CN108558966A - 一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷d的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，包括以下步骤：(1)、将甜菊叶粉碎，用水或有机溶剂浸提，获得甜菊糖苷粗品；(2)、通过大孔树脂分离出RA\STV\RC，得到莱鲍迪苷D含量为5～30％的粗提液；(3)、将粗提液泵入制备色谱系统，柱内填料为10μm～50μm的反相球形硅胶，上样量为3％～20％，柱内流动相为质量浓度5％～95％且具有可调梯度的有机溶剂水溶液，进行梯度洗脱。本发明采用粗提取后的RD粗品来一次制备含量较高的RD，省略了多步重结晶过程，所用溶剂量少，全封闭体系，操作更安全，且分离纯化过程可在线实时监测，大大提高了生产效率，RD一次提纯纯度大于70％，收率大于70％。

Description

一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，涉及甜菊糖中莱鲍迪苷D的富集方法。
背景技术
为蔗糖的200～350倍，热量仅相当于蔗糖的1/300。甜菊糖苷是由10种四环二萜类物质组成的混合物，其中含量最多的是甜菊苷(STV)，大约占总糖苷的70％，其次是莱鲍迪苷A(RA)，大约占15％～20％，再次是莱鲍迪苷C(RC)，含量大约是5％，其余几种莱鲍迪苷B(RB)、莱鲍迪苷D(RD)等物质的含量都非常低。
RA是目前使用最广泛的甜菊苷类甜味剂，但RA具有后苦味，与RA产品相比，RD具有更好的糖状和更好的味道，基本消除了后味。经过应用对照试验，RA产品中即使增加15％的RD，其口感就得到了明显改善，完全改变了人们对甜菊糖传统的甜味观念，但由于RD在甜菊苷中的含量极低，通常以2％或更低的含量存在，因此较高纯度的RD提取步骤比较繁琐，目前只能通过多次重结晶得到较高纯度的RD产品，提纯过程费时、费溶剂，生产效率较低。
发明内容
为解决现有技术存在的RD纯化步骤繁琐，时间成本高的缺陷，本发明提供一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法。
一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，包括以下步骤:
(1)、将甜菊叶粉碎，用水浸提，固液分离后在滤液中加入絮凝剂，静置过滤，获得甜菊糖苷粗品；
(2)、通过大孔树脂分离出甜菊苷、莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷C，得到莱鲍迪苷D含量为5～30％的粗提液；
(3)、将粗提液泵入制备色谱系统，柱内填料为10μm～50μm的反相球形硅胶，上样量为3％～20％，柱内流动相为质量浓度5％～95％且具有可调梯度的有机溶剂水溶液，先控制有机溶剂水溶液的初始梯度为1:9～2:8，流速为1ml/min，洗脱10min～20min，而后调整有机溶剂水溶液的梯度为3:7～8:2，继续洗脱至40min～50min，之后调整有机溶剂水溶液的梯度为6:4～7:3，继续洗脱至50min～60min，最后，调整流动相有机溶比例为100％，继续冲洗柱子10-20min；调整紫外光度检测器的检测波长为210nm，自流动相开始流动起对制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，得到纯度大于70％的莱鲍迪苷D。
进一步的，步骤(3)中的反相球形硅胶的粒径为10μm、22μm或50μm的正十八烷基反相硅胶粒。
进一步的，步骤(1)和步骤(3)中柱内流动相的有机溶剂为甲醇、乙醇或食品级乙醇中的任意一种或几种。
进一步的，步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为1:9～5:5的乙醇水溶液。
进一步的，步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为2:8～7:3的乙腈水溶液。
进一步的，包括以下步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为2:8～6:4的甲醇水溶液。
有益效果：
本发明直接采用粗提取后的RD粗品来富集得到含量较高的RD，简化了多步重结晶过程，所用溶剂量少，廉价、安全，全封闭体系，操作更安全，且分离纯化过程可在线实时监测，大大提高了生产效率。高效液相色谱最终测定显示，RD一次提纯纯度大于70％，收率大于70％。
