CN104447470A

CN104447470A - 一种枸杞叶黄素hsccc分离制备方法

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Publication number: CN104447470A
Application number: CN201410819646.2A
Authority: CN
Inventors: 刘兰英; 曹有龙; 石志刚; 安巍
Original assignee: Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN104447470B

Abstract

本发明公开了一种枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，主要包括如下步骤：枸杞果破碎提取、提取液浓缩、皂化、洗脱溶解、HSCCC分离，得到枸杞叶黄素溶液，再经浓缩、冷冻干燥，得到叶黄素纯品，经HPLC分析检测纯度达90.6％以上。本发明采用甲醇与四氢呋喃复合溶剂超声波提取，结合皂化工艺，并与HSCCC协同作用，成功解决了枸杞中主要类胡萝卜素叶黄素和玉米黄素属同分异构体，分离困难的问题。利用秋果枸杞作为原料，大大降低了生产成本，通过在逆流色谱分离纯化阶段，反复调整溶剂比例，成功实现了叶黄素和玉米黄素的有效分离，获得了较高纯度的叶黄素单体，为实现从枸杞中分离提纯叶黄素，实现工业化生产提供了新的思路。

Description

一种枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法

技术领域

本发明属于分离提纯技术领域，特别涉及一种枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法。

背景技术

高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography,简称HSCCC)是一种能实现连续有效的分配分离功能的液—液分配技术，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。HSCCC技术自发明以来，由于其独特的分离优势，得到了不断的推广和发展，目前已被广泛应用在中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成等领域。目前，我国应用HSCCC技术在天然药物有效成分的分离纯化方面处于国际领先地位。世界上许多国家，尤其是墨西哥和西班牙早在60年代就开展了万寿菊植物中天然叶黄素资源的专项研究，我国叶黄素的应用尚处于研究开发阶段，目前国内外叶黄素加工主要以万寿菊和金盏菊花瓣为原料，采用有机溶剂提取、树脂皂化、精制、重结晶制备。

申请号02100125.1的中国发明《叶黄素的分离制备方法》涉及一种用高速逆流色谱法从万寿菊粗提物中分离制备出高纯度单体叶黄素的方法。其特点是所用的溶剂可为正构、烷烃、卤代烃、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚类、水等溶剂，其溶剂的两相组合可由其中的三个、四个或二个组分构成，其适用于对各种途径获得的万寿菊花粗提物提纯，纯度可达到98％以上，用各种型号的逆流色谱仪分离制备叶黄素单体，能直接进大量粗品或合成混合物，分离效果能达到很高的纯度。

枸杞是我国重要的“药食同源”功能性特色植物资源，传统医学认为枸杞具有“滋肝明目，清肺补肾”之功效，枸杞富含类胡萝卜素，其中速冻枸杞叶黄素含量达65mg/100g，居世界水果之首。叶黄素在延缓人体衰老、预防视网膜黄斑退化、抑制癌症、抗心脑血管疾病等方面有显著功效。叶黄素是人眼视网膜黄斑色素的主要组成部分，流行病学研究表明，经常食用富含类胡萝卜素尤其是含叶黄素和玉米黄色素的食品，能够有效预防眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降。作为一种优良的叶黄素来源，枸杞的开发利用也正日益受到关注。但是，作为中药材的枸杞果实价格昂贵，导致从枸杞中分离制备叶黄素生产成本十分高昂，限制了从枸杞中分离提纯叶黄素的研究和应用，更重要的是，枸杞中不仅富含叶黄素，同时富含玉米黄素，而两者不易分离，传统采用的柱色谱法和HPLC法制备量小，难以实现大规模工业化生产，没有实际应用价值。如何降低生产成本，从枸杞中有效分离提纯叶黄素，是我们要解决的问题。而有关采用HSCCC技术从枸杞中分离叶黄素的研究未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，以枸杞为原料，采用HSCCC分离技术，分离制备叶黄素，所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法包括如下步骤：

