BR112016018855B1 - Processo para produção de uma combinação glicosídeos de esteviol - Google Patents

Abstract

processo para separação isolamento e caracterização de glicosídeos de esteviol. são divulgados um processo abrangente para separação, isolamento e caracterização de uma combinação de dois ou mais glicosídeos de esteviol a partir do extrato de plantas de stevia rebaudiana e o seu uso em composições adoçantes. combinações de dois ou mais glicosídeos de esteviol de stevia rebaudiana são caracterizadas. as combinações de dois ou mais glicosídeos de esteviol podem ser utilizadas como intensificadores da doçura, intensificadores do sabor e adoçantes em alimentos, bebidas, cosméticos e produtos farmacêuticos. também é divulgado um método para o isolamento das combinações de dois ou mais glicosídeos de esteviol.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/941.018, depositado em 18 de fevereiro de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referên cia na sua totalidade.

CAMPO DE INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se a um processo abrangente para sepa ração, isolamento e caracterização dos glicosídeos de esteviol a partir do extrato das plantas de Stevia rebaudiana e o seu uso em composi ções adoçantes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Hoje em dia, as alternativas de açúcar estão recebendo atenção crescente devido à consciência de muitas doenças em con junto com o consumo de alimentos e bebidas ricos em açúcar. No en tanto, muitos adoçantes artificiais, tais como dulcin, ciclamato de sódio e sacarina, foram proibidos ou restritos em alguns países devido às preocupações com a sua segurança. Portanto, os adoçantes não caló- ricos de origem natural estão se tornando cada vez mais populares.

[004] Stevia rebaudiana Bertoni é um arbusto perene da família Asteraceae (Compositae) nativa em certas regiões da América do Sul. As folhas da planta contêm de 10 a 20 % de glicosídeos de diterpeno, os quais são ao redor de 150 a 450 vezes mais doce do que o açúcar. As folhas têm sido tradicionalmente utilizadas por centenas de anos no Paraguai e no Brasil para adoçar chás e medicamentos locais.

[005] A prática típica é cultivar as plantas durante a parte quente do ano, em seguida colher antes que as plantas floresçam. David J. Midmore and Andrew H. Rank (“A new rural industry - Stevia - to re- place imported chemical sweeteners. A report for the Rural Industries Research and Development Corporation, August 2002; RIRDC Web Publication No. W02/022, RIRDC Project No UCQ-16A) relatam que várias safras por ano são possíveis em climas mais quentes tais como no Brasil, no Paraguai, na Índia ou na Indonésia. "Números de produ ção comercial não são relatados a não ser em termos gerais, por exemplo, 1600 a 2000 kg de folhas secas/ha/ano. Os rendimentos ex perimentais sugerem que os sistemas com múltiplas colheitas por ano irão fornecer rendimentos mais elevados. Este rendimento refere-se a massa de planta seca, para a não otimização do glicosídeo de esteviol por hectare por colheita. Ao alavancar melhores métodos analíticos e bom desenvolvimento agronômico das plantas selecionadas para um rendimento melhorado de glicosídeo de esteviol por hectare, e através da coordenação de maturação da planta dentro de uma determinada região geográfica com colheita escalonada, melhoras no rendimento de glicosídeo de esteviol pós-colheita por época de colheita podem ser executadas.

[006] Midmore e Rank continuam a relatar "O procedimento usual é colher a totalidade da safra verde e transportá-la para instalações de secagem: secagem ao sol ou fornos de secagem (artificiais). Com pouca umidade, a secagem ao sol de uma camada fina de plantas cor tadas pode ser bastante rápida (9 a 10 horas) para reduzir a umidade da planta em aproximadamente 80 % a 10 % [116]. A secagem em forno pode levar dois dias [37]. A secagem rápida é suscetível de for necer folhas secas de 'melhor qualidade'. Se a matéria vegetal cortada não for seca rapidamente, a qualidade da folha pode deteriorar por oxidação, perdendo até um terço do teor de esteviosídeo após três di as [116]. A temperatura elevada durante a secagem artificial também pode levar à perda de conteúdo. A cor da folha seca verde é desejável e representa boa qualidade". Temos possibilitado melhoras nessa prá- tica através de uma colheita impressionante e época apropriada para o processamento extrativo de folhas úmidas (isto é, frescas, não secas) que não são submetidas a qualquer processo de secagem. Esta me lhora confere o duplo benefício de reduzir a perda de glicosídeo duran te a secagem e economias nos custos de processamento por livrar-se da necessidade de um secador.

[007] As folhas de Stevia secas são relatadas de conter aproxi madamente 5 % a 9 % de umidade, 10 % a 20 % de proteína, 35 % a 62 % de hidratos de carbono, de 3 % a 5 % de gorduras (principalmen teácidos palmíticos, linolênicos e linoléicos), de 7 % a 13 % cinzas e vários componentes voláteis incluindo espatulenol, beta-pineno, beta- cariofileno e óxido de cariofileno. A Stevia também é uma rica fonte de ácido oxálico (ver Wolwer-Rieck U. The Leaves of Stevia rebaudiana (Bertoni), Their Constituents and the Analysis Thereof: A Review. J. Agric. Chem. 2012, 60,886-895). Estes componentes podem afetar o aroma condimentar do adoçante se não removidos ou reduzidos para um nível substancialmente baixo. Como um resultado, o isolamento dos adoçantes Stevia individuais de alta pureza requer processamento extenso, incluindo o tratamento com várias resinas, separação utili zando solventes orgânicos, e cristalização para render um produto de sabor e qualidade adequados.

[008] Neste momento, existem mais de 230 espécies de Stevia com propriedades adoçantes significativas. A planta tem sido cultivada com sucesso sob uma ampla faixa de condições de seus subtrópicos nativos nas latitudes frias do norte. A composição dos glicosídeos de esteviol pode ser modificada pela reprodução de plantas direcionadas. Enquanto que as espécies vegetais nativas possuem esteviosídeo como um glicosídeo de esteviol predominante, cultivares modernos foram selecionados com relação ao aumento do teor de rebaudiosídeo A, o qual é considerado um adoçante de melhor qualidade do que o esteviosídeo. A Stevia rebaudiana produz uma série de outros glicosí- deos de esteviol que também representam doçuras e propriedades sensoriais de alta intensidade, em alguns casos superiores àqueles de muitos outros que adoçantes de alta potência de ocorrência natural. Os glicosídeos de esteviol não são metabolizados para energia no sis tema digestivo humano, e podem ser utilizados para adoçar alimentos sem adição de calorias onde quer que o açúcar seja utilizado. Eles são adequados para diabéticos e dietas de baixa caloria.

[009] Os glicosídeos acima mencionados possuem uma aglicona comum, esteviol, e diferem pelo número e tipo de resíduos de carboi dratos nas posições C13 e C19 (R2 e R1 respectivamente na Figura 1). As folhas de Stevia são capazes de acumular até 10 a 20 % (com ba se em peso seco) glicosídeos de esteviol. Os glicosídeos principais encontrados nas folhas de Stevia nativas são Rebaudiosídeo A (2 a 10 %), Esteviosídeo (2 a 10 %), e Rebaudiosídeo C (1 a 2 %). Outros gli- cosídeos, tais como Rebaudiosídeo B, D, E e F, Esteviolbioside e Ru- busoside, também são encontrados em níveis mais baixos (menos do que 1 %). Ainda outros glicosídeos foram recentemente relatados por Ohta, et al. in J.Appl.Glycosci. (2010) 57:199-209.

