, al llevar a cabo la mutagénesis dirigida de sitio del ADN, el ADN de partida se altera mediante la hibridación en primer lugar de un oligonucleótido que codifica la mutación

deseada en una cadena sencilla de dicho ADN de partida. Después de la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa, utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador, y utilizando la cadena sencilla del ADN de partida como plantilla. De este modo, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN de doble cadena resultante.

[0108] La mutagénesis por PCR también es adecuada para producir secuencias de aminoácidos variantes del polipéptido de partida, es decir CBH1 de H. jecorina. Véase, Higuchi, en PCR Protocols, pág.177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989). Véase, también, por ejemplo, Cadwell et al., PCR Methods and Applications, Vol 2, 28-33 (1992). Brevemente, cuando se utilizan pequeñas cantidades de ADN plantilla como material de partida en una PCR, se pueden utilizar cebadores que difieren ligeramente en la secuencia con la correspondiente región en un ADN plantilla para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia de la plantilla sólo en las posiciones en las que los cebadores difieren de la plantilla.

[0109] Otro método para preparar variantes, la mutagénesis de cassette, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene 34:315-323 (1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN del polipéptido de partida a mutar. Se identifican el codón o codones en el ADN de partida a mutar. Debe haber un único sitio para endonucleasa de restricción en cada lado del sitio o sitios de mutación identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, se pueden generar utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótido descrito anteriormente para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN del polipéptido de partida. El ADN plasmídico se corta en estos sitios para linealizarlo. Utilizando procedimientos estándar, se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción, pero que contiene la mutación o mutaciones deseadas, donde las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan por separado y a continuación se hibridan juntas utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de doble cadena se refiere como el cassette. Este cassette se diseña para que tenga los extremos 5’ y 3’ compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de manera que se puede unir directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada.

[0110] Alternativamente, o adicionalmente, se puede determinar la secuencia de aminoácidos deseada que codifica una variante de CBHI, y se puede generar sintéticamente una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos de variante.

[0111] La variante o variantes de CBH I preparadas de este modo se pueden someter a modificaciones posteriores, algunas veces dependiendo del uso pretendido de la celulasa. Dichas modificaciones pueden implicar la alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, la fusión a un polipéptido o polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes.

V. Ácidos nucleicos cbh1 y polipéptidos CBH1.

A. Variantes de ácidos nucleicos del tipo cbh

[0112] La secuencia de ácido nucleico para la CBHI de H. jecorina de tipo salvaje se muestra en la figura 1. La presente invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica las variantes de celulasas descritas aquí. El ácido nucleico puede ser una molécula de ADN.

[0113] Después del aislamiento y clonación de la CBH I, se utilizan otros métodos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida de sitio, para realizar sustituciones, adiciones o deleciones que corresponden a aminoácidos sustituidos en la variante de CBHI expresada. De nuevo, la mutagénesis dirigida de sitio y otros métodos de incorporación de cambios de aminoácidos en proteínas expresadas a nivel de ADN se pueden hallar en Sambrook, et al. y Ausubel, et al.

[0114] Después de clonar las secuencias de ADN que codifican las variantes de CBH1 en construcciones de ADN, se utiliza el ADN para transformar microorganismos. El microorganismo a transformar con el objetivo de expresar una variante de CBH1 según la presente invención puede comprender de manera ventajosa una cepa derivada de una especie Trichoderma. De este modo, un modo preferido para preparar una variante de celulasas CBH1 según la presente invención comprende transformar una célula huésped de especie de Trichoderma con una construcción de ADN que comprende por lo menos un fragmento de ADN que codifica una parte o toda la variante de CBH1. La construcción de ADN en general se unirá funcionalmente a un promotor. La célula huésped transformada crece a continuación bajo condiciones para expresar la proteína deseada. Posteriormente, el producto de proteína deseada se purifica hasta una homogeneidad sustancial.

[0115] Sin embargo, de hecho, puede ser que el mejor vehículo de expresión para un ADN determinado que codifica una variante de CBH1 puede diferir de H. jecorina. De este modo, puede ser que lo más ventajoso sea expresar una proteína en un huésped de transformación que porta una similitud filogenética con el organismo de origen para la variante de CBH1. En una realización alternativa, se puede utilizar, Aspergillus niger como un vehículo de expresión. Para la descripción de las técnicas de transformación con A. niger, véase WO 98/31821, la descripción de la cual se

incorpora por referencia en su totalidad.

[0116] Por consiguiente, la presente descripción de un sistema de expresión de especies de Trichoderma se proporciona con fines ilustrativos únicamente y sólo como opción para expresar la variante de CBH1 de la invención. Un experto en la materia, sin embargo, se puede inclinar por expresar el ADN que codifica la variante de CBH1 en una célula huésped diferente si es apropiado y debe entenderse que debe considerarse el origen de la variante de CBH1 en la determinación del huésped de expresión óptimo. Adicionalmente, el experto en el campo será capaz de seleccionar el mejor sistema de expresión para un gen particular mediante técnicas de rutina utilizando las herramientas disponibles en la técnica.

B. Polipéptidos de variantes de CBH1

[0117] La secuencia de aminoácidos para la CBH I de H. jecorina de tipo salvaje se muestra en la figura 1. Se describen aquí polipéptidos variantes de CBH I que comprende una sustitución o deleción en una posición correspondiente a uno o más de los residuos S8, Q17, G22, T41, N49, S57, N64, A68, A77, N89, S92, N103, A112, S113, E193, S196, M213, L225, T226, P227, T246, D249, R251, Y252, T255, D257, D259, S276, S279, K286, L288, E295, T296, S297, A299, N301, E325, T332, F338, S342, F352, T356, Y371, T380, Y381, V393, R394, S398, V403, S411, G430, G440, T445, T462, T484, Q487, y P491 en CBH I de Hypocrea jecorina. Además, la variante puede comprender además una deleción de residuos correspondientes a los residuos 382-393 en CBH I de Hypocrea jecorina.

[0118] Las variantes de CBH de la presente invención tienen secuencias de aminoácidos que derivan de la secuencia de aminoácidos del precursor de CBH I. La secuencia de aminoácidos de la variante de CBH I difiere de la secuencia de aminoácidos del precursor de CBH I en la sustitución de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del precursor. En una realización preferida, el precursor de CBH I es CBH I de Hypocrea jecorina. La secuencia de aminoácidos madura de CBH I de H. jecorina se muestra en la figura 1. De este modo, la presente invención se refiere a variantes de CBH I que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones que son equivalentes a un residuo particular identificado en CBH I de H. jecorina. Un residuo (aminoácido) de un homólogo de CBH I es equivalente a un residuo de CBH I de Hypocrea jecorina si es homólogo (es decir, correspondiente en la posición en la estructura primaria o terciaria) o es funcionalmente análogo a un residuo específico o una parte de ese residuo en CBH I de Hypocrea jecorina (es decir, que tiene la misma capacidad funcional o similar de combinarse, reaccionar o interaccionar química o estructuralmente). Tal como se utiliza aquí, la numeración pretende corresponder a la de la secuencia de aminoácidos de CBH I maduro tal como se ilustra en la figura 1. Además de las localizaciones en el precursor de CBH I, se identifican aquí para sustitución o deleción residuos específicos en el precursor de CBH I correspondientes a las posiciones de aminoácidos que son responsables de la inestabilidad cuando el precursor de CBHI se encuentra bajo tensión térmica. El número de posición de aminoácido (por ejemplo, +51) se refiere al número asignado a la secuencia de CBH I madura de Hypocrea jecorina presentada en la figura 1.

[0119] Las variantes de CBH de la presente invención tienen secuencias de aminoácidos que derivan de la secuencia de aminoácidos del precursor de CBH I de H. jecorina. La secuencia de aminoácidos de la variante de CBH I difiere de la secuencia de aminoácidos del precursor de CBH I en la sustitución de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del precursor. La secuencia de aminoácidos madura de CBH I de H. jecorina se muestra en la figura 1. De este modo, la presente invención se refiere a variantes de CBH I que contienen residuos de aminoácidos en las posiciones que son equivalentes a un residuo particular identificado en CBH I de H. jecorina. Un residuo (aminoácido) de una variante de CBH I es equivalente a un residuo de CBH I de Hypocrea jecorina si es homólogo (es decir, correspondiente en la posición en la estructura primaria o terciaria) o es funcionalmente análogo a un residuo específico o una parte de ese residuo en CBH I de Hypocrea jecorina (es decir, que tiene la misma capacidad funcional o similar de combinarse, reaccionar o interaccionar química o estructuralmente). Tal como se utiliza aquí, la numeración pretende corresponder a la de la secuencia de aminoácidos de CBH I maduro tal como se ilustra en la figura 1. Además de las localizaciones en el precursor de CBH I, se identifican aquí para sustitución o deleción residuos específicos en el precursor de CBH I correspondientes a las posiciones de aminoácidos que son responsables de la inestabilidad cuando el precursor de CBHI se encuentra bajo tensión térmica. El número de posición de aminoácido (por ejemplo, +51) se refiere al número asignado a la secuencia de CBH I madura de Hypocrea jecorina presentada en la figura 1.

[0120] La alineación de las secuencias de aminoácidos para determinar la homología se determina preferiblemente utilizando un “algoritmo de comparación de secuencias”. La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), mediante inspección visual o MOE por Chemical Computing Group, Montreal Canada.

[0121] Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo

BLAST, que se describe en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (<www.ncbi.nim.nih.gov>). Este algoritmo implica en primer lugar la identificación de las parejas de secuencias de puntuación elevada (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia bajo análisis que cumplen o satisfacen una puntuación umbral T de valor algo positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Estas coincidencias iniciales de palabras próximas actúan como puntos de partida para encontrar HSPs más largas que las contienen. Las coincidencias de palabras se expanden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan siempre que se pueda incrementar la puntuación de alineación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabras se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada disminuye en una cantidad X del máximo valor conseguido; la puntuación acumulada es cero o inferior; o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff &amp; Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M’5, N’-4, y una comparación de ambas cadenas.

[0122] El algoritmo BLAST realiza a continuación un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin &amp; Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más baja (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos tendría lugar por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos se considera similar a una proteasa si la probabilidad de la suma más pequeña en comparación con la secuencia de aminoácidos de prueba con una secuencia de aminoácidos de proteasa es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente a 0,01, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

[0123] A continuación, se proporcionan estrategias específicas adicionales para modificar la estabilidad de celulasas CBH1:

[0124] (1) Disminución de la entropía del despliegue de la cadena principal puede introducir estabilidad a la enzima. Por ejemplo, la introducción de residuos de prolina puede estabilizar significativamente la proteína mediante la disminución de la entropía del despliegue (véase, por ejemplo, Watanabe, et al., Eur. J. Biochem. 226:277-283 (1994)). De manera similar, los residuos de glicina no tienen carbono , y de este modo, tienen una libertad conformacional del esqueleto considerablemente mayor a la de muchos otros residuos. La sustitución de glicinas, preferiblemente por alaninas, puede reducir la entropía del despliegue y mejorar la estabilidad (véase, por ejemplo, Matthews, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84; 6663-6667 (1987)). Adicionalmente, mediante el recorte de bucles externos puede ser posible mejorar la estabilidad. Se ha observado que proteínas producidas con hipertermófilos tienen bucles externos más cortos que sus homólogos mesofílicos (véase, por ejemplo, Russel, et al., Current Opinions in Biotechnology’6:370-374 (1995)). La introducción de puentes disulfuro también puede ser eficaz de estabilizar distintas estructuras terciarias en relación entre sí. De este modo, la introducción de cisteínas en residuos accesibles a cisteínas existentes o la introducción de parejas de cisteínas que podrían formar enlaces disulfuro alterarían la estabilidad de una variante de CBH1.

