CN106317145B

CN106317145B - 紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法

Info

Publication number: CN106317145B
Application number: CN201610671719.7A
Authority: CN
Inventors: 徐贞贞; 陈爱亮; 杨曙明
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2016-08-15
Filing date: 2016-08-15
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2036-08-15
Also published as: CN106317145A

Abstract

本发明涉及有机物分离纯化领域，具体而言，涉及一种紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：1)、用酸化乙醇对破碎后的紫甘蓝进行抽提得到花色苷粗提液；将所述花色苷粗提液旋蒸除去乙醇后过树脂柱吸附，经洗柱后再次旋蒸得到花色苷膏状物，常温放置干燥后得到花色苷粗上样粉末；2)、使用高速逆流色谱技术对所述花色苷粗上样粉末进一步分离纯化；3)、收集步骤2)得到的纯化好的花色苷组份并采用HPLC‑MS进行定性分析，对纯度大于90％的花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

Description

紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及有机物分离纯化领域，具体而言，涉及一种紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法。

背景技术

紫甘蓝(Brassica oleracea var.capitata f.rubra)，又称紫洋白菜、红甘蓝、紫椰菜、赤球甘蓝，是结球甘蓝(洋白菜)的变型，属十字花科、芸薹属、甘蓝种，是结球甘蓝的一个变种。它最早起源于地中海以及欧洲西部和南部地区，目前在世界各地均有种植。已报到的紫甘蓝花色苷因品种差异，其花色苷种类从十余种到几十余种不等，紫甘蓝花色苷和水果中的花色苷不同，主要是酰基化的花色苷。

花色苷属于多酚类化合物，是一类重要的植物化学成分。花色苷分布于鲜花、水果、蔬菜和谷类豆类等植物中，已报到的花色苷有500余种。花色苷具有一定的生理活性，如改善视觉功能、改善大脑功能、抗肥胖症、抗糖尿病、抗心血管疾病和抗癌症等。

目前，对花色苷的生理活性研究均采用花色苷单体、提取物或富含花色苷的食品在人、动物和细胞三大体系进行实验。而市售花色苷单体仅为30余种，其总量不足已报到花色苷单体总量的1％，且均为非酰基化花色苷。商品化花色苷单体种类不足极大地制约了花色苷生理功能和作用机理的相关研究，因此开展分离纯化花色苷单体，特别是酰基化花色苷单体的工作极具重要的意义。

高速逆流色谱法是20世纪80年代初，由美国国立健康研究院的Ito和Bowman在液液分配色谱的基础上研究和发展起来的一种现代色谱分离制备技术。与传统的液－固色谱相比，它的固定相和流动相都是液体，不需要固体支撑，避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等弊端。且被分离物质与液态固定相之间能可充分接触，使得样品的制备量大大提高。高速逆流色谱法具有连续、高效、制备量大等优点，在天然产物分离纯化领域应用较为广泛。虽然高速逆流色谱法有以上优点，但其在花色苷提取领域却鲜有应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)、用酸化乙醇对破碎后的紫甘蓝进行抽提得到花色苷粗提液；将所述花色苷粗提液旋蒸除去乙醇后过树脂柱吸附，经洗柱后再次旋蒸得到花色苷膏状物，常温放置干燥后得到花色苷粗上样粉末；

2)、使用高速逆流色谱技术对所述花色苷粗上样粉末进一步分离纯化；

3)、收集步骤2)得到的纯化好的花色苷组份并采用HPLC-MS进行定性分析，对纯度大于90％的花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得花色苷单体成品。

高速逆流色谱技术(High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)是基于样品在逆行的互不混溶两相溶剂之间分配系数的差异而实现分离的新型分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。

花色苷最基本的结构单元是由C₆-C₃-C₆基本框架构成的花色啶，是植物的二级次生代谢产物，具有典型的共轭双键。花青素在自然条件下非常不稳定，游离状态的花色苷元极少见，一般会与单个或多个糖类以化学键形式结合，形成花色苷。糖苷单元和酰基化基团以化学键形式结合在花色苷的不同结合位点上，会对花青素的稳定性和反应性产生重要的影响。

紫甘蓝(Brassica oleracea L.)来源广、价格低廉，使之成为一种理想的花色苷来源。在以往的研究中，从紫甘蓝中鉴定的花色苷有20种之多，且全部为矢车菊素类花色苷，其中18种为酰基化的。由于紫甘蓝中花色苷种类如此之多，且几乎全部为酰基化，因此单种酰基化花色苷的分离纯化就变的尤为困难。