[0010] Dois principais glicosídeos - Esteviosídeo e Rebaudiosídeo A - foram extensivamente estudados e caracterizados em termos da sua adequação como adoçantes comerciais de alta intensidade. Por exemplo, os estudos de estabilidade em bebidas gasosas confirmaram a sua estabilidade ao calor e pH. Chang S. S. et al. (1983) Stability studies of Stevioside and Rebaudiosídeo A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31: 409-412. Mesmo em um estado altamente purificado, estes glicosídeos de esteviol ainda possuem atributos de sabor indesejáveis tais como amargura, gosto residual doce, sabor de alcaçuz, etc. Um dos principais obstáculos para a comercialização bem sucedida de adoçantes de Stevia são esses atributos de sabor indesejáveis. Mostrou-se que estas notas de sabor tornam-se mais proeminentes quando a concentração do glicosídeo de esteviol au menta (Prakash et al. (2008) Development of Rebiana®, a natural, non caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82).

[0011] Rebaudiosídeo A se mostra menos adstringente, menos amargo, e o gosto residual menos persistente, possuindo assim atribu tos sensoriais favoráveis em comparação com os glicosídeos de este- viol conhecidos (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweeteners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips K. C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. In: Grenby T. H. ed. Develop ments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, London. 1-43).

[0012] O Pedido Publicado U.S. No. 2013347140 de Wang divulga um método de reprodução de plantas de estévia tendo elevado teor de Rebaudiosídeo A.

[0013] As Patentes U.S. Nos PP23.164 e PP23.728 divulgam culti vares de estévia nomeados AKH L1 e AKH L4. Os cultivares possuem teor elevado de rebaudiosídeo A.

[0014] Os métodos para a extração e purificação de glicosídeos doces a partir da planta Stevia rebaudiana utilizando água ou solven-tesorgânicos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 4.361.697; 4.082.858; 4.892.938; 5.972.120; 5.962.678; 7.838.044 e 7.862.845.

[0015] Dobberstein e Ahmed (Patente U.S. No 4.361.697) e Morita et al. (Patente U.S. No 4.082.858) divulgam a cromatografia de sílica de glicosídeos de esteviol. Giovenatto (Patente U.S. No 4.892.938) emprega hidróxido de cálcio para clarificar um extrato bruto de ado çantes de Stevia, seguido por filtração ou centrifugação. Este precipi tado é tratado com uma resina de troca iônica fortemente acídica e subsequentemente com uma resina de troca iônica fracamente básica, filtrada e secada. Magomet e outros (Patente U.S. No 7862845) tam- bém ensina o isolamento de glicosídeos de esteviol parcialmente puri ficados mediante o tratamento de um extrato bruto com sais de cálcio, filtração da pasta fluida, seguido pela cristalização de Rebaudiosídeo A partir de uma mistura de metanol-água. Abelyan et al. (Patente U.S. No 7.838.044) ensina a extração de glicosídeos doces da Stevia re- baudiana Bertoni na presença de pectinase, e purificação mediante o contanto do extrato com ciclodextrina e resinas de bentonita e de troca iônica, seguido pela cristalização e recristalização a partir de etanol. Kutowy et al. (Patente U.S. No 5.972.120) divulgam um processo para a extração de compostos doces de Stevia rebaudiana (Bertoni) em uma coluna de extração vertical, seguido pela purificação através da filtração, mediante o uso de microfiltração como uma etapa de pré- tratamento para clarificar o extrato, depois ultrafiltração seguida por nanofiltração. Payzant et al. (Patente U.S. No 5.962.678) utilizam duas colunas de troca iônica para remover as impurezas dos glicosídeos doces extraídos da Stevia rebaudiana, o metanol sendo utilizado para eluir os glicosídeos doces da segunda coluna, e esfriamento da solu ção para cristalizar o Esteviosídeo. O filtrado é ainda concentrado e esfriado para cristalizar Rebaudiosídeo A.

[0016] A Patente U.S. No 4.612.942 divulga glicosídeos de diter- peno, incluindo Rebaudiosídeo D, e o seu uso em gêneros alimentí-cios,composições médicas, composições de higiene oral, composi ções de goma de mascar e composições de fumo.

[0017] Determinou-se que algumas destas propriedades indesejá veis podem ser reduzidas ou eliminadas por submeter os glicosídeos de esteviol à reação de transglicosilação intermolecular, quando novos resíduos de carboidrato estão ligados à molécula inicial nas posições C13 e C19. Dependendo do número de resíduos de carboidrato nestas posições, a qualidade e a potência do sabor do composto irão variar. A tabela 1 ilustra de que modo a qualidade e a intensidade de doçura varia com o número e a posição dos glicosídeos. Os componentes de glicose (designados como Gluc ou G na tabela) estão conectados por uma ligação beta-glicosídica. Pululanase, isomaltase (Lobov S. V. et al. (1991) Enzymatic production of sweet stevioside derivatives: transglycosylation by glucosidases. Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965), β-galactosidase (Kitahata S. et al. (1989) Production of rubusoside de rivatives by transglycosylation of various β-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 2923-2928), e dextrano sacarase (Yamamoto K. et al. (1994) Effective production of glucosyl-stevioside by α-1,6- transglucosylation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) foram utilizadas como enzimas de transglicosilação, jun tamente com pululano, maltose, lactose e amido parcialmente hidroli- sado, respectivamente, como doadores de resíduos glicosídicos para estender linearmente a parte de carboidrato sobre o núcleo de glicosí- deo de esteviol com unidades de glicose ligadas a alfa.

[0018] A transglicosilação dos glicosídeos de esteviol também foi executada pela ação das ciclodextrina glucanotransferases (CGTase) produzidas pelo Bacillus stearothermophilus (Patentes U.S. Nos 4.219.571 e 7.807.206). Como um resultado, os derivados de α-1,4- glicosila foram formados com um grau de polimerização até 10.

[0019] Foi demonstrado que o perfil de sabor e a potência de do çura dos derivados de glicosila são grandemente dependentes de vá rios derivados adicionais de glicosila, isto é, o grau de polimerização da cadeia de α-1,4-glicosila. O aumento no número de resíduos de α- 1,4-glicosila melhorou a qualidade do sabor, mas ao mesmo tempo reduziu o nível de doçura. (Tanaka, 1987).

[0020] Deve ser observado também que muitos produtos de glico- sil Stevia contêm até 20 % de dextrina residuais que não possuem propriedades funcionais significativas e reduzem o teor de glicosídeos de esteviol no produto, reduzindo ainda a intensidade de doçura.

[0021] Portanto, é necessário desenvolver um processo simples e eficiente de preparação de glicosídeos de Stevia de alta pureza.

[0022] O Pedido Publicado Chinês No. CN103012516 de Wuxi Kingboon Stevia Internat Trade Co. Ltd. divulga métodos de prepara ção de esteviosídeo que incluem uma etapa de imersão das folhas es- tévia em água; uma etapa de filtragem grosseira e ultrafiltração para obter uma solução de ultrafiltração; uma etapa de introdução da solu ção de ultrafiltração em uma coluna de nano micro guarda; e pelo me nos duas etapas de alcoólise na coluna de nano micro guarda.

[0023] O Pedido Publicado Chinês No. CN102127129 de Liaoning Qianqian Biolog Technology Co. divulga um método de preparação de um extrato de estévia que inclui uma etapa de trituração mecânica das folhas de estévia; uma etapa de filtração das folhas de estévia; uma etapa de extração de ultrassônica; uma etapa de floculação; uma eta pa de adsorção; uma etapa de análise através da eluição de etanol; uma etapa de dessalinização e descoloração; uma etapa de concen tração; e uma etapa de secagem por pulverização.