[0125] (2) La disminución de cavidad internas mediante el incremento de la hidrofobicidad de cadena lateral puede alterar la estabilidad de una enzima. La reducción del número y el volumen de las cavidades internas incrementa la estabilidad de la enzima maximizando interacciones hidrofóbicas y reduciendo los defectos de empaquetamiento (véase, por ejemplo, Matthews, Ann. Rev. Biochem. 62:139-160 (1993); Burley, et al., Science 229:23-29 (1985); Zuber, Biophys. Chem. 29:171-179 (1988); Kellis, et al., Nature 333:784-786 (1988)). Se sabe que las proteínas multiméricas de termófilos tienen a menudo más interfases de subunidades hidrofóbicas con una mayor complementariedad de superficie que sus homólogos mesofílicos (Russel, et al., supra). Se cree que este principio es aplicable a interfases de dominios de proteínas monoméricas. Las sustituciones específicas que pueden mejorar la estabilidad mediante el incremento de la hidrofobicidad incluyen lisina en arginina, serina en alanina y treonina en alanina (Russel, et al., supra). La modificación de la sustitución en alanina o prolina puede incrementar el tamaño de la cadena lateral con una reducción resultante en las cavidades, un mejor empaquetamiento y una mayor hidrofobicidad. Las sustituciones para reducir el tamaño de la cavidad, incrementar la hidrofobicidad y mejorar la complementariedad de las interfases entre los dominios de CBH1 pueden mejorar la estabilidad de la enzima. Específicamente, la modificación del residuo específico en estas posiciones con un residuo diferente seleccionado entre cualquiera de fenilalanina, triptófano, tirosina, leucina e isoleucina puede mejorar el rendimiento.

[0126] (3) El equilibrio de cargas en la estructura secundaria rígida, es decir, hélices α y giros β pueden mejorar la estabilidad. Por ejemplo, la neutralización de cargas positivas parciales en una hélice N-terminal con carga negativa en ácido aspártico puede mejorar la estabilidad de la estructura (véase, por ejemplo, Eriksson, et al., Science 255:178-183 (1992)). De manera similar, la neutralización de las cargas negativas parciales en una hélice C-terminal con carga positiva puede mejorar la estabilidad. La eliminación de la carga positiva de la interacción con el péptido N-terminal en giros β debe ser eficaz para conferir estabilidad a la estructura terciaria. La sustitución con un residuo no cargado positivamente podría eliminar una carga positiva desfavorable de la interacción con un nitrógeno amida presente en un giro.

[0127] (4) La introducción de puentes de sales y enlaces de hidrógeno para estabilizar estructuras terciarias puede ser eficaz. Por ejemplo, las interacciones de pares iónicos, por ejemplo, entre ácido aspártico o ácido glutámico y lisina, arginina o histidina, pueden introducir efectos estabilizantes intensos y se pueden utilizar para unir diferentes elementos de estructura terciaria con una mejora resultante en la termoestabilidad. Adicionalmente, aumentos en el número de enlaces de hidrógeno de residuo cargado/residuo no cargado y el número de enlaces de hidrógeno, en general, pueden mejorar la termoestabilidad (véase, por ejemplo, Tanner, et al., Biochemistry 35:2597-2609 (1996)). La sustitución con ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico o glutamina puede introducir un enlace de hidrógeno con una amida del esqueleto. La sustitución con arginina puede mejorar un puente de sales e introducir un enlace de H en un carbonilo del esqueleto.

[0128] (5) Evitar los residuos termolábiles en general pueden incrementar la estabilidad térmica. Por ejemplo, la asparagina y glutamina son susceptibles a la desamidación y la cisteína es susceptible a la oxidación a altas temperaturas. La reducción del número de estos residuos en posiciones sensibles puede dar lugar a una termoestabilidad mejorada (Russel, et al., supra). La sustitución o deleción por cualquier residuo diferente a glutamina o cisteína pueden incrementar la estabilidad evitando un residuo termolábil.

[0129] (6) Estabilización o desestabilización de unión de un ligando que confiere una estabilidad modificada a variantes de CBH1. Por ejemplo, un componente de la matriz en que se utilizan variantes de CBH1 de la invención se pueden unir a un sitio de tensoactivo específico/sitio de sensibilidad térmica de la variante de CBH1. Modificando el sitio a través de la sustitución, la unión del componente a la variante se puede fortalecer o disminuir. Por ejemplo, un residuo no aromático en la hendidura de la unión de CBH1 se puede sustituir por fenilalanina o tirosina para introducir estabilización de cadena lateral aromática donde la interacción del sustrato de celulosa puede interaccionar de manera favorable con los anillos de bencilo, incrementando la estabilidad de la variante de CBH1.

[0130] (7) El incremento de la electronegatividad de cualquiera de los ligandos de tensoactivo/sensitividad térmica puede mejorar la estabilidad bajo tensoactivo o tensión térmica. Por ejemplo, la sustitución con fenilalanina o tirosina puede incrementar la electronegatividad de residuos D (aspartato) mejorando la protección del disolvente, mejorando así la estabilidad.

C. Anticuerpos anti-CBH

[0131] La presente invención proporciona además anticuerpos anti-CBH. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos o heteroconjugados.

[0132] Los métodos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. El agente de inmunización puede ser un polipéptido CBH o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el antígeno a una proteína que se sabe que ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. El protocolo de inmunización puede ser determinado por parte de un experto en la materia basado en protocolos estándar o experimentación de rutina.

[0133] Alternativamente, los anticuerpos anti-CBH puede ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por células inmunizadas en un animal o usando procedimientos de ADN recombinante. (Véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature, vol. 256, pág. 495-499, 7 agosto, 1975; Patente de Estados Unidos 4.816.567).

[0134] Un anticuerpo anti-CBH de la invención también puede comprender un anticuerpo humanizado o humano. El término &quot;anticuerpo humanizado&quot; se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) que son anticuerpos quiméricos, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab')2 u otras secuencias parciales de unión a antígeno de anticuerpos), que contienen una parte de la secuencia derivada de un anticuerpo no humano. Los métodos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica, tal como se detalla en Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, vol. 332, pp. 323-327, 1988; y Verhoeyen et al., Science, vol. 239, pp. 1534-1536, 1988. Los métodos para la producción de anticuerpos humanos también son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Jakobovits, A, et al., Annals New York Academy of Sciences, 764:525-535, 1995 and Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6(5):561-6, 1995.

VI. Expresión de variantes de CBH1 recombinantes

[0135] Los métodos de la invención se basan en el uso de células para expresar variantes de CBHI, sin que se requiera ningún método particular de expresión de CBH I.

[0136] La invención proporciona células huésped que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CBH. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares son las utilizadas anteriormente por la célula huésped parental antes de la transducción, transformación o transfección y será evidente para los expertos en la materia.

[0137] En una estrategia, una célula de hongos filamentosos o célula de levadura se transfecta con un vector de expresión que tiene un promotor o fragmento de promotor biológicamente activo o uno o más (por ejemplo, una serie) de potenciadores que funcionan en la línea de la célula huésped, unido operativamente a un segmento de ADN que codifica CBH, de manera que CBH se expresa en la línea celular.

A. Construcciones/Vectores de expresión de ácido nucleico.

[0138] Pueden incorporarse fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican CBH I (&quot;secuencias de ácido nucleico que codifican CBH I&quot;) en construcciones o vectores de ácido nucleico heterólogo, capaces de la introducción y la replicación en un hongo filamentoso o célula de levadura. Los vectores y los procedimientos aquí descritos son adecuados para su uso en células huésped para la expresión de CBH I. Cualquier vector puede utilizarse siempre que sea replicable y viable en las células en las que se introduce. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos para los expertos en la materia, y están disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión también se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, y Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1981, cada uno incorporado por referencia en la presente invención. Los vectores de expresión apropiados para los hongos se describen en van den Hondel,

C.A.M.J.J. et al. (1991) En: Bennett, J.W. y Lasure, L.L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pág. 396-428. La secuencia de ADN adecuada puede insertarse en un plásmido o vector (denominados en lo sucesivo como &quot;vectores&quot;) mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante procedimientos estándar. Estos procedimientos y los procedimientos de subclonación relacionados se consideran dentro del alcance de aplicación de los conocimientos de los expertos en la materia.

[0139] Los hongos filamentosos recombinantes que comprenden la secuencia de codificación para la variante de CBH I pueden producirse mediante la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia de codificación de la variante de CBH I en las células de una cepa seleccionada de los hongos filamentosos.

[0140] Una vez que se obtiene la forma deseada de una secuencia de ácido nucleico de la variante de cbh, puede modificarse en una variedad de maneras. Cuando la secuencia implica regiones flanqueantes no codificantes, las regiones flanqueantes pueden someterse a resección, mutagénesis, etc. De este modo, pueden realizarse transiciones, transversiones, supresiones e inserciones en la secuencia natural.

[0141] Puede insertarse una secuencia de codificación de la variante de cbh seleccionada en un vector adecuado de acuerdo con técnicas recombinantes bien conocidas y utilizarse para transformar los hongos filamentosos capaces de la expresión de CBH I. Debido a la inherente degeneración del código genético, pueden utilizarse otras secuencias de ácido nucleico que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia funcionalmente equivalente para clonar y expresar la variante deCBH I. Por lo tanto, se entiende que tales sustituciones en la región codificante están en las variantes de la secuencia cubiertas por la presente invención. Todas y cada una de estas variantes de la secuencia se pueden utilizar de la misma manera tal como se describe en este documento para una secuencia de ácido nucleico parental que codifica CBH I.

[0142] La presente invención también incluye construcciones de ácido nucleico recombinante que comprenden una

o más secuencias de ácido nucleico de codificación de variante de CBH I, tal como se describe anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa.

[0143] Las construcciones de ácido nucleico heterólogo pueden incluir la secuencia de codificación para la variante de cbh: (i) en aislamiento, (ii) en combinación con secuencias de codificación adicionales, tales como proteína de fusión o secuencias de codificación de péptido señal, donde la secuencia de codificación de cbh es la secuencia de codificación dominante; (iii) en combinación con secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, tales como promotor y otros elementos de terminación o regiones 5' y/o 3&quot; no traducidas, eficaces para la expresión de la secuencia de codificación en un huésped apropiado, y/o (iv) en un vector o medio huésped en el que la secuencia de codificación de cbh es un gen heterólogo.

[0144] En un aspecto de la presente invención, una construcción de ácido nucleico heterólogo se utiliza para transferir una secuencia de ácido nucleico que codifica CBH I en una célula in vitro, con hongos filamentosos establecidos y líneas de levadura preferidas. A largo plazo, se prefiere la producción de expresión estable de una variante de CBH I. Se deduce que se puede utilizar cualquier procedimiento eficaz para generar transformantes estables en la práctica de la invención.

[0145] Los vectores apropiados están habitualmente equipados con una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, sitios de inserción, y elementos de control adecuados, tales como secuencias de promotor y de terminación. El vector puede comprender secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, es decir, elementos promotores y de terminación o

regiones 5' y/o 3’ no traducidas, efectivas para la expresión de la secuencia de codificación en las células huésped (y/o en un vector o medio de células huésped en la que una secuencia de codificación de antígeno de proteína soluble modificada no se expresa normalmente), unidas operativamente a la secuencia de codificación. Un gran número de vectores adecuados y promotores son conocidos para los expertos en la materia, muchos de los cuales están disponibles comercialmente y/o se describen en Sambrook, et al., (supra).

[0146] Promotores de ejemplo incluyen promotores constitutivos y promotores inducibles, ejemplos de los cuales incluyen un promotor CMV, un promotor SV40 temprano, un promotor RSV, un promotor EF-1a, un promotor que contiene el elemento sensible a tet (TRE) en el sistema tet-on, o tet-off tal como se ha descrito (ClonTech y BASF), el promotor beta actina y el promotor metalotionina que puede estimularse mediante la adición de sales de metales determinados. Una secuencia promotora es una secuencia de ADN que es reconocida por el hongo filamentoso particular para propósitos de expresión. Está unida operativamente a la secuencia de ADN que codifica un polipéptido de variante de CBH I. Dicha unión comprende la posición del promotor en relación con el codón de iniciación de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la variante de CBH I en los vectores de expresión descritos. La secuencia promotora contiene la secuencia de control de la transcripción y la traducción que media en la expresión del polipéptido de la variante de CBH I. Ejemplos incluyen los promotores de Aspergillus niger, A awamori o A. oryzae glucoamilasa, alfa-amilasa, o genes que codifican la alfa-glucosidasa, los genes de A. nidulans GPDA o trpC, los genes cbh1 de Neurospora crassa o los genes trp1, los genes que codifican aspártico proteinasa de A. niger o Rhizomucor miehei, los genes cbh1, cbh2, egl1, egl2 de T. reesei, u otros genes que codifican celulasa.