附图说明
图1是RD粗品(原料)的高效液相色谱图。
图2是用填充了10μm正十八烷基反相硅胶填料动态轴向压缩柱分离纯化RD的制备色谱图谱。
图3是一次分离纯化后得到的RD溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明鉴于背景技术中公开的针对RD粗品现有精制过程中所存在的工艺繁琐，纯度不高等问题，创新提出了富集RD的方法。该方法可以直接采用粗提取后的RD粗品来富集RD，简化了传统制备RD所需的多次重结晶步骤，所用溶剂廉价、安全，且分离纯化过程可在线实时监测。
从本发明制备方法的概述来看，其包括RD粗品的制备，利用RD粗品配置溶液及采用高效液相色谱(HPLC)法优化和判断RD的最佳分离纯化条件，实现高效提取。
分步骤来看，步骤I：用水或有机溶剂或两者的混合溶剂在加热、微波、超声等任一种辅助作用下对甜菊叶进行浸提，固液分离后得到甜菊糖苷提取液，而后采用大孔树脂富集的方法，获得甜菊糖苷总苷质量含量5％～30％的甜菊糖苷粗品，其高效液相色谱测定图谱如图1所示。
步骤Ⅱ、用水将RD粗品配置成溶液。
步骤Ⅲ、将甜菊糖苷溶液泵入制备色谱系统，柱内填料为10μm～50μm的反相球形硅胶，上样量为3％～20％，柱内流动相为质量浓度5％～95％且具有可调梯度的有机溶剂水溶液，先控制有机溶剂水溶液的初始梯度为1:9～2:8，流速为1ml/min，洗脱10min～20min，而后调整有机溶剂水溶液的梯度为3:7～8:2，继续洗脱至40min～50min，之后调整有机溶剂水溶液的梯度为6:4～7:3，继续洗脱至50min～60min，最后，调整流动相有机溶比例为100％，继续冲洗柱子10-20min。调整紫外光度检测器的检测波长为210nm，自流动相开始流动起对制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，得到纯度大于70％的RD。
在上述笼统的原理性技术方案指导下，其较为具体或现实的优选实施过程可以是：由于RD粗品的制备为本领域的常规技术手段，在本发明的后续工艺步骤中几乎没有差别，故在该优选实施例及后述的若干实施例中，步骤I的描述将被省略。在完成RD粗品的准备后，配置10g/L的RD粗提液。而后将该RD粗提液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统中。这里柱尺寸为Φ50mm×250mm，而柱内填料为10μm的正十八烷基反相硅胶粒，上样量为6g/100ml，柱内流动相为食品级乙醇与水的混合溶液，初始梯度范围为1:9～2:8。出于食品安全考虑，故优选食品级乙醇。控制流速为100ml/min，洗脱时间10min；之后将上述有机溶剂水溶液的比例调整为4:6，继续洗脱至45min；之后再将有机溶剂水溶液的比例调整为7:3；洗后将有机溶剂比例调整为100％，以此结束一个分离周期。在洗脱的过程中，调整紫外光度检测器的检测波长为203nm，对动态轴向压缩柱制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，根据色谱峰出现对应的时间收集在17min～45min的洗脱液，如图2所示，得到的馏出液经HPLC分析，RD纯度达78.2％。
为更充分地展示本发明制备方法的可变实施方式和高效适用性，以下通过更多实施例对本发明作更详细的说明。
实施例1——在完成RD粗品的准备后，配置10g/L的RD溶液。而后将该RD溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统中。这里柱尺寸为Φ50mm×250mm，而柱内填料为10μm的正十八烷基反相硅胶粒，上样量为6g/100ml，柱内流动相为食品级乙醇与水的混合溶液，初始比例为1:9。出于食品安全考虑，故优选食品级乙醇。控制流速为100ml/min，洗脱时间10min；之后将上述有机溶剂水溶液的比例调整为3:7，继续洗脱至45min；之后再将有机溶剂水溶液的比例调整为6:4；洗后将有机溶剂比例调整为100％，以此结束一个分离周期。在洗脱的过程中，调整紫外光度检测器的检测波长为203nm，对动态轴向压缩柱制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，根据色谱峰出现对应的时间收集在21min～48min的洗脱液，得到的馏出液经HPLC分析，RD纯度达72.1％。
