JP5796925B2 - キシロース発酵性真核細胞の代謝工学 - Google Patents

Description

本発明は、宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化する能力をもたらすキシロースイソメラーゼを発現するように形質転換された真核宿主細胞におけるさらなる遺伝子改変に関する。このさらなる遺伝子改変は、キシロース代謝効率の改善を目的としており、たとえば、非特異的アルドース還元酵素活性の減少、キシルロースキナーゼ活性の増加及びペントースリン酸経路への流束増加を含む。本発明の改変宿主細胞は、炭素源としてキシロースを含む方法における多種多様な発酵産物の生産に適している。

植物性バイオマスのヘミセルロース画分から経済的且つ実用的にエタノールを生産するためには、同程度の速度且つ高収率でペントース及びヘキソースの両方を同時変換することが必要である。酵母、特にサッカロミセス種は、好気的にも嫌気的にもヘキソースで迅速に増殖することができるので、この方法に最も適した候補である。さらに、これらは（遺伝的に改変された）細菌よりもずっとリグノセルロース加水分解物の毒性環境に対して耐性である。

従来の研究で、キシロースを利用するために、Ｓ．セレビシエの代謝工学はキシロースイソメラーゼ（ＸＩ、ＥＣ５．３．１．５）の導入に基づくべきであることが立証された。Ｂｒｕｉｎｅｎｂｅｒｇ他（１９８３、Ｅｕｒ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２８７〜２９２）。キシロース還元酵素（ＸＲ、ＥＣ１．１．１．２１）及びキシリトール脱水素酵素（ＸＤ、ＥＣ１．１．１．９）をベースにした株とは対照的に、ＸＩ活性を発現する株は、ＷＯ ０３／０６２４４３０及びＫｕｙｐｅｒ他（２００４、ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４：６５５〜６６４）で最近示されたように、高いアルコール収率を示し、キシリトールをほとんど産生しない。理論上の観点では、ＸＲ及びＸＤによる経路は、酸素無しでは、たとえば、キシリトール形成によって緩和され得るＮＡＤＨ平衡障害を引き起こすので、このことは驚くことではない。

ＷＯ ０３／０６２４４３０は、機能的ピロミセスＸＩをＳ．セレビシエに導入することによって、ＸＫＳ１によってコードされた内在性キシルロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）及びペントースリン酸経路の非酸化的部分の酵素を介したキシロースのゆっくりした代謝が可能になり、酵母形質転換体にキシロースで増殖する能力をもたらすことを開示している。

Ｋｕｙｐｅｒ他（前述）は、ピロミセスＸＩが導入され、その後振盪フラスコで指向進化を遂げたＳ．セレビシエ株は、キシロース発酵速度が改善しているが、まだ増殖に酸素を必要としたことを記載している。キシロース過剰で極端に酸素を制限した状況でさらに選択し、その後嫌気的に選択すると、ヘミセルロース利用の必要条件の少なくとも１つ、いわゆるキシロースでの許容されるエタノール収率を満たす実験室株（ＲＷＢ２０２−ＡＦＸ）が得られた。しかし、この株におけるエタノール産生の特異的速度はまだ許容できないほど低い。特に、キシロースで増殖する間の特異的糖消費速度（３４５ｍｇキシロース／バイオマスｇ／ｈ）はまだ、グルコースでの増殖よりも１０倍低い。進化工学によってＲＷＢ２０２−ＡＦＸ株をさらに改善しようとする試みは今までのところ失敗している。

ＷＯ ０３／０６２４４３０は、商用のヘミセルロース利用に必要とされるレベルまで、ピロミセスＸＩ遺伝子を発現する宿主細胞において、キシロースでのエタノール産生及び／又は糖消費の特異的速度をさらに改善することができるいくつかの代替的遺伝子改変を挙げている。これら別の手段には、（ａ）キシロースの宿主細胞への輸送の増加、（ｂ）キシルロースキナーゼ活性の増加、（ｃ）ペントースリン酸経路流束の増加、（ｄ）異化産物抑制に対する感受性の軽減、（ｅ）エタノール、浸透圧又は有機酸に対する耐性の増加、及び（ｆ）（たとえば、キシリトール、グリセロール及び／又は酢酸などの）副産物産生の減少が含まれる。より具体的には、ＷＯ ０３／０６２４４３０は、ヘキソース又はペントース輸送体、キシルロースキナーゼ（Ｓ．セレビシエＸＫＳ１など）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ１）又はトランスケトラーゼ（ＴＫＬ１）糖分解酵素などのペントースリン酸経路の酵素、アルコール脱水素酵素などのエタノール生成酵素をコードする１種又は複数の遺伝子の過剰発現、及び／又は、Ｓ．セレビシエＨＸＫ２遺伝子、Ｓ．セレビシエＭＩＧ１又はＭＩＧ２遺伝子などのヘキソースキナーゼ遺伝子、Ｓ．セレビシエＧＲＥ３遺伝子などの（非特異的）アルドース還元酵素遺伝子、又はＳ．セレビシエグリセロール−リン酸脱水素酵素１及び／又は２遺伝子などのグリセロール代謝に関連する酵素の遺伝子の不活性化を示唆している。しかし、ＷＯ ０３／０６２４４３０は、ピロミセスＸＩ遺伝子を有する宿主細胞において、これらの多くの代替手段のどれが実際にエタノール産生及び／又はキシロース消費の特異的速度を改善するかは開示していない。

Ｋａｒｈｕｍａａ他（２００４、「細菌性キシロースイソメラーゼを発現するキシロース増殖性サッカロミセス セレビシエ株の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｘｙｌｏｓｅ−ｇｒｏｗｉｎｇ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｔｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）」酵母と糸状菌の生理学についての第２会議でのポスター発表、２００４年３月２４〜２８日、Ａｎｇｌｅｔ、フランス４３頁、及び２００４、「バイオ燃料であるエタノールを製造するための新規キシロース増殖性サッカロミセス セレビシエ株（Ｎｅｗ Ｘｙｌｏｓｅ−ｇｒｏｗｉｎｇ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｂｉｏｆｕｅｌ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、第２６回燃料及び化学物質のバイオテクノロジーに関するシンポジウムでの口答発表、２００４年５月９〜１２日、Ｃｈａｔｔａｎｏｏｇａ（ＴＮ）、ＵＳＡ、１９ページ）は、サーマス サーモフィルスから細菌性ＸＩを発現するＳ．セレビシエ株を開示している。この株はさらに、ＷＯ ０３／０６２４４３０で示唆された、いくつかの遺伝子改変、すなわちキシルロースキナーゼ及び非酸化的ペントースリン酸経路の酵素全４種の過剰発現並びにＳ．セレビシエ非特異的アルドース還元酵素遺伝子（ＧＲＥ３）の不活性化を含有する。しかし、これらの遺伝子改変にもかかわらず、この株はキシロースで増殖することができない。キシロースでの好気的増殖に適応した後でのみ、キシロースで低速度（μ＝０．０４ｈ^−１）で増殖することができ、キシロース４．３ｍｇ／細胞ｇ／ｈであるキシロース特異的消費速度が低い、ＴＭＢ３０５０株が得られた。そもそもキシロースで増殖するためには未確認の（適応中に蓄積する）遺伝子改変が明らかに必要であるので、Ｋａｒｈｕｍａａ他の研究から、もしあるとしても、確認された遺伝子改変（たとえば、キシルロースキナーゼ又はペントースリン酸化経路酵素のいずれかの過剰発現或いはアルドース還元酵素遺伝子の不活性化）がキシロースで増殖するために適合した株の能力に実際に寄与することを推論することはできない。

したがって、本発明の目的は、キシロースで増殖する能力をもたらすＸＩ遺伝子で形質転換された真菌宿主細胞などの真核宿主細胞であって、宿主細胞の商用的実用化に適合するキシロース消費及び／又は産物（エタノール）形成の特異的速度を有する宿主細胞を提供することである。

定義
キシロースイソメラーゼ
酵素「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、本明細書では、Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへ、及びその逆の直接異性化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとして知られている。いくつかのキシロースイソメラーゼはまた、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の変換を触媒することができ、したがって、時にグルコースイソメラーゼと呼ばれる。キシロースイソメラーゼは、マグネシウム又はマンガンなどの２価陽イオンを補因子として必要とする。本発明のキシロースイソメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。さらに、キシロースイソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、及び本明細書で以下に説明するようなキシロースイソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、本明細書では、Ｋｕｙｐｅｒ他（２００３、ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４：６９〜７８）によって記載されたような条件下で、１分当たりキシルロース１ｎｍｏｌを生成する酵素の量と定義する。

キシルロースキナーゼ
酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ２．７．１．１７）は、本明細書では、ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５リン酸の反応を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、リン酸化を行うキシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼ又はＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとして知られている。本発明のキシルロースキナーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。さらに、キシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、及び本明細書で以下に説明するようなキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。キシルロキナーゼ活性の単位を、本明細書では実施例１．１３で定義する。

リブロース５−リン酸エピメラーゼ
酵素「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」（５．１．３．１）は、本明細書では、Ｄ−キシルロース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸へ、及びその逆のエピマー化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ホスホリブロースエピメラーゼ、エリスロース−４−リン酸イソメラーゼ、ホスホケトペントース３−エピメラーゼ、キシルロースリン酸３−エピメラーゼ、ホスホケトペントースエピメラーゼ、リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ、Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ、Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−Ｐ ３−エピメラーゼ、Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ、ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ又はＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとして知られている。本発明のリブロース５−リン酸エピメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、リブロース５−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

リブロース５−リン酸イソメラーゼ
酵素「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．６）は、本明細書では、Ｄ−リボース５−リン酸からＤ−リブロース５−リン酸へ、及びその逆の直接異性化を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ホスホペント−スイソメラーゼ、ホスホリボイソメラーゼ、リボースリン酸イソメラーゼ、５−ホスホリボースイソメラーゼ、Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ、Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ、又はＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとして知られている。本発明のリブロース５−リン酸イソメラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、リブロース５−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

トランスケトラーゼ
酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ２．２．１．１）は、本明細書では、
Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース５−リン酸Κ←→
セドヘプツロース−７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸
の反応、及びその逆の反応を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼ又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとして知られている。本発明のトランスケトラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、トランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

トランスアルドラーゼ
酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ２．２．１．２）は、本明細書では、
セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸←→
Ｄ−エリスロース−４−リン酸＋Ｄ−フルクトース−６−リン酸
の反応及びその逆を触媒する酵素と定義する。この酵素はまた、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ、ジヒドロキシアセトン合成酵素、ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ、又はセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとして知られている。本発明のトランスアルドラーゼはさらに、本明細書で以下に説明するようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、トランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

