CN111153843B

CN111153843B - 一种分离枸杞色素单体的方法

Info

Publication number: CN111153843B
Application number: CN202010025760.3A
Authority: CN
Inventors: 黄新异; 邸多隆; 巩媛
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111153843A

Abstract

本发明提供一种分离枸杞色素单体的方法，即分离枸杞中玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体的方法。通过本方法可以获得纯度大于85％的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体。本发明分离成本低，制备过程安全，通过将高速剪切快速提取技术和逆流色谱高效分离技术联用，采用逆流色谱分离两相溶剂作为高速剪切提取溶剂，在提取后直接过滤将提取液进入逆流色谱进行分离，省去中间的步骤，能够实现快速的从枸杞中分离制备纯度达到85％以上的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体。

Description

一种分离枸杞色素单体的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种分离枸杞色素单体的方法，即分离枸杞中玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体的方法。

背景技术

枸杞色素是从枸杞(Lycium Barbartum L.)的果实中提取分离的一种天然着色剂，主要用于食品和化妆品等领域，其主要成分是脂溶性的类胡萝卜素及其酯。其中玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯是枸杞色素中含量较高的三种色素单体。玉米黄质及其酯具有极强的抗氧化活性，它通过降低自由基单线态氧和光化学敏感剂的反应活性起到抗氧化作用，可以保护生物系统免受过氧化过程的伤害。同时，玉米黄质及其酯还具有预防黄斑衰退、治疗白内障、预防心血管疾病、增强免疫力、减缓动脉粥样硬化等功效。而在食品工业领域中，玉米黄质及其酯作为天然食用色素也得到越来越广泛的应用。

枸杞中含有丰富的以玉米黄质及其酯为主的枸杞色素，当前，从枸杞中提取枸杞色素主要有传统的溶剂萃取法、超临界CO₂萃取法、亚临界提取法等。大部分都采用先提取出含有玉米黄质及其酯的混合油脂，再通过对油脂的皂化、分离、纯化等方法制得色素混合物或者单体，提取分离时间过长，步骤繁琐，制备过程中损失较大。

如发明名称“一种提取枸杞中的玉米黄质及其衍生物的方法”(申请号201610768879.3，公布号CN106349136B)的中国发明专利公布了一种枸杞中玉米黄质及其衍生物的制备方法，将枸杞降糖后烘干粉碎，采用超临界方法萃取，然后收集0.6h～3h的萃取物，可以得到玉米黄质及其酯的提取物，纯度达到80％以上。但是该方法得到的是玉米黄质及其酯的混合物，并且采用超临界萃取的方法，生产成本较高。

发明名称“一种枸杞色素提取物及其制备方法”(申请号：201510711042.0，公布号CN 105232774A)的中国发明专利公布了一种枸杞色素提取物及其制备方法，将清洗干净的枸杞干燥后超微粉碎，然后采用超临界CO₂萃取的方法得到色素粗提取物；将粗提取物离心初步分离，得到浓稠状色素膏和上清液；将浓稠状膏状枸杞色素提取物加入活性炭吸附色素，然后解吸附；解吸液微波真空干燥得到枸杞色素。该方法得到的是玉米黄质及其酯的混合物，并且步骤较多，采用超临界萃取的方法，生产成本较高。

发明名称“制造含有玉米黄质和/或其酯的萃取物的方法”(申请号201280070228.7，公布号CN 104136035B)的中国发明专利公布了一种枸杞中玉米黄质和/或其酯的萃取物的制备方法。采用亲脂性溶剂萃取干燥的枸杞子果皮，获得玉米黄质含量约4％～15％的油性树脂；然后采用乙醇或者乙醇和水的混合溶剂结晶纯化，可以提高萃取物中的玉米黄质及其酯的含量。但是该方法获得的仅为玉米黄质及其酯的混合物，无法获得单一的色素单体。

