CN112142636B - 一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，是将枸杞果实粉碎后经正己烷回流提取，提取液浓缩后得到枸杞色素粗浸膏；以正己烷、二氯甲烷、乙腈的混合溶剂作为逆流色谱分离的溶剂系统，在分液漏斗中静置分层后得到上相和下相；再分别以上相和下相作为固定相和流动相，通过基于二阶重叠重复进样的洗脱‑挤出高速逆流色谱的方法分离得到玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三个色素单体，且纯度均达到85%以上，三个单体化合物的得率分别在3.5%、5.0%、19.9%以上。本发明的制备方法具有进样量大、溶剂消耗少、制备量大等特点，可以实现枸杞中玉米黄质及其酯类色素单体的宏量制备。

Description

一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的 方法

技术领域

本发明涉及一种提取枸杞果实中类胡萝卜素的方法，尤其涉及一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体三类单体化合物的方法，属于天然产物分离方法领域。

背景技术

枸杞子作为枸杞 (Lycium barbarum.L) 的成熟果实，由于其含量丰富的活性成分被广泛用作功能性食品和膳食补充剂。除了作为中国传统中药外，现代药理学研究也再次证实了其拥有各种对人体健康有益的药理活性，例如抗氧化活性、延缓衰老、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、肝脏保护作用以及神经保护作用等等。因此，枸杞子也被称为是“药食同源”的植物果实。正是因为枸杞子在人类健康产业中发挥的日益增长的保健作用，学者们也对其植物化学方面进行了深入研究，发现其中含有各类不同的化学成分，包括多糖、酚类、类胡萝卜素、生物碱以及维生素等。

类胡萝卜素是枸杞子中一类主要的活性成分，它主要有减少氧化损伤、增强免疫调节、预防心血管疾病和某些类型的肿瘤、抑制眼部以及皮肤疾病等功效。玉米黄质及其酯类是枸杞中最具代表性的色素类化合物，其中玉米黄质双棕榈酸酯是枸杞色素中含量最高的。而玉米黄质和玉米黄质双棕榈酸酯具有预防老年黄斑性病变和紫外线辐射导致的退行性病变的主要功能。因此，枸杞色素在食品、药品以及化妆品等行业引起了广泛地关注。然而，枸杞中类胡萝卜素作为一种脂溶性的天然色素，因其特殊的化学结构和理化性质对提取和分离技术的选择具有一定的局限性。

目前常用的从枸杞中提取类胡萝卜素的技术主要有溶剂萃取法、超声提取法、微波提取法、超临界CO₂萃取和亚临界流体萃取等方法。而在分离技术方面，传统的柱色谱和薄层色谱、以及膜分离被应用在该类化合物的分离中。与枸杞中类胡萝卜素提取分离相关的文献大多数集中于对枸杞色素混合物的提取以及总的色素含量的提高，对于枸杞色素单体化合物分离制备的报道较少，并且得到的化合物数量少、纯度较低，使用的分离方法达不到简单、快速、高效、且大量制备的需求。

发明内容

本发明针对现有的枸杞类胡萝卜素化合物分离方面的需求，提供一种提取分离枸杞中玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯和玉米黄质双棕榈酸酯三种类胡萝卜素单体化合物的方法。

本发明提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，包括以下步骤：

（1）枸杞色素粗浸膏的制备：将干燥的枸杞果实粉碎后加入正己烷，于水浴60~75℃回流提取20min~120 min得到提取液，并将提取液在压力-0.03MPa~0.08MPa，温度30℃~45℃下减压浓缩得到枸杞色素粗浸膏；