アルドース還元酵素
酵素「アルドース還元酵素」（ＥＣ１．１．１．２１）は、本明細書では、キシロース又はキシルロースをキシリトールに還元することができる任意の酵素と定義する。本発明の場合、アルドース還元酵素は、本発明の宿主細胞に本来備わっており（内在性であり）、キシロース又はキシルロースをキシリトールに還元することができる任意の非特異的アルドース還元酵素であってよい。非特異的アルドース還元酵素は、
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ^＋←→アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）^＋
の反応を触媒する。

この酵素は、広範な特異性を備えており、アルドース還元酵素、ポリオール脱水素酵素（ＮＡＤＰ^＋）、アルジトール：ＮＡＤＰ酸化還元酵素、アルジトール：ＮＡＤＰ^＋１−酸化還元酵素、ＮＡＤＰＨ−アルドペントース還元酵素又はＮＡＤＰＨ−アルドース還元酵素として知られている。このような非特異的アルドース還元酵素の特定の例は、Ｓ．セレビシエに内在性であり、ＧＲＥ３遺伝子によってコードされる（Ｔｒａｆｆ他、２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８〜７４）。こうして、本発明のアルドース還元酵素はさらに、本明細書で以下に説明したようなアミノ酸配列によって定義することができる。同様に、アルドース還元酵素は、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、並びに本明細書で以下に説明するようなアルドース還元酵素をコードする参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。

配列の同一性及び類似性
配列同一性は、本明細書では、配列を比較することによって測定されるような、２種以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２種以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、このような配列の鎖の間の合致によって決定されるような、アミノ酸又は核酸配列の間の配列関連性の程度を意味する。２種のアミノ酸配列の間の「類似性」は、１本のポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を第２のポリペプチドの配列と比較することによって測定される。「同一性」及び「類似性」は、限定はしないが、（「コンピューターによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；「バイオコンピューティング：インフォマティクス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；「配列データのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及び「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含む既知の方法によって容易に計算することができる。

同一性を測定する好ましい方法は、試験した配列間に最大の一致を与えるように設計されている。同一性及び類似性を測定する方法は、公的に使用できるコンピュータプログラムに体系化されている。２種の配列の間の同一性及び類似性を測定するのに好ましいコンピュータプログラム法には、たとえば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７ （１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）が含まれる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．他、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）から公的に入手できる。周知のスミス ウォーターマンアルゴリズムはまた、同一性の測定に使用することができる。

ポリペプチド配列比較に好ましいパラメータには、以下が含まれる。「アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）；「比較マトリックス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）」：ＢＬＯＳＳＵＭ６２ ｆｒｏｍ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２）；Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；及びＧａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：４。これらのパラメータを使用して有用なプログラムは、ウィスコンシン、マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ製の「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に使用することができる。前述のパラメータは、（エンドギャップのペナルティーがない）アミノ酸比較用の初期設定パラメータである。

核酸比較のために好ましいパラメータには、以下が含まれる。「アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３ （１９７０）；「比較マトリックス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）」：一致＝＋１０、不一致＝０；Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：５０；Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：３。前記のウィスコンシン、マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ製のギャップとして有用なのは、核酸比較用初期設定パラメータである。

場合によっては、アミノ酸類似性の程度の測定では、当業者には明らかなように、当業者はまた、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してよい。保存的アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性のことである。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸の群はシスティン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示したアミノ酸配列の置換による変種は、開示した配列の少なくとも１つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸変化は保存的であることが好ましい。天然に生じるアミノ酸それぞれの好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ、Ａｒｇからｌｙｓ、Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ、Ａｓｐからｇｌｕ、Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ、ＧＩｎからａｓｎ、ＧＩｕからａｓｐ、ＧＩｙからｐｒｏ、Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ、Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ、Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ、Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ、Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ、Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ、Ｓｅｒからｔｈｒ、Ｔｈｒからｓｅｒ、Ｔｒｐからｔｙｒ、Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。

核酸配列のハイブリダイゼーション
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列はまた、適度な、又は好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号９〜１６及び１８のヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力によって定義することができる。本明細書では、厳密なハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約２５個、好ましくは約５０個、７５個又は１００個のヌクレオチド、最も好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列が、約６５℃の温度で、塩約１Ｍを含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液中でハイブリダイズするのを可能にして、６５℃で、塩約０．１Ｍ以下を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液で洗浄する条件と定義される。ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち、少なくとも１０時間実施することが好ましく、洗浄は洗浄溶液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間実施することが好ましい。通常、これらの条件は、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする。

本明細書では、適度なハイブリダイゼーション条件は、少なくとも５０個、好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列が、約４５℃の温度で、塩約１Ｍを含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液中でハイブリダイズするのを可能にして、室温で、塩約１Ｍ以下を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意のその他の溶液で洗浄する条件と定義される。ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち、少なくとも１０時間実施することが好ましく、洗浄は洗浄溶液を少なくとも２回交換して少なくとも１時間実施することが好ましい。通常、これらの条件は、５０％までの配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする。当業者であれば、同一性が５０％と９０％との間で変動する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を変更することができるだろう。

操作可能な結合
本明細書では、「操作可能に結合した」という用語は、機能的関係のポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれると「操作可能に結合」する。たとえば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼすならばコーディング配列に操作可能に結合する。操作可能な結合とは、結合するＤＮＡ配列が一般的に近接していて、そこで２種のタンパク質コーディング領域を近接してリーディングフレーム内に結合することが必要であることを意味する。

プロモーター
本明細書では、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、１種又は複数の遺伝子の転写を制御するために機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位及び、限定はしないが、転写因子結合部位、抑制因子及び活性化因子タンパク質結合部位を含むその他の任意のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写量を直接的又は間接的に制御するよう作用することが当業者に知られている任意のその他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に同定される核酸断片のことである。「構成的」プロモーターとは、最も環境的及び発生的な条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導的」プロモーターとは、環境的及び発生的制御下で活性のあるプロモーターである。

相同性
「相同性」という用語は、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を示すために使用されるとき、自然界ではその核酸又はポリヌクレオチド分子が同じ種の、好ましくは同じ変種又は同じ株の宿主細胞又は生物によって生成されることを意味するものと理解される。宿主細胞が相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、自然の環境におけるよりも、一般的に他のプロモーター配列、又は、適切であるならば、他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に操作可能に結合するであろう。２種の核酸配列の関連性を示すために使用する場合、「相同性」という用語は、１種の１本鎖核酸配列が相補的な１本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量並びに後で説明する温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含めた多くの要素に左右され得る。同一領域は約５ｂｐよりも大きいことが好ましく、同一領域は１０ｐｂより大きいことがより好ましい。

異種性
「異種性」という用語は、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用するとき、それが存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の一部としては天然に生じない核酸又はタンパク質、或いは自然界で見いだされるものとは異なる細胞又はゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列における１種又は複数の位置に見いだされる核酸又はタンパク質を意味する。異種核酸又はタンパク質は、導入された細胞には内在しないが、他の細胞から得られたか、又は合成若しくは組換えによって得られた。一般的に、必ずしも必要ではないが、このような核酸は、そのＤＮＡが転写されるか、又は発現する細胞によって通常産生されないタンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは外因性ＲＮＡが存在する細胞において通常発現しないタンパク質をコードする。異種核酸及びタンパク質はまた、外来性核酸又はタンパク質と呼ばれることがあり得る。当業者が、発現する細胞に対して異種又は外来であると認識する任意の核酸又はタンパク質は、本明細書では異種核酸又はタンパク質という用語に包含される。異種性という用語はまた、核酸又はアミノ酸配列の天然にはない組合せ、すなわち、少なくとも２種の組合せ配列が互いに異質である組合せに適用される。

この明細書及び特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその活用形は、非限定的な意味で、その言葉に続く項目は含まれるが、具体的に記載されていない項目は除外されないことを意味するために使用される。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素に関しては、文脈が明らかに１種及び１種だけの要素があることを必要としなければ、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常、「少なくとも１種」を意味する。

本発明は、たとえば、ＷＯ０３／６２４４３０に記載されたような、キシロースをキシルロースに異性化する能力を備えた、形質転換された真核宿主細胞に関する。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することによって宿主細胞にもたらされる。形質転換された宿主細胞がキシロースをキシルロースに異性化する能力は、キシロースのキシルロースへの直接的な異性化である。これは、キシロース還元酵素及びキシリトール脱水素酵素それぞれによって触媒されるようなキシリトール中間体を介したキシロースのキシルロースへの２段階変換とは対照的に、キシロースイソメラーゼによって触媒される１段階反応でキシロースをキシルロースに異性化することを意味するものと理解される。

このヌクレオチド配列は、形質転換された宿主細胞で好ましくは活性型で発現するキシロースイソメラーゼをコードする。したがって、宿主細胞内においてこのヌクレオチド配列が発現すると、３０℃でのタンパク質１ｍｇ当たりのキシロースイソメラーゼ活性の比活性が少なくとも１０Ｕであるキシロースイソメラーゼ、好ましくは３０℃で１ｍｇ当たり少なくとも２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００又は５００Ｕであるキシロースイソメラーゼが生じる。形質転換された宿主細胞内で発現したキシロースイソメラーゼの比活性は、本明細書では、宿主細胞の無細胞溶解液、たとえば、酵母無細胞溶解液のタンパク質１ｍｇ当たりのキシロースイソメラーゼ活性単位の量として定義される。キシロースイソメラーゼ活性、タンパク質の量の測定及び無細胞溶解液の調製は、実施例１．１３で説明した通りである。したがって、宿主細胞内においてキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列が発現すると、３０℃でのタンパク質１ｍｇ当たりのキシロースイソメラーゼの活性の比活性が少なくとも５０Ｕであるキシロースイソメラーゼ、好ましくは３０℃で１ｍｇ当たり少なくとも１００、２００、５００、７５０又は１０００Ｕのキシロースイソメラーゼが生じる。

好ましくは、宿主細胞においてキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現は、キシロースに対するＫ_ｍが５０、４０、３０又は２５ｍＭ未満であるキシロースイソメラーゼ、より好ましくはキシロースに対するＫ_ｍが約２０ｍＭ以下であるキシロースイソメラーゼが生成する。

キシロースイソメラーゼをコードする好ましいヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１及び／又は配列番号２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号９及び／又は配列番号１０のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８又は９９％であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列とハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列、
（ｄ）遺伝子コードの縮重によって（ｃ）の核酸分子の配列と異なる配列のヌクレオチド配列からなる群から選択することができる。

キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、原核性又は真核性キシロースイソメラーゼのいずれか、すなわち、原核生物又は真核生物で天然に生じるキシロースイソメラーゼのアミノ酸と同一のアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼをコードすることができる。本発明者等は、特定のキシロースイソメラーゼが真核細胞宿主にキシロースをキシルロースに異性化する能力を与える能力は、このイソメラーゼが原核由来であるか、又は真核由来であるかにはさほど左右されないことを発見した。むしろ、これはイソメラーゼのアミノ酸配列のピロミセス配列（配列番号１）のアミノ酸配列に対する関連性に左右される。驚くべきことに、真核型ピロミセスイソメラーゼは、その他の公知の真核型イソメラーゼよりも原核型イソメラーゼに関連している。ピロミセスイソメラーゼは、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）酵素とのアミノ酸同一性が６１％で、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）酵素（配列番号２）との同一性は８２％であるが、一方数種の植物型キシロースイソメラーゼとの同一性は４９〜５２％にすぎない。酵母で盛んに発現する植物性キシロースイソメラーゼの報告はなされていない。対照的に、本明細書の実施例３では、バクテロイデスキシロースイソメラーゼが真核宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化し、単一の炭素源としてキシロースで増殖する能力をもたらすと記載している。したがって、好ましいヌクレオチド配列は、前記で定義したようなピロミセス配列に関連するアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼをコードする。好ましいヌクレオチド配列は、真菌キシロースイソメラーゼ（たとえば、担子菌由来）、より好ましくは嫌気性真菌、たとえば、ネオカリマスティクス科（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、シコミセス科（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）、ピロミセス科（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、オルピノミセス科（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）又はルミノミセス科（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）に属する嫌気性真菌のキシロースイソメラーゼをコードする。或いは、好ましいヌクレオチド配列は、細菌性キシロースイソメラーゼ、好ましくはグラム陰性菌、より好ましくはバクテロイデス綱、又はバクテロイデス属、最も好ましくはＢ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）のイソメラーゼ（配列番号２）をコードする。

キシロースイソメラーゼが酵母などの真核宿主細胞において活性型で発現する可能性を増大させるために、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン利用が真核宿主細胞のコドン利用に最適化するように、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を適合させることができる。キシロースイソメラーゼ（又は本発明のその他の酵素、以下を参照）をコードするヌクレオチド配列の宿主細胞のコドン利用への適合性は、コドン適合指数（ＣＡＩ）として表すことができる。このコドン適合指数は、本明細書では、発現性の高い遺伝子のコドン利用に対するその遺伝子のコドン利用の相対的適合性の測定値として定義する。各コドンの相対的適合性（ｗ）とは、同一アミノ酸の最も豊富なコドンの利用に対する各コドンの利用の比である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的適合値の相乗平均と定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝子コードに依存する）は、除外する。ＣＡＩ値の範囲は０から１で、値が高ければ高いほど最も豊富なコドンの割合が高いことを示す（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ １５：１２８１〜１２９５参照、Ｊａｎｓｅｎ他、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２〜５１も参照）。適合したヌクレオチド配列のＣＡＩは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６又は０．７であることが好ましい。

前述のようにキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列で形質転換するための宿主細胞は、この細胞にキシロースを能動的又は受動的に輸送できる宿主が好ましい。この宿主細胞は、活発な解糖系を含むことが好ましい。この宿主細胞はさらに、キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸に代謝されることができるように、内在性ペントースリン酸化経路を含有することができ、内在性キシルロースキナーゼ活性を含有することができる。この宿主はさらに、ピルビン酸を所望する発酵産物、たとえば、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンに変換する酵素を含有することが好ましい。

好ましい宿主細胞は、本来アルコール発酵、好ましくは嫌気的アルコール発酵ができる宿主細胞である。宿主細胞はさらに、エタノールに強い耐性があり、低ｐＨに強い耐性があり（すなわち、ｐＨが５、４、３又は２．５を下回っても増殖することができる）、乳酸、酢酸若しくはギ酸などの有機酸並びにフルフラル及びヒドロキシメチルフルフラルなどの糖分解産物に強い耐性があり、高温に強い耐性があることが好ましい。宿主細胞のこれらの特性又は活性はいずれも、宿主細胞に本来備わっていてよく、或いは遺伝子改変によって導入又は改変されてもよい。適切な宿主細胞は、たとえば、真菌などの真核微生物であるが、宿主細胞として最も適切なのは酵母又は糸状菌である。

酵母は、本明細書では、真核微生物として定義され、主に単細胞型で増殖する真菌亜門の全種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃ．Ｊ．、１９６２、Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。酵母は、単細胞植物体の出芽によって増殖するか、又は生物体の分裂によって増殖することができる。宿主細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、クロエケラ属、シュワニオミセス属及びヤロウイア属に属する。酵母は、嫌気性発酵ができることが好ましく、嫌気的アルコール発酵ができることがより好ましい。

糸状菌は、本明細書では、真菌亜門の糸状菌型全てを含む真核微生物として定義される。これらの真菌の特徴は、キチン、セルロース及びその他の複合多糖類からなる植物性菌糸体である。本発明の糸状菌は、形態学的、生理学的、及び遺伝学的に酵母と異なる。糸状菌による植物性の増殖は、菌糸の伸長により、ほとんどの糸状菌の炭素異化作用は偏性好気性である。宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、フミコラ属、アクレモニウム属、フサリウム属及びペニシリウム属に属する。

多年にわたって、穀物糖類からバイオエタノールを製造するために様々な生物を導入することが提案されてきた。しかし、実際には、主要なバイオエタノール製造方法は全て、エタノール生産体としてサッカロミセス属の酵母を使用し続けてきた。これは、サッカロミセス種の工業工程に適した多くの魅力的な特徴、すなわち、酸、エタノール及び浸透圧に対する高い耐性、嫌気性での増殖能、及び、もちろん、高いアルコール発酵能による。宿主細胞として好ましい酵母の種類には、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ブルデリ、Ｓ．バルネッチ、Ｓ．エクシグウス、Ｓ．ウバラム、Ｓ．ジアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクティス、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．フラギリスが含まれる。

したがって、本発明の宿主細胞は、前記で定義したようなキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換した宿主細胞である。キシロースイソメラーゼコーディング配列を含む核酸構築物は、宿主細胞でキシロースイソメラーゼを発現できることが好ましい。このために、この核酸構築物は、たとえば、ＷＯ ０３／０６２４４３０に記載されたように構築することができる。この宿主細胞は、この核酸構築物の単一コピーを含むことができるが、複数コピーを含むことが好ましい。この核酸構築物は、エピソームで保持されてよく、したがって、ＡＲＳ配列などの自立増殖配列を含む。適切なエピソームの核酸構築物は、たとえば、酵母の２μ又はｐＫＤ１（Ｆｌｅｅｒ他、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８〜９７５）プラスミドをベースとすることが可能である。しかし、この核酸構築物は、１種又は複数のコピーで宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。宿主ゲノムへの組込みは、非正統的組換えによって無作為に生じ得るが、核酸構築物は真菌分子遺伝学の分野で周知の相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい（たとえば、ＷＯ ９０／１４４２３、欧州特許出願公開第０４８１００８号、欧州特許出願公開第０６３５５７４号及び米国特許第６２６５１８６号参照）。

本発明の第１の態様では、本発明の宿主細胞は、ペントースリン酸経路の流束を増加させる遺伝子改変を含む。特に、この遺伝子改変によって非酸化的部分のペントースリン酸経路の流束の増加が引き起こされる。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、流束の増加を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一な株における流束と比較して、流束を少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０又は２０倍増加させる改変を意味すると理解する。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、単一炭素源としてキシロースで改変宿主を増殖させ、特異的キシロース消費速度を測定し、もしキシリトールが産生されるならば、特異的キシロース消費速度から特異的キシリトール産生率を差し引くことによって測定することができる。しかし、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、単一炭素源としてのキシロースでの増殖速度、好ましくは単一炭素源としてのキシロースでの嫌気的増殖速度に比例する。単一炭素源としてのキシロースでの増殖速度（μ_ｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束との間には直線関係がある。特異的キシロース消費速度（Ｑ_ｓ）は、糖に対するバイオマスの収率は一定であるので、糖に対するバイオマスの収率（Ｙ_ＸＳ）によって除された増殖速度（μ）に等しい（所与の一連の条件下で：嫌気性、増殖培地、ｐＨ、その株の遺伝的背景など、すなわち、Ｑ_ｓ＝μ／Ｙ_ＸＳ）。したがって、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束増加は、これらの条件下での最大増殖速度の増加から推定することができる。

ペントースリン酸経路の流束を増加させる遺伝子改変は、様々な方法で宿主細胞に導入することができる。これらには、たとえば、キシルロースキナーゼ及び／又は非酸化的部分ペントースリン酸経路の１種又は複数の酵素の定常状態活性レベルの増加及び／又は非特異的アルドース還元酵素活性の定常状態レベルの低減の実現が含まれる。定常状態活性レベルのこれらの変化は、変異体の選択（自発的又は化学物質若しくは放射線による誘導）によって、及び／又は組換えＤＮＡ技術、たとえば、これらの遺伝子を制御する酵素又は要素をコードする遺伝子の過剰発現又は不活性化それぞれによって、実施することができる。

好ましい宿主細胞では、この遺伝子改変には（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１種の酵素の過剰発現が含まれる。この酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択されることが好ましい。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組合せを過剰発現させることができる。たとえば、過剰発現させる酵素は、少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びリブロース−５−リン酸エピメラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスケトラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスケトラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともリブロース５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスアルドラーゼの酵素、又は少なくともリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース５−リン酸エピメラーゼ、及びトランスケトラーゼの酵素であってよい。本発明の一実施形態では、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの酵素のそれぞれは、宿主細胞で過剰発現する。遺伝子改変に、少なくともトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼ両酵素の過剰発現が含まれる宿主細胞は、既にキシロースで嫌気的に増殖することができるので、より好ましい。実際に、いくつかの条件の下で、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞が既に、酵素４種類全て、すなわち、リブロース５−リン酸イソメラーゼ、リブロース５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同様にキシロースでの嫌気的増殖速度を有することを発見した。さらに、リブロース５−リン酸イソメラーゼとリブロース５−リン酸エピメラーゼの両酵素を過剰発現する宿主細胞は、イソメラーゼのみ、又はエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞より好ましく、なぜならば、これらの酵素の１種のみの過剰発現は代謝の不均衡を起こす可能性があるからである。

本発明の宿主細胞において酵素を過剰発現させるために使用可能な様々な手段が当業界にはある。特に、１つの酵素を、宿主細胞中でこの酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、たとえば、宿主細胞ゲノムに遺伝子のコピーをさらに組み込むことによって、エピソーム型多コピー発現ベクターで遺伝子を発現させることによって、又はこの遺伝子の多コピーを含むエピソーム型発現ベクターを導入することによって、過剰発現させることができる。

