BR112017021066B1

BR112017021066B1 - Glicosídeos de esteviol, método para a produção de um glicosídeo de esteviol, composição, usos relacionados, gênero alimentício, alimento para animais e bebida

Info

Publication number: BR112017021066B1
Application number: BR112017021066-5A
Authority: BR
Inventors: Robertus Antonius Mijndert Van Der Hoeven; Peter Philip Lankhorst; Silvia GOSIEWSKA
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2016-04-04
Publication date: 2022-02-08
Also published as: BR112017021066A2; CN113683712B; US20180070622A1; CN113683712A; EP3718417A1; US20220256903A1; EP3277829B1; CA2980090A1; EP3277829A1; US11540544B2; WO2016156616A1; CN107666834B; CN107666834A; US11344051B2

Abstract

glicosídeos de esteviol. a presente invenção se refere a um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (i) em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição r1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição r2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar, todas as quais estão ligadas, direta ou indiretamente, à aglicona de esteviol por ligações ß.

Description

Campo da invenção

A presente invenção se refere a glicosídeos de esteviol, aos métodos para produção destes, a composições adoçantes, composições aromatizantes, gêneros alimentícios, alimentos e bebidas compreendendo os glicosídeos de esteviol e ao uso dos glicosídeos de esteviol em composições adoçantes, composições aromatizantes, gêneros alimentícios, alimentos para animais e bebidas.

Antecedentes da Invenção

As folhas da erva perene, Stevia rebaudiana Bert., acumulam quantidades de compostos intensamente adocicados conhecidos como glicosídeos de esteviol. Enquanto que a função biológica desses compostos não está clara, esses possuem significância comercial como adoçantes de alta potência alternativos.

Esses glicosídeos de esteviol adocicados possuem propriedades sensoriais e funcionais que aparentam serem superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência. Além disso, estudos sugerem que o esteviosídeo pode reduzir níveis de glicose sanguínea em diabéticos do Tipo II e pode reduzir a pressão sanguínea em pacientes com hipertensão moderada.

Os glicosídeos de esteviol que se acumulam em folhas de estévia onde podem compreender de 10 a 20 % do peso seco da folha. O esteviosídeo e o rebaudiosídeo A são tanto termoestáveis quanto estáveis em pH e adequados para uso em bebidas gasosas e muitos outros alimentos. O esteviosídeo é entre 110 e 270 vezes mais doce que a sacarose, o rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes mais doce que a sacarose. Além disso, o rebaudiosídeo D é também um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência que se acumula em folhas de estévia. Esse pode ser cerca de 200 vezes mais doce que a sacarose. O rebaudiosídeo M é um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência adicional. Esse está presente em quantidades-traço em certas variedades da folha de estévia, mas é pensado que tenha um perfil de sabor superior.

Os glicosídeos de esteviol têm sido tradicionalmente extraídos da planta Stevia. Na Stevia, o (-)-ácido caurenoico, um intermediário em biossíntese de ácido giberélico (GA), é convertido no diterpeno esteviol tetracíclico, que, então, prossegue através de uma via de glicosilação de múltiplas etapas para formar os vários glicosídeos de esteviol. Entretanto, as produtividades podem ser variáveis e afetadas por agricultura e condições ambientais. Ademais, a cultivação de estévia requer área útil substancial, um longo tempo antes da colheita, mão-de- obra intensa e custos adicionais para a extração e a purificação dos glicosídeos.

Existe, portanto, uma necessidade por glicosídeos de esteviol adicionais tendo perfis de sabor alternativos e/ou melhorados, uma vez que diferentes glicosídeos de esteviol podem ser mais bem adequados para diferentes aplicações. Sumário da invenção

A presente invenção se baseia na identificação de novos glicosídeos de esteviol em caldos de fermentação obtidos a partir de microrganismos que foram modificados de modo a produzir glicosídeos de esteviol, incluindo rebA. Os novos glicosídeos de esteviol terão diferentes propriedades sensoriais em comparação com glicosídeos de esteviol conhecidos. Eles podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros glicosídeos de esteviol, em particular como adoçantes ou em composições de adoçante.

Por conseguinte, a invenção se refere a: - um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 açúcar estão presentes glicosídeo de esteviol frações de açúcar, todas e pelo menos três frações de na posição R2 e em que o compreende pelo menos sete as quais estão ligadas, direta ou indiretamente, à aglicona de esteviol por ligações β; um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que (I) pelo menos posições R1 4 frações de açúcar estão presentes nas açúcar estão presentes na um glicosídeo de esteviol e pelo posição tendo a menos três frações de R2; fórmula (I)

em que (I) presentes na açúcar estão pelo menos posição R1 3 frações de açúcar estão glicosídeo presentes de esteviol e pelo menos na posição três R2 frações de em que o frações de presentes compreende pelo açúcar e em que pelo menos na posição R1 está ligado menos sete um dos açúcares aglicona de esteviol ou a uma molécula de açúcar por uma ligação α; - um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos quatro frações de açúcar estão presentes na posição R2, em que pelo menos quatro frações de açúcar presentes na posição R2 são frações de glicose; - um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (II)

- um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (III)

um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (IV)

um glicosídeo de esteviol produzido por fermentação tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar; - um método para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, cujo método compreende: proporcionar uma célula de levedura recombinante compreendendo sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos codificadas por: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; fermentar a célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado; e, opcionalmente, recuperar um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores. - uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol da invenção e um ou mais glicosídeos de esteviol diferentes (em que os glicosídeos de esteviol diferentes podem ou não ser um glicosídeo de esteviol da invenção); - uma composição adoçante, uma composição aromatizante, um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida que compreende um glicosídeo de esteviol ou uma composição da invenção; - uso de um glicosídeo de esteviol ou de uma composição da invenção em uma composição adoçante ou composição aromatizante; e - uso de um glicosídeo de esteviol ou de uma composição da invenção em um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 apresenta uma representação esquemática do plasmídeo pUG7-EcoRV.

A Figura 2 apresenta uma representação esquemática do método pelo qual os cassetes de superexpressão ERG20, tHMG1 e BTS1 são projetados (A) e integrados (B) no genoma da levedura. (C) mostra a situação final após a remoção do marcador KANMX pela Cre recombinase.

A Figura 3 apresenta uma representação esquemática do construto knockdown ERG9. Isso consiste em uma parte 3’ de ERG9 com 500 pb de comprimento, 98 pb do promotor de TRP1, do quadro de leitura aberto e do terminador de TRP1, seguido por uma sequência a jusante de ERG9 com 400 pb de comprimento. Devido à introdução de um sítio XbaI na extremidade do quadro de leitura aberto de ERG9, o último aminoácido se altera para Ser e o códon de parada para Arg. Um novo códon de parada está situado no promotor de TPR1, resultando em uma extensão de 18 aminoácidos.

A Figura 4 apresenta uma representação esquemática de como UGT2 é integrada ao genoma. A. diferentes fragmentos usados na transformação; B. situação após integração; C. situação após expressão de Cre recombinase.

A Figura 5 apresenta uma representação esquemática de como a via de GGPP para RebA é integrada ao genoma. A. diferentes fragmentos usados na transformação; B. situação após integração.

A Figura 6a apresenta um cromatograma dos íons extraídos de m/z 1451.5820 da mistura dos glicosídeos de esteviol contendo 7 glicoses (7.1, 7.2 e 7.3) no extrato etanólico (material de partida para purificação), usando espectrometria de massa de alta resolução; e a Figura 6b: cromatograma dos íons extraídos de m/z 1451.5 dos glicosídeos de esteviol purificados contendo 7 glicoses (7.1, 7.2 e 7.3), usando LC-MS.

A Figura 7 mostra a estrutura do Rebaudiosídeo 7.1.

A Figura 8 mostra a estrutura do Rebaudiosídeo 7.2.

A Figura 9 mostra a estrutura do Rebaudiosídeo 7.3.

A Figura 10 mostra a estrutura do Rebaudiosídeo M.