[0024] O Pedido Publicado Chinês No. CN102406113 de Ningbo Green Health Pharmaceutical Co. Ltd. divulga um método para prepa rar uma preparação de rebaudiosídeo A/rebaudiosídeo D que inclui uma etapa de extração das folhas de estévia pulverizadas com água; uma etapa de passagem do filtrado através de uma coluna de resina macroporosa; e uma etapa de eluição com um solvente alcoólico utili zando a análise de HPLC que detecta o teor de rebaudiosídeo A/rebaudiosídeo D.

[0025] O Pedido Publicado U.S. No. 20130071537 de E.P.C Plant Pharmaceutical Technology Co., divulga composições de adoçantes à base de estévia que incluem uma forma de sal de Rebaudiosídeo B.

[0026] O Pedido Publicado U.S. No. 20140243514 da Cargill In corporated divulga um método de preparação de uma composição en- riquecida que compreende pelo menos um de rebaudiosídeo B, rebau- diosídeo D, ou uma mistura destes que inclui o uso de uma resina po rosa neutra macroporosa.

[0027] O Pedido Publicado U.S. No. 20130309389 da Cargill In corporated divulga uma composição que contém quantidades específi cas de rebaudiosídeo D e rebaudiosídeo B.

[0028] O Pedido Publicado U.S. No. 20140004248 de LGL Life Tech Corporation divulga um processo para a produção de uma com posição adoçante natural compreendendo pelo menos um de extrato de esteviolbiosídeo, extrato de rebaudiosídeo B e extrato de rebaudio- sídeo D, compreendendo o uso de uma coluna de adsorção porosa tendo parâmetros específicos. O Pedido Publicado U.S. No. 20130071339 de Markosyan divulga métodos de preparação de glico- sídeos de esteviol altamente purificados, particularmente Rebaudiosí- deo D.

[0029] O Pedido Publicado U.S. No. 20150017284 de Markosyan divulga uma composição cristalina de rebaudiosídeo N e rebaudiosí- deo D contendo pelo menos 75 % de rebaudiosídeo M.

[0030] O Pedido Publicado U.S. No. 20130071339 de Markosyan divulga um método para a purificação de glicosídeos de esteviol que inclui o uso de colunas consecutivamente conectadas acondicionadas com uma resina adsorvente capaz de adsorver os glicosídeos de este- viol.

[0031] A Patente U.S. No. 8.299.224 de PureCircle Sdn Bhd divul ga um método para a purificação de Rebaudiosídeo D a partir do ex trato de estévia que inclui o fornecimento de um extrato de estévia; dissolução do extrato em uma primeira solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma primeira mistura de glicosídeos de es- teviol, em que o solvente orgânico é selecionado do grupo que consis te em metanol, etanol, 1-propanol, isopropanol, e uma mistura destes, e o solvente orgânico é de 75 a 99 % em vol.; indução da cristalização na primeira mistura; filtração da mistura para se obter um primeiro pre cipitado e um primeiro filtrado; dissolução do primeiro precipitado em uma segunda solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma segunda mistura, em que o solvente orgânico é selecionado do grupo que consiste em metanol, etanol, l-propanol, isopropanol, e uma mistura destes, e o solvente orgânico é de 70 a 80 % em vol.; indução da cristalização na segunda mistura; filtração da mistura para se obter um segundo precipitado e um segundo filtrado; dissolução do segundo precipitado em uma terceira solução aquosa de solvente orgânico para resultar em uma terceira mistura, em que o solvente orgânico é seleci onado do grupo que consiste em metanol, etanol, l-propanol, isopro panol, e uma mistura destes, e o solvente orgânico é de 10 a 80 % em vol.; indução da cristalização na terceira mistura; e filtração da mistura para se obter um terceiro precipitado e um terceiro filtrado; por meio do qual a secagem do terceiro precipitado produz Rebaudiosídeo D purifi cado.

[0032] Os Pedidos Publicados U.S. Nos. 20140335253, 20140335254, 20140335264 e 20140335265 de EPC Beijing Natural Products Co. Ltd. divulgam composições de rebaudiosídeo D não na turais que contêm uma quantidade aumentada de rebaudiosídeo D pu rificado, em que o aumento da quantidade de rebaudiosídeo D purifi cadoé adicionado como rebaudiosídeo D purificado nas composições.

[0033] O Pedido Publicado U.S. No. 20120269954 de Tate & Lyle Ingredients Americas LLC divulga um extrato de Stevia compreenden-doRebaudiosídeo B.

[0034] O Pedido Publicado U.S. No. 20110256588 de Lee et al. divulga um método de produção de Rebaudiosídeo A com um rendi mento elevado através da reciclagem de subprodutos produzidos quando o Rebaudiosídeo A é produzido a partir das folhas de Stevia rebaudiana Bertoni.

[0035] O Pedido Publicado U.S. No. 20110183056 de Morita et al. divulga glicosídeos de esteviol isolados tendo as estruturas aqui divul gadas. A referência divulga que os glicosídeos de esteviol, os quais possuem estruturas que apresentam mais componentes glicosídicos do que no esteviosídeo ou rebaudiosídeo A, podem fornecer uma me lhora sutil no sabor adoçante da Stevia.

[0036] A Patente U.S. No. 8.520.527 da PureCircle Sdn Bhd divul ga um processo para a produção de um ingrediente alimentar com es- tévia que inclui uma etapa de imersão de uma biomassa de estévia em água para remover os componentes solúveis; uma etapa de incubação de uma biomassa de estévia insolúvel em água com solução alcalina para produzir uma polpa; e outras etapas de processamento para con seguir um ingrediente alimentar de estévia que contém celulose micro- cristalina.

[0037] A Patente U.S. No. 8.337.928 de Concentrate Manufactu ring Company of Ireland divulga um produto de bebida que compreen de pelo menos um adoçante de glicosídeo de esteviol e ácido anísico.

[0038] As Patentes U.S. Nos. 8.318.459 e 8.257.948 de PureCircle USA divulgam um processo para a produção de uma composição de glicosila Stevia altamente purificada utilizando amido como uma fonte dos resíduos de glicose.

[0039] A Patente U.S. No. 8.299.224 de PureCircle Sdn Bhd divul ga um método para a purificação de Rebaudiosídeo D a partir do ex trato de Stevia.

[0040] A Patente U.S. No. 8.277.862 de Concentrate Manufactu ring Company of Ireland divulga um produto de bebida que compreen de Rebaudiosídeo A, eritritol e um componente ácido.

[0041] A Patente U.S. No. 8.277.862 de Concentrate Manufactu ring Company of Ireland divulga um produto de bebida que compreen- de um glicosídeo esteviol e um componente ácido.

[0042] A Patente U.S. No. 7.964.232 da PepsiCo, Inc. divulga isô- meros de glicosídeo de esteviol em que a ligação dupla exo-cíclica de fórmula I foi movido para uma posição endo-cíclica dentro do anel de cinco membros.

[0043] A Patente U.S. No. 7.927.851 de Vineland Research and Innovation Centre divulga um método de produção de um glicosídeo de esteviol em uma planta ou célula vegetal compreendendo, a) sele cionar uma planta ou célula vegetal que produz ácido ent-caurenoico; b) transformar a planta ou célula vegetal com uma primeira sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo contendo atividade de ácido ent-caurenoico 13-hidroxilase, e pelo menos uma outra sequên cia de nucleotídeos que codifica uma ou mais glicosiltransferases para catalisar a adição de uma ou mais moléculas de glicose em esteviol ou glicosil-esteviol; e c) expressar o polipeptídeo que possui ácido ent- caurenoico 13-hidroxilase e dito uma ou mais glicosiltransferases na célula para converter o ácido ent-caurenoico em um ou mais glicosí- deos de esteviol.