枸杞果破碎提取、类胡萝卜素提取液浓缩、皂化、洗脱溶解、HSCCC分离得到枸杞叶黄素溶液，再经浓缩、冷冻干燥，得到叶黄素纯品，采用HPLC分析检测产品纯度。

所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法主要步骤如下：

(1)提取：称取枸杞鲜果，研磨后加入甲醇、四氢呋喃复合溶剂提取，料液比1:15，超声功率300w，超声提取30min，过滤得提取液，滤渣按以上操作再提取2次，合并提取液；

所述复合溶剂为体积比1：1的甲醇、四氢呋喃复合溶液，其中含有以混合溶液总体积计0.1％质量体积百分数的BHT。

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至提取液体积的四十分之一至四十五分之一，得粗浓缩物，加入粗浓缩物8-12倍体积的石油醚和5-8倍体积10％的NaCL水溶液于分液漏斗中，有机层用粗浓缩物8-10倍体积的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至与粗浓缩物同体积，得到浓缩物。

(3)皂化：加入浓缩物8-10倍10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化8-12h，得皂化液。

(4)洗脱溶解：加入浓缩物8-10倍体积的石油醚和5-8倍体积10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣按质量体积比1:50加入二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液。

(5)HSCCC分离：采用高速逆流色谱仪，选用体积比为4:3:1的正己烷-乙醇-水两相溶剂体系，流动相流速1mL/min，离心转速1800r/min，检测波长450nm，根据紫外谱图，接收目标成分。

(6)叶黄素HPLC检测：

采用Agilent 1260高效液相色谱系统，YMC-C30分析柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A相：质量体积百分比为0.1％的三乙胺甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为75:25；B相：体积比为70:5:25的丙酮/二氯甲烷/甲醇溶液；梯度洗脱程序：0min-5min，0％B-25％B；10-15min，50％-85％B，35-45min，100％B-0％B；流速1mL/min；检测波长450nm；柱温25℃，进样量25μL。

本发明通过以上技术手段成功地从枸杞原料中分离制备得到了叶黄素，产品经HPLC分析检测纯度达90.6％以上。

本发明优选秋果枸杞为原料。

有益效果：

1.采用超声波提取法，超声波的空化效应可强化萃取，加速萃取过程，且条件温和，耗能少。

2.提取溶剂的选择：选用甲醇与四氢呋喃复合溶剂提取，目标提取物叶黄素在四氢呋喃中的溶解度最大，为8000mg/L，而且所选用复合溶剂安全性较高。

3.皂化过程对提取效果有着至关重要的影响。枸杞中的叶黄素大部分以酯化形式存在，经过了有机溶剂萃取后，它们的存在形式并没有发生改变，因此，在进一步纯化前必须要经过皂化处理，将叶黄素还原为单体形式。皂化处理可以使枸杞鲜果中的酯化叶黄素最大限度释放出来，皂化完全的程度直接影响提取效果。时间短，皂化不完全，时间过长，部分叶黄素在碱性条件下会发生降解，反而会降低叶黄素的提取率。同时，KOH-甲醇溶液的质量浓度也影响着皂化效果，浓度过高会使叶黄素在强碱环境发生分解。本发明通过大量试验，研究了不同KOH-甲醇溶液浓度和皂化时间对提取效果的影响，最终确定最佳KOH-甲醇溶液浓度为10％，皂化时间为8-12h。本发明采用特定的提取、皂化工艺为HSCCC分离纯化奠定了基础，并与HSCCC协同作用，与未经皂化直接经HSCCC分离相比，枸杞果实中的叶黄素提取量提高了近4倍。具体见表1和表2。

4.叶黄素和玉米黄素是枸杞中的主要类胡萝卜素，由于两者属同分异构体，将两者成功的分离存在很大困难。本发明通过在逆流色谱分离纯化阶段，反复调整溶剂比例，成功实现了叶黄素和玉米黄素的有效分离。