（2）高速逆流色谱分离溶剂系统：将正己烷、二氯甲烷、乙腈混合得到溶剂体系；溶剂系统中，正己烷、二氯甲烷、乙腈的体积比为1:1:1~12:10:10；

（3）样品溶液配制：将步骤（1）获得的枸杞色素粗浸膏用步骤（2）的溶剂系统配制成浓度为30~90 mg/mL的样品溶液；

（4）二阶重叠重复进样的洗脱-挤出的高速逆流色谱分离：将步骤（2）配制的混合溶剂在分液漏斗中震荡后静置分层，得到溶剂系统的上相和下相，并分别将上相和下相作为固定相和流动相高速逆流色谱分离：首先以流速10~100 mL/min将固定相泵入聚四氟乙烯分离柱中，当其充满柱子后运行高速逆流色谱仪器，设定转速为200~1600 rpm；当仪器实际转速达到预设转速且稳定后，将流动相泵入柱子中，其流速为0.5~30 mL/min；待流动相流过样品环后将步骤（3）配制得样品溶液通过进样六通阀注入高速逆流色谱仪器中，继续以流速0.5~30 mL/min持续泵入流动相，设定检测波长为450 nm；当第一次进样10~30 min后开始第二次进样，二次进样10~30 min后开始第三次进样；根据所检测的高速逆流色谱图，当三次进样后分离的玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被完全洗脱后，用固定相代替流动相以相同的流速开始洗脱并收集被固定相挤出的玉米黄质双棕榈酸酯馏分，此时已经完成二阶重叠重复分离过程中的第一个循环（即一阶重叠重复进样）；然后以第一个循环同样的时间间隔完成第二个循环和第三个循环（第四次进样意味着二阶重叠重复进样的开始，在此过程中同样以第一个循环的时间间隔进行，本次循环中剩余一阶重叠重复进样的两次进样，即第五次和第六次；最后按照同样的方法完成第三个循环，总共包括9次进样）；

（5）收集步骤（3）中分离得到的所有馏分，在温度20℃~35℃，压力0.03MPa~-0.1MPa下真空干燥，得到三个单体化合物。

本发明相对现有技术具有以下优点：

1、本发明实现了在相同时间内，单次分离过程中重叠重复多次进样的目的，获得了纯度85%以上的玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三种类胡萝卜素单体化合物；

2、本发明分离方法简单高效，进样量大，与传统的单次进样分离比较，在相同分离时间内提高了进样量和产量，节省了溶剂消耗，且单体化合物的得率也提高了9倍左右。

附图说明

图1为二阶重叠重复进样的洗脱-挤出高速逆流色谱分离的色谱图。

图2为HPLC检测枸杞色素粗提物和HSCCC分离所得三个单体化合物的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸色素单体的方法做进一步说明。

实施例1

（1）枸杞色素粗提物提取：将干燥的枸杞果实粉碎后加入正己烷中，在62℃水浴回流提取60 min，得到提取液；将提取液在温度45℃、压力-0.03MPa的条件下减压干燥，得到枸杞色素粗浸膏；

（2）高速逆流色谱溶剂体系的配制：将正己烷、二氯甲烷、乙腈以10:3.5:6.5的体积比混合，得到溶剂体系；

（3）样品溶液的配制：将步骤（1）获得的枸杞色素粗浸膏用步骤（2）的溶剂体系配制成浓度为90 mg/mL的样品溶液；

（4）二阶重叠重复进样的洗脱-挤出的高速逆流色谱分离：将步骤（2）得到溶剂体系在分液漏斗中震荡后静置分层，得到溶剂系统的上相和下相；再分别以上相和下相作为高速逆流色谱分离的固定相和流动进行相高速逆流色谱分离。首先以流速30 mL/min将固定相泵入聚四氟乙烯分离柱中，当其充满柱子后运行高速逆流色谱仪器，设定转速为660rpm；当仪器实际转速达到预设转速且稳定后，以流速2 mL/min将流动相泵入分离柱中；待流动相流过样品环后将枸杞粗浸膏样品溶液通过进样六通阀注入高速逆流色谱仪器中，继续以流速2 mL/min持续泵入流动相，设定检测波长为450 nm；当第一次进样16 min后开始第二次进样，进样32 min后开始第三次进样；根据所检测的高速逆流色谱图所示（图1），当三次进样后分离的玉米黄质（峰1）和玉米黄质单棕榈酸酯（峰2）被完全洗脱后（163 min），用固定相代替流动相以相同的流速开始洗脱并收集被固定相挤出的玉米黄质双棕榈酸酯（峰3）馏分，此时已经完成二阶重叠重复分离过程的第一个循环；然后重复第一个循环的进样步骤，以同样的方法完成后续的两个循环，总共包括9次进样，整个分离过程运行651min；