A Figura 11 mostra (a) a numeração atômica do esteviol e (b) a numeração atômica da glicose.

A Figura 12 mostra a região selecionada do espectro de 1H RMN de a) Reb M (cdcl3/pir 1:1, 2 gotas de cdood a 300 K), b) Reb 7.1 (cdcl3/pir 1:3, 2 gotas de cdood a 320 K) c) Reb 7.2 (cdcl3/pir 1:1, 2 gotas de cdood de 300 K) e d) Reb 7.3 (cdcl3/pir 1:2, 3 gotas de cdood a 300 K).

Descrição da listagem de sequências

Uma descrição das sequências é apresentada na Tabela 15. As sequências descritas aqui podem ser definidas com referência à listagem de sequências ou com referência aos números de acesso dos bancos de dados também definidos na Tabela 15.

Descrição detalhada da invenção

Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras “compreender”, “incluir” e “ter” e variações como “compreende”, “compreendendo”, “inclui” e “incluindo” devem ser interpretadas inclusivamente. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, onde for permitido pelo contexto.

Os artigos “um” e “uma” são usados no presente documento para se referirem a um ou a mais que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” pode significar um elemento ou mais de um elemento.

A presente invenção se refere a glicosídeos de esteviol. Para os propósitos da presente invenção, um glicosídeo de esteviol é um glicosídeo de esteviol, especificamente uma molécula de esteviol com o seu átomo de hidrogênio da carboxila substituído por uma molécula de glicose para formar um éster e um hidrogênio da hidroxila substituído por glicose para formar um acetal.

Um glicosídeo de esteviol da invenção pode ser proporcionado em forma isolada. Um “glicosídeo de esteviol isolado” é uma substância extraída de outros materiais, tais como outros glicosídeos de esteviol, com os quais este pode estar associado naturalmente. Assim, um glicosídeo de esteviol isolado pode conter no máximo 10 %, no máximo 8 %, mais de preferência no máximo 6 %, mais de preferência no máximo 5 %, mais de preferência no máximo 4 %, mais de preferência no máximo 3 %, ainda mais de preferência no máximo 2 %, ainda mais de preferência no máximo 1 % e com a máxima preferência no máximo 0,5 % em peso de outros materiais, por exemplo, outros glicosídeos de esteviol, com os quais ele é associado naturalmente. Os glicosídeos de esteviol isolados podem ser isentos de quaisquer outras impurezas. O glicosídeo de esteviol isolado da invenção pode ser pelo menos 50 % puro, por exemplo, pelo menos 60 % puro, pelo menos 70 % puro, pelo menos 75 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % puro em peso.

A invenção proporciona um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar, todas as quais estão ligadas, direta ou indiretamente, à aglicona de esteviol por ligações β; ou em que pelo menos 4 frações de açúcar estão presentes nas posições R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2, ou em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2, em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar e em que pelo menos um dos açúcares presentes na posição R1 está ligado à aglicona de esteviol ou a uma molécula de açúcar por uma ligação α; ou em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos quatro frações de açúcar estão presentes na posição R2, em que pelo menos quatro frações de açúcar presentes na posição R2 são frações de glicose.

A invenção também proporciona glicosídeos de esteviol (II)

Um glicosídeo de esteviol da invenção pode ser obtido a partir de material vegetal, mas mais tipicamente será obtido por produção fermentativa, por exemplo, através da fermentação de uma célula hospedeira recombinante, tal como uma célula de levedura.

Assim, a invenção proporciona um glicosídeo de esteviol produzido por fermentação tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar.

É possível distinguir entre ligações glicosídicas α e β com base na estereoquímica relativa (R ou S) da posição anomérica e o estereocentro mais afastado do C1 em um sacarídeo. Normalmente, uma ligação a-glicosídica é formada quando ambos os carbonos têm a mesma estereoquímica, ao passo que uma ligação β-glicosídica ocorre quando os dois carbonos têm estereoquímica diferente.

Tal glicosídeo de esteviol produzido por fermentação pode ter uma estrutura de qualquer dos glicosídeos de esteviol descritos aqui.

A invenção se refere ainda a um método para a produção de um glicosídeo de esteviol. Em tal método, uma célula hospedeira recombinante adequada, tal como uma célula de levedura, é fermentada em um meio de fermentação adequado de modo que o glicosídeo de esteviol é produzido. Opcionalmente, o glicosídeo de esteviol pode ser recuperado.

Por exemplo, um método para a produção de um glicosídeo de esteviol, conforme descrito no presente documento, pode compreender: proporcionar uma célula de levedura recombinante compreendendo sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos codificadas por: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; fermentar a célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado; e, opcionalmente, recuperar o glicosídeo de esteviol conforme descrito no presente documento.

O termo “recombinante” quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desta forma. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de forma anormal, subexpressos ou não expressos. O termo “recombinante” é sinônimo de “geneticamente modificado”.

Uma célula de levedura recombinante usada em um processo da invenção pode ser qualquer célula de levedura adequada. Células de levedura recombinantes preferidas podem ser selecionadas dos gêneros: Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. carlsbergensis), Brettanomyces, Kluyveromyces, Candida (por exemplo, C. krusei, C. revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis), Issatchenkia (por exemplo, I. orientalis), Pichia (por exemplo, P. pastoris), Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Pachysolen, Schwanniomyces, Trichosporon, Yarrowia (por exemplo, Y. lipolytica (classificada anteriormente como Candida lipolytica) ou Yamadazyma. De preferência, a célula de levedura recombinante é uma célula de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolitica ou Issatchenkia orientalis.

Uma célula de levedura recombinante para uso em um método de acordo com a invenção pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeos recombinantes que codificam um ou mais de: um polipeptídeo que tem atividade de ent-copalil pirofosfato sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-Caureno sintase; um polipeptídeo que tem atividade de ent-Caureno oxidase; e um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenoico 13-hidroxilase.

Para os propósitos da presente invenção, um polipeptídeo tendo atividade de ent-copalil pirofosfato sintase (EC 5.5.1.13) é capaz de catalisar a reação química:

Essa enzima tem um substrato, geranilgeranil pirofosfato, e um produto, ent-copalil pirofosfato. Essa enzima participa em biossíntese de giberelina. Essa enzima pertence à família de isomerase, especificamente a classe de liases intramoleculares. O nome sistemático desta classe de enzima é ent-copalil-difosfato liase (desciclização). Outros nomes de uso comum incluem ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase A e ent-caureno sintetase A.

As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-copalil pirofosfato sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência como definido na SEQ ID. NO: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184.

Para os propósitos da presente invenção, um polipeptídeo tendo atividade ent-caureno sintase (EC 4.2.3.19) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar a reação química: ent-copalil difosfato = ent-caureno + difosfato Por conseguinte, essa enzima tem um substrato, ent- copalil difosfato, e dois produtos, ent-caureno e difosfato.

Esta enzima pertence à família das liases, especificamente àquelas liases de carbono-oxigênio que agem sobre os fosfatos. O nome sistemático desta classe de enzima é ent-copalil-difosfato difosfato-liase (ciclizante, formadora de ent-caureno). Outros nomes de uso comum incluem ent-caureno sintase B, ent-caureno sintetase B, ent-copalil- difosfato difosfato-liase e (ciclizante). Esta enzima participa na biossíntese de diterpenoides.

As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-Caureno sintase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme definida nas SEQ ID. NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184.

Ent-copalil difosfato sintases também podem ter uma atividade ent-caureno sintase distinta associada à mesma molécula proteica. A reação catalisada por ent-caureno sintase é a próxima etapa na via biossintética para giberelinas. Os dois tipos de atividade enzimática são distintos e a mutagênese sítio dirigida para suprimir a ent- caureno sintase da proteína leva ao acúmulo de ent-copalil pirofosfato.

Por conseguinte, uma única sequência nucleotídica usada em uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode codificar um polipeptídeo tendo atividade ent-copalil pirofosfato sintase e atividade ent-caureno sintase. Alternativamente, as duas atividades podem ser codificadas por duas sequências nucleotídicas separadas distintas.