已经报道的花色苷提取方法有：溶剂提取法、微波和超声波辅助提取法、生物酶或生物发酵法和超高压法等。然而这些方法在面临紫甘蓝的酰基化花色苷提取时由于分辨率不高因而很难得到令人满意的效果。本申请将高速逆流色谱技术应用于紫甘蓝中酰基化花色苷的提取，成功的提取得到两种酰基化花色苷，且得率高，纯度好。

优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，在步骤1)中，所述破碎后的紫甘蓝与酸化乙醇的固液比为1g：(2mL～4mL)；

按体积份数计，所述酸化乙醇包括：乙醇37～38份、水60～64份以及三氟乙酸0.3～0.7份。

优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，所述树脂柱中灌注的为XAD-7树脂；

将去乙醇后的花色苷粗提液过树脂柱时的流速为2mL/min～4mL/min。

XAD-7树脂可吸附多肽类和酶类，是含有丙烯酸酯的非极性离子交换树脂。表面积450m²/g。颗粒度：20～50目。

优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，所述洗柱过程具体为：

用酸化水冲洗10倍柱体积以除去杂质后，用酸化水冲洗10倍柱体积以除去杂质后，用体积百分数为0.3％～0.7％的三氟乙酸的甲醇溶液洗脱。

优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，在步骤2)中，使用高速逆流色谱技术对所述花色苷粗上样粉末进一步分离纯化时，所用的逆流色谱溶剂体系主要由甲基叔丁基醚、正丁醇、乙腈以及酸化水组成。

进一步优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，按体积份数计，所述逆流色谱溶剂体系包括甲基叔丁基醚含量10～25份、正丁醇18～42份、乙腈10～24份以及酸化水30～55份。

进一步优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，按体积百分数计，所述酸化水含0.01％～0.05％的三氟乙酸。

优选的，如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法，在步骤2)中，使用高速逆流色谱技术对所述花色苷粗上样粉末进一步分离纯化时，逆流色谱设置为正向旋转，转速为400～800r/min。

高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50％，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。因此，基于其分离原理，转速是其非常重要的一个参数。

如上所述的紫甘蓝花色苷单体的分离纯化方法制得的紫甘蓝酰基化花色苷单体。

如上所述的紫甘蓝酰基化花色苷单体在制备包含花色苷的食品、保健品、化妆品及药品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、分离过程可连续进行，操作简单、高效。

2)、采用高效逆流色谱法制备得到了高纯度的酰基化花色苷单体，分离效果较好。

3)、本发明所用产品可在花色苷类相研究领域、食品、化妆品、药品等行业得到逐步应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3中高效逆流色谱分离紫甘蓝花色苷图；峰1为酰基化花色苷单体A，峰2为酰基化花色苷单体B；纵坐标代表吸光度；

图2a为本发明实验例中酰基化花色苷A的液相图谱；图2b为本发明实验例中酰基化花色苷A的全波长扫描光谱图；

图3a为本发明实验例中酰基化花色苷B的液相图谱；图3b为本发明实验例中酰基化花色苷B的全波长扫描光谱图；。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种从紫甘蓝中分离制备酰基化花色苷单体的方法，包括以下步骤：

1)、取紫甘蓝切丝后用榨汁机打碎。按照1g：2mL的料液比加入提取溶剂酸化乙醇，于4℃下避光搅拌10h，抽滤得到花色苷粗提液。33℃下旋蒸除去乙醇，得到浓缩液放在4℃冷库中备用。按体积份数计，所述酸化乙醇包括：乙醇37份、水60份以及三氟乙酸0.7份。

2)、用超纯水浸泡XAD-7树脂24h使其充分溶胀，湿法装入内玻璃层析柱中，用0.1mol/L的HCl冲洗10倍柱体积对树脂进行活化，随后用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗树脂至不含HCl为止。在4℃的层析柜中以4mL/min的流速上步骤1)所得粗提液。以相同的流速用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗10倍柱体积以除去杂质后用含0.7％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，采用自动收集器收集，每2min收集一管，并在520nm处分别测定其吸光值。随后将所收集洗脱液后用旋转蒸发仪在35℃下除去混合物中的甲醇得到膏状物，常温放置一晚得花色苷粗上样粉末。

3)、逆流色谱溶剂体系准备：溶剂体系为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙腈以及酸化水(含三氟乙酸0.01％)；按体积份数计，其中甲基叔丁基醚含量10份、正丁醇18份、乙腈17份以及酸化水55份。将按照固定配比混匀的试剂配置好后放入试剂瓶中，充分混匀后倒入分液漏斗中，室温静置待两相平衡后。将两相溶剂的上下相分开，分别置于试剂瓶中，超声脱气20min，静置后备用。