5.秋果枸杞也即9月中旬-10月底采摘的枸杞果实，由于枸杞树前期消耗大量营养，果实表现为果形小，果皮厚，种子颗粒大，出汁率低，苦味和生药味加重，不适宜加工利用，因而价格低廉，干果每千克售价仅10-15元。发明人分析发现，秋果枸杞类胡萝卜素总量是夏果枸杞的75％-80％％，但其中叶黄素含量较夏果高5％-8％，作为制备叶黄素的原料非常适宜，扩大了资源的有效开发利用，又大大提升了枸杞的附加值。而且，制备叶黄素过程中产生的副产物枸杞籽是枸杞籽油的主要原料，可实现二次增值。本发明利用秋果枸杞作为制备叶黄素的原料，大大降低了生产成本，采用HSCCC技术，实现了叶黄素和玉米黄素的有效分离，成功的获得了较高纯度的叶黄素单体，为实现从枸杞中分离提纯叶黄素，实现工业化生产提供了新的思路。

表1：KOH-甲醇溶液质量浓度对叶黄素提取效果的影响单位：μg/100g

皂化液浓度	5％	8％	10％	15％	20％
						叶黄素含量	15.64	16.78	20.75	18.08	15.14

注：本实验皂化时间8h

表2：皂化时间对叶黄素提取效果的影响单位：μg/100g

皂化时间	未皂化	1h	2h	4h	8h	12h	16h
								叶黄素含量	6.39	6.78	10.40	12.08	24.42	19.57	15.10

具体实施方式

实施例1

枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法主要步骤如下：

(1)提取：称取枸杞鲜果10g，研磨后加入甲醇、四氢呋喃复合溶剂提取，料液比1:15，超声功率300w，超声提取30min，过滤得提取液，滤渣按以上操作再提取2次，合并提取液；

所述复合溶剂为体积比1：1的甲醇、四氢呋喃复合溶液，其中含有以混合溶液总体积计，0.1％质量体积百分数的BHT。

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至10mL，得粗浓缩物，加入100mL石油醚和50mL10％的NaCL水溶液于分液漏斗中，有机层用100mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至10mL，得到浓缩物。

(3)皂化：加入80mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化8h，得皂化液。

(4)洗脱溶解：加入100mL的石油醚和50mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液。

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离：

选取正己烷-乙醇-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按4:3:1的体积比将上述溶剂组分超声15min，配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器。取步骤(4)叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分。得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达93.6％。

实施例2

枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法主要步骤如下：

(1)提取：同实施例1；

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至11.25mL，得粗浓缩物，加入90mL石油醚和70mL10％的NaCL水溶液于分液漏斗中，有机层用90mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至11.25mL，得到浓缩物。

(3)皂化：加入112mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化10h，得皂化液。

(4)洗脱溶解：加入100mL的石油醚和70mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液。

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离同实施例1。得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达92.3％。

实施例3

枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法主要步骤如下：

(1)提取同实施例1；

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至10.5mL，得粗浓缩物，加入126mL石油醚和84mL10％的NaCL水溶液于分液漏斗中，有机层用105mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至10.5mL，得到浓缩物。

(3)皂化：加入84mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化12h，得皂化液。

(4)洗脱溶解：加入95mL的石油醚和65mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液。

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离同实施例1；得到黄色固体，其HPLC纯度达90.6％。

对比试验1：

选取甲醇-丙酮-乙腈-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按10:7:4.5:3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器。取实施例1制备得到的叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分。得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达80.3％。

对比试验2：

选取甲醇-甲基叔丁基醚-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按6：3：1体积比将上述溶剂组分超声15min，配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器。取实施例1制备得到的二氯甲烷溶解物1mL溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分。得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达81.6％。

由对比试验可知：选取正己烷-乙醇-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，较选取甲醇-丙酮-乙腈-水和甲醇-甲基叔丁基醚-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，制备得到的叶黄素纯度均有明显提高，这是由于对比试验1和对比试验2中溶剂甲醇极性较高，会增加叶黄素在固定相中的溶解难度，另外，甲基叔丁基醚有毒性，乙腈难以挥发，而选取正己烷-乙醇-水作为溶剂体系，克服了以上缺点。以上试验说明：溶剂的选取对枸杞中叶黄素的提取具有重要影响，选取体积比为4:3:1的正己烷-乙醇-水体系，采用HSCCC分离枸杞叶黄素提纯率更高。