或いは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現させる酵素をコードする配列に本来備わっていないプロモーター、すなわち、操作可能に結合するコーディング配列とは異種のプロモーターを使用することによって実現することができる。プロモーターは、操作可能に結合するコーディング配列とは異種であることが好ましいが、このプロモーターは同種の、すなわち宿主細胞に内在性であることも好ましい。好ましくはキシロース又はキシロース及びグルコースを炭素源として使用できる条件下で、より好ましくは主要な炭素源として使用できる条件下で（すなわち、使用可能な炭素源の５０％超はキシロース又はキシロース及びグルコースからなる）、最も好ましくは単一の炭素源として使用できる条件下で、異種プロモーターは、コーディング配列に本来備わっているプロモーターよりも、コーディング配列を含む転写物の定常状態レベルを高めることができる（又は、時間単位当たりより多くの転写物分子、すなわち、ｍＲＮＡ分子を産生することができる）。この場合適切なプロモーターには、天然の構成的及び誘導的両方のプロモーター並びに操作されたプロモーターが含まれる。本発明で使用するために好ましいプロモーターはさらに、異化産物（グルコース）抑制に非感受性で、及び／又は誘導にキシロースを必要としないことが好ましい。

これらの特徴を有するプロモーターは、広く使用することができ、当業者には公知である。このようなプロモーターの適切な例には、解糖遺伝子のプロモーター、たとえば、酵母又は糸状菌由来のホスホフルクトキナーゼ（ＰＰＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＤＰ、ＴＤＨ３又はＧＡＤＰＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＤＫ）プロモーターが含まれ、酵母由来のこのようなプロモーターの詳細は（ＷＯ ９３／０３１５９）に見いだすことができる。その他の有用なプロモーターは、リボゾームタンパク質をコードする遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコール脱水素酵素プロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４など）、エノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。その他の構成的及び誘導的プロモーター及びエンハンサー又は上流の活性化配列は、当業者には公知である。本発明の宿主で使用したプロモーターは、所望するならば、制御特性に影響を与えるために改変することができる。

酵素を過剰発現するために使用したコーディング配列は、本発明の宿主細胞に相同であることが好ましい。しかし、本発明の宿主細胞に異種のコーディング配列も同様に適用することができる。

本発明の宿主細胞においてリブロース−５−リン酸イソメラーゼを過剰発現するために使用するヌクレオチド配列は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは、配列番号４との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いはそれによってこのヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１２のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

本発明の宿主細胞においてリブロース−５−リン酸エピメラーゼを過剰発現するために使用するヌクレオチド配列は、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは配列番号５との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いはそれによってこのヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１３のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

本発明の宿主細胞においてトランスケトラーゼを過剰発現するために使用するヌクレオチド配列は、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは配列番号６との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いはそれによってこのヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１４のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

本発明の宿主細胞においてトランスアルドラーゼを過剰発現するために使用するヌクレオチド配列は、トランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは配列番号７との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いはそれによってこのヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１５のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

遺伝子改変した宿主細胞における酵素の産生に関する場合、酵素の過剰発現とは、同一の条件下で、改変していない宿主細胞と比較して、高い酵素比活性レベルで酵素が産生されることを意味する。通常、これは、酵素的な活性のあるタンパク質（又は多サブユニット酵素の場合はタンパク質類）が大量に、というよりは、同一条件下で非改変宿主細胞と比較して高い定常状態レベルで産生されることを意味する。同様に、これは、通常、酵素的に活性のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡが大量に、というよりはまた、同一条件下で非改変宿主細胞と比較して高い定常状態レベルで産生されることを意味する。したがって、酵素の過剰発現は、本明細書で説明したような適切な酵素測定法を使用して宿主細胞における酵素の比活性のレベルを測定することによって測定することが好ましい。或いは、酵素の過剰発現は、たとえば、酵素に特異的な抗体を使用して酵素タンパク質の特異的定常状態レベルを定量することによって、又は酵素をコードするｍＲＮＡの特異的定常レベルを定量することによって、間接的に測定することができる。後者は、酵素用基質が市販されていないため酵素測定が容易に実行不可能なペントースリン酸経路の酵素に特に適することが可能である。本発明の宿主細胞では、過剰発現させる酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一な株と比較して、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０又は２０倍過剰発現することが好ましい。これらの過剰発現レベルは酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用することができるものと理解される。

本発明の第２の態様では、本発明の宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる遺伝子改変を含む。この遺伝子改変は、たとえば、キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によって、キシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こすことが好ましい。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞に内在していてよく、又は宿主細胞に異種のキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現に使用するヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは配列番号３との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いはそれによってこのヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１１のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

特に好ましいキシルロースキナーゼは、ピロミセスのキシルロースキナーゼ（ｘｙｌＢ、ＷＯ ０３／０６２４４３０参照）に関連したキシロースキナーゼである。このピロミセスのキシルロースキナーゼは実際に、酵母のキナーゼ（配列番号３）などの公知の真核型キナーゼ全てよりも原核型キナーゼに関連している。真核型キシルロースキナーゼは、非特異的糖キナーゼとして示されており、キシルロースを含む広範な基質範囲を有する。対照的に、ピロミセスキナーゼが最も密接に関連している原核型キシルロースキナーゼは、キシルロースにより特異的な、すなわち基質範囲の狭いキナーゼであることが示されている。したがって、本発明の宿主細胞においてキシルロースキナーゼを過剰発現させるために使用するより好ましいヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによって、このポリペプチドは配列番号１７との同一性が少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いは、それによって、このヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１８のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

本発明の宿主細胞では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる遺伝子改変は、前述したようなペントースリン酸経路の流束を増加させる改変のいずれかと組み合わせることができるが、この組合せは本発明に必須ではない。したがって、厳密には、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる遺伝子改変のみを含む本発明の宿主細胞が本発明に含まれる。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現の実施及び分析に使用可能な当業界での様々な手段は、ペントースリン酸経路の酵素で前述したものと同様である。本発明の宿主細胞では、過剰発現させるキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一な株と比較して、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０又は２０倍過剰発現することが好ましい。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル並びに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用することができるものと考えられる。

本発明の第３の態様では、本発明の宿主細胞は、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む。非特異的アルドース還元酵素活性は、非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の発現を減少させるか、不活性化する１種又は複数の遺伝子改変によって、宿主細胞において減少させることが好ましい。この遺伝子改変は、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の各内在性コピーの発現を減少させるか、又は不活性化することが好ましい。宿主細胞は、２倍性、多倍数性又は異数性の結果として非特異的アルドース還元酵素をコードする遺伝子の多コピーを含むことができ、及び／又はこの宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、異なる遺伝子によってそれぞれコードされるアルドース還元酵素活性を備えたいくつかの異なる（イソ）酵素を含有することができる。また、このような場合、非特異的アルドース還元酵素をコードする各遺伝子の発現は、減少するか、又は不活性化することが好ましい。この遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失又は遺伝子の破壊によって不活性化していることが好ましく、この場合は、遺伝子という用語はまた、コーディング配列の上流又は下流の任意の非コーディング配列を含み、その（部分的）欠失又は不活性化は、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性の発現の減少をもたらす。本発明の宿主細胞において活性を減少させるべきアルドース還元酵素をコードするヌクレオチド配列は、アルドース還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、それによってこのポリペプチドは配列番号８との同一性が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％であるアミノ酸配列を有することが好ましく、或いは、それによって、このヌクレオチド配列は、適度な条件下で、好ましくは厳密な条件下で、配列番号１６のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。

本発明の宿主細胞では、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の流束を増加させる改変のいずれか、及び／又は前述したような宿主細胞における特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる改変のいずれかと組み合わせることができるが、この組合せは本発明に必須ではない。したがって、厳密には、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変のみを含む本発明の宿主細胞が本発明に含まれる。

他の態様では、本発明は、キシロースで、好ましくは単一炭素源としてキシロースで、より好ましくは嫌気性条件下で増殖させるための、自然発生的な、又は（放射線若しくは化学物質によって）誘導された変異体を選択することによって、キシロース利用にさらに適合した改変宿主細胞に関する。変異体の選択は、たとえば、Ｋｕｙｐｅｒ他（２００４、ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４：６５５〜６６４）に記載されたような連続的継代培養によって、又は本明細書の実施例４で説明したようなケモスタット培養で選択圧下で培養することによって実施することができる。

本発明の好ましい宿主細胞では、変異体の選択によって得られた改変を含む前述の遺伝子改変の少なくとも１つは、宿主細胞に、好ましくは嫌気性条件下で、炭素源として、好ましくは単一炭素源としてキシロースで増殖する能力を与える。改変宿主細胞は、本質的にキシリトールを産生しないことが好ましく、たとえば、産生されたキシリトールは、検出限界未満、又はモルをベースとして消費された炭素の、たとえば５、２、１、０．５若しくは０．３％未満である。

改変宿主細胞は、単一炭素源としてキシロースで、好気性条件下で、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．２５若しくは０．３ｈ^−１の速度で、又は、適切ならば、嫌気性条件下で、少なくとも０．０３、０．０５、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１５若しくは０．２ｈ^−１の速度で増殖する能力を有することが好ましい。改変宿主細胞は、単一炭素源としてグルコース及びキシロースの混合物（重量比１：１）で、好気性条件下で、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．２５若しくは０．３ｈ^−１の速度で、又は、適切ならば、嫌気性条件下で、少なくとも０．０３、０．０５、０．１、０．１２、０．１５若しくは０．２ｈ^−１の速度で増殖する能力を有することが好ましい。

改変宿主細胞の特異的キシロース消費は、少なくとも３４６、３５０、４００、５００、６００、７５０若しくは１０００ｍｇキシロース／ｇ細胞／ｈであることが好ましい。改変宿主細胞のキシロースでの発酵産物（たとえば、エタノール）の収率は、グルコースでの発酵産物（たとえば、エタノール）の宿主細胞の収率の少なくとも５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくは９８％であることが好ましい。改変宿主細胞のキシロースでの発酵産物（たとえば、エタノール）の収率は、宿主細胞のグルコースでの発酵産物（たとえば、エタノール）の収率に等しいことがより好ましい。同様に、改変宿主細胞のキシロースでのバイオマス収率は、宿主細胞のグルコースでのバイオマス収率の少なくとも５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５又は９８％であることが好ましい。改変宿主細胞のキシロースでのバイオマス収率は、宿主細胞のグルコースでのバイオマス収率と等しいことがより好ましい。グルコース及びキシロースでの収率を比較すると、両収率は好気的条件下又は嫌気性条件下で比較されると理解される。

好ましい態様では、本発明の改変宿主細胞は、エタノールを生産するための宿主細胞である。他の態様では、本発明はエタノール以外の発酵産物の生産のために形質転換された宿主細胞に関する。このような非エタノール性発酵産物には、原則として、酵母又は糸状菌などの真核微生物によって産生され得るバルク又はファインケミカルが含まれる。このような発酵産物には、たとえば、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンが含まれる。非エタノール性発酵産物を生産するために好ましい本発明の改変宿主細胞は、アルコール脱水素酵素活性の減少をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。