发明“枸杞中提取玉米黄质为主的类胡萝卜素单体色素的方法”(申请号201610930302.8，公布号CN 106543769A)的中国发明专利公布了一种提取枸杞中玉米黄质为主的类胡萝卜素单体色素的方法。首先将枸杞粉碎后用添加了KOH的乙醇溶液皂化提取，提取过程中需要加热搅拌并超声；提取液用酸液调整pH值至6.8～7.2，然后静置8h～12h后离心或抽滤；将清液减压浓缩干燥后得到枸杞色素粗提取物；将枸杞色素粗提取物首先用20％～40％的乙醇制成混悬溶液后离心或抽滤，清液再减压浓缩的固形物；固形物再分别用四氢呋喃-水和非极性溶剂重结晶精制后得到纯度较高的玉米黄质单体。该方法虽然能得到含量85％～95％的玉米黄质提取物，但是仅能得到玉米黄质一个单体，并且步骤繁琐，需要使用多种溶剂反复处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离枸杞色素单体的方法，即分离枸杞中玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体的方法。本发明方法以枸杞为原料，无需经过提取液的浓缩，也不需要反复的精制和纯化，减少了中间处理的时间和步骤，在获得的高纯度枸杞色素单体的基础上降低生产成本，缩短分离时间，从而解决现有技术中存在的问题。

本发明所提供的分离枸杞色素单体的方法，包括如下的步骤

步骤A：将枸杞果实粉碎并过20目筛，得到的枸杞粉末颗粒；

步骤B：将正己烷、二氯甲烷、乙腈按照体积比1～10:1～10:1～10的比例混合作为分离溶剂系统，振摇后静置分层，将上、下相分开后分别作为逆流色谱分离的固定相和流动相。

步骤C：将步骤A粉碎的枸杞样品，选用步骤B中上相作为提取溶剂，采用高速剪切进行提取，其中料液比1:4～1:12，剪切时间3min～10min，剪切转速7000rpm～17000rpm；剪切提取液过滤后直接进逆流色谱进行分离；

步骤D：以步骤B中配制的两相溶剂系统的上相和下相分别作为固定相和流动相；在逆流色谱仪中泵入固定相，流速5mL/min～100mL/min；待固定相充满逆流色谱仪的分离柱后，开动逆流色谱仪主机，转速设为300rpm～2000rpm；待逆流色谱仪转速达到设定转速后，开始向其中泵入流动相，流速0.5mL/min～50mL/min，检测波长设为450nm；待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将步骤C中过滤后枸杞提取液直接注入逆流色谱仪，持续泵入流动相进行分离，流动相流速0.5mL/min～50mL/min；据逆流色谱检测器采集的图谱，待玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被洗脱出来后，将流动相换为固定相继续洗脱，流速不变，开始挤出过程，继续收集玉米黄质双棕榈酸酯的馏分。

步骤E：将步骤D中收集到的不同枸杞色素单体的馏分分别减压浓缩，减压浓缩选用真空浓缩装置或者减压旋转蒸发装置，浓缩倍率10倍～20倍，压力为-0.06Mpa～-0.08Mpa，温度为30℃～50℃；浓缩残余物进行真空干燥或者冷冻干燥，真空干燥的温度为50℃～55℃，压力为-0.06Mpa～-0.08Mpa，干燥时间6h～10h；冷冻干燥温度为-70℃～-50℃，压力5Pa～100Pa，干燥时间为10h～24h；干燥后得到枸杞色素单体。

本发明具有如下效果：

1)方法独特：本发明提供的方法采用高速剪切技术处理粉碎的枸杞，处理条件为料液比1:4～1:12，剪切时间3min～10min，剪切转速7000rpm～17000rpm。然后将枸杞提取液直接进入逆流色谱仪进行分离，在逆流色谱分离中以上相作为固定相，下相作为流动相。固定相流速流速5mL/min～100mL/min，转速300rpm～2000rpm；流动相流速0.5mL/min～50mL/min，检测波长450nm；根据逆流色谱仪检测器采集色谱峰分别收集馏分后回收溶剂，得到玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体。采用液相色谱法测定三种枸杞色素单体纯度达到85％以上。

2)提取过程快速，高效：本发明采用高速剪切提取枸杞色素，提取液过滤后直接进入逆流色谱进行分离，最终获得枸杞色素单体，制备工艺简单，易于实施；并且提取和分离时间短、提取率高、溶剂残留小。是一种高效快捷的从枸杞中分离提取玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种枸杞色素单体的方法。

附图说明

图1为高速剪切联用逆流色谱分离示意图；

图2为逆流色谱分离色谱图，其中1为玉米黄质；2为玉米黄质单棕榈酸酯；3.为玉米黄质双棕榈酸酯。分离条件：半制备型逆流色谱仪，柱体积134mL，流动相流速2mL/min，转速650rpm，检测波长450nm；