[0147] La elección del marcador seleccionable adecuado dependerá de la célula huésped, y los marcadores adecuados para los diferentes huéspedes son bien conocidos en la técnica. Los genes marcadores seleccionables típicos incluyen argB de A. nidulans o T. reesei, amdS de A. nidulans, pyr4 de Neurospora crassa o T. reesei, pyrG de Aspergillus niger y A. nidulans. Marcadores seleccionables de ejemplo adicionales incluyen, pero no se limitan a trpc, trp1, oliC31, niaD o leu2, que se incluyen en construcciones de ácido nucleico heterólogo utilizadas para transformar una cepa mutante tal como trp-, pyr-, leu-, y similares.

[0148] Dichos marcadores seleccionables confieren a los transformantes la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos. Por ejemplo, el gen amdS de H. jecorina que codifica la enzima acetamidasa que permite que las células transformantes crezcan en acetamida como fuente de nitrógeno. El marcador seleccionable (pyrG por ejemplo) puede restaurar la capacidad de una cepa mutante auxotrófica para crecer en un medio mínimo selectivo o el marcador seleccionable (por ejemplo, olic31) puede conferir a los transformantes la capacidad de crecer en presencia de un fármaco inhibidor o antibiótico.

[0149] La secuencia de codificación de marcador seleccionable se clona en cualquier plásmido adecuado utilizando procedimientos generalmente utilizados en la técnica. Plásmidos de ejemplo incluyen pUC18, pBR322, pRAX y pUC100. El plásmido pRAX contiene secuencias AMA1 de A. nidulans, que posibilita la replicación en A. niger.

[0150] La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la capacidad de la técnica. Estas técnicas se explican con detalle en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Ausubel, et al., 1993; and Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

B. Células huésped y condiciones de cultivo para la producción de CBH1

(i) Hongos filamentosos

[0151] De este modo, la presente invención proporciona hongos filamentosos que comprenden células que han sido modificadas, seleccionadas y cultivadas de una manera efectiva para dar lugar a una producción de variante de CBH I o expresión respecto a los correspondientes hongos parenterales no transformados.

[0152] Ejemplos de especies de hongos filamentosos parenterales que pueden ser tratados y/o modificados para la expresión de variante de CBH I incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii; especie Penicillium. especie Humicola., incluyendo Humicola insolens; especie Aspergillus, especie Chrysosporium., especie Fusarium, especie Hypocrea, y especie Emericella.

[0153] Las células que expresan CBH I se cultivan en condiciones que habitualmente se emplean para el cultivo de la línea fúngica parenteral. Generalmente, las células son cultivadas en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tal como se describe en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 y Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997. Las condiciones de cultivo son también estándar, por ejemplo, los cultivos se incuban a 28°C en cultivos agitadores o fermentadores hasta que se alcanzan los niveles deseados de expresión de CBH I.

[0154] Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso determinado se pueden encontrar en la

literatura científica y/o de la fuente de los hongos tal como la American Type Culture Collection (ATCC; &quot;http://www.atcc.org/&quot;). Después de establecer un crecimiento fúngico, las células se exponen a condiciones efectivas para causar o permitir la expresión de una variante de CBH I.

[0155] En los casos en los que una secuencia que codifica CBH I está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azúcar, sal de metal o antibióticos, se añade al medio en una concentración efectiva para inducir la expresión de CBH I.

[0156] En una realización, la cepa comprende Aspergillus niger, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que A. niger var awamori dgr246 secreta cantidades elevadas de celulasas secretadas (Goedegebuur et al, Curr. Genet (2002) 41: 89-98). Son conocidas otras cepas de Aspergillus niger var awamori, tales como GCDAP3, GCDAP4 y GAP3-4. Ward et al (Ward, M, Wilson, L.J. y Kodama, K.H., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738-743).

[0157] En otra realización, la cepa comprende Trichoderma reesei, que es una cepa útil para obtener proteína sobreexpresada. Por ejemplo, se sabe que RL-P37, descrita por Sheir-Neiss, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53 (1984), secreta cantidades elevadas de enzimas de celulasas. Los equivalentes funcionales de RL-P37 incluyen la cepa RUT-C30 (ATCC No. 56765) y la cepa QM9414 (ATCC No. 26921) de Trichoderma reesei. Se contempla que estas cepas también sería útiles en la sobreexpresión de la variante de CBH1.

[0158] Cuando se desea obtener la variante de CBH I en ausencia de actividad celulolítica nativa potencialmente perjudicial, es útil obtener una cepa de célula huésped de Trichoderma en la que se han eliminado uno o más genes de celulasa antes de la introducción de una construcción de ADN o plásmido que contiene el fragmento de ADN que codifica la variante de CBH I. Dichas cepas se pueden preparar mediante el método descrito en la patente de Estados Unidos No. 5,246,853 y WO 92/06209, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia. Mediante la expresión de una variante de celulasa CBH I en un microorganismo huésped que falta en uno o más genes de celulasa, se simplifican los procedimientos de identificación y posterior purificación. Cualquier gen de la especie Trichoderma que se ha clonado se puede eliminar, por ejemplo, los genes cbh1, cbh2, egl1, y egl2, así como los que codifican la proteína EG III y/o EGV (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5,475,101 y WO 94/28117; respectivamente).

[0159] La deleción de genes se puede realizar insertando una forma del gen deseado para eliminar o alterar en un plásmido mediante métodos conocidos en la técnica. A continuación, el plásmido de deleción se corta en un sitio o sitios de enzimas de restricción apropiados, internos a la región de codificación del gen deseado, y la secuencia que codifica el gen o parte de la misma se sustituye con un marcador seleccionable. Las secuencias de ADN flanqueante del locus del gen a eliminar o alterar, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 a 2,0 kb, permanecen en cualquier lado del gen del marcador seleccionable. Un plásmido de deleción apropiado tendrá en general sitios únicos de enzimas de restricción presentes en el mismo para permitir que se eliminen el fragmento que contiene el gen eliminado, incluyendo secuencias de ADN flanqueante, y el gen del marcador seleccionable como una única pieza lineal.

[0160] Un marcador seleccionable debe elegirse de manera que permita la detección del microorganismo transformado. Cualquier gen marcador seleccionable que se expresa en el microorganismo seleccionado será adecuado. Por ejemplo, con la especie Aspergillus, el marcador seleccionable se elige de manera que la presencia del marcador seleccionable en los transformantes no afectará significativamente a las propiedades de los mismos. Dicho marcador seleccionable puede ser un gen que codifica un producto ensayable. Por ejemplo, se puede utilizar una copia funcional del gen de la especie Aspergillus que si carece de la cepa huésped da lugar a la cepa huésped que expresa un fenotipo autotrófico. De manera similar, existen marcadores seleccionables para la especie Trichoderma.

[0161] En una realización, una cepa derivada de pyrG de especie Aspergillus se transforma con un gen pyrG funcional, que de este modo proporciona un marcador seleccionable para la transformación. Una cepa derivada de pyrG se puede obtener mediante la selección de cepas de la especie Aspergillus que son resistentes al ácido fluoroorótico (FOA). El gen pyrG codifica la orotidin-5’-monofosfato descarboxilasa, una enzima necesaria para la biosíntesis de uridina. Las cepas con un gen pyrG intacto crecen en un medio que carece de uridina, pero son sensibles al ácido fluroorótico. Es posible seleccionar cepas derivadas de pyrG que carecen de una enzima orotidinmonofosfato descarboxilasa funcional y requieren uridina para el crecimiento mediante la selección de resistencia a FOA. Utilizando la técnica de selección de FOA, también es posible obtener cepas que requieren uridina que carecen de una orotato fosforibosil transferasa funcional. Es posible transformar estas células con una copia funcional del gen que codifica esta enzima (Berges &amp; Barreau, Curr. Genet. 19:359-365 (1991), y van Hartingsveldte et al., (1986) Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene. Mol. Gen. Genet. 206:71-75). La selección de cepas derivadas se realiza fácilmente utilizando la técnica de resistencia a FOA referida anteriormente y, de este modo, el gen pyrG se utiliza preferiblemente como marcador seleccionable.

[0162] En una segunda realización, se transforma una cepa derivada de pyr 4 de especie Hyprocrea (Hyprocrea sp.

(Trichoderma sp.)) con un gen pyr4 funcional, que, de este modo, proporciona un marcador seleccionable para la transformación. Se puede obtener una cepa derivada de pyr4 mediante la selección de cepas de la especie Hyprocrea (Trichoderma sp.) que son resistente a ácido fluoroorótico (FOA). El gen pyr4 codifica la orotidin-5’monofosfato descarboxilasa, una enzima necesaria para la biosíntesis de uridina. Las cepas con un gen pyr4 intacto crecen en un medio que carece de uridina, pero que son sensibles al ácido fluororótico. Es posible seleccionar cepas derivadas de pyr4 que carecen de una enzima orotidin monofosfato descarboxilasa funcional y requieren uridina para el crecimiento mediante la selección de resistencia a FOA. Utilizando la técnica de selección de FOA, también es posible obtener cepas que requieren uridina que carecen de una orotato fosforibosil transferasa funcional. Es posible transformar estas células con una copia funcional del gen que codifica esta enzima (Berges &amp; Barreau, Curr. Genet. 19:359-365 (1991). La selección de cepas derivadas se realiza fácilmente utilizando la técnica de resistencia a FOA referida anteriormente y, de este modo, el gen pyr4 se utiliza preferiblemente como marcador seleccionable.

[0163] Para transformar pyrG- Aspergillus sp. o pyr4-Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.) para que carezcan de la capacidad de expresar uno o más genes de celulasa, a continuación un único fragmento de ADN que comprende un gen de celulasa alterado o suprimido se aísla del plásmido de deleción y se utiliza para transformar un huésped pyr Aspergillus o pyr Trichoderma adecuado. Los transformantes se identifican a continuación y se seleccionan en basa a su capacidad de expresar el producto génico de pyrG o pyr4, respectivamente, y de este modo cumplir con la auxotrofía de uridina de la cepa huésped. A continuación, se llevan a cabo un análisis de transferencia Southern en los transformantes resultantes para identificar y confirmar un caso de integración de doble cruzamiento que sustituye parte o toda la región codificante de la copia genómica del gen a eliminar con los marcadores seleccionables pyr apropiados.

[0164] Aunque los vectores plásmidos específicos descritos anteriormente se refieren a la preparación de transformantes de pyr, la presente invención no se limitan a estos vectores. Se pueden eliminar y sustituir varios genes en la cepa de especie Aspergillus o Hypracrea (Trichoderma sp.) utilizando las técnicas anteriores. Además, se puede utilizar cualquier marcador seleccionable disponible, tal como se ha descrito anteriormente. De hecho, se puede eliminar cualquier gen de huésped, por ejemplo, especie Aspergillus o Hyprocrea, que se ha clonado, y de este modo identificado, del genoma utilizando la estrategia descrita anteriormente.

[0165] Tal como se ha indicado anteriormente, las cepas huésped utilizadas pueden ser derivadas de la especie de Hyprocrea (Trichoderma sp.) que carecen o tienen un gen o genes no funcionales correspondientes al marcador seleccionable elegido. Por ejemplo, si se elige pyrG como marcador seleccionable para la especie Aspergillus, entonces se utiliza una cepa derivada de pyrG específica como receptor en el procedimiento de transformación. Además, por ejemplo, si se elige pyr4 como marcador seleccionable para una especie de Hyprocrea, entonces se utiliza una cepa derivada de pyr4 específica como receptor en el procedimiento de transformación. De manera similar, se pueden utilizar los marcadores seleccionables que comprende genes de especie Hyprocrea (Trichoderma sp.) equivalentes a los genes de Aspergillus nidulans amdS, argB, trpC, niaD. Por lo tanto, la cepa receptora correspondiente debe ser una cepa derivada, tal como argB-, ttpC-, niaD-, respectivamente.