[0044] Ohta et al., Characterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana morita, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209 (2010), divulga as estruturas de glicosídeos de esteviol extraídos das folhas de S. rebaudiana Morita, que foram produzidas pela seleção e reprodução de S. rebaudiana Bertoni.

[0045] Zimmerman, Tandem mass spectrometric fragmentation patterns of known and new steviol glycosides with structure proposals, Rapid Commun. Mass. Spectrom. 2011, 25, 1575-1582, divulga o uso de espectrometria de massa em tandem para identificar 12 glicosídeos de esteviol anteriormente desconhecidos.

[0046] Brandle et al. (2002) Plant Molecular Biology 50: 613-622; Richman et al. (1999) The Plant Journal 19(4), 411-421; e Richman et al., (2005) The Plant Journal 41, 55-67, divulgam as vias metabólicas para a produção de esteviol e a conversão de esteviol para vários gli- cosídeos de esteviol.

[0047] Os métodos existentes lidam com o isolamento e a purifica ção de um glicosídeo de esteviol a partir de um extrato inicial e não mostram um caminho para o tratamento posterior da solução residual ou purificação de compostos minoritários, individual ou coletivamente. Assim, continua a existir uma necessidade de um método eficiente e econômico para o retratamento abrangente do extrato produzido a par tir das plantas de Stevia rebaudiana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0048] A invenção refere-se a um processo amplo para a separa ção, isolamento, caracterização e uso de dois ou mais glicosídeos de esteviol secundários (e, em particular, aqueles de ocorrência naturale em menos do que 1 % em peso de folha seca) de plantas de Stevia rebaudiana.

[0049] De acordo com uma modalidade, um método eficaz de se paração,isolamento e caracterização de combinações de dois ou mais glicosídeos de esteviol de extracto de Stevia é fornecido, minimizando assim os resíduos.

[0050] As combinações de dois ou mais glicosídeos de esteviol, isoladamente ou em combinação com outros adoçantes e/ou outros ingredientes, são úteis como adoçantes não calóricos nas composi ções comestíveis e mastigáveis, tais como bebidas, confeitos, panifi cações, bolinhos, gomas de mascar, produtos farmacêuticos e outros mais.

[0051] De acordo com uma modalidade, o método inclui:

[0052] 1. o uso de um método cromatográfico para a identificação e quantificação de combinações de dois ou mais glicosídeos de este- viol secundários (que ocorrem em menos do que 5 % em peso da fo- lha seca) como um meio de informação de um programa de reprodu ção para otimizar para a produção desse conjunto definido de glicosí- deos de esteviol, os quais não são atualmente utilizados de forma co mercial como adoçantes;

[0053] 2. o método de extração, incluindo através da extração gra dual, de folhas de Stevia, folhas frescas ou desidratadas para preserva ção, para otimizar a recuperação dos dois ou mais glicosídeos de este- viol secundários de peso molecular maior do que cerca de 900 g/mol, e minimizar a necessidade de etapas de processamento subsequentes;

[0054] 3. o uso de cromatografia para isolar um conjunto de dois ou mais glicosídeos de esteviol de peso molecular maior do que cerca de 900 g/mol, de preferência rebaudiosídeos D, I, O, M e/ou N, todos os quais ocorrem individualmente em níveis abaixo de 5 % com base no peso da folha seca;

[0055] 4. um processo que evita a necessidade de cristalização no isolamento dos glicosídeos de esteviol D, I, O, M e/ou N, que envolve a eluição gradiente utilizando 2 ou mais solventes em uma temperatu ra constante, ou em um gradiente de temperatura com o solvente de eluição;

[0056] 5. o uso como um adoçante de uma combinação de dois ou mais glicosídeos de esteviol, de preferência rebaudiosídeos D, I, O, M e/ou N, que ocorrem individualmente em níveis abaixo de 5 % com ba se no peso seco da folha;

[0057] 6. os dois ou mais glicosídeos de esteviol pode ser utiliza dos isoladamente ou em combinação com glicosídeos de esteviol mais predominantes, incluindo, mas não limitado a estes, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo D, em quantidades menores do que cerca de 25 % de glicosídeo de esteviol predominante, menores do que cerca de 15 % de glicosídeo de esteviol predominante, menores do que cerca de 10 % de glicosídeo de esteviol predominante, meno- res do que cerca de 5 % de glicosídeo de esteviol predominante. A Tabela 9, tomada de Ohta et ai. (2010), fornece as quantidades relati vas de glicosídeos de esteviol das folhas de S. rebaudiana Morita e S. rebaudiana Bertoni.

[0058] A troca iônica contra corrente contínua e adsorção tal como a tecnologia SepTor da Outotec, Espoo, Finland, é uma técnica que po de ser empregada para remover os contaminantes. A cromatografia contínua é diferente da cromatografia de fase sólida estacionária con vencional (uma única ou múltiplas colunas) em que as múltiplas colunas empregadas na cromatografia contínua são operadas como se fossem uma única coluna, mas com múltiplos pontos de alimentação e pontos de descarga entre as colunas para permitir o avanço progressivo dos pontos de alimentação para a mistura e solvente em eluição, e os pon tos de remoção para os componentes de eluição mais lentos e mais rá pidos na mistura. Este modo de operação permite que cada segmento de coluna de componente seja operado de forma autônoma em relação à composição eluente ou taxa de fluxo. A simulação do processo de separação contínua é descrita por Johan Samuelsson in "Simulation of continuous chromatographic processes" and by Niklas Andersson in "Simulation of continuous preparative chromatography: A case study in MCSGP." (2009) for the use of a solvent gradient (SG) in a multi column (MC) system. "Preparativo" (P) refere-se ao impacto de uma separação em uma escala maior do que para os propósitos analíticos, até a escala de produção comercial. A aplicação de separação cromatográfica contí nua de açúcares é bem desenvolvida na indústria de refino de açúcar de beterraba e é descrita por Bubnik e co-autores em “Application of continuous chromatographic separation in sugar processing”, Journal of Food Engineering 61 (2004) 509-513. A aplicação de métodos de sepa ração contínua deve ser personalizada para o tipo de separação em preendida. Por exemplo, uma estratégia de separação para o isolamen- to de rebaudiosídeo A de alta pureza será diferente da operação do sis tema para uma mistura personalizada de outros glicosídeos de esteviol. Até o momento, os métodos de separação contínua não foram aplica dos para o isolamento de misturas de glicosídeo de esteviol personali zadas compreendendo pelo menos dois glicosídeos de esteviol selecio nados de rebaudiosídeos A, D, I, O, M e N.

[0059] Outra distinção importante na cromatografia contínua é o uso de um inventário persistente do material a ser separado que reside no sistema de múltiplas colunas e que é continuamente circulado no sistema. Este inventário é vantajosamente empregado na ajuda da se paração mediante o ajuste do inventário de componentes individuais para favorecer uma composição desejada. Por exemplo, se uma mistu ra de alimentação tiver um baixo nível de um conjunto de componentes desejados (por exemplo, 3 a 5 % de rebaudiosídeos A, D, I, O, H, M e N), mas uma parte dominante (> 20 %) de rebaudiosídeo A, a coluna pode ser operada inicialmente por remover principalmente o componen te predominante, enquanto permite que os componentes menores per maneçam no inventário na coluna. Isso pode permitir que os componen tes menores na alimentação sejam melhores resolvidos no inventário da coluna de outros componentes que permitem a remoção de uma cor rente enriquecida nos componentes desejados (secundários).