Claims

1.一种枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，包括如下步骤：

所述复合溶剂为体积比1：1的甲醇、四氢呋喃复合溶液，其中含有以混合溶液总体积计0.1％质量体积百分数的BHT；

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至提取液体积的四十分之一至四十五分之一，得粗浓缩物，加入粗浓缩物8-12倍体积的石油醚和5-8倍体积10％的NaCl水溶液于分液漏斗中，有机层用粗浓缩物8-10倍体积的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至与粗浓缩物同体积，得到浓缩物；

(3)皂化：加入浓缩物8-10倍10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化8-12h，得皂化液；

(4)洗脱溶解：加入浓缩物8-10倍体积的石油醚和5-8倍体积10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣按质量体积比1:50加入二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液；

2.根据权利要求1所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，还包括叶黄素HPLC检测步骤：

3.根据权利要求1或2所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，其特征在于，所述枸杞鲜果为秋果枸杞。

4.根据权利要求1或2所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，包括如下步骤：

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至10mL，得粗浓缩物，加入100mL石油醚和50mL10％的NaCl水溶液于分液漏斗中，有机层用100mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至10mL，得到浓缩物；

(3)皂化：加入80mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化8h，得皂化液；

(4)洗脱溶解：加入100mL的石油醚和50mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液；

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离：

选取正己烷-乙醇-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按4:3:1的体积比将上述溶剂组分超声15min，配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层；待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相；采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器；取步骤(4)叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用；进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分，得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达93.6％。

5.根据权利要求1或2所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，包括如下步骤：

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至11.25mL，得粗浓缩物，加入90mL石油醚和70mL10％的NaCl水溶液于分液漏斗中，有机层用90mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至11.25mL，得到浓缩物；

(3)皂化：加入112mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化10h，得皂化液；

(4)所述洗脱溶解：加入100mL的石油醚和70mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液；

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离：

选取正己烷-乙醇-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按4:3:1的体积比将上述溶剂组分超声15min，配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层；待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相；采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器；取步骤(4)叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用；进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分，得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达92.3％。

6.根据权利要求1或2所述枸杞叶黄素HSCCC分离制备方法，包括如下步骤：

(2)浓缩：35℃条件下避光浓缩至10.5mL，得粗浓缩物，加入126mL石油醚和84mL10％的NaCl水溶液于分液漏斗中，有机层用105mL的纯水洗至无色，合并有机层，用无水硫酸钠脱水，浓缩至10.5mL，得到浓缩物；

(3)皂化：加入84mL10％KOH-甲醇溶液，充入N₂，避光条件下在室温皂化12h，得皂化液；

(4)洗脱溶解：加入95mL的石油醚和65mL10％的NaCl溶液，有机层用纯水洗至中性，避光浓缩蒸干，残渣用2mL二氯甲烷溶解，得叶黄素二氯甲烷溶液；

(5)枸杞叶黄素HSCCC分离：

选取正己烷-乙醇-水在半制备逆流色谱仪上分离纯化枸杞提取物中的叶黄素，按4:3:1的体积比将上述溶剂组分超声15min，配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层；待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相；采用半制备高速逆流色谱仪，配有CF-80泵，手动进样阀，柱容积为500mL，UV3000UV-vis紫外检测器，BSZ-100-LCD自动馏分收集器；取步骤(4)叶黄素二氯甲烷溶液1mL溶解于流动相中待用；进样前，先用固定相装满整个柱子，调整主机转速为1800rpm，仪器反转，以1.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系达到静态平衡后，进样，根据紫外谱图，接收目标成分，得到纯化的枸杞叶黄素，HPLC纯度达90.6％。

7.根据权利要求1-6任一所述枸杞叶黄素HSCCC分离方法制备得到的枸杞叶黄素。