[0166] A continuación, se prepara el ADN que codifica la variante de CBH I para la inserción en un microorganismo apropiado. Según la presente invención, el ADN que codifica una variante de CBH I comprende el ADN necesario para codifica una proteína que tiene una actividad celulolítica funcional. El fragmento de ADN que codifica la variante de CBH I se pueden unir funcionalmente a una secuencia promotora fúngica, por ejemplo, el promotor del gen glaA en Aspergillus o el promotor de los genes cbh1 o egl1 en Trichoderma.

[0167] También se contempla que más de una copia de ADN que codifica una variante de CBH I se pueda recombinar en la cepa para facilitar la sobreexpresión. El ADN que codifica la variante de CBH I se puede preparar mediante la construcción de un vector de expresión que porta el ADN que codifica la variante. El vector de expresión que porta el fragmento de ADN insertado que codifica la variante de CBH I puede ser cualquier vector que es capaz de replicarse de forma autónoma en un organismo huésped determinado o de integrarse en el ADN del huésped, habitualmente un plásmido. En realizaciones preferidas, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes. El primero contiene secuencias de ADN en que el promotor, la región codificante del gen y la secuencia terminadora se originan todas del gen a expresar. El truncamiento del gen se puede obtener cuando se desee mediante la eliminación de las secuencias de ADN no deseadas (por ejemplo, que codifican dominios deseados) para dejar que el dominio se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras de la transcripción y traducción. Un marcador seleccionable también puede contenerse en el vector que permite la selección para la integración en el huésped de múltiples copias de las nuevas secuencias de genes.

[0168] El segundo tipo de vector de expresión se preensamblan y contiene secuencias requeridas para la transcripción a nivel elevado y un marcador seleccionable. Se contempla que la región codificante para un gen o parte de la misma se puede insertar en este vector de expresión de objetivo general, de manera que se encuentra bajo el control transcripcional de las secuencias de promotor y terminador de los cassettes de expresión.

[0169] Por ejemplo, en Aspergillus, pRAX es dicho vector de expresión de objetivo general. Los genes o parte de los mismos se pueden insertar en dirección 3’ del promotor de glaA fuerte.

[0170] Por ejemplo, en Hypocrea, pTEX es dicho vector de expresión de objetivo general. Los genes o parte de los mismos se pueden insertar en dirección 3’ del promotor de cbh1 fuerte.

[0171] En el vector, la secuencia de ADN que codifica la variante de CBH I de la presente invención debe estar unida operativamente a secuencias de transcripción y traducción, es decir, una secuencia promotora y secuencia señal adecuadas en el marco de lectura al gen estructural. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra la actividad transcripcional en la célula huésped y puede derivar de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula huésped. Un péptido señal opcional proporciona la producción extracelular de la variante de CBH I. El ADN que codifica la secuencia señal es preferiblemente la que está asociada de forma natural con el gen a expresar, aunque la secuencia señal sea de cualquier origen adecuado, por ejemplo, una exocelobiohidrolasa o endoglucanasa de Trichoderma, se contempla en la presente invención.

[0172] Los procedimientos utilizados para unir las secuencias de ADN que codifican la variante de CBH I de la presente invención con el promotor, y la inserción vectores adecuados, son conocidos en la técnica.

[0173] El vector o construcción de ADN descrito anteriormente se puede introducir en la célula huésped según técnicas conocidas, tales como la transformación, transfección, microinyección, microporación, bombardeo biolístico y similares.

[0174] En la técnica de transformación preferida, debe tenerse en cuenta que la permeabilidad de la pared celular al ADN en la especie Hyprocrea sp. (Trichoderma sp.) es muy baja. Por consiguiente, la captación de la secuencia de ADN deseada, gen o fragmento de genes es, como mucho, mínima. Existe un conjunto de métodos para incrementar la permeabilidad de la pared celular de la especie Hyprocrea (Trichoderma sp.) en la cepa derivada (es decir, que carece de un gen funcional correspondiente al marcador seleccionable utilizado) antes del proceso de transformación.

[0175] El método preferido en la presente invención para preparar especie Aspergillus o Hyprocrea (Trichoderma sp.) para la transformación implica la preparación de protoplastos a partir de micelio fúngico. Véase Campbell et al. improved transformation efficiency of A.niger using homologous niaD gene for nitrate reductase. Curr. Genet. 16:5356; 1989. El micelio se puede obtener de esporas vegetales germinadas. El micelio se trata con una enzima que digiere la pared celular dando lugar a protoplastos. A continuación, los protoplastos se protegen mediante la presencia de un estabilizante osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente, la concentración de estos estabilizantes varía entre 0,8 M y 1,2 M. Es preferible utilizar aproximadamente una solución 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.

[0176] La captación del ADN en la cepa huésped (especies Aspergillus o Hyprocrea (Trichoderma sp.), depende de la concentración de ion calcio. En general, se utiliza CaCl2 entre aproximadamente 10 mM y 50 mM en una solución de captación. Además de la necesidad de ion calcio en la solución de captación, otros elementos incluidos en general son un sistema tampón, tal como un tampó TE (10 Mm Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA) o 10 mM tampón MOPS, pH 6,0 (ácido morfolinpropanosulfónico) y polietilenglicol (PEG). Se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares, permitiendo así que se libere el contenido del medio en el citoplasma de la célula huésped, a modo de ejemplo la cepa de las especies Aspergillus o Hypocrea, y el ADN plasmídico se transfiere al núcleo. Esta fusión deja frecuentemente múltiples copias del ADN plasmídico integradas suavemente en el cromosoma huésped.

[0177] Normalmente, se utiliza en la transformación una suspensión que contiene protoplastos o células de la especie Aspergillus que se ha sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 108/mL, preferiblemente 2 x 105 /mL. Se manera similar, se utiliza en la transformación una suspensión que contiene protoplastos o células de la especie Hypocrea (Trichoderma sp.) que se ha sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 108 a 109/mL, preferiblemente 2 x 108 /mL. Se mezcla un volumen de 100 μl de estos protoplastos o células en una solución apropiada (por ejemplo, 1,2 M sorbitol; 50 mM CaCl2) con el ADN deseado. En general, se añade una concentración elevada de PEG a la solución de captación. Se pueden añadir de 0,1 a 1 volumen de PEG 4000 al 25% a la suspensión de protoplastos. Sin embargo, es preferible añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. También se pueden añadir aditivos, tales como dimetil sulfóxido, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares a la solución de captación y ayudar en la transformación.

[0178] En general, la mezcla se incuba a continuación a aproximadamente 0°C durante un periodo entre 10 y 30 minutos. A continuación, se añade PEG adicional a la mezcla para aumentar adicionalmente la captación del gen o secuencia de ADN deseado. El PEG 4000 al 25% se añade en general en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados mayores y menores volúmenes. El PEG4000 al 25% es preferiblemente aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de añadir PEG, a continuación la mezcla de transformación se incuba a temperatura ambiente o en hielo antes de la adición de una solución de sorbitol y CaCl2. A continuación, la suspensión de protoplastos se añade posteriormente a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Este medio de crecimiento permite el crecimiento de únicamente

transformantes. Se puede utilizar cualquier medio de crecimiento en la presente invención que sea adecuado para el crecimiento de transformantes deseados. Sin embargo, si se seleccionan transformantes Pyr*, es preferible utilizar un medio de crecimiento que no contenga uridina. Las colonias posteriores se transfieren y purifican en un medio de crecimiento agotado en uridina.

[0179] En esta fase, los transformantes estables se pueden diferenciar de los transformantes no estables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un perfil más liso que rugoso en el medio de cultivo que carece de uridina. Adicionalmente, en algunos casos, se puede realizar un test adicional de estabilidad mediante el crecimiento de los transformantes en un medio sólido no selectivo (es decir, que contiene uridina), la recogida de esporas de este medio de cultivo y la determinación del porcentaje de estas esporas que germinarán posteriormente y crecerán en medio selectivo que carece de uridina.

[0180] En una realización particular del método anterior, la variante o variantes de CBH I se recuperan en forma activa de la célula huésped después del crecimiento en medio líquido como resultado del procesamiento posttraduccional apropiado de la variante de CBH I.

(ii) Levadura

[0181] La presente invención también contempla el uso de la levadura como célula huésped para la producción de CBH I. Varios otros genes que codifican enzimas hidrolíticas se han expresado en diversas cepas de la levadura S. cerevisiae. Estos incluyen secuencias que codifican dos endoglucanasas (Penttila et al., Yeast vol. 3, pp 175-185, 1987), dos celobiohidrolasas (Penttila et al., Gene, 63: 103-112, 1988) y una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei (Cummings and Fowler, Curr. Genet. 29:227-233, 1996), una xilanasa de Aureobasidlium Pullulans (Li and Ljungdahl, Appl. Environ. Microbiol. 62, no. 1, pp. 209-213, 1996), una alfa-amilasa de trigo (Rothstein et al., Gene 55:353-356, 1987), etc. Además, un cassette de genes de celulasa que codifica la endo- [beta] - 1,4-glucanasa (END1) de Butyrivibrio fibrisolvens, celobiohidrolasa (CBH1) de Phanerochaete chrysosporium, la celodextrinasa (CEL1) de Ruminococcus flavefaciens y la celobiasa (Bgl1) de Endomyces fibrilizer (Bgl1) se expresó satisfactoriamente en una cepa de laboratorio de S. cerevisiae (Van Rensburg et al., Yeast, vol. 14, pp. 67-76, 1998).

C. Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica CBH I en células huésped.

[0182] La invención también proporciona células y composiciones celulares que han sido genéticamente modificadas para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de CBH I proporcionada de manera exógena. Una célula parental o línea celular puede modificarse genéticamente (es decir, transducirse, transformarse

o transfectarse) con un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc., tal como se describe anteriormente.

[0183] Los métodos de transformación de la presente invención pueden dar lugar a la integración estable de todo o parte del vector de transformación en el genoma del hongo filamentoso. Sin embargo, también se contempla la transformación que da lugar al mantenimiento de un vector de transformación extracromosómica autoreplicante.

[0184] Se pueden utilizar muchos métodos de transfección estándar para producir líneas celulares de Trichoderma reesei que expresan grandes cantidades de la proteína heteróloga. Algunos de los métodos publicados para la introducción de construcciones de ADN en cepas productoras de celulasa de Trichoderma incluyen Lorito, Hayes, DiPietro y Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu y Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17:169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen y Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, para Aspergillus Yelton, Hamer y Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, para Fusarium Bajar, Podila y Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8202-8212, para Streptomyces Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK y para Bacillus Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi y Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55:135-138).

[0185] Otros métodos para la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo (vector de expresión) en hongos filamentosos (por ejemplo, H. jecorina) incluyen, pero sin limitación, la utilización de una pistola de partículas o genes, permeabilización de las paredes celulares de hongos filamentosos antes del proceso de transformación (por ejemplo, mediante la utilización de concentraciones elevadas de álcali, por ejemplo, 0,05 M a 0.4 M CaCl2 o acetato de litio), fusión de protoplastos o transformación mediada por agrobacterium. Un método de ejemplo para la transformación de hongos filamentosos mediante el tratamiento de protoplastos o esferoplastos con polietilenglicol y CaCl2 se describe en Campbell, E.I. et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989 y Penttila, M. et al., Gene, 63:11-22,1988.

[0186] Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleótidos exógenas en células huésped. Éstos incluyen la utilización de la transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, biolíticas, liposomas, microinyección, vectores plasma, vectores virales y cualquiera de otros métodos conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético exógeno en una célula huésped (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). También se utiliza el método de transfección mediada por Agrobacterium descrito en la patente de Estados Unidos No. 6,255,115. Sólo es necesario

que el procedimiento de modificación genética particular utilizado sea capaz de introducir satisfactoriamente por lo menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el gen heterólogo.