4)、取步骤3)所配置溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相，上相作为固定相，下相作为流动相。开启循环水浴，开启泵，以17mL/min流速将已脱气好的固定相从主机管路进口处泵入，至管路内全部注满固定相，待体系平衡后；以1.5mL/min从进柱口泵入流动相。设置流路切换六通阀、主机设置为正向旋转，转速为800r/min，待主机的转速达到所需的转速，并平稳旋转，当出口端流出流动相稳定时，快速将调节旋钮到关闭阀，将样品注射入装样注射器中再将调节旋钮调节到进样阀，然后将紫外检测器、工作站获取状态、调零开始采集数据，根据峰形手动接收组分。

收集到的各管采用HPLC-MS进行花色苷定性分析，对纯度大于90％的花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得酰基化花色苷单体成品。

实施例2

1)、取紫甘蓝切丝后用榨汁机打碎。按照1g：4mL的料液比加入提取溶剂酸化乙醇，于4℃下避光搅拌14h，抽滤得到花色苷粗提液。37℃下旋蒸除去乙醇，得到浓缩液放在4℃冷库中备用。按体积份数计，所述酸化乙醇包括：乙醇38份、水64份以及三氟乙酸0.3份。

2)、用超纯水浸泡XAD-7树脂24h使其充分溶胀，湿法装入内玻璃层析柱中，用0.1mol/L的HCl冲洗10倍柱体积对树脂进行活化，随后用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗树脂至不含HCl为止。在4℃的层析柜中以2mL/min的流速上步骤1)所得粗提液。以相同的流速用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗10倍柱体积以除去杂质后用含0.3％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，采用自动收集器收集，每2min收集一管，并在520nm处分别测定其吸光值。随后将所收集洗脱液后用旋转蒸发仪在35℃下除去混合物中的甲醇得到膏状物，常温放置一晚得花色苷粗上样粉末。

3)、逆流色谱溶剂体系准备：溶剂体系为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙腈以及酸化水(含三氟乙酸0.05％)；按体积份数计，其中甲基叔丁基醚含量25份、正丁醇42份、乙腈24份以及酸化水30份。将按照固定配比混匀的试剂配置好后放入试剂瓶中，充分混匀后倒入分液漏斗中，室温静置待两相平衡后。将两相溶剂的上下相分开，分别置于试剂瓶中，超声脱气20min，静置后备用。

4)、取步骤3)所配置溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相，上相作为固定相，下相作为流动相。开启循环水浴，开启泵，以23mL/min流速将已脱气好的固定相从主机管路进口处泵入，至管路内全部注满固定相，待体系平衡后；以2.5mL/min从进柱口泵入流动相。设置流路切换六通阀、主机设置为正向旋转，转速为400r/min，待主机的转速达到所需的转速，并平稳旋转，当出口端流出流动相稳定时，快速将调节旋钮到关闭阀，将样品注射入装样注射器中再将调节旋钮调节到进样阀，然后将紫外检测器、工作站获取状态、调零开始采集数据，根据峰形手动接收组分。

实施例3

1)、取紫甘蓝切丝后用榨汁机打碎。按照1g：3mL的料液比加入提取溶剂酸化乙醇，于4℃下避光搅拌12h，抽滤得到花色苷粗提液。35℃下旋蒸除去乙醇，得到浓缩液放在4℃冷库中备用。按体积份数计，所述酸化乙醇包括：乙醇37.5份、水62份以及三氟乙酸0.5份。

2)、用超纯水浸泡XAD-7树脂24h使其充分溶胀，湿法装入内玻璃层析柱中，用0.1mol/L的HCl冲洗10倍柱体积对树脂进行活化，随后用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗树脂至不含HCl为止。在4℃的层析柜中以3mL/min的流速上步骤1)所得粗提液。以相同的流速用含0.5％三氟乙酸的超纯水冲洗10倍柱体积以除去杂质后用含0.5％三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，采用自动收集器收集，每2min收集一管，并在520nm处分别测定其吸光值。随后将所收集洗脱液后用旋转蒸发仪在35℃下除去混合物中的甲醇得到膏状物，常温放置一晚得花色苷粗上样粉末。