（5）收集馏分和浓缩干燥：收集步骤（3）中分离得到的所有馏分，在温度35℃，压力-0.1MPa下真空干燥，得到玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三个单体化合物。

图1为二阶重叠重复进样的洗脱-挤出高速逆流色谱分离的色谱图，其中峰1为玉米黄质；峰2为玉米黄质单棕榈酸酯；峰3为玉米黄质双棕榈酸酯。分离条件：柱体积为134mL，流动相流速为2 mL/min，转速为660 rpm，检测波长为450 nm；整个分离过程持续651min，其中图中A、B、C分别代表3次循环（每个循环进样3次，共进样9次），A：0~232 min, B：220~448 min； C：435~651 min。每个循环中包括3个峰1的色谱峰，3个峰2的色谱峰，和1个峰3的色谱峰。

图2为HPLC检测枸杞色素粗提物和HSCCC分离所得三个单体化合物的色谱图；其中，图（a）为枸杞色素粗提物的色谱图，图（b）为三个单体化合物中的峰1（玉米黄质）的色谱图，图（c）为三个单体化合物中的峰2（玉米黄质单棕榈酸酯）的色谱图，图（d）为三个单体化合物中的峰3（玉米黄质单棕榈酸酯）的色谱图。检测条件：YMC C30色谱柱(150 × 4.6 mm,5 μm)；流动相：A-甲醇/甲基叔丁基醚/水(92:4:4, v/v/v)，B-甲醇/甲基叔丁基醚/水(90:6:4, v/v/v)；梯度洗脱：0-10 min，10-75% B，10-30 min，75% B；流速：0.5 mL/min；检测波长为450 nm；进样量：20 uL；柱温：25℃。

称量三个循环中得到的三个单体化合物质量以及纯度如下： 3个单体化合物在三个循环中的质量分别为：循环A中玉米黄质（9.6 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（15.6 mg）, 玉米黄质双棕榈酸酯（54.6 mg）； 循环B中玉米黄质（9.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（15.2mg），玉米黄质双棕榈酸酯（54.0 mg）； 循环C中玉米黄质（9.9 mg）， 玉米黄质单棕榈酸酯（15.0 mg），玉米黄质双棕榈酸酯（52.9 mg）。其中循环A中第一、二、三次进样得到的玉米黄质纯度分别为88%、88.5%、88.2%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为89%、89.5%、89%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为92%；循环B中第四、五、六次进样得到的玉米黄质纯度分别为88.5%、88%、88%，玉米黄质单棕榈酸酯纯度分别为89.1%、 89%、88.6%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度91.5%；循环C中第七、八、九次进样得到的玉米黄质纯度分别为玉米黄质87.9%、87.9%、87.5%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为88.7%、88.5%、88.5%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为90%。玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三个单体化合物的总得率分别为3.51%、5.65%、19.93%。