[0187] Además, las construcciones de ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de CBH I se pueden transcribir in vitro, y el ARN resultante se puede introducir en la célula huésped mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante inyección.

[0188] La invención incluye además transformantes nuevos y útiles de hongos filamentosos, tales como H. jecorina y

A. niger para utilizar en la producción de composiciones de celulasa fúngicas. La invención incluye transformantes de hongos filamentosos, especialmente hongos que comprende la secuencia codificante de la variante de CBH I, o la deleción de la secuencia codificante cbh endógena.

[0189] Después de la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia de codificación para una variante de cbh1, las células modificadas genéticamente pueden ser cultivadas en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para la activación de los promotores, selección de transformantes o amplificación de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica CBH I. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas anteriormente para la célula huésped seleccionada para la expresión, y será evidente para los expertos en la materia.

[0190] La progenie de las células en las que estas construcciones de ácidos nucleicos heterólogos se han introducido generalmente se considera que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de CBH I en la construcción de ácido nucleico heterólogo.

[0191] La invención también incluye transformantes nuevos y útiles de hongos filamentosos, tales como H. jecorina para su uso en la producción de composiciones de celulasa fúngicas. La invención incluye transformantes de hongos filamentosos, especialmente hongos que comprenden la secuencia codificante de la variante de cbh1, o la deleción de la secuencia codificante cbh endógena.

[0192] Los transformantes estables de hongos filamentosos pueden distinguirse generalmente de los transformantes no estables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un perfil más liso que rugoso en el medio de cultivo sólido. Adicionalmente, en algunos casos, se puede realizar un test adicional de estabilidad mediante el crecimiento de los transformantes en un medio sólido no selectivo, la recogida de esporas de este medio de cultivo y la determinación del porcentaje de estas esporas que germinarán posteriormente y crecerán en medio selectivo.

VII. Análisis de las secuencias codificantes de ácidos nucleicos y/o expresión de proteína de CBH1

[0193] Para evaluar la expresión de una variante de CBH I mediante una línea celular que ha sido transformada con una construcción de ácido nucleico que codifica una variante de CBH I, pueden realizarse ensayos a nivel de proteína, a nivel de ARN o mediante el uso de bioensayos funcionales particulares de la actividad y/o la producción de celobiohidrolasa.

[0194] En una aplicación de ejemplo de las secuencias de ácido nucleico y de proteínas de variante de cbh 1 aquí descritas, se diseña una cepa modificada genéticamente de hongos filamentosos, por ejemplo, Trichoderma reesei, para producir una mayor cantidad de CBH I. Estos hongos filamentosos genéticamente modificados serían útiles para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica. En una estrategia, esto se logra mediante la introducción de la secuencia de codificación para cbh1 en un huésped adecuado, por ejemplo, un hongo filamentoso tal como Aspergillus niger.

[0195] Por consiguiente, la invención incluye procedimientos para expresar la variante de CBH I en un hongo filamentos u otro huésped adecuado mediante la introducción de un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN que codifica la variante de CBH I en las células de hongos filamentosos u otro huésped adecuado.

[0196] En otro aspecto, la invención incluye métodos para modificar la expresión de CBH I en un hongo filamentos u otro huésped adecuado. Dicha modificación incluye una reducción o eliminación de la expresión de la CBH endógena.

[0197] En general, los ensayos utilizados para analizar la expresión de la variante de CBH I incluyen transferencia Northern, transferencia “dot” (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa), o hibridación in situ, utilizando una sonda debidamente marcada (basada en la secuencia de codificación de ácido nucleico) y transferencia Southern y autorradiografía convencionales.

[0198] Además, la producción y/o la expresión de variante de CBH I se pueden medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos para la actividad, expresión y/o producción de la celobiohidrolasa. Estos ensayos se describen, por ejemplo, en Becker et al., Biochem J. (2001) 356:19-30 y Mitsuishi et al., FEBS (1990) 275:135-138, cada uno incorporados expresamente por referencia en la presente invención. La capacidad de CBH I para hidrolizar

sustratos aislados solubles e insolubles se puede medir mediante los ensayos descritos en Srisodsuk et al., J. Biotech. (1997) 57:49-57 y Nidetzky y Claeyssens Biotech. Bioeng. (1994) 44:961-966. Los sustratos útiles para ensayar las actividades de celobiohidrolasa, endoglucanasa o -glucosidasa, incluyen celulosa cristalina, papel de filtro, celulosa hinchada con ácido fosfórico, celooligosacáridos, metilumbeliferil lactósido, metilumbeliferil celobiósido, ortonitrofenil lactósido, paranitrofenil lactósido, ortonitrofenil celobiósido, paranitrofenil celobiósido.

[0199] Además, la expresión de proteínas se puede evaluar mediante métodos inmunológicos, tal como tinción inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o inmunoensayo del medio de cultivo de tejidos, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. Dichos inmunoensayos pueden utilizarse para evaluar cualitativa y cuantitativamente la expresión de una variante de CBH I. Los detalles de estos procedimientos son conocidos por los expertos en la materia y muchos reactivos para la práctica de dichos métodos están disponibles comercialmente.

[0200] Una forma purificada de una variante de CBH I puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales o policlonales o específicos para la proteína expresada para su uso en inmunoensayos diferentes. (Véase, por ejemplo, Hu et al., Mol Cell Biol. vol.11, no. 11, pág. 5792-5799, 1991). Ensayos de ejemplo incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, transferencia Western, ensayos de inmunofluorescencia indirecta y similares. En general, se pueden utilizar anticuerpos y/o kits disponibles comercialmente para el inmunoensayo cuantitativo del nivel de expresión de las proteínas de celobiohidrolasa.

VIII. Aislamiento y purificación de proteína CBH1 recombinante

[0201] En general, una proteína variante de CBH I producida en cultivo celular es secretada en el medio y se puede purificar o aislar, por ejemplo, eliminando los componentes no deseados del medio de cultivo celular. Sin embargo, en algunos casos, una proteína variante de CBH I pueden producirse en una forma celular que requiere la recuperación de un lisado celular. En tales casos, la proteína variante de CBH I se purifica de las células en las que se produjo utilizando técnicas habitualmente empleadas por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no limitados a, cromatografía de afinidad (Tilbeurgh et al., FEBS Lett. 16:215, 1984), métodos cromatográficos de intercambio iónico ((Goyal et al., Bioresource Technol. 36:37-50, 1991; Fliess et al., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314-318, 1983; Bhikhabhai et al., J. Appl. Biochem. 6:336-345, 1984; Ellouz et al., J. Chromatography 396:307-317; 1987), incluyendo el intercambio iónico utilizando materiales con alto poder de resolución (Medve et al., J. Chromatography A 808:153-165, 1998), cromatografía de interacción hidrofóbica (Tomaz and Queiroz, J. Chromatography A 865:123-128, 1999), y separación de dos fases (Brumbauer, et al., Bioseparation 7:287-295, 1999).

[0202] Habitualmente, la proteína variante de CBH I se fracciona para separar las proteínas que tienen propiedades seleccionadas, tales como la afinidad de unión a agentes de unión particulares, por ejemplo, anticuerpos o receptores, o que tienen un intervalo de peso molecular seleccionado, o un intervalo de puntos isoeléctricos.

[0203] Una vez que se consigue la expresión de una proteína variante de CBH I determinada, la proteína CBH I así producida se purifica a partir de células o cultivo celular. Procedimientos de ejemplo adecuados para esta purificación incluyen los siguientes: cromatografía de columna de afinidad a anticuerpos, cromatografía de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía de sílice o en una resina de intercambio catiónico, como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de proteínas y estos métodos son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, vol. 182, no. 57, pp. 779, 1990; Scopes, Methods Enzymol. 90: 479-91, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y de la proteína particular producida.

IX. Utilización de cbh1 y CBH1

[0204] Se puede entender que los ácidos nucleicos de la variante de cbh, la proteína variante de CBH I y las composiciones que comprenden actividad de la proteína variante de CBH I son útiles en una amplia variedad de aplicaciones, algunas de las cuales se describen a continuación

[0205] Las nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que comprenden cantidades variables de celulasas de tipo CBH, tipo EG y tipo BG son útiles en composiciones detergentes que presentan una capacidad de limpieza mejorada, función como agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodón (por ejemplo, &quot;lavado de piedra&quot; o &quot;biopulido&quot;), en las composiciones para degradar la pulpa de madera en azúcares (por ejemplo, para la producción de bioetanol), y/o en composiciones de alimentación. El aislamiento y la caracterización de la celulasa de cada tipo proporcionan la capacidad de controlar los aspectos de dichas composiciones.

[0206] Las variantes (o mutantes) de CBH con una mayor termoestabilidad son útiles en todas las áreas anteriores debido a su capacidad de mantener la actividad a temperaturas elevadas.

[0207] Las variantes (o mutantes) de CBH con una menor termoestabilidad son útiles, por ejemplo, en áreas en las

que la actividad de la enzima se requiere que sea neutralizada a temperaturas inferiores, de manera que otras enzimas que pueden estar presentes no se vean afectadas. Además, las enzimas pueden ser útiles en la conversión limitada de celulósicos, por ejemplo, en el control del grado de cristalinidad o de la longitud de cadena celulósica. Después de alcanzar el grado deseado de conversión, se puede elevar la temperatura de sacarificación por encima de la temperatura de supervivencia de la CBH I desestabilizada. Dado que la actividad de CBH I es esencial para la hidrólisis de la celulosa cristalina, la conversión de celulosa cristalina cesará a temperatura elevada.

[0208] Las variantes (o mutantes) de CBH con mayor reversibilidad, es decir un mayor replegamiento y retención de la actividad, también son útiles en áreas similares. Dependiendo de las condiciones de desactivación térmica, la desnaturalización reversible puede competir con, o dominar sobre, el proceso irreversible. Las variantes con una mayor reversibilidad mostrarían, bajo estas condiciones, una mayor resistencia a la desactivación térmica. La mayor reversibilidad también tendría ventajas potenciales en cualquiera de los procesos en los que la desactivación era seguida por un tratamiento bajo condiciones no desactivantes. Por ejemplo, en un proceso de Hidrólisis y Fermentación Híbrida (HHF) para la conversión de biomasa en etanol, la biomasa sería primera sacarificada de forma incompleta por las celulasas a temperatura elevada (por ejemplo, 50°C o superior), a continuació n se bajaría la temperatura (hasta 30°C, por ejemplo) para permi tir la introducción de un organismo fermentador para convertir slo azúcares en etanol. Si, después del descenso de la temperatura del proceso, la celulasa desactivada térmicamente se replegaba de manera reversible y recuperaba la actividad, entonces la sacarificación podía continuar a niveles más elevados de conversión durante el proceso de fermentación a baja temperatura.

[0209] En una estrategia, la celulasa de la invención es útil en composiciones detergentes o en el tratamiento de tejidos para mejorar el tacto y la apariencia.

[0210] Como la velocidad de hidrólisis de los productos celulósicos puede incrementarse mediante el uso de un transformante que tenga por lo menos una copia adicional del gen cbh insertado en el genoma, los productos que contienen celulosa o heteroglicanos pueden degradarse a un ritmo más rápido y en mayor medida. Los productos producidos a base de celulosa, tal como papel, algodón, pañales de celulosa y similares se puede degradar de manera más eficiente en un vertedero. Así, el producto de la fermentación que se puede obtener a partir de los transformantes o los transformantes en solitario pueden utilizarse en composiciones para ayudar a degradar mediante licuación una gran variedad de productos de celulosa que se añaden a los vertederos llenos.