Para os propósitos da presente invenção, um polipeptídeo tendo atividade ent-caureno oxidase (EC 1.14.13,78) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar três oxidações sucessivas do grupo 4-metila do ent-caureno para produzir ácido caurenoico. Tal atividade requer tipicamente a presença de um citocromo P450.

As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ent-Caureno oxidase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme definida nas SEQ ID. NO: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186.

Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo que tem atividade de ácido caurenoico 13-hidroxilase (EC 1.14.13) é um que é capaz de catalisar a formação de esteviol (ácido ent-caur-16-en-13-ol-19-oico) usando NADPH e O2. Tal atividade também pode ser referida como atividade de ent-ca 13-hidroxilase.

As sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma ácido caurenoico 13-hidroxilase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme definida nas SEQ ID. NO: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185.

Uma célula de levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocromo p450 redutase. Isso significa que uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode ser capaz de expressar uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo atividade NADPH-citocromo p450 redutase. Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocromo P450 redutase (EC 1.6.2.4; também conhecido como NADPH:ferri-hemoproteína oxidorredutase, NADPH:hemoproteína oxidorredutase, NADPH:oxirredutase P450, P450 redutase, POR, CPR, CYPOR) normalmente é um polipeptídeo que é uma enzima ligada à membrana permitindo a transferência de elétrons para o citocromo P450 no microssomo da célula eucariótica partir de uma enzima NADPH:citocromo P450 redutase contendo FADe FMN(POR; EC 1.6.2.4).

Sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma NADPH-citocromo p450 redutase podem, por exemplo, compreender uma sequência conforme definida nas SEQ ID. NO: 53, 55, 57 ou 77.

Uma célula de levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender também uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam um ou mais de: (i) um polipeptídeo tendo atividade de UGT74G1; (ii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT2; (iii) um polipeptídeo tendo atividade de UGT85C2; e (vi) um polipeptídeo tendo atividade de UGT76G1.

Uma levedura recombinante, adequada para uso na invenção, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose ao esteviol. Isso significa que uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender uma UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviol é convertido a esteviolmonosídeo.

Tal levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada pela UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT85C2, em que a sequência nucleotídica, mediante transformação da levedura, confere à tal levedura a capacidade de converter o esteviol a esteviolmonosídeo.

A atividade de UGT85C2 é a transferência de uma unidade de glicose ao 13-OH de esteviol. Dessa forma, uma UGT85C2 adequada pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 13-OH transferase e uma uridina 5'- difosfo glicosil: esteviol-19-0-glicosídeo 13-OH transferase. Polipeptídeos de UGT85C2 funcionais também podem catalisar as reações da glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol diferentes de esteviol e o esteviol-19-O-glicosídeo. Tais sequências podem ser chamadas de sequências de UGT1 no presente documento.

Uma levedura recombinante, adequada para uso na invenção, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo que tem atividade de UGT2.

Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 é um que funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-13-O- glicosídeo transferase (também referido como uma esteviol-13- monoglicosídeo 1,2-glicosilase), transferindo uma fração de glicose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol-13-O-glicosídeo. Tipicamente, um polipeptídeo de UGT2 adequado também funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: rubusosídeo transferase transferindo uma fração de glicose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, rubusosídeo.

Um polipeptídeo tendo atividade de UGT2 também pode catalisar reações que usam substratos de glicosídeos de esteviol diferentes de esteviol-13-O-glicosídeo e rubusosídeo, por exemplo, polipeptídeos UGT2 funcionais podem usar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma fração de glicose para o C-2' do resíduo 19-O-glicose, para produzir rebaudiosídeo E. Um polipeptídeo de UGT2 funcional também pode usar rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma fração de glicose para o C-2' do resíduo 19-O-glicose para produzir rebaudiosídeo D. No entanto, um polipeptídeo de UGT2 funcional normalmente não transfere uma fração de glicose para compostos de esteviol com uma glicose 1,3-ligada na posição C-13, ou seja, a transferência de uma fração de glicose para esteviol 1,3-biosídeo e 1,3- esteviosídeo normalmente não ocorre.

Um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 também pode transferir frações de açúcar de doadores além de uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 pode atuar como uma uridina 5'-difosfo D- xilosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção xilose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol-13-O-glicosídeo. Como um outro exemplo, um polipeptídeo que tem atividade de UGT2 pode atuar como uma uridina 5'-difosfo L-ramnosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma fração de ramnose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula receptora, esteviol.

Uma levedura recombinante, adequada para uso no método da invenção, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-19-glicose ao esteviolbiosídeo. Isso significa que uma levedura recombinante da invenção pode compreender uma UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviolbiosídeo é convertido a esteviosídeo. Por conseguinte, tal levedura recombinante pode ser capaz de converter esteviolbiosídeo a esteviosídeo. A expressão de tal sequência nucleotídica pode conferir à levedura recombinante a capacidade de produzir, pelo menos, esteviosídeo.

Uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode, assim, compreender também uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada pela UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT74G1, em que a sequência nucleotídica, mediante transformação da levedura, confere à célula a capacidade de converter esteviolbiosídeo a esteviosídeo.

Os polipeptídeos de UGT74G1 adequados podem ser capazes de transferir uma unidade de glicose ao 13-OH ou 19-COOH, respectivamente, do esteviol. Um polipeptídeo de UGT74G1 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5'- difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Os polipeptídeos de UGT74G1 funcionais também podem catalisar reações da glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol diferentes de esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem frações de açúcar a partir de doadores diferentes da uridina difosfato glicose. Tais sequências podem ser chamadas no presente documento de sequências de UGT3.

Uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode compreender uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a glicosilação do C-3' da glicose na posição C-13 do esteviosídeo. Isso significa que uma levedura recombinante, adequada para uso em um método de invenção, pode incluir uma UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviosídeo é convertido a rebaudiosídeo A. Por conseguinte, tal levedura recombinante pode ser capaz de converter esteviosídeo a rebaudiosídeo A. A expressão de tal sequência nucleotídica pode conferir à levedura a capacidade de produzir, pelo menos, rebaudiosídeo A.

Uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, pode, assim, compreender também uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada pela UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT76G1, em que a sequência nucleotídica, mediante transformação de uma levedura, confere à tal levedura a capacidade de converter esteviosídeo a rebaudiosídeo A.

Uma UGT76G1 adequada adiciona uma fração de glicose ao C-3' da C-13-O-glicose da molécula receptora, um esteviol 1,2 glicosídeo. Dessa forma, UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 13-0-1,2- glicosídeo C-3' glicosil transferase e uma uridina 5'- difosfo glicosil: esteviol-19-0-glicose, 13-0-1,2 biosídeo C-3' glicosil transferase. Os polipeptídeos de UGT76G1 funcionais também podem catalisar as reações de glicosil transferase que usam substratos de glicosídeos de esteviol que contêm açúcares diferentes de glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Tais sequências podem ser chamadas no presente documento de sequências de UGT4. A UGT4 pode, alternativamente ou adicionalmente, ser capaz de converter RebD a RebM.

Uma levedura recombinante, adequada para uso em um método da invenção, geralmente compreende sequências nucleotídicas que codificam pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT1, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT2, pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT3 e pelo menos um polipeptídeo tendo atividade de UGT4. Uma ou mais destas sequências de ácidos nucleicos podem ser recombinantes. Um determinado ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo que tem uma ou mais das atividades acima. Por exemplo, um ácido nucleico

codifica um polipeptídeo que tem duas, três ou quatro das atividades apresentadas acima. De preferência, uma levedura recombinante para uso no método da invenção compreende atividade de UGT1, UGT2 e UGT3 e UGT4. As sequências de UGT1, UGT2, UGT3 e UGT4 adequadas estão descritas na Tabela 15 no presente documento. Uma combinação preferida de sequências que codificam atividades de UGT1, 2, 3 e 4 são as sequências de SEQ ID NO: 71, 87, 73 e 75.