[0060] A capacidade de operar cada coluna de forma independen teé de crucial importância nas separações envolvendo duas ou mais entradas para o sistema de separação (por exemplo, alimentação de processo, eluente A e eluente B), e dois ou mais remoções (por exem plo, Produto 1, Produto 2 , Produto 3, etc.), onde as taxas de fluxo de fluxo de remoção são diferentes para cada uma. O equilíbrio de fluxo da coluna é calculado como Fentrada(coluna precedente) + Fentrada(alimentação) = Fsaída(Produto) + Fsaída(para a próxima coluna)

[0061] Onde Fentrada(alimentação) pode ser a alimentação do processo ou um solvente de eluição e Fsaída(produto) é um produto de remoção.

Leito móvel simulado

[0062] Na fabricação, o processo de leito móvel simulado (SMB) é um processo altamente planejado para a implementação de separação cromatográfica. Ele é utilizado para separar um composto químico ou uma classe de compostos químicos de um ou mais de outros compos tos químicos para fornecer quantidades significativas do material puri ficado ou enriquecido a um custo mais baixo do que poderia ser obtido utilizando a cromatografia simples (batelada). Ele não pode fornecer qualquer separação ou purificação que não possa ser realizada por uma coluna de purificação simples. O processo é bastante complicado. Uma vantagem que leva a uma purificação cromatográfica é aquela que permite a produção de grandes quantidades de material altamente purificado a um custo significativamente reduzido. As reduções de cus to acontecem como um resultado de: o uso de uma menor quantidade de meios de separação cromatográfica de fase estacionária, uma taxa contínua e elevada de produção, e redução das necessidades de sol vente e de energia. Este desempenho econômico melhorado é reali zado por uma disposição de válvula-e-coluna que é utilizada para pro longar a fase estacionária indefinidamente e permitir que cargas de soluto muito elevadas no processo.

[0063] Na técnica convencional de leito móvel de cromatografia de produção a entrada de alimentação e a recuperação de analito são simultâneas e contínuas, mas devido a dificuldades práticas com um leito móvel contínuo, a técnica de leito móvel simulada foi proposta. Na técnica de leito móvel simulada em vez de mover o leito, a entrada de alimentação, a entrada de solvente ou eluente e a saída do produto desejado e as posições de saída do produto indesejável são movidas continuamente, dando a impressão de um leito móvel, com fluxo contí- nuo de partículas sólidas e fluxo contínuo do líquido na direção oposta das partículas sólidas.

[0064] Outra forma de separação cromatográfica contínua é a cromatografia anular. Em um comentário publicado, Frank Hilbrig and Ruth Freitag (“Continuous annular chromatography”, Journal of Chro matography B, 790 (2003) 1-15) relatam "O princípio da cromatografia anular contínua (CAC) tem sido conhecido durante várias décadas. A CAC é um modo cromatográfico contínuo, que se presta para a sepa ração de misturas de múltiplos componentes, assim como aquelas de bi-componente. Na CAC, as fases móveis e estacionárias se movem de uma forma contracorrente, o que permite a transformação da sepa ração típica da coluna de batelada unidimensional em uma bidimensi onal contínua. Com a exceção da eluição gradiente linear, todos os modos de cromatografia foram atualmente aplicados em CAC". No início, Bart e coautores (Continuous chromatographic separation of fructose, mannitol and sorbitol. Chemical Engineering and Processing 35 (1996) 459-471) aplicaram o método para a separação de açúcares simples, mas este método não foi empregados para a separação dos glicosídeos de esteviol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0065] A Figura 1 mostra a estrutura de aglicona do glicosídeo de esteviol com localização indicada de glicosilação (R1 e R2).

[0066] A Figura 2 mostra a organização dos glicosídeos de esteviol.

[0067] A Figura 3 é um gráfico de que como a qualidade de sabor subjetivo e doçura podem ser previstas através do tamanho molecular do glicosídeo de esteviol.

[0068] A Figura 4 mostra os espectros de massa para os glicosí- deos de esteviol de interesse.

[0069] A Figura 5 mostra os espectros de massa para os glicosí- deos de esteviol de interesse.

[0070] A Figura 6 mostra as etapas de extração e purificação que podem ser utilizadas de acordo com a invenção.

[0071] A Figura 7 mostra o uso de cromatografia de leito móvel simulada de acordo com a invenção.

[0072] A presente invenção pode ser mais completamente com preendidaatravés da referência às figuras, descrição detalhada e exemplos que se seguem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0073] Acredita-se que uma pessoa versada na técnica possa, com base na descrição contida neste documento, utilizar a presente invenção na sua extensão mais completa. As seguintes modalidades específicas devem ser interpretadas como meramente ilustrativas, e não como limitativas do restante da divulgação de qualquer forma seja qual for.

[0074] A não ser que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como normalmente compreendido por uma pessoa de habilidade práti ca na técnica à qual a invenção pertence. Também, todas as publica ções, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencio nadas são incorporadas por referência. Como aqui utilizado, todas as percentagens são em peso a não ser que de outra maneira especifica da. Além disso, todas as faixas aqui apresentadas destinam-se a inclu ir todas as combinações de valores entre os dois estágios finais, inclu sive.

DEFINIÇÕES

[0075] Através do termo "notas de sabor" se quer dizer os aspec tos sensoriais sutis tipicamente detectados pelo sabor ou cheiro expe-rimentados enquanto exala através do nariz após a ingestão (olfato retronasal).

[0076] Pelo termo "esteviol" entende-se o composto diterpenoico ácido hidróxi-ent-kaur-16-en-13-ol-19-oico, que é a forma hidroxilada do composto denominado "ácido ent-caurenoico", o qual é o ácido ent- kaur-16-en-19-oico.

[0077] Através do termo "glicosídeo de esteviol " significa qualquer um dos glicosidos da aglicona esteviol, incluindo, mas não limitado a estes, esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosí- deo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosíde E, Rebaudiosídeo F, Rebau- diosídeo I, Rebaudiouside M, Rebaudiosídeo N, Rebaudiosídeo O, dulcosídeo, rubusosídeo, esteviolmonosíedo, esteviolbiosídeo, e 19-O- β-glucopiranosil-esteviol.

[0078] Exemplos de adoçantes sintéticos incluem a sucralose, aces- sulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, derivados sintéticos de neoesperidina di-hidrocalcona, ciclamato, neotame, dulcin, suosan, éster N-[N-[3-(3-hidróxi-4-metoxifenil)propil]-L-a-aspartil]-L-fenilalanina 1-metílico (Advantame), éster N-[N-[3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)-3-metilbutil]-L-α- aspartil]-L-fenilalanina 1-metílico, éster N-[N-[3-(3-metóxi-4-hidroxifenil) propil]-L-α-aspartil]-L-fenilalanina 1-metílico, seus sais, e outros mais.

[0079] Exemplos de adoçantes naturais de alta intensidade inclu em Esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Esteviolbiosídeo, dulcosídeo A, Rubusosídeo, alguns mogrosídeos (por exemplo, Mogrosídeo V), brazzein, neoesperidina di-hidrocalcona (NHDC), ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mucuroziosídeos, bai- yunosídeo, flomisosídeo-I, ácido dimetil-hexaidrofluoreno dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocari- osídeos, polipodosídeo A, brasilina, hernandulcina, filodulcina, glicifili- na, florizina, trilobatina, di-hidroflavonol, di-hidroquercetina-3-acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueain A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlin, pentadin, miraculina, curculina, neoculin, ácido clorogênico, cinarina, siamenosídeo e outros.