[0211] La sacarificación y la fermentación separada es un proceso mediante el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, forraje de maíz, se convierte en glucosa y, posteriormente, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. La sacarificación y fermentación simultánea es un proceso mediante el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, forraje de maíz, se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. Por lo tanto, en otra estrategia, el tipo de celulasa de variante de CBH de la invención es útil en la degradación de la biomasa en etanol. La producción de etanol a partir de fuentes fácilmente disponibles de celulosa proporciona una fuente de combustible renovable estable.

[0212] La materia prima con base de celulosa comprende residuos agrícolas, pastos y bosques y otra biomasa de bajo valor, tal como residuos municipales (por ejemplo, papel reciclado, hierba cortada, etc.). El etanol puede ser producido a partir de la fermentación de cualquiera de estas materias primas celulósicas. Sin embargo, la celulosa debe convertirse primero en azúcares, antes de que pueda haber la conversión en etanol.

[0213] Se pueden utilizar una gran variedad de materias primas con la variante de CBH de la invención y la seleccionada para su uso puede depender de la región en la que se realiza la conversión. Por ejemplo, en el medio oeste de Estados Unidos los residuos agrícolas tales como paja del trigo, forraje de maíz y bagazo pueden predominar, mientras que en California puede predominar la paja de arroz de. Sin embargo, debe entenderse que cualquier biomasa disponible de celulosa se puede utilizar en cualquier región.

[0214] Una composición de celulasa que contiene una cantidad mayor de celobiohidrolasa es útil en la producción de etanol. El etanol a partir de este proceso también se puede utilizar posteriormente como potenciador del octanaje o directamente como combustible en lugar de la gasolina, lo que es ventajoso porque el etanol como fuente de combustible es más ecológico que los productos derivados del petróleo. Es sabido que el uso de etanol mejorará la calidad del aire y posiblemente reducirá los niveles locales de ozono y de contaminación (smog). Además, la utilización de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia estratégica en la amortiguación del impacto de los cambios repentinos en los suministros de energías no renovables y petroquímicos.

[0215] El etanol puede producirse a través de procesos de sacarificación y fermentación de biomasa de celulosa, tal como árboles, plantas herbáceas, residuos sólidos municipales y residuos agrícolas y forestales. Sin embargo, la proporción de las enzimas de celulasa individuales en una mezcla de celulasas producida de manera natural mediante un microbio puede no ser la más eficaz para la rápida conversión de la celulosa de la biomasa en glucosa. Se sabe que las endoglucanasas actúan para producir nuevos extremos en la cadena de celulosa que por sí mismos son sustratos para la acción de celobiohidrolasas y mejorar así la eficiencia de la hidrólisis del sistema de celulasa entero. Por lo tanto, la utilización de una actividad de celobiohidrolasa aumentada u optimizada puede aumentar considerablemente la producción de etanol.

[0216] De este modo, la celobiohidrolasa de la invención es útil en la hidrólisis de la celulosa en sus componentes de azúcar. En una realización, se añade una variante de celobiohidrolasa a la biomasa antes de la adición de un organismo de fermentación. En una segunda realización, se añade una variante de la celobiohidrolasa a la biomasa al mismo tiempo que un organismo de fermentación. Opcionalmente, puede haber otros componentes de celulasa presentes en cualquier realización

[0217] En otra realización, la materia prima de celulosa se puede tratar previamente. El tratamiento previo puede ser mediante temperatura elevada y la adición de una solución de ácido diluido, ácido concentrado o solución álcali diluida. La solución de tratamiento previo se añade durante un tiempo suficiente para, por lo menos parcialmente, hidrolizar los componentes de la hemicelulosa y luego neutralizarlos.

[0218] El producto principal de la acción de CBH I en la celulosa es la celobiosa que está disponible para la conversión en glucosa por la actividad de BG (por ejemplo, en un producto de celulasa fúngica). Ya sea por tratamiento previo de la biomasa celulósica o por la acción enzimática en la biomasa, otros azúcares, además de la glucosa y la celobiosa, pueden estar disponibles a partir de la biomasa. El contenido de hemicelulosa de la biomasa se puede convertir (mediante hemicelulasas) en azúcares, tales como xilosa, galactosa, manosa y arabinosa. De este modo, en un proceso d conversión de biomasa, la sacarificación enzimática puede producir azúcares que están disponibles para las conversiones biológica o química en otros intermedios o productos finales. Por lo tanto, los azúcares generados a partir de la biomasa son útiles en una variedad de procesos, además de la generación de etanol. Ejemplos de dichas conversiones son la fermentación de glucosa en etanol (revisado por M.E. Himmel et al. pp2-45, en &quot;Fuels and Chemicals from Biomass&quot;, ACS Symposium Series 666, ed B.C. Saha and J. Woodward, 1997) y otras conversiones biológicas de glucosa en 2,5-diceto-D-gluconato (Patente de Estados Unidos No. 6,599,722), ácido láctico (R. Datta y S-P. Tsai pág 224-236, ibid), succinato (R.R. Gokam, M.A. Eiteman and J. Sridhar pág 237-263, ibid), 1,3-propanodiol (A-P. Zheng, H. Biebl and WD. Deckwer pág 264-279, ibid), 2,3butanodiol (C.S. Gong, N. Cao and G.T. Tsao pág 280-293, ibid), y las conversiones química y biológica de xilosa en xilitol (B.C. Saha and R.J. Bothast pág307-319, ibid). Véase también, por ejemplo, WO 98/21339.

[0219] Las composiciones de detergente de la invención pueden emplear, además de la composición de celulasas (independientemente del contenido de celobiohidrolasa, es decir, celobiohidrolasa libre, celobiohidrolasa sustancialmente libre, o celobiohidrolasa mejorada), un tensoactivo, incluyendo tensoactivos aniónicos, no iónicos y anfolíticos, una hidrolasa, agentes de relleno, agentes blanqueantes, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores de la aglomeración, solubilizantes, tensoactivos catiónicos y similares. Todos estos componentes son conocidos en el sector de los detergentes. La composición de celulasa tal como se describe anteriormente se puede añadir a la composición de detergente, ya sea en un diluyente líquido, en gránulos, en emulsiones, en geles, en pastas, y similares. Dichas formas son bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Cuando se utiliza una composición de detergente sólido, la composición de celulasas se formula preferentemente como gránulos. Preferentemente, los gránulos pueden formularse de manera que contengan un agente protector de celulasa. Para una descripción más completa, véase la patente US 6162782, titulada &quot;Composiciones de detergentes que contienen compuestos de celulasa deficientes en componentes CBH de tipo I&quot;, que se incorpora en la presente por referencia.

[0220] Preferiblemente, las composiciones de celulasas se utilizan entre aproximadamente un 0,00005 por ciento en peso y aproximadamente un 5 por ciento en peso en relación a la composición total de detergente. Más preferentemente, las composiciones de celulasas se utilizan entre aproximadamente un 0,0002 por ciento en peso y aproximadamente un 2 por ciento en peso en relación al total de la composición del detergente.

[0221] Además, la secuencia de ácidos nucleicos de la variante de cbhI se útil en la identificación y caracterización de las secuencias de ácido nucleico relacionadas. Una serie de técnicas útiles para determinar (predecir o confirmar) la función de genes o productos génicos relacionados incluyen, pero sin limitación: (A) análisis de ADN/ARN, tal como (1) sobreexpresión, expresión ectópica y expresión en otras especies, (2) “knock-out” génico (genética inversa, knock-out dirigido, silenciado génico inducido viral (VIGS, ver see Baulcombe, 100 Years of Virology, Calisher and Horzinek eds., Springer-Verlag, New York, NY 15:189-201, 1999), (3) análisis del estado de metilación del gen, especialmente regiones reguladoras flanqueantes, y (4) hibridación in situ; (B) análisis de productos génicos tales como (1) expresión de proteína recombinante, (2) producción de antisueros, (3) inmunolocalización; (4) ensayos bioquímicos para la actividad catalítica u otra actividad; (5) estado de fosforilación; y (6) interacción con otras proteínas a través de análisis de dos híbridos de levadura; (C) análisis de mecanismos, tal como la colocación de un gen o producto génico dentro de un producto bioquímico particular o mecanismo de señalización basado en su fenotipo de sobreexpresión o mediante homología de secuencia con los genes relacionados; y (D) otros análisis que también se pueden realizar para determinar o confirmar la participación del gen aislado y de su producto en una vía metabólicas o de señalización particular, y ayudar a determinar la función del gen.

[0222] Todas las patentes, solicitudes de patente, artículos y publicaciones mencionados aquí, se incorporan expresamente en la presente por referencia.

EJEMPLOS

[0223] La presente invención se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos que de ningún modo pretenden limitar el alcance de la invención según se reivindica. Las figuras adjuntas deben considerarse como partes integrales de la memoria y descripción de la invención. Todas las referencias citadas se incorporan específicamente aquí por referencia para todo lo que se describe en la misma.

EJEMPLO 1

Alineación de celulasas Cel7A conocidas

[0224] La elección de varias de las mutaciones se determinó alineando primero Cel7A de Hypocrea jecorina a sus 41 miembros de la familia utilizando información estructural y un programa de modelaje. La alineación de la secuencia primaria de aminoácidos de los 42 miembros de la familia se muestra en la figura 8.

[0225] Para cuatro de los miembros (es decir, 20VW.1, 1A39, 6CEL y 1EG1.1), se había determinado previamente la estructura cristalina. Las 4 proteínas alineadas de las que habían estructuras publicadas presentaban su alineación bloqueada para todos los residuos cuyos átomos de la estructura estaban en una desviación RMS específica (RMS inferior o igual a 2,0 A). La alineación estructural terciaria de las cuatro secuencias se realizó utilizando versión 2001.01 por Chemical Computing Group, Montreal Canadá. Se utilizaron elementos estructurales solapantes para congelar las estructuras primarias de las cuatro secuencias. Las 38 secuencias restantes tenían entonces su estructura primaria de aminoácidos alineada con las cuatro congeladas utilizando MOE con la predicción de la estructura secundaria activada y los otro parámetros fijados a los valores por defecto.

[0226] En base a las alineaciones, se realizaron varias mutaciones individuales y múltiples de aminoácidos en la proteína mediante mutagénesis de sitio.

[0227] Las mutaciones de aminoácidos individuales se basaron en las siguientes razones (véase también la tabla 1): Después de examinar la conservación de aminoácidos entre los homólogos, se escogieron los sitios en la secuencia de H. jecorina donde se observaba una preferencia estadística por otro aminoácido entre las otras 41 secuencias (por ejemplo, en la posición 77 la Ala, sólo presente en H. jecorina y otros 3 homólogos, se cambió a Asp, presente en las otras 22). A continuación, se modeló el efecto de cada sustitución en la estructura.

Tabla 1: Variantes de Cel7A y razones para el cambio

Variantes de Cel7A y

Tf ΔTf

razones para el cambio

H. jecorina de tipo salvaje

62,5

(4)A77D(22)

3 posibles enlaces de H a 62,2 -0,3

Q7 y 180

(7)S113D(18)

numerosos nuevos 62,8 0,3

enlaces de H al esqueleto

para estabilizar el giro

(8)L225F(13)

mejor empaquetamiento 61,6 -0,9

interno

(5)L288F(17)

mejor empaquetamiento 62,4 -0,1

interno

(1)A299E(24)

ligando extra a átomo de 61,2 -1,3

cobalto observado en la

estructura cristalina

(4)N301 K(11)

puentes de sales a E295 y 63,5 1,0

E325

(5)T356L(20)

mejor empaquetamiento 62,6 -0,8

interno

(2)G430F(17)

mejor empaquetamiento 61,7 -0,8

de superficie

[0228] Las mutaciones múltiples de aminoácidos se basaron en el deseo de afectar a la estabilidad, procesabilidad e inhibición por el producto de la enzima. Se construyeron los siguientes múltiples cambios de sitio en la secuencia de

H. jecorina:

1) Thr 246 Cys + Tyr 371 Cys 2) Thr 246 Ala + Arg 251 Ala + Tyr 252 Ala 3) Thr 380.Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala + deleción de los residuos 382 a 393, ambos inclusive 4) Thr 380 Gly + Tyr 381 Asp + Arg 394 Ala 5) Tyr 252 Gln + Asp 259 Trp + Ser 342 Tyr [0229] Se predice que T246A/R251A/Y252A y la otra triple + mutante por deleción disminuyen la inhibición por el producto de la enzima. Se predice que Thr246Cys + Tyr371 Cys incrementa la estabilidad de la enzima e incrementa la procesabilidad de la misma. Se predice que la variante D259W/Y252Q/S342Y afecta a la inhibición por el producto de la enzima.