No método da invenção, um hospedeiro recombinante, tal como uma levedura, pode ser capaz de crescer em qualquer fonte de carbono adequada conhecida no estado da técnica e convertê-la em um ou mais glicosídeos de esteviol. O hospedeiro recombinante pode ser capaz de converter diretamente biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, ou amido, derivado de amido, sacarose, lactose e glicerol. Por conseguinte, um hospedeiro preferido expressa enzimas como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo e exoxilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. De preferência, o hospedeiro é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e glicerol. A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula hospedeira eucariota como descrito no documento WO03/062430, WO06/009434, EP1499708B1, WO2006096130 ou WO04/099381.

O meio de fermentação usado no processo de produção de um glicosídeo de esteviol da invenção pode ser qualquer meio de fermentação adequado, que permita o crescimento de uma determinada célula hospedeira eucariota. Os elementos essenciais do meio de fermentação são conhecidos de técnicos no assunto e podem ser adaptados à célula hospedeira selecionada.

De preferência, o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose, ácidos graxos, triglicerídeos e glicerol. De preferência, o meio de fermentação também compreende uma fonte de nitrogênio como ureia, ou um sal de amônio tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou fosfato de amônio.

O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado em modo de batelada, batelada alimentada ou contínuo. Um processo de hidrólise e fermentação separadas (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) também pode ser empregado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para produtividade ideal. Um processo de SSF pode ser particularmente atraente se amido, celulose, hemicelulose ou pectina for usado como uma fonte de carbono no processo de fermentação, em que pode ser necessário adicionar enzimas hidrolíticas, como celulases, hemicelulases ou pectinases para hidrolisar o substrato.

O processo de fermentação para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo de fermentação aeróbica ou anaeróbica.

Um processo de fermentação anaeróbica pode ser definido no presente documento como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência, menos que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétron quanto como aceitantes de elétron. O processo de fermentação de acordo com a presente invenção também pode ser primeiramente executado sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições anaeróbicas.

O processo de fermentação também pode ser executado sob condições de oxigênio limitado ou microaeróbicas. Alternativamente, o processo de fermentação pode primeiramente ser executado sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e pela composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades reais de transferência de massa/mistura do equipamento de fermentação usado.

A produção de um glicosídeo de esteviol no processo de acordo com a presente invenção pode ocorrer durante a fase de crescimento da célula hospedeira, durante o estado estacionário (estado de equilíbrio) ou em ambas as fases. Pode ser possível executar o processo de fermentação em diferentes temperaturas.

O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser executado a uma temperatura que é ideal para o hospedeiro recombinante. A temperatura de crescimento ideal pode diferir para cada hospedeiro recombinante transformado e é conhecida por técnicos no assunto. A temperatura ideal pode ser maior que a ideal para organismos do tipo selvagem desenvolverem o organismo eficientemente em condições não estéreis, em sensibilidade de infecção mínima e custo de resfriamento mais baixo. Alternativamente, o processo pode ser executado a uma temperatura que não é ideal para desenvolvimento do hospedeiro recombinante.

O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a presente invenção pode ser um processo realizado em qualquer valor de pH adequado. Se o hospedeiro recombinante for uma levedura, o pH no meio de fermentação de preferência tem um valor abaixo de 6, de preferência abaixo de 5,5, de preferência abaixo de 5, de preferência abaixo de 4,5, de preferência abaixo de 4, de preferência abaixo de pH 3,5 ou abaixo de pH 3,0, ou abaixo de pH 2,5, de preferência acima de pH 2. Uma vantagem da execução da fermentação nesses valores de pH baixos é que o desenvolvimento de bactérias contaminantes no meio de fermentação pode ser impedido.

Tal processo pode ser executado em uma escala industrial. O produto de tal processo é um ou mais glicosídeos de esteviol de acordo com a invenção.

A recuperação do(s) glicosídeo(s) de esteviol da invenção do meio de fermentação pode ser realizada por métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, por destilação, extração a vácuo, extração por solvente ou evaporação.

No processo de produção de um glicosídeo de esteviol de acordo com a invenção, poderá ser possível atingir uma concentração acima de 0,5 mg/l, de preferência acima de cerca de 1 mg/l.

No caso em que um ou mais dos glicosídeos de esteviol da invenção são expressos em um hospedeiro recombinante, pode ser necessário tratar tais células de modo a liberá- los.

A invenção também proporciona uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol da invenção em combinação com um ou mais glicosídeos de esteviol diferentes. Um ou mais do um ou mais glicosídeos de esteviol diferentes pode ser um glicosídeo de esteviol da invenção. Um ou mais do um ou mais dos glicosídeos de esteviol diferentes pode ser um diterpeno glicosilado (ou seja, um glicosídeo de diterpeno), tal como esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, rubusosídeo, dulcosídeo A, esteviol-13-monosídeo, esteviol- 19-monosídeo ou éster 2-O-β-D-glucopiranosil-β-D- glucopiranosílico do ácido 13-[(β-D-glucopiranosil)oxi]caur- 16-en-18-oico.

Uma composição da invenção pode compreender uma quantidade relativamente pequena de um glicosídeo de esteviol da invenção em combinação com uma quantidade maior de um glicosídeo de esteviol diferente.

Por exemplo, uma composição da invenção pode compreender pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % de rebaudiosídeo A em combinação com um glicosídeo de esteviol da invenção. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % de rebaudiosídeo D em combinação com um glicosídeo de esteviol da invenção. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % de rebaudiosídeo M em combinação com um glicosídeo de esteviol da invenção. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % de rebaudiosídeo A em combinação com um glicosídeo de esteviol da invenção e rebaudiosídeo D. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 % de rebaudiosídeo A em combinação com um glicosídeo de esteviol da invenção e rebaudiosídeo M. As percentagens referidas estão em uma base de peso seco.

Um glicosídeo de esteviol, de acordo com a presente invenção, pode ser usado em qualquer aplicação conhecida para tais compostos. Em particular, eles podem, por exemplo, ser usados como adoçante ou aromatizante, por exemplo, em um alimento, ração ou uma bebida. Por exemplo, glicosídeos de esteviol podem ser formulados em refrigerantes como bebidas gasosas, como um adoçante de mesa, gomas de mascar, produtos lácteos como iogurte (por exemplo, iogurte natural), bolo, cereais ou alimentos à base de cereais, produtos nutracêuticos, produtos farmacêuticos, géis comestíveis, produto de confeitaria, cosméticos, pastas de dente ou outra composição para a cavidade oral, etc. Além disso, um glicosídeo de esteviol pode ser usado como um adoçante não apenas para bebidas, alimentos e outros produtos destinados ao consumo humano, mas também para alimentação animal e forragens com características melhoradas.

Portanto, a invenção proporciona, entre outros, uma composição adoçante, uma composição aromatizante, um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida que compreende um glicosídeo de esteviol preparado de acordo com um processo da invenção. Uma composição da invenção pode compreender um ou mais componentes que não ocorrem naturalmente.

Além disso, a invenção proporciona: - uso de um glicosídeo de esteviol ou de uma composição da invenção em uma composição adoçante ou composição aromatizante; e - uso de um glicosídeo de esteviol ou de uma composição da invenção em um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida.

Durante a fabricação de produtos alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, borrifo, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

O glicosídeo de esteviol obtido na presente invenção pode ser usado nas formas seca ou líquida. O mesmo pode ser adicionado antes ou depois do termotratamento de produtos alimentícios. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. O mesmo pode ser adicionado sozinho ou em combinação com outros compostos.

Os compostos produzidos de acordo com o método da invenção podem ser mesclados com um ou mais adoçantes não calóricos ou calóricos adicionais. Tal mistura pode ser usada para aprimorar o perfil de sabor ou temporal ou a estabilidade. O glicosídeo de esteviol da invenção pode ser usado para melhorar o sabor ou o perfil temporal ou a estabilidade de um segundo glicosídeo de esteviol, tal como rebaudiosídeo A, D ou M.