他の態様では、本発明は、本発明の改変宿主細胞をキシロース源、たとえば、キシロースを含む炭素源の発酵のために使用する発酵方法に関する。キシロース源に加えて、発酵培地中の炭素源はまた、グルコース源を含むことができる。キシロース源又はグルコース源は、キシロース又はグルコース自体であってよく、或いはキシロース又はグルコース単位を含む任意の炭水化物オリゴマー又はポリマー、たとえば、リグノセルロース、キシラン、セルロース、澱粉などであってよい。このような炭水化物からキシロース又はグルコース単位を脱離するために、適切な炭水化物分解酵素（たとえば、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を発酵培地に添加してよく、或いは改変宿主細胞によって産生させてもよい。後者の場合、改変宿主細胞を、このような炭水化物分解酵素を産生分泌するために遺伝子操作することができる。グルコースのオリゴマー又はポリマー源を使用する他の利点は、たとえば、炭水化物分解酵素の律速量を使用することによって、発酵中の遊離グルコースの濃度を（より）低く維持することが可能なことである。これは、次に、キシロースなどの非グルコース糖類の代謝及び輸送に必要な系が抑制されるのを阻止する。好ましい方法では、改変宿主細胞はキシロース及びグルコースの両方を発酵し、好ましくはこれと同時に、ジオキシック増殖を阻止するためにグルコース抑制に非感受性の改変宿主細胞を使用することが好ましい。炭素源としてのキシロース源（及びグルコース源）に加えて、発酵培地はさらに、改変宿主細胞の増殖に必要な適切な成分を含む。酵母などの微生物を増殖させるための発酵培地の組成は、当業界では周知である。

この発酵方法は、たとえば、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧ又はペニシリンＶなどのβ−ラクタム系抗生物質及びそれらの発酵誘導体並びにセファロスポリンなどの発酵産物を産生するための方法である。この発酵方法は、好気的又は嫌気性発酵方法でよい。嫌気性発酵方法は、本明細書では、酸素無しで行われるか、又は実質的に酸素が消費されない、好ましくは５、２．５又は１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｎｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満（すなわち、酸素消費が検出されない）が消費される発酵方法であって、有機分子が電子供与体及び電子受容体の両方として役立つ発酵方法として定義される。酸素無しで、解糖及びバイオマス形成で生じるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化されることはできない。この問題を解決するために、多くの微生物はピルビン酸又はその誘導体の１種を電子及び水素受容体として利用し、それによってＮＡＤ^＋を再生する。したがって、好ましい嫌気性発酵方法では、ピルビン酸は、電子（及び水素受容体）として利用され、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンなどの発酵産物に還元される。

この発酵方法を、改変宿主細胞に最適な温度で実施することが好ましい。したがって、ほとんどの酵母又は糸状菌宿主細胞のために、この発酵方法を、４２℃未満、好ましくは３８℃未満の温度で実施する。酵母又は糸状菌宿主細胞のために、この発酵方法を、３５、３３、３０又は２８℃未満であり、２０、２２又は２５℃を上回る温度で実施することが好ましい。

好ましい方法は、エタノールの生産方法で、この方法は、（ａ）前記で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵する段階と、場合によって、（ｂ）エタノールを回収する段階とを含む方法である。この発酵培地はまた、エタノールにまた発酵されるグルコース源を含むことができる。この方法では、エタノール生産容量は、１時間当たり１リットル当たりエタノールが少なくとも０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、５．０又は１０．０ｇであることが好ましい。この方法におけるキシロース及び／又はグルコースに対するエタノール収率は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９８％であることが好ましい。エタノール収率は、本明細書では理論的最大収率として定義され、グルコース及びキシロースでは、グルコース又はキシロース１ｇ当たりエタノール０．５１ｇである。

他の態様では、本発明は、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択された発酵産物を生産する方法に関する。この方法は、（ａ）本明細書で前記に定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵する段階と、場合によって、（ｂ）この発酵産物を回収する段階とを含むことが好ましい。好ましい方法では、この培地はまた、グルコース源を含有する。

遺伝子改変
前述したような本発明の宿主細胞で酵素を過剰発現させるため、並びに宿主細胞、好ましくは酵母をさらに遺伝子改変するために、宿主細胞を当技術分野で周知の方法によって本発明の様々な核酸構築物で形質転換する。このような方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）「分子クローニング：研究マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、「分子生物学における現在の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準的教科書によって知られている。真菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子改変方法は、たとえば、ＥＰ−Ａ−０６３５５７４、ＷＯ ９８／４６７７２、ＷＯ ９９／６０１０２及びＷＯ ００／３７６７１によって知られている。

本発明の宿主細胞において酵素を過剰発現するために核酸構築物で使用するプロモーターについては前述した。過剰発現するための核酸構築物において、酵素をコードする核酸配列の３’末端は、操作可能に転写ターミネーター配列に結合されることが好ましい。このターミネーター配列は、選択した宿主細胞、たとえば、選択した酵母種などにおいて操作可能であることが好ましい。いずれの場合においても、ターミネーターの選択は重要ではなく、たとえば、非酵母の真核細胞遺伝子由来であればターミネーターは時々しか使用できないが、酵母遺伝子由来であれば可能である。転写終結配列はさらに、ポリアデニル化シグナルを含むことが好ましい。

場合によっては、選択可能なマーカーを核酸構築物中に存在させることができる。本明細書では、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞の選択又はスクリーニングを可能にする形質又は表現型をコードする遺伝子のことである。このマーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であることが可能で、それによって、形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択するために適切な抗生物質を使用することができる。適切な抗生物質耐性マーカーの例には、たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシン及びＧ４１８耐性）が含まれる。抗生物質耐性マーカーは多倍数体宿主細胞の形質転換に最も便利であるが、非抗生物質耐性マーカー、たとえば、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）又はＳ．ｐｏｍｂｅ ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｐ Ｒ、１９８５、Ｇｅｎｅ ４０：１２５〜１３０に記載されている）を使用することが好ましい。好ましい実施形態では、核酸構築物で形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含まない。組換えマーカー遺伝子を含まない微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開第０６３５５７４号に開示されており、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子又は酵母ＵＲＡ３及びＬＹＳ２遺伝子などの両方向性マーカーの使用に基づいている。或いは、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーを、本発明の核酸構築物に組み込み、形質転換細胞のスクリーニングを可能にすることができる。

本発明の核酸構築物に存在することができる任意選択の他の要素には、限定はしないが、１種又は複数のリーダー配列、エンハンサー、組込み要素、及び／又はリポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア及び／又はマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が含まれる。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列などの自立増殖のための配列を含んでよい。適切なエピソームの核酸構築物は、たとえば、酵母２μ又はｐＫＤ１（Ｆｌｅｅｒ他、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９６８〜９７５）プラスミドをベースとすることが可能である。或いは、この核酸構築物は、組込みのための配列を、好ましくは相同組換えによって含むことができる。したがって、このような配列は、宿主細胞のゲノムに組み込むための標的部位に相同な配列であってよい。本発明の核酸構築物は、それ自体公知の方法でもたらすことができ、このような方法は、一般的に、核酸／核酸配列の制限及び連結などの技術を含み、それについては、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）「分子クローニング：研究マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、「分子生物学における現在の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準的教科書に記載されている。

酵母又は糸状菌における不活性化及び遺伝子破壊の方法は当業界では周知である（たとえば、Ｆｉｎｃｈａｍ、１９８９、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．５３（１）：１４８〜７０及び欧州特許出願公開第０６３５５７４号を参照）。

１．材料及び方法
１．１．プラスミド構築物
標的遺伝子の前にＴＰＩ１プロモーターを組み込むために、いくつかのプラスミドを構築した。最初に、ＴＰＩ１プロモーターをｐＹＸ０１２−ＡａｔからＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片として切断し（Ａ．Ａ．Ｗｉｎｋｌｅｒ、ｐＹＸ０１２の誘導体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｉｌｓ、ＭＮ、ＵＳＡ））、ＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩで切断したｐＵＧ６［３］に連結した。これによってｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩが得られ、これは次にＰＣＲ Ｋａｎｌｏｘ−Ｐ_ＴＰＩ組込みカセットに使用することができた。

推定ＯＲＦが標的遺伝子のＡＴＧの非常に近くに位置する場合、この遺伝子をｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩにクローニングした。０．８ｋｂ ＲＰＥ１断片及び２．３ｋｂ ＴＫＬ１断片をゲルから単離して、（表３参照、プライマーに存在する）ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで消化したｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩに連結して、ｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１及びｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１を得た。

キシルロキナーゼの活性を増加させるために、ＸＫＳ１遺伝子をＰＣＲによって（表３参照、プライマーに存在する）ＳｐｅＩ−ＳａｌＩ断片として増幅し、ＸｂａＩ−ＸｈｏＩで切断したｐ４１５ＡＤＨ［４］にクローニングして、ｐ４１５ＡＤＨＸＫＳを得た。

制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ及びＲｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、スイス）及びＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）は、製造元の説明書に従って使用した。大腸菌からのプラスミド単離は、Ｑｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）で実施した。ＤＮＡ断片は、１％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で１×ＴＢＥで分離した［５］。ゲルからの断片の単離は、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で実施した。ＲＰＥ１、ＴＫＬ１及びＸＫＳ１の増幅は、Ｖｅｎｔ_Ｒ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で製造元の説明書に従って実施した。鋳型はＣＥＮ．ＰＫ１１３〜７Ｄ（ｗｔ）の染色体ＤＮＡであった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｂｉｏｍｅｔｒａ ＴＧａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）で以下の設定、６０℃で１分のアニーリング、７５℃で３分の伸長及び９４℃で１分の変性を３０回で実施した。

１．２．株及び培地
この研究で使用したサッカロミセス セレビシエ株はＲＷＢ２１２（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１１２ ｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−２６６、−１）ＴＡＬ１ ｇｒｅ３：：ｈｐｈＭＸ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１ ＫａｎｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−？、−１）ＲＫＩ１）で、これはＣＥＮ．ＰＫ１０２−３Ａ（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−５２ ；ｌｅｕ２−１１２）から得られる。

構築の間、株を複合培地（ＹＰ：酵母抽出物（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）１０ｇｌ^−１、ペプトン（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）２０ｇｌ^−１）又はプレートの場合は炭素源としてグルコース（２％）を補給した合成培地（ＭＹ）［６］（ＹＰＤ又はＭＹＤ）及び寒天１．５％で維持した。形質転換後、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）２００μｇ／ｍｌ又はハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）３００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤに播種することによって組込み体を選択した。プラスミドで形質転換した後、株をＭＹＤに播種した。酵母の形質転換は、Ｇｉｅｔｚ及びＷｏｏｄｓ［７］に従って実施した。