图3为HPLC测定样品及三种枸杞色素单体的色谱图，其中A为样品HPLC色谱图，B为分离得到的三个枸杞色素单体HPLC色谱图，其中1为玉米黄质；2为玉米黄质单棕榈酸酯；3为玉米黄质双棕榈酸酯。检测条件：YMC C₃₀色谱柱(150×4.6mm，5μm)，或其他等效色谱柱；流动相：A：甲醇-甲基叔丁基醚-水(92:4:4，v/v)，B：甲醇-甲基叔丁基醚-水(90:6:4,v/v)；梯度洗脱：0min～20min，10％～75％B，20min～30min，75％B；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是，本发明的保护范围并不只限于实施例所覆盖的范围，而是由权利要求加以限定。

本发明实施例中所使用的分离设备逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可以选择分析型、半制备型和制备型逆流色谱仪。

实施例1：具体的提取方法

A、粉碎

将枸杞果实粉碎并过20目筛，得到的枸杞粉末颗粒。

B、分离溶剂系统的选择：

在逆流色谱分离过程中，用于分离的两相溶剂系统的选择是一个非常重要的步骤。通常是将不同溶剂混合后，根据目标化合物在所形成的两相溶剂系统中上相和下相之间分配系数来选择合适的溶剂系统。本发明比较了玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯在不同溶剂组成的两相溶剂系统中的分配系数，一些溶剂系统筛选结果如下：

溶剂系统(v/v)	K<sub>1</sub>	K<sub>2</sub>	K<sub>3</sub>
				正己烷-二氯甲烷-乙腈(10:3.5:6.5)	0.26	1.59	20.11
正己烷-二氯甲烷-乙腈(10:4:6.5)	0.45	1.33	4.66
				正己烷-甲醇(6:4)	0.11	2.50	51.20
正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(8:2:9:1)	-	1.94	3.90
				正己烷-乙醇-水(10:10:1)	0.25	2.42	8.90

注：-表示在上相中没有检测到。K的计算方法为样品在上相中溶解的量/下相中溶解的量。

表中，K₁、K₂和K₃分别是玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯在相应两相溶剂系统中上相和下相之间的分配系数。由于分配系数较大，样品分离时间较长；分配系数较小，样品会很快被洗脱出来，分离度较差，纯度较低。因此选择正己烷、二氯甲烷和乙腈组成的两相溶剂系统分离枸杞中的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯单体。

将正己烷、二氯甲烷、乙腈按照体积比10:4:6.5的比例混合，剧烈振摇后静置分层，将上、下相分开后分别作为逆流色谱分离的固定相和流动相。

C、枸杞色素的提取

称取1.5g步骤A粉碎的枸杞样品，加入步骤B中上相溶剂6mL作为提取溶剂，采用高速剪切进行提取，剪切时间5min，剪切转速15000rpm。提取液过滤后直接进逆流色谱进行分离。

D、逆流色谱分离

以步骤B中配制的溶剂系统上相作为固定相，下相作为流动相。使用一台半制备型逆流色谱仪，柱体积134mL。首先在逆流色谱仪中泵入固定相(上相)，流速10mL/min；待固定相充满逆流色谱仪的分离柱后，开动逆流色谱仪主机，转速设为650rpm；待逆流色谱仪转速达到设定转速后，开始向其中泵入流动相(下相)，流速2mL/min，检测波长设为450nm。待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将步骤C中过滤后高速剪切提取液注入，进样体积6mL，然后继续泵入流动相进行分离，流动相流速2mL/min。据逆流色谱检测器采集的图谱，待玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被洗脱出来后，在第95min将流动相换为上相继续洗脱，流速仍然为2mL/min，继续收集玉米黄质双棕榈酸酯的馏分。

E、浓缩干燥

将步骤D中收集到的不同枸杞色素单体的馏分减压旋转蒸发回收溶剂，浓缩倍率15倍，压力为-0.08Mpa，温度为40℃。浓缩残余物进行真空干燥，真空干燥温度为50℃，压力为-0.08Mpa，干燥时间8h，干燥后分别得到玉米黄质2.1mg、玉米黄质单棕榈酸酯3.5mg和玉米黄质双棕榈酸酯10.8mg，得率分别为0.140％、0.233％和0.720％。经HPLC检测，纯度分别为89％，90％和93％。