Uma grande variedade de adoçantes calóricos e não calóricos pode ser adequada para mistura com um glicosídeo de esteviol da invenção, incluindo um ou mais outros glicosídeos de esteviol de acordo com a invenção, ou um ou mais outros glicosídeos de esteviol conhecidos, tal como esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, rubusosídeo, dulcosídeo A, esteviol-13- monosídeo, esteviol-19-monosídeo ou éster 2-O-β-D- glucopiranosil-β-D-glucopiranosilico do ácido 13-[(β-D- glucopiranosil)oxi]caur-16-en-18-oico. Alternativamente, ou adicionalmente, adoçantes não calóricos como mogrosida, monatina, aspartame, sais de acessulfame, ciclamato, sucralose, sais de sacarina ou eritritol. Adoçantes calóricos adequados para mistura com glicosídeos de esteviol incluem alcoóis de açúcar e carboidratos como a sacarose, glicose, frutose e HFCS. Aminoácidos com sabor doce como glicina, alanina ou serina também podem ser usados.

O glicosídeo de esteviol pode ser usado em combinação com um supressor de adoçante, tal como um supressor de adoçante natural. O mesmo pode ser combinado com um melhorador de sabor umami, como um aminoácido ou um sal do mesmo.

Um glicosídeo de esteviol pode ser combinado com um poliol ou álcool de açúcar, um carboidrato, uma substância fisiologicamente ativa ou ingrediente funcional (por exemplo, um carotenoide, fibra dietética, ácido graxo, saponina, antioxidante, nutracêutico, flavonoide, isotiocianato, fenol, esterol ou estanol vegetal (fitoesteróis e fitoestanóis), um poliol, um prebiótico, um probiótico, um fitoestrogênio, proteína de soja, sulfetos/tióis, aminoácidos, uma proteína, uma vitamina, um mineral e/ou uma substância classificada com base em benefícios de saúde, como cardiovascular, redutor de colesterol ou anti-inflamatória.

Uma composição com um glicosídeo de esteviol pode incluir um agente aromatizante, um componente de aroma, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um sal de ácido orgânico, um ácido inorgânico, um composto amargo, uma proteína ou um hidrolisado de proteína, um surfactante, um flavonoide, um composto adstringente, uma vitamina, uma fibra dietética, um antioxidante, um ácido graxo e/ou um sal.

Um glicosídeo de esteviol da invenção pode ser aplicado como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas com zero caloria, calorias reduzidas ou para diabéticos e produtos alimentícios com características de sabor aprimoradas. Também pode ser usado em bebidas, produtos alimentícios, produtos farmacêuticos e outros produtos nos quais o açúcar não pode ser usado.

Além disso, um glicosídeo de esteviol da invenção pode ser usado como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios e outros produtos destinados ao consumo humano, mas também para alimentação animal e forragens com características melhoradas.

Os exemplos de produtos onde um glicosídeo de esteviol da composição da invenção pode ser usado como um composto adoçante podem ser bebidas alcoólicas tais como vodka, vinho, cerveja, licor, saquê, etc.; sucos naturais, bebidas refrescantes, refrigerantes gasosos, bebidas dietéticas, bebidas zero caloria, bebidas e alimentos de caloria reduzida, iogurtes de beber, sucos instantâneos, café instantâneo, tipos em pó de bebidas instantâneas, produtos enlatados, xaropes, pasta de soja fermentada, molho de soja, vinagre, temperos, maionese, ketchups, curry, sopa, caldo instantâneo, molho de soja em pó, vinagre em pó, tipos de biscoitos, biscoito de arroz, cream crackers, pão, chocolates, caramelo, doces, goma de mascar, gelatina, pudim, frutas e vegetais em conserva, creme fresco, geleia, marmelada, pasta de flor, leite em pó, sorvete, sorvete de frutas, vegetais e frutas embalados em garrafas, feijões cozidos e enlatados, carne e alimentos cozidos em molho adocicado, produtos alimentícios vegetais agrícolas, frutos do mar, presunto, salsicha, embutido de peixe, salsicha de peixe, pasta de peixe, produtos de peixe fritos em imersão, produtos de fruto do mar seco, produtos alimentícios congelados, alga marinha em conserva, carne em conserva, tabaco, produtos medicinais e muitos outros. A princípio, pode ter aplicações ilimitadas.

A composição adoçada compreende uma bebida, cujos exemplos não limitantes incluem bebidas gasosas e não gasosas como colas, refrigerantes de gengibre, cervejas-de- raiz, sidras, refrigerantes com sabor de fruta (por exemplo, refrigerantes com sabor cítrico como lima-limão ou laranja), refrigerantes em pó e similares; sucos de fruta originados de frutas ou vegetais, sucos de fruta incluindo sucos espremidos ou similares, sucos de fruta que contêm pedaços de fruta, bebidas de fruta, bebidas de suco de fruta, bebidas que contêm sucos de fruta, bebidas com aromatizantes de fruta, sucos vegetais, sucos que contêm vegetais e sucos misturados que contêm frutas e vegetais; bebidas esportivas, bebidas energéticas, água aromatizada e bebidas similares (por exemplo, água com aromatizantes naturais ou sintéticos); bebidas do tipo chá ou de uso diário como café, chocolate, chá preto, chá verde, chá oolong e similares; bebidas que contêm componentes de leite como bebidas à base de leite, café que contém componentes de leite, café com leite, chá com leite, bebidas de leite de frutas, iogurte bebível, bebidas com bactérias formadoras de ácido láctico ou similares; e laticínios.

Em geral, a quantidade de adoçante presente em uma composição adoçada varia amplamente dependendo do tipo particular de composição adoçada e de sua doçura desejada. Técnicos no assunto podem discernir prontamente a quantidade apropriada de adoçante a colocar na composição adoçada.

O glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser usado nas formas seca ou líquida. O mesmo pode ser adicionado antes ou depois do termotratamento de produtos alimentícios. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. O mesmo pode ser adicionado sozinho ou em combinação com outros compostos.

Dessa forma, as composições da presente invenção podem ser feitas por qualquer método conhecido por técnicos no assunto que fornecem misturas uniformes homogêneas ou misturas homogêneas dos ingredientes. Esses métodos incluem mistura seca, secagem por pulverização, aglomeração, granulação a úmido, compactação, cocristalização e similares.

Na forma sólida, um glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser fornecido aos consumidores em qualquer forma adequada para administração em produtos comestíveis a serem adoçados, incluindo sachês, pacotes, em sacos a granel ou caixas, cubos, pastilhas, névoas ou tiras dissolvíveis. A composição pode ser administrada como uma dose unitária ou em forma a granel.

Para sistemas e composições adoçantes líquidos, podem ser usadas formas fluidas, semifluidas, pastas e formas cremosas convenientes, embalagem apropriada que usa material de embalagem apropriado em qualquer formato ou forma deve ser inventada para ser conveniente para carregar ou descartar ou armazenar ou transportar qualquer combinação contendo qualquer um dos produtos adoçantes acima ou combinação de produtos produzidos acima.