3)、逆流色谱溶剂体系准备：溶剂体系为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙腈以及酸化水(含三氟乙酸0.03％)；按体积份数计，其中甲基叔丁基醚含量21份、正丁醇18份、乙腈21份以及酸化水30份。将按照固定配比混匀的试剂配置好后放入试剂瓶中，充分混匀后倒入分液漏斗中，室温静置待两相平衡后。将两相溶剂的上下相分开，分别置于试剂瓶中，超声脱气20min，静置后备用。

4)、取步骤3)所配置溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相，上相作为固定相，下相作为流动相。开启循环水浴，开启泵，以20mL/min流速将已脱气好的固定相从主机管路进口处泵入，至管路内全部注满固定相，待体系平衡后；以2mL/min从进柱口泵入流动相。设置流路切换六通阀、主机设置为正向旋转，转速为600r/min，待主机的转速达到所需的转速，并平稳旋转，当出口端流出流动相稳定时，快速将调节旋钮到关闭阀，将样品注射入装样注射器中再将调节旋钮调节到进样阀，然后将紫外检测器、工作站获取状态、调零开始采集数据，根据峰形手动接收组分。

实验例

实施例1～3分离得到的酰基化花色苷单体共有两种，其液相色谱图及全波长扫描光谱图分别如图2和图3所示。

质谱结果表明紫甘蓝花色苷单体A和B的分子量为979和1141，分别为Cyanidin-3-(sinapoyl)diglucoside-5-glucoside和Cyanidin-3-(caffeoyl)(sinapoyl)diglucoside-5-glucoside。

对各实施例分离纯化得到的酰基化花色苷单体的纯度和得率分析如表1所示。

表1实施例1～3分离纯化得到的酰基化花色苷单体的纯度和得率

其中得率为分离所得的花色苷单体粉末质量占上样花色苷粗提物粉末的比例。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种紫甘蓝花色苷单体矢车菊-3-芥子酰二葡萄糖基-5葡萄糖苷以及矢车菊-3-咖啡酰芥子酰二葡萄糖基-5葡萄糖苷的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、取紫甘蓝切丝后用榨汁机打碎；按照1g：3mL的料液比加入提取溶剂酸化乙醇，于4℃下避光搅拌12h，抽滤得到花色苷粗提液；35℃下旋蒸除去乙醇，得到浓缩液放在4℃冷库中备用；按体积份数计，所述酸化乙醇包括：乙醇37.5份、水62份以及三氟乙酸0.5份；

2）、用超纯水浸泡XAD-7树脂24h使其充分溶胀，湿法装入内玻璃层析柱中，用0.1mol/L的HCl冲洗10倍柱体积对树脂进行活化，随后用含0.5%三氟乙酸的超纯水冲洗树脂至不含HCl为止；在4℃的层析柜中以3mL/min的流速上步骤1）所得粗提液；以相同的流速用含0.5%三氟乙酸的超纯水冲洗10倍柱体积以除去杂质后用含0.5%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，采用自动收集器收集，每2min收集一管，并在520nm处分别测定其吸光值；随后将所收集洗脱液后用旋转蒸发仪在35℃下除去混合物中的甲醇得到膏状物，常温放置一晚得花色苷粗上样粉末；

3）、逆流色谱溶剂体系准备：溶剂体系为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙腈以及含三氟乙酸0.03%的酸化水；按体积份数计，其中甲基叔丁基醚含量21份、正丁醇18份、乙腈21份以及酸化水30份；将按照固定配比混匀的试剂配置好后放入试剂瓶中，充分混匀后倒入分液漏斗中，室温静置待两相平衡后；将两相溶剂的上下相分开，分别置于试剂瓶中，超声脱气20min，静置后备用；

4）、取步骤3）所配置溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；开启循环水浴，开启泵，以20mL/min流速将已脱气好的固定相从主机管路进口处泵入，至管路内全部注满固定相，待体系平衡后；以2mL/min从进柱口泵入流动相；设置流路切换六通阀、主机设置为正向旋转，转速为600r/min，待主机的转速达到所需的转速，并平稳旋转，当出口端流出流动相稳定时，快速将调节旋钮到关闭阀，将样品注射入装样注射器中再将调节旋钮调节到进样阀，然后将紫外检测器、工作站获取状态、调零开始采集数据，根据峰形手动接收组分；

收集到的各管采用HPLC-MS进行花色苷定性分析，对纯度大于90%的花色苷单体于旋转蒸发仪上依次经减压浓缩、真空冷冻干燥至恒重，即得酰基化花色苷单体成品矢车菊-3-芥子酰二葡萄糖基-5葡萄糖苷以及矢车菊-3-咖啡酰芥子酰二葡萄糖基-5葡萄糖苷。