[0080] Os adoçantes adequados "estáveis ao calor, de alta inten sidade" incluem os compostos químicos ou misturas de compostos que extraem um sabor doce, pelo menos cinco vezes mais doce do que a sacarose, como medido de acordo com o método de teste des crito na Patente G.B. No. 1.543.167, que é aqui incorporada por refe rência. Tipicamente, tais adoçantes são substancialmente livres de produtos de degradação após terem sido aquecidos durante cerca de uma hora ao redor de 40 °C. Exemplos de tais adoçantes adequados incluem, mas não são limitados a estes, sucralose, neotame, sacarina, acessulfame-K, ciclamato, neoesperdina DC, estévia, tavmatina, braz- zein, aspartame, e suas misturas.

[0081] A estévia é um adoçante natural não calórico da planta Ste via rebaudiana. A planta produz vários compostos doces coletivamente referidos como glicosídeos de esteviol, os quais tornam a estévia até 300 vezes mais doce do que a sacarose. Estes glicosídeos podem ser extraídos da planta com água e outros solventes bem conhecidos da queles versados na técnica. Eles são estáveis ao calor, estáveis ao pH, não fermentam, e não induzem uma resposta glicêmica.

[0082] O Esteviosídeo, às vezes referido como éster β-D- glocopiranosílico de ácido 13-[(2-O-β-D-glucopiranosil-α-D- glucopiranosil) óxi]-kaur-16-en-18-oico, e rebaudiosídeo A são glicosí- deos exemplares do derivado de diterpeno esteviol, extraído e refinado das folhas de Stevia rebaudiana(também conhecido como Eupatorium rebaudianum). Estes glicosídeos são adoçantes de alta intensidade, de cerca de 100 a cerca de 500 vezes da sacarose, mas possuem no tas metálicas e amargas. Eles podem ser utilizados em uma ampla fai xade produtos e bebidas alimentares de baixa ou reduzida caloria.

[0083] Outros glicosídeos doces também podem ser extraídos de Stevia rebaudiana. Estes possuem diferentes graus de doçura. Como aqui utilizado "extrato de estévia"significa um glicosídeo doce extraído de uma planta de estévia.

[0084] Dos glicosídeos encontrados nos extratos de estévia, acre dita-se que o Rebaudiosídeo A possua de uma forma geral menos gosto residual. Este gosto residual, que tem sido descrito por muitos como amargo e semelhante a alcaçuz, está presente em todos os pro dutos atuais adoçados com estévia. Tais formulações tipicamente ne cessitam de grande diluição ou tecnologia de mascaramento de sabor.

[0085] Parecido com todas as composições de adoçante contendo adoçante de alta intensidade, as composições de adoçante contendo estévia tipicamente foram fornecidas com um agente encorpante para ajudar na medição e distribuição na aplicação do usuário. Entre estes divulgados ou utilizados incluem frutooligossacarídeo (FOS) e outras fibras, maltodextrinas e eritritol. O eritritol é especialmente popular vis to que ele pode atenuar alguns dos sabores amargos.

[0086] Os Pedidos de Patente U.S. Nos. 20120201952 e 20120201940 de Catani et al. divulgam um método de produzir uma composição de adoçante natural que compreende a extração de vapor de uma mistura bruta compreendendo pelo menos um composto ado çante de alta intensidade natural com base em plantas e filtração da mistura bruta.

[0087] O Pedido U.S. No. de Série 20100285201 de Catani et al. divulga uma composição adoçante sinérgica que compreende sucralo se e um extrato purificado de estévia, em que o extrato purificado de estévia compreende rebaudiosídeos e dulcosídeos.

[0088] O Pedido de Patente U.S. 20090017185 de Catani et al. divulga uma composição adoçante com calorias reduzidas que consis te em um extrato de estévia e um açúcar simples. A referência divulga que o extrato de estévia pode ter um nível de rebaudiosídeo A de cer ca de 80 % em peso a cerca de 99,5 % em peso em relação a todos os glicosídeos de esteviol e o açúcar simples pode ser sacarose, fruto- se ou glicose.

[0089] O Pedido de Patente U.S. 20090004355 de Catani divulga uma composição adoçante que compreende eritritol e um extrato de estévia.

[0090] A presente invenção fornece um processo para a separa ção, isolamento e caracterização de uma combinação de dois ou mais glicosídeos doces de extrato vegetal de Stevia rebaudiana com pesos moleculares na faixa de cerca de 966 g/mol a cerca de 1436 g/mol e com Rebaudiosídeo A de menos do que 25 % de glicosídeos de este- viol, mais preferivelmente com Rebaudiosídeo A de menos do que 15% de glicosídeos de esteviol, mais preferivelmente com Rebaudio- sídeo A de menos do que 10 % de glicosídeos de esteviol, e mais pre ferivelmente com Rebaudiosídeo A de menos do que 5 % de glicosí- deos de esteviol.

[0091] As vantagens da presente invenção se tornarão mais evi dentes a partir da descrição detalhada dada daqui em diante. No en tanto, deve ficar entendido que a descrição detalhada e exemplos es pecíficos, embora indicando as modalidades preferidas da invenção, são fornecidos apenas por meio de ilustração, uma vez que várias al terações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

[0092] Entre os glicosídeos doces existentes na Stevia, apenas o esteviosídeo, o rebaudiosídeo A e o rebaudiosídeo C estão disponíveis a um custo moderado em < 80 % de pureza e alto custo em > 80 % de pureza. O máximo grau de pureza do produto comercial é geralmente mais do que 97 %. Daqui em diante, o termo "altamente purificado" refere-se a uma composição de glicosídeo de esteviol que inclui pelo menos cerca de 90 % a cerca de 100 % do glicosídeo de esteviol em uma base de peso seco. No mercado não existe nenhuma quantidade comercial de Rebaudiosídeo B ou Rebaudiosídeo D altamente purifi cado, dois componentes de estévia com qualidade e intensidade de sabor comparáveis ao Rebaudiosídeo A. Os Rebaudiosídeos E e F, da mesma forma adoçantes de bom sabor, são disponíveis em quantida des menores como padrões analíticos. Nenhum uso comercial tem si do feito de glicosídeos de esteviol de ocorrência natural de massa mo lecular comparável ou maior do que o Rebaudiosídeo D. A presente invenção visa definir uma composição de tais componentes de grande massa molecular, e método de baixo custo de obtenção desta compo sição, o que compensa a baixa concentração dos componentes na Stevia rebaudiana mediante o seu uso coletivamente como um agente adoçante.

[0093] Existe uma necessidade de um método eficiente e econô mico para a separação, isolamento e/ou caracterização abrangente das combinações de dois ou mais glicosídeos doce de extrato de Ste via com peso molecular maior do que cerca de 900 g/mol. Os glicosí- deos de esteviol individuais que foram desenvolvidos para uso comer cialpossuem limitações em termos de qualidade de sabor e perfil tem poral de doçura. As características e limitações de adoçantes isolados de ocorrência natural e produzidos pelo homem são descritas por Grant E. DuBois and Indra Prakash in Annu. Rev. Food Sci. Technol. (2012), 3:353-380 (Non-Caloric Sweeteners, Sweetness Modulators, and Sweetener Enhancers). A presente invenção evita o conceito de isolamento dos componentes doces individuais em favor da separa ção, isolamento e/ou caracterização de uma combinação de duas ou mais moléculas de Stevia.

EXEMPLOS

[0094] Os glicosídeos de esteviol conhecidos podem ser ordena dos com base no padrão de substituição de açúcar (glicosídeo). Isto leva em conta a previsão de outros glicosídeos de esteviol ausentes ou ainda não identificados que podem estar presentes, embora em ní veis muito baixos em várias preparações. A organização dos glicosí- deos de esteviol é ilustrada na Figura 2.