A composição pode incluir agentes de aumento de volume, ingredientes funcionais, corantes, aromatizantes. Técnicas genéticas padrão, como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, modificação genética de células hospedeiras, ou técnicas de hibridação são métodos conhecidos no estado da técnica, conforme descrito em Sambrook e Russel (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing e Wiley Interscience, Nova York (1987). Métodos para transformação, modificação genética, etc. de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, dos documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186. Modalidades da invenção: 1. Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I) (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar, todas as quais estão ligadas, direta ou indiretamente, à aglicona de esteviol por ligações β. 2.Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 4 frações de açúcar estãopresentes nas posições R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2. 3.Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2, em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar e em que pelo menos um dos açúcares presentes na posição R1 está ligado à aglicona de esteviol ou a uma molécula de açúcar por uma ligação α. 4.Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos quatro frações de açúcar estão presentes na posição R2, em que pelo menos quatro frações de açúcar presentes na posição R2 são frações de glicose. 5.Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (II)

6. Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (III)

7. Um glicosídeo de esteviol tendo a fórmula (IV)

8. Um glicosídeo de esteviol, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que é produzido por fermentação. 9. Um glicosídeo de esteviol produzido por fermentação tendo a fórmula (I)

em que pelo menos 3 frações de açúcar estão presentes na posição R1 e pelo menos três frações de açúcar estão presentes na posição R2 e em que o glicosídeo de esteviol compreende pelo menos sete frações de açúcar. 10. Um glicosídeo de esteviol, de acordo com a modalidade 9, tendo uma estrutura de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7. 11. Um método para a produção de um glicosídeo de esteviol, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, cujo método compreende: proporcionar uma célula de levedura recombinante compreendendo sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos codificadas por: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; fermentar a célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado; e, opcionalmente, recuperar um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. 12. Uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11 e um ou mais glicosídeos de esteviol diferentes. 13. Um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida que compreende um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10 ou uma composição de acordo com a modalidade 12. 14. Uso de um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, ou de uma composição de acordo com a modalidade 12 em uma composição adoçante ou composição aromatizante. 15. Uso de um glicosídeo de esteviol de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, ou de uma composição de acordo com a modalidade 12 em um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida.

Uma referência no presente documento a um documento de patente ou outra matéria que é dada como estado da técnica não deve ser considerada como uma admissão de que aquele documento ou matéria era conhecida ou que as informações contidas eram parte do conhecimento comum geral na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

A divulgação de cada referência apresentada no presente documento é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes Exemplos:

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de STV016

A cepa STV016 de S. cerevisiae foi construída para a produção fermentativa de glicosídeos de esteviol.

1.1 Superexpressão do ERG20, BTS1 e tHMG em S. cerevisiae

Para a superexpressão de ERG20, BTS1 tHMG1, os cassetes de expressão foram projetados para serem integrados em um locus usando a tecnologia descrita no documento WO2013/076280. Para amplificar os flancos de integração 5’ e 3’ para o locus de integração, foram usados primers e DNA genômico adequados de uma cepa de levedura CEN.PK (van Dijken et al. Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 706-714). Os diferentes genes foram ordenados como cassetes (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0. Os genes nesses cassetes foram flanqueados por promotores e terminadores constitutivos. Consultar a Tabela 1. DNA plasmidial de DNA2.0 contendo os cassetes ERG20, tHMG1 e BTS1 foram dissolvidos até uma concentração de 100 ng/μl. Em uma mistura de PCR de 50 μl, foram usados 20 ng de modelo junto com 20 pmol dos primers. O material foi dissolvido para uma concentração de 0,5 μg/μl. Tabela 1: Composição dos construtos de superexpressão

Para amplificação do marcador de seleção, o construto pUG7-EcoRV (Figura 1) e primers adequados foram usados. O fragmento KanMX foi purificado a partir do gel com o uso do kit Zymoclean Gel DNA Recovery (ZymoResearch). A cepa de levedura Cen.PK113-3C foi transformada com os fragmentos listados na Tabela 2.

Tabela 2: Fragmentos de DNA usados para transformação de ERG20, tHMGl e BTS1

Após a transformação e a recuperação por 2,5 horas em YEPhD (glicose de fitona peptona de extrato de levedura; BBL Fitona Peptona da BD) a 30 °C, as células foram plaqueadas em ágar YEPhD com 200 μg/ml de G418 (Sigma). As placas foram incubadas a 30 °C por 4 dias. A integração correta foi estabelecida com PCR de diagnóstico e sequenciamento. A superexpressão foi confirmada com LC/MS nas proteínas. O diagrama esquemático da montagem de ERG20, tHMG1 e BTS1 é ilustrado na Figura 2. Esta cepa foi denominada de STV002.

A expressão da CRE-recombinase nesta cepa levou à recombinação ends-out do marcador KanMX. A recombinação ends-out correta e a presença de ERG20, tHMG e BTS1 foram estabelecias com PCR de diagnóstico.

1.2 Knockdown do ERG9

Para reduzir a expressão de Erg9, um construto de Erg9 knockdown foi projetado e usado, o qual contém uma extremidade 3’ modificada, que continua para o promotor TRP1 que aciona a expressão de TRP1.

O construto que contém o fragmento Erg9-KD foi transformado em células TOP10 de E. coli. Os transformantes foram desenvolvidos em 2PY (2 vezes extrato de levedura de fitona peptona), meio sAMP. O DNA de plasmídeo foi isolado com o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) e digerido com SalI-HF (New England Biolabs). Para concentrar, o DNA foi precipitado com etanol. O fragmento foi transformado em S. cerevisiae, e as colônias foram plaqueadas em placas de ágar de meio mineral (Verduyn et al, 1992. Yeast 8:501-517) sem triptofano. A integração correta do construto Erg9-KD foi confirmada com PCR de diagnóstico e sequenciamento. O diagrama esquemático da transformação realizada do construto Erg9-KD é ilustrado na Figura 3. A cepa foi denominada de STV003.

1.3 Superexpressão de UGT2_1a

Para a superexpressão de UGT2_1a, foi usada a tecnologia conforme descrita nos pedidos de patente pendentes de n° WO2013/076280 e WO2013/144257. A UGT2a foi ordenada como um cassete (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0. Para detalhes, consultar a Tabela 3. Para obter fragmentos contendo o marcador e Cre-recombinase, foi usada a tecnologia conforme descrita nos pedidos de patente pendentes de n° WO2013/135728. O marcador NAT, que confere resistência à nourseotricina, foi usado para seleção. Tabela 3: Composição do construto de superexpressão

Primers adequados foram usados para amplificação. Para amplificar os flancos de integração 5’ e 3’ para o locus de integração, foram usados primers e DNA genômico adequados de uma cepa de levedura CEN.PK.

A cepa de levedura STV003 de S. cerevisiae foi transformada com os fragmentos listados na Tabela 4, e a mistura de transformação foi plaqueada em placas de ágar YEPhD contendo 50 μg/ml de nourseotricina (Lexy NTC da Jena Bioscience). Tabela 4: Fragmentos de DNA usados para transformação da UGT2A

A expressão da CRE recombinase é ativada pela presença de galactose. Para induzir a expressão da CRE recombinase, os transformantes foram novamente pincelados em meios YEPh Galactose. Isso resultou em recombinação externa do(s) marcador(es) situado(s) entre os sítios lox. A integração correta do UGT2a e a recombinação externa do marcador NAT foram confirmadas com PCR de diagnóstico. A cepa resultante foi denominada de STV004. O diagrama esquemático da transformação realizada do construto UGT2a é ilustrado na Figura 4.

1.4 Superexpressão da via de produção de RebA: CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGT1, UGT3 e UGT4

Todos os genes da via conducentes à produção de RebA foram concebidos para serem integrados em um locus no fundo genético da cepa STV004. Para amplificar os flancos de integração 5' e 3' para o locus de integração (sítio 3), foram usados primers e DNA genômico adequados de uma cepa de levedura CEN.PK. Os diferentes genes foram ordenados como cassetes (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0 (consultar a Tabela 5 para visão geral). O DNA de DNA2.0 foi dissolvido para 100 ng/μl. Essa solução estoque foi adicionalmente diluída para 5 ng/μl, dos quais 1 μl foi usado em uma mistura de PCR de 50μl. A reação continha 25 pmol de cada primer. Após a amplificação, o DNA foi purificado com o kit

NucleoSpin 96 PCR Clean-up (Macherey-Nagel) ou alternativamente concentrado usando precipitação em etanol. Tabela 5. Composição dos construtos de superexpressão para CPS, KS, KO, KAH, RCP, UGT1, UGT3 e UGT4

Todos os fragmentos para a via do RebA, o marcador e os flancos (consultar a visão geral na Tabela 6) foram transformados em uma cepa STV004 de levedura S. cerevisiae. Após recuperação durante a noite em YEPhD a 20 °C, as misturas de transformação foram plaqueadas em ágar YEPhD contendo 200 μg/ml de G418. Estas foram incubadas durante 3 dias a 30 °C.