5 [0230] Se construyeron otras mutaciones individuales y múltiples utilizando métodos conocidos en la técnica (véanse las referencias anteriores y se presentan en la tabla 2.

10 Tabla 2: Variantes de CBH I de H. jecorina

Mutaciones

S8P

N49S

A68T

A77D

N89D

S92T

S113N

S113D

L225F

P227A

P227L

D249K

T255P

D257E

S279N

L288F

E295K

S297T

A299E

N301K

T332K

T332Y

T332H

T356L

F338Y

V393G

G430F

T41I (más la eliminación de Thr en 445)

V403D/T462I

S196T/S411F

E295K/S398T

A112E/T226A

T246C/Y371C

G22D/S278P/T296P

SBP/N1031/S113N

S113T/T255P/K286M

P227L/E325K/Q487L

P227T/T484S/F352L

T246A/R251A/Y252A

T380G/Y381D/R394A

Y252Q/D259W/S342Y

A68T/G440R/P491L

Q17L/E193V/M213I/F352L

S8P/N49S/A68T/S113N

A112E/P227L/S278P/T296P

S8P/N49S/A68T/N103I/S113N

S8P/N49S/A68T/S278P/T296P

G22D/N49S/A68T/S278P/T296P

G22D/N 1031/S113N/S278P/T296P

S8P/N49S/A68T/S113N/P227L

S8P/N49S/A68T/A112E/T226A

S8P/N49S/A68T/A112E/P227L

T41I/A112E/P227L/S278P/T296P

S8P/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L

S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L

G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P

G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P

G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/ T296P

G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/ T296P

G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/ T296P

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F

S8P/G22D/T411/N49S/A68T/N1031/S113N/S278PlT296P

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N1103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R

S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/ E325K/S411F

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/ V403D/S411F/T462I

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/ E325K/V403D/S411F/T462I

EJEMPLO 2

Clonación y expresión de variantes de CBH I en H. jecorina

A. Construcción del plásmido PTEX de expresión de objetivo general de H. jecorina.

[0231] Se construyó el plásmido, pTEX siguiendo los métodos de Sambrook et al. (1989), supra, y se ilustra en la figura 7. Este plásmido se ha diseñado como un vector de expresión con múltiples objetivos para utilizar en el hongo 10 filamentoso Trichoderma longibrachiatum. El cassette de expresión tiene varias características únicas que lo hacen útil para esta función. La transcripción se regula utilizando las secuencias de promotor y terminador del gen de CBH I para T. longibrachiatum. Ente el promotor y terminador de CBHI, existen sitios de restricción únicos Pmel y Sstl que se utilizan para insertar el gen a expresar. El gen marcador seleccionable pyr 4 de T. longibrachiatum se ha insertado en el terminador de CBHI y todo el cassette de expresión (promotor de CBHI–sitios de inserción–

15 terminador de CBHI-gen pyr4-terminador de CBHI) se puede escindir utilizando el sitio de restricción único Notl o los sitios de restricción únicos Notl y Nhel.

[0232] Este vector se basa en el vector bacteriano, pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.), que es un vector de tipo PUC con un sitio de clonación múltiple extendido. Un experto en la materia sería capaz de construir este vector

20 en base al diagrama de flujo ilustrado en la figura 7.

[0233] El vector pTrex2L se construyó a partir de pTrex2, un derivado de pTEX. La secuencia para pTrex2 se proporciona en la figura 6.

25 [0234] El plásmido exacto utilizado no es tan importante siempre que la variante de proteína se exprese a nivel útil. Sin embargo, es ventajoso maximizar el nivel de expresión forzando la integración en el locus cbh1.

B. Clonación

30 [0235] Utilizando métodos conocidos en la técnica, un experto puede clonar la variante e CBHI deseada en un vector apropiado. Tal como se ha indicado anteriormente, el plásmido exacto utilizado no es tan importante siempre que la variante de proteína se exprese en un nivel útil. La siguiente descripción de la preparación de una de las variantes de enzimas de CBH I de la invención se puede utilizar para preparar cualquiera de las variantes de la invención aquí descritas.

35 [0236] Las variantes de genes cbh 1 se clonaron en el vector pTrex2L.

[0237] La construcción del plásmido pTrex2L se realiza de la siguiente manera: Se sustituyeron los 6 nucleótidos entre los sitios Sac II y Asc únicos de pTrex2 por un enlazador sintético que contenía sitios BstE II y BamHI para

producir el plásmido Trex2L. Se hibridaron os enlazadores sintéticos complementarios oligo CBHlink1+ sintético de 21 unidades: GGTTTGGATCCGGTCACCAGG y oligo CBHlink- sintético de 27 unidades: CGCGCCTGGTGACCGGATCCAAACCGC.

5 [0238] Se digirió pTrex2 con Sac II y Asc I. A continuación, el enlazador hibridado se unió a pTrex2 para crear pTrex2L. A continuación, el plásmido se digirió con una enzima o enzimas de restricción apropiadas y se unió un gen de CBH I de tipo salvaje en el plásmido.

[0239] Se utilizaron cebadores para introducir las mutaciones deseadas en el gen de tipo salvaje. Se entenderá que

10 se puede utilizar cualquier método que dé lugar a la introducción de una alteración o mutación deseada en el gen. Se utilizaron cebadores de ADN sintéticos como plantillas de PCR para las construcciones de mutantes. Es bien conocido para un experto en la materia el diseño de los cebadores en base a la mutación deseada a introducir.

[0240] Las plantillas mutagénicas se extendieron y se realizaron las cadenas dobles mediante PCR utilizando los

15 oligonucleótidos de ADN sintéticos. Después de 25 ciclos de PCR, el producto final era principalmente un producto de doble cadena de 58 pb que comprendía la mutación deseada. Los fragmentos mutagénicos se unieron posteriormente a fragmentos de CBH I de tipo salvaje y se unieron en el plásmido utilizando técnicas estándar.

C. Transformación y expresión

20 [0241] El vector preparado para la variante deseada se transformó en la versión auxótrofa de uridina de las cepas de Trichoderma eliminadas en doble o quad (véase la tabla 3; véanse también las patentes de Estados Unidos Nos. 5,861,271 y 5,650,322) y se identificaron los transformantes estables.

25 Tabla 3: Transformación/cepa de expresión

Variante de CBH I

Cepa de expresión

A77D

cepa eliminada en quad (1A52)

S113D

cepa eliminada en doble

L225F

cepa eliminada en doble

L288F

cepa eliminada en doble

A299E

cepa eliminada en quad (1A52)

N301K

cepa eliminada en quad (1A52)

T356L

cepa eliminada en doble

G430F

cepa eliminada en quad (1A52)

T246C/Y371C

cepa eliminada en quad (1A52)

T246A/R251A/Y252A

cepa eliminada en quad (1A52)

Y252Q/D259W/S342Y

cepa eliminada en quad (1A52)

T380G/Y381D/R394A

cepa eliminada en quad (1A52)

T380G/Y381D/R394A más eliminación de 382-393

cepa eliminada en quad (1A52)

cepas huésped de T. reesei &quot;eliminadas en doble&quot; (L CBHI y L CBHII) y &quot;eliminadas en quad&quot; (L CBHI y A CBHII, L EGI y A EGII)

[0242] Para seleccionar qué transformantes expresaban la variante de CBH I, se aisló ADN de cepas después del crecimiento en Vogels + glucosa al 1% y se realizaron experimentos de transferencia Southern utilizando un

30 fragmento de ADN aislado que contenía sólo la variante de CBH I. Se aislaron transformantes que tenían una copia del cassette de expresión de la variante de CBH I integrado en el genoma de la célula huésped. Se aisló el ARNm total de las cepas después del crecimiento durante 1 día en Vogels + lactosa al 1%. Se sometió el ARNm a análisis Northern utilizando la región codificante de la variante de CBH I como una sonda. Se identificaron los transformantes que expresaban el ARNm de la variante de CBHI.

35 [0243] Se puede obtener cualquier otra variante de celulasas de CBH I nueva o derivada de la misma mediante la utilización de los métodos descritos anteriormente.

EJEMPLO 3

Expresión de variantes de CBH1 en A. niger

[0244] Se obtuvieron los fragmentos de PCR utilizando los siguientes cebadores y protocolos.

45 [0245] Se construyeron los siguientes cebadores de ADN para utilizar en la amplificación de genes de CBH1 homólogos a partir de ADN genómico aislado de varios microorganismos. Todos los símbolos utilizados aquí para secuencias de proteína y ADN corresponden a los códigos de la IUPAC IUB Biochemical Nomenclature Commission.

[0246] Se desarrollaron cebadores homólogos 5’ (FRG192) y 3’ (FRG193) en base a la secuencia de CBH1 de Trichoderma reesei. Ambos cebadores contenían secuencias de clonación Gateway de Invitrogen® en el 5’ del cebador. El cebador FRG192 contenía la secuencia attB1 y el cebador FRG193 contenía la secuencia attB2.

Secuencia de FRG192 sin la attB1: ATGTATCGGAAGTTGGCCG (secuencia señal de CBH1 de H. jecorina) (SEC ID NO: 3) Secuencia de FRG193 sin la attB2: TTACAGGCACTGAGAGTAG (modulo de unión a celulosa de CBH1 de H. jecorina) (SEC ID NO: 4)

[0247] El clon de ADNc de CBH I de H. jecorina como plantilla.

[0248] Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 10 μL de 10X tampón de reacción (10X tampón de reacción que comprende Tris HCl 100 mM, pH 8-8,5; KCI 250 mM; (NH4)2SO4 50 mM; MgSO4 20 mM); 0,2 mM de cada uno de dATP, dTTP, dGTP, dCTP (concentración final), 1 μL de ADN genómico 100 ng/μL, 0,5 μL de PWO polimerasa (Boehringer Mannheim, Cat # 1644-947) a 1 unidad por μL, 0,2μM de cada cebador, FRG192 y FRG193, (concentración final), 41μl DMSO y agua hasta 100 μL.

[0249] Varios sitios en CBH1 de H. jecorina CBH1 pueden estar implicados en la termoestabilidad de las variantes y por tanto el gen de CBH1 de H. jecorina se sometió a mutagénesis.

[0250] Los fragmentos que codificaban las variantes se purificaron a partir de un gel de agarosa utilizando el KIT de extracción Qiagen Gel. Los fragmentos purificados se utilizaron para realizar una reacción de clonasa con el vector pDONR™201 de Invitrogen® utilizando el manual de instrucciones (versión C) de Gateway™ Technology de Invitrogen®, incorporado en la presente por referencia. A continuación, los genes se transfirieron desde el vector ENTRY al vector de destino (pRAXdes2) para obtener el vector de expresión pRAXCBH1.

[0251] Las células se transformaron con un vector de expresión que comprendía un ácido nucleico que codificaba una variante de celulasa CBH I. Las construcciones se transformaron en A. niger var. awamori según el método descrito por Cao et al (Cao Q-N, Stubbs M, Ngo KQP, Ward M, Cunningham A, Pai EF, Tu G-C y Hofmann T (2000) Penicillopepsin-JT2 a recombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9: 991-1001).