[0095] A qualidade e intensidade de doçura dos glicosídeos de es- teviol são encontradas de estarem correlacionadas com a extensão da glicosilação na aglicona de esteviol. A Figura 3 abaixo ilustra como a qualidade de sabor subjetivo e a doçura podem ser previstas pelo ta manho molecular, embora exceções possam ocorrer, tais como rebau- diosídeo B. Este composto pode ser ilustrativo da importância da es trutura de glicosídeo específica em R2, mesmo na ausência de glicosi- lação em R1, na definição da qualidade e intensidade de doçura.

[0096] A qualidade e a intensidade de doçura também são afeta- das pela presença de monossacarídeos diferentes da glicose. Assim, a presença de ramnose (Rh) na molécula, tal como em dulcosídeo A ou rebaudiosídeo C, resulta em uma menor intensidade e qualidade de doçura em relação aos glicosídeos de esteviol substituídos com o mesmo número de monossacarídeos únicos de glicose, tais como es- teviosídeo ou rebaudiosídeo A, respectivamente. Tabela 1. O padrão da glicosilação de glicosídeo de esteviol se correlaciona com a doçura.

Nota: Os dados de qualidade e intensidade de doçura de Osamu Ta naka. “Improvement of taste of natural sweeteners”. Pure & Appl. Chem. 1997, 69(4),675-683. Intensidade de doçura é compreendida de ser relativa a um peso igual de sacarose. A qualidade de doçura é uma classificação relativa subjetiva.

[0097] Os glicosídeos de esteviol diferem entre si não apenas pela estrutura molecular, mas também pelas suas propriedades de sabor. Geralmente, o esteviosídeo é observado de ser de cerca de 110 a cer ca de 270 vezes mais doce do que a sacarose, o Rebaudiosídeo A es tá entre cerca de 150 e cerca de 320 vezes, e o Rebaudiosídeo C está entre cerca de 40 e cerca de 60 vezes mais doce do que a sacarose. O dulcosídeo A está ao redor de 30 vezes mais doce do que a sacaro se. A intensidade de doçura é conhecida de variar um pouco com a temperatura e a viscosidade do meio portador.

[0098] Embora vários glicosídeos de esteviol sejam agora conhe cidos, nem todos foram avaliados com relação à qualidade e intensi dade de doçura. Da mesma forma, embora muitos processos sejam empregados para isolar e explorar os glicosídeos de esteviol indivi duais como adoçantes, o conhecimento atual não permite prever as características de doçura das misturas de glicosídeo de esteviol, parti cularmente em proporções diferentes daquelas encontradas natural mente, ou as características de sabor quando combinadas com outros adoçantes, quer calóricos quer não calóricos, de alta intensidade ou mais compatíveis com mono e dissacarídeos simples como glicose, frutose ou sacarose.

MÉTODO DE ANÁLISE

[0099] Os métodos convencionais de análise dos glicosídeos de esteviol requerem gradientes de solventes duplos para separar os gli- cosídeos de esteviol de outros componentes do extrato vegetal não doce. Consequentemente, os detectores que utilizam mudanças de índice de refração no eluente não são úteis. Tipicamente, detectores de ultravioleta (UV) são utilizados para testar os glicosídeos de este- viol que contêm um cromóforo de UV fraco. Este método é de utilidade limitada para testar os extratos brutos por causa da presença de com ponentes com cromóforos mais fortes, os quais obscurecem a detec ção dos componentes de interesse, porque os componentes com um grande coeficiente de extinção molar no comprimento de onda sele cionado irão aparecer mais proeminentes do que os componentes com coeficientes de extinção mais baixos, que embora presentes em uma concentração mais elevada sobre uma base de massa, produzirão um sinal muito mais fraco. Outra alternativa para o índice de refração (RI) com relação à detecção baseada em massa inclui a dispersão de luz evaporativa (ELS) e detecção de aerossol carregado (CAD). A THERMO Scientific (Determination of Steviol Glycosides by HPLC with UV and ELS Detections. Application Note 241 (2012)) ensina como a ELS pode apresentar vantagens sobre a detecção de UV na medição do teor de Rebaudiosídeo A e Esteviosídeo nas formulações de ado çantes de mesa. No entanto, na nossa experiência, a ELS pode ser de uso limitado na medição da concentração de um componente secun dário na presença de outro componente principal de eluição rigorosa. H.Y. Eom et al. (J. Chromatogr. A 1217 (2010) 4347-4354) ensinam que a detecção de saponinas derivadas das raízes de Bupleurum fal- catum L. (Umbelliferae) é mais sensível com DAC do que com a ELS. Observamos que o uso de um detector de aerossol carregado, ESA®, Inc., Chelmsford, MA, leva em conta uma boa quantificação dos glico- sídeos de esteviol nos extratos brutos de Stevia rebaudiana, cujas preparações são ricas em proteínas e outros componentes da planta que possuem forte absorvência de UV, e também na presença de grandes quantidades de polissacarídeos ou outros glicosídeos de es- teviol que pode "ocultar" o detector para diminuir os níveis de compo nentes de interesse.

[00100] A identificação de um detector eficaz é apenas parte do sis tema para a quantificação eficaz dos componentes de interesse em uma preparação em bruto. Outra parte do sistema é a identificação de um sistema de solventes (fase móvel) e suporte sólido (fase estacioná ria) para executar a separação. O desenvolvimento bem sucedido de uma combinação adequada de fases móveis e estacionárias é um pro cessoempírico de tentativa e erro que não é previsível a priori. Temos experimentado com vários sistemas de fase móvel de sistema gradien te para descobrir um gradiente de solvente que seja útil para separar os glicosídeos de esteviol de interesse, permitindo assim a sua identi ficação por espectrometria de massa, e quantificação por CAD. Um exemplo é mostrado abaixo. O gradiente pode ser ajustado para per mitir uma maior resolução em torno de uma região máxima particular tal como próximo de Rebaudiosídeo D.

[00101] Método Cromatográfico de Análise:

[00102] Fase estacionária: Phenomenex Kinetex C-18, 150 x 4,6, 2,6 μm; Temp. da Coluna: 55°C;

[00103] Volume de injeção é de 10 μl.

[00104] Fase móvel (MPA e MPB; taxa de fluxo: 0,35 ml/min):

[00105] MPA: ácido fórmico a 0,1 % em água

[00106] MPB: ácido fórmico a 0,1 % em acetonitrila Tabela 2

Tabela 3

Ver também a Figura 4. 1TR - tempo de retenção.

[00107] Como é conhecido, o gradiente pode ser modificado para uma separação mais rápida (0 a 2 min 80 % MPA, 20 % MPB; 2 a 35 min de 80 a 0 % MPA, de 20 % a 100 % MPB, 35,01 a 40 min 80 % MPA, 20 % MPB. A taxa de fluxo 0,35 ml/min; volume de injeção: 5 μl), tal como para levar em conta a identificação por espectrometria de massa de gli- cosídeos de esteviol. Um exemplo é fornecido na Figura 5. Tabela 4

Integração do Método Analítico para o Desenvolvimento Agrícola

[00108] Desenvolveram uma estratégia para a otimização da sele ção de progênie de reprodução particular de plantas de Stevia com base no teor de glicosídeo de esteviol. É bem conhecido historicamen te que a Stevia nativa continha predominantemente Esteviosídeo como o principal glicosídeo de esteviol, mas a reprodução seletiva tem favo recido o desenvolvimento da progênie em que o Rebaudiosídeo A pre domina. Aplicamos nossa nova análise para permitir a identificação de progênie de reprodução que favorece ainda mais o Rebaudiosídeo D ou outros glicosídeos de esteviol desejáveis com peso molecular (Pe so Mol.) igual ou maior do que a do Rebaudiosídeo A (Peso Mol. 966 g/mol), de forma especial os Rebaudiosídeos I, O, M, N, entre outros, que podem ser posteriormente observados de ocorrer em nova progê- nie de reprodução.