Tabela 6. Fragmentos de DNA usados para transformação de CPS, KS, KO, KanMX, KAH, CPR, UGT1, UGT3 e UGT4

A integração correta foi confirmada com PCR de diagnóstico e análise de sequência (3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). As reações de sequência foram feitas com o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life Technologies). Cada reação (10 μl) conteve 50 ng de modelo e 3,2 pmol de primer. Os produtos foram purificados por precipitação em etanol/EDTA, dissolvidos em 10 μl de HiDi formamida e aplicados sobre o aparelho. A cepa foi denominada de STV016. O diagrama esquemático sobre como a via de GGPP para RebA é integrada ao genoma é ilustrado na Figura 5. A Tabela 7 define as cepas usadas neste Exemplo 1. Tabela 7. Tabela de cepas

1.5 Fermentação de STV016

A cepa STV016 de S. cerevisiae, construída conforme descrito acima, foi cultivada em frascos com agitação (2 l com 200 ml de meio) durante 32 horas a 30 °C e 220 rpm. O meio foi baseado em Verduyn et al. (Verduyn C, Postma e, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, 1992 Jul;8(7):501-517), com modificações nas fontes de carbono e nitrogênio, conforme descrito na Tabela 8. Tabela 8. Composição de meio para pré-cultura

aSolução de oligoelementos

bSolução vitamínica

Posteriormente, 200 ml do conteúdo do frasco agitado foram transferidos para um fermentador (volume inicial de 5 l), que continha o meio conforme definido na Tabela 9. Tabela 9. Composição do meio de fermentação

O pH foi controlado em 5,0 por adição de amônia (25 % em peso). A temperatura foi controlada em 27 °C. pO2 foi controlado em 40 % ajustando a velocidade do agitador. A concentração de glicose foi mantida limitada pela alimentação controlada para o fermentador, conforme definida na Tabela 10. Tabela 10. Composição do meio de alimentação da fermentação

Exemplo 2: Observação de 7.1, 7.2 e 7.3 usando LC-MS

Glicosídeos de esteviol contendo 7 moléculas de glicose (posteriormente referidas como 7.1, 7.2 e 7.3) foram observados com o sistema de LC-MS descrito abaixo, no líquido-mãe, após cristalização de rebaudiosídeo A em uma mistura água/etanol (cepa STV016). Antes da purificação a amostra foi concentrada por evaporação. 7.1, 7.2 e 7.3 foram analisadas em um Acquity UPLC (Waters) acoplado a um espectrômetro de massa XEVO-TQ (Waters) equipado com uma fonte de ionização por eletropulverização, operado no modo de íon negativo em modo MRM nas moléculas desprotonadas para todos os glicosídeos de esteviol estudados, entre estes m/z 1451.5, representando a molécula desprotonada de um glicosídeo de esteviol contendo 7 moléculas de glicose.

A separação cromatográfica foi realizada com um tamanho de partícula de 2,1 x 100 mm 1,8 μm, coluna Acquity UPLC® HSS T3, com um gradiente de eluição com (A) 50 mM de acetato de amônio em água de grau LC-MS, e (B) acetonitrila de grau LC-MS como fase móvel. O gradiente de 4 min começou a partir de 30 % de B, aumentando linearmente para 35 % de B em 0,5 minutos e mantido a 35 % de B durante 0,8 minutos, depois aumentando linearmente para 95 % B em 0,7 minutos e mantido nisso durante 0,5 minutos, em seguida reequilibrando com 30 % de B durante 1,5 min. A vazão foi mantida em 0,6 ml/min, usando um volume de injeção de 5 μl e a temperatura da coluna foi definida como 50 °C. Os compostos individuais, 7.1, 7.2 e 7.3, observados para m/z 1451.5 eluíram em tempos de retenção de 0,59, 0,71 e 0,74 minutos.

Para a análise da composição elementar de 7.1, 7.2 e 7.3 foi realizada uma análise por HRMS (Espectrometria de massa de alta resolução) com um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap de Transformada de Fourier (Thermo Electron) equipado com uma fonte de ionização por eletropulverização operado no modo de íon negativo, varredura a partir de m/z 300-2000. A separação cromatográfica foi obtida com um sistema Acella LC (Thermo Fisher) com a mesma coluna e sistema de gradiente conforme descrito acima.

Usando este sistema cromatográfico, os compostos individuais eluíram em tempos de retenção de 0,84, 1,20 e 1,30 minutos, respectivamente, conforme mostrado na Figura 6a, e 7.1, 7.2 e 7.3 foram caracterizados respectivamente em m/z 1451.5786, 1451.5793 e 1451.5793, o que está de acordo com o valor de m/z teórico de 1451.5820 (respectivamente - 1,8 e -2,3 ppm). A fórmula química correspondente desses componentes é C62H100S38 para a espécie não carregada.

Exemplo 3: Purificação de 7.1, 7.2 e 7.3 usando LC-UV preparativa

A purificação de 7.1, 7.2 e 7.3 foi realizada a partir do extrato etanólico do caldo de Saccharomyces (cepa STV016) contendo quantidade mínima dos compostos de interesse. A separação preparativa foi realizada usando cromatografia de fase reversa (Waters Atlantis T3, 30*150 mm, 5 um), gradiente de eluição com água de grau LC-MS e acetonitrila como eluente. Foram usadas uma vazão de 40 ml/min e um volume de injeção de 300 μl.

Foram realizadas, aproximadamente, 100 injeções e os compostos de interesse foram ativados por detecção por UV a 210 nm. Todas as frações de 7.1, 7.2 e 7.3 foram agrupadas e secas por congelamento antes das análises por LC-MS e RMN.

LC-MS de 7.1, 7.2 e 7.3 para confirmação de massa e determinação de pureza após purificação preparativa, usando LC-MS.

A pureza de 7.1, 7.2 e 7.3 foi analisada em um Acquity UPLC (Waters) acoplado a um espectrômetro de massa XEVO-TQ (Waters) equipado com uma fonte de ionização por eletropulverização, operado no modo de íon negativo em modo MRM nas moléculas desprotonadas para todos os glicosídeos de esteviol estudados, entre estes m/z 1451.5, representando a molécula desprotonada de um glicosídeo de esteviol contendo 7 moléculas de glicose.

A eluição de 7.1 em um tempo de retenção de 0,59 minutos pode ser estimada como sendo acima de 80 % de pureza, ao passo que 7.2 e 7.3, eluindo em tempos de retenção de 0,71 e 0,74 minutos, puderam ser estimados como sendo acima de 90 % de pureza e 7.3 ainda contém cerca de 5 % de 7.2, mostrado na Figura 6b.

Usando HRMS (Espectrometria de massa de alta resolução), a análise foi realizada com um espectrômetro de massa LTQ Orbitrap de Transformada de Fourier (Thermo

Electron) equipado com uma fonte de ionização por eletropulverização operado no modo de íon negativo, a composição elementar do composto individual foi verificada e foi encontrado que a mesma está de acordo com a massa teórica correspondente à fórmula química C62H100S38 para a espécie não carregada.

Exemplo 4: Análise do Rebaudiosídeo 7.1

1,1 mg da fração 7.1 obtida conforme descrito no Exemplo 3 foram dissolvidos em 1,3 ml de CDCl3/piridina-d5 1/3 (p/p) e 2 gotas de DCOOD.

Uma série de espectros de RMN de COSY e TOCSY 2D com pequenos incrementos de tempo de mistura proporcionaram a atribuição de quase todos os prótons de cada sistema de spin (das sete unidades de açúcar) para todos os três rebaudiosídeos, bem como o núcleo de ent-caurano diterpenoide. O experimento de HSQC permitiu a atribuição dos pares C-H correspondentes.