实施例2

（1）枸杞色素粗提物提取：同实施例1；

（2）高速逆流色谱溶剂体系的配制：将正己烷、二氯甲烷、乙腈以10:3:7的体积比混合，得到溶剂体系；

（3）样品溶液的配制：将步骤（1）获得的枸杞色素粗浸膏用步骤（2）的溶剂体系配制成浓度为90 mg/mL的样品溶液；

（4）二阶重叠重复进样的洗脱-挤出的高速逆流色谱分离：将步骤（2）得到溶剂体系在分液漏斗中震荡后静置分层，得到溶剂系统的上相和下相；再分别以上相和下相作为高速逆流色谱分离的固定相和流动进行相高速逆流色谱分离。首先以流速20 mL/min将固定相泵入聚四氟乙烯分离柱中，当其充满柱子后运行高速逆流色谱仪器，设定转速为410rpm；当仪器实际转速达到预设转速且稳定后，以流速2 mL/min将流动相泵入分离柱中；待流动相流过样品环后将枸杞粗浸膏样品溶液通过进样六通阀注入高速逆流色谱仪器中，继续以流速2 mL/min持续泵入流动相，设定检测波长为450 nm；当第一次进样20 min后开始第二次进样，然后在同样的时间间隔40 min后开始第三次进样；根据所检测的高速逆流色谱图所示，当三次进样后分离的玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被完全洗脱后（170 min），用固定相代替流动相以相同的流速开始洗脱并收集被固定相挤出的玉米黄质双棕榈酸酯馏分，此时已经完成二阶重叠重复分离过程的第一个循环；然后重复第一个循环的进样步骤，以同样的方法完成后续的两个循环，总共包括9次进样，整个分离过程运行689 min；

（5）收集馏分和浓缩干燥：收集步骤（4）中分离得到的所有馏分，在温度35℃、压力-0.1MPa下真空干燥，得到三个单体化合物。

干燥后称量三个循环中得到的三个单体化合物质量以及纯度如下：3个单体化合物在三个循环中的质量分别为：循环A中玉米黄质（32.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（52.0mg）， 玉米黄质双棕榈酸酯（182.0 mg）；循环B中玉米黄质（30.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（50.7 mg），玉米黄质双棕榈酸酯（180.0 mg）；循环C中玉米黄质（33.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（50.0 mg），玉米黄质双棕榈酸酯（176.3 mg）。其中循环A中第一、二、三次进样得到的玉米黄质纯度分别为87%、87.3%、87.2%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为88%、88.5%、88%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为91%；循环B中第四、五、六次进样得到的玉米黄质纯度分别为87.5%、87%、87%，玉米黄质单棕榈酸酯纯度分别为88.1%、88%、88.3%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度90.5%；循环C中第七、八、九次进样得到的玉米黄质纯度分别为玉米黄质87%、87.1%、87%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为88.2%、88%、88%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为90%。

玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三个单体化合物的总得率分别为3.53%、5.60%、19.89%。

实施例3

（1）枸杞色素粗提物提取：提取过程同实施例1；

（2）高速逆流色谱溶剂体系的配制：将正己烷、二氯甲烷、乙腈以10:4:6.5的体积比混合，得到溶剂体系；

（3）样品溶液的配制：将步骤（1）获得的枸杞色素粗浸膏用步骤（2）的溶剂体系配制成浓度为90 mg/mL的样品溶液；

（4）二阶重叠重复进样的洗脱-挤出的高速逆流色谱分离：将步骤（2）得到溶剂体系在分液漏斗中震荡后静置分层，得到溶剂系统的上相和下相；再分别以上相和下相作为高速逆流色谱分离的固定相和流动进行相高速逆流色谱分离。首先以流速100 mL/min将固定相泵入聚四氟乙烯分离柱中，当其充满柱子后运行高速逆流色谱仪器，设定转速为600rpm；当仪器实际转速达到预设转速且稳定后，以流速10 mL/min将流动相泵入柱子中；待流动相流过样品环后将枸杞粗浸膏样品溶液通过进样六通阀注入高速逆流色谱仪器中，继续以流速10 mL/min持续泵入流动相，设定检测波长为450 nm；当第一次进样18 min后开始第二次进样，然后在同样的时间间隔36 min后开始第三次进样；根据所检测的高速逆流色谱图，当三次进样后分离的玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被完全洗脱后（200 min），用固定相代替流动相以相同的流速开始洗脱并收集被固定相挤出的玉米黄质双棕榈酸酯馏分，此时已经完成二阶重叠重复分离过程的第一个循环；然后重复第一个循环的进样步骤，以同样的方法完成后续的两个循环，总共包括9次进样，整个分离过程运行725 min；