SEPARAÇÃO DOS GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL DESEJÁVEIS SEM CRISTALIZAÇÃO

[00109] Tem ainda desenvolvido o discernimento obtido a partir da separação analítica de glicosídeos de esteviol em um novo processo que evita a necessidade de isolar e purificar um único componente (ti picamente Rebaudiosídeo A) através da cristalização. Ainda desenvol- vemos um sistema de solventes que utiliza etanol de grau alimentar (álcool de cereais) e água para separar os glicosídeos de esteviol de interesse sem a necessidade de cristalização.

Exemplo:

[00110] Um extrato bruto foi preparado por submeter 208,6 g de fo lhas secas à extração com água quente (3 L) durante 2 h a 95°C. O extrato foi concentrado sob vácuo a menos do que 40°C, clarificado por centrifugação, decantado, esfriado e secado através da liofilização para produzir 76,5 g de extrato bruto seco. Uma parte do extrato bruto (100 g, contendo cerca de 1,7 g de sólidos) foi diretamente fracionada em uma coluna de fase reversa em escala preparativa (RediSep C18, 360 g) utilizando um gradiente de água etanol conforme abaixo: Tabela 5

[00111] O ponto de eluição foi previamente marcado com amostras autênticas de Rebaudiosídeos A e D como estando dentro da faixa de 25 a 30 minutos e frações foram coletadas em intervalos regulares de um modo geral sobre esta faixa, reunidas e secadas com base na composição de HPLC. Um total de 628 mg de glicosídeos de esteviol foi recuperado. Dessa amostra 18 mg foram recuperados compreen dendo cerca de 23 % de Rebaudiosídeo D, 21 % de Rebaudiosídeos N e M, 1,4% de glicosídeos de esteviol descaracterizados, 2 % de Re- baudiosídeo A e ao redor de 16 % de outros glicosídeos de esteviol conhecidos. O sólido tinha uma aparência esbranquiçada a bege e ti- nha um sabor doce limpo. O produto é adequado para uso como um agente adoçante sem outro processamento ou purificação.

Exemplo:

[00112] Um extrato bruto foi preparado por submeter 208,6 g de fo lhas secas à extração com água quente (3 L) durante 2 h a 95 °C. O extrato foi concentrado sob vácuo a menos do que 40 °C, clarificado por centrifugação, decantado, esfriado e secado por liofilização para produzir 76,5 g de extrato bruto seco. Uma parte do extrato bruto (100 g, contendo ao redor de 1,7 g de sólidos) foi diretamente fracionada em uma coluna de fase reversa em escala preparativa (RediSep C18, 360 g) utilizando um gradiente de água etanol conforme abaixo: Tabela 6

Tabela 7

[00113] O ponto de eluição foi previamente marcado com amostras autênticas de Rebaudiosídeos A e D como estando dentro da faixa de aproximadamente 25 a 30 minutos e as frações foram coletadas em intervalos regulares de um modo geral sobre esta faixa, reunidas e se- cadas com base na composição de HPLC. Um total de 628 mg de gli- cosídeos de esteviol foi recuperado. A partir desta amostra, 18 mg fo ram recuperados, compreendendo cerca de 23 % de Rebaudiosídeo D, 21 % de Rebaudiosídeos N e M, 1,4 % de glicosídeos de esteviol não caracterizados, 2 % de Rebaudiosídeo A e ao redor de 16 % de vários outros glicosídeos de esteviol conhecidos presentes em peque nas quantidades. O sólido tinha uma aparência esbranquiçada a cas tanho claro e tinha um sabor doce limpo. O produto é adequado para uso como um agente adoçante, sem mais processamento ou purifica ção.

[00114] Os glicosídeos de esteviol obtidos de acordo com esta in venção podem ser incorporados como um adoçante natural de alta in tensidade em gêneros alimentícios, bebidas, composições farmacêuti cas,cosméticos, gomas de mascar, produtos de mesa, cereais, laticí nios, cremes dentais e outras composições para a cavidade oral, etc. Os exemplos acima mostram as proporções representativas que po dem ser empregadas.

[00115] Além disso, os glicosídeos de esteviol podem ser utilizados como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios, e outros produtos destinados para o consumo humano, mas também em ração animal com características melhoradas.

[00116] Durante a fabricação dos gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, gomas de mascar, os métodos convencionais tais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, aspersão, atomiza- ção, infusão e outros métodos podem ser utilizados.

[00117] O adoçante obtido nesta invenção pode ser utilizado nas formas secas ou líquidas. Ele pode ser adicionado antes ou após o tratamento térmico de produtos alimentares. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. Ele pode ser adicionado isoladamente ou em combinação com outros compostos. Tabela 8 - apresenta a estrutura química de esteviol e dos glico- sídeos de esteviol presentes nas folhas de Stevia rebaudiana Ber- toni. Patente U.S. 30 de outubro de 2012 folha 1 de 11 US8.299.224 B2

Tabela 9 Estruturas propostas e suas porcentagens relativas dos glicosídeos de esteviol das folhas de S. rebaudiana Morita e S. rebaudiana Bertoni.

* De Ohta et al. (2010). 1Quantidades relativas são expressas em por- centagem das áreas máximas totais detectadas na base de sua absor- vência de UV em 210 nm por Amida-SO/HPLC. A relação de SG16-I e SG16-II foi obtida pelas intensidades relativas dos íons do produto em m/z 787 e 803, respectivamente, através da voltagem CID de 60 V em análise ESI-MS/MS como o íon precursor [M - H] em m/z 1111. 2As estruturas foram propostas com base nos resultados sobre a mobilida de de HPLC e ESI-MS e análises MS/MS. 3Não detectado. 4Nomes foram propostos neste estudo.

Claims (8)

1. Processo para a produção de uma combinação glicosí- deos de esteviol, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair folhas secas de Stevia com água quente a uma temperatura de 95° C; (b) clarificar o extrato bruto por centrifugação ou filtração; e (c) separar uma combinação de dois ou mais glicosídeos de esteviol através da cromatografia contínua, em que a cromatografia contínua é realizada utilizando eluição de gradiente de dois ou mais solventes; em que os dois ou mais solventes inclui água e etanol, em que um gradiente é usado a partir de 1: 0, passando para 0:1 e, final mente, 1:1 de água para etanol usando uma fase estacionária de fase reversa C-18; em que a combinação resultante de glicosídeos de esteviol compreende menos de 25% de rebaudiosídeo A em peso, e compre ende ainda rebaudiosídeo D, N e M em uma proporção de 1: 1 de Re- baudiosídeo D para Rebaudiosídeo N e M; e em que o processo evita a necessidade de cristalização.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que a clarificação é executada por centrifugação.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que a clarificação é executada por filtração.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do pelo fato de que a filtração é com uma membrana semipermeável.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que a separação é executada através de um gradiente de água e etanol em temperaturas entre 20° C e 90° C.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que a separação é executada através de um gradiente de água e etanol em temperaturas entre 30° C e 60° C.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que o projeto fractal é empregado.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo fato de que o conjunto de válvulas de remoção múltiplo é em pregado.

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