O H anomérico de glcI e glcII foi identificado com base na sua correlação de longo alcance em HMBC aos prótons do núcleo de ent-caurano diterpenoide.

A correlação de longo alcance de H2I-H1V e H3I-H1VI e H2II-H1III e H3II-H1IIII observada em espectros de ROESY correspondentes permitiu a atribuição dos sítios de substituição de glcI e glcII. A atribuição também foi corroborada pela correlação de longo alcance no experimento de HMBC dos prótons anoméricos de glcIII a glcVI com os átomos 13C de glcI e glcII, nomeadamente a H1III-C2II, H1IIII-C3II, H1V- C2I e H1VI-C3I. A posição dos açúcares glcIII, glcIV, glcV e glcVI é idêntica àquela da estrutura do Rebaudiosídeo M (Figura 10).

O deslocamento químico do H1VII anomérico (5,86 ppm versus 4,5-4,6 ppm) e a pequena constante de acoplamento (3,8 Hz versus 7,8 Hz) indicam que o sétimo resíduo de açúcar tem a configuração α.

A posição do 7° açúcar no Rebaudiosídeo 7.1 pode ser identificada a partir do acoplamento de HMBC de longo alcance de H1VII e C3III, acoplamento de prótons de longo alcance de H1VII-H3III no experimento de ROESY e o deslocamento químico do C3III (83,8 ppm em comparação com átomos C3 não substituídos em torno de 78-79 ppm). A estrutura do rebaudiosídeo 7.1 é representada na Figura 7. Todos os deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN para o Rebaudiosídeo 7.1 estão listados na Tabela 11. Para fins de comparação também estão incluídos os dados do Rebaudiosídeo M. Tabela 11: Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN do Rebaudiosídeo 7.1 em CDCl3/piridina 1/3 e 3 gotas de DCOOD registrado em 320 K e Rebaudiosídeo M em CDCl3/piridina 1/1 e 3 gotas de DCOOD registrado em 300 K, δTMS = 0

Exemplo 5: Análise do Rebaudiosídeo 7.2

2,5 mg de amostra foram dissolvidos em 1 ml de CDCl3/piridina-d5 1/1 (p/p) e 2 gotas de DCOOD. Uma série de espectros de RMN de COSY e TOCSY 2D com pequenos incrementos de tempo de mistura proporcionaram a atribuição de quase todos os prótons de cada sistema de spin (das sete unidades de açúcar) para todos os três rebaudiosídeos, bem como o núcleo de ent-caurano diterpenoide. O experimento de HSQC permitiu a atribuição dos pares C-H correspondentes.

A posição dos açúcares glcIII, glcIV, glcV e glcVI é idêntica àquela da estrutura do Rebaudiosídeo M e a atribuição é descrita em mais detalhes na seção dedicada à atribuição da estrutura do Rebaudiosídeo 7.1.

A posição do 7° açúcar no Rebaudiosídeo 7.2 pode ser identificada a partir do acoplamento de HMBC de longo alcance de H6IV e C1VII, acoplamento de prótons de longo alcance de H1VII-H6IV no experimento de ROESY e o deslocamento químico do C6IV (69,4 ppm em comparação com os átomos C6 restantes de 62-64 ppm). O 7° açúcar é ligado por uma ligação β-glicosidica ao GlcIV.A estrutura do rebaudiosídeo 7.2 é representada na Figura 8. Todos os deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN para o Rebaudiosídeo 7.2 estão listados na Tabela 12. Para fins de comparação também estão incluídos os dados do Rebaudiosídeo M. Tabela 12: Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN do Rebaudiosídeo 7.2 em CDCl3/piridina 1/1 e 2 gotas de DCOOD e Rebaudiosídeo M em CDCl3/piridina 1/1 e 3 gotas de DCOOD registrado a 300 K, δTMs = 0

Exemplo 6: Análise do Rebaudiosídeo 7.3

2,3 mg de amostra foram dissolvidos em 1 ml de CDCl3/piridina-d5 1/2 (p/p) e 3 gotas de DCOOD.

A posição do 7° açúcar no Rebaudiosideo 7.3 pode ser identificada a partir do acoplamento de HMBC de longo alcance de H1IV e C6VII, acoplamento de prótons de longo alcance de H1VII-H6IV no experimento de ROESY e o deslocamento químico do C6VI (69,5 ppm em comparação com os átomos C6 restantes de 61-63 ppm). O 7° açúcar é ligado por uma ligação β-glicosidica ao GlcVI.A estrutura do rebaudiosideo 7.3 é representada na Figura 9. Todos os deslocamentos quimicos de 1H e 13C RMN para o Rebaudiosideo 7.3 estão listados na Tabela 13. Para fins de comparação também estão incluidos os dados do Rebaudiosideo M.

Tabela 13: Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN do Rebaudiosideo 7.3 em CDCla/piridina 1/2 e 3 gotas de DCOOD e Rebaudiosideo M em CDCl3/piridina 1/1 e 3 gotas de DCOOD registrado a 300 K, δTMs = 0

Em resumo, três novos rebaudiosídeos foram determinados conforme definido na Tabela 14.Tabela 14: Resumo dos novos Rebaudiosídeos

Materiais e métodos gerais (análise de RMN)

A mistura de solvente foi otimizada para cada uma das amostras de Rebaudiosídeo, para obter a melhor resolução possível dos sinais dos prótons anoméricos. A quantidade das amostras e a quantidade de solvente é crítica para a resolução dos picos, já que o deslocamento dos picos, especialmente dos anoméricos, é dependente da concentração e do pH (Figura 12).

Os espectros dos Rebaudiosídeos 7.2 e 7.3 foram registrados a 300 K, enquanto que no caso do Rebaudiosídeo 7.1 teve de ser usada uma temperatura maior. A 300 K, as ressonâncias no espectro do Rebaudiosídeo 7.1 foram bastante amplas, indicando ou uma má solubilidade ou processos conformacionais lentos. Por conseguinte, a atribuição final de todos os sinais foi alcançada em uma temperatura da amostra de 320 K.

Para cada exemplo, foram realizados diversos experimentos de RMN 2D: COSY, TOCSY (com tempos de mistura de 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 ms), espectros de HSQC, HMBC e ROESY (tempos de mistura de 225, 400 ms) foram registrados a 320 K em um espectrômetro Bruker Avance III a 600 e 700 MHz. A atribuição detalhada para cada exemplo é especificada na seção do exemplo.

Nos Exemplos 4, 5 e 6, a numeração atômica do esteviol e da glicose é a definida na Figura 11a e Figura 11b, respectivamente. Tabela 15: Descrição da listagem de sequências

As IDs acinzentadas são truncadas e, portanto, um fragmento da ID UniProt mencionada

Claims

1. Glicosídeo de esteviol caracterizado por ter a fórmula (IV)

2. Glicosídeo de esteviol, de acordo com reivindicação 1, caracterizado por ser produzido por fermentação.

3. Método para a produção de um glicosídeo de esteviol, como definido na reivindicação 1 ou 2, cujo método é caracterizado por compreender: proporcionar uma célula de levedura recombinante compreendendo sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam polipeptídeos compreendendo as sequências de aminoácidos codificadas por: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; fermentar a célula de levedura recombinante em um meio de fermentação adequado; e, opcionalmente, recuperar um glicosídeo de esteviol como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Composição caracterizada por compreender um glicosídeo de esteviol como definido na reivindicação 1 ou 2 e um ou mais glicosídeos de esteviol diferentes.

5. Gênero alimentício, alimento para animais ou bebida caracterizado por compreender um glicosídeo de esteviol como definido na reivindicação 1 ou 2 ou uma composição como definida na reivindicação 4.

6. Uso de um glicosídeo de esteviol como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de uma composição como definida na reivindicação 4 caracterizado por ser em uma composição adoçante ou composição aromatizante.

7. Uso de um glicosídeo de esteviol como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de uma composição como definida na reivindicação 4 caracterizado por ser em um gênero alimentício, alimento para animais ou bebida.