プラスミドは、大腸菌株ＸＬ−１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で増幅させた。形質転換は、Ｉｎｏｕｅ他［８］に従って実施した。大腸菌は、プラスミドを単離するためＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート又は液体ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）培地で増殖させた［５］。

１．３．株の構築
ＴＡＬ１及びＲＫＩ１では、オープンリーディングフレームのＴＰＩ１プロモーター５’の組込みを、ＫａｎＭＸマーカー及びＴＰＩ１プロモーターを有するＰＣＲ断片を増幅し、相同末端を介して標的位置に向けることによって実施した。ＰＣＲは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）で、製造元の説明書に従って実施した。鋳型は、プライマーとしてＰ_ＴＡＬｄｉｓＡ及びＰ_ＴＡＬｄｉｓＢ又はＰ_ＲＫＩｄｉｓＡ及びＰ_ＲＫＩｄｉｓＢ（表３）を有するｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩであった。

ＴＫＬ１及びＲＰＥ１の場合、プラスミドｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１及びｐＵＧ６Ｐ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１はそれぞれＰｖｕＩＩ及びＳａｌＩで直線化し、ゲノムに組み込んだ。構築物の正確な組込みは、ＴＡＬ１ではＴＡＬ１ ｉｎｔｅｒｎ＋ＫａｎＡ及びＴＫＬ１、ＲＰＥ１及びＲＰＩ１ではＰ_ＴＰＩプライマー＋「ｉｎｔｅｒｎ」によるコロニーＰＣＲで確認された。「ｉｎｔｅｒｎ」プライマーは組み込まれた構築物の下流にアニールし、一方Ｐ_ＴＰＩプライマーはＴＰＩ１プロモーターの３’末端にアニールする。

構築物の組込みの後、ＫａｎＭＸマーカーをＣｒｅリコンビナーゼで除去した。このために、株をｐＳＨ４７で形質転換した［３］。プラスミドを有するコロニーを、ガラクトース１％を含むＹＰに再懸濁し、３０℃で１時間インキュベートした。次に、約２００個の細胞をＹＰＤに播種した。得られたコロニーのＫａｎＭＸマーカーの欠損及びｐＳＨ４７（ＵＲＡ３）について調べた。

さらに、ＧＲＥ３遺伝子をｐＡＧ３２のｈｐｈＭＸカセットによって置換して、ハイグロマイシン耐性を与えた［９］。ｈｐｈＭＸカセットは、オリゴ５’ｇｒｅ３：：Ｋａｎｌｏｘ及び３’ｇｒｅ３：：Ｋａｎｌｏｘを使用して増幅した。正確な組込みは、５’ＧＲＥ３＋ＫａｎＡ及び３’ＧＲＥ３＋ＫａｎＢ（表３）を用いたＰＣＲによって確認した。ＫａｎＡ及びＫａｎＢはそれぞれ、Ａ．ｇｏｓｓｉｐｉＴＥＦプロモーター及びターミネーターにアニールし、一方その他のプライマーはＧＲＥ３オープンリーディングフレームの外側にアニールする。

コロニーＰＣＲは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）で、製造元の説明書に従って実施した。鋳型として、細胞を０．０２Ｍ ＮａＯＨ ２．５μｌに再懸濁して、それにＰＣＲ反応混合物を添加した。ＰＣＲは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ ＴＧｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）で以下の設定、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で３分の伸長及び９４℃で１分の変性を３０回で実施した。

次に、得られた株、ＲＷＢ２１２（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１１２ ｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−２６６、−１）ＴＡＬ１ ｇｒｅ３：：ｈｐｈＭＸｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１ ＫａｎｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−？，−１）ＲＫＩ１）をｐＡＫＸ００２、ＴＰＩ１プロモーターの後ろにピロミセス種Ｅ２ ＸｙｌＡを含有する多コピーベクター並びにｐ４１５ＡＤＨＸＫＳで形質転換した。これによって、ＲＷＢ２１７（ＭＡＴＡ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１１２ ｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−２６６、−１）ＴＡＬ１ ｇｒｅ３：：ｈｐｈＭＸ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１ ＫａｎｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−？、−１）ＲＫＩ１｛ｐＡＫＸ００２、ｐ４１５ＡＤＨＸＫＳ｝）が得られた。

１．４．株の維持
保存培養物は、振盪フラスコ中で、グルコース２０ｇｌ^−１を補給した合成培地［６］で３０℃で増殖させた。定常状態に到達したら、滅菌グリセロールを３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）まで添加して、一定量２ｍｌを滅菌バイアル中で−８０℃で保存した。

１．５．培養及び培地
振盪フラスコ培養は、合成培地中で３０℃で実施した［６］。滅菌前に培地のｐＨをＫＯＨ ２Ｍで６．０に調節した。５００ｍｌ振盪フラスコ中のキシロース２０ｇｌ^−１を含有する培地１００ｍｌに凍結保存培養物を接種することによって、予備培養を準備した。オービタル振盪機（２００ｒｐｍ）で３０℃で２４時間から４８時間インキュベートした後、この培養物を振盪フラスコ培養又は発酵槽培養のいずれかに接種するために使用した。嫌気性培養用合成培地にエタノールに溶解したエルゴステロール０．０１ｇｌ^−１及びＴｗｅｅｎ８０ ０．４２ｇｌ^−１を補給し［１０、１１］、これによって培地中のエタノールは１１〜１３ｍＭになった。

１．６．発酵槽における嫌気性バッチ培養
嫌気性バッチ培養は、ノルプレンチューブを備えた研究用発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、オランダ）２リットルで、操作容量１．５リットル、３０℃、ｐＨ５．０で実施した。培養物を８００ｒｐｍで撹拌し、高級窒素（酸素＜５ｐｐｍ）を０．５ｌ分^−１で散布した。この合成培地に嫌気的成長因子エルゴステロール及びＴｗｅｅｎ８０（それぞれ、０．０１及び０．４２ｇｌ^−１）並びにシリコーン消泡剤１００μｌ^−１（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を補給した。

１．７．培養物乾燥重量の測定
培養試料（１０．０ｍｌ）を予め重量を測定したニトロセルロースフィルター（孔径０．４５μｍ、Ｇｅｌｍａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）で濾過した。培地を除去した後、フィルターを脱塩水で洗浄して、電子レンジ（Ｂｏｓｃｈ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ）内で３６０Ｗで２０分間乾燥して、重量を測定した。２連の測定の変動は１％未満であった。

１．８．ガス分析
排出ガスを凝縮器（２℃）で冷却して、Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ乾燥機ＭＤ−１１０−４８Ｐ−４型（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ、Ｔｏｍｓ Ｒｉｖｅｒ、ＵＳＡ）で乾燥した。Ｏ_２及びＣＯ_２濃度は、ＮＧＡ２０００分析器（Ｒｏｓｅｍｏｕｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｏｒｒｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）で測定した。排出ガス−流速及び特異的酸素消費量及び二酸化炭素生成率は、既に記載されたように測定した［１２、１３］。これらのバイオマス特異的速度の計算では、培養試料の採取によって生じる体積の変化を修正した。

１．９．代謝物分析
グルコース、キシロース、キシリトール、有機酸、グリセロール及びエタノールは、Ｂｉｏｒａｄ ＨＰＸ ８７Ｈカラム（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を含有するＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）でＨＰＬＣ分析することによって検出した。このカラムを、６０℃で、Ｈ_２ＳＯ_４ ０．５ｇｌ^−１によって、流速０．６ｍｌ分^−１で溶出した。Ｗａｔｅｒｓ ２４１０屈折率検出器及びＷａｔｅｒｓ ２４８７ＵＶ検出器によって検出した。キシルロースは、以下の方法で酵素的に測定した。反応混合物は、ＭｇＣｌ_２ １０ｍＭ、ＮＡＤＨ ０．３０ｍＭを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）及び適切な量の試料（全量１ｍｌ）からなり、測定はソルビトール脱水素酵素０．２Ｕ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を添加することによって開始した。キシルロース濃度は、ＮＡＤＨについての吸収係数６．３ｍＭ^−１ｃｍ^−１を使用して計算した。

１．１０．炭素回収率及びエタノール蒸発
炭素回収率は、形成された生成物中の炭素を消費した糖炭素の全量で除することによって計算し、バイオマスの炭素含量４８％に基づいた。発酵中のエタノール蒸発を修正するために、産生したエタノールの量は、測定したＣＯ_２累積生成量マイナスバイオマス合成によって生じたＣＯ_２生成量（バイオマス１ｇ当たりＣＯ_２５．８５ｍｍｏｌ、［１４］）及び既に記載されたような［２］酢酸形成に関連したＣＯ_２に等しいと推定された。

１．１１ マイクロアレイ分析
ケモスタットからの細胞採取、プローブ調製及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、既に記載されたように実施した［１５］。各増殖条件の結果は、独立した３回の反復培養から得た。

１．１２．データ取得及び分析
アレイ画像の取得及び定量並びにデータフィルタリングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアパッケージ：マイクロアレイセット ｖ５．０ ＭｉｃｒｏＤＢ ｖ３．０及びデータマイニングツール ｖ３．０を使用して実施した。

比較の前に、マイクロアレイセット ｖ５．０を用いて、全遺伝子特性の平均的シグナルを使用して、全アレイの規模を全体的に標的値１５０に合わせた。ＹＧ−Ｓ９８アレイ上の９３３５個の転写特性から、６０８４個の様々な遺伝子がある正確に６３８３個の酵母オープンリーディングフレームにフィルターを適用した。この相違は、最適以下のプローブ類をアレイ設計に使用したとき、いくつかの遺伝子が複数回表されるためである。

３回の測定の変動を表すために、変動係数（Ｃ．Ｖ．、平均で除した標準偏差）をＢｏｅｒ他によって既に記載されたように計算した［１６］。

さらに統計学的に分析するには、８種のデータ組の可能なペアワイズ比較のためにＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ＳＡＭ ｖ１．１２）アドインを行うマイクロソフトエクセルを使用した［１７］。ＳＡＭ（過誤発見率（ＦＤＲ）の中央値の期待値１％）を使用して互いの条件で少なくとも２倍の有意な変化がある場合、遺伝子の発現は変化していると見なした。得られた発現レベルが有意に変化した組の階層的クラスタリングを、その後Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって実施した。

１．１３．酵素アッセイ
キシロースイソメラーゼ活性は、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、キシロース１０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １０ｍＭ及び適切な量の無細胞抽出液を含有する反応混合物において３７℃で測定した。形成したキシロースの量を、システインカルバゾール法によって測定した［９］。或いは、キシロースイソメラーゼ活性は、Ｋｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｓｏｎ他（「Ｄ−ソルビトール脱水素酵素を使用した酵素アッセイによるＤ−キシロースイソメラーゼの動力学的特徴付け（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｉｔｏｎ ｏｆ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９８７）１４５〜１４８）によって開発された３０℃での酵素アッセイで測定した。形質転換したＳ．セレビシエ株の無細胞抽出液におけるキシロースイソメラーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、２価陽イオン（Ｍｇ^２＋及びＣｏ^２＋）に左右される。