实施例2：

A、粉碎

将枸杞果实粉碎并过20目筛，得到的枸杞粉末颗粒。

B、分离溶剂系统的选择：

将正己烷、二氯甲烷、乙腈按照体积比9:3.5:6的比例混合，剧烈振摇后静置分层，将上、下相分开后分别作为逆流色谱分离的固定相和流动相。

C、枸杞色素的提取

称取10g步骤A粉碎的枸杞样品，加入步骤B中上相溶剂50mL作为提取溶剂，采用高速剪切进行提取，剪切时间8min，剪切转速16000rpm。提取液过滤后直接进逆流色谱进行分离。

D、逆流色谱分离

以步骤B中配制的溶剂系统上相作为固定相，下相作为流动相。使用一台制备型逆流色谱，柱体积980mL。首先在逆流色谱仪中泵入固定相，流速100mL/min；待固定相充满逆流色谱仪的分离柱后，开动逆流色谱仪主机，转速设为400rpm；待逆流色谱仪转速达到设定转速后，开始向其中泵入流动相，流速10mL/min，检测波长设为450nm。待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将步骤C中过滤后高速剪切提取液注入，进样体积50mL，然后继续泵入流动相进行分离，流动相流速10mL/min。据逆流色谱检测器采集的图谱，待玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被洗脱出来后，在第135min将流动相换为上相继续洗脱，流速仍然为10mL/min，继续收集玉米黄质双棕榈酸酯的馏分。

E、浓缩干燥

将收集到的不同枸杞色素单体的馏分减压旋转蒸发回收溶剂，浓缩倍率20倍，压力为-0.08Mpa，温度为45℃。浓缩残余物进行冷冻干燥，冷冻干燥温度为-50℃，压力为50Pa，干燥时间20h，干燥后分别得到玉米黄质13.6mg、玉米黄质单棕榈酸酯22.7mg和玉米黄质双棕榈酸酯72.5mg，得率分别为0.136％、0.227％和0.725％。经HPLC检测，纯度分别为88％，90％和92％。

Claims

1.一种分离枸杞色素单体的方法，所述的枸杞色素单体为玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯；其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

步骤A：将枸杞果实粉碎得到的枸杞粉末颗粒；

步骤B：将正己烷、二氯甲烷、乙腈混合作为分离溶剂系统，振摇后静置分层，将上、下相分开后分别作为逆流色谱分离的固定相和流动相；

所述的正己烷、二氯甲烷、乙腈的体积比为1～10:1～10:1～10；

步骤C：将步骤A粉碎的枸杞样品，选用步骤B中上相作为提取溶剂，采用高速剪切进行提取，剪切提取液过滤后直接进逆流色谱进行分离；

步骤D：以步骤B中配制的两相溶剂系统的上相和下相分别作为固定相和流动相；在逆流色谱仪中泵入固定相，流速5mL/min～100mL/min；待固定相充满逆流色谱仪的分离柱后，开动逆流色谱仪主机，转速设为300rpm～2000rpm；待逆流色谱仪转速达到设定转速后，开始向其中泵入流动相，流速0.5mL/min～50mL/min，检测波长设为450nm；待两相在分离柱中达到动态平衡后，通过进样阀将步骤C中过滤后枸杞提取液直接注入逆流色谱仪，持续泵入流动相进行分离，流动相流速0.5mL/min～50mL/min；据逆流色谱检测器采集的图谱，待玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被洗脱出来后，将流动相换为固定相继续洗脱，流速不变，开始挤出过程，继续收集玉米黄质双棕榈酸酯的馏分；

步骤E：将步骤D中收集到的不同枸杞色素单体的馏分分别减压浓缩，浓缩残余物进行真空干燥或者冷冻干燥，干燥后得到枸杞色素单体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A中，是将枸杞果实粉碎，过20目筛得到枸杞粉末颗粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤C中，高速剪切提取的条件如下：料液比1:4～1:12，剪切时间3min～10min，剪切转速7000rpm～17000rpm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤E中,减压浓缩选用真空浓缩装置或者减压旋转蒸发装置，浓缩倍率10倍～20倍，压力为-0.06Mpa～-0.08Mpa，温度为30℃～50℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤E中,真空干燥的温度为50℃～55℃，压力为-0.06Mpa～-0.08Mpa，干燥时间6h～10h；冷冻干燥温度为-70℃～-50℃，压力5Pa～100Pa，干燥时间为10h～24h。