实施例2
在完成RD粗品的准备后，配置10g/L的RD粗提液。而后将该RD溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统中。这里柱尺寸为Φ50mm×250mm，而柱内填料为10μm的正十八烷基反相硅胶粒，上样量为3g/100ml，柱内流动相为食品级乙醇与水的混合溶液，初始比例为1:9。控制流速为100ml/min，洗脱时间10min；之后将上述有机溶剂水溶液的比例调整为3:7，继续洗脱至40min；之后再将有机溶剂水溶液的比例调整为8:2；洗后将有机溶剂比例调整为100％，以此结束一个分离周期。在洗脱的过程中，调整紫外光度检测器的检测波长为203nm，对动态轴向压缩柱制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，根据色谱峰出现对应的时间收集在23min～38min的洗脱液，得到的馏出液经HPLC分析，RD纯度达81.2％。
实施例3
除柱内填料采用22μm的正十八烷基反相硅胶粒，其余工艺均同实施例2，所得RD纯度为73.5％
实施例4
采用流动相为甲醇与水，初始比例为2:8，控制流速为100ml/min，洗脱时间10min；之后将上述有机溶剂水溶液的比例调整为4:6，洗脱至55min；再将有机溶剂水溶液的比例调整为8:2，洗脱至65min；最后将有机溶剂的比例调整为100％，洗脱至80min；其余工艺均同实施例2，所得RD纯度为83.4％。
以上诸多实施例介绍可见，通过本发明的制备方法，能够直接采用粗提取后的RD粗品来富集得到较高纯度的RD，省略了多步重结晶过程，所用溶剂量少，全封闭体系，操作更安全，且分离纯化过程可在线实时监测，大大提高了生产效率。高效液相色谱最终测定显示，RD一次提纯纯度大于70％，收率大于70％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)、将甜菊叶粉碎，用水或有机溶剂浸提，固液分离后在滤液中加入絮凝剂，静置过滤，获得甜菊糖苷粗品；
(2)、通过大孔树脂分离出甜菊苷、莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷C，得到莱鲍迪苷D含量为5～30％的粗提液；
(3)、将粗提液泵入制备色谱系统，柱内填料为10μm～50μm的反相球形硅胶，上样量为3％～20％，柱内流动相为质量浓度5％～95％且具有可调梯度的有机溶剂水溶液，先控制有机溶剂水溶液的初始梯度为1:9～2:8，流速为1ml/min，洗脱10min～20min，而后调整有机溶剂水溶液的梯度为3:7～8:2，继续洗脱至40min～50min，之后调整有机溶剂水溶液的梯度为6:4～7:3，继续洗脱至50min～60min，最后，调整流动相有机溶比例为100％，继续冲洗柱子10-20min；调整紫外光度检测器的检测波长为210nm，自流动相开始流动起对制备色谱系统进行液相色谱检测，在线收集对应色谱峰的洗脱液，得到纯度大于70％的莱鲍迪苷D。
2.如权利要求1所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，包括以下步骤(3)中的反相球形硅胶的粒径为10μm、22μm或50μm的正十八烷基反相硅胶粒。
3.如权利要求1所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中的有机溶剂为甲醇、乙醇或食品级乙醇中的任意一种或几种。
4.如权利要求3所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为1:9～5:5的乙醇水溶液。
5.如权利要求3所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为2:8～7:3的乙腈水溶液。
6.如权利要求3所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，步骤(3)中柱内流动相为梯度范围为2:8～6:4的甲醇水溶液。
7.如权利要求3所述的富集甜菊糖中莱鲍迪苷D的生产方法，其特征在于，步骤(1)中在加热、微波或超声的辅助作用下对甜菊叶进行浸提。
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