キシルロースキナーゼ及びキシロース還元酵素活性は、Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ他（２８）によって記載されたように測定した。活性の１単位は、測定条件下で、１分当たりキシルロース１ｎｍｏｌを産生する酵素の量と定義する。形成されたキシルロースは、Ｄｉｓｃｈｅ及びＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｓｃｈｅ及びＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９２：５８３〜５８７）の方法、又はＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｎカラムを８０℃で操作し、溶出液としてＮａ_２ＨＰＯ_４０．０１Ｍを用いて０．６ｍｌ／分で溶出したＨＰＬＣによって測定した。キシロース及びキシルロースは、内部温度６０℃で屈折率検出器によって検出した。

比活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの単位として表す。タンパク質は、標準物としてウシγ−グロブリンを使用してＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定した。

２．結果
２．１ ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）遺伝子の過剰発現
以前に、サッカロミセス セレビシエにおける真菌キシロースイソメラーゼの発現は、十分な選択圧を加えれば、原理上は単一炭素源としてキシロースでのこの酵母の嫌気的増殖を可能にするために十分であることを示した［２］。しかし、選択された株は、産業上の必要条件まではまだ実現していない（表１）。

ペントースリン酸代謝における律速段階の可能性を調べるために、キシロースをフルクトース−６−リン酸及びグリセルアルデヒド−３−リン酸に変換するために必要な酵素全てを過剰生成する株を構築することに決定した。過剰発現する酵素は、キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシルロキナーゼ（ＸＫＳ）、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ（Ｒ５ＰＩ）、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ（Ｒ５ＰＥ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）及びトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）であった。さらに、所望しないキシリトールの産生を媒介する［１８］、ＧＲＥ３によってコードされる非特異的アルドース還元酵素は除去した。ＰＰＰにおける酵素の基質のいくつかは市販されていないので、酵素活性測定よりもＤＮＡアレイによって過剰発現を調べることを決定した。表１に挙げた結果によってさらに、標的遺伝子の転写はＲＷＢ２１２株においてうまく変更されていることが確かめられた。

表１。対照株Ｓ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ及び操作されたキシロースイソメラーゼ発現種Ｓ．セレビシエＲＷＢ２１２におけるキシルロキナーゼ及びペントースリン酸経路酵素をコードする構造遺伝子のｍＲＮＡレベル。両方の株を好気的に、グルコースを制限したケモスタット培養（Ｄ＝０．１０ｈ^−１）で増殖させた。転写レベルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップマイクロアレイで測定した。データは、各株の３種の独立した培養物での分析の平均±平均の平均偏差である。ＡＣＴ１（Ｎｇ及びＡｂｅｌｓｏｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：３９１２〜３９１６）及びＰＤＡ１（Ｗｅｎｚｅｌ他、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：８８３〜８８４）を内部標準として含める。

２．２ 操作された株の生理学的特徴付け
操作された株の顕著な特徴の１つは、いかなる選択的圧力も必要とせず、キシロースで嫌気的に増殖する能力であった（図１）。無機質培地でのキシロースによる嫌気的増殖は、０．０９ｈ^−１の高い増殖速度で進行した。キシルロースは蓄積しないが、キシリトール形成は極めて僅かであるが検出可能なバイオマスで（図１）、キシロースによるＲＷＢ２１２種のエタノール及びグリセロールの収率は、進化工学によって得られたＲＷＢ２０２−ＡＦＸの収率に匹敵した（表２）。表２から、ＲＷＢ２０２−ＡＦＸのキシロース３４５ｍｇ／バイオマスｇ／ｈと比較すると、キシロース１．０ｇ／バイオマスｇ／ｈを上回る特異的キシロース消費速度を算出することができるが（Ｑｓ＝０，０９／０，０８５＝１，０５９ｇｒＸｙｌ／ｇｒＸ／ｈ）、グルコースでの収率と少なくとも類似の収率が得られた。

２．３ 混合基質の利用
導入で指摘したように、ヘミセルロース加水分解物のエタノールへの経済的変換には、グルコース及びキシロース両方の好ましくは同時の発酵が必要である。混合糖利用に関して、ＲＷＢ２１２株の特性を確認するために、酵母をグルコース及びキシロース（それぞれ２０ｇｌ^−１）の混合物で増殖させた。図２に示した結果は、両方の糖は完全に消費されるが、グルコースが好ましい基質であることを示している。グルコースの約８０％が消費された後に、キシロース消費が開始した。

３．酵母におけるＢ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）キシロースイソメラーゼの機能的発現
Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＶＰＩ−５４８２キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列（アクセッション番号ＡＡＯ７５９００又はＮＰ８０９７０６、配列番号１０）を多コピー酵母発現ベクターにクローニングして、ｐ４２６ＧＰＤＢｔＸＩを得た。このプラスミドを使用してＲＷＢ２１５（ＭＡＴαｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−１１２ ｌｏｘＰ−ＰＴＰＩ：：（−２６６、−１）ＴＡＬ１ ｇｒｅ３：：ｈｐｈＭＸ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＴＫＬ１ ｐＵＧＰ_ＴＰＩ−ＲＰＥ１ ＫａｎｌｏｘＰ−Ｐ_ＴＰＩ：：（−？、−１）ＲＫＩ１）を形質転換し、キシルロキナーゼを過剰発現させるためにさらにｐ４１５ＡＤＨＸＫＳで形質転換した。２種の独立した形質転換体を選択したところ、両者とも単独炭素源としてキシロースを含む最少培地で増殖することができ、この形質転換体の溶解物では、特異的キシロースイソメラーゼ活性を測定すると、ピロミセスキシロースイソメラーゼを発現する株のタンパク質１ｍｇ当たり約１３００Ｕと比較して、タンパク質１ｍｇ当たり１４０＋／−２０Ｕであった。

４．ＲＷＢ２１２の選択
ＲＷＢ２１２株（前記参照）を、炭素源としてキシロース３０ｇ／ｌを含む嫌気的ケモスタット培地（ｄｕｐｌｏ）で、推定増殖速度０．０６ｈ^−１で培養することによって選択圧下に置いた。選択方法は、培養乾燥重量及び残存キシロース濃度を測定することによってモニターした。初期残存キシロース濃度は、約３０ｍＭであったが、２６世代（３００時間）後では既に、残存キシロース濃度は１５ｍＭ未満に減少しており（図３Ａ）、バイオマス濃度の対応する増加も認められた（図３Ｂ）。

これらからケモスタット培養試料を５３０時間目に採取して、グルコース２％を補給した無機質培地寒天プレートに播種した。３０℃で６２時間後、これらのプレートからシングルコロニーを新鮮なグルコースプレートに再度画線した。さらに３０℃で７２時間インキュベートした後、２個のコロニーを選択し（１個のコロニーはそれぞれ別のケモスタットから生じた）、グルコース２０ｇ／ｌ及びキシロース２０ｇ／ｌによる嫌気性発酵槽バッチのための予備培養（好気的振盪フラスコ、グルコースを含む無機質培地）に接種するために使用した。

図４のＣＯ_２排気シグナルから、これらの培養は、親株ＲＷＢ２１２及びその他の選択株ＲＷＢ２０２−ＡＦＸと比較して優れたキシロース利用特性を有していることが証明されている。「新規」選択株は、キシロースを消費するときＣＯ_２生成率の増加を示すが、これは親株では認められない。図５は、主にキシロース消費段階における、これら２種の独立したバッチ上清中の炭素源及び生成物の測定濃度を示す。両実験の総（すなわち、グルコース＋キシロース段階）量的エタノール生成率は、０．５ｇ／Ｌ．時間より高く、第１のバッチはまた、キシロース消費段階における量的生成率が０．５ｇ／Ｌ．時間より高いことを示している。

５．ＲＢＷ２０４、２０６、２０８及び２１０株の試験
試験した株は、特許文献及びＫｕｙｐｅｒ他、２００５、ＦＥＭＳＹＲ ５：３９９〜４０９に記載されたように構築された。改変遺伝子を以下の表に挙げる。

前記表に挙げた改変を導入した後、全株を２個のプラスミド、ピロミセスキシロースイソメラーゼを発現するｐＡＫＸ００２及び内在性キシルロキナーゼを発現する第２プラスミド、ｐ４１５ＡＤＨＸＫＳで形質転換した。上記文献中、２個のプラスミドで形質転換したＲＷＢ２１２は、別の番号、ＲＷＢ２１７を与えられた。２個のプラスミドによるＲＷＢ２１２の形質転換を繰り返すことによってＲＷＢ２２３が生じた。

形質転換後、シングルコロニーをグルコースを含む合成培地寒天プレートに画線した。これらのプレートから、合成培地及びキシロース２０ｇ／ｌを含む振盪フラスコ培養に接種して、３０℃で４８時間インキュベートした。各振盪フラスコ培養を使用して、合成培地及びキシロース２０ｇ／ｌを含む嫌気性発酵槽に接種した。

４８時間インキュベーションした後、ＲＷＢ２０４を接種した振盪フラスコは、目で見たところ増殖していなかった。フラスコ４個全てを１個の発酵槽の接種に使用した。発酵槽における増殖は、排気中のＣＯ_２濃度を測定することによってモニターした。

参考にするために、ＲＷＢ２１７及びＲＷＢ２２３（いずれもＴＡｌ、ＴＫＬ、ＲＰＥ及びＲＫＩを過剰発現している）のＣＯ_２プロフィールも図１に挙げる。１００時間にわたって、ＲＷＢ２０４及びＲＷＢ２０６のバッチの排気中に顕著なＣＯ_２生成を測定することができなかった。これらのＣＯ_２生成図から測定された増殖率は、ＲＷＢ２０８、２１７及び２２３では０．１２ｈ^−１、ＲＷＢ２１０では０．０８^−１と測定された。これらから、キシロースによる嫌気的増殖にはトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼ両方の過剰発現が必要であるという結果が得られた。さらに、ＲＷＢ２１０においてリボース−５−リン酸エピメラーゼがさらに過剰発現することによってキシロースでの増殖速度が減少する。ＲＰＥ１の過剰発現はおそらくキシルロース−５Ｐ、リブロース−５Ｐ及びリボース−５Ｐの間の平衡を攪乱し、トランスケトラーゼの活性を妨害する。これらの実験条件下では、Ｒ５Ｐ−エピメラーゼ及び−イソメラーゼがさらに過剰発現することによって嫌気的キシロース発酵の成果が改善されることはない。