[0252] Los transformantes se dispersaron en placas de medio mínimo (Ballance DJ, Buxton FP, y Turner G (1983) Transformation of Aspergillus nidulans by the orotidine-5’-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassa Biochem Biophys Res Commun 112:284-289) y se desarrollaron durante 4 días a 30oC. Se recogieron las esporas utilizando métodos conocidos en la técnica (Véase http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>). Se recogieron conidios de A. nidulans en agua (mediante la disposición en tubos de la superficie de una cultivo de conidios con una varilla de vidrio estéril doblada para sacar las esporas) y se pueden almacenar durante semanas a meses a 4oC sin una pérdida seria de viabilidad. Sin embargo, las esporas recién recogidas germinan de manera más reproducible. Para un almacenamiento a largo plazo, las esporas se pueden almacenar en glicerol al 50% a -20°C, o en glicerol al 15-20% a -80°C. El gliceerol se pipetea más fácilmen te como una solución al 80% en agua. Se utilizan 800 μl de una suspensión acuosa de conidios (producida para un almacenamiento a 4°C) añadidos a 200 μl de glicerol al 80% para una solución madre a -80°C; se utilizan 400 μl de suspensión añadidos a 600 μl de glicerol al 80% para una solución madre a -20°C. Se agita antes de congelarse . Para las recogidas de mutantes, se pueden escindir piezas pequeñas de cultivos de conidios y se pasan en glicerol al 20%, se agitan y se congelan como soluciones madre a 80°C stocks. En este caso, se almacenaron en glicero l al 50% a -80°C.

[0253] Se desarrollaron transformantes de A. niger var awamori en medio mínimo que carecía de uridina (Ballance et al. 1983). Los transformantes se cribaron por la actividad de celulasa mediante la inoculación de 1 cm2 de suspensión de esporas de la placa de agar con desarrollo esporulado en matraces de agitación de 100 ml durante 3 días a 37°C tal como se describe por Cao et al. (20 00).

[0254] El ensayo de actividad de CBHI se basa en la hidrólisis del 4-metilumbeliferil--lactósido no fluorescente en los productos lactosa y 7-hidroxi-4-metilcumarina, éste último es responsable de la señal fluorescente. Se pipetean 170 μl de tampón NaAc 50 mM pH 4,5 en una placa de microtitulación de 96 pocillos (MTP) (Greiner, Fluotrac 200, art. nr. 655076) adecuada para fluorescencia. Se añaden 10 μl de sobrenadante y a continuación se añaden 10 μl de MUL (4-metilumbeliferil--lactósido (MUL) 1 mM en agua milliQ) y se pone la MTP en el Fluostar Galaxy (BMG Labtechnologies; D-77656 Offenburg). Se mide la cinética durante 16 minutos (8 ciclos de 120 s cada uno) utilizando una 1320 nm (excitación) y A460 nm (emisión) a 50°C. A continuación, los sobrenadantes que tenían actividad de CBH se sometieron a Cromatografía de Interacción Hidrofóbica.

EJEMPLO 4

Estabilidad de las variantes de CBH 1

[0255] Se clonaron las variantes de celulasa CBHI y se expresaron como antes (véanse los ejemplos 2 y 3). A continuación, Cel7A variantes y de tipo salvaje se purificaron de sobrenadantes libres de células de estos cultivos mediante cromatografía en columna. Se purificaron las proteínas utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Las columnas se desarrollaron en un Sistema de Cromatografía de Perfusión BioCAD® Sprint utilizando

5 resinas Poros® 20 HP2 producidas por Applied Biosystems.

[0256] Las columnas HIC se equilibraron con 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,020 M, sulfato de amonio 0,5 M a pH 6,8. Se añadió sulfato de amonio a los sobrenadantes hasta una concentración final de aproximadamente 0,5 M y el pH se ajustó hasta 6,8. Después de la filtración, el sobrenadante se cargó en la

10 columna. Después de cargarse, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y a continuación se eluyó con una gradiente de 10 volúmenes de columna desde sulfato de amonio 0,5 M hasta sulfato de amonio cero en fosfato de sodio 0,02 M pH 6,8. La Cel7A se eluyó aproximadamente a la mitad del gradiente. Se recogieron las fracciones y se agruparon en base de un análisis de gel SDS-PAGE reducido.

15 [0257] Los puntos de fusión se determinaron según los métodos de Luo, et al., Biochemistry 34:10669 y Gloss, et al., Biochemistry 36:5612. Véase también Sandgren at al. (2003) Protein Science 12(4) pág 848.

[0258] Se recogieron los datos en un espectrofotómetro de dicroismo circular Aviv 215. Los espectros nativos de las variantes entre 210 y 260 nanómetros se tomaron a 25°C. Las condiciones de tampón fueron Bis Tris Propan o 50

20 mM/acetato de amonio 50 mM/ácido acético glacial a pH 5,5. La concentración de proteína se mantuvo entre 0,25 y 0,5 mg/mL. Después de determinar la longitud de onda óptima para monitorizar el despliegue, las muestras se desnaturalizaron térmicamente mediante una rampa de temperatura desde 25°C a 75°C bajo las mismas condiciones de tampón. Se recogieron datos durante 5 segundos cada 2 grados. Se monitorizó el despliegue parcialmente reversible a 230 nanómetros en una celda de longitud de paso de 0,1 centímetros. Mientras que a 75°C

25 se recogieron los espectros no plegados tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, la muestra se enfrió hasta 25°C para recoger un espectro replegado. La d iferencia entre los tres espectros a 230 nm se utilizó para valorar la reversibilidad de las variantes.

[0259] Los perfiles de desnaturalización térmica se muestran en las Figuras 9A y 9B para CBHI de tipo salvaje y 30 varias variantes de CBHI. Véase también la Tabla 4

Tabla 4: Estabilidad térmica de variantes de celulasas CBHI

Sustitución de residuo en CBHI de H. jecorina

Tf delta Tf % rev. 230 nm

Tipo salvaje

62,5 23

S8P

63,1 0,6

N49S

63,7 1,2

A68T

63,7 1,2 32

A77D

62,2 -0,3

N89D

63,6 1,1 50

S92T

64,4 1,9 25

S113D

62,8 0,3

S113N

64,0 1,5

225F

61,6 -0,9

P227A

64,8 2,3 49

P227L

65,2 2,7 45

D249K

64,0 1,5 39

T255P

64,4 1,9 35

S279N

62,4 -0,1 ∼95

E295K

64,0 1,5 ∼95

T332K

63,3 0,8 37

T332Y

63,3 0,8 37

T332H

62,7 0,2 64

F338Y

60,8 -1,7 ∼95

G430F

61,7 -0,8

L288F

62,4 -0,1

A299E

61,2 -1,3

N301K

63,5 1,0

T356L

62,6 0,1

D257E

61,8 -0,7 45

V393G

61,7 -0,8 43

S297T

63,3 0,8 31

T41I más la deleción en T445

64,2 1,7

T246C/Y371C

65,0 2,5

S196T/S411F

65,3 2,8 27

E295K/S398T

63,9 1,4 36

V403D/T4621

64,5 2 53

A112E/T226A

63,5 1,0

A68T/G44OR/P491L

63,1 0,6 32

G22D/S278P/T296P

63,6 1,1

T246A/R251A/Y252A

63,5 1,0

T380G/Y381D/R394A

58,1 -4,4

Y252Q/D259W/S342Y

59,9 -2,6 50

S113T/T255P/K286M

63,8 1,3 16

P227L/E325K/Q487L

64,5 2,0 22

P227T/T484S/F352L

64,2 1,7 45

Q17L/E193V/M213I/F362L

64,0 1,6 34

S8P/N49S/A88T/S113N

64,5 2,0 90

S8P/N49S/A68T/S113N/P227L

68,0 3,5 86

T41I/A112E/P227L/S278P/T296P

66,1 3,6 48

S8P/N49S/A68T/A112E/T226A

64,8 2,1 46

S8P/N49S/A68T/A112E/P227L

65,2 2,7 32

S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L

67,6 5,1 40

G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P

65,9 3,4 26

G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P

65,3 2,8 72

G22D/N49S/A68T/NI031/A112E/P227L/S278P/T296P

65,1 2,6 20

G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P

61,4 -1,1 75

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103L/S113N/P227L/S278P/ T296P

68,8 8,3 56

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/ S278P/T296P

69,0 6,5 71

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103L/S113N/P227L/S278P/ T296P/N301 R

68,7 6,2 70

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/ S278P/T296P/N301R

68,8 6,3 74

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P/N301 R

69,9 7,4 88

S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P/N301R

68,9 6,4 ∼100

S8P/G220/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/ N301 R

68,7 6,2 92

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/ T462I

68,8 6,3 ∼100

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/ V403D/T462I

68,5 6,0 ∼100

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F

68,6 6,1 ∼100

S8P/G22D/T4D/N49S/A68T/S92T/S113N/P227UD249K/ S411F

69,5 7,0 ∼100

SSP/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/ D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F

70,7 8,2 ∼100

S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/ T255P/S278P/T298P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I

71,0 8,5 ∼100

S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/ D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/ T4621

70,9 8,4 ∼100

[0260] Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas de la invención descritos serán evidentes para los expertos en la materia sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones. Aunque la invención se ha descrito en relación a realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse demasiado a dichas realizaciones específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en biología molecular o campos relacionados se definen en el alcance de las reivindicaciones.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Variante de celulasa CBH I, en la que dicha variante comprende una sustitución en la posición correspondiente al

   residuo P227(L/T/A) en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2), 5 en la que dicha variante de celulasa CBH I tiene una mayor temperatura de fusión.
2. 2. Variante de celulasa CBH I según la reivindicación 1, en la que dicha variante CBH I consiste esencialmente en las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en

   10 i. P227L/E325K/Q487L;

   ii. P227T/T484S/F352L;

   iii.

   S8P/N49S/A68T/S113N/P227L;

   v.

   T41I/A112E/P227L/S278P/T296P;

   v.

   S8P/N49S/A68T/A112E/P227L; 15 vi. S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L;

   vii. G22D/N49S/A68T/P227US278P/T296P;

   viii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P;

   ix. G22D/N49S/A68T/N1031/S113N/P227US278P/T296P;

   x.

   G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P; 20 xi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P;

   xii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R;

   xiii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/ T296P/N301 R;

   xiv. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/ N301R;

   xv. S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R; 25 xvi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R;

   xvii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I;

   xviii. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I: xix. S8P/T41I/N49S/A68T/ S92T/S113N/P227L/D249K/S411F;

   xx. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F; 30 xxi. S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S198T/P227L/D249K/ T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F;

   xxii. S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P /S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/ S411F/T462I:

   xxiii. S8P/G22D/T4D/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/ T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/ V403D/S411F/T462I en CBH I de Hypocrea jecorina (SEC ID NO: 2),

   35 en la que dicha variante de celulasa CBH I tiene una mayor temperatura de fusión.
3. 3. Ácido nucleico que codifica una variante de CBH I según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

   40 4. Vector que comprende un ácido nucleico que codifica una variante de CBHI según la reivindicación 3.
4. 5. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 4.
5. 6. Método de producción de una variante de CBH I que comprende las etapas de: 45

   (a)

   cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones adecuadas para producir la variante de CBH I;

   (b)

   obtener dicha variante de CBH I producida.

   50 7. Composición detergente que comprende un tensoactivo y una variante de CBH I, en la que dicha variante de CBH I comprende una variante de CBH I según la reivindicación 1.

6. 8. Detergente según la reivindicación 7, en el que dicho detergente es un detergente de lavandería.

   55 9. Detergente según la reivindicación 8, en el que dicho detergente es un detergente para platos.

7. 10. Aditivo alimenticio que comprende una variante de CBH I según la reivindicación 1.
8. 11. Método de tratamiento de pulpa de madera que comprende poner en contacto dicha pulpa de madera con una 60 variante de CBH I según la reivindicación 1.
9. 12. Método de conversión de biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con una variante de CBH I según la reivindicación 1.

   Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de Cel7A de Hypocrea jecorina

   Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L225F de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante S113D de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante A77D de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L288F de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante L299F de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante N301K de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T356L de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante G430F de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T246/Y371C de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T246A/R251A/Y252A de Cel7A de Hypocrea jecorina Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante T380G/Y381D/R394A de Cel7A de Hypocrea jecorina

   Figura 5L

   Secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de mutante Y252Q/D259W/S342Y de Cel7A de Hypocrea jecorina