（5）收集馏分和浓缩干燥：收集步骤（3）中分离得到的所有馏分，在温度35℃，压力-0.1MPa下进行真空干燥，得到三个单体化合物。

干燥后称量三个循环中得到的三个单体化合物质量以及纯度如下：3个单体化合物在三个循环中的质量分别为：循环A中玉米黄质（80.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（130.0mg），玉米黄质双棕榈酸酯（455.0 mg）； 循环B中玉米黄质（75.0 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（126.7 mg），玉米黄质双棕榈酸酯（450.0 mg）；循环C中玉米黄质（82.5 mg），玉米黄质单棕榈酸酯（125.0 mg），玉米黄质双棕榈酸酯（440.8 mg）。其中循环A中第一、二、三次进样得到的玉米黄质纯度分别为87%、87.3%、87.2%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为88%、88.5%、88%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为91%；循环B中第四、五、六次进样得到的玉米黄质纯度分别为87.5%、87%、87%，玉米黄质单棕榈酸酯纯度分别为88.1%、88%、88.3%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度90.5%；循环C中第七、八、九次进样得到的玉米黄质纯度分别为玉米黄质87%、87.1%、87%，玉米黄质单棕榈酸酯的纯度分别为88.2%、88%、88%，玉米黄质双棕榈酸酯的纯度为90%。

玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯三个单体化合物的总得率分别为3.50%、5.58%、19. 90%。

Claims (5)

1.一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，包括以下工艺步骤：

（1）提取：将干燥的枸杞果实粉碎后加入正己烷，回流提取得到提取液；提取液经减压浓缩得到枸杞色素粗浸膏；

（2）高速逆流色谱分离溶剂系统：选择正己烷、二氯甲烷、乙腈的混合溶剂作为逆流色谱分离的溶剂系统；

（3）样品溶液配制：将步骤（1）获得的枸杞色素粗浸膏用步骤（2）的溶剂系统配制成浓度为30~90 mg/mL的样品溶液；

（4）二阶重叠重复进样的洗脱-挤出的高速逆流色谱分离：将步骤（2）配制的混合溶剂在分液漏斗中震荡后静置分层，得到溶剂系统的上相和下相，并分别将上相和下相作为固定相和流动相高速逆流色谱分离：首先以流速10~100 mL/min将固定相泵入聚四氟乙烯分离柱中，当其充满柱子后运行高速逆流色谱仪器，设定转速为200~1600 rpm；当仪器实际转速达到预设转速且稳定后，将流动相泵入柱子中，其流速为0.5~30 mL/min；待流动相流过样品环后将步骤（3）配制得样品溶液通过进样六通阀注入高速逆流色谱仪器中，继续以流速0.5~30 mL/min持续泵入流动相，设定检测波长为450 nm；当第一次进样10~30 min后开始第二次进样，二次进样10~30 min后开始第三次进样；根据所检测的高速逆流色谱图，当三次进样后分离的玉米黄质和玉米黄质单棕榈酸酯被完全洗脱后，用固定相代替流动相以相同的流速开始洗脱并收集被固定相挤出的玉米黄质双棕榈酸酯馏分，此时已经完成二阶重叠重复分离过程中的第一个循环；然后以第一个循环同样的时间间隔进行重复第一个循环的进样步骤，完成第二个循环和第三个循环；

（5）将步骤（4）中分离得到的所有馏分真空干燥，得到三个单体化合物玉米黄质、玉米黄质单棕榈酸酯、玉米黄质双棕榈酸酯。

2.如权利要求1所述一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，其特征在于：步骤（1）的回流提取是在60~75℃水浴回流提取20min~120 min。

3.如权利要求1所述一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，其特征在于：步骤（1）的减压浓缩是在温度30℃~45℃，压力-0.03MPa~0.08MPa条件下减压浓缩得到枸杞色素粗浸膏。

4.如权利要求1所述一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，其特征在于：步骤（2）的溶剂系统中，正己烷、二氯甲烷、乙腈的体积比为10:3.5:6.5、10:3:7、10:4:6。

5.如权利要求1所述一种提取分离枸杞果实中玉米黄质及其棕榈酸酯色素单体的方法，其特征在于：步骤（5）的真空干燥是在温度20℃~35℃，压力0.03MPa~-0.1MPa下进行。

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