表２。発酵槽での嫌気性バッチ培養中の野生型ＣＥＮ．ＰＫ １１３〜７Ｄ、選択株ＲＷＢ２０２−ＡＦＸ及び操作株ＲＷＢ２１２による増殖パラメータ、糖消費及び生成物形成。値は、２種の独立したバッチ培養の平均及び実験による偏差として表す。

^ａグルコース消費段階から測定。^ｂＣＯ_２生成から推定したエタノール濃度に基づいて計算、１．１０項を参照。^ｃＣＯ_２生成から推定、１．１０項を参照。^ｄ一時的蓄積。この値は、対数期中間部における最高濃度を表す。増殖の最後に、全キシルロースは再度消費され、その他の培養では全て、キシルロース濃度は検出限界を下回ったままであった。

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９．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．及びＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９９９）「サッカロミセス セレビシエにおける遺伝子破壊用の３種の主要な新規薬剤耐性カセット（Ｔｈｒｅｅ ｎｅｗ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）」Ｙｅａｓｔ １５、１５４１〜１５５３。
１０．Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ａ．Ａ．及びＳｔｉｅｒ，Ｔ．Ｊ．（１９５３）「サッカロミセス セレビシエの嫌気的栄養。Ｉ。合成培地で増殖するためのエルゴステロールの必要性（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｉ．Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ．）」Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１、２３〜３６。
１１．Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ａ．Ａ．及びＳｔｉｅｒ，Ｔ．Ｊ．（１９５４）「サッカロミセス セレビシエの嫌気的栄養。ＩＩ。合成培地で増殖するための不飽和脂肪酸の必要性（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＩＩ．Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ．）」Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３、２７１〜２８１。
１２．Ｖａｎ Ｕｒｋ，Ｈ．、Ｍａｋ，Ｐ．Ｒ．、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，Ｗ．Ａ．及びＶａｎ Ｄｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ．（１９８８）「グルコース制限からグルコース過剰への転換によるサッカロミセス セレビシエＣＢＳ８０６６及びカンジダ ユチリスＣＢＳ６２１の代謝応答（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＢＳ ８０６６ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＣＢＳ ６２１ ｕｐｏｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ ｅｘｃｅｓｓ．）」Ｙｅａｓｔ ４、２８３〜２９１。
１３．Ｗｅｕｓｔｈｕｉｓ，Ｒ．Ａ．、Ｌｕｔｔｉｋ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，Ｗ．Ａ．，Ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ．及びＰｒｏｎｋ，Ｊ．Ｔ．（１９９４）「生成阻害によって酵母においてＫｌｕｙｖｅｒ効果が引き起こされるか（Ｉｓ ｔｈｅ Ｋｌｕｙｖｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ？）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４０、１７２３〜１７２９。
１４．Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｃ、Ｐｏｓｔｍａ，Ｅ．、Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，Ｗ．Ａ．及びＶａｎ Ｄｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９０）「嫌気的グルコース制限ケモスタット培養におけるサッカロミセス セレビシエの生理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｈｅｍｏｓｔａｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６、３９５〜４０３。
１５．Ｐｉｐｅｒ，Ｍ．Ｄ．、Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ，Ｐ．、Ｂｒｏ，Ｃ、Ｒｅｇｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．、Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｓ．、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．及びＰｒｏｎｋ，Ｊ．Ｔ．（２００２）「オリゴヌクレオチドマイクロアレイトランスクリプトーム分析の再現性。サッカロミセス セレビシエのケモスタット培養を使用した研究室間の比較（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ａｎ ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｏｓｔａｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３７００１〜３７００８。
１６．Ｂｏｅｒ，Ｖ．Ｍ．、ｄｅ Ｗｉｎｄｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｎｋ，Ｊ．Ｔ．及びＰｉｐｅｒ，Ｍ．Ｄ．（２００３）「炭素、窒素、リン又は硫黄を制限した好気的ケモスタット培養においてグルコースで増殖したサッカロミセス セレビシエのゲノム規模の転写応答（Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｒｏｗｎ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｈｅｍｏｓｔａｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｆｏｒ ｃａｒｂｏｎ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，ｏｒ ｓｕｌｆｕｒ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、３２６５〜３２７４。
１７．Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．及びＣｈｕ，Ｇ．（２００１）「イオン化照射応答に適用したマイクロアレイの有意性分析（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９８、５１１６〜５１２１。
１８．Ｔｒａｆｆ，Ｋ．Ｌ．、Ｏｔｅｒｏ Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｒ．Ｒ．、Ｖａｎ ＺｙＩ，Ｗ．Ｈ．及びＨａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ｂ．（２００１）「ＧＲＥ３アルドース還元酵素遺伝子の欠失並びにｘｙｌＡ及びＸＫＳ１遺伝子を発現するサッカロミセス セレビシエの組換え種におけるキシロース代謝に対するその影響（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＲＥ３ ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｘｙｌｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｘｙｌＡ ａｎｄ ＸＫＳｌ ｇｅｎｅｓ．）」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７、５６６８〜５６７４。
１９．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，Ｔ．Ｗ．及びＪｉｎ，Ｙ．Ｓ．（２００４）「酵母によるペントースの発酵改善のための代謝工学（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｔｏｓｅｓ ｂｙ ｙｅａｓｔｓ．）」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６３、４９５〜５０９。
２０．Ｋｕｙｐｅｒ，Ｍ．、Ｈａｒｈａｎｇｉ，Ｈ．Ｒ．、Ｓｔａｖｅ，Ａ．Ｋ．、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ａ．Ａ．、Ｊｅｔｔｅｎ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｅ Ｌａａｔ，Ｗ．Ｔ．、Ｄ Ｒｉｄｄｅｒ、Ｊ．Ｊ．、Ｏｐ ｄｅｎ Ｃａｍｐ、Ｈ．Ｊ．、Ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｐｒｏｎｋ，Ｊ．Ｔ．（２００３）「真菌キシロースイソメラーゼの高レベル機能的発現：サッカロミセス セレビシエによるキシロールの効果的なエタノール発酵の鍵は？（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｇａｌ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ： ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ？）」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．４、６９〜７８。
２１．Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．及びＦｕｎｋ，Ｍ．（１９９５）「様々な遺伝的背景において異種タンパク質を制御発現するための酵母Ｖベクター（Ｙｅａｓｔ Ｖｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｓ．）」Ｇｅｎｅ １５６、１１９〜１２２。

発酵槽において、キシロース２％（ｗ／ｖ）を炭素源とした合成培地でのＲＷＢ２１２株の嫌気的増殖を示した標準的な図で、２連の実験の差は５％未満であった。パネルＡ：キシロース（●）、エタノール（○）、グリセロール（■）及びガス分析から推定される１リットル当たりのＣＯ_２蓄積生産量（−）。パネルＢ：乾燥重量（●）、酢酸（○）、キシリトール（□）、コハク酸（▲）、乳酸（△）。 発酵槽において、グルコース２％（ｗ／ｖ）及びキシロース２％（ｗ／ｖ）を炭素源とした合成培地でのＲＷＢ２１２株の嫌気的増殖を示した標準的な図で、２連の実験の差は５％未満であった。パネルＡ：グルコース（●）、キシロース（○）、エタノール（■）、グリセロール（□）及びガス分析から推定される１リットル当たりのＣＯ_２蓄積生産量（−）。パネルＢ：乾燥重量（●）、酢酸（○）、キシリトール（■）、乳酸（□）、コハク酸（▲）。 パネルＡ：キシロース３０ｇ／ｌを炭素源としたＲＷＢ２１２の嫌気的ケモスタット培養中の残存キシロース濃度を示す図である。示したデータは、２つの独立したケモスタットの平均及び実験の偏差である。パネルＢ：キシロース３０ｇ／ｌを炭素源としたＲＷＢ２１２の嫌気的ケモスタット培養中の培養乾燥重量を示す図である。示したデータは、２つの独立したケモスタットの平均及び実験の偏差である。 グルコース及びキシロース（それぞれ２０ｇ／ｌ）での嫌気性バッチ培養における３種のキシロース代謝株の二酸化炭素産生特性を示した図である。正確な実験条件は変化するので、実際の数値は比較できない。 ＲＷＢ２１２から生じた選択種のグルコース２％及びキシロース２％による２種の独立した嫌気性発酵槽バッチで測定されたグルコース、キシロース、エタノール、グリセロール及びＣＯ_２の濃度を示す図である。

Claims (17)

1. 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で形質転換された酵母又は糸状菌の宿主細胞であって、該宿主細胞を形質転換することによって、該核酸構築物が、キシロースをキシルロースへ直接異性化する能力を該宿主細胞にもたらし、該宿主細胞が、少なくともトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変、並びに、非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変を含む、上記宿主細胞。
2. 前記ヌクレオチド配列がバクテロイデス綱の細菌から得られるキシロースイソメラーゼをコードする、請求項１に記載の宿主細胞。
3. キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列のコドン利用が宿主細胞のコドン利用に最適化するように、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を適合させる、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
4. 適合化されたヌクレオチド配列は宿主細胞のコドン利用に対して少なくとも０．６のコドン適合指数を有する、請求項３に記載の宿主細胞。
5. 前記宿主細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の一つに属する酵母である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
6. 前記酵母が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ジアスタチカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、及びＫ．フラギリス（Ｋ．ｇｒａｇｉｌｉｓ）の種の一つに属する、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 前記宿主細胞が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の一つに属する糸状菌である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
8. リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする各遺伝子の過剰発現を含む遺伝子改変を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
9. 前記遺伝子改変が特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変である、請求項８に記載の宿主細胞。
10. 前記特異的なキシルロースキナーゼ活性を増加する遺伝子改変がキシルロースキナーゼをコードする内在性のまたは異種性の遺伝子の過剰発現を含む、請求項９に記載の宿主細胞。
11. 前記宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素活性を減少させる遺伝子改変が、宿主細胞において非特異的アルドース還元酵素をコードする内在性遺伝子を不活性化させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
12. 以下のステップを含むエタノール生産方法：
    （ａ）請求項１から１１までのいずれか一項で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵するステップ；及び、場合によって、
    （ｂ）エタノールを回収するステップ。
13. 前記培地が、グルコース源も含有する、請求項１２に記載の方法。
14. エタノールの量的生産性が少なくとも１時間当たり１リットル当たりエタノール０．５ｇである、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. エタノール収率が少なくとも５０％である、請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の方法。
16. 以下のステップを含む、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質及びセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物の生産方法：
    （ａ）請求項１から１１までのいずれか一項で定義した改変宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵し、それによって前記宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵するステップ；及び、場合によって、
    （ｂ）発酵産物を回収するステップ。
17. 前記培地がグルコース源も含有する、請求項１６に記載の方法。

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